CN108383824B - 一种苯并吡喃酮二聚体及其提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苯并吡喃酮二聚体及其提取方法和应用，包括以下步骤：(1)在菌种培养基中对猫儿屎内生真菌塔宾曲霉DS37进行菌种培养；(2)在发酵培养基中对步骤(1)中获得的菌种进行发酵培养，然后用石油醚、乙酸乙酯和甲醇浸提若干次，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，滤液减压浓缩，得到粗品浸膏，最后经硅胶柱层析得到苯并吡喃酮二聚体。本发明制得的苯并吡喃酮二聚体有很好的抑制金黄色葡萄球菌作用，可以用于药剂防治技术；且苯并吡喃酮二聚体具有较强的抗A549细胞株活性，可以为抗肿瘤药物的开发提供一种可能；同时，苯并吡喃酮二聚体具有一定的抗氧化活性。

Description

一种苯并吡喃酮二聚体及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及苯并吡喃酮二聚体制备领域，具体涉及一种苯并吡喃酮二聚体及其提取方法和应用。
背景技术
猫儿屎(Decaisnea insignis(Griff.)Hook.f.&Thomson)系木通科(Lardiyabalaeeae)猫儿屎属植物。丛生落叶直立灌木，广泛分布于我国西南部和中部地区。木通科植物猫儿屎是我国传统的民间中草药，味辛、甘、性平，根及果实甘、凉具有清肺止咳，祛风除湿，治疗风湿关节痛，抗肿瘤等功效。迄今为止，对猫儿屎的研究主要集中在它的植物化学成分，而对其内生真菌的研究相对较少。据报道，内生真菌次生代谢产物种类主要有：生物碱、萜类、甾体、有机酸类等化合物，均具有一定的生物活性。然而未见猫儿屎内生真菌中有关苯并吡喃酮二聚体及其活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苯并吡喃酮二聚体及其提取方法和应用，以克服上述现有技术存在的缺陷，本发明从猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物中分离得到苯并吡喃酮二聚体，且该苯并吡喃酮二聚体有较好的抑菌活性和抗肿瘤活性，同时，具有一定的抗氧化活性。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种苯并吡喃酮二聚体，所述苯并吡喃酮二聚体的化学结构式为：
Figure GDA0001685716230000021
一种苯并吡喃酮二聚体的提取方法，包括以下步骤：
(1)在菌种培养基中对猫儿屎内生真菌塔宾曲霉DS37进行菌种培养；
(2)在发酵培养基中对步骤(1)中获得的菌种进行发酵培养，然后用石油醚、乙酸乙酯和甲醇浸提若干次，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，滤液减压浓缩，得到粗品浸膏；
(3)将步骤(2)得到的粗品浸膏在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为1:0:0,0:1:0,0:1:1,0:0:1的石油醚/乙酸乙酯/甲醇洗脱剂进行洗脱，得到A-D四个组分；
(4)将步骤(3)得到的B组分在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为100:0,100:20,100:50,100:100,100:200,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B1-B6六个组分，B3组分继续在硅胶色谱柱上，用体积梯度为100:0,100:20,100:50,100:70,100:90,100:100,100:120,100:140,100:150,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B3.1-B3.10十个组分，B3.5组分静置纯化，得到苯并吡喃酮二聚体。
进一步地，步骤(1)中所述的菌种培养基含有质量百分数组分：葡萄糖3％，硝酸钠0.3％，磷酸氢二钾0.1％，氯化钾0.05％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，余量为水；
步骤(2)中所述的发酵培养基含有质量百分数组分：大米70-80％，氯化钠5％，硝酸钠0.1％，谷氨酸钠0.5％，余量为水，且所述的发酵培养基pH＝8。
进一步地，步骤(1)中所述的菌种培养的条件为：28℃下培养7-10天；
步骤(2)中所述的发酵培养的条件为：20-24℃下培养35-40天；
步骤(2)中发酵物用石油醚/乙酸乙酯/甲醇浸提8次；
步骤(2)所述的石油醚、乙酸乙酯和甲醇均为工业用标准。
苯并吡喃酮二聚体在抑制细菌或真菌上的应用。
进一步地，所述细菌为金黄色葡萄球菌。
苯并吡喃酮二聚体在抗肿瘤上的应用。
进一步地，所述抗肿瘤指对人肺癌细胞、人前列腺癌细胞、人乳腺癌细胞、人肝癌细胞和人正常肝细胞的体外作用。
苯并吡喃酮二聚体在抗氧化上的应用。
进一步地，所述抗氧化指对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼的作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明通过对猫儿屎内生真菌DS37固体发酵物进行提取，得到此苯并吡喃酮二聚体，其分子式为C31H24O10，通过对本发明苯并吡喃酮二聚体的抑菌活性测试，发现该化合物有较好的抗细菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌有相当好的抑菌活性，为猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物的抑菌活性成分，因此，可以用于药剂防治技术。另外，通过对本发明苯并吡喃酮二聚体的抗肿瘤活性测试，发现该化合物有良好的抗肿瘤活性，尤其对A549细胞株有很好的细胞毒活性。同时，本发明苯并吡喃酮二聚体具有一定的抗氧化活性。
附图说明
图1为本发明苯并吡喃酮二聚体的HR-ESI-M谱；
图2为本发明苯并吡喃酮二聚体的1H-NMR谱；
图3为本发明苯并吡喃酮二聚体的13C-NMR谱；
图4为本发明苯并吡喃酮二聚体的自由基清除率线性拟合图；
图5为阳性对照维生素C的自由基清除率线性拟合图；
图6为苯并吡喃酮二聚体化合物的化学结构式。
保藏说明
本发明对从猫儿屎植物茎部分离得到的一株内生真菌塔宾曲霉DS37进行了下述保藏：
保藏时间：2018年3月22日，保藏地点：中国，武汉。中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏号为CCTCC M 2018147，分类命名为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式做进一步详细描述：
一种苯并吡喃酮二聚体化合物，该化合物的化学结构式：
Figure GDA0001685716230000041
该化合物的提取方法如下：
(1)在菌种培养基中对猫儿屎内生真菌塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)DS37进行菌种培养；
(2)在发酵培养基中对步骤(1)中获得的菌种进行发酵培养，以发酵物(9.2kg)为原料用石油醚/乙酸乙酯/甲醇浸提8次，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，减压浓缩，得到粗品浸膏1500g；
(3)将步骤(2)得到的粗品浸膏在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为1:0:0,0:1:0,0:1:1,0:0:1的石油醚/乙酸乙酯/甲醇洗脱剂进行洗脱，得到A(110g)，B(420g)，C(700g)，D(100g)四个组分；
(4)将步骤(3)得到的B组分在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为100:0,100:20,100:50,100:100,100:200,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B1-B6六个组分，B3组分继续在硅胶色谱柱上，用体积梯度为100:0,100:20,100:50,100:70,100:90,100:100,100:120,100:140,100:150,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B3.1-B3.10十个组分，B3.5组分静置纯化，得到苯并吡喃酮二聚体6.1mg。
本发明制备的猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物苯并吡喃酮二聚体是一种强生物活性的苯并吡喃酮类化合物，目前从猫儿屎植物的内生真菌中还未见有关该化合物活性研究的报道，也未见有人工合成此化合物活性研究的报道。本发明对猫儿屎内生真菌DS37固体发酵物采用硅胶柱层析的方法分离鉴定了一个强生物活性的苯并吡喃酮类化合物——asperpyrone D，该化合物的活性为首次报道。
本发明的强生物活性化合物苯并吡喃酮二聚体为橙色粉末，HR-ESI-MS在m/z557.1422处给出[M+H]+峰，推算其分子式为C31H24O10，1H和13C核磁共振数据如表1所示。
表1苯并吡喃酮二聚体的1H和13C核磁数据
Figure GDA0001685716230000051
Figure GDA0001685716230000061
通过对苯并吡喃酮二聚体的抑菌活性测试，发现该化合物有相当好的抗细菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌有很好的抑菌活性，为猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物的抑菌活性成分，因此，可以用于药剂防治技术。
通过对苯并吡喃酮二聚体的体外抗肿瘤活性测试，发现该化合物有较好的抗肿瘤活性，尤其对A549细胞株的活性，为猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物的抗肿瘤成分，因此，可以为抗肿瘤药物的开发提供一种可能。
通过对苯并吡喃酮二聚体的抗氧化活性测试，发现该化合物对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)有一定的抗氧化活性。
如图1-3所示，由苯并吡喃酮二聚体的HR-ESI-M谱、1H-NMR谱以及13C-NMR谱最终确定了该化合物的结构。该化合物为未见文献报道其活性的苯并吡喃酮类化合物，相关NMR数据归属如表1所示。
下面结合实施例对本发明做进一步说明：
首先，在菌种培养基中对猫儿屎内生真菌塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)DS37进行菌种培养；其次，在发酵培养基中对上述菌种进行发酵培养，得到次生代谢产物9.2kg，用石油醚/乙酸乙酯/甲醇浸提8次，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，减压浓缩，得到粗品浸膏1500g；得到的粗品浸膏在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为1:0:0,0:1:0,0:1:1,0:0:1的石油醚/乙酸乙酯/甲醇洗脱剂进行洗脱，得到A(110g)，B(420g)，C(700g)，D(100g)四个组分；将B组分浸膏，在硅胶色谱柱上，用不同梯度的石油醚/乙酸乙酯(100:0,100:20,100:50,100:100,100:200,0:100,v/v)洗脱剂进行洗脱，得到B1-B6六个组分，B3组分继续在硅胶色谱柱上，用体积梯度为100:0,100:20,100:50,100:70,100:90,100:100,100:120,100:140,100:150,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B3.1-B3.10十个组分，B3.5组分静置纯化，得到纯净的苯并吡喃酮二聚体6.1mg。
苯并吡喃酮二聚体的抗细菌活性实验：
1、实验材料
1.1、受试样品
苯并吡喃酮二聚体用DMSO溶解，配成500μg/mL的溶液。
1.2、菌株
两株革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)、两株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、乳酸链球菌)。
1.3、培养基
牛肉膏3.0g/L、NaCl 5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、pH 7.0-7.5。
1.4、其他材料
96孔板。
2、实验方法
96孔板每孔加入100μL上述培养基，100μL浓度为1×106CFU/mL的细胞悬液，第一孔中加500μg/mL的样品溶液，利用二倍稀释法使样品浓度从第一孔到第十孔依次为500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.81，3.91，1.95和0.975μg/mL，第十一孔和第十二孔分别加入100μL上述培养基和DMSO作为对照。选用硫酸链霉素作为革兰氏阴性菌的阳性对照，青霉素钠作为革兰氏阳性菌的阳性对照。上述每组进行3次平行实验，将96孔板置于37℃培养箱内孵育24h。
3、实验结果
结果见表2，结果显示，苯并吡喃酮二聚体对金黄色葡萄球菌有相当好的抑制活性，MIC(最小抑菌浓度)为7.81μg/mL。
苯并吡喃酮二聚体的抗真菌活性实验：
1、实验材料
1.1、受试样品
苯并吡喃酮二聚体用DMSO溶解，配成500μg/mL的溶液。
1.2、菌株
七株植物病原真菌(苹果树腐烂病菌、白菜黑斑病菌、玉米大斑病菌、烟草赤星病菌、油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、芍药炭疽病菌)。
1.3、培养基
200g马铃薯浸汁，葡萄糖20g、水1000mL。
1.4、其他材料
96孔板。
2、实验方法
96孔板每孔加入100μL上述培养基，100μL浓度为1×106CFU/mL的细胞悬液，第一孔中加500μg/mL的样品溶液，利用二倍稀释法使样品浓度从第一孔到第十孔依次为500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.81，3.91，1.95和0.975μg/mL，第十一孔和第十二孔分别加入100μL上述培养基和DMSO作为对照。选用多菌灵作为植物病原真菌的阳性对照。上述每组进行3次平行实验，将96孔板置于28℃培养箱内孵育48h。
3、实验结果
结果见表2，结果显示，苯并吡喃酮二聚体对苹果树腐烂病菌有较好的抑制活性，MIC(最小抑菌浓度)为31.2μg/mL。
表2苯并吡喃酮二聚体的抑菌活性
Figure GDA0001685716230000091
其中：A:大肠杆菌；B:绿脓杆菌；C：金黄色葡萄球菌；D：乳酸链球菌；E：苹果树腐烂病菌；F：白菜黑斑病菌；G：玉米大斑病菌；H：烟草赤星病菌；I：油菜菌核病菌；J：番茄灰霉病菌；K：芍药炭疽病菌；-：未设置实验。
苯并吡喃酮二聚体的抗肿瘤活性实验：
1、实验材料
1.1、受试样品
苯并吡喃酮二聚体用DMSO溶解，配成20mM的溶液。
1.2、肿瘤细胞
人肺癌细胞(A549)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人正常肝细胞(L02)。
1.3、其他材料
高糖DMEM培养液，胎牛血清，透明底96孔细胞培养板，无菌离心管，无菌移液管，无菌加样槽，无菌枪头，MTT，多道移液器，酶标仪。
2、实验方法
取处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化细胞，调整细胞悬液浓度为5x104/mL，加入96孔细胞培养板的中间6排，100μL/孔，第1排和第8排加培养液，100μL/孔。培养板放于37℃，5％CO2的培养箱中过夜。次日配置样品，阳性对照为阿霉素，用无菌生理盐水溶解至300μM；样品以DMSO溶解至20mM。阿霉素以培养液稀释至9μM，再依次做3倍稀释，6个浓度，即各浓度梯度分别为9,3,1,0.33,0.11,0μM。样品以培养液稀释至200μM，再依次做3倍稀释，6个浓度，即各浓度梯度分别为200,67,22,7.4,2.5,0μM。吸出培养液，每孔依次加入100μL不同浓度的样品。将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育48h后，吸去含样品的培养液，再加入MTT溶液(0.5mg/mL)，100μL/孔。放入培养箱中继续培养4h，吸去含MTT的培养液，加入DMSO，100μL/孔，低速振荡10min后，用酶标仪在490nm波长处测定各孔的OD值。根据抑制率公式
细胞的抑制率＝(空白对照OD值-加药孔的OD值)/空白对照OD值x100％。
评价化合物的体外抗肿瘤活性：
3、实验结果
结果见表3，结果显示，经对人肺癌细胞(A549)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)和人正常肝细胞(L02)的细胞毒活性实验，得苯并吡喃酮二聚体对A549细胞株具有较好的细胞毒活性，IC50值达到22.71μM。
表3 Desertorin B的抗肿瘤活性
Figure GDA0001685716230000111
苯并吡喃酮二聚体的抗氧化活性实验：
1、实验材料
1.1、受试样品
苯并吡喃酮二聚体用甲醇溶解，配成2mg/mL的溶液。
1.2、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液
新配制的0.2mg/mL DPPH的甲醇溶液。
1.3、其他材料
酶标板，酶标仪。
2、实验方法
将样品溶解于甲醇中，配制成质量浓度为2mg/mL的溶液。首先，向酶标板的第一排和第二排每孔中依次加入100μL甲醇。其次，在两排的第一孔中各加入100μL待测样品，用移液枪将其混合均匀，吸取100μL加到每排的第2个孔中，再将第2孔中的液体混合均匀，吸取100μL加到每排的第3个孔，按此法操作至第11个孔，吸取100μL溶液弃去，最后一孔不加样品作为空白对照。最后，向第一排每孔中加入100μL配制好的DPPH溶液，第二排每孔中加入100μL甲醇。将上述酶标板放置在室温、避光条件下反应30min后将酶标仪波长设置成517nm测定所测化合物的吸光度。每组平行测3次，以Vc作为阳性对照。
计算自由基清除率：自由基清除率＝[1-(Ai-Aj)/A0]x100％，其中Ai为DPPH溶液加待测样品溶液的吸光度；Aj为甲醇溶液加待测样品溶液的吸光度；A0为甲醇溶液加DPPH溶液的吸光度。因所测定化合物的浓度和其对DPPH自由基的清除率呈线性关系，故以自由基清除率为纵坐标，样品浓度为横坐标可建立量效关系曲线，通过量效关系曲线可求出自由基清除率为50％时样品的浓度(IC50)。
3、实验结果
结果见表4，结果显示，苯并吡喃酮二聚体具有一定的抗氧化活性，IC50值为426.15μg/mL。
表4苯并吡喃酮二聚体自由基清除率测试结果
Figure GDA0001685716230000121

Claims (2)

1.一种苯并吡喃酮二聚体在制备抑制细菌或真菌药物上的应用，其特征在于，所述苯并吡喃酮二聚体的化学结构式为：
Figure FDA0002379551860000011
所述苯并吡喃酮二聚体的制备方法包括以下步骤：
(1)在菌种培养基中对猫儿屎内生真菌塔宾曲霉DS37进行菌种培养；
(2)在发酵培养基中对步骤(1)中获得的菌种进行发酵培养，然后用石油醚、乙酸乙酯和甲醇浸提若干次，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，滤液减压浓缩，得到粗品浸膏；
(3)将步骤(2)得到的粗品浸膏在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为1:0:0,0:1:0,0:1:1,0:0:1的石油醚/乙酸乙酯/甲醇洗脱剂进行洗脱，得到A-D四个组分；
(4)将步骤(3)得到的B组分在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为100:0,100:20,100:50,100:100,100:200,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B1-B6六个组分，B3组分继续在硅胶色谱柱上，用体积梯度为100:0,100:20,100:50,100:70,100:90,100:100,100:120,100:140,100:150,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B3.1-B3.10十个组分，B3.5组分静置纯化，得到苯并吡喃酮二聚体。
2.根据权利要求1所述的苯并吡喃酮二聚体的应用，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌。
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