KR101782963B1

KR101782963B1 - 연골 손상 치료제 및 그 제조 방법

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Publication number: KR101782963B1
Application number: KR1020167005246A
Authority: KR
Inventors: 코이치로 츠지; 미노루 모리카와; 사토시 마에다; 유이 키타야마; 아키 오모리; 진 창 샤오; 신이치 하세가와; 유키오 카토; 타카시 마쯔시다; 마사토 타카오; 신야 미키; 켄 인나미; 야스후미 타카하시
Original assignee: 가부시키가이샤 투셀
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2017-09-28
Also published as: KR20160035069A; CN105392489A; US20160166734A1; JPWO2015016357A1; EP3028722B1; EP3028722A4; AU2014297188B2; WO2015016357A1; US10507266B2; AU2014297188A1; EP3028722A1; JP6191694B2; CN105392489B

Abstract

본 발명에 따른 연골 손상 치료제의 제조 방법은, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서, 간엽계 줄기세포를 증식시키는 증식 공정과, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기세포, 등장 보존제 및 세포 보호제를 혼합하는 혼합 공정을 포함하고 있다. 이 제조 방법에 의해 바람직하게 연골 조직을 재생하는 연골 손상 치료제가 제공된다.

Description

연골 손상 치료제 및 그 제조 방법{CARTILAGE-DAMAGE TREATMENT AGENT AND METHOD FOR PRODUCING SAME}

본 발명은 연골 손상 치료제 및 그 제조 방법에 관한 것이고, 또한 당해 제조 방법에 이용되는 배지용 첨가제, 배양 배지 및 키트, 그리고 이들을 이용한 배양 방법에 관한 것이다.

무릎 등의 관절 부위에서 활막의 내측에 있는 가동성 관절에 존재하는 연골 조직은, Ⅱ형 콜라겐, 프로테오글리칸 및 물 등에 의해 구성되고, 관절 연골(유리연골)로서 정의된다. 한편, 관절 부위 이외에 존재하는 연골 조직의 구성 성분으로는 Ⅱ형 콜라겐보다 I형 콜라겐이 많다.

관절 연골은 수복능이 낮고, 한 번 손상되어 버리면 자연 재생되는 것은 거의 불가능하다. 외상성 관절 연골 손상을 입어 강한 동통 및/또는 관절 수종이 반복되는 경우에는, 내복 진통제에 의한 치료 및/또는 히알루론산의 관절내 주사가 행해지지만, 이들은 모두 대증요법으로 근본적인 치료 방법은 아니다. 이 때문에, 현재 일반적인 치료 방법으로는, 관절 연골을 외과적으로 재생하는 방법이 채용되고 있다. 주된 외과적 치료 방법으로서 비특허 문헌 1에 개시된 골천공법 및 자가골 연골주 이식술이 알려져 있다.

비특허 문헌 1의 골천공법은, 연골 손상부의 뼈에 드릴로 구멍을 뚫어 골수로부터 출혈시켜, 골수에 함유된 간엽계 줄기세포(MSC: Mesenchymal Stem Cell)를 손상부로 유도해, 연골 및 연골에 유사한 조직이 재생되는 것을 기대하는 방법이다. 자기 조직을 희생하지 않고, 관절경을 이용해 간편하게 실시 가능하기 때문에, 지금까지 연골 손상의 제1 치료법으로서 세계적으로 널리 행해지고 있다.

여기에서, 줄기세포는 자기 복제능과 분화능을 갖는 세포이다. 이와 같은 줄기세포로는, 예를 들면 배아 줄기세포(ES 세포), 인공 다능성줄기세포(iPS 세포), 및 성체 줄기세포 등이 알려져 있다. 상기 성체 줄기세포로는, 예를 들면 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 및 간엽계 줄기세포 등이 있다. 상기 ES 세포 및 상기 iPS 세포는 모든 조직으로 분화할 수 있는 다분화능을 갖고 있다. 상기 조혈 줄기세포는 혈액 세포로 분화하는 능력을 갖고, 상기 신경 줄기세포는 신경세포로 분화하는 능력을 갖고 있다. 또한, 상기 간엽계 줄기세포는 골수 등의 조직 중에 존재하고, 지방세포, 골세포 및 연골 세포 등으로 분화하는 다분화능을 갖는 줄기세포로서 알려져 있다.

비특허 문헌 1의 자가골 연골주 이식술은, 자가 관절 연골의 건상부(健常部)로부터 뼈와 연골을 원주상으로 한 덩어리 도려내, 손상부에 자가 이식(Auto graft)하는 방법으로, 이식된 유리 연골과 그 간극의 섬유성 연골에 의한 수복이 가능하지만, 건상부 조직의 손상 및 이식 면적의 제한이 결점이다.

또한, 관절 연골 손상의 다른 외과적 치료법으로 자가 배양 연골 이식술이 알려져 있다. 자가 배양 연골 이식술은, Brittberg 등에 의해 1994년에 보고된 방법으로, 환자 자신의 비하중부 무릎관절 연골로부터 소량의 연골 조직을 채취해, 분리 및 단층 배양한 연골 세포를 연골 손상부에 이식하는 방법이다.

관절 연골 손상의 또 다른 외과적 치료법으로, 특허 문헌 1에 개시되어 있는 인간 조직 공학(Tissue engineering)을 이용한 치료 방법이 알려져 있다. 이 치료 방법에서는, 연골 세포 또는 줄기세포 등의 세포원과 스캐폴드 소재를 조합해 관절 연골 손상 부위에 이식하여 관절 연골의 재생을 촉진한다.

또한, 오사카 대학 의학부 부속 병원에서 실시되고 있는 인간 줄기세포 임상 연구 '관절 연골 병변에 대한 자기 활막 간엽계 줄기세포 유래 삼차원 인공 조직 치료법'(2012년 1월 25일자로 계획 인가)은, 외상성 슬연골 손상 환자를 대상으로 하고 있다. 당해 임상 연구는 관절내 조직으로부터 단리한 활막 줄기세포를 배양해 생물학적 자극을 주어 입체적인 조직편을 얻은 후, 연골 손상 부위에 이식하는 것이다.

특허 문헌 1: 국제 공개 제2005/012512호 팸플릿(2005년 2월 10일 공개)

비특허 문헌 1: 정형외과 Knack ＆ Pitfalls 무릎관절 외과의 요점과 맹점, 쿠로사카 마사히로, 2005

그러나, 전술한 바와 같은 종래의 간엽계 줄기세포를 이용한 관절 연골 손상의 치료 방법에는, 다음과 같은 문제가 있다.

즉, 비특허 문헌 1에 개시된 골천공법에 대해, 최근의 보고에서는 치료 부위의 연골 조직이 경시적으로 유리 연골로부터 섬유 연골로 치환되어 조직이 손상되기 쉬워지는 것, 및, 치료 후 2년 정도는 임상 증상의 개선이 양호하지만, 5년 이상 경과하면 동통이 재발해, 환자의 활동성이 저하되는 것이 분명해지고 있어, 장기간의 치료 효과는 기대하기 어렵다. 또한, 비특허 문헌 1의 골천공법에서는, 연골 조직에 혈액을 유입시키기 위해 구멍을 뚫은 뼈는 수복되지 않는다.

또한, 비특허 문헌 1의 자가골 연골주 이식술은, 건상부의 연골 조직을 희생해야 하여 중고령의 환자를 대상으로 했을 경우, 연령 증가에 수반해 건강한 연골의 범위가 작아지기 때문에, 연골 손상 치료에 필요한 양의 연골 조직을 채취할 수 없다는 문제가 있다. 또한, 비특허 문헌 1의 자가골 연골주 이식술에서는, 환자로부터 취득한 이식편이 신선한 경우에는 이식편의 생물 활성이 유지되지만, 이식편을 동결한 경우에는 생물 활성이 사라져 버린다. 따라서, 이식 때마다 신선한 이식편을 환자로부터 취득할 필요가 있어, 환자의 부담이 증가한다.

자가 배양 연골 이식술은, 골천공법 및 자가골 연골주 이식술에서의 상기 문제를 해결할 수 있는 치료법이지만, 이전에는 일본에서 보험 진료로서 인정되지 않았었다. 그러나, 2012년 7월, 환자 자신의 연골 조직으로부터 분리한 연골 세포를 아테로콜라겐겔에 포매(embedding)해 배양한 자가 배양 연골인 JACC(등록상표)이 일본에서 승인되었다. 마찬가지로, 미국에서는 Carticel(등록상표)이 1997년 8월에, 유럽에서는 ChondroCelect(등록상표)가 2009년 10월에 승인되었다. 따라서, 자가 배양 연골 이식술은 외상성 연골 결손증에 대한 새로운 치료법으로서 주목받지만, 그 밖에 치료법이 없고 또한 연골 결손 면적이 4㎠ 이상인 연골 결손 부위를 적응 범위로 하고 있기 때문에 적응 범위가 매우 한정적이다.

또한, 특허 문헌 1의 치료 방법에서는, 관절 연골의 재생에 시간이 걸리고, 게다가 반복적으로 이식을 실시할 필요가 있다.

또한, 관절 연골 병변에 대한 자기 활막 간엽계 줄기세포 유래 삼차원 인공 조직 치료법에서는, 자가 유래의 간엽계 줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양해 이용하기 때문에, 환자로부터 세포를 취득할 필요가 있어 환자의 부담이 증가할 뿐만 아니라, 후술하는 바와 같이 혈청에 의한 세포 오염 등의 리스크가 있다.

간엽계 줄기세포 등의 세포를 관절 연골 손상 치료에 이용하는 경우, 투여하기 전에 세포를 배양하는데, 이때 배지로는, 현재, 동물 혈청(통상 10 내지 15% 소태아 혈청)이 첨가된 배지가 널리 이용되고 있다. 이 혈청은 생체외에서의 세포의 성장 및/또는 증식을 촉진하기 위한 영양원, 또는 호르몬 등의 생리 활성 물질의 공급원으로서 이용되고 있다.

그러나, 혈청은 매우 고가이고, 또한 천연 제품이기 때문에 로트마다 성분의 차가 생긴다. 이 때문에, 세포 증식 효과에 편차가 생기기 쉽다. 또한, 배양 후의 세포로부터 혈청 유래의 단백질 등을 제거하기 위해 정제할 필요가 있어, 작업이 번잡하게 된다. 게다가 혈청 중에 혼입되어 있는 미지의 병원체(바이러스 및 병원성 프리온 등)에 의해 배양 세포가 오염되는 위험성이 있다.

본 발명은 상기 문제점을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 바람직하게 연골을 재생시킬 수 있는, 무혈청 배양한 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제 및 그 제조 방법을 제공하는 것, 또한, 당해 제조 방법에 이용되는 배지용 첨가제, 배양 배지 및 키트, 및 이들을 이용한 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제의 제조 방법은, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서, 간엽계 줄기세포를 증식시키는 증식 공정과, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기세포, 등장 보존제 및 세포 보호제를 혼합하는 혼합 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제는, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서 배양된 간엽계 줄기세포와, 등장 보존제와, 세포 보호제를 함유하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 배양 배지는, 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 무혈청의 배양 배지이며, 본 발명에 따른 배지용 첨가제를 함유하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 배양 방법은, 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 배양 방법이며, 본 발명에 따른 배양 배지에서 간엽계 줄기세포를 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 키트는, 본 발명에 따른 배지용 첨가제를 적어도 구비하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제의 제조 방법은, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서, 간엽계 줄기세포를 증식시키는 증식 공정과, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기세포, 등장 보존제 및 세포 보호제를 혼합하는 혼합 공정을 포함하므로, 무혈청 배양한 간엽계 줄기세포를 함유하여, 연골 손상 부위를 바람직하게 재생시킬 수 있는 연골 손상 치료제를 제조할 수 있는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 메커니즘을 설명하는 모식도면이다.
도 2는 정상 연골의 염색상의 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (b)는 톨루이딘 블루 염색상, (c)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 3은 MSC 5×10⁵개 및 락트산 링거 1㎖를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 4는 MSC 5×10⁵개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 5는 MSC 5×10⁵개, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 6은 MSC 5×10⁵개, 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 7은 MSC 5×10⁶개 및 락트산 링거 1㎖를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 8은 MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 9는 MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 10은 MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 11은 MSC 5×10⁷개 및 락트산 링거 1㎖를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상이며, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 12는 MSC 5×10⁷개, 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 13는 락트산 링거 1㎖만을 함유하는 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 14는 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 톨루이딘 블루 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 15는 MSC 5×10⁷개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 type Ⅱ 콜라겐 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 16은 MSC 5×10⁷개, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 type Ⅱ 콜라겐 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상, (e)는 톨루이딘 블루 염색상을 각각 나타낸다.
도 17은 세포 투여액을 단회 투여한 관절내의 건상 연골의 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (b)는 톨루이딘 블루 염색상, (c)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 18은 세포 투여액을 단회 투여한 관절내의 건상 활막의 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (b)는 톨루이딘 블루 염색상, (c)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 19은 가장 결과가 좋았던, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 개체의 type Ⅱ 콜라겐 면역 염색을 실시한 현미경 화상(약확대)을 나타내는 도면이다.
도 20은 가장 결과가 좋았던, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 개체의 type Ⅱ 콜라겐 면역 염색을 실시한 현미경 화상(강확대)을 나타내는 도면이다.
도 21은 연골 재생이 전혀 이루어지지 않은, 락트산 링거 1㎖만을 함유하는 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 개체의 type Ⅱ 콜라겐 면역 염색을 실시한 현미경 화상(약확대)을 나타내는 도면이다.
도 22는 연골 재생이 전혀 이루어지지 않은, 락트산 링거 1㎖만을 함유하는 투여액을 연골 반층 결손 부위에 단회 투여한 개체의 type Ⅱ 콜라겐 면역 염색을 실시한 현미경 화상(강확대)을 나타내는 도면이다.
도 23은 MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 3회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 type Ⅱ 콜라겐 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타낸다.
도 24는 MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 3회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상을 나타내는 도면이다. (a)는 육안 화상, (b)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (c)는 type Ⅱ 콜라겐 염색상, (d)는 사프라닌 O 염색상, (e)는 톨루이딘 블루 염색상을 각각 나타낸다.
도 25는 연골 분화용 배지에서 배양한 MSC에서의, 연골 특이적 유전자(type Ⅱ collagen, aggrecan, 및, sox9)의 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 26은 세포 투여액이 투여된 관절강 내로부터 채취한 MSC에서, 미분화 마커 유전자 발현을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. S는 무혈청 배양한 결과, D는 유혈청 배양한 결과, P는 계대수를 각각 나타낸다.
도 27은 MSC를 5종류의 보존액[락트산 링거액 1㎖, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 용액, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 용액, 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 용액, 및, 무혈청 배지(STK2 배지)] 중에서 보존했을 때의 경시적 세포 생존율을 나타내는 도면이다. (a)는 MSC가 5×10⁵개이고 37℃의 인큐베이터 내에 보존했을 때의 결과, (b)는 MSC가 5×10⁵개이고 4℃의 냉장 조건에서 보존했을 때의 결과, (c)는 MSC가 5×10⁶개이고 4℃의 냉장 조건에서 보존했을 때의 결과를 각각 나타낸다.
도 28은 MSC 5×10⁵개를 3종류의 보존액[락트산 링거액 1㎖, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 용액, 및, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 용액] 중에서 37℃의 인큐베이터 내에 24시간 보존했을 때의 세포 생존율을 나타내는 도면이다.

[1. 연골 손상 치료제의 제조 방법]

본 발명은 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 연골 손상 치료제의 제조 방법은, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서, 간엽계 줄기세포를 증식시키는 증식 공정과, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기세포, 등장 보존제 및 세포 보호제를 혼합하는 혼합 공정을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 경우, '무혈청 배지'란 혈청을 포함하지 않는 배지인 것을 의도하고, '무혈청 배양'이란 혈청을 이용하지 않는 배양인 것을 의도한다.

본 명세서 중에서 '연골 손상 치료제'는, 연골 손상 치료용 재료로서 재생 의료 등에 이용되는, 간엽계 줄기세포를 제재화한 치료약이다. 연골 손상 치료제는 연골 조직 재생제라고 부를 수도 있다. 연골 손상 치료제는 간엽계 줄기세포를 본래 상태인 채로 기능을 변화시키지 않고 제재화한 것 뿐만 아니라, 간엽계 줄기세포를 특정 조건하에서 배양 및 증식시킴으로써 분화능 등의 기능을 향상시킨 세포를 제재화한 것도 포함한다.

(증식 공정)

증식 공정에서는, 간엽계 줄기세포를 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서 배양해 간엽계 줄기세포를 증식시킨다.

〈간엽계 줄기세포〉

간엽계 줄기세포에는 활막세포, 지방세포, 골수, 치조골 및 치근막 등 성인의 조직으로부터 뿐만이 아니라, 태반, 제대혈 및 태아의 여러 가지 세포 등으로부터 단리되는 것도 포함된다. 증식 공정에서 증식시키는 간엽계 줄기세포는 활막, 탯줄, 제대혈, 양막, 골수 및 지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직 유래인 것이 바람직하다.

증식 공정에서 증식시키는 간엽계 줄기세포는, 제조한 연골 손상 치료제를 투여하는 환자의 자가 세포인 것이 바람직하지만, 동종 세포여도 된다. 또한, 증식 공정에서 증식시키는 간엽계 줄기세포는, 인간 간엽계 줄기세포라도 되고, 마우스, 래트, 고양이, 개 등의 비인간 동물 유래 간엽계 줄기세포라도 된다.

각 조직으로부터 간엽계 줄기세포를 단리하는 방법으로는, 종래 공지의 방법을 채용하는 것이 가능하고, 예를 들면 콜라게나아제법에 의해 조직으로부터 간엽계 줄기세포를 바람직하게 분리할 수 있다.

〈무혈청 배지(A)〉

증식 공정에서 이용하는 무혈청 배지(A)를 구성하기 위한 기초 배지는, 당해 분야에서 주지의 동물 세포용 배지라면 특별히 한정되지 않는다. 바람직한 기초 배지로는, 예를 들면 Ham's F12 배지, DMEM 배지, RPMI-1640 배지, 및 MCDB 배지 등을 들 수 있다. 이들 기초 배지는 단독으로 사용되어도 되고, 복수 개를 혼합해 사용되어도 된다. 일 실시 형태에서, 무혈청 배지(A)를 구성하기 위한 기초 배지는 MCDB 배지와 DMEM 배지를 1:1의 비율로 혼합한 배지인 것이 바람직하다.

일 실시 형태에 있어서, 상기 기초 배지에 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 첨가한 무혈청 배지(A)를 증식 공정에 이용하면 된다.

기초 배지에 대한 FGF의 함유량은, 종농도(final concentration)로 0.1 내지 100 ng/㎖인 것이 바람직하고, 3 ng/㎖인 것이 더 바람직하다. 기초 배지에 대한 PDGF의 함유량은, 종농도로 0.5 내지 100 ng/㎖인 것이 바람직하고, 10 ng/㎖인 것이 더 바람직하다. 기초 배지에 대한 TGF-β의 함유량은, 종농도로 0.5 내지 100 ng/㎖인 것이 바람직하고, 10 ng/㎖인 것이 더 바람직하다.

기초 배지에 대한 HGF의 함유량은, 종농도로 0.1 내지 50 ng/㎖인 것이 바람직하고, 5 ng/㎖인 것이 더 바람직하다. 기초 배지에 대한 EGF의 함유량은, 종농도로 0.5 내지 200 ng/㎖인 것이 바람직하고, 20 ng/㎖인 것이 더 바람직하다. 기초 배지에 대한 인지질의 총함유량은, 종농도로 0.1 내지 30 ㎍/㎖인 것이 바람직하고, 10 ㎍/㎖인 것이 더 바람직하다. 기초 배지에 대한 지방산의 총함유량은 기초 배지의 1/1000 내지 1/10인 것이 바람직하고, 1/100인 것이 더 바람직하다.

이와 같은 무혈청 배지(A)를 사용함으로써, 이종 단백질의 혼입을 막으면서 혈청 함유 배지와 동등 이상의 증식 촉진 효과를 얻을 수 있어, 간엽계 줄기세포를 원하는 대로 증식시킬 수 있다.

무혈청 배지(A)가 함유하는 인지질로는, 예를 들면 포스파티드산, 리소포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 포스파디딜 세린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 콜린, 및 포스파티딜 글리세롤 등을 들 수 있고, 이들의 인지질을 단독으로 함유해도 되고, 조합해서 함유해도 된다. 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지(A)는 포스파티드산과 포스파티딜 콜린을 조합해서 함유하고 있어도 되며, 이들의 인지질은 동물 유래여도 되고, 식물 유래라도 무방하다.

무혈청 배지(A)가 함유하는 지방산으로는, 예를 들면, 리놀레산, 올레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 미리스트산, 팔미톨레산, 팔미트산 및 스테아르산 등을 들 수 있고, 이들 지방산을 단독으로 함유해도 되고, 조합해서 함유해도 된다. 또한, 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지(A)는 상기 지방산 이외에 콜레스테롤을 더 함유하고 있어도 무방하다.

본 명세서에서 사용되는 경우, FGF는 섬유아세포 증식 인자(FGF: fibroblast growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자를 의도하고, FGF-2(bFGF)인 것이 바람직하지만, FGF-1 등 다른 FGF 패밀리로부터 선택되어도 무방하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 경우, PDGF는 혈소판 유래 증식 인자(PDGF: platelet derived growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자를 의도하고, PDGF-BB 또는 PDGF-AB인 것이 바람직하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 경우, TGF-β는 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β: transforming growth factor-β) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자를 의도하고, TGF-β3인 것이 바람직하지만, 다른 TGF-β패밀리로부터 선택되어도 무방하다.

본 명세서에서 사용되는 경우, HGF는 줄기세포 증식 인자(HGF: hepatocyte growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자를 의도한다. 본 명세서에서 사용되는 경우, EGF는 상피 증식 인자(EGF: epidermal growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자를 의도한다.

또한, 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지(A)는 결합 조직 증식 인자(CTGF: connective tissue growth factor), 혈관 내피 증식 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor) 및 아스코르브산 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 인자를 더 함유해도 무방하다.

본 명세서에서 사용되는 경우, 아스코르브산 화합물은 아스코르브산(비타민 C) 혹은 아스코르브산-2-인산, 또는 이들과 유사한 화합물이 의도된다.

한편, 무혈청 배지(A)에 함유되는 전술한 증식 인자는, 천연의 것이어도 되고, 유전자 변형에 의해 제조된 것이어도 무방하다.

일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지(A)는 지질 산화 방지제를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 일 실시 형태에서, 무혈청 배지(A)에 함유되는 지질 산화 방지제는 DL-α-토코페롤아세테이트(비타민 E)일 수 있다. 또한, 무혈청 배지(A)는 계면활성제를 더 함유하고 있어도 무방하다. 일 실시 형태에서, 무혈청 배지(A)에 함유되는 계면활성제는 Pluronic F-68 또는 Tween 80일 수 있다.

무혈청 배지(A)는 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 더 함유하고 있어도 무방하다. 본 명세서에서 사용되는 경우, 인슐린은 인슐린 유사 증식 인자여도 되고, 천연의 세포 유래여도 되고, 유전자 변형에 의해 제조된 것이라도 된다. 무혈청 배지(A)는 덱사메타손, 혹은 다른 글루코코르티코이드를 더 함유하고 있어도 무방하다.

증식 공정에서는, 전술한 무혈청 배지(A)에 인간 등의 동물 조직 또는 세포로부터 종래 공지의 방법에 의해 단리된 간엽계 줄기세포를 파종하고, 원하는 수로 증식할 때까지 배양한다. 배양 조건으로는, 배지 1㎖에 대해 1 내지 2×10⁴개의 간엽계 줄기세포를 파종하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 37℃±1℃, 배양 시간은 48 내지 96시간, 또한 5% CO₂ 분위기하인 것이 바람직하다. 이와 같은 조건으로 배양함으로써 분화능을 유지한 간엽계 줄기세포를 효율적으로 대량으로 얻을 수 있다.

증식 공정에서, 배양에 이용하는 배양 용기는 간엽계 줄기세포가 증식할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, Falcon 제품 75㎠ 플라스크, 또는 스미토모 베이크라이트 제품 75㎠ 플라스크 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 단, 세포에 따라서는, 이용하는 배양 용기의 종류에 의해 세포의 증식이 영향을 받는 경우가 있다. 이 때문에, 간엽계 줄기세포를 보다 효율적으로 증식시키기 위해, 증식 공정에서 증식시키는 대상이 되는 간엽계 줄기세포(이하, '증식 대상 세포'라고도 한다)별로 증식에 적합한 배양 용기를 이용해 증식 공정을 행하는 것이 바람직하다.

증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기의 선택 방법으로는, 예를 들면 최적의 배양 용기를 증식 대상 세포에 선택시키는 방법을 들 수 있다. 구체적으로 설명하면, 복수 종류의 배양 용기를 준비하고, 배양 용기의 종류가 다른 것 외에는 동일한 배양 조건으로 증식 대상 세포를 증식시켜, 배양 개시로부터 2주일 후의 세포수를 공지의 방법에 의해 계측해, 세포수가 많은 것으로부터 차례로 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기라고 판단할 수 있다. 또한, 증식 대상 세포의 증식 속도가 빠른 경우는 배양 개시로부터 2주가 경과하기 전이라도, 콘플루언트 상태(confluent state)의 80 내지 90%의 세포수에 도달하는 기간이 짧은 것으로부터 차례로 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기이라고 판단할 수 있다.

한편, 간엽계 줄기세포의 증식에는 세포가 배양 용기에 접착하는 것이 필수 조건이므로, 배양 용기에 대한 증식 대상 세포의 접착이 약한 경우는, 증식 공정에서 상기 무혈청 배지(A)에 세포 접착 분자를 더 함유시키는 것이 바람직하다. 세포 접착 분자로는, 예를 들면 피브로넥틴, 콜라겐 및 젤라틴 등을 들 수 있다. 이들 세포 접착 분자는 한 종류를 단독으로 이용해도 되고, 복수 종류를 조합해서 이용해도 무방하다.

무혈청 배지(A)에 대한 세포 접착 분자의 함유량은, 종농도로 1 내지 50 ㎍/㎖인 것이 바람직하고, 5 ㎍/㎖인 것이 더 바람직하다. 일 실시 형태에서, 세포 접착 분자로서 피브로넥틴을 이용하는 경우는, 무혈청 배지(A)에 대한 피브로넥틴의 종농도가 5 ㎍/㎖가 되도록 첨가함으로써 배양 용기에 대한 증식 대상 세포의 접착 효율을 향상시킬 수 있다.

혹은, 상기 세포 접착 분자가 코팅되어 있는 배양 용기를 이용해 증식 대상 세포를 증식시켜도 무방하다.

또한, 증식 공정에서는, 간엽계 줄기세포를 적어도 1회 계대해도 무방하다. 간엽계 줄기세포는 스캐폴드 의존적으로 증식하므로, 간엽계 줄기세포가 국소적으로 치우쳐 증식하는 등의 경우에는, 증식 공정 도중에 간엽계 줄기세포를 계대함으로써 배양 조건을 개선할 수 있다.

간엽계 줄기세포의 계대 방법으로는 특별히 한정되지 않고, 종래 공지의 간엽계 줄기세포의 계대 방법을 이용해 계대할 수 있다. 계대 후의 간엽계 줄기세포 상태가 양호한 것으로부터, 상기 증식 공정에서는, 계대를 실시하는 경우에 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제를 이용해 상기 간엽계 줄기세포를 박리하는 것이 바람직하다. 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제로는, 예를 들면 Accutase(등록상표)(Innovative Cell Technologies, Inc.) 및 TrypLE(등록상표) Select(1X)(Life Technologies Corporation) 등을 들 수 있다.

여기에서, 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제로서 Accutase를 이용하는 경우의 계대 방법의 일례를 설명한다. (i) 내지 (ⅵ)의 순서에 따라 간엽계 줄기세포를 박리하고 계대한다. 한편, 이하에 설명하는 계대 방법에서는, 배양 용기로서 T-25 플라스크(Falcon 제품)를 이용한 것으로 가정한다.

(i) 세포층을 PBS(-) 5㎖를 이용해 세정한다.

(ⅱ) Accutase를 2㎖ 첨가한다.

(ⅲ) 실온에서 2분 정도 가만히 두고, 세포의 박리를 확인 후 원심관으로 세포 부유액을 옮긴다.

(ⅳ) 배양 용기에 PBS(-)를 7㎖ 첨가해 플라스크 바닥면을 씻는다.

(v) 상기 (ⅲ)의 원심관에 상기 (ⅳ)의 용액을 옮겨, 1500 rpm(200×g)로 5분간 원심분리한다.

(ⅵ) 상청액을 제거하고, 5,000 개/㎠의 파종 농도로 무혈청 배지(A)를 이용해 파종한다.

한편, 증식 공정에는, 인간 등의 동물 조직으로부터 채취한 후 계대 1회째(P1) 이후의 간엽계 줄기세포를 제공하는 것이 바람직하다.

또한, 증식 공정에 있어서는, 분화능을 유지한 채로 간엽계 줄기세포를 증식시키는 것이 바람직하다. 즉, 증식 공정에서는, 미분화이면서, 또한, 지방세포, 골세포 및 연골 세포 등으로 분화하는 분화능을 갖는 간엽계 줄기세포를 무혈청 배지(A)에서 배양하고, 배양 후의 간엽계 줄기세포도 미분화이면서 또한 분화능을 갖고 있다. 이에 따라, 분화능을 갖는 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제조하는 것이 가능하고, 이 연골 손상 치료제를 연골 손상 부위에 투여함으로써, 연골 손상 부위에 분화능을 유지한 간엽계 줄기세포를 투여할 수 있다.

한편, 간엽계 줄기세포가 분화능을 갖는지 여부는, 증식시킨 간엽계 줄기세포를, 골분화용 배지, 지방 분화용 배지 및 연골 분화용 배지 등의 배지에서 배양하고, 각각 골아세포, 지방세포, 및 연골 세포 등으로 분화 유도시키고 있는지 여부를 평가함으로써 확인할 수 있다. 또한, 증식시킨 간엽계 줄기세포를 각종 CD 항체와 반응시켜, 플로우 사이토미터(flow cytometer)로 형광 강도를 측정함으로써 표면 항원 발현을 평가하는 방법, 또는 증식시킨 간엽계 줄기세포에서 미분화 마커 유전자(nanog, sox2, oct3/4)와 내재성 컨트롤 유전자(Gapdh)를 측정함으로써 미분화 마커 유전자 발현을 평가하는 방법 등에 의해서도, 간엽계 줄기세포가 분화능을 갖고 있는지 여부를 확인할 수 있다.

(혼합 공정)

혼합 공정에서는, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기세포, 등장 보존제 및 세포 보호제를 혼합해 세포 투여액을 조제한다. 이 세포 투여액이 연골 손상 치료제이다.

혼합 공정에서 혼합하는 간엽계 줄기세포는 증식 공정에서 증식한 간엽계 줄기세포이며, 종래 공지의 방법에 의해 배지로부터 박리한 간엽계 줄기세포이다. 배지에서 간엽계 줄기세포를 박리하는 방법으로는, 전술한, 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은, Accutase 등의 세포 박리제를 이용하는 방법을 들 수 있다.

또한, 혼합 공정에서 혼합하는 간엽계 줄기세포는, 증식 공정에서 증식시킨 후, 동결 보존(예를 들면, 영하 80℃)한 간엽계 줄기세포를 융해시킨 것이라도 무방하다. 동결 보존한 간엽계 줄기세포를 이용하는 경우에는, 사전에 그 증식능을 확인하고, 융해시킨 후에 무혈청 배지(A)에 의해 프리콘플루언트 상태(preconfluent state)가 될 때까지 배양해, 1회 계대하고 나서 이용해도 무방하다. 또한, 동결 보존한 간엽계 줄기세포를 이용하는 경우에는, 분화능을 갖는 것을 사전에 확인하는 것이 바람직하다.

혼합 공정에 있어서, 세포 투여액(즉, 연골 손상 치료제)에서의 간엽계 줄기세포는 1×10⁵ 개/㎖ 이상, 1×10⁸ 개/㎖ 이하가 되도록 혼합하는 것이 바람직하고, 1×10⁶개/㎖ 이상, 5×10⁷ 개/㎖ 이하가 되도록 혼합하는 것이 보다 바람직하고, 5×10⁶개/㎖ 이상, 5×10⁷ 개/㎖ 이하가 되도록 혼합하는 것이 더욱 바람직하고, 5×10⁶ 개/mL가 되도록 혼합하는 것이 가장 바람직하다. 간엽계 줄기세포수가 상기 범위내가 되도록 혼합함으로써 제조한 연골 손상 치료제를 연골 손상 부위에 투여했을 때, 바람직하게 연골의 재생을 촉진할 수 있다.

〈등장 보존제〉

혼합 공정에서 혼합하는 등장 보존제로는, 예를 들면 락트산 링거액을 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 락트산 링거액으로는 상업적으로 입수 가능한 것을 사용 가능하고, 예를 들면 락트산 링거 솔루락트(SOLULACT) 수액(Telmo 제품)을 바람직하게 사용할 수 있다. 등장 보존제는 일종을 단독으로 이용해도 되고, 복수 종류를 조합해서 이용해도 무방하다.

〈세포 보호제〉

혼합 공정에서 혼합하는 세포 보호제로는, 예를 들면 히알루론산을 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 세포 보호제로서 사용하는 히알루론산의 평균 분자량은 1500000 이상, 3900000 이하인 것이 바람직하다. 세포 보호제는 일종을 단독으로 이용해도 되고, 복수 종류를 조합해서 이용해도 무방하다.

혼합 공정에서, 세포 투여액(즉, 연골 손상 치료제)에서의 세포 보호제의 농도는 0%보다 많고 0.5% 이하가 되도록 혼합하는 것이 바람직하고, 0.005% 이상, 0.1% 이하가 되도록 혼합하는 것이 보다 바람직하고, 0.01% 이상, 0.1% 이하가 되도록 혼합하는 것이 더욱 바람직하고, 0.01%가 되도록 혼합하는 것이 가장 바람직하다.

따라서, 혼합 공정에서 혼합하는 등장 보존제 및 세포 보호제의 양은 혼합하기 전의 세포 보호제의 농도에 따라 결정된다. 즉, 혼합 공정에서, 간엽계 줄기세포, 등장 보존제 및 세포 보호제를 혼합해 조제되는 세포 투여액의 양이, 예를 들면 1㎖이고, 혼합 전의 세포 보호제의 농도가 1%일 때, 세포 투여액 중의 세포 보호제의 농도를 0.1%로 하기 위해 세포 보호제 100㎕ 및 등장 보존제 900㎕를 혼합한다. 또한, 세포 투여액의 양이, 예를 들면 1㎖이고, 혼합 전의 세포 보호제의 농도가 1%일 때, 세포 투여액 중의 세포 보호제의 농도를 0.01%로 하기 위해, 혼합 공정에서는 세포 보호제 10㎕ 및 등장 보존제 990㎕를 혼합한다.

본 발명자들은, 세포 보호제를 고농도로 함유하는 경우보다, 전술한 바와 같이, 세포 보호제를 저농도로 함유하는 경우가, 연골 손상 치료제의 연골 재생능이 우수한 것을 알아냈다. 즉, 세포 보호제의 농도를 상기 범위 내에서 혼합함으로써 간엽계 줄기세포의 기능 저하를 방지해, 보다 바람직하게 연골의 재생을 촉진할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 조제한 세포 투여액에서의 세포 보호제의 농도가 0.01% 이상, 0.1% 이하인 경우, 당해 세포 투여액의 보존에 수반하는 간엽계 줄기세포의 생존율 저하가 억제되는 것을 알아냈다. 즉, 세포 보호제의 농도를 상기 범위 내가 되도록 혼합함으로써 보다 장기적인 보존에 견딜 수 있는 연골 손상 치료제를 제공할 수 있다.

혼합 공정에서는, 연골 손상 치료제의 연골 재생 기능을 변화시키지 않는 한, 다른 성분을 혼합해도 무방하다.

혼합 공정에서 조제한 세포 투여액은, 연골 손상 부위에 투여할 때까지 일정 기간, 예를 들면 4 내지 37℃에서 보존되어도 무방하다. 보존하는 경우에는, 냉장 보존(4℃)하는 것이 보다 바람직하다. 세포 보호제의 농도가 0.01% 이상, 0.1% 이하인 경우, 4℃에서 1개월 이상 보존해도, 60% 이상의 세포 생존율을 유지할 수 있다. 또한, 상기 농도인 경우, 37℃에서 보존해도, 24시간에서 70% 이상의 세포 생존율을 유지할 수 있다. 일정 기간 보존한 경우에는, 투여 전에 간엽계 줄기세포가 분화능을 갖고 있는 것을 확인하는 것이 바람직하다.

(사전 증식 공정)

본 발명에 따른 제조 방법에서는, 상기 증식 공정의 전에, 간엽계 줄기세포를, FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(B)에서 배양해, 간엽계 줄기세포를 증식시키는 사전 증식 공정을 더 실시해도 무방하다.

〈무혈청 배지(B)〉

무혈청 배지(B)는 HGF 및 TGF-β를 함유하지 않는다는 점에서, 상기 '증식 공정'의 항에서 설명한 무혈청 배지(A)와는 상이하다. HGF 및 TGF-β 이외의 성분(FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산) 및 기초 배지에 대해서는, 상기 '증식 공정'의 항에서 무혈청 배지(A)에 관해 설명했던 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.

또한, 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지(B)는, 무혈청 배지(A)와 마찬가지로, 지질 산화 방지제를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 무혈청 배지(B)는 계면활성제를 더 함유하고 있어도 무방하다. 또한, 무혈청 배지(B)는 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 더 함유하고 있어도 무방하다. 또한, 무혈청 배지(B)는 덱사메타손 혹은 다른 글루코코르티코이드를 함유하고 있어도 무방하다. 이들 성분에 대해서도, 상기 '증식 공정'의 항에서 무혈청 배지(A)에 관해 설명한 바와 같으므로, 여기에서는 설명을 생략한다.

한편, 무혈청 배지(B)에 함유되어 있는 상기 성분의 함유량은, 상기 '증식 공정'의 항에서 무혈청 배지(A)에 관해 설명한 함유량의 범위 내이면, 무혈청 배지(A)에 함유되어 있는 각 성분의 함유량과 같아도 되고, 달라도 무방하다.

사전 증식 공정에서는, 전술한 무혈청 배지(B)에 인간 등의 동물 조직으로부터 종래 공지의 방법에 의해 단리된 간엽계 줄기세포를 파종해, 원하는 수로 증식할 때까지 배양한다. 배양 조건으로는, 배지 1㎖에 대해 1 내지 500㎎의 조직편(MSC를 함유한다)을 분리해 간엽계 줄기세포를 파종하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 37℃±1℃, 배양 시간은 3 내지 14일간, 5% CO₂ 분위기하인 것이 바람직하다.

사전 증식 공정에 제공되는 간엽계 줄기세포에 특별히 제한은 없지만, 초기의 간엽계 줄기세포, 즉, 인간 등의 동물 조직으로부터 채취하고 나서 한 번도 계대 배양을 거치지 않은 세포인 것이 바람직하다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 증식 공정에 제공하기 전에 무혈청 배지(B)에서 초기의 간엽계 줄기세포를 미리 증식시킴으로써, 증식 공정에서 얻어지는 간엽계 줄기세포의 수를 극히 현저하게 증폭시키는 것이 가능해진다.

일 실시 형태에 있어서, 사전 증식 공정에서의 간엽계 줄기세포의 배양 방법으로는, 예를 들면 2×10⁵ 개/㎠의 파종 농도로 무혈청 배지(B)에서 간엽계 줄기세포를 파종하고, 그 후 1주일 정도는 파종시 배양액량의 10%의 무혈청 배지(B)를 2일마다 추가로 첨가하고, 세포수가 콘플루언트 상태의 70 내지 80%가 될 때까지 세포를 증식시킨다. 이와 같이 무혈청 배지(B)에서 미리 배양한 간엽계 줄기세포를 증식 공정에 제공함으로써, 분화능을 유지한 간엽계 줄기세포를 효율적으로 대량으로 얻을 수 있다.

또한, 사전 증식 공정에서 간엽계 줄기세포를 보다 효율적으로 증식시키기 위해, 사전 증식 공정에서 증식시키는 대상이 되는 간엽계 줄기세포(이하, ' 사전 증식 대상 세포'라고도 한다)마다 증식에 적합한 배양 용기를 이용해 사전 증식 공정을 실시하는 것이 바람직하다. 전증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기의 선택 방법으로는, 상기 '증식 공정'의 항에서 설명했던 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.

또한, 증식 공정과 마찬가지로, 사전 증식 공정에서는 배양 용기에 대해 전증식 대상 세포의 접착이 약한 경우에, 상기 무혈청 배지(B)에 세포 접착 분자를 더 함유시켜도 무방하다. 상기 세포 접착 분자에 대해서는, 상기 '증식 공정'의 항에서 설명했던 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.

또한, 증식 공정과 마찬가지로, 사전 증식 공정에서는 간엽계 줄기세포를 적어도 1회 계대해도 무방하다. 사전 증식 공정의 도중에 간엽계 줄기세포를 계대함으로써 배양 조건을 개선할 수 있다. 한편, 사전 증식 공정은 초대 배양(P0)에서 계대 3회째(P3)까지의 기간에 실시하는 것이 바람직하다. 사전 증식 공정의 도중에 간엽계 줄기세포를 계대하는 방법 및 사전 증식 공정 후의 세포를 증식 공정에 제공할 때의 계대 방법에 대해서는, 상기 '증식 공정'의 항에서 설명했던 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.

한편, 사전 증식 공정에서는, 간엽계 줄기세포의 접착 또는 증식이 나쁜 경우에, 배양 도중에 배지 중에 1%의 자기 혈청 또는 동종 혈청을 첨가해도 무방하다. 또한, 사전 증식 공정에서는, 배지 중에 항생 물질을 1% 첨가하고, 서서히 그 농도가 낮아지도록 배양해도 무방하다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 제조 방법에 의하면, 무혈청 배지라도 혈청 함유 배지에서 배양한 경우와 동등 또는 그 이상의 속도로 간엽계 줄기세포를 증식시키는 것이 가능할 뿐만 아니라, 증식시킨 간엽계 줄기세포가 분화능을 유지하고 있다. 따라서, 이와 같은 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 환자에게 투여했을 경우, 간엽계 줄기세포에 의한 뛰어난 이식 치료를 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 안정적인 치료를 실현할 수 있다. 또한, 혈청을 이용해 제조한 종래의 세포 제재와 비교해, 혈청의 로트차를 고려할 필요가 없어, 이식 치료에서 안정적인 치유율을 실현할 수 있다.

[2. 연골 손상 치료제]

본 발명은 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제공한다. 본 발명에 따른 연골 손상 치료제는, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서 배양된 간엽계 줄기세포와, 등장 보존제와, 세포 보호제를 함유하고 있다.

(간엽계 줄기세포)

연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포에는, 활막세포, 지방세포, 골수, 치조골 및 치근막 등 성인의 조직으로부터 뿐만이 아니라, 태반, 탯줄, 제대혈 및 태아의 여러 가지 세포 등으로부터 단리되는 것도 포함된다. 증식 공정에서 증식시키는 간엽계 줄기세포는 활막, 탯줄, 제대혈, 양막, 골수 및 지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직 유래인 것이 바람직하다.

연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는, 연골 손상 치료제를 투여하는 환자의 자가 세포인 것이 바람직하지만, 동종 세포라도 무방하다. 또한, 간엽계 줄기세포는 인간 간엽계 줄기세포라도 되고, 마우스, 래트, 고양이, 개 등의 비인간 동물 유래 간엽계 줄기세포라도 무방하다.

연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는, 전술한 무혈청 배지(A)에서 배양해 증식시킨 간엽계 줄기세포이다. 즉, 연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는, 전술한 연골 손상 치료제의 제조 방법에서의 증식 공정에서 증식한 간엽계 줄기세포일 수 있다. 또한, 연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는, 전술한 무혈청 배지(B)에서 배양해 증식시킨 다음, 다시 무혈청 배지(A)에서 배양해 증식시킨 간엽계 줄기세포라도 무방하다. 즉, 연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는, 전술한 연골 손상 치료제의 제조 방법에서의 사전 증식 공정에서 증식한 후에, 증식 공정에서 증식한 간엽계 줄기세포라도 무방하다.

또한, 연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는, 무혈청 배지(A)에서 배양한 후, 세포 박리제를 이용해 배지로부터 박리해 동결 보존(예를 들면, 영하 80℃)한 후에 융해시킨 것이라도 무방하다. 그리고, 연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는, 융해시킨 후에 무혈청 배지(A)에 의해 프리콘플루언트 상태가 될 때까지 배양해, 1회 계대한 것이라도 무방하다.

연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포의 세포수는, 1×10⁵ 개/㎖ 이상, 1×10⁸ 개/㎖ 이하인 것이 바람직하고, 1×10⁶ 개/㎖ 이상, 5×10⁷ 개/㎖ 이하인 것이 보다 바람직하고, 5×10⁶ 개/㎖ 이상, 5×10⁷ 개/㎖ 이하인 것이 더욱 바람직하고, 5×10⁶ 개/mL인 것이 가장 바람직하다. 간엽계 줄기세포수를 상기 범위 내에서 함유하고 있음으로써 연골 손상 치료제를 연골 손상 부위에 투여했을 때, 바람직하게 연골의 재생을 촉진할 수 있다.

연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는 분화능을 유지하고 있는 것이 바람직하다. 즉, 연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는 미분화이며, 또한, 지방세포, 골세포, 연골 세포 등으로 분화하는 분화능을 갖고 있다. 이와 같은 연골 손상 치료제를 연골 손상 부위에 투여함으로써, 연골 손상 부위에 분화능을 유지한 간엽계 줄기세포를 투여할 수 있다.

(등장 보존제)

연골 손상 치료제에 함유되는 등장 보존제로는, 예를 들면 락트산 링거액을 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 락트산 링거액으로는, 상업적으로 입수 가능한 것을 사용 가능하고, 예를 들면 락트산 링거 솔루락트(SOLULACT) 수액(Telmo 제품)을 바람직하게 사용할 수 있다. 연골 손상 치료제는 등장 보존제로서 일종을 단독으로 함유해도 되고, 복수 종류를 조합하여 함유해도 무방하다.

(세포 보호제)

연골 손상 치료제에 함유되는 세포 보호제로는, 예를 들면 히알루론산을 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 세포 보호제로서 사용하는 히알루론산의 평균 분자량은 1500000 이상, 3900000 이하인 것이 바람직하다. 연골 손상 치료제는 세포 보호제로서 일종을 단독으로 함유해도 되고, 복수 종류를 조합하여 함유해도 무방하다.

연골 손상 치료제에 함유되는 세포 보호제의 농도는 0%보다 많고 0.5% 이하인 것이 바람직하고, 0.005% 이상, 0.1% 이하인 것이 보다 바람직하고, 0.01% 이상, 0.1% 이하인 것이 더욱 바람직하고, 0.01%인 것이 가장 바람직하다.

연골 손상 치료제에 함유되는 등장 보존제 및 세포 보호제의 양은, 세포 보호제의 농도에 의해 결정된다. 즉, 연골 손상 치료제 전체의 양이, 예를 들면 1㎖이고, 연골 손상 치료제에 혼합하기 전의 세포 보호제의 농도가 1%일 때, 연골 손상 치료제 중의 세포 보호제의 농도가 0.1%이면, 연골 손상 치료제에는 세포 보호제 100㎕ 및 등장 보존제 900㎕가 함유된다. 또한, 연골 손상 치료제 전체의 양이, 예를 들면 1㎖이고, 연골 손상 치료제에 혼합하기 전의 세포 보호제의 농도가 1%일 때, 연골 손상 치료제 중의 세포 보호제의 농도가 0.01%이면, 연골 손상 치료제에는 세포 보호제 10㎕ 및 등장 보존제 990㎕가 함유된다.

본 발명자들은 세포 보호제를 고농도로 함유하는 경우보다, 전술한 바와 같이, 세포 보호제를 저농도로 함유하는 경우가, 연골 손상 치료제의 연골 재생능이 우수한 것을 알아냈다. 즉, 세포 보호제의 농도를 상기 범위 내에서 함유함으로써 간엽계 줄기세포의 기능 저하를 방지해, 보다 바람직하게 연골의 재생을 촉진할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 세포 보호제의 농도가 0.01% 이상, 0.1% 이하인 경우, 세포 투여액의 보존에 수반하는 간엽계 줄기세포의 생존율 저하가 억제되는 것을 알아냈다. 즉, 세포 보호제의 농도를 상기 범위 내에서 함유함으로써, 연골 손상 치료제는 보다 장기적인 보존에 견딜 수 있다.

연골 손상 치료제는, 그 연골 재생 기능을 변화시키지 않는 한, 다른 성분을 함유하고 있어도 된다.

(연골 손상 치료제의 용도)

본 발명에 따른 연골 손상 치료제는, 연골 손상 부위에 투여해 연골을 재생하기 위해 이용된다. 또한, 연골 손상 치료제는, 뼈를 피복하는 연골이 손상되어 적어도 일부의 뼈가 노출된 전층 손상 부위에 투여해도 되지만, 뼈가 노출되지 않을 정도로 연골의 일부가 손상된 일부 손상 부위, 또는, 연골층의 약 절반이 손상된 반층 손상 부위에 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 연골의 변성부를 제거해 연골 손상 치료제를 투여하는 것도 효과적이다.

연골 손상 치료제는 관절 연골의 손상 부위에 투여하는 것이 가능하고, 예를 들면 무릎관절 연골, 다리 관절 연골 또는 어깨관절 연골 등의 손상 부위에 투여할 수 있다. 또한, 연골 손상 치료제는 추간판의 손상 부위 또는 변성 부위에 투여해, 추간판의 재생 및/또는 수핵 변성의 개선에 이용할 수도 있다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제는, 연골 손상 부위에 1회당 0.5㎖ 이상, 10㎖ 이하 투여하는 것이 바람직하고, 1㎖ 이상, 5㎖ 이하 투여하는 것이 보다 바람직하고, 1㎖ 이상, 3㎖ 이하 투여하는 것이 가장 바람직하다. 이에 따라, 보다 효과적으로 연골 손상 부위의 연골을 재생할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제는, 치료 1개소당 1회 이상, 10회 이하 투여하는 것이 바람직하고, 1회 이상, 5회 이하 투여하는 것이 보다 바람직하고, 1회 이상, 3회 이하 투여하는 것이 가장 바람직하다. 이에 따라, 보다 효과적으로 연골 손상 부위의 연골을 재생할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제를, 치료 1개소당 여러 차례 투여하는 경우, 투여 타이밍으로는 3일 이상, 28일 이하마다 투여하는 것이 바람직하고, 3일 이상, 21일 이하마다 투여하는 것이 보다 바람직하고, 3일 이상, 7일 이하마다 투여하는 것이 가장 바람직하다. 이에 따라, 보다 효과적으로 연골 손상 부위의 연골을 재생할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제의 투여 방법으로는, 연골 손상 치료제를 주사기 등에 의해 관절강 내에 투여하는 방법이 바람직하다. 또한, 연골 손상 치료제를 관절강 내에 적절히 투여하기 위해, 관절경을 이용해 투여 위치를 확인하면서 연골 손상 치료제를 투여해도 된다. 또한, 연골 손상 부위를 깎아 손상 개소를 클리닝한 후에, 연골 손상 치료제를 투여해도 무방하다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 따르면, 연골 손상 부위에 직접 투여함으로써 연골 손상 부위에서의 연골 재생을 촉진할 수 있다. 본 발명자들은 연골 손상 부위에, 무혈청 배양하고, 분화능을 유지한 간엽계 줄기세포와 세포 보호제를 함유하는 연골 손상 치료제를 투여함으로써, 본래 간엽계 줄기세포가 갖는 항염증 작용 및 면역 관용 작용 외에, 이 간엽계 줄기세포의 기능이 세포 보호제에 의해 충분히 보호되어 (i) 간엽계 줄기세포로부터 연골 재생에 기여하는 사이토카인을 매우 바람직하게 방출시킬 수 있는 것, 및, (ⅱ) 간엽계 줄기세포가 연골 손상 부위에 바람직하게 호밍(homing)하는 것을 알아내 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포는, 세포 보호제에 의해 바람직하게 보호되고 있으므로, 도 1에 나타내는 바와 같이, 투여된 연골 손상 부위에서 장기간 생존해, 연골 재생에 기여하는 사이토카인을 계속적으로 방출시키는 것이 가능하고, 또한, 연골 손상 부위에 바람직하게 호밍한다. 도 1은 본 발명의 메커니즘을 설명하는 모식도이다.

그리고, 연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포로부터 방출되는 사이토카인이, 연골 손상 부위에서의 섬유아세포 및 혈관 내피 세포 등의 증식을 자극한다. 이에 따라, 연골 손상 부위에서의 혈관 신생이 개시되어 섬유아세포 및 유연 세포(related cells)가 연골 손상 부위에 집적되고, 지속적으로 세포외 매트릭스가 신생 및 침착된다. 또한, 연골 손상 부위에 호밍한 간엽계 줄기세포가 접착, 증식 및 분화해, 연골 조직을 재생한다.

이와 같이, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 의하면, 연골 손상 치료제에 함유되는 간엽계 줄기세포 자신이, 투여된 연골 손상 부위에서 연골 세포로 분화해 연골 조직을 재생할 뿐만 아니라, 연골 손상 부위에 미분화 상태로 장기간 생존해, 연골 재생에 기여하는 사이토카인을 계속적으로 방출함으로써 연골 재생을 촉진한다. 물론, 간엽계 줄기세포가 갖는 항염증 작용 및 면역 관용 작용이 동종 이식을 가능하게 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제는 등장 보존제를 함유하고 있으므로, 연골 손상 치료제 중의 간엽계 줄기세포의 생존율 저하를 방지해, 연골 손상 치료제를 장기간 보존하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제는 미리 조제한 것을 필요한 때에 환자에게 투여할 수 있으므로, 환자의 부담을 큰 폭으로 저감시킬 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 의하면, 연골 손상 부위에 주사기 등에 의해 투여하는 것만으로 연골을 재생할 수 있으므로, 손상된 연골 조직 이외의 다른 조직을 불필요하게 손상시키지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제는 자가 이식에 의한 치료 뿐만 아니라, 자기 이외의 조직 및 세포를 타인에게 이식하는(도너와 수여자가 다르다) 타가 이식에 의한 치료에 적용하는 것이 가능하다. 또한, 인간 조직 또는 인간 세포를 이용한 동종 타가 이식(allotransplantation) 뿐만 아니라, 인간 이외의 동물 조직 또는 동물 세포를 이용한 이종 이식(xenotransplantation)에도 바람직하게 사용 가능하다고 할 수 있다. 따라서, 환자 자신으로부터 세포를 취득하지 않아도 되기 때문에 환자의 부담이 경감될 뿐만 아니라, 다수의 환자에 대해 적절한 시기에 연골 손상 치료제를 제공할 수 있고, 게다가 한 번의 수술로 치료가 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 의하면, 한 번의 투여로 연골을 재생할 수도 있으므로 반복 치료할 필요가 없어, 육체적, 정신적 및 금전적인 면에서 환자의 부담이 경감된다. 또한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 의하면, 단기간에 확실하게 연골을 재생시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제는, 무혈청 배양한 간엽계 줄기세포를 함유하고 있으므로, 혈청 중에 혼입되어 있는 미지의 병원체(바이러스 및 병원성 프리온 등)가 환자의 체내에 투여될 위험성이 없다. 또한, 혈청은 매우 고가이고, 또한 천연 제품이기 때문에 로트마다 성분의 차이가 생기므로, 세포 증식 효과에 편차가 생기기 쉽지만, 본 발명에서는 혈청을 사용하지 않기 때문에, 이와 같은 문제가 발생하지 않는다. 또한, 배양 후의 간엽계 줄기세포로부터 혈청 유래의 단백질 등을 제거하기 위해 정제를 실시할 필요가 없기 때문에, 작업의 효율화를 도모할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제는, 스캐폴드 프리(scaffold-free)이기 때문에, 기존의 배양 연골 세포 이식술과 같이 건상부의 골막을 채취해 이식부를 피복할 필요가 없다. 따라서, 골막 채취에 기인하는 유해 사상 발현의 리스크가 없다.

한편, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제를 이용한 연골 손상 치료 방법, 및, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제를 이용한 연골 조직 재생 방법에 대해서도, 본 발명의 범주에 포함된다. 연골 손상 치료 방법 및 연골 조직 재생 방법은, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제를, 환자의 전술한 투여 부위에, 전술한 투여량, 투여 횟수 및 투여 타이밍으로 투여하는 투여 공정을 포함한다.

[3. 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 무혈청의 배지용 첨가제]

본 발명은, 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 무혈청의 배지용 첨가제를 제공한다. 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하고 있다. 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 종래 공지의 기초 배지에 첨가해, 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 무혈청 배지(무혈청 배지(A))로서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 배지용 첨가제가 함유하고 있는 인지질로는, 예를 들면 포스파티드산, 리소포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 포스파디딜 세린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 콜린 및 포스파티딜 글리세롤 등을 들 수 있고, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 이들 인지질을 단독으로 함유해도 되고, 조합해서 함유해도 된다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 포스파티드산과 포스파티딜 콜린을 조합해서 함유하고 있다. 또한, 이들 인지질은 동물 유래라도 되고, 식물 유래라도 무방하다.

본 발명에 따른 배지용 첨가제가 함유하고 있는 지방산으로는, 예를 들면 리놀레산, 올레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 미리스트산, 팔미톨레산, 팔미트산 및 스테아르산 등을 들 수 있고, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 이들 지방산을 단독으로 함유해도 되고, 조합해서 함유해도 된다. 또한, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 상기 지방산 외에 콜레스테롤을 더 함유하고 있어도 무방하다.

또한, 일 실시 형태에 있어서, 배지용 첨가제는 결합 조직 증식 인자(CTGF: connective tissue growth factor), 혈관 내피 증식 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor) 및 아스코르브산 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 인자를 더 함유하고 있어도 무방하다.

한편, 본 발명에 따른 배지용 첨가제에 함유되어 있는 증식 인자는, 천연의 것이어도 되고, 유전자 변형에 의해 제조된 것이어도 무방하다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 지질 산화 방지제를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 배지용 첨가제에 함유되는 지질 산화 방지제는, DL-α-토코페롤아세테이트(비타민 E)일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 계면활성제를 더 함유하고 있어도 된다. 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 배지용 첨가제에 함유되는 계면활성제는 Pluronic F-68 또는 Tween 80일 수 있다.

본 발명에 따른 배지용 첨가제는 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 더 함유하고 있어도 된다. 본 명세서에서 사용되는 경우, 인슐린은 인슐린 유사 증식 인자여도 되고, 천연의 세포 유래여도 되고, 유전자 변형에 의해 제조된 것이라도 된다. 또한, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 덱사메타손 혹은 다른 글루코코르티코이드를 함유하고 있어도 무방하다.

[4. 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 무혈청의 배양 배지]

본 발명은 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 무혈청의 배양 배지를 제공한다. 본 발명에 따른 배양 배지는 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하고 있다. 본 발명에 따른 배양 배지는, 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 무혈청 배지(무혈청 배지(A))로서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 배양 배지는, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하고 있으면 되고, 이들 성분은 기초 배지에 동시에 첨가되어도 되고, 각각 첨가되어도 무방하다. 즉, 본 발명에 따른 배양 배지는 전술한 배지용 첨가제에 함유되고 있는 성분, 또는, 후술하는 배지용 첨가제 키트 중에 구비되어 있는 성분을 포함하고 있으면 된다고 할 수 있다.

본 발명에 따른 배양 배지를 구성하기 위한 기초 배지는, 당해 분야에서 주지의 동물 세포용 배지라면 특별히 한정되지 않는다. 바람직한 기초 배지로는, 예를 들면 Ham's F12 배지, DMEM 배지, RPMI-1640 배지 및 MCDB 배지 등을 들 수 있다. 이들 기초 배지는 단독으로 사용해도 되고, 복수 개를 혼합해 사용해도 무방하다. 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 배양 배지를 구성하기 위한 기초 배지는 MCDB 배지와 DMEM 배지를 1:1의 비율로 혼합한 배지인 것이 바람직하다.

[5. 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 배양 방법]

본 발명은 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 배양 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 배양 방법은 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하고 있는 무혈청 배지(무혈청 배지(A)) 중에서 간엽계 줄기세포를 배양하는 공정(배양 공정 A)을 포함하고 있다. 본 발명에 따른 배양 방법은, 간엽계 줄기세포를 배양할 때, 전술한 무혈청의 배양 배지를 이용하면 된다고 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 배양 방법은, 상기 배양 공정 A의 전에, FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(B)에서 간엽계 줄기세포를 배양하는 공정(배양 공정 B)을 더 포함하고 있어도 된다.

한편, 상기 배양 공정 A 및 상기 배양 공정 B는, 본 발명에 따른 간엽계 줄기세포를 함유하는 세포 제재의 제조 방법에서의 증식 공정 및 사전 증식 공정에 각각 대응된다. 이 때문에, 본 명세서에서의 상기 '연골 손상 치료제의 제조 방법'항의 증식 공정 및 사전 증식 공정에 대한 설명을 각각 배양 공정 A 및 배양 공정 B에 대한 설명으로서 대신할 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 배양 방법은 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을, 기초 배지에 동시에 첨가하는 공정을 포함해도 된다. 또한, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 배양 방법은 FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을, 기초 배지에 동시에 첨가하는 공정을 포함해도 된다. 상기 기초 배지는, 전술한 바와 같이 당해 분야에서 주지의 동물 세포용 배지라면 특별히 한정되지 않는다.

[6. 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 키트]

본 발명은, 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하고 있다.

본 발명에 따른 키트는 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 동일 용기 내에 구비하고 있어도 되고, 이들 성분을 각각 구비하고 있어도 된다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 세포 접착 분자를 더 함유하고 있어도 무방하다. 상기 세포 접착 분자에 대해서는, 본 명세서에서의 상기 '연골 손상 치료제의 제조 방법'항의 증식 공정에서 설명했던 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.

본 발명에 따른 키트는, 종래 공지의 기초 배지에 첨가해, 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 무혈청 배지(무혈청 배지(A))로서 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 경우, '조성물'은 각 주성분이 한 물질 중에 함유되어 있는 형태이며, '키트'는 각 주성분의 적어도 하나가 다른 물질 중에 함유되어 있는 형태인 것이 의도된다. 따라서, 본 발명에 따른 키트에 구비되어 있는 증식 인자, 인지질 및 지방산은, 배지용 첨가제에 대해 전술한 것과 동일하다는 것이 쉽게 이해된다.

또한, 본 발명에 따른 키트는 간엽계 줄기세포를 함유하는 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 키트로서, 본 발명에 따른 배지용 첨가제(배지용 첨가제 A)를 적어도 구비하고 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 배지용 첨가제 B를 더 구비하고 있어도 된다. 한편, 전술한 무혈청 배지(B)에 대한 설명을 배지용 첨가제 B에 대한 설명으로 대신할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 키트는 등장 보존제, 세포 보호제, 배양 용기 및 사용 설명서 등 중 적어도 1개를 구비하고 있어도 된다. 상기 등장 보존제, 세포 보호제 및 배양 용기에 대해서는, 본 명세서에서의 상기 '연골 손상 치료제의 제조 방법'항에서 설명했던 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다. 상기 사용 설명서에는, 예를 들면 상기 '연골 손상 치료제의 제조 방법'의 항에서 설명한, 본 발명에 따른 연골 손상 치료제의 제조 방법의 내용이 기록되어 있다.

[7. 정리]

본 발명에 따른 연골 손상 치료제의 제조 방법은 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서 간엽계 줄기세포를 증식시키는 증식 공정과, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기세포, 등장 보존제 및 세포 보호제를 혼합하는 혼합 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 혼합 공정에서는, 상기 간엽계 줄기세포가 1×10⁵ 개/㎖ 이상, 1×10⁸ 개/㎖ 이하가 되도록 혼합하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 혼합 공정에서는, 상기 세포 보호제의 농도가 0%보다 많고, 0.5% 이하가 되도록 혼합하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 혼합 공정에서는, 상기 세포 보호제의 농도가 0.01% 이상, 0.1% 이하가 되도록 혼합하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 간엽계 줄기세포는, 활막, 탯줄, 제대혈, 양막, 골수 및 지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직 유래인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 제조 방법은, 상기 증식 공정에서, 분화능을 유지한 채로 상기 간엽계 줄기세포를 증식시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 제조 방법은, 상기 증식 공정의 전에, FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(B)에서 간엽계 줄기세포를 증식시키는 사전 증식 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 있어서, 상기 간엽계 줄기세포의 세포수는 1×10⁵ 개/㎖ 이상, 1×10⁸ 개/㎖ 이하인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 있어서, 상기 세포 보호제의 농도는 0%보다 많고, 0.5% 이하인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 있어서, 상기 세포 보호제의 농도는 0.01% 이상, 0.1% 이하인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제에 있어서, 상기 간엽계 줄기세포가 분화능을 유지하고 있는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제는, 연골의 일부가 손상된 연골 손상 부위에 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 연골 손상 치료제는, 상기 연골 손상 부위에 여러 차례 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 배지용 첨가제는, 연골 손상 치료제를 제조하기 위한 무혈청의 배지용 첨가제이며, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 전술한 각 실시 형태로 한정되는 것이 아니며, 청구항에 기재한 범위에서 여러 가지의 변경이 가능하고, 다른 실시 형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절하게 조합해 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

〈실시예〉

[I. 연골 재생 실험]

(1. 세포 배양)

지름 2.0㎜의 악관절경을 사용해, 건상(健常) 비글의 성견(Kitayama Labes Co., Ltd., 월령: 11개월령, 성별: 수컷)의 무릎관절 연골을 반층 결손시켜, 개의 연골 결손 모델을 제작했다. 연골을 반층 결손시킨 무릎관절과는 다른 무릎관절로부터 활막조직을 관혈적(罐血的)으로 채취해, 50㎖ 튜브 내의 항생 물질(페니실린-스트렙토마이신, 농도 1%, Sigma-Aldrich 제품)을 첨가한 생리 식염액에 침지해 실험실로 수송했다. 수송한 조직을 가위로 세단해 콜라게나아제 처리한 후에, 필터로 여과 했다. 하기 표 1에 나타내는 무혈청 배지(A)인 배지 1(STK2(등록상표))로부터, HGF 및 TGF-β를 제거한 무혈청 배지(B)인 배지 2(STK1(등록상표))를 포함하는 배양기에, 세포 밀도가 균일하게 되도록 파종하고, 37℃로 유지한 탄산가스 인큐베이터 내(공기 95% 및 이산화탄산 5%)에서 배양했다.

배양 개시로부터 4일째(계대 0회째)에, Accutase(Innovative Cell Technologies, Inc.)로 처리함으로써 세포를 회수하고, 하기 표 1에 나타내는 무혈청 배지(A)인 배지 1을 포함하는 배양기에 세포 밀도가 균일하게 되도록 다시 파종해 계대 배양했다.

배양 9일째, 세포가 콘플루언트 상태가 된 것을 확인하고, Accutase로 처리해 세포를 회수해, 영하 80℃에서 동결 보존했다.

(2. 다분화능 시험)

상기 1.의 배양 후 세포가 분화능을 유지하고 있는지 여부를 조사했다.

〈골분화능〉

배지 2에서 배양해 콘플루언트 상태가 된 세포를 회수해, 골분화용 배지(STK3(등록상표))에 파종해 배양했다. 배양 7일 후 및 21일 후에 알리자린 레드 S(Nacalai Tesque, Inc.: 01303-52)로 염색해 골분화 유도 여부를 확인했다. 배양 7일 후에 비해 배양 21일 후의 배지가 잘 염색되어 골아세포로 유도되고 있는 것을 알 수 있었다.

〈지방 분화능〉

배지 2에서 배양해 콘플루언트 상태가 된 세포를 회수해, 지방 분화용 배지(DMEM(Sigma: D5796), FBS(Hyclone), 페니실린-스트렙토마이신(Sigma: P0781), 인슐린(Wako: 093-06471), 덱사메타손(Sigma: D1756), 인드메타신(Wako: 097-02471), 3-이소부틸-1-메틸잔틴(Calbiochem: 410957))에 파종해 배양했다. 지방 분화 유도 배지와 지방 분화 유지 배지(MEM(Sigma: D5796), FBS(Hyclone), 페니실린-스트렙토마이신(Sigma: P0781), 인슐린(Wako: 093-06471))을 3일 간격으로 번갈아 교환해 배양했다. 배양 7일 후 및 배양 21일 후에 오일 레드 O(WAKO: 154-02072)로 염색해, 지방 분화 유도 여부를 확인했다. 배양 7일 후에 비해 배양 21일 후의 배지가 잘 염색되어 지방세포로 유도되고 있는 것을 알 수 있었다.

〈연골 분화능〉

배지 2에서 배양해 콘플루언트 상태가 된 세포를 회수해, 연골 분화용 배지(αMEM(Sigma: M4526), 페니실린-스트렙토마이신(Sigma: P0781), glutaMAX(L-glutamine)(Life Technologies Corporation: 35050-061), 덱사메타손(Sigma: D1756), 아스코르브산-2-인산(Sigma: A8960), D-글루코오스(Sigma: G8769), 피루브산(Sigma: 28-4020-2), ITS(인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산)(Life Technologies Corporation: 41400-045), 리놀레산(Sigma: L5900), BSA(WAKO: 017-15146), TGF-b3(peprotec: 100-36E))에서 삼차원 배양했다.

세포의 연골 분화 유도를 확인하기 위해, 연골 분화용 배지에서 배양한 세포를, 배지 1(STK2) 및 기초 배지(DMEM)에 각각 파종해 배양했다. 배양 14일 후 및 28일 후에, 리얼타임 PCR에 의해 연골 특이적 유전자(type Ⅱ collagen, aggrecan 및 sox9)의 발현량을 측정했다. 측정 결과를 도 25에 나타낸다. 도 25는 연골 분화용 배지에서 배양한 MSC에서의 연골 특이적 유전자(type Ⅱ collagen, aggrecan, 및, sox9)의 발현량을 나타내는 그래프이다. 도 25에 나타내는 바와 같이, 각 유전자 모두 고발현되고 있는 것이 확인되어, 연골 세포로 유도되고 있는 것을 알 수 있었다.

(3. 관절내 투여(단회 투여))

〈방법〉

동결 보존하고 있던 세포의 증식능을 사전에 확인해, 투여일부터 역산하여 배양을 개시했다. 동결 보존하고 있던 세포를 융해하고, STK2 배지에서 프리콘플루언트 상태가 될 때까지 배양해 1회 계대했다. 투여일 당일 또는 전날에 세포를 회수해, 세포수를 조정하여 히알루론산(SUVENYL(등록상표), Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. 제품) 및 락트산 링거 솔루락트(SOLULACT) 수액(Telmo 제품)과 혼합해 세포 투여액을 조제했다.

조제 후의 세포 투여액을 동물 실험 시설로 수송하고(5 내지 21시간 냉장 보존), 실린지에 세포 투여액을 주입해, 상기 1.에서 제작한 개의 연골 결손 모델의 관절내(무릎관절의 연골 반층 결손 부위)에 단회 투여했다.

한편, 투여 후에, 세포 투여액 내의 세포 생존율을 측정한 결과, 냉장 보존 21시간 이내에서는 세포수 및 히알루론산 농도와 상관없이 세포의 생존율이 85% 이상을 유지하고 있었다. 이에 따라, 세포 투여액의 관절내 투여가 정상적으로 행해진 것을 확인할 수 있었다.

〈결과〉

관절 연골 손상부의 재생에 최적인 MSC의 투여 세포수 및 히알루론산 농도를 검토하기 위해, 여러 가지 세포수 및 히알루론산 농도의 세포 투여액을 이용해 상기 3.의 관절내 투여를 실시했다.

세포 투여액 투여의 12주 후에, 연골 반층 결손 부위를 관찰하고 절편을 제작했다. 제작한 절편에 대해, 헤마톡실린·에오신 염색, 톨루이딘 블루 염색 및 사프라닌 O 염색, type Ⅱ 콜라겐 염색 등의 각종 염색을 실시하고, 현미경 관찰에 의해 결손 부위의 수복 상태를 평가했다.

여기에서, 관절 연골에 손상이 없는, 정상적인 유리 연골 염색상의 현미경 화상을 도 2에 나타낸다. 도 2의 (a)는 헤마톡실린·에오신 염색상을 나타내고, (b)는 톨루이딘 블루 염색상을 나타내고, (c)는 사프라닌 O 염색상을 나타낸다. 연골 기질은 화살표로 나타내고 있으며, 헤마톡실린·에오신 염색에 의해 옅은 핑크색으로 물들고, 톨루이딘 블루 염색에 의해 진한 청색에 물들고, 사프라닌 O 염색에 의해 진한 적색에 물든다. 도면에서는, 이들 염색 상태를 그레이 스케일에 의해 나타내고 있다.

다음으로, 상기 3.에 있어서, 여러 가지 성분 농도의 세포 투여액을 각각 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 대표적인 현미경 화상을 도 3 내지 도 16에 나타낸다. 또한, 연골 반층 결손 부위의 육안적 평가로서 ICRS(International Cartilage Repair Society)의 Macroscopic scales를 이용하고, 조직학적 평가로서 수정된 O'Driscoll의 histological grading scales를 이용해, 각각 평가했다. ICRS Macroscopic scales의 평가 지표를 표 2에 나타내고, 수정된 O'Driscoll의 histological grading scales의 평가 지표를 표 3에 나타낸다.

도 3은 비교예로서 히알루론산을 함유하지 않은 세포 투여액을 이용한 실험 결과를 나타낸다. 즉, 도 3은 MSC 5×10⁵개 및 락트산 링거 1㎖를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 3의 (a)는 연골 반층 결손 부위의 육안 화상을 나타내고, (b)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 헤마톡실린·에오신 염색상을 나타내고, (c)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 톨루이딘 블루 염색상을 나타내고, (d)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 사프라닌 O 염색상을 나타낸다. 이하, 도 4 내지 도 14에 있어서도, 도면의 (a) 내지 (d)를 도 3과 마찬가지로 나타낸다. 도 3 상태에서의 ICRS 스코어는 2, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 13이었다.

도 4는, MSC 5×10⁵개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 4 상태에서의 ICRS 스코어는 3, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 17이었다.

도 5는, MSC 5×10⁵개, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 5 상태에서의 ICRS 스코어는 2, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 17이었다.

도 6은, MSC 5×10⁵개, 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 6 상태에서의 ICRS 스코어는 2, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 16이었다.

도 7은, 비교예로서 히알루론산을 함유하지 않은 세포 투여액을 이용한 실험 결과를 나타낸다. 즉, 도 7은, MSC 5×10⁶개 및 락트산 링거 1㎖를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 7 상태에서의 ICRS 스코어는 2, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 14였다.

도 8은, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 8 상태에서의 ICRS 스코어는 11, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 39였다.

도 9는, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 9 상태에서의 ICRS 스코어는 4, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 19였다.

도 10은, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 10 상태에서의 ICRS 스코어는 2, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 15였다.

도 11은, 비교예로서 히알루론산을 함유하지 않은 세포 투여액을 이용한 실험 결과를 나타낸다. 즉, 도 11은, MSC 5×10⁷개 및 락트산 링거 1㎖를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 11 상태에서의 ICRS 스코어는 2, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 17이었다.

도 12는, MSC 5×10⁷개, 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 12 상태에서의 ICRS 스코어는 2, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 16이었다.

도 13은, 비교예로서 MSC 및 히알루론산을 함유하지 않은 투여액을 이용한 실험 결과를 나타낸다. 즉, 도 13은, 락트산 링거 1㎖만을 함유하는 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 13 상태에서의 ICRS 스코어는 1, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 11이었다.

도 14는, 비교예로서 MSC를 함유하지 않은 투여액을 이용한 실험 결과를 나타낸다. 즉, 도 14는, 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 14 상태에서의 ICRS 스코어는 1, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 11이었다.

도 15는, MSC 5×10⁷개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 15의 (a)는 연골 반층 결손 부위의 육안 화상을 나타내고, (b)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 헤마톡실린·에오신 염색상을 나타내고, (c)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 type Ⅱ 콜라겐 염색상을 나타내고, (d)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 사프라닌 O 염색상을 나타낸다. 도 15 상태에서의 ICRS 스코어는 11, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 37이었다.

도 16은, MSC 5×10⁷개, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 16의 (a) 내지 (d)의 설명은, 도 15와 마찬가지이다. 도 16의 (e)는, (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 톨루이딘 블루 염색상을 나타낸다. 도 16 상태에서의 ICRS 스코어는 3, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 18이었다.

각 세포수 및 히알루론산 농도별 ICRS 스코어 및 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어에 기초하면, MSC를 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액이, 가장 양호하게 연골 조직을 재생시킬 수 있는 것을 알 수 있었다. 한편, 히알루론산이 고농도가 되면, 연골 재생이 저해되는 것을 알 수 있었다. 또한, 수술 후의 개의 보행 능력, 감염 유무 등의 건강 상태에의 영향은 극히 적었다.

또한, 세포 투여액을 투여한 개의 연골 결손 모델에 있어서, 건상 관절내 연골 및 활막에 대해 전술한 염색을 실시하고, 이형성(dysplasia)의 발생을 평가했다. 도 17은 세포 투여액을 투여한 관절내의 건상 연골의 현미경 화상을 나타내는데, (a)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (b)는 톨루이딘 블루 염색상, (c)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타내는 도면이다. 도 18은 세포 투여액을 투여한 관절내의 건상 활막의 현미경 화상을 나타내는데, (a)는 헤마톡실린·에오신 염색상, (b)는 톨루이딘 블루 염색상, (c)는 사프라닌 O 염색상을 각각 나타내는 도면이다. 도 17 및 18에 나타내는 바와 같이, 건상 관절내에서 분명한 이형성은 인정되지 않았다.

정리로서, 가장 결과가 좋았던, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 개체의 type Ⅱ 콜라겐 면역 염색을 실시한 현미경 화상의 약확대도를 도 19에 나타내고, 강확대도를 도 20에 나타낸다. 그리고, 연골 재생을 전혀 얻을 수 없었던 락트산 링거 1㎖만을 함유하는 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여한 개체의 type Ⅱ 콜라겐 면역 염색을 실시한 현미경 화상의 약확대도를 도 21에 나타내고, 강확대도를 도 22에 나타낸다.

도 19 및 도 20에 나타내는 가장 양호한 결과는, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 투여한 연골 반층 결손 부위의 type Ⅱ 콜라겐 면역 염색상을 나타내고 있다. 도 21 및 도 22는, 락트산 링거 1㎖만을 함유하는 투여액을 투여한 연골 반층 결손 부위의 type Ⅱ 콜라겐 면역 염색상을 나타내고 있다.

도 19 내지 도 22에 나타내는 바와 같이, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 투여함으로써 연골이 양호하게 재생되었다.

(4. 관절내 투여(복수 회 투여))

〈방법〉

상기 3.과 같은 방법으로, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액, 및, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 세포 투여액을 조제했다. 조제 후의 세포 투여액을 동물 실험 시설로 수송하고(5 내지 21시간 냉장 보존), 실린지에 세포 투여액을 주입해, 상기 1.에서 제작한 개의 연골 결손 모델의 관절내(무릎관절의 연골 반층 결손 부위)에 3회 투여했다. 투여량은 1회당 1㎖로 하고, 투여 간격은 7일로 했다.

〈결과〉

3회째 투여로부터 12주 후에, 연골 반층 결손 부위를 관찰하고 절편을 제작했다. 제작한 절편에 대해 헤마톡실린·에오신 염색, 톨루이딘 블루 염색 및 사프라닌 O 염색, type Ⅱ 콜라겐 염색 등의 각종 염색을 실시하고, 현미경 관찰에 의해 결손 부위의 수복 상태를 상기 3.과 같이 평가했다.

도 23은, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 3회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 23의 (a)는 연골 반층 결손 부위의 육안 화상을 나타내고, (b)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 헤마톡실린·에오신 염색상을 나타내고, (c)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 type Ⅱ 콜라겐 염색상을 나타내고, (d)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 사프라닌 O 염색상을 나타낸다. 도 23 상태에서의 ICRS 스코어는 11, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 37이었다.

도 24는, MSC 5×10⁶개, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 세포 투여액을 연골 반층 결손 부위에 3회 투여한 경우의 육안 및 현미경 화상이다. 도 24의 (a) 내지 (d)의 설명은 도 23과 마찬가지이다. 도 24의 (e)는 (a)에서 점선으로 둘러싼 부분의 톨루이딘 블루 염색상을 나타낸다. 도 24 상태에서의 ICRS 스코어는 3, 수정 O'Driscoll의 조직학 스코어는 21이었다.

[Ⅱ. 관절강 내에서의 MSC 상태]

(1. 미분화 상태)

상기 I.의 연골 재생 실험에서 세포 투여액이 단회 투여된 관절강 내에 미분화 상태의 MSC가 존재하는지 여부를 확인했다. MSC를 함유하는 세포 투여액을 투여한 개체의 관절강으로부터 MSC를 채취해, 무혈청 배지 및 유혈청 배지에서 각각 배양한 후, 배양 세포의 미분화 마커 유전자(nanog, sox2, oct3/4) 발현과 내재성 컨트롤 유전자(Gapdh) 발현을 측정했다. 결과를 도 26에 나타낸다. 도 26은, 세포 투여액이 투여된 관절강 내로부터 채취한 MSC에서 미분화 마커 유전자 발현을 측정한 결과를 나타내는 도면으로, S는 무혈청 배양한 결과, D는 유혈청 배양한 결과, P는 계대수를 나타내고 있다.

도 26에 나타내는 바와 같이, 각 배양 세포에서 각 미분화 마커 유전자의 발현이 인정되어, 세포 투여액이 투여된 관절강 내에 미분화 상태의 MSC가 존재하는 것이 확인되었다.

(2. 사이토카인 방출 상태)

상기 I.의 연골 재생 실험에서 세포 투여액이 단회 투여된 관절강 내에서의 사이토카인의 방출 상태를 확인했다. 세포 투여액이 투여된 관절강 내에서 CTACK, Eotaxin, bFGF, G-CSF, GRO-α, HGF, IFN-α2, IFN-γ, IL-1rα, IL-2, IL-2Rα, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-16, IL-18, IP-10, LIF, MCP-1(MCAF), M-CSF, MIF, MIG, β-NGF, PDGF-BB, RANTES, SCF, SCGF-β, SDF-1α, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TRAIL 및 VEGF의 검출이 인정되어, 세포 투여액이 투여된 관절강 내에서 다수의 사이토카인이 방출되고 있는 것이 확인되었다.

[Ⅲ. 세포 보호제의 성능 시험 1]

(1. 세포 배양)

세포 보존에서의, 상기 I.에서 이용한 세포 보호제(히알루론산)의 성능을 확인했다. 보존액으로, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 용액, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 용액, 락트산 링거 500㎕ 및 히알루론산 1% 500㎕(히알루론산 농도 0.5%)를 함유하는 용액을 준비했다. 또한, 락트산 링거액 1㎖ 및 무혈청 배지(STK2 배지) 1㎖를 대조군으로 준비했다. 인간 활막 조직 유래 MSC가 5×10⁵개 또는 5×10⁶개가 되도록 각 용액에 분주하고, 37℃로 유지한 탄산가스 인큐베이터 내(공기 95% 및 이산화탄산 5%) 또는 4℃의 냉장 쇼케이스에서 보존했다. 37℃에서는 보존 후 168시간까지의 생존율을 측정하고, 4℃에서는 보존 후 5주간까지의 생존율을 측정했다.

(2. 결과)

도 27에 결과를 나타낸다. 도 27에서 'HA'는 '히알루론산'을 가리킨다. 37℃의 보존 조건에서는, 도 27의 (a)에 나타내는 바와 같이, 히알루론산 농도 0.01%의 용액이 다른 용액보다 높은 생존율을 유지하는 것이 분명해졌다. 또한, 4℃의 보존 조건에서는, 도 26의 (b) 및 (c)에 나타내는 바와 같이, 히알루론산 농도 0.01%의 용액, 히알루론산 농도 0.1%의 용액 및 락트산 링거액에서 1개월 이상 생존율 60%를 유지할 수 있는 능력을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

[Ⅳ. 세포 보호제의 성능 시험 2]

(1. 세포 배양)

상기 Ⅲ.에 있어서, 세포를 37℃의 온도 조건하에 보존한 경우에도, 세포 보호제를 이용하면 24시간 후의 생존율이 60% 이상인 것이 나타났다. 그래서, 인간 활막 조직 유래 MSC를 5×10⁵개로 하고, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 용액, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 용액, 그리고 락트산 링거액 1㎖의 3개에서 다시 시험을 실시했다.

(2. 결과)

도 28에 결과를 나타낸다. Non-repeated Measures ANOVA로 통계 해석을 실시해, P＜0.01의 유의차를 보이는 개소에 **를 기재했다. 도 28에서 'HA'는 '히알루론산'을 가리킨다. 도 28에 나타내는 바와 같이, 37℃의 보존 조건에서, 락트산 링거 990㎕ 및 히알루론산 1% 10㎕(히알루론산 농도 0.01%)를 함유하는 용액, 그리고, 락트산 링거 900㎕ 및 히알루론산 1% 100㎕(히알루론산 농도 0.1%)를 함유하는 용액은, 락트산 링거액 1㎖보다 유의미하게 세포 보호 효과를 갖는 것이 확인되었다.

이로부터, 세포 보호제는 0.01% 내지 0.1%의 농도에서 투여 전 세포 보존액으로서도 그 세포 보호 효과를 갖고, 특히 냉장 조건에서는 장기간 보관을 가능하게 하는 것을 알 수 있었다. 또한, 세포의 대사 활성이 높을 것으로 생각되는 37℃의 보존 조건에서도 24시간에서의 생존율이 높은 것으로부터, 세포 수송이나 보존 시에 높은 온도 조건하에 놓여질 때의 보호 작용도 높은 것으로 나타났다.

〈산업상의 이용 가능성〉

본 발명은, 간엽계 줄기세포를 이용한, 보다 안전하고 이용 가치가 높은 관절 손상 치료제를 제공할 수 있으므로, 간엽계 줄기세포를 이용한 연골 조직 재생 의료에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 세포 보호 작용에 의해 세포를 장기간 보존할 수 있으므로, 본 발명은 세포 보호제 등으로서 재생 의료 산업 분야에서 응용할 수도 있다.

Claims

FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서, 간엽계 줄기세포를 증식시키는 증식 공정과,
상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기세포, 등장 보존제 및 세포 보호제를 혼합하는 혼합 공정을 포함하고,
상기 혼합 공정에서는, 상기 세포 보호제의 농도가 0.005% 이상, 0.1% 이하가 되도록 혼합하는 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료제의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합 공정에서는, 상기 간엽계 줄기세포가 1×10⁵ 개/㎖ 이상, 1×10⁸개/㎖ 이하가 되도록 혼합하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 혼합 공정에서는, 상기 세포 보호제의 농도가 0.01% 이상, 0.1% 이하가 되도록 혼합하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포는, 활막, 탯줄, 제대혈, 양막, 골수 및 지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직 유래인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 증식 공정에서, 분화능을 유지한 채로 상기 간엽계 줄기세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 증식 공정의 전에, FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(B)에서, 간엽계 줄기세포를 증식시키는 사전 증식 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지(A)에서 배양된 간엽계 줄기세포와,
등장 보존제와,
세포 보호제를 함유하고,
상기 세포 보호제의 농도가 0.005% 이상, 0.1% 이하인 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료제.
제8항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포의 세포수가, 1×10⁵ 개/㎖ 이상, 1×10⁸ 개/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료제.
삭제
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 세포 보호제의 농도가, 0.01% 이상, 0.1% 이하인 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료제.
제8항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포가 분화능을 유지하고 있는 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료제.
제8항에 있어서,
연골의 일부가 손상된 연골 손상 부위에 투여되는, 연골 손상 치료제.
제13항에 있어서,
상기 연골 손상 부위에 여러 차례 투여되는, 연골 손상 치료제.
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