CN105392489A

CN105392489A - 软骨损伤治疗剂及其制造方法

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Publication number: CN105392489A
Application number: CN201480041243.8A
Authority: CN
Inventors: 辻纮一郎; 森川宝; 前田悟; 北山唯; 大森亚树; 邵金昌; 长谷川森一; 加藤幸夫; 松下隆; 高尾昌人; 三木慎也; 印南健; 高桥泰文
Original assignee: Two Cells Co Ltd
Current assignee: Two Cells Co Ltd
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2034-08-01
Also published as: KR20160035069A; JPWO2015016357A1; EP3028722A1; CN105392489B; AU2014297188B2; EP3028722A4; US20160166734A1; WO2015016357A1; US10507266B2; JP6191694B2; KR101782963B1; EP3028722B1; AU2014297188A1

Abstract

本发明涉及的软骨损伤治疗剂的制造方法包含以下工序:在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中，使间充质干细胞增殖的增殖工序；将上述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合的混合工序。通过该制造方法提供一种很好地使软骨组织再生的软骨损伤治疗剂。

Description

软骨损伤治疗剂及其制造方法

技术领域

本发明涉及软骨损伤治疗剂及其制造方法，进一步涉及该制造方法所使用的培养基用添加剂、培养用培养基和试剂盒、以及使用它们的培养方法。

背景技术

在膝等关节部位，位于滑膜内侧的活动性关节中存在的软骨组织由II型胶原蛋白、蛋白聚糖和水等构成，将其定义为关节软骨(透明软骨)。另一方面，作为关节部位以外存在的软骨组织的构成成分，与II型胶原蛋白相比，多数为I型胶原蛋白。

关节软骨修复能力低，一旦损伤时基本不可能自然再生。具有外伤性关节软骨损伤且反复出现强烈的疼痛和/或关节水肿时，进行内服止痛药的治疗和/或透明质酸的关节内注射，但是这些治疗方法均是对症疗法，不是根本的治疗方法。因此，作为现在的常见的治疗方法，采用外科再生关节软骨的方法。作为主要的外科治疗方法，已知非专利文献1记载的骨穿孔法和自体骨软骨移植术。

非专利文献1的骨穿孔法是使用钻对软骨损伤部的骨打孔，使从骨髓出血，将骨髓中含有的间充质干细胞(MSC:MesenchymalStemCell)诱导至损伤部，期待软骨和类似于软骨的组织再生的方法。由于不牺牲自身的组织，且能够在关节镜观察下简便实施，因此，目前为止作为软骨损伤的首选治疗法在世界范围内广泛进行。

此处，干细胞是具有自我复制能力和分化能力的细胞。作为这类干细胞，例如已知有胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、和成体干细胞等。作为上述成体干细胞，例如有造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞等。上述ES细胞和上述iPS细胞具有能够向所有组织分化的多分化能力。上述造血干细胞具有向血液细胞分化的能力，上述神经干细胞具有向神经细胞分化的能力。另外，上述间充质干细胞存在于骨髓等组织中，作为具有向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞等分化的多分化能力的干细胞而被熟知。

非专利文献1的自体骨软骨移植术是从自体关节软骨的健康部以圆柱状切去一块骨和软骨并自体移植(Autograft)至损伤部的方法，虽然能够利用移植的透明软骨和其间隙的纤维性软骨进行修复，但是存在对健康部组织造成损伤和移植面积受到限制的缺点。

另外，作为关节软骨损伤的其他外科治疗法，已知有自体培养软骨移植术。自体培养软骨移植术是Brittberg等于1994年报告的方法，其是从患者自体的非负荷部的膝关节软骨采取少量的软骨组织，将分离和单层培养的软骨细胞移植于软骨损伤部的方法。

作为关节软骨损伤的另一外科的治疗法，已知专利文献1记载的利用人组织工程(Tissueengineering)的治疗方法。该治疗方法中，将软骨细胞或干细胞等细胞源与支架材料组合移植至关节软骨损伤部位，促进关节软骨的再生。

另外，在大阪大学医学部附属医院实施的人干细胞临床研究“针对关节软骨病变的自身滑膜间充质干细胞来源三维人工组织治疗法”(2012年1月25日获得计划审批)，将外伤性膝软骨损伤患者作为对象。该临床研究是将从关节内组织分离的滑膜干细胞进行培养，给予生物学的刺激而得到立体的组织片后，将其移植至软骨损伤部位的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第2005/012512号小册子(2005年2月10日公开)

非专利文献

非专利文献1:整形外科Knack&Pitfalls膝关节外科的要点和盲点，黑坂昌弘，2005

发明内容

但是，上述以往的利用间充质干细胞的关节软骨损伤的治疗方法存在以下所示的问题。

即，对于非专利文献1记载的骨穿孔法，最近的报告表明，治疗部位的软骨组织随时间推移由透明软骨置换为纤维软骨，组织容易受到损伤，以及治疗后2年左右临床症状的改善良好，但是经过5年以上时疼痛复发，患者的活动性降低，难以期待长时间的治疗效果。另外，非专利文献1的骨穿孔法中，为了使血液流入软骨组织，开孔的骨不被修复。

另外，非专利文献1的自体骨软骨移植术，存在必须牺牲健康部的软骨组织，将中老年患者作为对象时，由于伴随年龄增加而健康的软骨的范围变少，所以不能采取到软骨损伤治疗所需要的量的软骨组织的问题。另外，非专利文献1的自体骨软骨移植术中，从患者取得的移植片在新鲜时，移植片的生物活性得到保持，但是将移植片冷冻时则生物活性丧失。因此，每次移植都需要从患者取得新鲜的移植片，患者的负担增大。

自体培养软骨移植术是能够解决骨穿孔法和自体骨软骨移植术中的上述问题的治疗法，但是以前在日本作为保险诊疗并没有获得认可。但是，在2012年7月，将从患者自体的软骨组织分离的软骨细胞包埋于端缺胶原凝胶而培养的自体培养软骨JACC(注册商标)在日本获得批准。另外，同样地，在美国Carticel(注册商标)于1997年8月，在欧洲ChondroCelect(注册商标)于2009年10月获得批准。因此，自体培养软骨移植术，作为针对外伤性软骨缺失症的新的治疗法受到注目，但由于在其适用范围没有其他治疗法，且将软骨缺失面积为4cm²以上的软骨缺失部位作为适用范围，因此，其适用范围非常有限。

另外，专利文献1的治疗方法，在关节软骨的再生上花费时间，进一步需要进行重复移植。

而且，在针对关节软骨病变的来源于自身滑膜间充质干细胞的三维人工组织治疗法中，由于在含有血清的培养基中培养自体来源的间充质干细胞并使用，因此需要从患者取得细胞，患者的负担增大，而且如后述所示存在血清引起的细胞污染等风险。

将间充质干细胞等细胞用于关节软骨损伤治疗时，在投予之前培养细胞，作为此时的培养基，现在广泛使用添加动物血清(通常10～15％胎牛血清)的培养基。该血清作为用于促进在体外的细胞的生长和/或增殖的营养源或激素等生理活性物质的供给源而使用。

但是，血清非常昂贵，而且是天然制品，因此每批之间产生成分的差异。因此，细胞增殖效果容易产生波动。另外，为了从培养后的细胞除去来源于血清的蛋白质等而需要精制，操作变得复杂。而且，存在混入血清中的未知病原体(病毒和病原性朊病毒等)引起培养细胞被污染的危险性。

本发明是鉴于上述问题点而完成的发明，其目的在于提供能够很好地使软骨再生的含有无血清培养的间充质干细胞的软骨损伤治疗剂及其制造方法，进一步能够提供该制造方法所使用的培养基用添加剂、培养用培养基和试剂盒、以及使用这些物质的培养方法。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂的制造方法，其特征在于，包含以下工序:在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中，使间充质干细胞增殖的增殖工序；将上述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合的混合工序。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂，其特征在于，含有间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂，上述间充质干细胞是在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中培养而得到的。

本发明涉及的培养用培养基，其特征在于，是用于制造软骨损伤治疗剂的无血清的培养用培养基，含有本发明涉及的培养基用添加剂。

本发明涉及的培养方法，其特征在于，是用于制造软骨损伤治疗剂的培养方法，包含在本发明涉及的培养用培养基中培养间充质干细胞的工序。

本发明涉及的试剂盒，其特征在于，至少具有本发明涉及的培养基用添加剂。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂的制造方法，由于包含在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中使间充质干细胞增殖的增殖工序以及将上述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合的混合工序，所以发挥以下效果，即能够制造含有无血清培养的间充质干细胞并能够很好地使软骨损伤部位再生的软骨损伤治疗剂。

附图说明

图1是说明本发明机理的示意图。

图2是表示正常软骨的染色图像的显微镜图像的图。(a)表示苏木精·伊红染色图像，(b)表示甲苯胺蓝染色图像，(c)表示藏红O染色图像。

图3是表示将含有MSC5×10⁵个和乳酸林格氏液1mL的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图4是表示将含有MSC5×10⁵个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图5是表示将含有MSC5×10⁵个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图6是表示将含有MSC5×10⁵个、乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图7是表示将含有MSC5×10⁶个和乳酸林格氏液1mL的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图8是表示将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图9是表示将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图10是表示将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图11是表示将含有MSC5×10⁷个和乳酸林格氏液1mL的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图12是表示将含有MSC5×10⁷个、乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图13是表示将仅含有乳酸林格氏液1mL的投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图14是表示将含有乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示甲苯胺蓝染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图15是表示将含有MSC5×10⁷个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示typeII胶原蛋白染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图16是表示将含有MSC5×10⁷个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示typeII胶原蛋白染色图像，(d)表示藏红O染色图像，(e)表示甲苯胺蓝染色图像。

图17是表示将细胞投予液单次投予的关节内健康软骨的显微镜图像的图。(a)表示苏木精·伊红染色图像，(b)表示甲苯胺蓝染色图像，(c)表示藏红O染色图像。

图18是表示将细胞投予液单次投予的关节内健康滑膜的显微镜图像的图。(a)表示苏木精·伊红染色图像，(b)表示甲苯胺蓝染色图像，(c)表示藏红O染色图像。

图19是表示结果最好的、将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位的个体的进行了typeII胶原蛋白免疫染色的显微镜图像(低倍率放大)的图。

图20是表示结果最好的、将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位的个体的进行了typeII胶原蛋白免疫染色的显微镜图像(高倍率放大)的图。

图21是表示完全没有得到软骨再生的、将仅含有乳酸林格氏液1mL的投予液单次投予至软骨半层缺失部位的个体的进行了typeII胶原蛋白免疫染色的显微镜图像(低倍率放大)的图。

图22是表示完全没有得到软骨再生的、将仅含有乳酸林格氏液1mL的投予液单次投予至软骨半层缺失部位的个体的进行了typeII胶原蛋白免疫染色的显微镜图像(高倍率放大)的图。

图23是表示将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液3次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示typeII胶原蛋白染色图像，(d)表示藏红O染色图像。

图24是表示将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的细胞投予液3次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。(a)表示肉眼图像，(b)表示苏木精·伊红染色图像，(c)表示typeII胶原蛋白染色图像，(d)表示藏红O染色图像，(e)表示甲苯胺蓝染色图像。

图25是表示利用软骨分化用培养基培养的MSC中的软骨特异性基因(typeII胶原蛋白、蛋白聚糖和sox9)的表达量的图。

图26是表示在从投予细胞投予液的关节腔内采取的MSC中测定未分化标记物基因表达的结果的图。S表示无血清培养的结果，D表示有血清培养的结果，P表示传代数。

图27是表示MSC在5种保存液[乳酸林格氏液1mL，含有乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的溶液，含有乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的溶液，含有乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的溶液以及无血清培养基(STK2培养基)]中保存时的随着时间推移的细胞生存率的图。(a)表示MSC以5×10⁵个在37℃的培养箱内保存时的结果，(b)表示MSC以5×10⁵个在4℃的冷藏条件下保存时的结果，(c)表示MSC以5×10⁶个在4℃的冷藏条件下保存时的结果。

图28是表示将MSC5×10⁵个在3种保存液[乳酸林格氏液1mL，含有乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的溶液以及含有乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的溶液]中在37℃的培养箱内保存24小时时的细胞生存率的图。

具体实施方式

1.软骨损伤治疗剂的制造方法

本发明提供含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂的制造方法。本发明涉及的软骨损伤治疗剂的制造方法包含以下工序:在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中，使间充质干细胞增殖的增殖工序；将上述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合的混合工序。

本说明书中使用时，“无血清培养基”是指不含有血清的培养基，“无血清培养”是指不使用血清的培养。

本说明书中，“软骨损伤治疗剂”是作为软骨损伤治疗用材料而用于再生医疗等的、将间充质干细胞制剂化的治疗药。软骨损伤治疗剂也可以称为软骨组织再生剂。软骨损伤治疗剂不仅包括将间充质干细胞保持原状功能没有变化地制剂化而成的治疗剂，也包括将通过使间充质干细胞在特定的条件下培养和增殖从而分化能力等功能提高的细胞制剂化而成的治疗剂。

增殖工序

增殖工序中，将间充质干细胞在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中培养，使间充质干细胞增殖。

间充质干细胞

间充质干细胞中，不仅包括来自滑膜细胞、脂肪细胞、骨髓、牙槽骨和牙周膜等成人的组织的细胞，也包括从胎盘、脐带血和胎儿的各种细胞等分离出的细胞。增殖工序中增殖的间充质干细胞优选为来源于选自滑膜、脐带、脐带血、羊膜、骨髓和脂肪中的组织。

增殖工序中增殖的间充质干细胞，优选为投予制造的软骨损伤治疗剂的患者的自体细胞，但也可以是同种细胞。另外，增殖工序中增殖的间充质干细胞可以是人间充质干细胞，也可以是小鼠、大鼠、猫、狗等非人动物来源的间充质干细胞。

作为从各组织分离间充质干细胞的方法，可以采用以往公知的方法，例如，利用胶原酶法能够从组织将间充质干细胞很好地分离。

无血清培养基A

用于构成增殖工序中使用的无血清培养基A的基础培养基是该领域周知的动物细胞用培养基即可，没有特别限制。作为优选的基础培养基，例如，可举出Ham’sF12培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基和MCDB培养基等。这些基础培养基可以单独使用，也可以将多个混合使用。一个实施方式中，用于构成无血清培养基A的基础培养基优选为MCDB培养基和DMEM培养基以1:1的比率混合而成的培养基。

一个实施方式中，可以将在上述基础培养基中添加FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A应用于增殖工序。

相对于基础培养基的FGF的含量，以终浓度计，优选为0.1～100ng/mL，进一步优选为3ng/mL。相对于基础培养基的PDGF的含量，以终浓度计，优选为0.5～100ng/mL，进一步优选为10ng/mL。相对于基础培养基的TGF-β的含量，以终浓度计，优选为0.5～100ng/mL，进一步优选为10ng/mL。

相对于基础培养基的HGF的含量，以终浓度计，优选为0.1～50ng/mL，进一步优选为5ng/mL。相对于基础培养基的EGF的含量，以终浓度计，优选为0.5～200ng/mL，进一步优选为20ng/mL。相对于基础培养基的磷脂的总含量，以终浓度计，优选为0.1～30μg/mL，进一步优选为10μg/mL。相对于基础培养基的脂肪酸的总含量，优选为基础培养基的1/1000～1/10，进一步优选为1/100。

通过使用这样的无血清培养基A，防止异种蛋白质的混入，同时得到与含血清培养基同等以上的增殖促进效果，能够使间充质干细胞以期望的方式增殖。

作为无血清培养基A含有的磷脂，例如，可举出磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油等，这些磷脂可以单独含有，也可以组合含有。一个实施方式中，无血清培养基A可以组合含有磷脂酸和磷脂酰胆碱，这些磷脂可以是动物来源，也可以是植物来源。

作为无血清培养基A含有的脂肪酸，例如，可举出亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、棕榈酸和硬脂酸等，这些脂肪酸可以单独含有，也可以组合含有。另外，一个实施方式中，无血清培养基A可以在上述脂肪酸以外进一步含有胆固醇。

本说明书中使用时，FGF是指选自成纤维细胞生长因子(FGF:fibroblastgrowthfactor)家族的生长因子，优选为FGF-2(bFGF)，但也可以从FGF-1等其他FGF家族选择。

另外，本说明书中使用时，PDGF是指选自血小板来源生长因子(PDGF:plateletderivedgrowthfactor)家族的生长因子，优选为PDGF-BB或PDGF-AB。

另外，本说明书中使用时，TGF-β是指选自转化生长因子-β(TGF-β:transforminggrowthfactor-β)家族的生长因子，优选为TGF-β3，但也可以从其他的TGF-β家族选择。

本说明书中使用时，HGF是指选自肝细胞生长因子(HGF:hepatocytegrowthfactor)家族的生长因子。本说明书中使用时，EGF是指选自上皮生长因子(EGF:epidermalgrowthfactor)家族的生长因子。

另外，一个实施方式中，无血清培养基A可以进一步含有选自结缔组织生长因子(CTGF:connectivetissuegrowthfactor)、血管内皮生长因子(VEGF:vascularendothelialgrowthfactor)和抗坏血酸化合物中的至少2种因子。

本说明书中使用时，抗坏血酸化合物是指抗坏血酸(维生素C)或抗坏血酸2磷酸或者与这些化合物类似的化合物。

应予说明，无血清培养基A中含有的上述生长因子可以是天然的生长因子，也可以是通过基因重组而制造的生长因子。

一个实施方式中，无血清培养基A优选含有脂质抗氧化剂。一个实施方式中，无血清培养基A含有的脂质抗氧化剂可以是DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E)。无血清培养基A此外可以进一步含有表面活性剂。一个实施方式中，无血清培养基A含有的表面活性剂可以是PluronicF-68或Tween80。

无血清培养基A可以进一步含有胰岛素、转铁蛋白和硒酸盐。本说明书中使用时，胰岛素可以是胰岛素样生长因子，可以是天然细胞来源，也可以是通过基因重组而制造的胰岛素。无血清培养基A进一步可以含有地塞米松或其他糖皮质激素。

增殖工序中，在上述无血清培养基A中，播种利用以往公知的方法从人等的动物组织或细胞分离的间充质干细胞，培养到增殖至期望的数量。作为培养条件，优选相对于培养基1mL播种1～2×10⁴个间充质干细胞，培养温度优选为37℃±1℃、培养时间优选为48～96小时且优选为5％CO₂下。通过在这样的条件下培养，能够效率良好地大量得到维持分化能力的间充质干细胞。

增殖工序中，用于培养的培养容器只要是间充质干细胞能够增殖即可，没有特别限制。例如，能够很好地使用Falcon制75cm²培养瓶或住友电木制75cm²培养瓶等。但是，不同细胞，存在因使用的培养容器的种类而细胞的增殖受到影响的情形。因此，为了使间充质干细胞效率更好地增殖，优选对增殖工序中成为增殖的对象的每种间充质干细胞(以下称为“增殖对象细胞”)，使用适于增殖的培养容器进行增殖工序。

作为适合于增殖对象细胞的增殖的培养容器的选择方法，例如，可举出针对增殖对象细胞选择最佳培养容器的方法。具体说明时，准备多种培养容器，除培养容器的种类不同以外在相同的培养条件下使增殖对象细胞增殖，对培养开始起2周后的细胞数利用公知方法测定，按照细胞数多的顺序能够判断适合于增殖对象细胞的增殖的培养容器。另外，增殖对象细胞的增殖速度快时，即使在培养开始起经过2周之前，按照达到汇合状态的80～90％的细胞数的时间短的顺序能够判断适合于增殖对象细胞的增殖的培养容器。

应予说明，间充质干细胞的增殖中，由于细胞附着于培养容器是必要条件，因此，增殖对象细胞对于培养容器的附着弱时，增殖工序中，优选在上述无血清培养基A中进一步含有细胞附着分子。作为细胞附着分子，例如，可举出纤维连接蛋白、胶原蛋白和明胶等。这些细胞附着分子可以单独使用一种，也可以组合使用多种。

相对于无血清培养基A的细胞附着分子的含量，以终浓度计，优选为1～50μg/mL，进一步优选为5μg/mL。一个实施方式中，使用纤维连接蛋白作为细胞附着分子时，通过相对于无血清培养基A按照以终浓度计为5μg/mL的方式添加纤维连接蛋白，能够提高增殖对象细胞对培养容器的附着效率。

或者，也可以使用涂布有上述细胞附着分子的培养容器来使增殖对象细胞增殖。

另外，增殖工序中，可以将间充质干细胞传代至少1次。由于间充质干细胞支架依赖性地进行增殖，所以当间充质干细胞局部集中增殖等时，在增殖工序的中途通过将间充质干细胞传代能够改善培养条件。

作为间充质干细胞的传代方法没有特别限制，能够使用以往公知的间充质干细胞的传代方法传代。由于传代后的间充质干细胞的状态良好，因此在上述增殖工序中，进行传代时优选使用不含有哺乳类和微生物来源的成分的细胞剥离剂将上述间充质干细胞剥离。作为不含有哺乳类和微生物来源的成分的细胞剥离剂，例如，可举出Accutase(注册商标)(InnovativeCellTechnologies，Inc.)和TrypLE(注册商标)Select(1X)(LifeTechnologiesCorporation)等。

此处，对使用Accutase作为不含有哺乳类和微生物来源的成分的细胞剥离剂时的传代方法的一例进行说明。按照(i)～(vi)的顺序将间充质干细胞剥离、传代。应予说明，以下说明的传代方法中，作为培养容器，假定使用T-25培养瓶(Falcon制)。

(i)使用PBS(-)5mL清洗细胞层。

(ii)添加2mLAccutase。

(iii)室温下静置2分钟左右，在确认细胞剥离后，将细胞悬浮液转移至离心管。

(iv)向培养容器添加7mLPBS(-)，冲洗培养瓶底面。

(v)将上述(iv)溶液转移至上述(iii)的离心管，以1500rpm(200×g)离心5分钟。

(vi)除去上清，以5000个/cm²的播种浓度，使用无血清培养基A播种。

应予说明，增殖工序中，优选提供从人等动物组织采取并传代第1次(P1)以后的间充质干细胞。

另外，增殖工序中，优选在维持分化能力的状态下使间充质干细胞增殖。即，增殖工序中，将未分化的且具有分化为脂肪细胞、骨细胞、和软骨细胞等的分化能力的间充质干细胞在无血清培养基A中培养，培养后的间充质干细胞也是未分化的且具有分化能力。由此，能够制造包含具有分化能力的间充质干细胞的软骨损伤治疗剂，通过将该软骨损伤治疗剂投予至软骨损伤部位，能够将维持分化能力的间充质干细胞投予至软骨损伤部位。

应予说明，间充质干细胞是否具有分化能力能够通过以下方法确认，即，将增殖的间充质干细胞在骨分化用培养基、脂肪分化用培养基和软骨分化用培养基等培养基中培养，评价是否分别被分化诱导为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等。另外，也可以通过以下方法确认间充质干细胞是否具有分化能力，即，使增殖的间充质干细胞与各种CD抗体反应，通过利用流式细胞仪测定荧光强度来评价表面抗原表达的方法，或者在增殖的间充质干细胞中通过测定未分化标记物基因(nanog、sox2、oct3/4)和内源性控制基因(Gapdh)来评价未分化标记物基因表达的方法等。

混合工序

混合工序中，将上述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合，制备细胞投予液。该细胞投予液是软骨损伤治疗剂。

混合工序中混合的间充质干细胞是增殖工序中增殖的间充质干细胞，且是利用以往公知的方法从培养基剥离的间充质干细胞。作为从培养基剥离间充质干细胞的方法，可举出上述的使用不含有哺乳类和微生物来源的成分的Accutase等细胞剥离剂的方法。

另外，混合工序中混合的间充质干细胞可以是将增殖工序中增殖后冷冻保存(例如，-80℃)的间充质干细胞融化的细胞。使用冷冻保存的间充质干细胞时，可以事先确认其增殖能力，融化后利用无血清培养基A培养至前汇合状态，在1次传代后使用。另外，使用冷冻保存的间充质干细胞时，优选事先确认有分化能力。

混合工序中，细胞投予液(即，软骨损伤治疗剂)中的间充质干细胞优选以成为1×10⁵个/mL～1×10⁸个/mL的方式混合，更优选以成为1×10⁶个/mL～5×10⁷个/mL的方式混合，进一步优选以成为5×10⁶个/mL～5×10⁷个/mL的方式混合，最优选以成为5×10⁶个/mL的方式混合。间充质干细胞数通过以成为上述范围内的方式混合，将制造的软骨损伤治疗剂投予至软骨损伤部位时，能够很好促进软骨的再生。

等张保存剂

作为混合工序中混合的等张保存剂，例如，可举出乳酸林格氏液，但不局限于此。作为乳酸林格氏液，能够使用可商业获得的乳酸林格氏液，例如，能够很好地使用乳酸林格氏液SOLULACT输液(TERUMO公司制)。等张保存剂可以单独使用一种，也可以将多种组合使用。

细胞保护剂

作为混合工序中混合的细胞保护剂，例如，可举出透明质酸，但不局限于此。作为细胞保护剂使用的透明质酸的平均分子量，优选为1500000～3900000。细胞保护剂可以单独使用一种，也可以将多种组合使用。

混合工序中，细胞投予液(即，软骨损伤治疗剂)中的细胞保护剂的浓度优选以成为大于0％且为0.5％以下的方式混合，更优选以成为0.005％～0.1％的方式混合，进一步优选以成为0.01％～0.1％的方式混合，最优选以成为0.01％的方式混合。

因此，混合工序中混合的等张保存剂和细胞保护剂的量，根据混合前的细胞保护剂的浓度确定。即，混合工序中，将间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合而制备的细胞投予液的量例如为1mL，混合前的细胞保护剂的浓度为1％时，为了将细胞投予液中的细胞保护剂的浓度制备为0.1％，将细胞保护剂100μL和等张保存剂900μL混合。另外，细胞投予液的量例如为1mL，混合前的细胞保护剂的浓度为1％时，为了将细胞投予液中的细胞保护剂的浓度制备为0.01％，混合工序中将细胞保护剂10μL和等张保存剂990μL混合。

本发明人等发现，与以高浓度含有细胞保护剂的情形相比，如上述所示，以低浓度含有细胞保护剂的情形的软骨损伤治疗剂的软骨再生能力优异。即，通过细胞保护剂的浓度在上述范围内混合，能够防止间充质干细胞的功能降低，能够更好地促进软骨的再生。

另外，本发明人等发现，制备的细胞投予液中的细胞保护剂的浓度为0.01％～0.1％时，与该细胞投予液的保存相伴的间充质干细胞的生存率的降低得到抑制。即，通过将细胞保护剂的浓度以成为上述范围内的方式混合，能够提供可经受更长期的保存的软骨损伤治疗剂。

混合工序中，只要软骨损伤治疗剂的软骨再生功能不变化，则可以混合其他成分。

混合工序中制备的细胞投予液在投予至软骨损伤部位之前的一定时间，例如可以在4～37℃保存。保存时，更优选冷藏保存(4℃)。细胞保护剂的浓度为0.01％～0.1％时，即使在4℃保存1个月以上，仍能够维持60％以上的细胞生存率。另外，该浓度时，即使在37℃保存，24小时仍能维持70％以上的细胞生存率。保存一定时间时，优选在投予前确认间充质干细胞有分化能力。

前增殖工序

本发明涉及的制造方法中，在上述增殖工序之前，可以进一步进行前增殖工序，即将间充质干细胞在含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基B中培养，使间充质干细胞增殖。

无血清培养基B

无血清培养基B，在不含有HGF和TGF-β这一点上与上述“增殖工序”一项中说明的无血清培养基A不同。对于HGF和TGF-β以外的成分(FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸)以及基础培养基，如上述“增殖工序”一项中关于无血清培养基A的说明所示，因此此处省略相关说明。

另外，一个实施方式中，无血清培养基B与无血清培养基A同样地优选含有脂质抗氧化剂。另外，无血清培养基B可以进一步含有表面活性剂。另外，无血清培养基B可以进一步含有胰岛素、转铁蛋白和硒酸盐。另外，无血清培养基B，进一步可以含有地塞米松或其他糖皮质激素。对于这些成分，如上述“增殖工序”一项中关于无血清培养基A的说明所示，因此此处省略相关说明。

应予说明，无血清培养基B所含有的上述成分的含量在上述“增殖工序”一项中关于无血清培养基A的说明的含量的范围内即可，可以与无血清培养基A所含有的各成分的含量相同，也可以不同。

前增殖工序中，在上述的无血清培养基B中，播种利用以往公知的方法从人等动物组织分离的间充质干细胞，培养至增殖到期望的数量为止。作为培养条件，优选相对于培养基1mL分离1～500mg的组织片(含有MSC)而播种间充质干细胞，培养温度优选为37℃±1℃，培养时间优选为3～14日，且优选为5％CO₂下。

供于前增殖工序的间充质干细胞没有特别限制，优选为初期的间充质干细胞，即从人等动物组织采取后未经过一次传代培养的细胞。如后述的实施例所示，在提供给增殖工序之前通过在无血清培养基B中使初期间充质干细胞预先增殖，能够极其显著地增加增殖工序中得到的间充质干细胞的数量。

一个实施方式中，作为前增殖工序中的间充质干细胞的培养方法，例如，以2×10⁵个/cm²的播种浓度在无血清培养基B中播种间充质干细胞，之后1周左右，每2日追加添加播种时培养液量的10％的无血清培养基B，使细胞增殖到细胞数达到汇合状态的70～80％。由此通过将在无血清培养基B中预先培养的间充质干细胞提供给增殖工序，能够效率良好地大量得到维持分化能力的间充质干细胞。

另外，为了在前增殖工序中使间充质干细胞效率更加良好地增殖，对于每种前增殖工序中成为增殖的对象的间充质干细胞(以下称为“前增殖对象细胞”)，优选使用适合于增殖的培养容器进行前增殖工序。作为适合于前增殖对象细胞的增殖的培养容器的选择方法，如上述“增殖工序”一项说明所示，因此此处省略相关说明。

另外，与增殖工序同样地，在前增殖工序中，前增殖对象细胞相对于培养容器的附着弱时，上述无血清培养基B可以进一步含有细胞附着分子。对于上述细胞附着分子，如上述“增殖工序”一项说明所示，因此此处省略相关说明。

另外，与增殖工序同样地，在前增殖工序中，可以将间充质干细胞传代至少1次。在前增殖工序中途通过将间充质干细胞传代能够改善培养条件。应予说明，前增殖工序优选在初代培养(P0)～传代第3次(P3)的期间进行。对于在前增殖工序中途将间充质干细胞传代的方法和将前增殖工序后的细胞提供于增殖工序时的传代方法，如上述“增殖工序”一项说明所示，因此此处省略相关说明。

应予说明，前增殖工序中，间充质干细胞的附着或增殖差时，在培养中途可以在培养基中添加1％的自身血清或同种血清。另外，在前增殖工序中，可以以在培养基中添加1％抗生物质并逐渐降低其浓度的方式培养。

如上述所示，根据本发明的制造方法，即便是无血清培养基，仍能以与在含血清培养基中培养时同等或其以上的速度使间充质干细胞增殖，而且增殖的间充质干细胞维持分化能力。因此，将含有这种间充质干细胞的软骨损伤治疗剂投予患者时，不仅能够实现利用间充质干细胞的优异的移植治疗，而且能够实现稳定的治疗。另外，与使用血清制造的以往的细胞制剂相比，不需要考虑血清的批次差异，能够实现移植治疗中稳定的治愈率。

2.软骨损伤治疗剂

本发明提供一种含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂。本发明涉及的软骨损伤治疗剂含有间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂，其中间充质干细胞是在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中培养而得到的。

间充质干细胞

软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞中，不仅包括来自滑膜细胞、脂肪细胞、骨髓、牙槽骨和牙周膜等成人组织的细胞，而且也包括从胎盘、脐带、脐带血和胎儿的各种细胞等分离的细胞。增殖工序中增殖的间充质干细胞优选为来源于选自滑膜、脐带、脐带血、羊膜、骨髓和脂肪中的组织。

软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞优选为投予软骨损伤治疗剂的患者的自体细胞，但也可以是同种细胞。另外，间充质干细胞可以是人间充质干细胞，也可以是小鼠、大鼠、猫、狗等非人动物来源的间充质干细胞。

作为从各组织分离间充质干细胞的方法，能够采用以往公知的方法，例如，利用胶原酶法能够很好地从组织分离间充质干细胞。

软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞是在上述的无血清培养基A中培养增殖的间充质干细胞。即，软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞能够是上述的软骨损伤治疗剂的制造方法中的增殖工序中增殖的间充质干细胞。另外，软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞可以是在上述的无血清培养基B中培养增殖后，进一步在无血清培养基A中培养增殖的间充质干细胞。即，软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞可以是上述的软骨损伤治疗剂的制造方法中的前增殖工序中增殖后，在增殖工序中增殖的间充质干细胞。

另外，软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞可以是在无血清培养基A中培养后，使用细胞剥离剂从培养基剥离并冷冻保存(例如，-80℃)后融化的细胞。而且，软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞可以是融化后利用无血清培养基A培养到达到前汇合状态并传代1次的细胞。

软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞的细胞数优选为1×10⁵个/mL～1×10⁸个/mL，更优选为1×10⁶个/mL～5×10⁷个/mL，进一步优选为5×10⁶个/mL～5×10⁷个/mL，最优选为5×10⁶个/mL。通过在上述范围内含有间充质干细胞数，将软骨损伤治疗剂投予至软骨损伤部位时，能够很好地促进软骨的再生。

软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞优选维持分化能力。即，软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞是未分化的且具有分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等的分化能力。通过将这种软骨损伤治疗剂投予至软骨损伤部位，能够将维持分化能力的间充质干细胞投予至软骨损伤部位。

等张保存剂

作为软骨损伤治疗剂所含有的等张保存剂，例如，可举出乳酸林格氏液，但不局限于此。作为乳酸林格氏液，能够使用可商业获得的乳酸林格氏液，例如，能够很好地使用乳酸林格氏液SOLULACT输液(TERUMO公司制)。软骨损伤治疗剂，作为等张保存剂，可以单独含有一种，也可以将多种组合含有。

细胞保护剂

作为软骨损伤治疗剂所含有的细胞保护剂，例如可举出透明质酸，但不局限于此。作为细胞保护剂使用的透明质酸的平均分子量优选为1500000～3900000。软骨损伤治疗剂，作为细胞保护剂，可以单独含有，也可以将多种组合含有。

软骨损伤治疗剂所含有的细胞保护剂的浓度优选为大于0％且为0.5％以下，更优选为0.005％～0.1％，进一步优选为0.01％～0.1％，最优选为0.01％。

软骨损伤治疗剂所含有的等张保存剂和细胞保护剂的量，根据细胞保护剂的浓度确定。即，软骨损伤治疗剂整体的量例如为1mL，混合至软骨损伤治疗剂前的细胞保护剂的浓度为1％时，如果软骨损伤治疗剂中细胞保护剂的浓度为0.1％，则软骨损伤治疗剂中含有细胞保护剂100μL和等张保存剂900μL。另外，软骨损伤治疗剂整体的量例如为1mL，混合至软骨损伤治疗剂前的细胞保护剂的浓度为1％时，如果软骨损伤治疗剂中的细胞保护剂的浓度为0.01％，则软骨损伤治疗剂中含有细胞保护剂10μL和等张保存剂990μL。

本发明人等发现，与以高浓度含有细胞保护剂的情形相比，如上述所示，以低浓度含有细胞保护剂的情形的软骨损伤治疗剂的软骨再生能力优异。即，细胞保护剂的浓度通过在上述范围内含有，能够防止间充质干细胞的功能降低，能够更好地促进软骨的再生。

另外，本发明人等发现，细胞保护剂的浓度为0.01％～0.1％时，与细胞投予液的保存伴随的间充质干细胞的生存率的降低被抑制。即，细胞保护剂的浓度通过在上述范围内含有，软骨损伤治疗剂能够经得住更长期保存。

软骨损伤治疗剂只要不使其软骨再生功能变化，也可以含有其他成分。

软骨损伤治疗剂的用途

本发明涉及的软骨损伤治疗剂用于投予至软骨损伤部位，使软骨再生。另外，软骨损伤治疗剂也可以投予至因覆盖骨的软骨损伤引起至少一部分的骨露出的全层损伤部位，但优选投予至软骨的一部分损伤到不露出骨的程度的部分损伤部位或软骨层约一半损伤的半层损伤部位。另外，除去软骨的变性部，投予软骨损伤治疗剂也是有效的。

软骨损伤治疗剂可投予至关节软骨的损伤部位，例如能够投予至膝关节软骨、足关节软骨或肩关节软骨等的损伤部位。另外，软骨损伤治疗剂投予至椎间盘的损伤部位或变性部位，也能够用于椎间盘的再生和/或髓核变性的改善。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂优选对于软骨损伤部位每1次投予0.5mL～10mL，更优选投予1mL～5mL，最优选投予1mL～3mL。由此，能够更有效地使软骨损伤部位的软骨再生。

另外，本发明涉及的软骨损伤治疗剂优选每1治疗位置投予1次～10次，更优选投予1次～5次，最优选投予1次～3次。由此，能够更有效地使软骨损伤部位的软骨再生。

而且，将本发明涉及的软骨损伤治疗剂每1治疗位置多次投予时，作为投予时机，优选每3日～28日投予，更优选每3日～21日投予，最优选每3日～7日投予。由此，能够更有效地使软骨损伤部位的软骨再生。

另外，作为本发明涉及的软骨损伤治疗剂的投予方法，优选利用注射器等将软骨损伤治疗剂投予至关节腔内的方法。另外，为了适当地将软骨损伤治疗剂投予至关节腔内，可以边使用关节镜确认投予位置边投予软骨损伤治疗剂。而且，可以将软骨损伤部位切去清洁损伤位置后投予软骨损伤治疗剂。

根据本发明涉及的软骨损伤治疗剂，通过直接投予至软骨损伤部位，能够促进软骨损伤部位中的软骨的再生。本发明人等发现，通过对软骨损伤部位投予含有无血清培养并维持分化能力的间充质干细胞和细胞保护剂的软骨损伤治疗剂，除了原本间充质干细胞具有的抗炎症作用和免疫耐受作用之外，该间充质干细胞的功能被细胞保护剂充分保护，(i)能够从间充质干细胞很好地释放有助于软骨再生的细胞因子和(ii)间充质干细胞能够很好地归巢至软骨损伤部位，从而完成本发明。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞，由于很好地被细胞保护剂保护，因此如图1所示，在投予的软骨损伤部位能够长时间生存，且能够持续释放有助于软骨再生的细胞因子，且很好地归巢至软骨损伤部位。图1是说明本发明机理的示意图。

而且，从软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞释放的细胞因子，刺激软骨损伤部位的成纤维细胞和血管内皮细胞等的增殖。由此，软骨损伤部位的血管开始新生，成纤维细胞和类似细胞在软骨损伤部位积累，细胞外基质持续新生和沉积。另外，归巢至软骨损伤部位的间充质干细胞附着、增殖和分化，使软骨组织再生。

这样，根据本发明涉及的软骨损伤治疗剂，软骨损伤治疗剂所含有的间充质干细胞本身在投予的软骨损伤部位分化为软骨细胞使软骨组织再生，而且在软骨损伤部位以未分化的状态长时间生存，持续释放有助于软骨再生的细胞因子，由此促进软骨再生。当然，间充质干细胞具有的抗炎症作用和免疫耐受作用使同种移植成为可能。

另外，本发明涉及的软骨损伤治疗剂，由于含有等张保存剂，因此能够防止软骨损伤治疗剂中的间充质干细胞的生存率的降低，且能够长时间保存软骨损伤治疗剂。即，本发明涉及的软骨损伤治疗剂，在需要时可以将预先制备的治疗剂投予给患者，因此能够大幅减少患者的负担。

这样，根据本发明涉及的软骨损伤治疗剂，仅通过利用注射器等投予至软骨损伤部位就能够使软骨再生，因此不会对损伤的软骨组织以外的其他组织带来不必要的损伤。

另外，本发明涉及的软骨损伤治疗剂不仅很好地适用于自体移植的治疗，而且也适用于将自身以外的组织和细胞移植给他人的(捐献者与接受者不同)异体移植的治疗。而且，不仅能够很好地用于使用人组织或人细胞的同种移植(allograft)，而且能够很好地用于使用人以外的动物组织或动物细胞的异种移植(xenograft)。因此，由于可以不从患者自身取得细胞，因此，在患者的负担减轻的同时，能够对多数患者及时提供软骨损伤治疗剂，而且，通过一次手术能够治疗。

而且，根据本发明涉及的软骨损伤治疗剂，通过一次投予也能够使软骨再生，因此不需要反复治疗，在肉体、精神和金钱方面，患者的负担减轻。而且，根据本发明涉及的软骨损伤治疗剂，能够短时间内可靠地使软骨再生。

另外，本发明涉及的软骨损伤治疗剂，由于含有无血清培养的间充质干细胞，因此，不存在将血清中混入的未知病原体(病毒和病原性朊病毒等)投予至患者体内的危险性。另外，由于血清非常昂贵，并且因为是天然制品所以每批次产生成分的差异，因此细胞增殖效果容易产生波动，本发明中由于不使用血清，因此不产生这类问题。而且，不需要为了从培养后的间充质干细胞除去来源于血清的蛋白质等而进行精制，因此实现操作的高效化。

而且，本发明涉及的软骨损伤治疗剂，由于免支架(scaffold)，因此，不需要如已有的培养软骨细胞移植术这样采取健康部的骨膜来覆盖移植部。因此，不存在骨膜采取引起的有害事件产生的风险。

应予说明，对于使用本发明涉及的软骨损伤治疗剂的软骨损伤治疗方法和使用本发明涉及的软骨损伤治疗剂的软骨组织再生方法，也包含于本发明的范畴。软骨损伤治疗方法和软骨组织再生方法包含以下投予工序，即将本发明涉及的软骨损伤治疗剂以上述的投予量、投予次数和投予时机投予至患者的上述投予部位。

3.用于制造软骨损伤治疗剂的无血清的培养基用添加剂

本发明提供用于制造含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂的无血清的培养基用添加剂。本发明涉及的培养基用添加剂含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸。本发明涉及的培养基用添加剂添加至以往公知的基础培养基，能够作为用于制造含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂的无血清培养基(无血清培养基A)使用。

作为本发明涉及的培养基用添加剂含有的磷脂，例如，可举出磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油等，本发明涉及的培养基用添加剂可以单独含有这些磷脂，也可以组合含有。一个实施方式中，本发明涉及的培养基用添加剂将磷脂酸和磷脂酰胆碱组合含有。另外，这些磷脂可以是动物来源，也可以是植物来源。

作为本发明涉及的培养基用添加剂含有的脂肪酸，例如，可举出亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、棕榈酸和硬脂酸等，本发明涉及的培养基用添加剂可以单独含有这些脂肪酸，也可以组合含有。另外，本发明涉及的培养基用添加剂，除上述脂肪酸以外可以进一步含有胆固醇。

本说明书中使用时，FGF是指选自成纤维细胞生长因子(FGF:fibroblastgrowthfactor)家族的生长因子，优选为FGF-2(bFGF)，但也可以选自FGF-1等其他FGF家族。

另外，本说明书中使用时，TGF-β是指选自转化生长因子-β(TGF-β:transforminggrowthfactor-β)家族的生长因子，优选为TGF-β3，但也可以选自其他TGF-β家族。

另外，一个实施方式中，培养基用添加剂可以进一步含有选自结缔组织生长因子(CTGF:connectivetissuegrowthfactor)、血管内皮生长因子(VEGF:vascularendothelialgrowthfactor)和抗坏血酸化合物中的至少2种因子。

应予说明，本发明涉及的培养基用添加剂所含有的生长因子，可以是天然的生长因子，也可以是通过基因重组制造的生长因子。

一个实施方式中，本发明涉及的培养基用添加剂优选含有脂质抗氧化剂。一个实施方式中，本发明涉及的培养基用添加剂所含有的脂质抗氧化剂可以是DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E)。本发明涉及的培养基用添加剂另外可以进一步含有表面活性剂。一个实施方式中，本发明涉及的培养基用添加剂所含有的表面活性剂可以是PluronicF-68或Tween80。

本发明涉及的培养基用添加剂可以进一步含有胰岛素、转铁蛋白和硒酸盐。本说明书中使用时，胰岛素可以是胰岛素样生长因子，其可以是天然的细胞来源，也可以是通过基因重组而制造的生长因子。本发明涉及的培养基用添加剂进一步可以含有地塞米松或其他糖皮质激素。

4.用于制造软骨损伤治疗剂的无血清的培养用培养基

本发明提供用于制造含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂的无血清的培养用培养基。本发明涉及的培养用培养基含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸。本发明涉及的培养用培养基能够作为用于制造含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂的无血清培养基(无血清培养基A)使用。

本发明涉及的培养用培养基含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸即可，这些成分可以同时添加到基础培养基也可以分别添加。即，本发明涉及的培养用培养基含有上述的培养基用添加剂所含有的成分或者后述的培养基用添加剂试剂盒中所具有的成分即可。

用于构成本发明的培养用培养基的基础培养基是在该领域周知的动物细胞用培养基即可没有特别限制。作为优选的基础培养基，例如，可举出Ham’sF12培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基和MCDB培养基等。这些基础培养基可以单独使用，也可以将多个混合使用。一个实施方式中，用于构成本发明的培养用培养基的基础培养基优选为MCDB培养基和DMEM培养基以1:1的比率混合的培养基。

5.用于制造软骨损伤治疗剂的培养方法

本发明提供同于制造含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂的培养方法。本发明涉及的培养方法包含在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基(无血清培养基A)中培养间充质干细胞的工序(培养工序A)。本发明涉及的培养方法，只要在培养间充质干细胞时使用上述无血清的培养用培养基即可。

另外，本发明涉及的培养方法，在上述培养工序A之前，进一步包含在含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基B中培养间充质干细胞的工序(培养工序B)。

应予说明，上述培养工序A和上述培养工序B，与本发明涉及的含有间充质干细胞的细胞制剂的制造方法中的增殖工序和前增殖工序分别对应。因此，能够将对于本说明书中的上述“软骨损伤治疗剂的制造方法”一项中的增殖工序和前增殖工序的说明，分别作为对于培养工序A和培养工序B的说明。

一个实施方式中，本发明涉及的培养方法可以包含将FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸同时添加到基础培养基的工序。另外，一个实施方式中，本发明涉及的培养方法可以包含将FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸同时添加到基础培养基的工序。上述基础培养基，如上述所示为该领域周知的动物细胞用培养基即可没有特别限制。

6.用于制造软骨损伤治疗剂的试剂盒

本发明提供用于制造含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂的试剂盒。本发明涉及的试剂盒含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸。

本发明涉及的试剂盒可以在同一容器内具有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸，也可以分别具有这些成分。另外，本发明涉及的试剂盒可以进一步含有细胞附着分子。对于上述细胞附着分子，如本说明书中的上述“软骨损伤治疗剂的制造方法”一项的增殖工序中说明所示，此处省略相关说明。

本发明涉及的试剂盒，能够添加到以往公知的基础培养基，作为用于制造含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂的无血清培养基(无血清培养基A)使用。

本说明书中使用时，“组合物”是指各主成分含有在一物质中的形式，“试剂盒”是指各主成分的至少一种含有在不同物质中的形式。因此，可容易理解的是本发明涉及的试剂盒所具有的生长因子、磷脂和脂肪酸与在培养基用添加剂叙述的物质相同。

另外，本发明涉及的试剂盒是用于制造含有间充质干细胞的软骨损伤治疗剂的试剂盒，至少具有本发明的培养基用添加剂(培养基用添加剂A)。另外，本发明涉及的试剂盒可以进一步具有含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的培养基用添加剂B。应予说明，对于上述无血清培养基B的说明，能够阅读与培养基用添加剂B相关的说明。

另外，本发明涉及的试剂盒可以具有等张保存剂、细胞保护剂、培养容器和使用说明书等中的至少一种。对于上述等张保存剂、细胞保护剂、和培养容器，如本说明书中的上述“软骨损伤治疗剂的制造方法”一项中说明所示，因此此处省略相关说明。上述使用说明书中，例如，记录有在上述“软骨损伤治疗剂的制造方法”一项中说明的本发明涉及的软骨损伤治疗剂的制造方法的内容。

7.总结

本发明涉及的软骨损伤治疗剂的制造方法，其特征在于，包含以下工序：在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中使间充质干细胞增殖的增殖工序；将上述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合的混合工序。

本发明涉及的制造方法中，在上述混合工序中，优选以上述间充质干细胞成为1×10⁵个/mL～1×10⁸个/mL的方式混合。

本发明涉及的制造方法中，在上述混合工序中，优选以上述细胞保护剂的浓度成为大于0％且为0.5％以下的方式混合。

本发明涉及的制造方法中，在上述混合工序中，更优选以上述细胞保护剂的浓度成为0.01％～0.1％的方式混合。

本发明涉及的制造方法中，上述间充质干细胞优选来源于选自滑膜、脐带、脐带血、羊膜、骨髓和脂肪中的组织。

本发明涉及的制造方法，在上述增殖工序中，优选以维持分化能力的状态使上述间充质干细胞增殖。

本发明涉及的制造方法，在上述增殖工序之前，优选进一步包含在含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基B中使间充质干细胞增殖的前增殖工序。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂中，上述间充质干细胞的细胞数优选为1×10⁵个/mL～1×10⁸个/mL。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂中，上述细胞保护剂的浓度优选为大于0％且为0.5％以下。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂中，上述细胞保护剂的浓度优选为0.01％～0.1％。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂中，上述间充质干细胞优选维持分化能力。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂，优选投予至软骨的一部分损伤的软骨损伤部位。

本发明涉及的软骨损伤治疗剂，优选多次投予至上述软骨损伤部位。

本发明涉及的培养基用添加剂，其特征在于，其是用于制造软骨损伤治疗剂的无血清的培养基用添加剂，含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸。

本发明涉及的培养用培养基，其特征在于，其是用于制造软骨损伤治疗剂的无血清的培养用培养基，含有本发明涉及的培养基用添加剂。

本发明涉及的培养方法，其特征在于，其是用于制造软骨损伤治疗剂的培养方法，包含在本发明涉及的培养用培养基中培养间充质干细胞的工序。

本发明不局限于上述各实施形式，在要求保护的范围内能够进行各种变形，将不同的实施形式分别公开的技术手段适当组合得到的实施形式也包含于本发明的技术范围内。

实施例

I.软骨再生实验

1.细胞培养

使用直径2.0mm的颞下颌关节镜，使健康的比格成年犬(北山LABES株式会社，月龄:11个月龄，性别:雄性)的膝关节软骨半层缺失，制作狗的软骨缺失模型。从与软骨半层缺失的膝关节不同的另一膝关节侵袭性采取滑膜组织，浸泡于50mL管内的添加有抗生物质(青霉素-链霉素，浓度1％，sigma公司制)的生理食盐液中运输至实验室。利用剪刀切碎运输的组织，胶原酶处理后，利用过滤器过滤。在含有从下述表1所示的无血清培养基A即培养基1(STK2(注册商标))除去HGF和TGF-β而得的无血清培养基B即培养基2(STK1(注册商标))的培养器中，以细胞密度均匀的方式播种，在保持37℃的二氧化碳培养箱内(空气95％和二氧化碳5％)培养。

培养开始起第4日(传代第0次)，通过用Accutase(InnovativeCellTechnologies,Inc.)处理回收细胞，在含有下述表1所示的无血清培养基A即培养基1的培养器中，再次以细胞密度均匀的方式播种，传代培养。

[表1]

在培养第9日，确认细胞汇合，使用Accutase处理，回收细胞，-80℃下冷冻保存。

2.多分化能力试验

考察上述1.的培养后的细胞是否维持分化能力。

骨分化能力

在培养基2中培养，回收成为汇合的细胞，在骨分化用培养基(STK3(注册商标))中播种培养。培养7日后和21日后，利用茜素红S(NacalaiTesque:01303-52)染色，确认是否被骨分化诱导。与培养7日后相比培养21日后的培养基被良好地染色，可知被诱导为成骨细胞。

脂肪分化能力

在培养基2中培养，回收成为汇合的细胞，在脂肪分化用培养基(DMEM(sigma:D5796)、FBS(Hyclone)、青霉素-链霉素(Sigma:P0781)、胰岛素(Wako:093-06471)、地塞米松(Sigma:D1756)、吲哚美辛(Wako:097-02471)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Calbiochem:410957))中播种培养。脂肪分化诱导培养基和脂肪分化维持培养基(MEM(sigma:D5796)、FBS(Hyclone)、青霉素-链霉素(Sigma:P0781)、胰岛素(Wako:093-06471))每隔3日相互交换培养。培养7日后和培养21日后利用油红O(WAKO:154-02072)染色，确认是否被脂肪分化诱导。与培养7日后相比培养21日后的培养基被良好地染色，可知被诱导为脂肪细胞。

软骨分化能力

在培养基2中培养，回收成为汇合的细胞，在软骨分化用培养基(αMEM(Sigma:M4526)、青霉素-链霉素(Sigma:P0781)、glutaMAX(L-glutamine)(LifeTechnologiesCorporation:35050-061)、地塞米松(Sigma:D1756)、抗坏血酸-2-磷酸(Sigma:A8960)、D-葡萄糖(Sigma:G8769)、丙酮酸(Sigma:28-4020-2)、ITS(胰岛素，转铁蛋白，硒酸)(LifeTechnologiesCorporation:41400-045)、亚油酸(Sigma:L5900)、BSA(WAKO:017-15146)、TGF-b3(peprotec:100-36E))中立体培养。

为了确认细胞的软骨分化诱导，将软骨分化用培养基中培养的细胞，在培养基1(STK2)和基础培养基(DMEM)中分别播种培养。培养14日后和28日后，利用实时PCR测定软骨特异性基因(typeII胶原蛋白、蛋白聚糖和sox9)的表达量。测定结果由图25示出。图25是表示在软骨分化用培养基中培养的MSC中的软骨特异性基因(typeII胶原蛋白、蛋白聚糖和sox9)的表达量的图。如图25所示，确认各基因均高表达，可知被诱导为软骨细胞。

3.关节内投予(单次投予)

方法

事先确认冷冻保存的细胞的增殖能力，从投予日起向前推算开始培养。将冷冻保存的细胞融化，在STK2培养基中，培养直至变为前汇合，进行1次传代。在投予日当天或前一天回收细胞，制备细胞数并与透明质酸(SUVENYL(注册商标)，中外制药公司制)和乳酸林格氏液SOLULACT输液(TERUMO公司制)混合，制备细胞投予液。

将制备后的细胞投予液运输至动物实验设施(5～21小时冷藏保存)，将细胞投予液注入注射器，单次投予至上述1.中制作的狗的软骨缺失模型的关节内(膝关节的软骨半层缺失部位)。

应予说明，投予后，测定细胞投予液内的细胞生存率后，冷藏保存21小时以内，无论细胞数和透明质酸浓度如何，细胞的生存率均维持85％以上。由此，确认正常进行细胞投予液的关节内投予。

结果

为了研究最适合关节软骨损伤部的再生的MSC的投予细胞数和透明质酸浓度，使用各种细胞数和透明质酸浓度的细胞投予液，进行上述3.的关节内投予。

细胞投予液投予12周后，观察软骨半层缺失部位，制作切片。对制作的切片，进行苏木精·伊红染色、甲苯胺蓝染色和藏红O染色、typeII胶原蛋白染色等各种染色，通过显微镜观察评价缺失部位的修复状态。

此处，关节软骨没有损伤的正常透明软骨的染色图像的显微镜图像由图2示出。图2中(a)表示苏木精·伊红染色图像，图2中(b)表示甲苯胺蓝染色图像，图2中(c)表示藏红O染色图像。软骨基质由箭头表示，通过苏木精·伊红染色染成淡的粉红色，通过甲苯胺蓝染色染成浓的蓝色，通过藏红O染色染成浓的红色。附图中，这些染色状态由灰度示出。

接下来，上述3.中将各种成分浓度的细胞投予液分别投予至软骨半层缺失部位时的代表性的显微镜图像由图3～16示出。另外，作为软骨半层缺失部位的肉眼评价，使用ICRS(InternationalCartilageRepairSociety)的Macroscopicscales进行评价，作为组织学评价，使用修正的O’Driscoll的histologicalgradingscales进行评价。ICRSMacroscopicscales的评价指标由表2示出，修正的O’Driscoll的histologicalgradingscales的评价指标由表3示出。

[表2]

[表3]

图3示出作为比较例的使用不含有透明质酸的细胞投予液的实验结果。即，图3是将含有MSC5×10⁵个和乳酸林格氏液1mL的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图3中(a)表示软骨半层缺失部位的肉眼图像，图3中(b)表示图3中(a)的虚线包围的部分的苏木精·伊红染色图像，图3中(c)表示图3中(a)的虚线包围的部分的甲苯胺蓝染色图像，图3中(d)表示图3中(a)的虚线包围的部分的藏红O染色图像。以下，图4～14中，图中的(a)～(d)与图3相同。图3的状态下的ICRS评分为2，修正O’Driscoll的组织学评分为13。

图4是将含有MSC5×10⁵个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图4的状态下的ICRS评分为3，修正O’Driscoll的组织学评分为17。

图5是将含有MSC5×10⁵个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图5的状态下的ICRS评分为2，修正O’Driscoll的组织学评分为17。

图6是将含有MSC5×10⁵个、乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图6的状态下的ICRS评分为2，修正O’Driscoll的组织学评分为16。

图7表示作为比较例的使用不含有透明质酸的细胞投予液的实验结果。即，图7是将含有MSC5×10⁶个和乳酸林格氏液1mL的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图7的状态下的ICRS评分为2，修正O’Driscoll的组织学评分为14。

图8是将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图8的状态下的ICRS评分为11，修正O’Driscoll的组织学评分为39。

图9是将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图9的状态下的ICRS评分为4，修正O’Driscoll的组织学评分为19。

图10是将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图10的状态下的ICRS评分为2，修正O’Driscoll的组织学评分为15。

图11表示作为比较例的使用不含有透明质酸的细胞投予液的实验结果。即，图11是将含有MSC5×10⁷个和乳酸林格氏液1mL的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图11的状态下的ICRS评分为2，修正O’Driscoll的组织学评分为17。

图12是将含有MSC5×10⁷个、乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图12的状态下的ICRS评分为2，修正O’Driscoll的组织学评分为16。

图13表示作为比较例的使用不含有MSC和透明质酸的投予液的实验结果。即，图13是将仅含有乳酸林格氏液1mL的投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图13的状态下的ICRS评分为1，修正O’Driscoll的组织学评分为11。

图14表示作为比较例的使用不含有MSC的投予液的实验结果。即，图14是将含有乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图14的状态下的ICRS评分为1，修正O’Driscoll的组织学评分为11。

图15是将含有MSC5×10⁷个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图15中(a)表示软骨半层缺失部位的肉眼图像，图15中(b)表示图15中(a)的虚线包围的部分的苏木精·伊红染色图像，图15中(c)表示图15中(a)的虚线包围的部分的typeII胶原蛋白染色图像，图15中(d)表示图15中(a)的虚线包围的部分的藏红O染色图像。图15的状态下的ICRS评分为11，修正O’Driscoll的组织学评分为37。

图16是将含有MSC5×10⁷个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图16中(a)～(d)的说明与图15相同。图16中(e)表示图16中(a)的虚线包围的部分的甲苯胺蓝染色图像。图16的状态下的ICRS评分为3，修正O’Driscoll的组织学评分为18。

基于各细胞数和每个透明质酸浓度的ICRS评分和修正O’Driscoll的组织学评分，可知含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液能够最良好地使软骨组织再生。另一方面，可知透明质酸变为高浓度时，软骨再生受到阻碍。另外，对手术后的狗的步行能力、感染的有无等健康状态的影响极少。

另外，在投予细胞投予液的狗的软骨缺失模型中，对健康的关节内软骨和滑膜进行上述染色，评价再生异常的产生。图17表示投予细胞投予液的关节内的健康软骨的显微镜图像，(a)是表示苏木精·伊红染色图像的图，(b)是表示甲苯胺蓝染色图像的图，(c)是表示藏红O染色图像的图。图18表示投予细胞投予液的关节内的健康滑膜的显微镜图像，(a)是表示苏木精·伊红染色图像的图，(b)是表示甲苯胺蓝染色图像的图，(c)是表示藏红O染色图像的图。如图17和18所示，在健康的关节内没有发现明显的再生异常。

作为结论，结果最好的、将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位的个体的进行了typeII胶原蛋白免疫染色的显微镜图像的低倍率放大图由图19示出，高倍率放大图由图20示出。而且，完全没有得到软骨再生的将仅含有乳酸林格氏液1mL的投予液投予至软骨半层缺失部位的个体的进行了typeII胶原蛋白免疫染色的显微镜图像的低倍率放大图由图21示出，高倍率放大图由图22示出。

图19和20所示的最良好的结果表示投予含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液的软骨半层缺失部位的typeII胶原蛋白免疫染色图像。图21和22表示投予仅含有乳酸林格氏液1mL的投予液的软骨半层缺失部位的typeII胶原蛋白免疫染色图像。

如图19～22所示，通过将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液投予至软骨半层缺失部位，软骨良好地再生。

4.关节内投予(多次投予)

方法

利用与上述3.相同的方法，制备含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液，以及含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的细胞投予液。将制备后的细胞投予液运输至动物实验设施(5～21小时冷藏保存)，将细胞投予液注入注射器，在上述1.制作的狗的软骨缺失模型的关节内(膝关节的软骨半层缺失部位)3次投予。投予量设定为每1次1mL，投予的间隔设定为7日。

结果

第3次投予起12周后，观察软骨半层缺失部位，制作切片。对制作的切片，进行苏木精·伊红染色、甲苯胺蓝染色和藏红O染色、typeII胶原蛋白染色等各种染色，通过显微镜观察与上述3.同样地评价缺失部位的修复状态。

图23是将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的细胞投予液3次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图23中(a)表示软骨半层缺失部位的肉眼图像，图23中(b)表示图23中(a)的虚线包围的部分的苏木精·伊红染色图像，图23中(c)表示图23中(a)的虚线包围的部分的typeII胶原蛋白染色图像，图23中(d)表示图23中(a)的虚线包围的部分的藏红O染色图像。图23的状态下的ICRS评分为11，修正O’Driscoll的组织学评分为37。

图24是将含有MSC5×10⁶个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的细胞投予液3次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像。图24中(a)～(d)的说明与图23相同。图24中(e)表示图24中(a)的虚线包围的部分的甲苯胺蓝染色图像。图24的状态下的ICRS评分为3，修正O’Driscoll的组织学评分为21。

II.关节腔内的MSC的状态

1.未分化状态

确认在上述I的软骨再生实验中单次投予细胞投予液的关节腔内是否存在未分化状态的MSC。从投予含有MSC的细胞投予液的个体的关节腔采取MSC，在无血清培养基和有血清培养基中分别培养后，测定培养细胞的未分化标记物基因(nanog、sox2、oct3/4)表达和内源性控制基因(Gapdh)表达。结果由图26示出。图26是表示从投予细胞投予液的关节腔内采取的MSC中测定未分化标记物基因表达的结果的图，S表示无血清培养的结果，D表示有血清培养的结果，P表示传代数。

如图26所示，各培养细胞中发现各未分化标记物基因的表达，确认在投予细胞投予液的关节腔内存在未分化状态的MSC。

2.细胞因子的释放状态

确认上述I的软骨再生实验中在单次投予细胞投予液的关节腔内的细胞因子的释放状态。在投予细胞投予液的关节腔内，确认检测到CTACK、Eotaxin、bFGF、G-CSF、GRO-α、HGF、IFN-α2、IFN-γ、IL-1rα、IL-2、IL-2Rα、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-16、IL-18、IP-10、LIF、MCP-1(MCAF)、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、PDGF-BB、RANTES、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TRAIL和VEGF，在投予细胞投予液的关节腔内确认多个细胞因子被释放。

III.细胞保护剂的性能试验1

1.细胞培养

确认细胞的保存中的上述I.中使用的细胞保护剂(透明质酸)的性能。作为保存液，准备含有乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的溶液，含有乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的溶液，含有乳酸林格氏液500μL和透明质酸1％500μL(透明质酸浓度0.5％)的溶液。另外，准备乳酸林格氏液1mL和无血清培养基(STK2培养基)1mL作为对照。人滑膜组织来源MSC以成为5×10⁵个或5×10⁶个的方式分别注入各溶液，在保持37℃的二氧化碳培养箱内(空气95％和二氧化碳5％)或4℃的冷藏陈列柜中保存。测定37℃保存后到168小时为止的生存率，测定4℃保存后到5周为止的生存率。

2.结果

图27示出结果。图27中“HA”指“透明质酸”。在37℃的保存条件下，如图27中(a)所示，表明透明质酸浓度0.01％的溶液保持高于其他溶液的生存率。另外，在4℃的保存条件下，如图26中(b)和(c)所示，确认在透明质酸浓度0.01％的溶液、透明质酸浓度0.1％的溶液和乳酸林格氏液中具有能够保持1个月以上生存率60％的能力。

IV.细胞保护剂的性能试验2

1.细胞培养

上述III.表明细胞即便在37℃的温度条件下保存，使用细胞保护剂时24小时后的生存率为60％以上。因此，含有人滑膜组织来源MSC5×10⁵个、乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的溶液，含有乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的溶液以及乳酸林格氏液1mL这3种溶液中，进一步进行试验。

2.结果

由图28示出结果。利用Non-repeatedMeasuresANOVA进行统计分析，在P＜0.01具有显著差异的位置记载**。图28中“HA”指“透明质酸”。如图28所示，确认在37℃的保存条件下，含有乳酸林格氏液990μL和透明质酸1％10μL(透明质酸浓度0.01％)的溶液以及含有乳酸林格氏液900μL和透明质酸1％100μL(透明质酸浓度0.1％)的溶液，与乳酸林格氏液1mL相比显著具有细胞保护效果。

基于这一点，可知细胞保护剂在0.01％～0.1％的浓度下即便作为投予前的细胞保存液也具有细胞保护效果，尤其是在冷藏条件下能够长时间保管。另外，可知即使在认为细胞的代谢活性高的37℃的保存条件下24小时的生存率也高，因此，细胞运输或保存时置于高的温度条件下时的保护作用也高。

本发明能够提供使用了间充质干细胞的更安全且利用价值高的关节损伤治疗剂，因此，能够用于使用间充质干细胞的软骨组织的再生医疗。另外，本发明中发现通过细胞保护作用能够将细胞长时间保存，因此，本发明作为细胞保护剂等在再生医疗产业领域也能够应用。

Claims

1.一种软骨损伤治疗剂的制造方法，其特征在于，包含以下工序:

在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中使间充质干细胞增殖的增殖工序，

将所述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合的混合工序。

2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述混合工序中，以所述间充质干细胞成为1×10⁵个/mL～1×10⁸个/mL的方式混合。

3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于，所述混合工序中，以所述细胞保护剂的浓度成为大于0％且为0.5％以下的方式混合。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其特征在于，所述混合工序中，以所述细胞保护剂的浓度成为0.01％～0.1％的方式混合。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源于选自滑膜、脐带、脐带血、羊膜、骨髓和脂肪中的组织。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其特征在于，所述增殖工序中，以维持分化能力的状态使所述间充质干细胞增殖。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其特征在于，在所述增殖工序之前，进一步包含在含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基B中使间充质干细胞增殖的前增殖工序。

8.一种软骨损伤治疗剂，其特征在于，含有间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂，

所述间充质干细胞是在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中培养而得到的。

9.根据权利要求8所述的软骨损伤治疗剂，其特征在于，所述间充质干细胞的细胞数是1×10⁵个/mL～1×10⁸个/mL。

10.根据权利要求8或9所述的软骨损伤治疗剂，其特征在于，所述细胞保护剂的浓度大于0％且为0.5％以下。

11.根据权利要求8～10中任一项所述的软骨损伤治疗剂，其特征在于，所述细胞保护剂的浓度是0.01％～0.1％。

12.根据权利要求8～11中任一项所述的软骨损伤治疗剂，其特征在于，所述间充质干细胞维持分化能力。

13.根据权利要求8～12中任一项所述的软骨损伤治疗剂，其特征在于，被投予至软骨的一部分损伤的软骨损伤部位。

14.根据权利要求13所述的软骨损伤治疗剂，其特征在于，被多次投予至所述软骨损伤部位。

15.一种用于制造软骨损伤治疗剂的无血清的培养基用添加剂，其特征在于，含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸。

16.一种用于制造软骨损伤治疗剂的无血清的培养用培养基，其特征在于，含有权利要求15所述的培养基用添加剂。

17.一种用于制造软骨损伤治疗剂的培养方法，其特征在于，包含在权利要求16所述的培养用培养基中培养间充质干细胞的工序。

18.一种用于制造软骨损伤治疗剂的试剂盒，其特征在于，至少具有权利要求15所述的培养基用添加剂。