JPWO2015016357A1 - 軟骨損傷治療剤及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、間葉系幹細胞を含む軟骨損傷治療剤の製造方法を提供する。本発明に係る軟骨損傷治療剤の製造方法は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Aにおいて、間葉系幹細胞を増殖させる増殖工程と、上記増殖工程後の間葉系幹細胞、等張保存剤、及び、細胞保護剤を混合する混合工程とを包含する。
増殖工程においては、間葉系幹細胞を、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Aにおいて培養し、間葉系幹細胞を増殖させる。
間葉系幹細胞には、滑膜細胞、脂肪細胞、骨髄、歯槽骨、及び歯根膜等の成人の組織からだけでなく、胎盤、臍帯血、及び胎児の種々の細胞等から単離されるものも含まれる。増殖工程において増殖させる間葉系幹細胞は、滑膜、臍帯、臍帯血、羊膜、骨髄、及び、脂肪からなる群より選択される組織由来であることが好ましい。
増殖工程において用いる無血清培地Aを構成するための基礎培地は、当該分野において周知の動物細胞用培地であれば特に限定されない。好ましい基礎培地としては、例えば、Ham’s F12培地、DMEM培地、RPMI−1640培地、及びMCDB培地等が挙げられる。これらの基礎培地は、単独で使用されてもよいし、複数を混合して使用されてもよい。一実施形態において、無血清培地Aを構成するための基礎培地は、MCDB培地とDMEM培地とを1:1の比率で混合した培地であることが好ましい。
(i)細胞層をPBS(−)5mLを用いて洗浄する。
(ii) Accutaseを2mL添加する。
(iii)室温にて2分程度静置し、細胞の剥離を確認のうえ遠心管に細胞浮遊液を移す。
(iv)培養容器にPBS(−)を7mL添加し、フラスコ底面をリンスする。
(v)上記(iii)の遠心管に上記(iv)の溶液を移し、1500rpm(200×g)で5分間遠心する。
(vi)上清を除き、5,000個/cm2の播種濃度にて、無血清培地Aを用いて播種する。
混合工程においては、上記増殖工程後の間葉系幹細胞、等張保存剤、及び、細胞保護剤を混合し、細胞投与液を調製する。この細胞投与液が軟骨損傷治療剤である。
混合工程において混合する等張保存剤としては、例えば、乳酸リンゲル液が挙げられるが、これに限定されない。乳酸リンゲル液としては、商業的に入手可能なものを使用可能であり、例えば、乳酸リンゲル ソルラクト輸液(テルモ社製)を好適に使用することができる。等張保存剤は、一種類を単独で用いてもよいし、複数種類を組み合わせて用いてもよい。
混合工程において混合する細胞保護剤としては、例えば、ヒアルロン酸が挙げられるが、これに限定されない。細胞保護剤として使用するヒアルロン酸の平均分子量は、1500000以上、3900000以下であることが好ましい。細胞保護剤は、一種類を単独で用いてもよいし、複数種類を組み合わせて用いてもよい。
本発明に係る製造方法においては、上記増殖工程の前に、間葉系幹細胞を、FGF、PDGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Bにおいて培養し、間葉系幹細胞を増殖させる前増殖工程をさらに行ってもよい。
無血清培地Bは、HGF及びTGF−βを含有していない点で、上記「増殖工程」の項で説明した無血清培地Aとは異なる。HGF及びTGF−β以外の成分(FGF、PDGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸)並びに基礎培地については、上記「増殖工程」の項で無血清培地Aに関して説明したとおりであるので、ここでは説明を省略する。
本発明は、間葉系幹細胞を含む軟骨損傷治療剤を提供する。本発明に係る軟骨損傷治療剤は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Aにおいて培養された間葉系幹細胞と、等張保存剤と、細胞保護剤とを含有している。
軟骨損傷治療剤に含まれる間葉系幹細胞には、滑膜細胞、脂肪細胞、骨髄、歯槽骨、及び歯根膜等の成人の組織からだけでなく、胎盤、臍帯、臍帯血、及び胎児の種々の細胞等から単離されるものも含まれる。増殖工程において増殖させる間葉系幹細胞は、滑膜、臍帯、臍帯血、羊膜、骨髄、及び、脂肪からなる群より選択される組織由来であることが好ましい。
軟骨損傷治療剤に含まれる等張保存剤としては、例えば、乳酸リンゲル液が挙げられるが、これに限定されない。乳酸リンゲル液としては、商業的に入手可能なものを使用可能であり、例えば、乳酸リンゲル ソルラクト輸液(テルモ社製)を好適に使用することができる。軟骨損傷治療剤は、等張保存剤として、一種類を単独で含んでいてもよいし、複数種類を組み合わせて含んでいてもよい。
軟骨損傷治療剤に含まれる細胞保護剤としては、例えば、ヒアルロン酸が挙げられるが、これに限定されない。細胞保護剤として使用するヒアルロン酸の平均分子量は、1500000以上、3900000以下であることが好ましい。軟骨損傷治療剤は、細胞保護剤として、一種類を単独で含んでいてもよいし、複数種類を組み合わせて含んでいてもよい。
本発明に係る軟骨損傷治療剤は、軟骨損傷部位に投与して、軟骨を再生するために用いられる。また、軟骨損傷治療剤は、骨を被覆する軟骨が損傷することによって、少なくとも一部の骨が露出している全層損傷部位に投与してもよいが、骨が露出しない程度に軟骨の一部が損傷した一部損傷部位、又は、軟骨の層の約半分を損傷した半層損傷部位に投与することが好ましい。また、軟骨の変性部を除去して、軟骨損傷治療剤を投与することも有効である。
本発明は、間葉系幹細胞を含む軟骨損傷治療剤を製造するための無血清の培地用添加剤を提供する。本発明に係る培地用添加剤は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有している。本発明に係る培地用添加剤は、従来公知の基礎培地に添加して、間葉系幹細胞を含む軟骨損傷治療剤を製造するための無血清培地(無血清培地A)として使用することができる。
本発明は、間葉系幹細胞を含む軟骨損傷治療剤を製造するための無血清の培養培地を提供する。本発明に係る培養培地は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有している。本発明に係る培養培地は、間葉系幹細胞を含む軟骨損傷治療剤を製造するための無血清培地(無血清培地A)として使用することができる。
本発明は、間葉系幹細胞を含む軟骨損傷治療剤を製造するための培養方法を提供する。本発明に係る培養方法は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有している無血清培地(無血清培地A)中において間葉系幹細胞を培養する工程(培養工程A)を包含している。本発明に係る培養方法は、間葉系幹細胞を培養する際に、上述した無血清の培養培地を用いればよいといえる。
本発明は、間葉系幹細胞を含む軟骨損傷治療剤を製造するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有している。
本発明に係る軟骨損傷治療剤の製造方法は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Aにおいて、間葉系幹細胞を増殖させる増殖工程と、上記増殖工程後の間葉系幹細胞、等張保存剤、及び、細胞保護剤を混合する混合工程とを包含することを特徴としている。
(1.細胞培養)
径2.0mmの顎関節鏡を使用して、健常なビーグルの成犬(北山ラベス株式会社、月齢:11か月齢、性別:オス)の膝関節の軟骨を半層欠損させ、イヌの軟骨欠損モデルを作製した。軟骨を半層欠損させた膝関節とは別の膝関節から、滑膜組織を観血的に採取し、50mLチューブ内の抗生物質(ペニシリン−ストレプトマイシン、濃度1%、sigma社製)を添加した生理食塩液に浸して実験室に輸送した。輸送した組織をハサミで細断し、コラゲナーゼ処理した後に、フィルターでろ過した。下記表1に示す無血清培地Aである培地1(STK2(登録商標))から、HGF及びTGF−βを除いた無血清培地Bである培地2(STK1(登録商標))を含む培養器に、細胞密度が均一になるように播種し、37℃に保った炭酸ガスインキュベータ内(空気95%及び二酸化炭酸5%)で培養した。
上記1.の培養後の細胞が分化能を維持しているか否かを調べた。
培地2で培養し、コンフルエントになった細胞を回収し、骨分化用培地(STK3(登録商標))に播種して培養した。培養7日後及び21日後にアリザリンレッドS(ナカライテスク:01303−52)で染色し、骨分化誘導されているか否かを確認した。培養7日後に比べて培養21日後の培地の方が良く染色されており、骨芽細胞に誘導されていることが分かった。
培地2で培養し、コンフルエントになった細胞を回収し、脂肪分化用培地(DMEM(sigma:D5796)、FBS(Hyclone)、ペニシリン−ストレプトマイシン(Sigma:P0781)、インスリン(Wako:093−06471)、デキサメタゾン(Sigma:D1756)、インドメタシン(Wako:097−02471)、3−イソブチル−1−メチルキサンチン(Calbiochem:410957))に播種して培養した。脂肪分化誘導培地と脂肪分化維持培地(MEM(sigma:D5796)、FBS(Hyclone)、ペニシリン−ストレプトマイシン(Sigma:P0781)、インスリン(Wako:093−06471))とを3日おきに交互に交換し培養した。培養7日後及び培養21日後にオイルレッドO(WAKO:154−02072)で染色し、脂肪分化誘導されているか否かを確認した。培養7日後に比べて培養21日後の培地の方が良く染色されており、脂肪細胞に誘導されていることが分かった。
培地2で培養し、コンフルエントになった細胞を回収し、軟骨分化用培地(αMEM(Sigma:M4526)、ペニシリン−ストレプトマイシン(Sigma:P0781)、glutaMAX(L−glutamine)(Life Technologies Corporation:35050−061)、デキサメタゾン(Sigma:D1756)、アスコルビン酸−2−リン酸(Sigma:A8960)、D−グルコース(Sigma:G8769)、ピルビン酸(Sigma:28−4020−2)、ITS(インスリン,トランスフェリン、アセレン酸)(Life Technologies Corporation:41400−045)、リノール酸(Sigma:L5900)、BSA(WAKO:017−15146)、TGF−b3(peprotec:100−36E))にて三次元培養した。
<方法>
凍結保存していた細胞の増殖能を事前に確認し、投与日から逆算して培養を開始した。凍結保存していた細胞を融解し、STK2培地にて、プレコンフルエントになるまで培養し、1回継代した。投与日当日又は前日に細胞を回収し、細胞数を調製してヒアルロン酸(スベニール(登録商標)、中外製薬社製)及び乳酸リンゲル ソルラクト輸液(テルモ社製)と混合して細胞投与液を調製した。
関節軟骨損傷部の再生に最適なMSCの投与細胞数及びヒアルロン酸濃度を検討するために、種々の細胞数及びヒアルロン酸濃度の細胞投与液を用いて、上記3.の関節内投与を行った。
<方法>
上記3.と同様の方法で、MSCを5×106個、乳酸リンゲル 990μL、及び、ヒアルロン酸1% 10μL(ヒアルロン酸濃度 0.01%)を含む細胞投与液、並びに、MSCを5×106個、乳酸リンゲル 900μL、及び、ヒアルロン酸1% 100μL(ヒアルロン酸濃度 0.1%)を含む細胞投与液を調製した。調製後の細胞投与液を動物実験施設に輸送し(5〜21時間冷蔵保存)、シリンジに細胞投与液を注入して、上記1.で作製したイヌの軟骨欠損モデルの関節内(膝関節の軟骨半層欠損部位)に3回投与した。投与量は、1回あたり1mLとし、投与の間隔は7日とした。
3回目の投与から12週間後に、軟骨半層欠損部位を観察し、切片を作製した。作製した切片に対して、ヘマトキシリン・エオシン染色、トルイジンブルー染色、及び、サフラニンO染色、typeIIコラーゲン染色等の各種染色を行い、顕微鏡観察により欠損部位の修復状態を上記3.と同様に評価した。
(1.未分化状態)
上記Iの軟骨再生実験において細胞投与液が単回投与された関節腔内に未分化状態のMSCが存在するか否かを確認した。MSCを含む細胞投与液を投与した個体の関節腔からMSCを採取し、無血清培地及び有血清培地においてそれぞれ培養した後、培養細胞の未分化マーカー遺伝子(nanog、sox2、oct3/4)発現と内在性コントロール遺伝子(Gapdh)発現を測定した。結果を図26に示す。図26は、細胞投与液が投与された関節腔内から採取したMSCにおいて、未分化マーカー遺伝子発現を測定した結果を示す図であり、Sは無血清培養した結果、Dは有血清培養した結果、Pは継代数を示している。
上記Iの軟骨再生実験において細胞投与液が単回投与された関節腔内におけるサイトカインの放出状態を確認した。細胞投与液が投与された関節腔内において、CTACK、Eotaxin、bFGF、G−CSF、GRO−α、HGF、IFN−α2、IFN−γ、IL−1rα、IL−2、IL−2Rα、IL−3、IL−4、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−12(p40)、IL−12(p70)、IL−16、IL−18、IP−10、LIF、MCP−1 (MCAF)、M−CSF、MIF、MIG、β−NGF、PDGF−BB、RANTES、SCF、SCGF−β、SDF−1α、TGF−β 1、TGF−β 2、TGF−β 3、TRAIL、及び、VEGFの検出が認められ、細胞投与液が投与された関節腔内において多数のサイトカインが放出されていることが確認された。
(1.細胞培養)
細胞の保存における、上記I.で用いた細胞保護剤(ヒアルロン酸)の性能を確認した。保存液として、乳酸リンゲル 990μL及びヒアルロン酸1% 10μL(ヒアルロン酸濃度 0.01%)を含む溶液、乳酸リンゲル 900μL及びヒアルロン酸1% 100μL(ヒアルロン酸濃度 0.1%)を含む溶液、乳酸リンゲル 500μL及びヒアルロン酸1% 500μL(ヒアルロン酸濃度 0.5%)を含む溶液を用意した。また、乳酸リンゲル液 1mL、及び、無血清培地(STK2培地) 1mLを対照として用意した。ヒト滑膜組織由来MSCが5×105個又は5×106個となるように各液に分注し、37℃に保った炭酸ガスインキュベータ内(空気95%及び二酸化炭酸5%)又は4℃の冷蔵ショーケースで保存した。37℃では保存後168時間までの生存率を測定し、4℃では保存後5週間までの生存率を測定した。
図27に結果を示す。図27中「HA」は「ヒアルロン酸」を指す。37℃の保存条件では、図27中(a)に示すとおり、ヒアルロン酸濃度0.01%の溶液が他の溶液よりも高い生存率を保持することが明らかとなった。また、4℃の保存条件では、図26中(b)及び(c)に示すとおり、ヒアルロン酸濃度0.01%の溶液、ヒアルロン酸濃度0.1%の溶液、及び乳酸リンゲル液において1か月以上生存率60%を保つことができる能力を有することを確認した。
(1.細胞培養)
上記III.において、細胞を37℃の温度条件下に保存した場合でも、細胞保護剤を用いると24時間後の生存率が60%以上であることが示された。そのため、ヒト滑膜組織由来MSCを5×105個で、乳酸リンゲル 990μL及びヒアルロン酸1% 10μL(ヒアルロン酸濃度 0.01%)を含む溶液、乳酸リンゲル 900μL及びヒアルロン酸1% 100μL(ヒアルロン酸濃度 0.1%)を含む溶液、並びに、乳酸リンゲル液 1mLの3つにおいて、さらに試験を行った。
図28に結果を示す。Non-repeated Measures ANOVAで統計解析を行い、P<0.01で有意差が示された箇所に**を記載した。図28中「HA」は「ヒアルロン酸」を指す。図28に示すとおり、37℃の保存条件において、乳酸リンゲル 990μL及びヒアルロン酸1% 10μL(ヒアルロン酸濃度 0.01%)を含む溶液、並びに、乳酸リンゲル 900μL及びヒアルロン酸1% 100μL(ヒアルロン酸濃度 0.1%)を含む溶液は、乳酸リンゲル液 1mLよりも有意に細胞保護効果を有することが確認された。
Claims (18)
- FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Aにおいて、間葉系幹細胞を増殖させる増殖工程と、
上記増殖工程後の間葉系幹細胞、等張保存剤、及び、細胞保護剤を混合する混合工程と
を包含することを特徴とする軟骨損傷治療剤の製造方法。 - 上記混合工程では、上記間葉系幹細胞が1×105個/mL以上、1×108個/mL以下になるように混合することを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 上記混合工程では、上記細胞保護剤の濃度が0%より多く、0.5%以下になるように混合することを特徴とする請求項1又は2に記載の製造方法。
- 上記混合工程では、上記細胞保護剤の濃度が0.01%以上、0.1%以下になるように混合することを特徴とする請求項1〜3の何れか1項に記載の製造方法。
- 上記間葉系幹細胞は、滑膜、臍帯、臍帯血、羊膜、骨髄、及び、脂肪からなる群より選択される組織由来であることを特徴とする請求項1〜4の何れか1項に記載の製造方法。
- 上記増殖工程において、分化能を維持したまま上記間葉系幹細胞を増殖させることを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載の製造方法。
- 上記増殖工程の前に、
FGF、PDGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Bにおいて、間葉系幹細胞を増殖させる前増殖工程をさらに包含することを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法。 - FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Aにおいて培養された間葉系幹細胞と、
等張保存剤と、
細胞保護剤と
を含有していることを特徴とする軟骨損傷治療剤。 - 上記間葉系幹細胞の細胞数が、1×105個/mL以上、1×108個/mL以下であることを特徴とする請求項8に記載の軟骨損傷治療剤。
- 上記細胞保護剤の濃度が、0%より多く、0.5%以下であることを特徴とする請求項8又は9に記載の軟骨損傷治療剤。
- 上記細胞保護剤の濃度が、0.01%以上、0.1%以下であることを特徴とする請求項8〜10の何れか1項に記載の軟骨損傷治療剤。
- 上記間葉系幹細胞が分化能を維持していることを特徴とする請求項8〜11の何れか1項に記載の軟骨損傷治療剤。
- 軟骨の一部が損傷した軟骨損傷部位に投与される、請求項8〜12の何れか1項に記載の軟骨損傷治療剤。
- 上記軟骨損傷部位に複数回投与される、請求項13に記載の軟骨損傷治療剤。
- FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有していることを特徴とする軟骨損傷治療剤を製造するための無血清の培地用添加剤。
- 請求項15に記載の培地用添加剤を含有していることを特徴とする軟骨損傷治療剤を製造するための無血清の培養培地。
- 請求項16に記載の培養培地において間葉系幹細胞を培養する工程を包含することを特徴とする軟骨損傷治療剤を製造するための培養方法。
- 請求項15に記載の培地用添加剤を少なくとも備えていることを特徴とする軟骨損傷治療剤を製造するためのキット。
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