CN113234674B - 一种t细胞活化扩增的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于促进T细胞活化的方法，是将不同细胞因子处理的肿瘤细胞添加至T细胞培养环境中。本发明的方法包括将不同细胞因子处理的肿瘤细胞添加至T细胞培养环境中，并由此促进T细胞活化，其中所述细胞因子包含但不限于IFNγ、IFNα、TNFα和IL‑6分子中一种或多种的组合。活化的T细胞可用于制备用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。通过细胞因子处理的肿瘤细胞其HLA‑I类分子显著上调，促使其肿瘤相关抗原和/或新抗原被进一步大量提呈；从而促进T细胞活化，并诱导肿瘤特异性T细胞活化后的克隆扩增，显著提高其IFNγ分泌水平，以及对肿瘤细胞的杀伤能力。

Description

一种T细胞活化扩增的方法及其应用
技术领域
本发明属于人体免疫细胞培养技术领域，具体涉及一种T细胞活化扩增的方法及其应用，包括将不同细胞因子处理的肿瘤细胞添加至T细胞培养环境中，来促进T细胞的活化及扩增。
背景技术
恶性肿瘤是导致人类死亡的重大原因之一，在肿瘤发生发展进程中，肿瘤细胞逃逸免疫系统攻击可能是造成疾病进展的关键，因此提高抗肿瘤的免疫治疗可能是彻底清除肿瘤细胞的方法之一。现今研究普遍认为，恶性肿瘤的发生与机体免疫功能的抑制有着密切关联。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是浸润在肿瘤组织周围的淋巴细胞，其受到肿瘤表面抗原的刺激而被激活，是近年来肿瘤免疫治疗的研究热点之一。
因机体免疫功能及局部微环境的影响，体内肿瘤组织中存在的TIL细胞数量较少，活力低下。已有研究表明，TIL细胞在体外可被白介素IL-2等细胞因子诱导活化并扩增。继Rosenberg等首次报道了TIL细胞良好的抗肿瘤效果后，又有不少关于临床应用于治疗恶性肿瘤、恶性胸腹腔积液的研究见诸报道。
目前在对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的扩增研究中，使用最多的是使用IL-2、anti-CD3单克隆抗体等细胞因子对TIL细胞进行活化扩增。此外，CD8+T细胞分化亚群如图1所示，Naive CD8+T细胞依次分化为stem cell memory T细胞(TSCM)；T central memory细胞(TCM)；T effector memory细胞(TEM)；以及T effector细胞(TEFF)。通过细胞表面标志物：L-selectin、CD45RO、CD45RA和CCR7将其鉴定。随着CD8+T的分化，其效应功能增加，而其记忆和扩增能力降低。各阶段的活化需要合适的抗原刺激，抗原刺激过低导致应答无能，不能促进其分化；抗原刺激过强导致其分化过度，大部分成为TEFF，其体内存活时间短，扩增能力差，细胞因子分泌水平低。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于促进T细胞活化的方法，包括以不同的细胞因子处理肿瘤细胞以调节肿瘤相关抗原和/或促进肿瘤抗原在肿瘤细胞表面的递呈表达，将不同细胞因子处理的肿瘤细胞添加至T细胞培养环境中，并由此促进T细胞活化。其中所使用的细胞因子包含但不限于IFNγ、IFNα、TNFα和IL-6分子中一种或多种的组合。同时，在T细胞培养环境中添加不同的细胞因子，包括促进T细胞激活的第二信号激动剂如激活型anti-CD28单克隆抗体，或者肿瘤坏死因子家族的因子如4-1BBL重组蛋白或者激活型anti-4-1BB单克隆抗体。其中所述T细胞包括外周血获得的T细胞，实体肿瘤组织获得的TIL细胞，或体液(包括胸腔或者腹腔积液)中获得的T细胞。本发明方法培养获得的T细胞可用于肿瘤的治疗和/或预防癌症的复发，或是与其他抗肿瘤治疗方案组合使用。
本发明首先提供一种T细胞的活化培养方法，是将不同细胞因子处理的肿瘤细胞添加至T细胞培养环境中；
所述的细胞因子为IFNγ、IFNα、TNFα或IL-6分子中一种或几种；
优选的，所述细胞因子为IFNγ，其中IFNγ处理肿瘤细胞的时间4-120h。
所述的肿瘤细胞，为原代肿瘤或HLA分型匹配的肿瘤细胞系；
更进一步的，所述的HLA分型匹配的肿瘤细胞系优选为HLA-A位点分型纯合子的肿瘤细胞系，其中HLA-A位点等位基因型别是T细胞HLA-A位点等位基因型别之一。
更进一步的，肿瘤细胞系优选为上皮或内皮来源的肿瘤细胞系，例如肺癌、胃癌、乳腺癌细胞系。
本发明还提供一种活化的T细胞，是使用本发明所提供的方法激活培养的；
本发明再一个方面还提供一种组合物，包含有上述方法培养的T细胞和其它T细胞的活化剂、生长因子、诱导剂，和/或可以包含MHC-I/II类限制性多肽。
所述的T细胞，为TIL细胞或者外周血分离的T细胞。
本发明提供了一种用于促进T细胞活化及刺激T细胞增殖的方法，包括将不同细胞因子处理的肿瘤细胞添加至T细胞培养环境中，并由此促进T细胞活化，其中所述细胞因子包含但不限于IFNγ、IFNα、TNFα和IL-6分子中，一种或多种的组合。同时，在T细胞培养环境中添加不同的细胞因子，包括促进T细胞激活的第二信号激动剂如激活型anti-CD28单克隆抗体，或者肿瘤坏死因子家族的因子如4-1BBL重组蛋白或者激活型anti-4-1BB单克隆抗体。活化的T细胞可用于制备用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。通过细胞因子处理的肿瘤细胞其HLA-I类分子显著上调，促使其肿瘤相关抗原被进一步大量提呈；从而促进TIL细胞活化，并诱导肿瘤特异性T细胞活化后的克隆扩增，显著提高其IFNγ分泌水平，以及对肿瘤细胞的杀伤能力。
附图说明
图1：CD8+T细胞分化亚群图；
图2：不同来源的原代肿瘤细胞，采用不同浓度的IFNγ处理后HLA-I分子表达的上调比例图，结果表明IFNγ能有效刺激原代肿瘤HLA-I分子的表达上调，上调百分比在30％-400％不等。其中600-1000ng/mL浓度处理达到峰值并饱和，48h组的效果优于24h处理组。
图3：不同来源的肿瘤细胞系，采用不同浓度的IFNγ处理后在不同时间点上HLA-I分子表达的上调比例图，结果表明IFNγ能有效刺激上皮和内皮来源的肿瘤细胞系(如A549、BT549、MKN45、HCC827)HLA-I分子的表达上调。其中300-1500ng/mL之间的IFNγ浓度处理达到峰值并饱和，48h左右的处理的效果优于24h处理的效果。
图4：肿瘤细胞系A549、MKN45、HCC827，采用600ng/mL浓度的IFNγ处理后在0-120h不同时间点上HLA-I分子表达的上调比例图，结果表明IFNγ能有效刺激HLA-I分子的表达上调；不同时间点上HLA-I分子的表达明显有一个处理时间的相关性。但是随着处理时间的延长肿瘤细胞的增殖明显受到抑制，并被诱导凋亡，尤其在72h和之后的时间点尤为明显。所以综合考虑IFNγ处理48-72h是处理肿瘤细胞系的最佳时间点。
图5：原代培养的TIL细胞与IFNγ处理或未处理的原代肿瘤混合后72h检测IFNγ分泌水平图，结果表明TIL细胞经过与IFNγ处理的原代肿瘤混合后，显著提高了其对肿瘤靶细胞的IFNγ分泌水平。
图6：原代培养的TIL细胞与IFNγ处理或未处理的原代肿瘤混合后72h检测对CD45-肿瘤细胞的杀伤水平图，结果表明TIL细胞经过与IFNγ处理的原代肿瘤混合后，显著提高了其对肿瘤靶细胞的IFNγ分泌水平。
图7：添加anti-CD28单克隆抗体后对原代培养的TIL细胞与IFNγ处理或未处理的原代肿瘤混合后72h IFNγ分泌的影响图，结果表明TIL细胞经过与IFNγ处理的原代肿瘤混合后，显著提高了其对肿瘤靶细胞的IFNγ分泌水平，表明添加anti-CD28单克隆抗体能进一步促进其IFNγ分泌水平的提高。
图8：添加anti-CD28单克隆抗体后对原代培养的TIL细胞与IFNγ处理或未处理的原代肿瘤混合后48h对IFNγ分泌的影响图，结果表明TIL细胞经过与IFNγ处理的原代肿瘤混合后，显著提高了其对肿瘤靶细胞的IFNγ分泌水平。
图9：HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理，与HLA-A匹配的CD8+的PBMC混合，评价对杀伤的影响；
图10：HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理，与HLA-A匹配的CD8+的PBMC混合，评价对FNγ的分泌水平的影响；
图11：HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理，与HLA-A匹配的CD8+的PBMC混合后72h，各组细胞在显微镜下的情况，结果表明T细胞经过与IFNγ处理的HCC827肿瘤细胞系混合后，显著提高了其对肿瘤靶细胞的杀伤，肿瘤细胞数量显著降低，以及IFNγ分泌水平的显著提高(相比较其他各组)，表明HLA-A位点配型匹配细胞系可以代替原代肿瘤，在IFNγ处理后发挥同样的促进作用；
图12：HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理组MHC-I分子表达水平图；
图13：添加不同细胞因子后，对HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理、与HLA-A匹配的CD8+的PBMC混合后杀伤效果的影响图；对比未经IFNγ处理的细胞，当CD8+细胞与经过IFNγ处理的肿瘤细胞(MHC-I明显上调)混合后，CD8+细胞的杀伤效果明显增加(对比1组与7组、2组与8组、3组与9组、4组与10组、5组与11组、6组与12组。其中1-6组为经过IFNγ处理48小时的肿瘤细胞，7-12组为空白溶剂处理的细胞)(图A)。结果进一步表明T细胞与经过IFNγ处理的肿瘤细胞系混合后，能显著提高其对肿瘤靶细胞的杀伤，肿瘤细胞数显著降低(图B)。同时表明添加anti-4-1BB单抗和/或anti-CD28单抗，能在原有基础上进一步促进T细胞杀伤水平。
图14：添加不同细胞因子后，对HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理、与HLA-A匹配的CD8+的PBMC混合后杀伤效果的影响图；对比未经IFNγ处理的细胞，当CD8+细胞与经过IFNγ处理的肿瘤细胞(MHC-I明显上调)混合后，CD8+细胞和Tscm亚群总细胞数明显增加(对比1组与7组、2组与8组、3组与9组、4组与10组、5组与11组、6组与12组。其中1-6组为经过IFNγ处理48h的肿瘤细胞，7-12组为空白溶剂处理的细胞)(图A-B)；结果表明通过IFNγ上调MHC-I表达及增加肿瘤新抗原的递呈对TCR激活的效果；同时表明添加anti-4-1BB单抗和/或anti-CD28单抗，能在原有基础上进一步促进T细胞的绝对数的增加(上方图A)，同时也显著促进了Tscm细胞绝对数的增加(下方图B)。
图15：添加不同细胞因子后，对HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理、与HLA-A匹配的CD8+的PBMC混合后IFNγ分泌效果的影响图。对比未经IFNγ处理的细胞，当CD8细胞与经过IFNγ处理的的肿瘤细胞(MHC-I明显上调)混合后，IFNγ的分泌明显增加(对比1组与7组、2组与8组、3组与9组、4组与10组、5组与11组、6组与12组。其中1-6组为经过IFNγ处理48h的肿瘤细胞，7-12组为空白溶剂处理的细胞)；结果进一步表明T细胞与经过IFNγ处理的HCC827肿瘤细胞系混合后，促进了其IFNγ分泌水平的显著提高；同时表明添加anti-4-1BB单抗和/或anti-CD28单抗，能在原有基础上进一步促进T细胞的IFNγ分泌水平，具有协同作用。
具体实施方式
在本发明中使用细胞因子处理肿瘤细胞，之后将处理后的肿瘤细胞添加至T细胞培养环境中，并选择性添加其它促进T细胞活化的第二信号(如激活CD28信号通路的anti-CD28单抗，激活4-1BB信号通路的anti-4-1BB单抗，也可以是激活OX40等其他肿瘤坏死因子通路的因子或者抗体)，及第三信号因子(如IL-2，也可以是其它受体家族细胞因子，如IL-7，IL-15，IL-21等)，由此促进了T细胞的活化增殖。对T细胞的活化不仅包括T细胞的活化，还包括T细胞的诱导与生长。
在本发明中，促进T细胞的活化不仅包括T细胞的活化，还包括T细胞的诱导与生长；通过增加T细胞的诱导、生长或活化而活化免疫系统。因此，本发明用于活化T细胞的方法可促进T细胞对肿瘤细胞的特异性和杀伤作用，促进T细胞在肿瘤治疗中的作用。同时，本方法刺激T细胞增殖能有效减少T细胞制备时间。
可通过测量细胞因子诸如IFNγ和白介素等的产量和分泌量而确定T细胞的活化。
本发明所述的肿瘤细胞，为原代肿瘤或HLA分型匹配的肿瘤细胞系。
本发明中肿瘤细胞的分离，以及T细胞的培养方法可以采用本领域常用的方案，其一种具体的方法如下：
1、肿瘤组织块采用胶原酶I、DNA酶、透明质酸酶的混合液消化后，采用美天旎CD45细胞分选磁珠，分选CD45阳性细胞，进行常规TIL细胞培养扩增(添加IL-2 6000U/ml)。
2、同时收集CD45阴选细胞，阴选细胞1×106/mL的细胞浓度铺种6孔板，每孔1mL。同时添加600ng/mL IFNγ量，采用Gibco AIM-V培养基，10％人AB血清，1×双抗，2mM谷氨酰胺。然后置于37℃5％CO2浓度培养箱内培养处理48h。
3、将常规培养扩增的TIL细胞与处理后的原代肿瘤按不同细胞比例进行混合。按常规TIL细胞培养扩增方法继续培养。
更进一步的，所述的HLA分型匹配的肿瘤细胞系优选为HLA-A位点分型纯合子的肿瘤细胞系。该HLA-A位点纯合子肿瘤细胞系的HLA-A位点等位基因型别，是共培养T细胞HLA-A位点等位基因型别之一。肿瘤细胞系优选为上皮或内皮来源的肿瘤细胞系，例如肺癌、胃癌、乳腺癌细胞系。
采用HLA-A位点配型匹配细胞系及后续的T细胞培养，其一种方法如下：
1、肿瘤组织块采用胶原酶I、DNA酶、通明质酸酶的混合液消化后，进行常规TIL细胞培养扩增。
2、取少量T细胞约1×105细胞，进行HLA分型检测。
3、根据HLA分型结果，选用由对应HLA-A位点单体型之一的纯合子肿瘤细胞系。例如：HLA分型结果A位点为HLA-A*11:01/A*33:03，则可选用HCC-827肿瘤细胞系(HLA-A*11:01纯合子)或SNU-620肿瘤细胞系(HLA-A*33:03纯合子)。
4、选用的肿瘤细胞系1×106/mL的细胞浓度铺种6孔板，每孔1mL。同时添加600ng/mL IFNγ量，采用Gibco AIM-V培养基，10％人AB血清，1×双抗，2mM谷氨酰胺。然后置于37℃5％CO2浓度培养箱内培养处理48h。
5、将外周血分离的T细胞或者常规培养扩增的TIL细胞与处理后的原代肿瘤按不同细胞比例进行混合；按常规TIL细胞培养扩增方法继续培养。
本发明所使用的细胞因子，包含有IFNγ、IFNα、TNFα、IL-6分子中一种或几种；
本发明所涉及的T细胞，优选为TIL细胞或者外周血分离的T细胞；
本发明还提供一种组合物，包含有上述方法培养的T细胞和其它T细胞的活化剂、生长因子、诱导剂，和/或可以包含MHC-I/II类限制性多肽。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：原代肿瘤CD45-Epcam+细胞用不同浓度IFNγ刺激培养
1)不同来源的人源肿瘤组织块采用胶原酶I、DNA酶、通明质酸酶的混合液消化后，采用美天旎CD45细胞分选磁珠，收集CD45阴选细胞。流式分析CD3、CD4、CD8、CD107a、IFNγ起始情况，以及流式分析CD45、CD16、CD19、EPCAM、HLA起始情况；并评价CD45+与CD45-的细胞比例。
2)将CD45阴选细胞按1×106/mL的细胞浓度铺种6孔板，每孔1mL；同时添加不同浓度的IFNγ量，采用Gibco AIM-V培养基，10％人AB血清，1×双抗，2mM谷氨酰胺；然后置于37℃、5％CO2浓度的培养箱内培养处理48h。
3)流式分析CD45、CD16、CD19、EPCAM、HLA-I在不同类群细胞上的表达情况，重点分析CD45-Epcam+原代肿瘤上HLA-I的表达情况。
结果如图2所示，IFNγ能有效刺激原代肿瘤HLA-I分子的表达上调，上调百分比在30％-400％不等；其中600-1000ng/mL浓度处理达到峰值并饱和，48h组的效果优于24h处理组。
实施例2：不同细胞系、不同浓度IFNγ刺激后HLA-I上调百分比
1)不同肿瘤细胞系分别以0.5×106/mL的细胞浓度铺种6孔板，每孔1mL；同时添加600ng/mL IFNγ，采用1640培养基，10％人AB血清，1×双抗，2mM谷氨酰胺。然后置于37℃、5％CO2浓度培养箱内培养处理48h。
2)流式分析HLA-I在不同肿瘤细胞系上的表达情况。
结果如图3表明，IFNγ能有效刺激肿瘤细胞系(A549、BT549、MKN45、HCC827)HLA-I分子的表达上调，上调百分比在100％-500％不等。其中300-1500ng/mL之间的IFNγ浓度处理达到峰值并饱和，48h左右的处理的效果优于24h处理的效果。
实施例3:不同细胞系、固定浓度IFNγ刺激后在不同时间下的HLA-I上调百分比
1)不同肿瘤细胞系分别以0.5×106/mL的细胞浓度铺种6孔板，每孔1mL；同时添加600ng/mL IFNγ，采用1640培养基，10％人AB血清，1×双抗，2mM谷氨酰胺。然后置于37℃、5％CO2浓度培养箱内培养处理对应的时间。
2)流式分析：在不同的时间点收获细胞，流式分析HLA-I在不同肿瘤细胞系上的表达情况。
结果如图4所示，IFNγ能有效刺激HLA-I分子的表达上调。不同时间点上HLA-I分子的表达明显有一个处理时间的相关性。但是随着处理时间的延长肿瘤细胞的增殖明显受到抑制，并被诱导凋亡，尤其在72h和之后的时间点尤为明显，所以综合考虑IFNγ处理48-72h是处理肿瘤细胞系的最佳时间点。
实施例4：IFNγ刺激的肿瘤细胞促进T细胞IFNγ分泌水平的检测
1)原代肿瘤样本LA2020111701实验
原代肿瘤样本LA2020111701，采用胶原酶I、DNA酶、通明质酸酶的混合液消化后，采用CD45磁珠分选，收集获得CD45+细胞和CD45-细胞；CD45+细胞采用常规TIL培养技术进行扩增培养；CD45-细胞经IFNγ(600ng/ml)刺激48h后与扩增培养的CD45+细胞混合，并添加对应细胞因子，分组如表1所示。
表1：实施例实验分组方案表
Figure GDA0003108727720000101
结果表明TIL细胞经过与IFNγ处理的原代肿瘤混合后，显著提高了TIL细胞对肿瘤靶细胞的杀伤能力，肿瘤细胞数显著降低，IFNγ分泌水平显著提高(相比较其他各组)，其中混合72h组最为明显(图5、图6)。
2)原代肿瘤样本LA2020111901实验
原代肿瘤样本LA2020111901，采用胶原酶I、DNA酶、透明质酸酶的混合液消化后，采用CD45磁珠分选，收集获得CD45+细胞和CD45-细胞；CD45+细胞采用常规TIL培养技术进行扩增培养。CD45-细胞经IFNγ(600ng/ml)刺激48h后与扩增培养的CD45+细胞混合，并添加对应细胞因子；分组如表2所示。
表2：实施例实验分组方案表
Figure GDA0003108727720000111
结果表明TIL细胞经过与IFNγ处理的原代肿瘤混合后，显著提高了其对肿瘤靶细胞的杀伤，肿瘤细胞数显著降低，以及IFNγ分泌水平的显著提高(相比较其他各组，图7)。
3)原代肿瘤样本LA2020112601实验
原代肿瘤样本LA2020112601，采用胶原酶I、DNA酶、通明质酸酶的混合液消化后，采用CD45磁珠分选，收集获得CD45+细胞和CD45-细胞；CD45+细胞采用常规TIL培养技术进行扩增培养；CD45-细胞经IFNγ(600ng/ml)刺激48h后与扩增培养的CD45+细胞混合，并添加对应细胞因子，分组如表3所示。
表3：实施例实验分组方案表
Figure GDA0003108727720000112
结果表明TIL细胞经过与IFNγ处理的原代肿瘤混合后，显著提高了其对肿瘤靶细胞的杀伤活性，肿瘤细胞数显著降低；IFNγ分泌水平显著提高(1组与3组、2组与4组)，表明混合48h也是很好的处理时间点(图8)。
4)HLA#16实验：HCC827经IFNγ处理，与CD8+T细胞混合培养，并评价对CD8+T杀伤效果的促进作用：
代号NL供者的HLA-A分型结果为A*11:01/A*33:03，HCC827为HLA*A位点A*11:01/A*11:01纯合子；NL外周血分离获得的PBMC，磁珠分选CD8+细胞，同时冻存阳选和阴选细胞(1×107/mL密度)。
HCC827细胞按1×105/mL的浓度铺种6孔板，添加600ng/mL的IFNγ，采用1640培养基、10％FBS、1×双抗、1×谷氨酰胺；然后37℃处理48h后，取一部分流式HLA-ABC-APC染色检测HCC827细胞上MHC-I分子表达情况，结果表明MHC-I分子表达在HCC827上被诱导显著上调。
HCC827细胞与NL CD8+细胞混合前，弃去上清，再用PBS洗3遍以去除添加的IFNγ，再加入1mL 1640培养基、10％FBS、双抗、1×谷氨酰胺。HCC827细胞消化一孔计数，即为起始的HCC827细胞数。
复苏冻存的CD8+细胞，与处理过的HCC827肿瘤细胞系按1:1效靶比加入，培养基采用1640培养基、10％FBS、双抗、1×谷氨酰胺，终体积2mL。再加入对应的Anti-CD28抗体和IL-2。
实验的分组如表4所示。
表4：实施例实验分组方案表
Figure GDA0003108727720000121
结果表明T细胞经过与IFNγ处理的HCC827肿瘤细胞系混合后，显著提高了其对肿瘤靶细胞的杀伤效率(详见图9、图11对比1组与2组)，肿瘤细胞数显著降低，以及IFNγ分泌水平的显著提高(相比较其他各组)，表明HLA-A位点配型匹配细胞系与原代肿瘤效果一致，在IFNγ处理后发挥同样的促进作用(图9、图10、图11)。
5)HLA#17实验：HCC827经IFNγ处理，与CD8+T细胞混合培养，添加不同细胞因子在共培养体系内，并评价对CD8+T杀伤效果的促进作用：
HCC827细胞按0.2×105/mL的浓度铺种24孔板24个孔，每孔1mL，一组添加600ng/mL IFNγ量，另一组不做处理。采用1640培养基、10％FBS、双抗、1×谷氨酰胺。
HCC827细胞与NL PBMC细胞混合前，弃去上清，再用PBS洗2-3遍以去除添加的IFNγ，再加入1mL 1640培养基、10％FBS、双抗、1×谷氨酰胺。
HCC827细胞消化一孔计数，即为起始的HCC827细胞数。
复苏冻存的NL PBMC细胞，与处理过的HCC827肿瘤细胞系按1:1效靶比加入，培养基采用：1640培养基、10％FBS、双抗、1×谷氨酰胺，终体积2mL。再加入对应的anti-CD28抗体、anti-4-1BB抗体和IL-2。共设置12组，3个时间点24h、48h和72h(表5)。
表5：实施例实验分组方案表
Figure GDA0003108727720000131
在37℃培养72h后，计数各组细胞扩增的差异。分别在37℃培养72h后，取一部分细胞进行流式分析CD45、CD8、CD107a、HLA、7-AAD表达变化情况。评价各组CD45-细胞各群比例评价杀伤效果；ELISA检测不同时间点IFNγ分泌水平。
结果进一步表明T细胞经过与IFNγ处理的HCC827肿瘤细胞系混合后，显著提高了其对肿瘤靶细胞的杀伤，肿瘤细胞数显著降低，以及IFNγ分泌水平的显著提高。同时表明添加4-1BB单抗和/或CD28单抗，能在原有基础上进一步促进T细胞的杀伤水平，以及T细胞的绝对数的增加，同时也显著促进了Tcm和Tscm细胞绝对数的增加(图12-15)。其中图12表明HCC827细胞系采用IFNγ处理能显著提高其MHC-I分子表达水平。图13是添加不同细胞因子后，对HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理、与HLA-A匹配的CD8+的PBMC混合后杀伤效果的影响图；对比未经IFNγ处理的细胞，当CD8+细胞与经过IFNγ处理的肿瘤细胞(MHC-I明显上调)混合后，CD8+细胞的杀伤效果明显增加(对比1组与7组、2组与8组、3组与9组、4组与10组、5组与11组、6组与12组。其中1-6组为经过IFNγ处理48h的肿瘤细胞，7-12组为空白溶剂处理的细胞，图13A)。结果进一步表明T细胞经过与IFNγ处理的肿瘤细胞系混合后，能显著提高了其对肿瘤靶细胞的杀伤效果增加两倍以上(图13B)。
图14是添加不同细胞因子后，对HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理、与HLA-A匹配的CD8+的PBMC细胞增长的变化；对比未经IFNγ处理的细胞，当CD8+细胞与经过IFNγ处理的的肿瘤细胞(MHC-I明显上调)混合后，CD8+和Tscm亚群总细胞数明显增加(对比1组与7组、2组与8组、3组与9组、4组与10组、5组与11组、6组与12组。其中1-6组为经过IFNγ处理48小时的肿瘤细胞，7-12组为空白溶剂处理的细胞)(图A-B)；结果表明通过IFNγ上调MHC-I表达及增加肿瘤新抗原的递呈对TCR激活的效果刺激CD8细胞及Tscm细胞增殖；同时表明添加anti-4-1BB单抗和/或anti-CD28单抗，能在原有基础上进一步促进T细胞的绝对数的增加(上方图A)，同时也显著促进了Tscm细胞绝对数的增加(下方图B)。
图15是添加不同细胞因子后，对HCC827细胞系采用IFNγ处理或未处理、与HLA-A匹配的CD8+的PBMC混合后IFNγ分泌效果的影响图。对比未经IFNγ处理的细胞，当CD8细胞与经过IFNγ处理的的肿瘤细胞(MHC-I明显上调)混合后，IFNγ的分泌明显增加(对比1组与7组、2组与8组、3组与9组、4组与10组、5组与11组、6组与12组。其中1-6组为经过IFNγ处理48h的肿瘤细胞，7-12组为空白溶剂处理的细胞)；结果进一步表明T细胞经过与IFNγ处理的HCC827肿瘤细胞系混合后，促进了其IFNγ分泌水平的显著提高；同时表明添加anti-4-1BB单抗和/或anti-CD28单抗，能在原有基础上进一步促进T细胞的IFNγ分泌水平，具有协同作用。

Claims (3)

1.一种T细胞的活化培养方法，其特征在于，所述的方法是将IFNγ处理的肿瘤细胞添加至T细胞培养环境中进行T细胞培养；所述的T细胞培养环境中还添加有激活型anti-CD28单克隆抗体和/或anti-CD137激活型单克隆抗体；
所述的IFNγ的添加浓度为300-600ng/mL，处理肿瘤细胞的时间为48-72h；
所述的肿瘤细胞为HLA分型匹配的肿瘤细胞系，且HLA分型匹配的肿瘤细胞系为HLA-A位点分型纯合子的肿瘤细胞系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞系为上皮或内皮来源的肿瘤细胞系。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的T细胞为TIL细胞或外周血分离的T细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103502439B (zh) * 2011-04-13 2016-10-12 因缪尼卡姆股份公司 用于抗原特异性t细胞增殖的方法
AU2016333873A1 (en) * 2015-10-06 2018-05-17 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treatment of metastatic and refractory cancers and tumors
CN110093315B (zh) * 2019-05-07 2020-06-19 北京安溢生物科技有限公司 外周血记忆t细胞培养方法
CN110938594A (zh) * 2019-09-12 2020-03-31 夏建川 一种功能增强型til细胞的培养方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104651311A (zh) * 2014-09-03 2015-05-27 深圳市茵冠生物科技有限公司 制备dc-ctl的试剂盒及其应用

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