CN107164323A - 一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，包括以下步骤：(1)从脐血或成人外周血中分离出单个核细胞，进行体外培养；同时，分离出的血浆用于制备自体血清添加物；(2)对体外培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激；(3)培养3天后，根据细胞的生长情况，进行补液操作；培养14天后，获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群，检测细胞表型。本发明能够解决未经培养的MNC中特异杀伤性T淋巴细胞比例低、淋巴细胞增殖能力低、经典CIK培养肿瘤细胞杀伤性细胞占比低等问题，获得具有高比例CD3+CD56+细胞和CD16+CD56+细胞的淋巴细胞亚群。

Description

一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法
技术领域
本发明涉及一种淋巴细胞的培养方法，特别涉及利用自体血清及相关细胞因子构建CD3+CD56+细胞和CD16+CD56+细胞扩增的共同优势环境，获得具高纯度、高杀伤肿瘤细胞能力的细胞亚群(CD3+CD56+&CD16+CD56+)的培养方法。
背景技术
经典CIK细胞培养体系所制取的细胞能将在血液中占比1％～5％CD3+T淋巴细胞进行扩增，而所扩增的细胞除5％至20％的CIK细胞外，多为对肿瘤细胞无显著杀伤能力的辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+)或抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)。如何获得更多的对肿瘤细胞具高杀伤能力的淋巴细胞亚群是当前的研究热点之一。
活化后的NK细胞可产生细胞因子IFN-γ，IFN-γ在对CIK细胞杀伤性的(CD3+CD56+占比)影响中起关键作用；自体血清内存在IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等因子可促使NK细胞活化。
发明内容
针对上述现有技术，为了弥补经典CIK细胞培养中除CD3+CD56+阳性细胞外的，杀伤肿瘤细胞亚群含量低的不足，本发明提供了一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法。本发明利用自体血清及相关因子构建CD3+CD56+和CD16+CD56+细胞扩增共同优势环境，提供了一种步骤简单、操作稳定的体外扩增培养单个核细胞、获得具有高杀伤肿瘤细胞亚群(CD3+CD56+&CD16+CD56+)的培养方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，包括以下步骤：
(1)从脐血或成人外周血中分离出单个核细胞，进行体外培养；同时，分离出的血浆用于制备自体血清添加物；
优选的，采用淋巴细胞无血清培养基KBM581(该培养基是现有技术中已有的商品化培养基，可常规市场购买得到)进行体外培养；
(2)对体外培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激：向含单个核细胞的培养物中加入终浓度为1000IU/ml的INF-γ；再添加培养物总体积5％(体积百分数)的自体血清添加物，37℃、5.0％CO2条件下培养；24小时后，加入OKT3抗体、IL-2和IL-1a，OKT3抗体终浓度为50ng/ml，IL-2终浓度为1000IU/ml，IL-1a终浓度为100IU/mL，37℃、5.0％CO2条件下继续培养；
所述自体血清添加物，是通过以下方法制备得到的：将步骤(1)中分离出的血浆，于56℃环境下静置30min，然后于-20℃环境下静置10min；3000rpm离心10min，收集血清，添加IL-12至终浓度为1000pg/ml，即得自体血清添加物；
(3)培养3天后，观察细胞增殖情况，细胞活化过程形成典型的细胞团，根据细胞的生长情况，进行补液操作，使细胞生长密度保持在1×106～2×106/ml；培养14天后，获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群，检测细胞表型。
进一步地，所述步骤(1)的具体操作如下：
①将采血袋或采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，抽取采血袋或采血管中的脐血或成人外周血，分装到50ml离心管中，每管血液30ml，800g下离心10min；
②离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中，吸至距分界面0.5cm处为止，若剩余血细胞多于15ml，则取上层15ml血细胞置于新的离心管中，弃去底部剩余红细胞；
③用生理盐水按照1∶1的比例稀释血细胞，取装有15mlficoll的离心管并倾斜，缓慢的将混匀的血细胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，血样与ficoll的比例不超过2∶1，于常温低升降速(离心机有升速和降速，低升降速指升降速小)，500g下离心20min；
④离心后液面分为4层，从底部分别为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，500g下离心10min；
⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用10ml生理盐水重悬，再加生理盐水至40ml，混匀，取样用于细胞数量检测、细胞亚群含量检测，500g下离心10min；
⑥离心后弃上清，用淋巴细胞无血清培养基KBM581将细胞密度调整为1×106～2×106/ml，加入到培养瓶中，37℃、5.0％CO2浓度培养箱中培养。
进一步地，所述步骤(3)的具体操作如下：
培养第4天，添加50ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物；所述扩增用培养基为含浓度为1000IU/mlIL-2的KBM581培养基；
培养第5天，添加100ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物；
培养第6天，添加200ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物；
培养第8天，添加400ml扩增用培养基，不再添加血清添加物；
培养第10天，添加800ml扩增用培养基；
培养第12天，添加400ml扩增用培养基；
培养第14天，收获细胞，进行细胞数量检测、细胞亚群含量检测。
本发明在现有细胞治疗细胞培养模式的基础上，发明了一种体外扩增培养单个核细胞，获得具有高杀伤肿瘤细胞亚群的培养方法。本发明取50～100ml脐血或自体外周血进行单个核细胞分离，采用无血清培养基、自体血清添加物和细胞因子组合进行淋巴细胞的培养，记录淋巴细胞的增殖能力、检测细胞的亚群含量。本发明能够解决未经培养的MNC中特异杀伤性T淋巴细胞比例低、淋巴细胞增殖能力低、经典CIK培养肿瘤细胞杀伤性细胞占比低等问题，获得具有高比例CD3+CD56+细胞和CD16+CD56+细胞的淋巴细胞亚群。
附图说明
图1：1号样本提取后(未添加因子与血清添加物)的单个核细胞镜下(100×)示意图。
图2：1号样本进行活化刺激24h后样本镜下(100×)示意图。
图3：1号样本细胞进行活化刺激3天后细胞镜下(100×)示意图。
图4：1号样本培养14天后流式结果示意图，其中，A：标记物CD45细胞表型图；B：标记物CD3细胞表型图；C：标记物CD3CD8细胞表型图；D：标记物CD3CD56细胞表型图；E：标记物CD4CD25细胞表型图。
图5：3份样本细胞D0天(扩则培养前)、D14(扩增培养后)天流式结果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
本发明中一些常用的术语说明如下：IL：白细胞介素；MNC：单个核细胞；OKT3：CD3单克隆抗体；INF-γ：γ-干扰素。
实施例1：获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法
步骤如下：
(1)从脐血(1号样本)获取单个核细胞，并进行细胞亚群含量检测，具体操作如下：
①将采血袋经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，抽取血袋中的血液分装到50ml离心管中，每管血液30ml，经800g下离心10min；
②离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中。吸至距分界面0.5cm处为止，若剩余血细胞多于15ml，则取上层15ml血细胞置于新的离心管中，弃去底部剩余红细胞；
③用生理盐水按照1∶1的比例稀释血细胞，取装有15mlficoll的离心管并倾斜，缓慢的将混匀的血细胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，血样与ficoll的比例不超过2∶1，于常温低升降速，500g下离心20min；
④离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，500g下离心10min；
⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用10ml生理盐水重悬，再加生理盐水至40ml，混匀，取样用于细胞数量检测、细胞亚群含量检测，500g下离心10min；
⑥离心后弃上清，用淋巴细胞无血清培养基KBM581将细胞密度调整为1～2×106/ml，加入到培养瓶中，37℃、5.0％CO2浓度培养箱中培养，如图1所示。
(2)将培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激，具体操作如下：
①将步骤(1)收集的血浆置于56℃，30min后，放入-20℃，10min，最终3000rpm，10min收集血清，根据血清中的IL-12浓度测定，添加IL-12至标准浓度1000pg/ml，制取获得血清添加物；
②加入INF-γ，终浓度为1000IU/ml，添加自体血清添加物浓度为5％，放入37℃，5.0％CO2培养箱培养，培养24h后，如图3所示；
③24h后，加入OKT3抗体、IL-2和IL-1a，OKT3抗体终浓度在50ng/ml，IL-2终浓度1000IU/ml，IL-1a终浓度100IU/mL，放入37℃，5.0％CO2培养箱培养，OKT3抗体开始刺激以后，静置活化3天，3天后，如图3所示。
(3)根据细胞生长情况，进行传代操作：
培养第4天，添加50ml扩增用培养基(含浓度为1000IU/mlIL-2的KBM581培养基)，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物。
培养第5天，添加100ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物。
培养第6天，添加200ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物。
培养第8天，添加400ml扩增用培养基，不再添加血清添加物。
培养第10天，添加800ml扩增用培养基。
培养第12天，添加400ml扩增用培养基。
培养第14天，收获细胞，进行细胞数量检测、细胞亚群含量检测，如图4所示。
按照同样的培养方法，对2号样本血液、3号样本血液(均为脐血)进行了实验，比较细胞D0天(扩增培养前)、D14(扩增培养后)天流式结果，结果如表1、图5所示，图5是表1的柱状图，采用本发明的细胞培养方法，14天后CD3+CD56+&CD3-CD16+CD56+细胞亚群含量相比培养前有大幅度提高。
表1
序号 样本说明 CD3+CD56+所占比例 CD3-CD16+CD56+所占比例
1 1号样本培养前 0.56％ 1.21％
2 2号样本培养前 0.97％ 1.48％
3 3号样本培养前 0.17％ 0.78％
4 1号样本培养14天后 28.68％ 16.80％
5 2号样本培养14天后 37.88％ 13.76％
6 3号样本培养14天后 16.15％ 20.61％

Claims (4)

1.一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)从脐血或成人外周血中分离出单个核细胞，进行体外培养；同时，分离出的血浆用于制备自体血清添加物；
(2)对体外培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激：向含单个核细胞的培养物中加入终浓度为1000IU/ml的INF-γ；再添加培养物总体积5％的自体血清添加物，37℃、5.0％CO2条件下培养；24小时后，加入OKT3抗体、IL-2和IL-1a，OKT3抗体终浓度为50ng/ml，IL-2终浓度为1000IU/ml，IL-1a终浓度为100IU/mL，37℃、5.0％CO2条件下继续培养；
所述自体血清添加物，是通过以下方法制备得到的：将步骤(1)中分离出的血浆，于56℃环境下静置30min，然后于-20℃环境下静置10min；3000rpm离心10min，收集血清，添加IL-12至终浓度为1000pg/ml，即得自体血清添加物；
(3)培养3天后，根据细胞的生长情况，进行补液操作，使细胞生长密度保持在1×106～2×106/ml；培养14天后，获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群。
2.根据权利要求1所述的获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采用淋巴细胞无血清培养基KBM581进行体外培养。
3.根据权利要求1所述的获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体操作如下：
①将采血袋或采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，抽取采血袋或采血管中的脐血或成人外周血，分装到50ml离心管中，每管血液30ml，800g下离心10min；
②离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中，吸至距分界面0.5cm处为止，若剩余血细胞多于15ml，则取上层15ml血细胞置于新的离心管中，弃去底部剩余红细胞；
③用生理盐水按照1∶1的比例稀释血细胞，取装有15ml ficoll的离心管并倾斜，缓慢的将混匀的血细胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，血样与ficoll的比例不超过2∶1，于常温低升降速，500g下离心20min；
④离心后液面分为4层，从底部分别为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，500g下离心10min；
⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用10ml生理盐水重悬，再加生理盐水至40ml，混匀，取样用于细胞数量检测、细胞亚群含量检测，500g下离心10min；
⑥离心后弃上清，用淋巴细胞无血清培养基KBM581将细胞密度调整为1×106～2×106/ml，加入到培养瓶中，37℃、5.0％CO2浓度培养箱中培养。
4.根据权利要求1所述的获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体操作如下：
培养第4天，添加50ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物；所述扩增用培养基为含浓度为1000IU/ml IL-2的KBM581培养基；
培养第5天，添加100ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物；
培养第6天，添加200ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物；
培养第8天，添加400ml扩增用培养基，不再添加血清添加物；
培养第10天，添加800ml扩增用培养基；
培养第12天，添加400ml扩增用培养基；
培养第14天，收获细胞。
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