WO2010055616A1 - 分化誘導培地用添加剤およびその利用 - Google Patents

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加藤幸夫
邵金昌
辻紘一郎
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独立行政法人科学技術振興機構
株式会社ツーセル
国立大学法人広島大学
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    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to a differentiation-inducing medium additive and use thereof, and more specifically, one or more kinds selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts.
  • the present invention relates to an additive for differentiation-inducing medium and its use for inducing cell differentiation under serum-free conditions.
  • Stem cells are cells that have self-renewal ability and differentiation ability.
  • the stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and somatic stem cells.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • somatic stem cells include hematopoietic stem cells, neural stem cells, and mesenchymal stem cells.
  • the ES cell and the iPS cell have multipotency capable of differentiating into any tissue.
  • the hematopoietic stem cells have the ability to differentiate into blood cells, and the neural stem cells have the ability to differentiate into nerve cells.
  • the mesenchymal stem cells are known as stem cells that exist in tissues such as bone marrow and have multipotency to differentiate into adipocytes, bone cells, chondrocytes and the like.
  • mesenchymal stem cells are currently used as transplantation cells in the field of regenerative medicine, and the diseases that are targeted for mesenchymal stem cells include bone defects, cartilage defects, periodontal diseases, Myocardial infarction, refractory skin disease, osteoporosis, osteoarthritis, spinal cord injury, hematopoietic support, suppression of rejection in organ transplantation, etc.
  • diseases for which mesenchymal stem cells are indicated will increase (for example, cerebral infarction, obstructive arteriosclerosis, kidney disease, etc.).
  • a medium for inducing differentiation from stem cells to various functional cells a medium supplemented with animal serum (usually 10-15% fetal bovine serum) is currently widely used.
  • This serum is used as a nutrient source for promoting cell growth and / or proliferation in vitro, or as a source of physiologically active substances such as hormones.
  • the cell differentiation promoting effect tends to vary.
  • it is necessary to purify in order to remove serum-derived proteins and the like from the cultured cells, which complicates the work.
  • the cultured cells are contaminated by unknown pathogens (viruses, pathogenic prions, etc.) mixed in the serum.
  • the serum may contain a component that inhibits bone differentiation of mesenchymal stem cells, and the efficiency of bone differentiation can be reduced. Therefore, a technique capable of inducing differentiation of the stem cells under serum-free conditions is essential for the realization and spread of regenerative medicine.
  • Non-patent Document 1 In the case of inducing differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts, there are known methods for bone differentiation by reducing the amount of serum used. For example, the amount of fetal bovine serum is 1%. A method of inducing differentiation of mesenchymal stem cells into osteogenic cells by adding an epidermal growth factor (EGF) to a medium reduced in this manner is disclosed (Non-patent Document 1).
  • EGF epidermal growth factor
  • cells containing cultured mesenchymal stem cells cultured under serum-free conditions can be differentiated into osteoblasts or adipocytes in serum-containing medium by adding a composition containing specific growth factors and phospholipids to the basal medium.
  • a technique for guiding is also known (Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 Although the amount of serum used is reduced, differentiation is still induced in the serum-containing medium, so that there are variations in the effect of promoting differentiation, and the purification work is complicated. And other problems caused by serum, such as the problem of contamination of cultured cells and the problem that differentiation cannot be induced at low cost. On the other hand, there is no existing knowledge about a method for inducing differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts under serum-free conditions.
  • a serum-free medium used for inducing differentiation of ES cells into nerve cells under serum-free conditions is based on the expensive medium of commercially available N2 additive and B27 additive (Gibco BRL). Even if it is necessary to induce differentiation under serum-free conditions, an expensive additive needs to be added instead of serum.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and its object is to provide one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts.
  • An object of the present invention is to provide an additive for differentiation-inducing medium for efficiently and efficiently inducing bone differentiation under serum-free conditions and use thereof.
  • Addition for differentiation induction medium for inducing bone differentiation under serum-free condition of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts according to the present invention
  • the agent is characterized by containing at least one growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, and PDGF, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate.
  • the growth factor is one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membranes and fibroblasts (hereinafter these cells are collectively referred to as “ Dexamethasone can promote cell survival and differentiation, and ⁇ -glycerophosphate can supply phosphate and promote calcification. Has an effect. Therefore, it is considered that by adding the differentiation-inducing medium additive according to the present invention to the basal medium, the bone differentiation-inducing cells can be efficiently induced to induce bone differentiation under serum-free conditions.
  • the additive for differentiation induction medium according to the present invention further contains at least one phospholipid.
  • the phospholipid is selected from the group consisting of phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and phosphatidylglycerol. It is preferable.
  • the differentiation target cell can be induced to differentiate by the action of the growth factor, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate, and the bone of the differentiation target cell by the action of at least one phospholipid. Since the signal transduction system that induces differentiation is activated, bone differentiation can be further promoted. Therefore, it is possible to induce bone differentiation induction cells more efficiently and to shorten the time required for bone differentiation induction. As a result, the cost for inducing bone differentiation can be reduced.
  • the differentiation induction medium additive according to the present invention preferably further contains an antioxidant, and the antioxidant is preferably DL- ⁇ -tocopherol acetate (vitamin E).
  • the above-mentioned additive for differentiation induction medium is preferably used for inducing bone differentiation using mesenchymal stem cells as the stem cells.
  • the growth factor has an action of promoting a bone differentiation program
  • dexamethasone induces a bone morphogenetic factor (BMP)
  • BMP bone morphogenetic factor
  • ⁇ -glycerophosphate is converted into inorganic phosphate by alkaline phosphatase and phosphorylated. It has an action of supplying an acid and promoting calcification. Therefore, it is considered that the mesenchymal stem cells can be efficiently induced to differentiate into osteoblasts under serum-free conditions by adding the additive for differentiation induction medium according to the present invention to the basal medium. Therefore, a stable differentiation promoting effect without variation can be obtained.
  • the signal transduction system which induces the bone differentiation of mesenchymal stem cells is activated by further containing at least one phospholipid, the bone differentiation can be further promoted. Therefore, mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into osteoblasts more efficiently, and the time required for inducing bone differentiation can be shortened. As a result, the cost for inducing bone differentiation can be reduced.
  • a culture medium for inducing bone differentiation under serum-free conditions of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts according to the present invention is provided by the present invention. It contains the components and basal medium that constitute the additive for differentiation induction medium according to the above, and is characterized by not containing serum.
  • the culture medium is preferably used for inducing bone differentiation using mesenchymal stem cells as the stem cells.
  • the culture method for inducing bone differentiation under serum-free conditions of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts is the culture method described above. It includes the step of differentiating and culturing one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts in a medium.
  • mesenchymal stem cells are preferably used as the stem cells.
  • a kit for inducing bone differentiation under serum-free conditions of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts according to the present invention is provided in the present invention. It has the component which comprises the additive for such differentiation induction culture media, It is characterized by the above-mentioned.
  • the kit is preferably used for inducing bone differentiation using mesenchymal stem cells as the stem cells.
  • the additive for differentiation induction medium according to the present invention contains at least one growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, and PDGF, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate.
  • the bone differentiation-inducing target cell can be induced to undergo bone differentiation under serum-free conditions.
  • at least one phospholipid it is possible to further promote bone differentiation of the cell subject to bone differentiation induction under serum-free conditions.
  • bone differentiation-inducing target cells in the culture medium, bone differentiation-inducing cells can be efficiently induced. Furthermore, by using the above-mentioned kit, it is possible to easily perform bone differentiation of the target cell for inducing bone differentiation, which has been difficult to perform under serum-free conditions.
  • mesenchymal stem cells as the stem cells, differentiation induction of mesenchymal stem cells into osteoblasts can be performed efficiently. Furthermore, by using the above kit, it is possible to easily differentiate mesenchymal stem cells into osteoblasts, which has heretofore been difficult to perform under serum-free conditions.
  • the culture method for inducing bone differentiation under serum-free conditions one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts according to the present invention, Prior to the above step of differentiating and culturing one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts in the culture medium according to the present invention, FGF, PDGF , EGF, TGF- ⁇ , and at least three growth factors selected from the group consisting of HGF, and at least one phospholipid, and in serum-free culture medium, stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta
  • the method includes a pre-treatment for growing and culturing one or more cells selected from the group consisting of amniotic membrane and fibroblast.
  • a target cell for inducing bone differentiation is a culture medium containing at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, EGF, TGF- ⁇ , and HGF, and at least one phospholipid, and without serum (hereinafter referred to as a culture medium).
  • a culture medium containing at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, EGF, TGF- ⁇ , and HGF, and at least one phospholipid, and without serum
  • serum-free growth culture medium referred to as “serum-free growth culture medium”.
  • the differentiation ability of the target cell for inducing bone differentiation can be maintained high. This is because the serum-free growth culture medium does not contain all the growth promoting factors of osteogenesis-inducing cells contained in serum, but does not contain any growth-suppressing factors of osteogenesis-inducing cells. Therefore, it is considered that this is because the proliferation ability and pluripotency of the target cell for inducing bone differentiation can be kept higher than the serum-containing medium.
  • inducing osteodifferentiation in cells cultured in the above-mentioned serum-free growth culture medium in the culture medium according to the present invention increases the proliferative ability and pluripotency of the osteodifferentiation target cells.
  • the maintained differentiation target cells for bone differentiation are efficiently induced to differentiate in the culture medium according to the present invention. For this reason, compared with the case where bone differentiation induction was performed in the culture medium according to the present invention, the bone differentiation induction target cells cultured in the growth culture medium containing normal serum were efficiently used. Guidance can be made. As a result, the period for inducing bone differentiation can be further shortened.
  • the osteoblast according to the present invention comprises one or more cells selected from the group consisting of stem cells, pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts according to the present invention under serum-free conditions. It is produced by a culture method for inducing differentiation.
  • the osteoblasts according to the present invention have a staining property of alizarin red, which indicates calcification of osteoblasts, as compared with osteoblasts induced by differentiation using a conventional osteodifferentiation induction method using a conventional osteodifferentiation induction medium. strong. That is, the osteoblast according to the present invention is characterized in that it is an osteoblast in which calcium is deposited more compared to an osteoblast differentiated by a conventional osteodifferentiation induction method using a conventional osteodifferentiation induction medium. Have.
  • the osteoblast according to the present invention can be used for regenerative medicine using cells cultured in a serum-free medium for bone defect sites such as orthopedics and dentistry and osteoporosis.
  • the agent contains at least one growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, and PDGF, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate. Therefore, by adding to the basal medium, osteodifferentiation induction target cells can be efficiently induced to induce bone differentiation under serum-free conditions, are expensive, and there are risks such as contamination with pathogens and variation in differentiation. There is an effect that the use of serum can be avoided.
  • an additive for differentiation induction medium can be provided at a lower cost.
  • B It is a figure which shows the result of having confirmed the differentiation induction to the osteoblast of the mesenchymal stem cell at the time of using 10% FBS containing bone differentiation-inducing medium and serum-free bone differentiation-inducing medium: B. It is a figure which shows the result of having examined about the influence which the growth factor has on the differentiation induction to the osteoblast of a mesenchymal stem cell. It is a figure which shows the result of having examined about the influence which EGF has on the differentiation induction to the osteoblast of a mesenchymal stem cell using the bone differentiation-inducing culture medium containing 10% FBS. It is a figure which shows the result of the differentiation induction to the osteoblast of a mesenchymal stem cell.
  • additive for differentiation-inducing medium for inducing bone differentiation of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts under serum-free conditions
  • the agent (hereinafter simply referred to as “additive for differentiation induction medium according to the present invention”) comprises one or more growth factors selected from the group consisting of EGF, FGF, and PDGF, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate. Contains at least.
  • the “stem cell” may be derived from a human or an animal.
  • the “stem cell” is not particularly limited as long as it has an ability to differentiate into osteoblasts.
  • Examples of such “stem cells” include somatic stem cells such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and mesenchymal stem cells.
  • the stem cells may be used together with supporting cells or may be used alone as stem cells.
  • a somatic stem cell a primary somatic stem cell collected from a tissue may be used, or a stocked stem cell may be used.
  • somatic stem cells obtained by inducing differentiation from the ES cells, iPS cells and the like may be used. Further, for example, it may be in the middle of differentiation or may be undifferentiated. Further, the stem cells to be differentiated may be cells that have reached confluence or cells that have not reached confluence.
  • mesenchymal stem cells for example, mesenchymal stem cells such as bone marrow-derived, adipose-derived, periosteum-derived, synovial-derived, umbilical cord blood-derived, placenta-derived, and finger-derived can be used.
  • mesenchymal stem cells such as bone marrow-derived, adipose-derived, periosteum-derived, synovial-derived, umbilical cord blood-derived, placenta-derived, and finger-derived can be used.
  • the mesenchymal stem cells may be those that are in the middle of differentiation into osteoblasts, or not yet. It may be differentiated.
  • the mesenchymal stem cells to be differentiated may be cells that have reached confluence or cells that have not reached it.
  • the dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts may be derived from humans or animals. Moreover, you may use with a support cell and may be used independently. Moreover, the primary cell extract
  • tissue may be used and what was stocked may be used.
  • Stem cells may be used alone or in combination.
  • bone differentiation-inducing cells When dexamethasone and ⁇ -glycerophosphate are added to the basal medium in combination with the above growth factor, bone differentiation-inducing cells can be efficiently induced to undergo bone differentiation under serum-free conditions. Specifically, formation of an extracellular matrix and mineralization of osteoblasts can be performed efficiently.
  • each compound used is not particularly limited.
  • dexamethasone is used in the range of 10 ⁇ 6 to 10 ⁇ 10 M as the final concentration in the medium to which the above-mentioned additive for differentiation induction medium is added. It is preferable to use within the range of 10 ⁇ 7 to 10 ⁇ 9 M.
  • ⁇ -glycerophosphoric acid is preferably used in the range of 1 to 100 mM, more preferably in the range of 1 to 30 mM.
  • EGF epidermal growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • amphiregulin transforming growth factor- ⁇
  • HB-EGF heparin-binding EGF-like growth factor
  • epiregulin neurogulin and the like.
  • EGF is preferred because EGF is the most common and inexpensive.
  • the FGF is a fibroblast growth factor (FGF), and a growth factor selected from the FGF family is intended.
  • the FGF is preferably FGF-2 (bFGF), but may be selected from other FGF families such as FGF-1.
  • PDGF is intended to be a growth factor selected from the platelet-derived growth factor (PDGF) family, and may be PDGF-BB or PDGF-AB. preferable.
  • EGF EGF or PDGF
  • EGF EGF or PDGF
  • two or more growth factors may be used in any combination.
  • the mesenchymal stem cell line is preferable because it can induce differentiation into osteoblasts and promote the differentiation.
  • the content of the growth factor in the differentiation-inducing medium additive according to the present invention is not particularly limited. However, as a final concentration in the medium to which the differentiation-inducing medium additive is added, EGF is 0. It is preferable to use 5 to 200 ng / ml and PDGF to 0.5 to 100 ng / ml. FGF is preferably used at a concentration of 0.1 ng / ml to 10 ⁇ g / ml. For example, when bFGF is used as FGF, it is preferably used so as to be 0.1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the above compound and growth factor may be either natural or synthesized as long as they have activity as a growth factor, and have been produced by a method such as genetic recombination. May be.
  • the medium additive (Patent Document 1) developed by the present inventors for serum-free culturing of animal cells is characterized by its properties (for example, at a rate equal to or higher than that in a 10% serum-containing medium)
  • mesenchymal stem cells stem cells can be proliferated while retaining bone differentiation ability, fat differentiation ability and the like.
  • differentiation induction of target cells for bone differentiation induction for example, when the stem cells are mesenchymal stem cells, differentiation induction into osteoblasts, adipocytes, etc. cannot be performed under serum-free conditions. It was necessary to perform in the presence of serum.
  • the present inventor examined a culture method capable of inducing bone differentiation of the target cells for induction of bone differentiation even under serum-free conditions.
  • an additive for differentiation induction medium containing at least one growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, and PDGF, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate. It has been found that the differentiation target cells can be induced into osteoblasts even under serum-free conditions, and in particular, the mesenchymal stem cells can be efficiently induced to differentiate into osteoblasts. .
  • the differentiation induction efficiency is superior to the case of inducing bone differentiation in the presence of serum, and the period of bone differentiation induction. Has been found to be shortened.
  • the differentiation induction medium additive according to the present invention preferably further contains at least one phospholipid. Even when the differentiation induction medium additive not containing at least one phospholipid is used, it is possible to induce bone differentiation of the target cell for inducing bone differentiation, but by adding at least one phospholipid, It is preferable because the bone differentiation induction efficiency of the cell to be induced can be further increased and the time required for induction of bone differentiation can be further shortened. In addition, it is the knowledge for the first time confirmed by the present invention that phospholipid promotes the induction of bone differentiation of bone differentiation-inducing cells under serum-free conditions.
  • the phospholipid is not particularly limited, and examples thereof include phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylcholine. Fattydylglycerol etc. are mentioned, and the additive for differentiation induction medium according to the present invention may contain these phospholipids alone or in combination. When used in combination, phosphatidic acid and phosphatidylcholine are preferably used. Moreover, these phospholipids may be derived from animals or plants.
  • the content of the phospholipid in the differentiation induction medium additive is not particularly limited, but the final concentration in the medium to which the differentiation induction medium additive is added is the total concentration of phospholipid as the final concentration.
  • the amount is preferably 0.1 to 30 ⁇ g / ml, and the final concentration is most preferably 10 ⁇ g / ml as the total amount of phospholipid.
  • the final concentration of the total amount of phospholipid exceeds 30 ⁇ g / ml, toxicity to cells may occur, which is not preferable.
  • the additive for differentiation induction medium contains an antioxidant.
  • an antioxidant examples include DL- ⁇ -tocopherol acetate (vitamin E), dibutylhydroxytoluene (BHT), butylhydroxyanisole (BHA), catechin and the like.
  • DL- ⁇ -tocopherol acetate (vitamin E) ) Can be used particularly preferably.
  • the content of the antioxidant in the differentiation induction medium additive is not particularly limited, but the final concentration in the medium to which the differentiation induction medium additive is added is 0.1 to 50 ⁇ g / ml. It is preferable that
  • the above-mentioned additive for differentiation induction medium may further contain insulin, transferrin and selenate.
  • the differentiation-inducing medium additive according to the present invention is not necessarily required to contain insulin, transferrin, and selenate, and can sufficiently induce bone differentiation of target cells for bone differentiation induction even if they are not included.
  • the additive for differentiation-inducing medium according to the present invention does not need to contain insulin, transferrin, and selenate, which have been conventionally considered essential for inducing differentiation of stem cells. It is possible to induce differentiation.
  • the insulin may be an insulin-like growth factor, may be derived from natural cells, or may be produced by gene recombination.
  • the contents of insulin, transferrin, and selenate in the differentiation induction medium additive are not particularly limited, but the final concentration in the medium to which the differentiation induction medium additive is added is 0.5% of insulin. It is preferable that the concentration is ⁇ 50 ⁇ g / ml and transferrin is 0.5 to 50 ⁇ g / ml.
  • the selenate is preferably 0.1 to 50 ng / ml, more preferably 0.5 to 50 ng / ml.
  • ITS supplements may be used for insulin, transferrin, and selenate, and those prepared by appropriately mixing insulin, transferrin, and selenate may be used. Insulin, transferrin, and selenate may be used separately. What added to the said additive for differentiation induction culture media may be used.
  • the additive for differentiation-inducing medium according to the present invention may contain other components than the above-described components unless the effect of the present invention of inducing bone differentiation-inducing cells under serum-free conditions is impaired.
  • other glucocorticoids such as cortisol, corticosterone, cortisone, prednisolone and the like may be contained.
  • the content of these other components is preferably 10 ⁇ 10 to 10 ⁇ 6 M, preferably 10 ⁇ 9 to 10 ⁇ 7 M, as the final concentration in the medium to which the above-described additive for differentiation induction medium is added. It is more preferable.
  • the method for preparing the differentiation induction medium additive according to the present invention is not particularly limited, and can be prepared according to a conventionally known method. For example, it can be prepared by appropriately mixing the above-described components (one or more growth factors selected from the group consisting of EGF, FGF, and PDGF, dexamethasone, ⁇ -glycerophosphate, etc.).
  • additives such as excipients, binders, preservatives, stabilizers, emulsifiers, osmotic pressure regulators, bases and the like can be used as necessary.
  • the additive for differentiation-inducing medium according to the present invention can be formulated by a conventional formulation technique using the above-described additive components, and is a tablet, powder, granule, aqueous solvent, emulsion, oily agent, or suspension. It can be used as a solid or liquid dosage form such as an agent.
  • the above-mentioned additive for differentiation induction medium is preferably used for inducing differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts using the mesenchymal stem cells as the stem cells.
  • the growth factor contained in the differentiation induction medium additive of the present invention has an effect of promoting the bone differentiation program, dexamethasone induces bone morphogenetic factor (BMP), and ⁇ -glycerophosphate supplies phosphate and bone. Since it has an action that can promote calcification of blasts, it can efficiently induce osteoblast differentiation. Moreover, the bone differentiation of the osteoblast can be further promoted by further adding phospholipid. Therefore, the additive for differentiation-inducing medium of the present invention is also useful for promoting bone differentiation of osteoblasts.
  • a culture medium for inducing differentiation of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membranes and fibroblasts under serum-free conditions A culture medium for inducing bone differentiation under serum-free conditions of one or more cells selected from the group consisting of dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts (hereinafter simply referred to as “ The culture medium according to the present invention ”) includes the components constituting the differentiation induction medium additive according to the present invention and a basal medium, and does not contain serum. The said component is [1. ] Each component demonstrated in]. That is, the culture medium according to the present invention contains at least one growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, and PDGF, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate.
  • the phospholipid can further promote differentiation into osteoblasts under serum-free conditions, it is preferable that the phospholipid further contains at least one phospholipid as the above component.
  • the culture medium since the culture medium only needs to contain the component constituting the additive for differentiation-inducing medium according to the present invention and the basal medium, the above-mentioned components are [1. ] May be added in the form of the additive for differentiation induction medium described in [1. Each component described in the above may be separately added to the basal medium.
  • the basal medium means a culture medium for animal cells, and a conventionally known culture medium for animal cells can be used.
  • a conventionally known culture medium for animal cells can be used.
  • Ham's F12 medium, ⁇ -MEM medium, DMEM medium, RPMI-1640 medium, MCDB201 medium and the like can be mentioned. These basal media may be used alone or in combination.
  • the basal medium for constituting the culture medium according to the present invention is preferably a medium in which an ⁇ -MEM medium and MCDB201 medium are mixed at a ratio of 1: 1.
  • the culture medium according to the present invention can be obtained by mixing the components constituting the differentiation induction medium additive according to the present invention and a basal medium.
  • a basal medium for example, [1. ] [1. It can be prepared by adding to the final concentration described in the above.
  • the prepared culture medium may be sterilized appropriately before use.
  • the culture medium can induce differentiation of cells to be induced to induce bone differentiation under serum-free conditions.
  • mesenchymal stem cells are used as the stem cells, and mesenchymal stem cells are induced to differentiate into osteoblasts. It is more preferable to use it.
  • the culture medium of this invention contains the component which comprises the additive for differentiation-inducing culture media which concerns on this invention.
  • the growth factor contained in the differentiation induction medium additive has an action of promoting the bone differentiation program, dexamethasone induces bone morphogenetic factor (BMP), and ⁇ -glycerophosphate supplies phosphate and osteoblasts. Since it has an action capable of promoting calcification of cells, it can efficiently induce osteoblast differentiation. Moreover, the bone differentiation of the osteoblast can be further promoted by further adding phospholipid. Therefore, the culture medium of the present invention is also useful for promoting osteoblastic bone differentiation.
  • a culture method for inducing bone differentiation of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts under serum-free conditions A culture method for inducing bone differentiation under serum-free conditions of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts according to the present invention (hereinafter simply referred to as “cell culture method”).
  • the "culture method of the present invention” differentiates and cultures one or more cells selected from the group consisting of dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts in the culture medium of the present invention. The process of carrying out is included.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as the differentiation target cells for osteogenesis can be differentiated into osteoblasts.
  • the mesenchymal stem cells when using mesenchymal stem cells as the stem cells and inducing differentiation into osteoblasts, the mesenchymal stem cells cultured until they become confluent in 10% FBS-containing DMEM medium as shown in the examples described later Is cultured in the culture medium according to the present invention for 7 days or more in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2 to differentiate mesenchymal stem cells into osteoblasts.
  • the culture method for inducing bone differentiation of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts Prior to the above-described step of differentiating and culturing one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts in the culture medium according to FGF, PDGF, EGF , At least three growth factors selected from the group consisting of TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid and in serum-free culture medium, stem cells, pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane It is preferable to include a pre-process for growing and culturing one or more cells selected from the group consisting of fibroblasts.
  • a growth culture medium containing normal serum for example, 10% FBS
  • Bone differentiation-inducing target cells cultured using a DMEM-containing medium or the like can induce bone differentiation more efficiently than when osteogenesis is induced in the culture medium according to the present invention. .
  • the period for inducing bone differentiation can be further shortened.
  • the serum-free growth medium contains at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, EGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid, and does not contain serum.
  • FGF FGF
  • PDGF EGF
  • TGF- ⁇ TGF- ⁇
  • HGF HGF
  • phospholipid phospholipid contained in the serum-free growth medium
  • the TGF- ⁇ is a transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), and a growth factor selected from the TGF- ⁇ family is intended.
  • TGF- ⁇ is preferably TGF- ⁇ 3 , but may be selected from other TGF- ⁇ families.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the content of the growth factor in the blood-free growth medium is not particularly limited, but PDGF is 0.5 to 100 ng / ml and TGF- ⁇ is 0 as final concentrations in the serum-free growth medium. It is preferable to use 0.5 to 100 ng / ml, EGF 0.5 to 200 ng / ml, and HGF 0.1 to 50 ng / ml. FGF is preferably used at a concentration of 0.1 ng / ml to 10 ⁇ g / ml. For example, when bFGF is used as FGF, it is preferably used so as to be 0.1 to 100 ng / ml.
  • the content of phospholipid in the serum-free growth medium is not particularly limited, but the final concentration in the serum-free growth medium is 0.1 to 30 ⁇ g / ml as the total amount of phospholipid as the final concentration. Preferably, the final concentration is 10 ⁇ g / ml as the total amount of phospholipid. Moreover, when using in combination, it is preferable to add so that the final concentration of each phospholipid may become equal. When the final concentration of the total amount of phospholipid exceeds 30 ⁇ g / ml, toxicity to cells may occur, which is not preferable.
  • the serum-free growth medium may contain phospholipids alone or in combination.
  • the serum-free growth medium contains a combination of phosphatidic acid and phosphatidylcholine.
  • the serum-free growth medium preferably further contains at least one fatty acid.
  • fatty acids contained in the serum-free growth medium include linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, oleic acid, palmitoyl acid, palmitic acid, and stearin. These fatty acids may be contained alone or in combination. In addition to the above fatty acids, cholesterol may be further contained.
  • the fatty acid content in the serum-free growth medium is not particularly limited. For example, when a lipid concentrate (11905-031, manufactured by Gibco) is used, the volume ratio of 1/1 / of the serum-free growth medium is used. It is preferable to add a stock solution of lipid concentrate in an amount of 1000 to 1/10.
  • the serum-free growth medium further contains at least two factors selected from the group consisting of connective tissue growth factor (CTGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and ascorbic acid compound. You may do it.
  • CTGF connective tissue growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • ascorbic acid compound You may do it.
  • VEGF is intended a growth factor selected from the VEGF family.
  • VEGF is preferably VEGF-A, but VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-D, VEGF-E, PlGF (placental growth factor) -1, PlGF-2 And may be selected from other VEGF families.
  • the content of the factor in the serum-free growth medium is not particularly limited, but the final concentration in the serum-free growth medium is 0.1 to 20 ⁇ g / ml for CTGF and 0.5 to 0.5 for VEGF. It is preferable to use 100 ng / ml and the ascorbic acid compound at 0.5 to 200 ⁇ g / ml.
  • commercially available VEGF v3388, manufactured by Sigma
  • CTGF (036-19471, manufactured by Wako
  • the serum-free growth medium preferably contains a phospholipid antioxidant.
  • a phospholipid antioxidant see [1. ] Is omitted because it is as described above.
  • the serum-free growth medium contains DL- ⁇ -tocopherol acetate (vitamin E) as a phospholipid antioxidant.
  • the content of the antioxidant in the serum-free growth medium is not particularly limited, but the final concentration in the serum-free growth medium is preferably 0.1 to 50 ⁇ g / ml.
  • the serum-free growth medium may further contain a surfactant.
  • the serum-free growth medium contains Pluronic F-68 or Tween 80 as a surfactant.
  • the serum-free growth medium may further contain insulin, transferrin and selenate.
  • the serum-free growth medium may further contain dexamethasone or other glucocorticoids.
  • insulin, transferrin, selenate, dexamethasone, and other glucocorticoids [1. ] Is omitted because it is as described above.
  • the contents of insulin, transferrin and selenate in the serum-free growth medium are not particularly limited, but the final concentration in the serum-free growth medium is 0.5 to 50 ⁇ g / ml for insulin and 0 for transferrin. 0.5 to 50 ⁇ g / ml, and selenate is preferably 0.1 to 50 ng / ml.
  • the content of other glucocorticoids is not particularly limited, but is preferably 10 ⁇ 10 to 10 ⁇ 6 M as the final concentration in the serum-free growth medium.
  • the method for preparing the serum-free growth medium is not particularly limited, and can be prepared according to a conventionally known method. For example, it is prepared by appropriately mixing the above-mentioned components (at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid) with respect to the basal medium. Can do.
  • the serum-free STK2 medium used in Examples described later can be mentioned.
  • osteodifferentiation induction target cells As long as the differentiation differentiation target cells can be grown while maintaining the differentiation ability, there is no particular limitation.
  • mesenchymal stem cells are used as the stem cells, and as shown in the examples described later, the mesenchymal stem cells seeded at a density of 5000 cells / cm 2 are exchanged every 2 days or 3 days while changing the medium.
  • stem cells By culturing at 5 ° C. in the presence of 5% CO 2 , stem cells can be grown while maintaining the differentiation ability of mesenchymal stem cells.
  • the degree of differentiation of the target cell for inducing bone differentiation after culture into osteoblasts can be confirmed using a conventionally known bone differentiation marker. For example, it can be confirmed by staining bone differentiation-inducing target cells with alizarin red.
  • bone differentiation-inducing cells can be induced to undergo bone differentiation under serum-free conditions.
  • the culture method uses mesenchymal stem cells as the stem cells, and mesenchymal stem cells. Is more preferably used to induce differentiation into osteoblasts.
  • the step of culturing one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts in the culture medium according to the present invention comprises Include.
  • the culture method of the present invention is also useful for promoting osteoblastic bone differentiation.
  • Kit for inducing differentiation of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts under serum-free conditions A kit for inducing bone differentiation of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membranes and fibroblasts according to the present invention under serum-free conditions (hereinafter simply “ The kit) includes components constituting the differentiation induction medium additive according to the present invention. Further, a basal medium may be further provided.
  • the kit includes one or more growth factors selected from the group consisting of EGF, FGF, and PDGF, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate. Moreover, since differentiation is further promoted, it is preferable to further contain at least one phospholipid as the component.
  • the phospholipid is selected from the group consisting of phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and phosphatidylglycerol. Is preferred.
  • kit may contain insulin, transferrin and selenate.
  • the configuration of the kit is not limited to that described above, and may include other reagents and instruments.
  • a culture plate for culturing bone differentiation-inducing cells for example, a reagent that can evaluate the differentiation state into osteoblasts (for example, alizarin red, etc.), or a bone differentiation-inducing cell to be cultured May be provided.
  • the kit according to the present invention is provided with a suitable agent for differentiation induction medium, or the above compound and the above growth factor, or the above compound, the above growth factor and the above phospholipid, basal medium, and other reagents. It may be provided as a single container contained in various volumes and / or forms, or may be provided in separate containers. In addition, the kit according to the present invention may be provided with instructions describing the procedure for performing the above-described method according to the present invention.
  • the kit uses mesenchymal stem cells as the stem cells to induce bone differentiation. More preferably, it is used.
  • the kit of this invention is equipped with the component which comprises the additive for differentiation induction culture media which concerns on this invention.
  • the growth factor contained in the differentiation induction medium additive has an action of promoting the bone differentiation program, dexamethasone induces bone morphogenetic factor (BMP), and ⁇ -glycerophosphate supplies phosphate and osteoblasts. Since it has an action capable of promoting calcification of cells, it can efficiently induce osteoblast differentiation. Moreover, the bone differentiation of the osteoblast can be further promoted by further adding phospholipid. Therefore, the kit of the present invention is useful for promoting osteoblastic bone differentiation.
  • the osteoblast according to the present invention induces bone differentiation of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts according to the present invention under serum-free conditions.
  • Produced by a culture method Regarding the culture method for inducing bone differentiation under serum-free conditions of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts according to the present invention, 3.
  • the osteoblasts according to the present invention are compared with osteoblasts differentiated by a conventional osteodifferentiation induction method using a conventional osteodifferentiation induction medium.
  • the staining property of alizarin red, which indicates oxidization, is strong. That is, the osteoblast according to the present invention is characterized in that it is an osteoblast in which calcium is deposited more compared to an osteoblast differentiated by a conventional osteodifferentiation induction method using a conventional osteodifferentiation induction medium.
  • the osteoblast according to the present invention can be used for regenerative medicine using cells cultured in a serum-free medium for bone defect sites such as orthopedics and dentistry and osteoporosis.
  • ⁇ Cell culture conditions The examples of the present invention were performed using mesenchymal stem cells as stem cells. All cells were cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator in the presence of 5% CO 2 .
  • STK2 medium the medium (serum-free growth culture medium) used for the growth culture of mesenchymal stem cells is referred to as STK2 medium.
  • This is a serum-free medium supplemented with salt, lithium chloride, reduced L-glutathione, Pluronic F-68, and Tween 80.
  • the composition of STK2 medium is shown in Table 1.
  • “Source” indicates the source and model number of each substance shown in Table 1. “Effective concentration” indicates the allowable range of the final concentration of each substance constituting the STK2 medium in the STK2 medium.
  • the lipid concentrate (CD) is described as “1/1000 to 1/10”, but this is a stock solution of lipid concentrate in a volume ratio of 1/1000 to 1/10 of STK2 medium. Is added.
  • the surfactants Pluronic F-68 and Tween 80 are contained in the lipid concentrate.
  • Optimum Concentration represents the preferred amount of each substance constituting the STK2 medium.
  • STK0 medium the medium used for inducing differentiation of osteoblasts.
  • the composition of the STK0 medium is shown in Table 2.
  • “Source” indicates the source and model number of each substance shown in Table 2. “Effective concentration” indicates the allowable range of the final concentration of each substance constituting the STK0 medium in the STK0 medium.
  • the lipid concentrate (CD) is described as “1/1000 to 1/10”, but this is a stock solution of lipid concentrate in a volume ratio of 1/1000 to 1/10 of STK0 medium. Is added.
  • the surfactants Pluronic F-68 and Tween 80 are contained in the lipid concentrate.
  • “Optimum Concentration” represents a suitable amount of each substance constituting the STK0 medium.
  • the differentiation into osteoblasts was evaluated by staining the cells after differentiation induction with alizarin red (manufactured by Wako, model number: 011-01192).
  • the method for staining alizarin red was performed according to the method described in its instruction manual.
  • the degree of differentiation into osteoblasts was evaluated as “mild”, “moderate”, and “strength” based on the staining properties of alizarin red.
  • the “mild” differentiation is a stage where weak staining with alizarin red can be visually confirmed.
  • the above-mentioned “moderate” differentiation is a stage at which medium staining with alizarin red can be visually confirmed.
  • the above-mentioned “strength” differentiation is a stage in which strong staining of alizarin red can be visually confirmed over the entire well of a 24-well microplate.
  • Example 1 Examination of differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts (1)
  • Three mesenchymal stem cells derived from human iliac bone marrow (purchased from Bio-Whittaker (Walkersville, MD)) (hereinafter referred to as A strain, B strain, and C strain) were used as mesenchymal stem cells. .
  • the A strain was used after 5 passages
  • the B strain and C strain were used after 4 passages.
  • the mesenchymal stem cells were cultured using 6% FBS-containing DMEM and seeding the mesenchymal stem cells at a density of 5000 cells / cm 2 in a 6-well microplate containing the medium. During the cell culture period, the medium was changed every 2 or 3 days.
  • the cells are washed twice with PBS and detached from the plate by incubating in PBS containing 0.05% trypsin and 0.2 mM EDTA for containing serum It was resuspended with Trypsin® inhibitor (manufactured by Sigma: T6522) derived from a non-plant.
  • the cells were cultured in serum-free STK2 medium in a CO 2 incubator in the presence of 5% CO 2 until confluence at 37 ° C.
  • the 24-well microplate with the cells adhered to the bottom surface was washed twice with serum-free DMEM medium, and each culture medium shown in Table 3 was used for 3 days, 7 days, 14 days. Or for 21 days.
  • the medium was replaced with a new identical medium every 2 to 3 days.
  • the differentiation into osteoblasts was evaluated by staining the cells with alizarin red on the 3rd or 7th day after the start of differentiation culture in each culture medium shown in Table 3.
  • Example 3 the medium for inducing bone differentiation used in Example 1 shown in Table 3 will be described.
  • 10% FBS-DMEM is a DMEM medium containing 10% FBS.
  • the “10% FBS-DMEM” was used as a control medium.
  • the “10% FBS-bone differentiation-inducing medium” includes ⁇ -MEM, FBS at a final concentration of 10% by weight, dexamethasone at a final concentration of 100 nM, ⁇ -glycerophosphate at a final concentration of 10 mM, and L-ascorbic acid 2-phosphorus.
  • This is a medium prepared by adding acid sesquimagnesium salt to a final concentration of 50 ⁇ g / ml, and is the same as the conventionally known bone differentiation-inducing medium used in Patent Document 1.
  • “Serum-free bone differentiation induction medium: A” is a medium obtained by adding ⁇ -glycerophosphate to STK0 medium, which is a serum-free medium, to a final concentration of 10 mM.
  • “A- (FGF-2)” is a serum-free bone differentiation inducing medium: a medium obtained by removing FGF-2 from A.
  • the removal of FGF-2 from the serum-free bone differentiation-inducing medium: A is performed by not adding FGF-2 alone when preparing the serum-free bone differentiation-inducing medium: A. be able to.
  • serum-free bone differentiation-inducing culture medium the removal of the TGF- ⁇ 3 from A", etc. The same is true for.
  • A- (TGF- ⁇ 3 ) is a serum-free bone differentiation-inducing medium: A medium in which TGF- ⁇ 3 is removed.
  • A-HGF is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium obtained by removing HGF from A.
  • A-EGF is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium obtained by removing EGF from A.
  • A- (PDGF-BB) is a medium obtained by removing PDGF-BB from serum-free bone differentiation-inducing medium: A.
  • “Serum-free bone differentiation-inducing medium: B” is a medium in which FGF-2, TGF- ⁇ 3 , HGF, EGF, and PDGF-BB are removed from serum-free bone differentiation-inducing medium: A.
  • B + EGF is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium in which EGF is added to B so that the final concentration is 20 ng / ml.
  • B + (FGF-2)” is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium in which FGF-2 is added to B so that the final concentration is 1 ng / ml.
  • B + (TGF- ⁇ 3 ) is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium in which TGF- ⁇ 3 is added to B to a final concentration of 10 ng / ml.
  • B + HGF is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium in which HGF is added to B so that the final concentration is 5 ng / ml.
  • B + (PDGF-BB) is a medium in which PDGF-BB is added to serum-free bone differentiation-inducing medium B to a final concentration of 10 ng / ml.
  • FIG. 1 shows mesenchymal stem cells in the case of using the above-mentioned “10% FBS-bone differentiation induction medium”, that is, a conventionally known 10% FBS-containing bone differentiation induction medium and serum-free bone differentiation induction medium: B. It is a figure which shows the result which confirmed the differentiation induction to an osteoblast. Although the results are shown in triplicate, the results for the A, B and C strains are shown from the left.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of examining the influence of growth factors on differentiation induction of mesenchymal stem cells into osteoblasts.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of examining the effect of EGF on differentiation induction of mesenchymal stem cells into osteoblasts using a 10% FBS-containing osteodifferentiation induction medium.
  • the serum-free bone differentiation-inducing medium: B shown in FIG. 1 is the serum-free bone differentiation-inducing medium: B shown in Table 3, and from the medium in which 10 mM ⁇ -glycerophosphate was added to STK0 medium, EGF, Excluding TGF- ⁇ 3 , HGF, FGF-2 and PDGF-BB.
  • serum-free bone differentiation-inducing medium: B + EGF is obtained by adding EGF to serum-free bone differentiation-inducing medium: B to a final concentration of 20 ng / ml.
  • Serum-free bone differentiation-inducing medium a medium in which EGF is added to B, moderate differentiation is observed on the third day, and 10% FBS is contained on the seventh day. It was confirmed that the differentiation induction was far more advanced than the 21st day when the bone differentiation induction medium was used.
  • Serum-free bone differentiation-inducing medium B is obtained by removing EGF, TGF- ⁇ 3 , HGF, FGF-2 and PDGF-BB from a medium obtained by adding 10 mM ⁇ -glycerophosphate to STK0 medium as described above. is there.
  • a basic medium medium in which MCDB and ⁇ -MEM are mixed at a ratio of 1: 1).
  • Arachidonic acid myristic acid, oleic acid, palmitoyl acid, palmitic acid, and stearic acid
  • phospholipids phosphatidic acid and phosphatidylcholine
  • cholesterol antioxidant DL- ⁇ -tocopherol acetate
  • vitamin E vitamin E
  • serum-free bone differentiation induction medium: B + EGF means a serum-free bone differentiation induction medium: B added with EGF to a final concentration of 20 ng / ml.
  • serum-free bone differentiation induction medium: A- (FGF-2) means a serum-free bone differentiation induction medium: a medium obtained by removing FGF-2 from A.
  • the culture period in FIG. 2 is 7 days.
  • Figure 2 as shown in Table 3, the serum-free bone differentiation-inducing medium: When using the A, the case of using the medium minus TGF-beta 3 therefrom only differentiation was observed.
  • the serum-free bone differentiation-inducing culture medium If you make the TGF- ⁇ 3 in B was observed differentiation.
  • the growth factor, EGF there is inadequate things as the mesenchymal stem cells and suitable to differentiate into osteoblasts, TGF-beta 3 as FGF-2, PDGF-BB I understood that.
  • control is a test group not containing ⁇ -glycerophosphate
  • right column is a test group containing ⁇ -glycerophosphate at a final concentration of 10 mM. is there.
  • FIG. 3 shows that the addition of EGF to 10% FBS-bone differentiation-inducing medium promotes differentiation into osteoblasts.
  • Serum-free bone differentiation-inducing medium shown in Fig. 1: B was inferior to the test group in which EGF was added to B.
  • Example 2 Examination of differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts (2)
  • mesenchymal stem cells human iliac bone marrow derived mesenchymal stem cells (purchased from Bio-Whittaker (Walkersville, MD)) 5 strains (hereinafter referred to as F strain, G strain, H strain, I strain, and J strain) Used).
  • the F strain, the H strain, and the I strain were used after 5 passages
  • the G strain and the J strain were used after 4 passages.
  • 10% FBS-containing DMEM was used, and the mesenchymal stem cells were seeded at a density of 5000 cells / cm 2 in a 6-well microplate containing the medium. During the cell culture period, the medium was changed every 2 or 3 days.
  • the 24-well microplate with the cells adhered thereto was washed twice with serum-free DMEM medium and cultured in each culture medium shown in Table 4 for 7 days, 14 days, or 21 days. did.
  • the medium was replaced with a new identical medium every 2 to 3 days. Evaluation of differentiation into osteoblasts was performed by staining the cells with alizarin red on the 7th, 14th, or 21st day after the start of differentiation culture in each culture medium shown in Table 4. It was.
  • Example 2 shown in Table 4 will be described.
  • 10% FBS-bone differentiation induction medium is the same as “10% FBS-bone differentiation induction medium” used in Example 1.
  • “Serum-free bone differentiation-inducing medium: B” is the same as “Serum-free bone differentiation-inducing medium: B” used in Example 1. Also, “B + EGF”, “B + (FGF-2)”, “B + (TGF- ⁇ 3 )”, “B + HGF”, and “B + (PDGF-BB)” are the same as those used in Example 1. It is.
  • “Serum-free bone differentiation-inducing medium: C” is a medium in which FGF-2 and EGF are added to serum-free bone differentiation-inducing medium: B so that the final concentrations are 1 ng / ml and 20 ng / ml, respectively.
  • “C-Dex” is a medium obtained by removing dexamethasone from serum-free bone differentiation-inducing medium: C.
  • “C-VC” is a medium obtained by removing L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt from serum-free bone differentiation-inducing medium: C.
  • C- ( ⁇ -glycerophosphate) is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium obtained by removing ⁇ -glycerophosphate from C.
  • C-PA-PC is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium obtained by removing phosphatidylcholine and phosphatidic acid sodium salt from C.
  • C-CD is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium obtained by removing a lipid concentrate from C.
  • C-LiCl is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium obtained by removing LiCl from C.
  • C-ITS is a serum-free bone differentiation-inducing medium: medium obtained by removing insulin, transferrin and selenate from C.
  • C-CD-LiCl is a serum-free bone differentiation-inducing medium: a medium obtained by removing lipid concentrate and LiCl from C.
  • C-CD-LiCl-VC + (PDGF-BB) is a serum-free bone differentiation-inducing medium: removing lipid concentrate, LiCl, and L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt from C, and PDGF A medium supplemented with BB to a final concentration of 10 ng / ml.
  • Table 4 shows the results of bone differentiation on day 7 after differentiation induction
  • Table 5 shows the results of bone differentiation on day 14
  • Table 6 shows the results of bone differentiation on day 21.
  • a serum-free bone differentiation-inducing medium B, ie, a medium in which 10 mM ⁇ -glycerophosphate was added to STK0 medium, with EGF, TGF- ⁇ 3 , HGF, FGF-2, and PDGF-BB removed.
  • B a medium in which 10 mM ⁇ -glycerophosphate was added to STK0 medium, with EGF, TGF- ⁇ 3 , HGF, FGF-2, and PDGF-BB removed.
  • EGF, TGF- ⁇ 3 , HGF, FGF-2, and PDGF-BB removed.
  • osteoblast differentiation could not be confirmed even 21 days after differentiation induction. Therefore, it was revealed that the addition of some growth factors is essential for inducing bone differentiation under serum-free conditions.
  • serum-free bone differentiation-inducing medium PDGF-BB alone is added to B
  • serum-free bone differentiation-inducing medium EGF alone is added to B
  • serum-free bone differentiation-inducing medium FGF- It was revealed that by adding 2 and EGF in combination, differentiation into osteoblasts can be induced very efficiently under serum-free conditions.
  • C-CD serum-free bone differentiation-inducing medium
  • a serum-free bone differentiation-inducing medium a medium obtained by removing a lipid concentrate from C
  • C serum-free bone differentiation-inducing medium
  • serum-free bone differentiation-inducing medium medium in which phospholipids (phosphatidylcholine and phosphatidate) are removed from C
  • serum-free bone differentiation induction Compared to the case of using medium: C, the efficiency of differentiation into osteoblasts was reduced, and it became clear that differentiation into osteoblasts was further promoted by adding phospholipid. .
  • mesenchymal stem cells are cultured more than when cultured with high-concentration serum. It became clear that differentiation can be strongly induced into osteoblasts.
  • the mesenchymal stem cells are serum-free. It was revealed that differentiation can be induced in osteoblasts under conditions. It was also revealed that differentiation into osteoblasts is further promoted when at least one phospholipid is further contained in addition to the growth factor, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate. Therefore, the mesenchymal stem cells are eliminated by adding one or more growth factors selected from the group consisting of EGF, FGF, and PDGF, dexamethasone, and ⁇ -glycerophosphate to the basal medium as additives.
  • Table 7 shows an example of a preferred serum-free medium composition.
  • the serum-free medium having the composition shown in Table 7 is hereinafter referred to as “STK3 medium”.
  • Example 3 Examination of differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts (3)
  • Three mesenchymal stem cells derived from human bone marrow purchased from Bio-Whittaker (Walkersville, MD)) (hereinafter referred to as K strain, L strain and M strain) were used as mesenchymal stem cells.
  • the K strain was used after 8 passages
  • the L strain was used after 7 passages
  • the M strain was used after 10 passages.
  • the mesenchymal stem cells were seeded at a density of 5000 cells / cm 2 in a 6-well microplate containing serum-free STK2 medium and containing the medium. During the cell culture period, the medium was changed every 2 or 3 days.
  • the cells are washed twice with PBS and detached from the plate by incubating in PBS containing 0.05% trypsin and 0.2 mM EDTA for containing serum It was resuspended with Trypsin® inhibitor (manufactured by Sigma: T6522) derived from a non-plant.
  • the cells were cultured in serum-free STK2 medium in a CO 2 incubator in the presence of 5% CO 2 until confluence at 37 ° C.
  • the 24-well microplate with the confluent cells adhered to the bottom surface was washed 2-3 times with serum-free DMEM medium, and 10% FBS-bone differentiation-inducing medium or serum-free bone differentiation-inducing medium (STK3 Medium).
  • the “10% FBS-bone differentiation induction medium” is ⁇ -MEM
  • FBS is 10% by weight
  • dexamethasone is 100 nM in final concentration
  • ⁇ -glycerophosphate 10 mM in final concentration.
  • a medium prepared by adding L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt to a final concentration of 50 ⁇ g / ml, which is the same as the conventionally known bone differentiation-inducing medium used in Patent Document 1. is there.
  • the medium was replaced with a new identical medium every 2 to 3 days.
  • the differentiation of the cells into osteoblasts was evaluated by staining the cells with alizarin red. .
  • the results are shown in FIG. 4 and Tables 8-11.
  • the mesenchymal stem cells were seeded at a density of 5000 cells / cm 2 in a 6-well microplate containing the medium using a DMEM medium containing 10% FBS. During the cell culture period, the medium was changed every 2 or 3 days.
  • the cells are washed twice with PBS and detached from the plate by incubating in PBS containing 0.05% trypsin and 0.2 mM EDTA for containing serum It was resuspended with Trypsin® inhibitor (manufactured by Sigma: T6522) derived from a non-plant.
  • the cells were cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator in the presence of 5% CO 2 until they became confluent.
  • the 24-well microplate with the confluent cells adhered to the bottom surface was washed 2-3 times with serum-free DMEM medium, and 10% FBS-bone differentiation-inducing medium or serum-free bone differentiation-inducing medium (STK3 Medium). During the differentiation induction period, the medium was replaced with a new identical medium every 2 to 3 days. On the 4th, 7th, 14th, or 21st day after the start of culture in the culture medium, the cells were stained with alizarin red to evaluate the differentiation into osteoblasts. The results are shown in FIG. 4 and Tables 8-11.
  • FIG. 4 shows the results of induction of differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.
  • the results of bone differentiation on the 4th day after differentiation induction shown in FIG. 4 are shown in Table 8, the results of bone differentiation on the 7th day after differentiation induction are shown in Table 9, and the results of bone differentiation on the 14th day are shown in Table 10.
  • Table 11 shows the results of bone differentiation on day 21.
  • the cells were grown using serum-free STK2 medium and differentiation-induced using serum-free STK3 medium. It was confirmed that leaf stem cells have already started to differentiate into osteoblasts.
  • mesenchymal stem cells that were proliferated and cultured using STK2 medium and differentiation-induced using conventional 10% FBS-bone differentiation induction medium differentiation into osteoblasts was not confirmed. It was.
  • the cells were grown and cultured using 10% FBS-containing DMEM medium, and differentiation induction was performed using serum-free STK3 medium.
  • Mesenchymal stem cells and mesenchymal stem cells that have been proliferated and cultured using serum-free STK2 medium and induced to differentiate using serum-free STK3 medium are all differentiated into osteoblasts. confirmed.
  • the cells were proliferated and cultured using DMEM medium containing 10% FBS, and differentiation induction was performed using 10% FBS-bone differentiation induction medium. It was confirmed that the mesenchymal stem cells that had undergone the differentiation into osteoblasts.
  • the degree of differentiation into osteoblasts was lighter than that of mesenchymal stem cells that had been proliferated and cultured using 10% FBS-containing DMEM medium and differentiation-induced using STK3 medium.
  • mesenchymal stem cells that were proliferated and cultured using serum-free STK2 medium and induced to differentiate using serum-free STK3 medium were grown and cultured using DMEM medium containing 10% FBS, It was also confirmed that the cells differentiated more strongly into osteoblasts than mesenchymal stem cells induced to differentiate using serum-free STK3 medium.
  • the cells were proliferated using DMEM medium containing 10% FBS, and differentiation induction was performed using serum-free STK3 medium. Both mesenchymal stem cells and mesenchymal stem cells grown and cultured using serum-free STK2 medium and induced to differentiate using serum-free STK3 medium must be strongly differentiated into osteoblasts. Was confirmed.
  • mesenchymal stem cells that were proliferated and cultured using DMEM medium containing 10% FBS and induced to differentiate using 10% FBS-bone differentiation induction medium were proliferated using serum-free STK2 medium.
  • the degree of differentiation into osteoblasts was lighter than mesenchymal stem cells cultured and induced to differentiate using 10% FBS-bone differentiation induction medium.
  • Example 3 when using the serum-free STK3 medium, the mesenchymal stem cells were more efficiently and more efficiently compared with the conventional method using 10% FBS-bone differentiation induction medium. It became clear that it can differentiate into osteoblasts quickly. From this result, the mesenchymal stem cells proliferated and cultured using serum-free STK2 medium were changed to osteoblasts of mesenchymal stem cells rather than mesenchymal stem cells proliferated and cultured using DMEM medium containing 10% FBS. It was revealed that the differentiation potential of the is maintained high.
  • differentiation induction medium for inducing bone differentiation into cells under serum-free conditions of one or more cells selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts according to the present invention
  • One kind selected from the group consisting of stem cells, dental pulp cells, periodontal ligament cells, placenta, amniotic membrane and fibroblasts by adding an additive to a serum-free medium, stronger than conventional differentiation-inducing medium containing serum
  • the above cells can be differentiated into bone. Therefore, the additive for differentiation induction medium can be suitably used in regenerative medicine.

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Abstract

　幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤およびその利用を提供する。本発明に係る、幹細胞を無血清条件下で分化誘導するための分化誘導培地用添加剤は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンとβ－グリセロリン酸とを少なくとも含有する。通常アスコルビン酸２－リン酸とＩＴＳは骨分化に必須であるが、本発明の分化誘導培地用添加剤には不必要である。また、リン脂質を添加することで骨分化を促進できた。

Description

分化誘導培地用添加剤およびその利用
　本発明は、分化誘導用培地添加剤およびその利用に関するものであり、より詳細には、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤およびその利用に関するものである。
　幹細胞は、自己複製能と分化能を有する細胞である。上記幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、および体性幹細胞等が知られている。上記体性幹細胞としては、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞等がある。上記ＥＳ細胞および上記ｉＰＳ細胞は、あらゆる組織へと分化することができる多分化能を有している。上記造血幹細胞は、血液細胞へと分化する能力を有しており、上記神経幹細胞は、神経細胞へと分化する能力を有している。また、上記間葉系幹細胞は、骨髄等の組織中に存在し、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等へ分化する多分化能を有する幹細胞として知られている。
　上記幹細胞のうち、例えば、間葉系幹細胞は、現在、再生医療分野において移植用細胞として利用されており、間葉系幹細胞の適応対象である疾患は、骨欠損、軟骨欠損、歯周病、心筋梗塞、難治性皮膚疾患、骨粗しょう症、変形性関節病、脊髄損傷、造血支持、臓器移植での拒絶反応抑制等、多岐にわたる。今後、間葉系幹細胞の適応対象となる疾患は、さらに増えるものと予想される（例えば、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症、腎臓疾患等）。
　上記幹細胞から各種機能性細胞への分化誘導培地としては、現在、動物血清（通常１０～１５％ウシ胎仔血清）が添加された培地が広く用いられている。この血清は、生体外での細胞の成長および／または増殖を促進するための栄養源、またはホルモン等の生理活性物質の供給源として用いられている。
　しかしながら、血清は、非常に高価であり、また天然製品であるがゆえにロット毎に成分の差が生じる。そのため、細胞分化の促進効果にばらつきが生じやすい。また、培養後の細胞から血清由来のタンパク質等を除去するために精製する必要があり、作業が煩雑になる。さらに、血清中に混入している未知の病原体（ウイルス、病原性プリオン等）により培養細胞が汚染される危険性がある。また、例えば、間葉系幹細胞を分化誘導する場合、血清中には、間葉系幹細胞の骨分化を阻害する成分が含まれる可能性があり、骨分化の効率を低下させうる。それゆえ、無血清条件下で上記幹細胞を分化誘導させうる技術が、再生医療の実現および普及には不可欠である。
　例えば、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化誘導する場合、これまでに、血清の使用量を低減させて骨分化を行う方法は知られており、例えば、ウシ胎仔血清の量を１％に低減した培地に上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）を添加することによって、間葉系幹細胞の骨形成細胞への分化を誘導する方法が開示されている（非特許文献１）。
　また、特定の増殖因子およびリン脂質を含有する組成物を基礎培地に添加することにより、間葉系幹細胞を無血清条件下で培養した細胞を、血清含有培地で骨芽細胞または脂肪細胞へ分化誘導させる技術も知られている（特許文献１）。
国際公開第２００７／０８０９１９Ａ１号パンフレット（２００７年７月１９日公開）
ＳＣＩＥＮＣＥ，３０８，１４７２‐１４７７，２００５．
　しかしながら、特許文献１の構成では、間葉系幹細胞を無血清条件下で培養することはできるものの、分化誘導を無血清条件下で行うことはできていない。
　また、非特許文献１の構成では、血清の使用量は低減されているとはいえ、依然として血清含有培地で分化誘導を行うため、分化の促進効果にばらつきが生じるという問題、精製作業の煩雑さという問題、培養細胞汚染の問題、安価に分化誘導を行うことができないという問題などの、血清に起因する問題点を内包している。一方、無血清条件下で間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する方法については、これまでに存在する知見はない。
　また、他の幹細胞に関しても、同様に無血清条件下で分化誘導する方法についてはほとんど知見が無い。例えば、ＥＳ細胞を無血清条件下で神経細胞へと分化誘導する場合に用いられる無血清培地は、市販のＮ２添加剤およびＢ２７添加剤（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）という高価な添加剤を基本培地に加える必要があり、無血清条件下での分化誘導が可能であるとしても、血清の代わりに高価な添加剤を加える必要があるという問題を有する。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で安価に効率よく骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤およびその利用を提供することにある。
　本発明に係る、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とを少なくとも含有することを特徴としている。
　上記の構成によれば、上記増殖因子は幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞（以下、これらの細胞を総称して「骨分化誘導対象細胞」ともいう）の骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは細胞の生存と分化を促進し、β－グリセロリン酸はリン酸を供給し、かつ石灰化を促進しうる作用を有する。それゆえ、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を基礎培地に添加することにより、無血清条件下で骨分化誘導対象細胞を効率よく骨分化誘導することができると考えられる。
　したがって、ばらつきのない安定した分化促進効果を得ることができる。また、培養後の細胞から血清由来のタンパク質等を除去するための精製を行うことなく、且つ血清中に混入している未知の病原体による培養細胞の汚染を防ぐことができる。さらに、高価な血清を用いる必要が無いので安価に上記分化誘導を行うことができる。また、従来、骨分化誘導に必要と考えられていたヒトインシュリン組み替え体、トランスフェリン、セレネート、およびアスコルビン酸を添加する必要が必ずしも無いため、分化誘導培地用添加剤をより安価に提供することができる。
　本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することが好ましい。さらに、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、およびフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
　上記構成によれば、上記増殖因子、デキサメタゾン、およびβ－グリセロリン酸の働きによって骨分化誘導対象細胞を分化誘導することができるとともに、少なくとも１つのリン脂質の働きによって、骨分化誘導対象細胞の骨分化を誘導するシグナル伝達系が活性化されるため、さらに骨分化を促進することができる。したがって、骨分化誘導対象細胞をより効率よく骨分化誘導することができ、骨分化誘導に必要な時間を短縮することができる。結果として、骨分化誘導にかかるコストを削減することができる。
　本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、酸化防止剤をさらに含有することが好ましく、上記酸化防止剤はＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
　上記構成によれば、リン脂質の劣化を防止することができるので、骨分化誘導対象細胞をより効率的に骨に分化させることが可能になる。
　また、上記分化誘導培地用添加剤は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いる骨分化誘導に用いることが好ましい。
　上記の構成によれば、上記増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、β－グリセロリン酸はアルカリホスファターゼにより無機リン酸に変換されてリン酸を供給し、かつ石灰化を促進しうる作用を有する。それゆえ、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を基礎培地に添加することにより、無血清条件下で間葉系幹細胞を効率よく骨芽細胞に分化誘導することができると考えられる。したがって、ばらつきのない安定した分化促進効果を得ることができる。また、少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することによって、間葉系幹細胞の骨分化を誘導するシグナル伝達系が活性化されるため、さらに骨分化を促進することができる。したがって、間葉系幹細胞をより効率よく骨芽細胞に分化誘導することができ、骨分化誘導に必要な時間を短縮することができる。結果として、骨分化誘導にかかるコストを削減することができる。
　本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養培地は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分および基礎培地を含有し、血清を含まないことを特徴としている。
　また、上記培養培地は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いる骨分化誘導に用いることが好ましい。
　本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法は、上記培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する工程を包含することを特徴としている。
　また、上記培養方法は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いることが好ましい。
　本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するためのキットは、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分を備えていることを特徴としている。
　また、上記キットは、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いる骨分化誘導に用いることが好ましい。
　本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、上述のように、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とを少なくとも含有することにより、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で骨分化誘導することができる。さらに、少なくとも１つのリン脂質を含有することにより、無血清条件下における骨分化誘導対象細胞の骨分化をさらに促進させることができる。
　よって、上記培養培地中で骨分化誘導対象細胞を培養することにより、骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導を効率的に行うことができる。さらに、上記キットを用いることにより、従来無血清下で行うことが困難であった骨分化誘導対象細胞の骨分化を容易に行うことができる。
　さらに、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いることにより、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導を効率的に行うことができる。さらに、上記キットを用いることにより、従来無血清下で行うことが困難であった間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を容易に行うことができる。
　また、本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法では、本発明に係る培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する上記工程よりも前に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を増殖培養する前工程を包含することが好ましい。
　骨分化誘導対象細胞を、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない培養培地（以下、「無血清増殖培養培地」と称する）を用いて培養することによって、骨分化誘導対象細胞の分化能を高く維持することができる。これは、上記無血清増殖培養培地には血清に含まれる骨分化誘導対象細胞の増殖促進因子の全てが含まれている訳ではないが、骨分化誘導対象細胞の増殖抑制因子は全く含まれないため、血清含有培地よりも骨分化誘導対象細胞の増殖能および多分化能を高く保つことができるためであると考えられる。
　従って、上記無血清増殖培養培地中で増殖培養された骨分化誘導対象細胞を、本発明に係る培養培地中で骨分化誘導させることは、骨分化誘導対象細胞の増殖能および多分化能が高く保たれた骨分化誘導対象細胞を、本発明に係る培養培地中で効率よく骨分化誘導することになる。このため、通常の血清を含む増殖培養培地を用いて培養された骨分化誘導対象細胞を用いて、本発明に係る培養培地中で骨分化誘導を行った場合と比較して、効率よく骨分化誘導を行うことができる。その結果、骨分化誘導にかかる期間をより短縮させることができる。
　また、本発明に係る骨芽細胞は、本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法によって生産されたことを特徴としている。
　本発明に係る骨芽細胞は、従来の骨分化誘導培地を用いる従来の骨分化誘導方法によって分化誘導された骨芽細胞と比較して、骨芽細胞の石灰化を示すアリザリンレッドの染色性が強い。つまり、本発明に係る骨芽細胞は、従来の骨分化誘導培地を用いる従来の骨分化誘導方法によって分化誘導された骨芽細胞と比較してカルシウムがより沈着した骨芽細胞であるという特性を有している。
　このため、本発明に係る骨芽細胞を用いれば、整形、歯科など骨欠損部位および骨粗鬆症に無血清培地で培養した細胞を用い再生医療に役立てることができる。
　本発明に係る、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤は、以上のように、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とを少なくとも含有する。それゆえ、基礎培地に添加することにより、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で効率よく骨分化誘導することができ、高価であり、かつ、病原体混入や分化のばらつき等の危険性がある血清の使用を回避することができるという効果を奏する。また、従来、骨分化誘導に必要と考えられていたヒトインシュリン組み替え体、トランスフェリン、セレネート、およびアスコルビン酸を添加する必要が無いため、分化誘導培地用添加剤をより安価に提供することができる。
１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地と、無血清骨分化誘導培地：Ｂとを用いた場合の、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導を確認した結果を示す図である。 増殖因子が間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響について検討した結果を示す図である。 １０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用い、ＥＧＦが間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響について検討した結果を示す図である。 間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導の結果を示す図である。
　本発明の実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を示す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」であることを示す。
　〔１．幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤〕
　本発明に係る、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤（以下、単に「本発明に係る分化誘導培地用添加剤」という）は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とを少なくとも含有する。
　本明細書において、上記「幹細胞」は、ヒト由来であってもよいし、動物由来であってもよい。上記「幹細胞」としては、骨芽細胞へと分化する能力を有しているものであれば特に限定されない。このような「幹細胞」としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞等の体性幹細胞等を挙げることができる。
　上記幹細胞としては、支持細胞とともに用いてもよいし、幹細胞単独で用いてもよい。上記体性幹細胞としては、組織から採取したプライマリーな体性幹細胞を用いてもよいし、株化されたものを用いてもよい。また、上記ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等から分化誘導して得られた体性幹細胞を用いてもよい。また、例えば、分化途中のものであってもよいし、未分化なものであってもよい。また、分化させる幹細胞は、コンフルエントに達した細胞でもよいし、達していない細胞でもよい。
　上記幹細胞として、間葉系幹細胞を例に挙げると、例えば、骨髄由来、脂肪由来、骨膜由来、滑膜由来、臍帯血由来、胎盤由来、指由来等の間葉系幹細胞を用いることができる。また、間葉系幹細胞の分化誘導の中でも、骨芽細胞へと分化誘導させる場合を例に挙げると、上記間葉系幹細胞は、骨芽細胞に分化途中のものであってもよいし、未分化なものであってもよい。また、分化させる間葉系幹細胞は、コンフルエントに達した細胞でもよいし、達していない細胞でもよい。
　歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞としては、ヒト由来であってもよいし、動物由来であってもよい。また、支持細胞とともに用いてもよいし、単独で用いてもよい。また、組織から採取したプライマリーな細胞を用いてもよいし、株化されたものを用いてもよい。
　幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞は、それぞれを単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
　デキサメタゾンおよびβ－グリセロリン酸は、上記増殖因子と組み合わせて基礎培地に添加することにより、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で効率よく骨分化誘導することができる。具体的には、骨芽細胞の細胞外マトリックス形成と石灰化を効率よく行うことができる。
　各化合物の使用量は特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、例えば、デキサメタゾンは、１０－６～１０－１０Ｍの範囲内で用いることが好ましく、１０－7～１０－9Ｍの範囲内で用いることがより好ましい。また、β－グリセロリン酸は、１～１００ｍＭの範囲内で用いることが好ましく、１～３０ｍＭの範囲内で用いることがより好ましい。
　上記ＥＧＦとは上皮増殖因子（ＥＧＦ：epidermal growth factor）のことであり、ＥＧＦファミリーから選択される増殖因子が意図される。ＥＧＦファミリーとしては、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α（transforming growth factor-α）、ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ、ＨＢ－ＥＧＦ（heparin-binding EGF-like growth factor）、ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ、ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ等が挙げられるが、ＥＧＦファミリーの中でＥＧＦが最も一般的で安価であることから、ＥＧＦであることが好ましい。
　上記ＦＧＦとは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：fibroblast growth factor）のことであり、ＦＧＦファミリーから選択される増殖因子が意図される。ＦＧＦとしては、ＦＧＦ－２（ｂＦＧＦ）であることが好ましいが、ＦＧＦ－１などの他のＦＧＦファミリーから選択されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、ＰＤＧＦとは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：platelet derived growth factor）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＰＤＧＦ－ＢＢまたはＰＤＧＦ－ＡＢであることが好ましい。
　ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される増殖因子は、上記本発明に係る分化誘導培地用添加剤中に少なくとも１つ含まれていればよい。中でもＥＧＦまたはＰＤＧＦが好ましく、ＥＧＦが特に好ましく用いられるが、２以上の増殖因子を任意に組み合わせて用いてもよい。特に、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いて、骨分化誘導を行う場合、上記増殖因子の中でも、ＥＧＦおよびＦＧＦを組み合わせて用いると、それぞれを単独で用いた場合と比較して、様々な異なる間葉系幹細胞株を、骨芽細胞へ分化誘導することができ、且つ上記分化を促進することができるため好ましい。他の幹細胞についても、２以上の増殖因子を任意に組み合わせて用いると、分化を促進できるため好ましい。
　本発明に係る分化誘導培地用添加剤における上記増殖因子の含有量は、特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、ＥＧＦは０．５～２００ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦは０．５～１００ｎｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。ＦＧＦは０．１ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。例えば、ＦＧＦとしてｂＦＧＦを用いる場合は、０．１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。
　なお、上記化合物および増殖因子は、増殖因子としての活性を有している限り、天然のものであっても合成されたものであってもよく、遺伝子組み換え等の方法によって製造されたものであってもよい。
　本発明者らが開発した、動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤（特許文献１）は、１０％血清含有培地において培養した場合と同等またはそれ以上の速度で、その特性（例えば、間葉系幹細胞であれば骨分化能、脂肪分化能など）を保持したまま幹細胞を増殖させることができる。しかしながら、骨分化誘導対象細胞の分化誘導、例えば、上記幹細胞が間葉系幹細胞の場合、骨芽細胞、脂肪細胞等への分化誘導を無血清条件下で行うことはできず、上記分化誘導は血清存在下で行う必要があった。
　そこで本発明者は、無血清条件下であっても骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導を行うことができる培養法を検討した。その結果、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とを少なくとも含有する分化誘導培地用添加剤を基礎培地に添加することによって、無血清条件下であっても骨分化誘導対象細胞を骨芽細胞へと分化誘導することができ、中でも特に、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと効率よく分化誘導することができることを見出した。さらに、本発明の分化誘導培地用添加剤を添加した培養培地を用いて骨分化誘導を行うと、血清存在下で骨分化誘導を行う場合よりも、分化誘導効率に優れ、骨分化誘導の期間を短縮することができることを見出したものである。
　一実施形態において、本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することが好ましい。少なくとも１つのリン脂質を含まない分化誘導培地用添加剤を用いた場合も、骨分化誘導対象細胞を骨分化誘導することは可能であるが、少なくとも１つのリン脂質を添加することにより、骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導効率をより一層高めることができ、骨分化誘導に要する時間をさらに短縮することができるため好ましい。なお、リン脂質が無血清条件下で骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導を促進することは、本発明によって初めて確認された知見である。
　上記リン脂質としては、特に限定されるものではないが、例えば、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロールなどが挙げられ、本発明に係る分化誘導培地用添加剤はこれらのリン脂質を単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。組み合わせて用いる場合は、フォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを用いることが好ましい。また、これらのリン脂質は、動物由来であっても、植物由来であってもよい。
　上記分化誘導培地用添加剤におけるリン脂質の含有量は、特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、最終濃度としてリン脂質の総量として０．１～３０μｇ／ｍｌであることが好ましく、最終濃度としてリン脂質の総量として１０μｇ／ｍｌであることが最も好ましい。また、組み合わせて用いる場合、それぞれのリン脂質の最終濃度が等しくなるように加えることが好ましい。リン脂質の総量の最終濃度が３０μｇ／ｍｌを超えると、細胞に対して毒性が発生する可能性があるため好ましくない。
　上記分化誘導培地用添加剤は、酸化防止剤を含有していることが好ましい。これにより、リン脂質の劣化を防止することができる。上記酸化防止剤としては、例えばＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、カテキン等を挙げることができ、ＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）を特に好ましく用いることができる。
　上記分化誘導培地用添加剤における酸化防止剤の含有量は、特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、０．１～５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
　上記分化誘導培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートをさらに含有してもよい。ただし、本発明に係る分化誘導培地用添加剤では、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートを含む必要は必ずしもなく、これらが含まれていなくても十分に骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導を行うことができる。このように、本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、従来、幹細胞の骨分化誘導には必須であると考えられていたインスリン、トランスフェリンおよびセレネートを含有する必要がないので、より安価に骨分化誘導を行うことが可能である。
　上記インスリンは、インスリン様増殖因子であってもよく、天然の細胞由来であっても、遺伝子組換えによって製造されたものでもよい。上記分化誘導培地用添加剤におけるインスリン、トランスフェリンおよびセレネートの含有量は、特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、インスリンは０．５～５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリンは０．５～５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。セレネートは０．１～５０ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、０．５～５０ｎｇ／ｍｌであることがより好ましい。
　また、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートは、市販のＩＴＳサプリメントを用いてもよいし、インスリンとトランスフェリンとセレネートとを適宜混合して調製したものを用いてもよいし、インスリンとトランスフェリンとセレネートとを別々に上記分化誘導培地用添加剤に添加したものであってもよい。
　本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で骨分化誘導するという本発明の効果を損なわない限り、上述した成分以外の他の成分を含んでいてもよい。例えば他のグルココルチコイド、例えばコルチゾール、コルチコステロン、コルチゾン、プレドニソロン等を含有していてもよい。これらその他の成分の含有量は上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、１０－１０～１０－６Ｍであることが好ましく、１０－９～１０－７Ｍであることがより好ましい。
　本発明に係る分化誘導培地用添加剤を調製する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法に従って調製することができる。例えば、上述した成分（ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子、デキサメタゾン、β－グリセロリン酸等）を適宜混合することによって調製することができる。
　本発明に係る分化誘導培地用添加剤には、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、乳化剤、浸透圧調整剤、基剤などの添加成分を必要に応じて使用することができる。本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、上記添加成分を用いて、通常の製剤化技術によって製剤化することができ、錠剤、粉剤、顆粒剤、水溶剤、乳剤、油性剤、もしくは懸濁剤などの固体または液体の剤型として使用することができる。
　また、上記分化誘導培地用添加剤は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化誘導するために用いることが好ましい。本発明の分化誘導培地用添加剤に含まれる増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、且つβ－グリセロリン酸はリン酸の供給および骨芽細胞の石灰化を促進しうる作用を有するため、効率よく骨芽細胞の骨分化を誘導できる。また、リン脂質をさらに添加することにより、上記骨芽細胞の骨分化をより促進することができる。よって、本発明の分化誘導培地用添加剤は、骨芽細胞の骨分化を促進することに対しても有用である。
　〔２．幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で分化誘導するための培養培地〕
　本発明に係る、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養培地（以下、単に「本発明に係る培養培地」という）は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分および基礎培地を含有し、血清を含まない。当該成分とは、〔１．〕で説明した各成分を指す。すなわち、本発明に係る培養培地は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とを少なくとも含有する。
　また、リン脂質は、無血清条件下での骨芽細胞への分化をさらに促進することができるため、上記成分として少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することが好ましい。
　また、上記培養培地は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分および基礎培地を含有していればよいので、上記成分は、〔１．〕で説明した分化誘導培地用添加剤の形態で添加してもよいし、〔１．〕で説明した各成分を別々に基礎培地に添加したものであってもよい。
　基礎培地とは、動物細胞用の培養培地を意味し、従来公知の動物細胞用の培養培地を用いることができる。例えば、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、α－ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＣＤＢ２０１培地などが挙げられる。これらの基礎培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。一実施形態において、本発明に係る培養培地を構成するための基礎培地は、α－ＭＥＭ培地とＭＣＤＢ２０１培地とを１：１の比率で混合した培地が好ましい。
　本発明に係る培養培地は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分と基礎培地とを混合することによって得ることができる。例えば、基礎培地に、〔１．〕で説明した成分を〔１．〕で説明した最終濃度になるように添加することによって調製することができる。調製した培養培地は、使用前に適宜滅菌して用いればよい。
　また、上記培養培地は、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で分化誘導することができるが、中でも、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化誘導するために用いることがより好ましい。本発明の培養培地は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分を含有する。当該分化誘導培地用添加剤中に含まれる増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、且つβ－グリセロリン酸はリン酸の供給および骨芽細胞の石灰化を促進しうる作用を有するため、効率よく骨芽細胞の骨分化を誘導できる。また、リン脂質をさらに添加することにより、上記骨芽細胞の骨分化をより促進することができる。よって、本発明の培養培地は、骨芽細胞の骨分化を促進することに対しても有用である。
　〔３．幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法〕
　本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法（以下、単に「本発明の培養方法」ともいう）は、本発明に係る培養培地中で、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する工程を包含する。
　培養条件は、骨分化誘導対象細胞を骨芽細胞に分化させることができる限り特に限定されるものではない。例えば、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、骨芽細胞へと分化誘導する場合、後述する実施例に示すように、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中でコンフルエント状態になるまで培養した間葉系幹細胞を、本発明に係る培養培地中で３７℃、５％ＣＯ２存在下で７日間以上培養することにより、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させることができる。ただし、これに限定されるものではない。
　本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法では、本発明に係る培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する上記工程よりも前に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を増殖培養する前工程を包含することが好ましい。
　上記無血清増殖培養培地を用いて培養された骨分化誘導対象細胞を用いて、本発明に係る培養培地中で骨分化誘導を行えば、通常の血清を含む増殖培養培地（例えば、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地等）を用いて培養された骨分化誘導対象細胞を用いて、本発明に係る培養培地中で骨分化誘導を行った場合と比較して、効率よく骨分化誘導を行うことができる。その結果、骨分化誘導にかかる期間をより短縮させることができる。
　上記無血清増殖培地は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない。上記無血清増殖培地が含有しているＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、およびリン脂質については、〔１．〕で説明したとおりであるので省略する。
　上記ＴＧＦ－βとはトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β：transforming growth factor－β）のことであり、ＴＧＦ－βファミリーから選択される増殖因子が意図される。ＴＧＦ－βとしては、ＴＧＦ－β３であることが好ましいが、他のＴＧＦ－βファミリーから選択されてもよい。上記ＨＧＦとは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ：hepatocyte growth factor）である。
　上記無血増殖持培地における上記増殖因子の含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、ＰＤＧＦは０．５～１００ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ－βは０．５～１００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦは０．５ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、ＨＧＦは０．１～５０ｎｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。ＦＧＦは０．１ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。例えば、ＦＧＦとしてｂＦＧＦを用いる場合は、０．１～１００ｎｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。
　上記無血清増殖培地におけるリン脂質の含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、最終濃度としてリン脂質の総量として０．１～３０μｇ／ｍｌであることが好ましく、最終濃度としてリン脂質の総量として１０μｇ／ｍｌであることが最も好ましい。また、組み合わせて用いる場合、それぞれのリン脂質の最終濃度が等しくなるように加えることが好ましい。リン脂質の総量の最終濃度が３０μｇ／ｍｌを超えると、細胞に対して毒性が発生する可能性があるため好ましくない。
　上記無血清増殖培地は、リン脂質を単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。一実施形態において、上記無血清増殖培地は、フォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを組み合わせて含有する。
　また、上記無血清増殖培地は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していることが好ましい。上記無血清増殖培地が含有している脂肪酸としては、例えば、リノール酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸およびステアリン等が挙げられる。これらの脂肪酸は、単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。また、上記脂肪酸以外にさらにコレステロールを含有していてもよい。上記無血清増殖培地における脂肪酸の含有量は、特に限定されるものではないが、例えば、脂質濃縮物（１１９０５－０３１、Ｇｉｂｃｏ製）を用いる場合は、体積比で上記無血清増殖培地の１／１０００量以上１／１０量以下の脂質濃縮物の原液を添加することが好ましい。
　上記無血清増殖培地は、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ：connective tissue growth factor）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor）およびアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに含有していてもよい。
　上記無血清増殖培地が含有しているＥＧＦおよびアスコルビン酸化合物については、〔１．〕で説明したとおりであるので省略する。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦファミリーから選択される増殖因子が意図される。ＶＥＧＦとしては、ＶＥＧＦ－Ａであることが好ましいが、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子：placental growth factor）－１、ＰｌＧＦ－２など他のＶＥＧＦファミリーから選択されてもよい。
　上記無血清増殖培地における上記因子の含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、ＣＴＧＦは０．１～２０μｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦは０．５～１００ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸化合物は０．５～２００μｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。例えば、市販されているＶＥＧＦ（ｖ３３８８、Ｓｉｇｍａ社製）や、ＣＴＧＦ（０３６－１９４７１、Ｗａｋｏ社製）を用いることができる。
　また、上記無血清増殖培地は、リン脂質の酸化防止剤を含有していることが好ましい。リン脂質の酸化防止剤については、〔１．〕で説明したとおりであるので省略する。一実施形態において、上記無血清増殖培地は、リン脂質の酸化防止剤として、ＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）を含有する。上記無血清増殖培地における酸化防止剤の含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、０．１～５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
　上記無血清増殖培地は、また、界面活性剤をさらに含有していてもよい。一実施形態において、上記無血清増殖培地は、界面活性剤として、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８またはＴｗｅｅｎ　８０を含有する。
　上記無血清増殖培地は、また、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートをさらに含有していてもよい。上記無血清増殖培地はさらに、デキサメタゾン、あるいは他のグルココルチコイドを含有していてもよい。インスリン、トランスフェリン、セレネート、デキサメタゾン、および他のグルココルチコイドについては、〔１．〕で説明したとおりであるので省略する。上記無血清増殖培地におけるインスリン、トランスフェリンおよびセレネートの含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、インスリンは０．５～５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリンは０．５～５０μｇ／ｍｌ、セレネートは０．１～５０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。他のグルココルチコイドの含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、１０－１０～１０－６Ｍであることが好ましい。
　上記無血清増殖培地を調製する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法に従って調製することができる。例えば、上述した成分（ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質等）を基礎培地に対して適宜混合することによって調製することができる。このような無血清増殖培地の一実施形態として、後述する実施例で用いた無血清のＳＴＫ２培地を挙げることができる。
　上記無血清増殖培地を用いて、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を増殖培養する方法としては、骨分化誘導対象細胞の分化能を維持しつつ、骨分化誘導対象細胞を増殖させることができる限り、特に限定されない。例えば、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、後述する実施例に示すように、５０００個／ｃｍ２の密度で播種した間葉系幹細胞を、２日または３日毎に培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養することにより、間葉系幹細胞の分化能を維持しつつ、幹細胞を増殖させることができる。ただし、これに限定されるものではない。
　培養後の骨分化誘導対象細胞の骨芽細胞への分化の程度は、従来公知の骨分化マーカーを用いて確認することができる。例えば骨分化誘導対象細胞をアリザリンレッドで染色することによって確認することができる。
　また、上記培養方法によれば、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で骨分化誘導することができるが、中でも、上記培養方法は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化誘導するために用いることがより好ましい。本発明の培養方法によれば、本発明に係る培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を培養する工程を包含する。当該培養培地中に含まれる増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、且つβ－グリセロリン酸はリン酸の供給および骨芽細胞の石灰化を促進しうる作用を有するため、効率よく骨芽細胞の骨分化を誘導できる。また、リン脂質をさらに添加することにより、上記骨芽細胞の骨分化をより促進することができる。よって、本発明の培養方法は骨芽細胞の骨分化を促進することに対しても有用である。
　〔４．幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で分化誘導するためのキット〕
　本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するためのキット（以下、単に「キット」という）は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分を備えている。また、さらに基礎培地を備えていてもよい。
　つまり、上記キットは、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とを備えている。また、分化がさらに促進されることから、上記成分として少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することが好ましい。
　上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、およびフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
　また、上記キットは、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートを含んでいてもよい。
　キットの構成としては上記したものに限定されるものではなく、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、骨分化誘導対象細胞を培養するための培養プレートや骨芽細胞への分化状態を評価可能な試薬（例えば、アリザリンレッド等）を含んでもよいし、培養する対象となる骨分化誘導対象細胞を備えていてもよい。
　また、本発明に係るキットの提供形態は、分化誘導培地用添加剤、または上記化合物および上記増殖因子、または上記化合物、上記増殖因子および上記リン脂質、基礎培地、並びにその他の試薬全てを、適切な容量および／または形態で含有した一つの容器として提供してもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本発明に係るキットには、上述した本発明に係る方法を行うための手順等を記載した説明書を備えてもよい。
　また、本発明に係るキットを用いることにより、骨分化誘導対象細胞を骨分化誘導することが可能であるが、中でも、上記キットは、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、骨分化を誘導するために用いられることがより好ましい。本発明のキットは、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分を備える。当該分化誘導培地用添加剤中に含まれる増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、且つβ－グリセロリン酸はリン酸の供給および骨芽細胞の石灰化を促進しうる作用を有するため、効率よく骨芽細胞の骨分化を誘導できる。また、リン脂質をさらに添加することにより、上記骨芽細胞の骨分化をより促進することができる。よって、本発明のキットは、骨芽細胞の骨分化を促進することに対して有用である。
　〔５．骨芽細胞〕
　本発明に係る骨芽細胞は、本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法によって生産される。本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法については、〔３．〕で説明したとおりであるので省略する。
　本発明に係る骨芽細胞は、後述する実施例に示すように、従来の骨分化誘導培地を用いる従来の骨分化誘導方法によって分化誘導された骨芽細胞と比較して、骨芽細胞の石灰化を示すアリザリンレッドの染色性が強い。つまり、本発明に係る骨芽細胞は、従来の骨分化誘導培地を用いる従来の骨分化誘導方法によって分化誘導された骨芽細胞と比較してカルシウムがより沈着した骨芽細胞であるという特性を有している。
　このため、本発明に係る骨芽細胞を用いれば、整形、歯科など骨欠損部位および骨粗鬆症に無血清培地で培養した細胞を用い再生医療に役立てることができる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　＜細胞の培養条件＞
　本発明の実施例は、幹細胞として間葉系幹細胞を用いて行った。全ての細胞の培養は、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃の条件下において行った。
　＜ＳＴＫ２培地＞
　本発明の実施例において、間葉系幹細胞の増殖培養に用いた培地（無血清増殖培養培地）をＳＴＫ２培地と称する。ＳＴＫ２培地は、基礎培地としてのＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ製：Ｄ６０４６）／ＭＣＤＢ２０１＝１：１にＦＧＦ－２、デキサメタゾン、ヒトインシュリン組み替え体、トランスフェリン、セレネート、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質濃縮物（Chemically defined lipid concentrate）、大豆レシチン、コレステロール、ＤＬ－α－トコフェロールアセテート、ＨＧＦ、ＴＧＦ－β３、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＥＧＦ、Ｌ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、フォスファチジルコリン、フォスファチジン酸塩、塩化リチウム、還元型Ｌ－グルタチオン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、Ｔｗｅｅｎ　８０を添加した無血清培地である。
　ＳＴＫ２培地の組成を表１に示す。本実施例で用いたＳＴＫ２培地は、表１に記載の各成分を、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１＝１：１に、最終濃度が表１中の「Optimum Concentration」となるように添加したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１中、「Source」は、表１に示す各物質の入手先および型番を示す。「Effective concentration」は、ＳＴＫ２培地を構成する各物質の、ＳＴＫ２培地における最終濃度の許容範囲を示す。脂質濃縮物（ＣＤ）については、「１／１０００～１／１０」と記載されているが、これは、体積比でＳＴＫ２培地の１／１０００量以上１／１０量以下の脂質濃縮物の原液を添加することを意味する。尚、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、Ｔｗｅｅｎ　８０は、脂質濃縮物中に含まれている。
　また、表１中、「Optimum Concentration」は、ＳＴＫ２培地を構成する各物質の好適な使用量を表している。
　＜ＳＴＫ０培地＞
　本発明の実施例において、骨芽細胞の分化誘導に用いた培地をＳＴＫ０培地と称する。ＳＴＫ０培地は、基礎培地としてのα－ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ製：Ｍ４５２６）／ＭＣＤＢ２０１＝１：１にＦＧＦ－２、デキサメタゾン、ヒトインシュリン組み替え体、トランスフェリン、セレネート、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質濃縮物（Chemically defined lipid concentrate）、大豆レシチン、コレステロール、ＤＬ－α－トコフェロールアセテート、ＨＧＦ、ＴＧＦ－β３、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＥＧＦ、Ｌ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、フォスファチジルコリン、フォスファチジン酸塩、塩化リチウム、還元型Ｌ－グルタチオン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、Ｔｗｅｅｎ　８０を添加した無血清培地である。
　ＳＴＫ０培地の組成を表２に示す。本実施例で用いたＳＴＫ０培地は、表２に記載の各成分を、α－ＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１＝１：１に、最終濃度が表２中の「Optimum Concentration」となるように添加したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２中、「Source」は、表２に示す各物質の入手先および型番を示す。「Effective concentration」は、ＳＴＫ０培地を構成する各物質の、ＳＴＫ０培地における最終濃度の許容範囲を示す。脂質濃縮物（ＣＤ）については、「１／１０００～１／１０」と記載されているが、これは、体積比でＳＴＫ０培地の１／１０００量以上１／１０量以下の脂質濃縮物の原液を添加することを意味する。尚、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、Ｔｗｅｅｎ　８０は、脂質濃縮物中に含まれている。「Optimum Concentration」は、ＳＴＫ０培地を構成する各物質の好適な使用量を表している。
　＜骨芽細胞への分化の評価＞
　本発明の実施例において、骨芽細胞への分化の評価は、分化誘導後の細胞をアリザリンレッド（Ｗａｋｏ製、型番：０１１－０１１９２）で染色することによって行った。アリザリンレッドの染色方法は、その取り扱い説明書の方法に従って行った。
　また、本明細書中において、骨芽細胞への分化度を、アリザリンレッドの染色性から判断して、「軽度」、「中度」および「強度」と評価した。
　上記「軽度」の分化とは、アリザリンレッドによる弱い染色が目視により確認できる段階である。例えば、図１の「無血清骨分化誘導培地Ｂ＋ＰＤＧＦ」のウェルの写真に表される程度の染色性を示した場合を「軽度」の分化と判断した。
　また、上記「中度」の分化とは、アリザリンレッドによる中程度の染色が目視で確認できる段階である。例えば、図１の「無血清骨分化誘導培地Ｂ＋ＦＧＦ」のウェルの写真に表される程度の染色性を示した場合を「中度」の分化と判断した。
　さらに、上記「強度」の分化とは、２４穴マイクロプレートのウェルの全面に、アリザリンレッドの強い染色が目視で確認できる段階である。例えば、図１の「無血清骨分化誘導培地Ｂ＋ＥＧＦ」のウェルの写真に表される程度の染色性を示した場合を「強度」の分化と判断した。
　〔実施例１：間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の検討（１）〕
　間葉系幹細胞としては、ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｂｉｏ－Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入）３株（以下、Ａ株、Ｂ株、Ｃ株と表記する）を用いた。尚、Ａ株は、５回継代したものを用い、Ｂ株およびＣ株は、４回継代したものを用いた。上記間葉系幹細胞の培養は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用い、培地を入れた６穴マイクロプレートに、上記間葉系幹細胞を５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養期間中、培地は２日または３日毎に交換した。
　なお、上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地とは、基礎培地としてのＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ製：Ｄ－６０４６）／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ製：Ｍ－６７７０）＝１：１にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を最終濃度が１０重量％となるように添加して調製した培地である。
　細胞がコンフルエント状態になる前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシンおよび０．２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより、プレートから剥離し、血清を含有しない植物由来のTrypsin inhibitor（Ｓｉｇｍａ製：Ｔ６５２２）とともに再懸濁させた。
　続いて、無血清ＤＭＥＭ培地で上記細胞を３回洗浄し、２４穴マイクロプレートに上記細胞を１００００細胞／ｃｍ２の密度となるように、１細胞株につき、１条件あたり２穴（ｎ＝２）に播種した。上記細胞は、無血清のＳＴＫ２培地中で、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃でコンフルエント状態になるまで培養した。
　培養４日目に、細胞が底面に接着した状態の２４穴マイクロプレートを、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて２回洗浄し、表３に示す各培養培地中で、３日間、７日間、１４日間、または２１日間培養した。分化誘導期間中、培地は２日ないし３日毎に新しい同一の培地に交換した。表３に示す各培養培地中で分化培養を開始してから３日目または７日目に、上記細胞をアリザリンレッドで染色することによって骨芽細胞への分化の評価を行った。
　ここで、表３に示した実施例１において用いた骨分化誘導用培地について説明する。表３中、「１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ」は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地である。上記「１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ」は、コントロール培地として用いた。尚、「１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地」は、α－ＭＥＭに、ＦＢＳを最終濃度１０重量％、デキサメタゾンを最終濃度１００ｎＭ、β－グリセロリン酸を最終濃度１０ｍＭ、およびＬ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩を最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように添加して調製した培地であり、特許文献１で用いられている従来公知の骨分化誘導培地と同じである。
　「無血清骨分化誘導培地：Ａ」は、無血清培地であるＳＴＫ０培地にβ－グリセロリン酸を最終濃度１０ｍＭとなるように添加した培地である。「Ａ－（ＦＧＦ‐２）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＦＧＦ－２を除去した培地である。尚、本明細書中において、例えば、無血清骨分化誘導培地：ＡからのＦＧＦ－２の除去は、無血清骨分化誘導培地：Ａを作製する際にＦＧＦ－２のみを添加しないことによって行うことができる。以下「無血清骨分化誘導培地：ＡからＴＧＦ－β３を除去した」等についても同様である。「Ａ－（ＴＧＦ－β３）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＴＧＦ－β３を除去した培地である。「Ａ－ＨＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＨＧＦを除去した培地である。「Ａ－ＥＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＥＧＦを除去した培地である。「Ａ－（ＰＤＧＦ‐ＢＢ）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＰＤＧＦ‐ＢＢを除去した培地である。
　「無血清骨分化誘導培地：Ｂ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＦＧＦ‐２、ＴＧＦ－β３、ＨＧＦ、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦ‐ＢＢを除去した培地である。「Ｂ＋ＥＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを最終濃度が２０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｂ＋（ＦＧＦ‐２）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ‐２を最終濃度が１ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｂ＋（ＴＧＦ－β３）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＴＧＦ－β３を最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｂ＋ＨＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＨＧＦを最終濃度が５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｂ＋（ＰＤＧＦ‐ＢＢ）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＰＤＧＦ‐ＢＢを最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。
　結果を表３、および図１～３に示した。図１は、上記「１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地」、すなわち従来公知の１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地と、無血清骨分化誘導培地：Ｂとを用いた場合の、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導を確認した結果を示す図である。結果は３連で示してあるが、左からＡ株、Ｂ株、Ｃ株の結果を示している。図２は、増殖因子が間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響について検討した結果を示す図である。図３は、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用い、ＥＧＦが間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響について検討した結果を示す図である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いた場合、７日間培養後も骨芽細胞への分化は見られなかった。また、図１に示すように、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合、培養７日目までは未分化であったが、１４日目に、骨芽細胞に特徴的な石灰化を示すアリザリンレッドによる染色性を示し、カルシウムの沈着が観察されるようになった。さらに２１日目まで培養すると、カルシウムの沈着が顕著となった。
　一方、図１に示す無血清骨分化誘導培地：Ｂとは、表３に示す無血清骨分化誘導培地：Ｂのことであり、ＳＴＫ０培地に１０ｍＭのβ－グリセロリン酸を添加した培地からＥＧＦ、ＴＧＦ－β３、ＨＧＦ、ＦＧＦ－２およびＰＤＧＦ－ＢＢを除いたものである。図１において、例えば「無血清骨分化誘導培地：Ｂ＋ＥＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを最終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるように加えたものである。以下「無血清骨分化誘導培地：Ｂ＋ＦＧＦ」等についても同様である。
　図１、表３に示すように、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを添加した培地を用いた場合、３日目で中程度の分化が見られ、７日目で、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合の２１日目よりもはるかに分化誘導が進んでいることが確認された。無血清骨分化誘導培地：Ｂは、上述のように、ＳＴＫ０培地に１０ｍＭのβ－グリセロリン酸を添加した培地からＥＧＦ、ＴＧＦ－β３、ＨＧＦ、ＦＧＦ－２およびＰＤＧＦ－ＢＢを除いたものである。つまり、基礎培地（ＭＣＤＢとα－ＭＥＭ）とを１：１の比率で混合した培地）にデキサメタゾン、Ｌ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、β－グリセロリン酸、脂肪酸（リノール酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、およびステアリン酸）、リン脂質（フォスファチジン酸およびフォスファチジルコリン）、コレステロール、酸化防止剤ＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８およびＴｗｅｅｎ　８０などを含有させた培地である。ここに、さらにＥＧＦを添加することによって、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合よりも非常に短期間で、強く骨芽細胞への分化誘導を促進できることが明らかとなった。
　また、図１、表３に示すように、無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ－２を加えた場合は、３日目には間葉系幹細胞は未分化であったが、７日目には中程度の骨芽細胞への分化が見られ、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合の２１日目よりもはるかに分化誘導が進んでいることが確認された。さらに、無血清骨分化誘導培地：ＢにＰＤＧＦ－ＢＢを加えた場合は、３日目には未分化であったが、７日目には軽度の分化が見られ、当該分化は、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合の１４日目よりも顕著であった。
　図２において、例えば「無血清骨分化誘導培地：Ｂ＋ＥＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを最終濃度２０ｎｇ／ｍｌになるように加えたものを意味する。図２において例えば「無血清骨分化誘導培地：Ａ－（ＦＧＦ－２）」とあるのは無血清骨分化誘導培地：ＡからＦＧＦ－２を除いた培地を意味する。図２における培養期間は７日間である。図２、表３に示すように、無血清骨分化誘導培地：Ａを用いた場合、そこからＴＧＦ－β３を除いた培地を用いた場合のみ、分化が見られた。また、無血清骨分化誘導培地：ＢにＴＧＦ－β３を加えた場合は分化が見られなかった。よって、増殖因子には、ＥＧＦ、ＦＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＢＢのように間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるために好適なものと、ＴＧＦ－β３のように不適当なものがあることが分かった。
　なお、図２におけるウェルの写真のうち、「コントロール」と表示した左の列はβ－グリセロリン酸を含まない試験区であり、右の列はβ－グリセロリン酸を最終濃度１０ｍＭで含む試験区である。
　図３は、１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地にＥＧＦを添加することによって骨芽細胞への分化が促進されることを示しているが、培養１４日目であっても、分化の程度は図１に示す無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを添加した試験区よりも劣っていた。
　〔実施例２：間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の検討（２）〕
　間葉系幹細胞としては、ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｂｉｏ－Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入）５株（以下、Ｆ株、Ｇ株、Ｈ株、Ｉ株、Ｊ株と表記する）を用いた。尚、Ｆ株、Ｈ株、およびＩ株は、５回継代したものを用い、Ｇ株およびＪ株は、４回継代したものを用いた。上記間葉系幹細胞の増殖培養には、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用い、培地を入れた６穴マイクロプレートに、上記間葉系幹細胞を５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養期間中、培地は２日または３日毎に交換した。
　間葉系幹細胞がコンフルエント状態になる前に、実施例１と同様の方法で、６穴マイクロプレートから間葉系幹細胞を回収した。続いて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で上記細胞を３回洗浄し、２４穴マイクロプレートに上記細胞を１００００個／ｃｍ２の密度となるように、１細胞株につき、１条件あたり２穴（ｎ＝２）に播種した。上記細胞は、上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で、コンフルエント状態になるまで培養した。
　培養４日目に、細胞が接着した状態の２４穴マイクロプレートを、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて２回洗浄し、表４に示す各培養培地中で、７日間、１４日間、または２１日間培養した。分化誘導期間中、培地は２日ないし３日毎に新しい同一の培地に交換した。表４に示す各培養培地中で分化培養を開始してから７日目、１４日目、または２１日目に、上記細胞をアリザリンレッドで染色することによって骨芽細胞への分化の評価を行った。
　ここで、表４に示した実施例２において用いた骨分化誘導用培地について説明する。表４中、「１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地」は、実施例１で用いられた「１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地」と同じである。また、「１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地（α：Ｍ＝１：１）」は、実施例１で用いられた「１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地」の基礎培地をα－ＭＥＭからα-ＭＥＭとＭＣＤＢ２０１とを１：１の比率で混合したものに変えた以外は、実施例１で用いられた「１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地」と同じである。
　「無血清骨分化誘導培地：Ｂ」とは、実施例１で用いた「無血清骨分化誘導培地：Ｂ」と同じである。また、「Ｂ＋ＥＧＦ」、「Ｂ＋（ＦＧＦ‐２）」、「Ｂ＋（ＴＧＦ－β３）」、「Ｂ＋ＨＧＦ」、および「Ｂ＋（ＰＤＧＦ‐ＢＢ）」についても、実施例１で用いた培地と同じである。
　「無血清骨分化誘導培地：Ｃ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ‐２およびＥＧＦを、それぞれ最終濃度が１ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｃ－Ｄｅｘ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃからデキサメタゾンを除去した培地である。「Ｃ－ＶＣ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＣからＬ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩を除去した培地である。「Ｃ－（β－グリセロリン酸）」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃからβ-グリセロリン酸を除去した培地である。「Ｃ－ＰＡ－ＰＣ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃからフォスファチジルコリンおよびフォスファチジン酸ナトリウム塩を除去した培地である。「Ｃ－ＣＤ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃから脂質濃縮物を除去した培地である。「Ｃ－ＬｉＣｌ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＣからＬｉＣｌを除去した培地である。「Ｃ－ＩＴＳ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃからインスリン、トランスフェリンおよびセレネートを除去した培地である。「Ｃ－ＣＤ－ＬｉＣｌ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃから脂質濃縮物およびＬｉＣｌを除去した培地である。「Ｃ－ＣＤ－ＬｉＣｌ－ＶＣ＋（ＰＤＧＦ－ＢＢ）」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃから脂質濃縮物、ＬｉＣｌ、およびＬ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩を除去し、且つＰＤＧＦ－ＢＢを最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。分化誘導後７日目の骨分化の結果を表４に、１４日目の骨分化の結果を表５に、２１日目の骨分化の結果を表６にそれぞれ示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表４～６に示すように、１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地を用いた場合、実施例１で得られた結果と同様、培養７日目までは間葉系幹細胞は未分化であったが、１４日目には骨芽細胞への軽度の分化が見られ、さらに２１日目まで培養すると、さらに分化が進んだ。また、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地（Ｄ：Ｍ＝１：１）を用いた場合も、ほぼ同様の結果が得られた。
　一方、無血清骨分化誘導培地：Ｂ、すなわちＳＴＫ０培地に１０ｍＭのβ－グリセロリン酸を添加した培地からＥＧＦ、ＴＧＦ－β３、ＨＧＦ、ＦＧＦ－２、およびＰＤＧＦ－ＢＢを除いたものを用いた場合、分化誘導後２１日目においても骨芽細胞の分化を確認することができなかった。よって、無血清条件下において骨分化誘導を行うには、何らかの増殖因子の添加が必須であることが明らかになった。
　さらに、表４～６中、培地４～培地９を用いて分化誘導を行った結果から、いずれの増殖因子を添加することが必要であるか明らかになった。表６に示すように、無血清骨分化誘導培地：ＢにＴＧＦ－β３、またはＨＧＦを添加した場合は、分化誘導後２１日目においても骨芽細胞の分化を確認することができなかった。一方、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦまたはＰＤＧＦ－ＢＢをそれぞれ単独で添加した場合は、分化誘導後７日目には既に軽度の分化が確認され、当該分化は、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合の１４日目の結果よりも顕著に促進されていた。よって、増殖因子には、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ－ＢＢのように、非常に効率よく間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができるものと、ＴＧＦ－β３およびＨＧＦのように骨芽細胞の分化に不適当なものがあることが明らかになった。
　また、無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ－２を単独で添加した場合は、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦまたはＰＤＧＦ－ＢＢをそれぞれ単独で添加した場合と比較して、骨芽細胞の分化誘導効率が低く、Ｂ株においてのみ骨芽細胞への分化誘導が可能であった。しかしながら、無血清骨分化誘導培地：Ｃ、すなわち無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ－２およびＥＧＦを添加した培地を用いた場合、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを単独で添加した場合と比較して、Ｃ株における分化誘導効率が高くなることが明らかになった。よって、無血清骨分化誘導培地：ＢにＰＤＧＦ－ＢＢを単独で添加すること、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを単独で添加すること、または無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ－２およびＥＧＦを組み合わせて添加することにより、無血清条件下で、非常に効率よく骨芽細胞への分化を誘導することができることが明らかになった。
　さらに、表４～６中、培地９～培地１８を用いて分化誘導を行った結果から、無血清骨分化誘導培地：Ｃにおいて、増殖因子の他に、さらに骨芽細胞への分化誘導に必要であるその他の因子が明らかになった。表４に示すように、培地１１、培地１４～培地１６を用いて分化誘導を行った場合、すなわちＬ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、脂質濃縮物、ＩＴＳ、および塩化リチウムは、これらの因子のいずれかを培地に添加しない場合であっても、分化誘導後７日目には骨芽細胞への軽度の分化が確認された。さらに、培地１７および培地１８を用いて分化誘導を行った結果から、Ｌ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、脂質濃縮物、ＩＴＳ、および塩化リチウムの複数の因子を培地に同時に添加しない場合であっても、分化誘導後7日目には骨芽細胞への軽度の分化が確認された。このことから、Ｌ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、脂質濃縮物、ＩＴＳ、および塩化リチウムは、無血清条件下での骨芽細胞の分化誘導に必須とはいえないことが明らかになった。また、従来、ＩＴＳおよびアスコルビン酸は、骨芽細胞の分化誘導に必須の因子であると考えられていたが、実施例２の結果から、必ずしも必要ではないことが明らかになった。よって、本発明によれば、骨分化誘導用培地添加剤にＩＴＳおよびアスコルビン酸を添加しなくてもよい分、骨分化誘導用培地添加剤をより安価に提供することができる。
　さらに、「Ｃ－ＣＤ」培地、すなわち無血清骨分化誘導培地：Ｃから脂質濃縮物を除去した培地を用いた場合に、無血清骨分化誘導培地：Ｃを用いた場合と比較して、骨芽細胞への分化が促進されることから、脂肪酸は骨芽細胞への分化に抑制的に働くことが明らかになった。
　一方、デキサメタゾン、β－グリセロリン酸に関しては、どちらか一方を除去すると骨芽細胞への分化が誘導されないことから、これら２つの因子は、無血清骨分化誘導培地に必須の因子であることが明らかになった。
　さらに、「Ｃ－ＰＡ－ＰＣ」培地、すなわち無血清骨分化誘導培地：Ｃからリン脂質（フォスファチジルコリンおよびフォスファチジン酸塩）を除去した培地を用いた場合に、無血清骨分化誘導培地：Ｃを用いた場合と比較して、骨芽細胞への分化効率が低下することから、リン脂質を添加することにより、骨芽細胞への分化がより促進されることが明らかになった。
　以上、図１～３および表３～６に示したように、好適な増殖因子および化合物を無血清培地に含有させることによって、間葉系幹細胞を、高濃度血清を用いて培養する場合よりも強く骨芽細胞へ分化誘導することができることが明らかとなった。
　実施例の結果から、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とが少なくとも含まれている場合に、間葉系幹細胞を無血清条件下で骨芽細胞に分化誘導することができることが明らかになった。また、上記増殖因子、デキサメタゾン、およびβ－グリセロリン酸に加えて、少なくとも１つのリン脂質がさらに含まれている場合に、骨芽細胞への分化がより促進されることも明らかになった。このことから、基礎培地にＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とを添加剤として添加することにより、間葉系幹細胞を無血清条件下で骨芽細胞に分化誘導することができ、さらに少なくとも１つのリン脂質を添加剤として添加することにより、骨芽細胞への分化をより効率的に誘導することができるといえる。尚、表７に好ましい無血清培地の組成の例を示す。本明細書中では、表７に表した組成を有する無血清培地を、以後「ＳＴＫ３培地」と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　〔実施例３：間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の検討（３）〕
　間葉系幹細胞としては、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｂｉｏ－Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入）３株（以下、Ｋ株、Ｌ株、Ｍ株と表記する）を用いた。尚、Ｋ株は、８回継代したものを用い、Ｌ株は、７回継代したものを用い、Ｍ株は、１０回継代したものを用いた。
　（１．無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養を行った間葉系幹細胞の骨分化誘導）
　上記間葉系幹細胞を、無血清のＳＴＫ２培地を用い、培地を入れた６穴マイクロプレートに、上記間葉系幹細胞を５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養期間中、培地は２日または３日毎に交換した。
　細胞がコンフルエント状態になる前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシンおよび０．２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより、プレートから剥離し、血清を含有しない植物由来のTrypsin inhibitor（Ｓｉｇｍａ製：Ｔ６５２２）とともに再懸濁させた。
　続いて、無血清のＳＴＫ２培地で上記細胞を３回洗浄し、２４穴マイクロプレートに上記細胞を５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように、１細胞株につき、１条件あたり３穴（ｎ＝３）に播種した。上記細胞は、無血清のＳＴＫ２培地中で、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃でコンフルエント状態になるまで培養した。
　コンフルエント状態になった細胞が底面に接着した状態の２４穴マイクロプレートを、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて２～３回洗浄し、１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地または無血清骨分化誘導培地（ＳＴＫ３培地）を用いて分化培養した。尚、上記「１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地」は、実施例１で説明したようにα－ＭＥＭに、ＦＢＳを最終濃度１０重量％、デキサメタゾンを最終濃度１００ｎＭ、β－グリセロリン酸を最終濃度１０ｍＭ、およびＬ－アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩を最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように添加して調製した培地であり、特許文献１で用いられている従来公知の骨分化誘導培地と同じである。分化誘導期間中、培地は２日ないし３日毎に新しい同一の培地に交換した。各培養培地中で培養を開始してから４日目、７日目、１４日目、または２１日目に、上記細胞をアリザリンレッドで染色することによって骨芽細胞への分化の評価を行った。結果を図４および表８～１１に示した。
　（２．１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養を行った間葉系幹細胞の骨分化誘導）
　上記間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、培地を入れた６穴マイクロプレートに、上記間葉系幹細胞を５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養期間中、培地は２日または３日毎に交換した。
　細胞がコンフルエント状態になる前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシンおよび０．２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより、プレートから剥離し、血清を含有しない植物由来のTrypsin inhibitor（Ｓｉｇｍａ製：Ｔ６５２２）とともに再懸濁させた。
　続いて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で、２４穴マイクロプレートに上記細胞を５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように、１細胞株につき、１条件あたり３穴（ｎ＝３）に播種した。上記細胞は、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃でコンフルエント状態になるまで培養した。
　コンフルエント状態になった細胞が底面に接着した状態の２４穴マイクロプレートを、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて２～３回洗浄し、１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地または無血清骨分化誘導培地（ＳＴＫ３培地）を用いて分化培養した。分化誘導期間中、培地は２日ないし３日毎に新しい同一の培地に交換した。培養培地中で培養を開始してから４日目、７日目、１４日目、または２１日目に、上記細胞をアリザリンレッドで染色することによって骨芽細胞への分化の評価を行った。結果を図４および表８～１１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　図４は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導の結果を示す図である。また、図４に示した分化誘導後４日目の骨分化の結果を表８に、分化誘導後７日目の骨分化の結果を表９に、１４日目の骨分化の結果を表１０に、２１日目の骨分化の結果を表１１にそれぞれ示した。図４および表８に示すように、骨分化誘導を開始してから４日目において、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞では、すでに骨芽細胞への分化が始まっていることが確認された。
　これに対して、ＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ従来法の１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞では、骨芽細胞への分化は確認されなかった。また、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞、および１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞では、いずれも骨芽細胞への分化は確認されなかった。
　図４および表９に示すように、骨分化誘導を開始してから７日目において、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞、および無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、いずれも骨芽細胞に分化していることが確認された。
　無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞の方が、やや強く骨芽細胞に分化していた。
　これに対して、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞では、骨芽細胞への分化は確認されなかった。
　図４および表１０に示すように、骨分化誘導を開始してから１４日目において、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、骨芽細胞に分化していることが確認された。
　しかし、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞よりも、骨芽細胞への分化の程度が軽かった。
　これに対して、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞よりも骨芽細胞に強く分化していることが確認された。
　図４および表１１に示すように、骨分化誘導を開始してから２１日目において、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞、および無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、いずれも骨芽細胞に強く分化していることが確認された。
　これに対して、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞よりも骨芽細胞への分化の程度が軽かった。
　実施例３の結果から、従来法の１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地を用いた場合と比較して、無血清のＳＴＫ３培地を用いた場合は、間葉系幹細胞をより高い効率で、且つより早く骨芽細胞に分化させることができることが明らかになった。この結果から、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養した間葉系幹細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養を行った間葉系幹細胞よりも間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化能が高く維持されていることが明らかになった。
　また、従来法の１０％ＦＢＳ－骨分化誘導培地を用いると、間葉系幹細胞が骨芽細胞へと分化するまでに２～３週間を要する。これに対して、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、分化誘導開始４日目において、既に骨芽細胞へと分化していることが確認された。これは、無血清のＳＴＫ２培地と無血清のＳＴＫ３培地とを組み合わせて用いることによって、相乗的に骨芽細胞への分化誘導が促進されていると考えられた。
　本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で細胞に骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤を無血清培地に添加することにより、血清を含有する従来の分化誘導培地よりも強く、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を骨分化させることができる。したがって、上記分化誘導培地用添加剤は、再生医療などにおいて好適に利用できる。

Claims (14)

  1. 　ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β－グリセロリン酸とを少なくとも含有することを特徴とする、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤。
  2. 　少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することを特徴とする、請求項１に記載の分化誘導培地用添加剤。
  3. 　上記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、およびフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の分化誘導培地用添加剤。
  4. 　酸化防止剤をさらに含有することを特徴とする、請求項２に記載の分化誘導培地用添加剤。
  5. 　上記酸化防止剤がＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることを特徴とする、請求項４に記載の分化誘導培地用添加剤。
  6. 　上記幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の分化誘導培地用添加剤。
  7. 　請求項１から５のいずれか１項に記載の分化誘導培地用添加剤を構成する成分および基礎培地を含有し、血清を含まないことを特徴とする、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養培地。
  8. 　上記幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項７に記載の培養培地。
  9. 　請求項７に記載の培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する工程を包含することを特徴とする、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法。
  10. 　上記幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の培養方法。
  11. 　請求項１から５のいずれか１項に記載の分化誘導培地用添加剤を構成する成分を備えていることを特徴とする、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するためのキット。
  12. 　上記幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
  13. 　請求項７に記載の培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する工程よりも前に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を増殖培養する前工程を包含することを特徴とする、請求項９または１０に記載の培養方法。
  14. 　請求項９、１０または１３に記載の培養方法によって生産されたことを特徴とする骨芽細胞。
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