CN110177560A - 活体组织损伤的修复剂以及该修复剂的制造方法 - Google Patents

活体组织损伤的修复剂以及该修复剂的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明使用在无血清培养基中培养的间充质干细胞以提供用于修复活体组织损伤的修复剂以及该修复剂的制造方法。

Description

活体组织损伤的修复剂以及该修复剂的制造方法
技术领域
本发明涉及活体组织损伤的修复剂以及该修复剂的制造方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem cell，MSC)是一种不仅能从骨髓、脂肪、滑膜、牙槽骨及牙周膜等组织中分离，还能从胎盘、脐带血及脐带等各种组织中分离的细胞，而且是一种能在活体外培养增殖的细胞。进而，间充质干细胞具有不仅能分化成间充质细胞(如成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞)还能分化成非间充质细胞(如神经前体细胞及肝细胞)的多分化能力，因此期待将其作为用于再生医疗、细胞治疗的细胞的制造原料而使用。
作为间充质干细胞的培养方法，例如可列举出如下方法：除了使用含有胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)的培养基之外，还使用来源于异种动物的蛋白质的混入较少的无血清培养基。例如，在专利文献1～3中记载了用于培养间充质干细胞的无血清培养基。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2007/080919号(2007年7月19日公开)
专利文献2：国际公开第2011/111787号(2011年9月15日公开)
专利文献3：国际公开第2015/016357号(2015年2月5日公开)
发明内容
技术问题
间充质干细胞所具有的功能多种多样，目前所利用的间充质干细胞的功能只是其一部分，期待其未知功能大量存在。
本发明的一个形态是鉴于上述问题点而做出的，其目的在于提供用于修复活体组织损伤的修复剂以及该修复剂的制造方法。
技术方案
在关于间充质干细胞对活体组织损伤带来的影响进行锐意研究的过程中，本发明者们发现(1)与在血清培养基中培养的间充质干细胞相比，在含有特定成分的无血清培养基中培养的间充质干细胞具有显著较高的活体组织损伤修复效果(例如纤维化抑制效果、炎症细胞浸润抑制效果、巨噬细胞活性控制效果)；以及(2)与在血清培养基中培养的间充质干细胞相比，在无血清培养基中培养的间充质干细胞表达出更高量的TSG-6，并完成了本发明。
为了解决上述问题，本发明的活体组织损伤的修复剂的特征在于，含有在无血清培养基中培养的间充质干细胞。
为了解决上述问题，本发明的活体组织损伤的修复剂的制造方法的特征在于，具有在无血清培养基中培养间充质干细胞的工序。
本发明的活体组织损伤的修复剂含有TSG-6(TNF-stimulated gene 6protein)，该修复剂的特征在于，上述活体组织损伤是伴随着慢性肾功能衰竭、慢性肾脏病、肝硬化、肺纤维症、烫伤、间质性肺炎、药剂性肺炎、放射性肺炎、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、软骨损伤、骨缺损、脊髓损伤、牙周病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病、糖尿病、动脉硬化、心肌梗塞、中风、阿尔茨海默病、黄斑变性、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、颚骨重建、腭裂、骨替代材料、骨缺损、骨系统疾病、干眼症、角膜疾病、咽炎、关节炎、癌症或者纤维症的组织损伤。
另外，通过“在无血清培养基中培养”等制造工序来确定构成本发明的活体组织损伤的修复剂的间充质干细胞。本发明者们就如下情况进行了试验：在本发明中使用的间充质干细胞与以往的间充质干细胞(具体为在血清培养基中培养的间充质干细胞)之间是否存在表达量不同的基因(换言之为基因标记物)。其结果，很明显很多种类的基因的表达量不同，但只有TSG-6能够对这些基因中哪个基因在本发明中使用的间充质干细胞与以往的间充质干细胞的区分上是重要的这一情况进行确定。为了对哪个基因在本发明中使用的间充质干细胞与以往的间充质干细胞的区分上是重要的这一情况进行确定，需要更为巨大的时间和劳力。因此，在提交申请时得出如下结论：根据结构或特性不能直接确定本发明的活体组织损伤的修复剂中的间充质干细胞，或者存在不实际的情况。
有益效果
与在血清培养基中培养的间充质干细胞相比，本发明中使用的间充质干细胞具有显著较高的组织纤维化抑制效果、炎症细胞浸润抑制效果以及使炎症抑制系统的巨噬细胞增加的效果。另外，本发明中使用的间充质干细胞高表达TSG-6，从而具有使炎症在早期稳定化的效果。因此，本发明起到了当使用在血清培养基中培养的间充质干细胞时无法实现的、显著较高的(换言之，高达在临床现场可利用的程度的)活体组织损伤恢复效果。
附图的简要说明
图1是表示TGF-β1的mRNA表达水平的图表。
图2(A)是表示通过蛋白质印迹法对TGF-β1进行检测的检测结果的图像，图2(B)是表示TGF-β1的蛋白质表达水平的图表。
图3是本发明的一个实施例中的荧光免疫染色结果的图像。
图4是表示α-SMA的mRNA表达水平的图表。
图5(A)是表示通过蛋白质印迹法对α-SMA进行检测的检测结果的图像，图5(B)是表示α-SMA的蛋白质表达水平的图表。
图6(A)是本发明的一个实施例中的免疫染色结果的图像，图6(B)是表示对图6(A)所示的图像的每单位面积的α-SMA阳性细胞的数量进行计数得到的结果的图表。
图7(A)是表示CD3的mRNA表达水平的图表，图7(B)是表示CD68的mRNA表达水平的图表。
图8是表示本发明的一个实施例中的免疫染色结果的图像。
图9(A)是表示对图8所示的图像的每单位面积的CD3阳性细胞的数量进行计数得到的结果的图表，图9(B)是表示对图8所示的图像的每单位面积的CD68阳性细胞的数量进行计数得到的结果的图表。
图10是表示从M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的分化诱导的图。
图11(A)是表示CD163阳性细胞的增加的图表，图11(B)是表示CD206阳性细胞的增加的图表。
图12(A)是表示CD163阳性细胞的增加的图表，图12(B)是表示CD206阳性细胞的增加的图表。
图13是表示HGF的蛋白质表达水平的图表。
图14是表示PGE2的蛋白质表达水平的图表。
图15是表示IL-6的mRNA表达水平的图表。
图16是表示TSG-6的mRNA表达水平的图表。
图17是表示TSG-6的mRNA表达水平的图表。
图18是表示CD163阳性细胞的增加的图表。
图19(A)是表示MCP-1的mRNA表达水平的图表，图19(B)是表示TNF-α的mRNA表达水平的图表。
图20是表示TSG-6的mRNA表达水平的图表。
图21(A)是表示通过蛋白质印迹法对TGF-β1及α-SMA进行检测的检测结果的图像，图21(B)是表示TGF-β及α-SMA的表达水平的图表。
图22(A)是CD68的免疫染色结果的图像，图22(B)是表示表达CD68的细胞的数量的图表。
图23是表示本发明的一个实施例中的模型大鼠的体重的推移的图表。
图24是表示本发明的一个实施例中的模型大鼠的LDH的值的图表。
图25是表示本发明的一个实施例中的模型大鼠的γ-GTP的值的图表。
图26表示本发明的一个实施例中的模型大鼠的天狼星红染色的图像。
具体实施方式
以下，关于本发明的实施方式详细地进行说明。但是，本发明并不限定于此，在权利要求所示的范围内能进行各种变更，对不同的实施方式及实施例中分别公开的技术方案适当地进行组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。此外，在本说明书中，只要没有特别说明，则表示数值范围的“A～B”是指“A以上且B以下”。
[1-1.修复剂的制造方法]
本发明的一个实施方式所涉及的活体组织损伤的修复剂的制造方法(以下也称为“本实施方式的制造方法”)是具有在无血清培养基中培养间充质干细胞的工序的方法。
上述无血清培养基的组成没有特别限定，只要是能进行间充质干细胞的培养的无血清培养基即可，可适当地使用公知的无血清培养基。作为公知的无血清培养基，例如可使用：STK1(智再如股份有限公司制造)、STK2(智再如股份有限公司制造)、人间充质干细胞专用完全合成培养基试剂盒(MSCGM-CD Bullet Kit)(Lonza)、间充质干细胞增殖培养基DXF：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF(Ready-touse)(Promo Cell GmbH.)、StemPro MSC SFM Xeno free(Thermo Fisher Scientific.)以及MesenCult-ACF Medium Kit(STEMCELL Technologies Inc.)等。
作为上述无血清培养基的具体组成，例如可举出：(i)含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基；(ii)含有FGF、PDGF、EGF、TGF-β(Transforming growth factor-β、转化生长因子-β)、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基；(iii)含有FGF、PDGF、EGF、地塞米松、胰岛素、血清蛋白、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基；(iv)含有FGF、PDGF、EGF、TGF-β、地塞米松、胰岛素、血清蛋白、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基。
另外，上述(i)和(iii)的无血清培养基也可以不含TGF-β和/或HGF。另外，上述(ii)和(iv)的无血清培养基也可以不含HGF。
作为上述磷脂，没有特别限定，例如可举出：磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰甘油等，这些磷脂可以单独使用，也可以组合(例如组合磷脂酸和磷脂酰胆碱)使用。这些磷脂可以来源于动物，也可以来源于植物。
作为上述脂肪酸，没有特别限定，例如可举出：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕榈油酸、棕榈酸及硬脂酸等，这些脂肪酸可以单独使用，也可以组合使用。
本实施方式中使用的无血清培养基也可以任意地含有上述组成以外的成分(例如胆固醇和/或HGF(hepatocyte growth factor、肝细胞生长因子)等)。作为HGF相对于后述的基础培养基的含有量，以终浓度计优选为0.1～50ng/ml，进一步优选为5ng/ml。当然，这些成分对于本发明申请来说并非必须成分。
以下，关于本实施方式的制造方法更具体地进行说明。
(A.第一工序)
在本实施方式的制造方法中，在含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基中培养间充质干细胞，进一步优选在还含有地塞米松、胰岛素和血清蛋白中的至少任一种的无血清培养基中培养间充质干细胞(以下称为第一工序)。此外，无血清培养基也可以不含TGF-β和/或HGF。
另外，只要无血清培养基含有地塞米松、胰岛素和血清蛋白中的至少任一种，就起到了延长间充质干细胞的生存期间和促进间充质干细胞的增殖的效果。
用于构成第一工序中使用的无血清培养基的基础培养基没有特别限定，只要是该领域中周知的动物细胞用培养基即可，作为优选的基础培养基，例如可举出：Ham's F12培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基、MCDB培养基等。这些基础培养基可以单独使用，也可以混合多种使用。在一个实施方式中，作为用于构成无血清培养基的基础培养基，优选将MCDB和DMEM以1：1的比率混合而成的培养基。在一个实施方式中，将在上述基础培养基中添加FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸得到的无血清培养基用于第一工序即可。
作为FGF相对于基础培养基的含有量，以终浓度计优选为0.1～100ng/ml，进一步优选为3ng/ml。作为PDGF相对于基础培养基的含有量，以终浓度计优选为0.5～100ng/ml，进一步优选为10ng/ml。作为EGF相对于基础培养基的含有量，以终浓度计优选为0.5～200ng/ml，进一步优选为20ng/ml。作为磷脂相对于基础培养基的总含有量，以终浓度计优选为0.1～30μg/ml，进一步优选为10μg/ml。作为脂肪酸相对于基础培养基的总含有量，优选为基础培养基的重量的1/1000～1/10，进一步优选为1/100。
作为地塞米松相对于基础培养基的含有量，以终浓度计优选为10-10～10-5M，进一步优选为10-9～10-6M。作为胰岛素相对于基础培养基的含有量，以终浓度计优选为0.01～500μg/ml，进一步优选为0.1～50μg/ml。作为血清蛋白相对于基础培养基的含有量，以终浓度计优选为0.01～50mg/ml，进一步优选为0.1～5mg/ml。
通过使用这样的无血清培养基，能够防止异种蛋白质混入无血清培养基中，同时能够获得与含血清培养基同等或更大的增殖促进效果，能够使间充质干细胞以希望的那样增殖。
作为无血清培养基所含有的磷脂和脂肪酸，可以为已经说明过的具体的磷脂和脂肪酸。
在用于本说明书中的情况下，FGF是指从成纤维细胞生长因子(FGF：Fibroblastgrowth factor)家族中选择的生长因子，优选为FGF2(bFGF)，但也可以从FGF-1等其它FGF家族中选择。另外，在用于本说明书中的情况下，PDGF是指从血小板衍生生长因子(PDGF：platelet derived growth factor)家族中选择的生长因子，优选为PDGF-BB或PDGF-AB。
EGF是指从表皮生长因子(EGF：epidermal growth factor)家族中选择的生长因子。
另外，在一个实施方式中，无血清培养基还可以含有从结缔组织生长因子(CTGF:connective tissue growth factor)、血管内皮生长因子(VEGF:vascular endothelialgrowth factor)及抗坏血酸化合物组成的组中选择的至少2种因子。
在用于本说明书中的情况下，抗坏血酸化合物是指抗坏血酸(维生素C)或抗坏血酸2磷酸或者与它们类似的化合物。
在一个方面，无血清培养基优选含有脂质抗氧化剂。在一个实施方式中，无血清培养基中含有的脂质抗氧化剂可以是DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E)。无血清培养基还可以含有表面活性剂。在一个实施方式中，无血清培养基中含有的表面活性剂可以是普卢兰尼克F-68或吐温80。
无血清培养基还可以含有胰岛素、运铁蛋白、地塞米松、血清蛋白及硒酸盐。在用于本说明书中的情况下，胰岛素可以是胰岛素样生长因子，可以来源于天然细胞，也可以通过基因重组而制造。
在第一工序中，在上述无血清培养基中播种通过以往公知的方法从人等动物组织中分离的间充质干细胞，并进行培养直到增殖为希望的细胞数(当然，在第一工序中，也可以不使间充质干细胞增殖而仅维持在无血清培养基中)。作为培养条件，优选相对于1ml培养基播种从1～500mg组织片(包括间充质干细胞)中分离的间充质干细胞，培养温度优选为37℃±1℃，而且优选在5％CO2下。此外，培养时间没有特别限定，只要是间充质干细胞达到目标浓度的培养时间即可。例如，培养时间可以是1小时～5小时、1小时～10小时、1小时～20小时、1小时～1天、1小时～10天、1小时～30天、1小时～50天、1小时～60小时、1小时～70小时、30小时～70小时、40小时～70小时、50小时～70小时。
关于提供给第一工序的间充质干细胞而言，没有特别限制，但优选初期的间充质干细胞，即从人等动物组织提取之后未经一次继代培养的细胞。
另外，为了在第一工序中使间充质干细胞更加有效地增殖，优选针对在第一工序中成为培养对象的每种间充质干细胞(以下也称为“第一工序对象细胞”)，使用适于培养的培养容器来进行第一工序。作为适于培养第一工序对象细胞的培养容器的选择方法，例如可举出使第一工序对象细胞选择最优的培养容器的方法。具体进行说明，准备多种培养容器，除了培养容器的种类不同之外在相同的培养条件下使第一工序对象细胞增殖，通过公知的方法测量自培养开始2周后的细胞数，可以从细胞数多的容器开始按顺序判断为适于培养第一工序对象细胞的培养容器。另外，在上述第一工序对象细胞的增值速度较快的情况下，即使在自培养开始经过2周之前，也可以从达到融合状态的80～90％的细胞数的时间短的容器开始按顺序判断为适于培养第一工序对象细胞的培养容器。
在本实施方式的制造方法的第一工序中，在适于第一工序对象细胞增殖的培养容器已经清楚的情况下，使用该培养容器即可。与此相对，在适于培养第一工序对象细胞的培养容器不清楚等情况下，本实施方式的制造方法也可以在第一工序之前还包括“培养容器选择工序”，该工序用于选择适于培养第一工序对象细胞的培养容器。
另外，就间充质干细胞的增殖而言，细胞粘附于培养容器是必须条件，因此在间充质干细胞对培养容器的粘附较弱的情况下，优选在第一工序中，上述无血清培养基还含有细胞粘附分子。作为上述“细胞粘附分子”，例如可举出：纤连蛋白、骨胶原、明胶等。这些细胞粘附分子可以单独使用一种，也可以组合使用多种。
另外，在第一工序中，可以将间充质干细胞至少继代一次。由于间充质干细胞定着依赖性地进行增殖，因此在间充质干细胞局部不均地进行增殖等情况下，通过在所述第一工序的中途将间充质干细胞进行继代，能够改善培养条件。此外，优选在从初次培养(P0)～第3次继代(P3)为止的期间进行培养第一工序。
作为间充质干细胞的继代方法，没有特别限定，可以使用以往公知的间充质干细胞的继代方法进行继代。由于继代后的间充质干细胞的状态良好，因此优选在上述第一工序中，在进行继代的情况下，使用不含来源于哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂来剥离上述间充质干细胞。作为上述“不含来源于哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂”，例如可举出ACCUTASE(Innovative Cell Technologies,Inc.)。
这里，关于使用ACCUTASE作为上述“不含来源于哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂”时的继代方法的一例进行说明。按照(i)～(vi)的顺序对间充质干细胞进行剥离、继代。此外，关于在以下说明的继代方法中使用T-25烧瓶(Falcon制造)作为培养容器的情况进行说明。
(i)使用5Ml的PBS(-)来清洗烧瓶上的细胞层。
(ii)对细胞层添加2mL的ACCUTASE。
(iii)在室温下将细胞层静置2分钟左右，对细胞自烧瓶剥离这一情况进行确认，然后将含有剥离后的细胞的PBS(-)移动至离心管。
(iv)将7mL的PBS(-)添加至烧瓶，并冲洗该烧瓶的底面。
(v)将上述(iv)的溶液移动至上述(iii)的离心管中，并以1500rpm(200～1000×g)离心5分钟。
(vi)从离心管中除去上清液，并以5,000个-细胞/cm2的播种浓度使用无血清培养基将细胞播种到新的烧瓶上。
(B.第二工序)
本实施方式的制造方法在上述第一工序之后还可以具有第二工序，该第二工序在含有FGF、PDGF、TGF-β、EGF、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基中培养间充质干细胞，进一步优选在还含有地塞米松、胰岛素和血清蛋白中的至少任一种的无血清培养基中培养间充质干细胞。此外，无血清培养基也可以不含HGF。
这里，第二工序中的“无血清培养基”在含有TGF-β这一点上与在第一工序项中说明的无血清培养基不同。在本说明书中，有时候将第一工序使用的无血清培养基称为“无血清培养基A”，将第二工序使用的无血清培养基称为“无血清培养基B”。关于TGF-β以外的成分(FGF、PDGF、EGF、地塞米松、胰岛素、血清蛋白、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸等)及基础培养基，与在上述第一工序项中关于无血清培养基A说明的情况相同，因此这里省略说明。另外，第二工序中使用的无血清培养基B中含有的上述成分的含有量可以与关于无血清培养基A说明的含有量相同。
在一个实施方式中，作为TGF-β相对于上述基础培养基的含有量，以终浓度计优选为0.5～100ng/ml，进一步优选为10ng/ml。
在第二工序中，在上述无血清培养基B中播种通过第一工序得到的间充质干细胞，并进行培养直到增殖为希望的数量(当然，在第二工序中，也可以不使间充质干细胞增殖而仅维持在无血清培养基B中)。作为培养条件，优选相对于1ml培养基播种1～2×104个间充质干细胞，培养温度优选为37℃±1℃，而且优选在5％CO2下。此外，细胞培养时间没有特别限定，只要是能充分得到目标细胞浓度的培养时间即可。例如，培养时间可以是1小时～5小时、1小时～10小时、1小时～20小时、1小时～1天、1小时～10天、1小时～30天、1小时～50天、1小时～60小时、1小时～70小时、30小时～70小时、40小时～70小时、50小时～70小时。通过这样进行培养，能够有效且大量获得维持或提高了活体组织损伤的恢复能力的间充质干细胞。
在第二工序中，用于培养的培养容器没有特别限定，只要是间充质干细胞能增殖的容器即可。例如，可适当地使用Falcon制造的75cm2烧瓶、住友电木有限公司制造的75cm2烧瓶等。但是，根据细胞的不同，有时候细胞的培养会因所使用的培养容器的种类而受到影响。因此，为了更加高效地培养间充质干细胞，优选针对每种成为培养对象的间充质干细胞(以下也称为“培养对象细胞”)，使用适于培养的培养容器来进行第二工序。作为适于第二工序对象细胞增殖的培养容器的选择方法，与上述”第一工序”项中说明的情况相同，因此这里省略说明。
另外，在间充质干细胞对培养容器的粘附较弱的情况下，上述无血清培养基B还可以含有细胞粘附分子。关于上述细胞粘附分子，与上述”第一工序”项中说明的情况相同，因此这里省略说明。
在第二工序中，可以将间充质干细胞至少继代一次。通过在第二工序的中途将间充质干细胞进行继代，能够改善培养条件。
另外，优选对第二工序提供从人等动物组织提取之后至少经第1次继代(P1)的间充质干细胞。
关于在第一工序的中途将间充质干细胞进行继代的方法以及对第二工序提供第一工序后的细胞时的继代方法，与上述”第一工序”项中说明的情况相同，因此这里省略说明。
本实施方式的制造方法还可以在上述第二工序之前(或上述第一工序之前)包括培养容器选择工序，该工序用于选择适于间充质干细胞增殖的培养容器。作为适于间充质干细胞增殖的培养容器的选择方法，与上述”第一工序”项中说明的情况相同，因此这里省略说明。
如上所述，本实施方式的制造方法可以包括第一工序及第二工序，但本发明并不限定于此。例如，本实施方式的制造方法也可以是只包括第一工序及第二工序中的第一工序的方法，还可以是只包括第一工序及第二工序中的第二工序的方法。
(C.筛选工序)
本实施方式的制造方法还可以在第一工序和/或第二工序之后包括筛选工序，该工序用于从间充质干细胞中筛选不具致瘤性的间充质干细胞。
通过将在筛选工序中选出的间充质干细胞作为修复剂使用，从而能够实现含有不具致瘤性的间充质干细胞的修复剂，能够提高修复剂的安全性。
在筛选工序中，能够通过致瘤性试验法来研究间充质干细胞的致瘤性，该致瘤性试验法利用了活体内高灵敏度免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)。
具体而言，分别将在上述无血清培养基中培养的间充质干细胞(例如1,000,000个)及Hela细胞(例如1,000个)移植到NOG小鼠的皮下10处。此时，在能确认Hela细胞的致瘤性(具体为在移植处产生肿瘤)的条件下(例如特定的小鼠饲养时间等)，若未确认到在无血清培养基中培养的间充质干细胞的致瘤性，则能判定该间充质干细胞是不具致瘤性的间充质干细胞。
[1-2.活体组织损伤的修复剂]
本发明的一个实施方式所涉及的活体组织损伤的修复剂(以下称为“本实施方式的修复剂”)的特征在于，含有在无血清培养基中培养的间充质干细胞。
这里，本实施方式的修复剂是指具有促进活体组织损伤恢复的效果的药剂。就本实施方式的修复剂而言，可以说是用于抑制活体组织纤维化的药剂(换言之是纤维化抑制剂)，也可以说是用于抑制炎症细胞浸润的药剂(换言之是炎症细胞浸润抑制剂)，还可以说是用于控制巨噬细胞的活性的药剂(换言之是巨噬细胞活性控制剂)。
这里，“抑制活体组织纤维化”是指抑制结缔组织异常增殖或结缔组织中的骨胶原异常蓄积导致的组织硬化。例如，若活体组织受到损伤，则在治愈的过程中，有时候构成活体组织的结缔组织会异常增殖。“抑制活体组织纤维化”是指对于例如在活体组织受到损伤之后构成活体组织的结缔组织异常增殖或结缔组织中的骨胶原异常蓄积导致的组织硬化进行抑制。
这里，“抑制炎症细胞浸润”是指对于炎症细胞(例如巨噬细胞、淋巴细胞和嗜中性白细胞)破坏组织或侵入组织中进而增殖这种情况进行抑制。
这里，“控制巨噬细胞的活性”是指使巨噬细胞的表型改变。“控制巨噬细胞的活性”是指：例如使巨噬细胞从促进组织的炎症的促炎表型(M1型)巨噬细胞改变为抗炎表型(M2型)巨噬细胞。通过使巨噬细胞从M1型改变为M2型，能够使组织的炎症镇静化。
另外，上述修复剂中含有在无血清培养基中培养的间充质干细胞。而且，在本说明书中，“无血清培养基”是指不含血清的培养基，换言之，是指不添加任何血清调制而成的培养基。另外，“无血清培养”是指使用无血清培养基进行的培养。此外，在培养间充质干细胞时，可以仅在单一的无血清培养基中培养间充质干细胞，也可以在多个无血清培养基中培养间充质干细胞。当在多个无血清培养基中培养间充质干细胞时，例如可以在希望的无血清培养基中培养间充质干细胞，然后将该希望的无血清培养基替换为其它无血清培养基，进而在该其它无血清培养基中培养间充质干细胞。
上述无血清培养基的组成没有特别限定，只要是能进行间充质干细胞的培养的无血清培养基即可，可适当地使用公知的无血清培养基。作为公知的无血清培养基，例如可使用：STK1(智再如股份有限公司制造)、STK2(智再如股份有限公司制造)、人间充质干细胞专用完全合成培养基试剂盒(MSCGM-CD Bullet Kit)(Lonza)、间充质干细胞增殖培养基DXF：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF(Ready-touse)(Promo Cell GmbH.)、StemPro MSC SFM Xeno free(Thermo Fisher Scientific Inc.)以及MesenCult-ACF MediumKit(STEMCELL Technologies Inc.)等。
作为上述无血清培养基的具体组成，例如可举出：(i)含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基；(ii)含有FGF、PDGF、EGF、TGF-β、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基；(iii)含有FGF、PDGF、EGF、地塞米松、胰岛素、血清蛋白、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基；(iv)含有FGF、PDGF、EGF、TGF-β、地塞米松、胰岛素、血清蛋白、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基。
作为上述磷脂，没有特别限定，例如可举出：磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰甘油等，这些磷脂可以单独使用，也可以组合(例如组合磷脂酸和磷脂酰胆碱)使用。这些磷脂可以来源于动物，也可以来源于植物。
作为上述脂肪酸，没有特别限定，例如可举出：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕榈油酸、棕榈酸及硬脂酸等，这些脂肪酸可以单独使用，也可以组合使用。
本实施方式中使用的无血清培养基也可以任意地含有上述组成以外的成分(例如胆固醇、HGF等)。当然，这些成分对于本发明申请来说并非必须成分。
本实施方式中使用的无血清培养基中的各种组成的浓度与上述[1-1]项中说明的情况相同，这里省略其说明。
本实施方式的修复剂中使用的间充质干细胞不仅包括从骨髓、脂肪、滑膜、牙槽骨及牙周膜等组织中分离的间充质干细胞，还包括从胎盘、脐带血及脐带等组织中分离的间充质干细胞。另外，本实施方式的修复剂中使用的间充质干细胞可以是人间充质干细胞(例如提取到的人间充质干细胞)，也可以是来源于大鼠、小鼠等非人动物的间充质干细胞。
成为上述修复剂的治疗对象的活体组织没有特别限定，例如可举出：肾藏、肝藏、肺、皮肤、软骨、骨、脊髓、牙齿、关节、血管(动脉和静脉)、心脏、脑、下巴、口腔、眼睛、角膜以及咽。也就是说，上述修复剂可以用于修复这些活体组织的损伤。
作为上述修复剂能起到功效的、伴有活体组织损伤的疾病，没有特别限定。作为疾病，例如可举出：慢性肾功能衰竭、慢性肾脏病、肝硬化、肺纤维症、烫伤、间质性肺炎、药剂性肺炎、放射性肺炎、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、软骨损伤、骨缺损、脊髓损伤、牙周病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病、糖尿病、动脉硬化、心肌梗塞、中风、阿尔茨海默病、黄斑变性、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、颚骨重建、腭裂、骨替代材料、骨缺损、骨系统疾病、干眼症、角膜疾病、咽炎、关节炎、癌症或者纤维症等。
本实施方式的修复剂可以是由在无血清培养基中培养的间充质干细胞构成的药剂，但是除了在无血清培养基中培养的间充质干细胞之外，还可以含有药学上可接受的添加剂(例如缓冲剂、抗氧化剂、增稠剂及赋形剂)。
上述添加剂的量没有特别限定，例如可以是本实施方式的修复剂的0.01～50重量％、0.01～40重量％、0.01～30重量％、0.01～20重量％、0.01～10重量％或0.01～1重量％。
本实施方式的修复剂中含有的间充质干细胞的数量没有特别限定，可根据施用对象的体重适当地进行设定。例如，可以是每服(1次施用)1×102细胞～1×1010细胞、1×103细胞～1×1010细胞、1×104细胞～1×1010细胞、1×105细胞～1×1010细胞、1×106细胞～1×1010细胞。当然，也可以是每服(施用)1010细胞以上。
作为上述修复剂的施用方法，例如可举出：静脉注射、动脉注射及局部(脊髓(例如脊髓腔)、肌肉、关节、脑等)注射。这些施用方法中，只要是使用导管对局部附近的动脉施用的施用方法，则起到了能减少施用所必需的细胞数的有利效果。
本发明的一个实施方式所涉及的活体组织损伤的修复剂的施用对象没有特别限定。作为上述施用对象，可举出人以及人以外的哺乳类(牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、小鼠、大鼠等)。
本实施方式的修复剂的施用量没有特别限定，可以是针对施用对象每1kg体重施用的间充质干细胞的数量成为1×102细胞～1×1010细胞、1×103细胞～1×1010细胞、1×104细胞～1×1010细胞、1×105细胞～1×1010细胞、1×106细胞～1×1010细胞的量。
[1-3.活体组织损伤的修复剂-2]
本发实施方式的修复剂的特征在于，含有TNF-stimulated gene 6protein(TSG-6)作为有效成分。
本发明者发现：与在血清培养基中培养的间充质干细胞相比，在无血清培养基中培养的间充质干细胞表达出更高量的TSG-6。进而，本发明者新发现：TSG-6在各种疾病(特别是肾脏中的疾病)中具有抗炎症作用。根据本实施方式的修复剂，例如(i)能够从早期开始抑制炎症细胞浸润；(ii)能够使炎症在早期稳定化；和/或(iii)能够抑制活体组织纤维化。
本实施方式的修复剂优选含有来源于在无血清培养基中培养的间充质干细胞的TSG-6(更具体地，含有在无血清培养基中培养的间充质干细胞本身)。此外，关于含有来源于间充质干细胞的TSG-6的修复剂的详细说明，与在[1-2.活体组织损伤的修复剂]中说明的情况相同，因此这里省略说明。
本实施方式的修复剂是指具有促进活体组织损伤恢复的效果的药剂。就本实施方式的修复剂而言，可以是用于抑制活体组织纤维化的药剂(换言之是纤维化抑制剂)，也可以是用于抑制炎症细胞浸润的药剂(换言之是炎症细胞浸润抑制剂)。
这里，关于“抑制活体组织纤维化”以及“抑制炎症细胞浸润”，与在[1-2.活体组织损伤的修复剂]中说明的情况相同，因此这里省略说明。
本实施方式的修复剂可含有在无血清培养基中培养的间充质干细胞。关于无血清培养基的组成及浓度、间充质干细胞的种类等，与在[1-2.活体组织损伤的修复剂]中说明的情况相同，因此这里省略说明。
成为上述修复剂的治疗对象的活体组织没有特别限定，例如可举出：肾藏、肝藏、肺、皮肤、软骨、骨、脊髓、牙齿、关节、血管(动脉和静脉)、心脏、脑、下巴、口腔、眼睛、角膜以及咽。也就是说，上述修复剂可以用于修复这些活体组织的损伤。
作为上述修复剂能起到功效的、伴有活体组织损伤的疾病，没有特别限定。作为疾病，例如可举出：慢性肾功能衰竭、慢性肾脏病、肝硬化、肺纤维症、烫伤、间质性肺炎、药剂性肺炎、放射性肺炎、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、软骨损伤、骨缺损、脊髓损伤、牙周病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病、糖尿病、动脉硬化、心肌梗塞、中风、阿尔茨海默病、黄斑变性、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、颚骨重建、腭裂、骨替代材料、骨缺损、骨系统疾病、干眼症、角膜疾病、咽炎、关节炎、癌症或者纤维症等。
本实施方式的修复剂可以是由TSG-6(或高表达TSG-6的在无血清培养基中培养的间充质干细胞)构成的药剂，但是除了TSG-6(或高表达TSG-6的在无血清培养基中培养的间充质干细胞)之外，还可以含有药学上可接受的添加剂(例如缓冲剂、抗氧化剂、增稠剂及赋形剂)。
本实施方式的修复剂中含有的添加剂的量没有特别限定，例如在将修复剂设为100重量％时，本实施方式的修复剂中含有的添加剂的量可以是0重量％～99.999重量％、0重量％～99.99重量％、0重量％～99.9重量％、5重量％～99.9重量％、10重量％～99.9重量％、20重量％～99.9重量％、30重量％～99.9重量％、40重量％～99.9重量％、50重量％～99.9重量％、60重量％～99.9重量％、70重量％～99.9重量％、80重量％～99.9重量％、90重量％～99.9重量％。
作为上述修复剂的施用方法，例如可举出：静脉注射、动脉注射及局部(脊髓(例如脊髓腔)、肌肉、关节、脑等)注射。这些施用方法中，只要是使用导管对局部附近的动脉施用的施用方法，则起到了能减少施用所必需的细胞数的有利效果。
本实施方式所涉及的活体组织损伤的修复剂的施用对象没有特别限定。作为上述施用对象，可举出人以及人以外的哺乳类(牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、小鼠、大鼠等)。
TSG-6可以是天然蛋白质，也可以是合成蛋白质，还可以是重组蛋白质。
本实施方式的修复剂中含有的TSG-6的量没有特别限定，例如在将修复剂设为100重量％时，本实施方式的修复剂中含有的TSG-6的量可以是0.001重量％～100重量％、0.01重量％～100重量％、0.1重量％～100重量％、0.1重量％～95重量％、0.1重量％～90重量％、0.1重量％～80重量％、0.1重量％～70重量％、0.1重量％～60重量％、0.1重量％～50重量％、0.1重量％～40重量％、0.1重量％～30重量％、0.1重量％～20重量％、0.1重量％～10重量％。
本发明也能以如下方式构成。
本发明的活体组织损伤的修复剂的特征在于，含有在无血清培养基中培养的间充质干细胞。
本发明的修复剂优选为用于抑制活体组织纤维化的修复剂。
本发明的修复剂优选为用于抑制炎症细胞浸润的修复剂。
本发明的修复剂优选为用于控制巨噬细胞的活性的修复剂。
在本发明的修复剂中，上述无血清培养基优选含有FGF(fibroblast growthfactor、成纤维细胞生长因子)、PDGF(platelet-derived growth factor、血小板衍生生长因子)、EGF(epidermal growth factor、表皮生长因子)、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸。
在本发明的修复剂中，上述活体组织损伤优选为：伴随着慢性肾功能衰竭、慢性肾脏病、肝硬化、肺纤维症、烫伤、间质性肺炎、药剂性肺炎、放射性肺炎、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)、软骨损伤、骨缺损、脊髓损伤、牙周病、多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematodes,SLE)、克罗恩病、糖尿病、动脉硬化、心肌梗塞、中风、阿尔茨海默病、黄斑变性、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、颚骨重建、腭裂、骨替代材料、骨缺损、骨系统疾病、干眼症、角膜疾病、咽炎、关节炎、癌症或者纤维症的组织损伤。
在本发明的修复剂中，上述间充质干细胞优选为经筛选的不具致瘤性的间充质干细胞。
在本发明的修复剂中，上述间充质干细胞优选至少继代一次。
在本发明的修复剂中，优选在上述继代中使用不含来源于哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂来剥离上述间充质干细胞。
在本发明的修复剂中，优选使用适于培养上述间充质干细胞的培养容器来培养该间充质干细胞。
本发明的活体组织损伤的修复剂的制造方法的特征在于，具有在无血清培养基中培养间充质干细胞的工序。
在本发明的活体组织损伤的修复剂的制造方法中，上述无血清培养基优选含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸。
在本发明的活体组织损伤的修复剂的制造方法中，优选在上述培养工序之后具有筛选不具致瘤性的间充质干细胞的工序。
在本发明的活体组织损伤的修复剂的制造方法中，优选在上述培养工序中将间充质干细胞至少继代一次。
在本发明的活体组织损伤的修复剂的制造方法中，优选在上述继代中使用不含来源于哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂来剥离上述间充质干细胞。
在本发明的活体组织损伤的修复剂的制造方法中，优选在上述培养工序中使用适于培养上述间充质干细胞的培养容器来培养该间充质干细胞。
本发明的活体组织损伤的修复剂含有TSG-6(TNF-stimulated gene 6protein)，该修复剂的特征在于，上述活体组织损伤是伴随着慢性肾功能衰竭、慢性肾脏病、肝硬化、肺纤维症、烫伤、间质性肺炎、药剂性肺炎、放射性肺炎、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、软骨损伤、骨缺损、脊髓损伤、牙周病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病、糖尿病、动脉硬化、心肌梗塞、中风、阿尔茨海默病、黄斑变性、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、颚骨重建、腭裂、骨替代材料、骨缺损、骨系统疾病、干眼症、角膜疾病、咽炎、关节炎、癌症或者纤维症的组织损伤。
本发明的活体组织损伤的修复剂优选为用于抑制活体组织纤维化的修复剂。
本发明的活体组织损伤的修复剂优选为用于抑制炎症细胞浸润的修复剂。
实施例
(实施例1)
关于在无血清培养基中培养的间充质干细胞的移植所带来的肾脏纤维化抑制效果进行研究。
按照周知的方法(例如参见Ueno et al."Mesenchmal stem cells ameliorateexperimental peritoneal fibrosis by suppressing inflammation and inhibitingTGF-βsignaling"，国际肾脏病学会,2013,p1-11)，从Sprague Dawley大鼠(6～7周龄)的大腿骨或胫骨中分离出间充质干细胞。
在37℃、5％CO2的条件下，将分离出的间充质干细胞在无血清培养基STK1(对应于智再如股份有限公司制造的“含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基”)或者含10％牛血清的DMEM培养基(西格玛奥德里奇公司制造)中初代培养7天。
然后，在37℃、5％CO2的条件下，将在无血清培养基STK1中初代培养的间充质干细胞在无血清培养基STK2(对应于智再如股份有限公司制造的“含有FGF、PDGF、EGF、TGF-β、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸的无血清培养基”)中培养12天，将在含10％牛血清的DMEM培养基中初代培养的间充质干细胞在含10％牛血清的DMEM培养基中培养12天。此外，在继代中使用了ACCUTASE。
接着，制作一般的大鼠单侧输尿管结扎模型来作为肾脏纤维化模型。制作方法是通过公知的方法进行的(例如，Masaki et al.,"Activation of the ERK pathwayprecedes tubular proliferation in the obstructed rat kidney",KidneyInternational,Vol.63(2003),p1256-1264)。
从输尿管结扎日起4天后，分别将用STK2培养的间充质干细胞或者用含10％牛血清的DMEM培养基培养的间充质干细胞对单侧输尿管结扎模型大鼠的尾静脉施用5×106个。此时，作为对照，以与上述相同的方式对单侧输尿管结扎模型大鼠的尾静脉施用磷酸缓冲生理盐水(phosphate-buffered saline,PBS)。在施用间充质干细胞起3天后和6天后，屠宰上述单侧输尿管结扎模型大鼠，然后提取肾脏。
对提取的肾脏细胞中的作为纤维化指标的TGF-β1和α-SMA的表达水平进行确认，并对纤维化抑制效果进行评价。
基于周知的实时PCR法的协议对mRNA表达水平进行确认。另外，基于周知的蛋白质印记法的协议对蛋白质表达水平进行确认。另外，使用市售的抗体并基于周知的协议来进行荧光免疫染色。
图1～图9中的“sham”是指“假手术”，“PBS”是指“施用PBS时的试验结果”，“10％MSCs”是指“施用在含10％牛血清的DMEM培养基中培养的间充质干细胞时的试验结果”，“SF-MSCs”是指“施用在无血清培养基STK2中培养的间充质干细胞时的试验结果”。
此外，图1～图3的试验结果是在“n＝5～6”、“*：P＜0.05”、“#：P＜0.01”及“观察倍率200倍”的条件下得到的。图4～图6的试验结果是在“n＝5～6”、“*：P＜0.05”、“#：P＜0.01”及“观察倍率200倍”的条件下得到的。图7～图9的试验结果是在“n＝5～6”、“*：P＜0.05”及“#：P＜0.01”的条件下得到的。图10～图11的试验结果是在“n＝6”、“*：P＜0.05”及“#：P＜0.01”的条件下得到的。
图1是表示对大鼠施用间充质干细胞3日后(第3天)及6日后(第6天)的TGF-β1的mRNA表达水平的图表。如第3天的图表所示，与施用作为对照的PBS的情况相比，在施用10％MSCs的情况下，TGF-β1的mRNA表达水平降低。进而，与施用10％MSCs的情况相比，在施用SF-MSCs的情况下，TGF-β1的mRNA表达水平显著降低。上述结果在第6天中也是同样的结果。
图2(A)表示通过蛋白质印迹法得到的针对TGF-β的试验的结果。与施用10％MSCs的情况相比，在施用SF-MSCs的情况下，TGF-β1的蛋白质表达水平进一步降低。图2(B)是表示TGF-β1的蛋白质表达水平的图表。与施用作为对照的PBS的情况相比，在施用10％MSCs的情况下，TGF-β1的蛋白质表达水平降低。进而，与施用10％MSCs的情况相比，在施用SF-MSCs的情况下，TGF-β1的蛋白质表达水平显著降低。
图3是本发明的一个实施例中的荧光免疫染色结果的图像。在施用SF-MSCs的情况下，TGF-β1的表达被显著抑制。
图4是表示α-SMA的mRNA量的图表。与TGF-β1的结果相同地，在施用SF-MSCs的情况下，在第3天，α-SMA的表达被显著抑制。在第6天中也是与上述相同的结果。
图5表示通过蛋白质印迹法得到的针对α-SMA的试验的结果。在第3天及第6天，在对大鼠施用SF-MSCs的情况下，α-SMA的蛋白质表达水平最低。图5(B)是对α-SMA的蛋白质量进行定量化得到的图表。在第3天及第6天两天中，在对大鼠施用SF-MSCs的情况下，α-SMA量均显著减少。
图6(A)是本发明的一个实施例中的免疫染色结果的图像。
图6(B)是对图6(A)所示的图像的每单位面积的α-SMA阳性细胞的数量进行计数得到的结果。由图6(A)和图6(B)可知，在对大鼠施用SF-MSCs的情况下，α-SMA阳性细胞的数量显著减少。
由图1～图6的结果可知，与血清培养基相比，在无血清培养基中培养的间充质干细胞起到了显著较高的纤维化抑制效果。也就是说，在血清培养基中培养的间充质干细胞对纤维化的抑制效果较低，不足以作为药剂使用。另一方面，在无血清培养基中培养的间充质干细胞对纤维化的抑制效果显著较高，足以作为药剂使用。
(实施例2)
关于在无血清培养基中培养的间充质干细胞的移植所带来的炎症细胞浸润抑制效果进行考察。如实施例1中记载的那样进行细胞培养条件及方法等。使用作为T淋巴细胞的指标的CD3以及作为巨噬细胞的指标的CD68，对输尿管被结扎的大鼠的肾脏中的炎症细胞浸润进行评价。
图7(A)是表示对大鼠施用间充质干细胞3日后(第3天)及6日后(第6天)的CD3及CD68的mRNA表达水平的图表。如第3天的图表所示，与施用作为对照的PBS的情况相比，在施用10％MSCs的情况下，CD3的mRNA表达水平降低。进而，与施用10％MSCs的情况相比，在施用SF-MSCs的情况下，CD3的mRNA表达水平显著降低。
图7(B)是表示对大鼠施用间充质干细胞3日后(第3天)及6日后(第6天)的CD68的mRNA表达水平的图表。在第3天及第6天的任一天中，与施用作为对照的PBS的情况相比，在施用10％MSCs的情况下，CD68的mRNA表达水平降低。进而，与施用10％MSCs的情况相比，在施用SF-MSCs的情况下，CD68的mRNA表达水平被显著抑制。
图8是表示本发明的一个实施例中的免疫染色结果的图像。该图像中可见的黑点表示的是表达CD3及CD68的部位。就CD3及CD68的任一个而言，在施用SF-MSCs的情况下，与施用了其它药剂的情况相比，CD3及CD68的表达被显著抑制。
图9表示对图8所示的图像的每单位面积的CD3及CD68阳性细胞的数量进行计数得到的结果。与图8的结果相同地，在对大鼠施用SF-MSCs的情况下，CD3及CD68中的阳性细胞的数量显著减少。
由图7～图9的结果可知：与血清培养基相比，在无血清培养基中培养的间充质干细胞起到了显著较高的炎症细胞浸润抑制效果。也就是说，在血清培养基中培养的间充质干细胞对炎症细胞浸润的抑制效果较低，不足以作为药剂使用。另一方面，在无血清培养基中培养的间充质干细胞对炎症细胞浸润的抑制效果显著较高，足以作为药剂使用。
(实施例3)
关于在无血清培养基中培养的来源于骨髓的间充质干细胞所带来的巨噬细胞的活性控制能力进行评价。
对人单核细胞(THP-1)进行培养之后，用160nM的PMA刺激该细胞48小时，使其向促炎表型(M1)巨噬细胞分化。将来源于人骨髓的间充质干细胞(hMSCs:Bio Whittaker(Walkersville,MD))在含10％牛血清的DMEM培养基(10％MSCs)或者无血清培养基STK2(SF-hMSCs)中进行培养，并将其用于与THP-1的共培养试验(Transwell试验)中。
＜共培养条件＞
使用Transwell系统将10％MSCs及SF-hMSCs与THP-1共培养。在共培养72小时之后，回收THP-1,通过FACS法对作为抗炎表型(M2)巨噬细胞标记物的CD163和CD206的表达进行定量。
图10是表示对于从M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的分化进行诱导的图。与将M1型巨噬细胞与10％hMSCs共培养的情况相比，在将M1型巨噬细胞与SF-hMSCs共培养的情况下，巨噬细胞从M1型向M2型的分化被显著诱导。
图11(A)是表示CD163阳性细胞的增加的图表，图11(B)是表示CD206阳性细胞的增加的图表。
相比于与10％hMSCs共培养的M1型巨噬细胞，与SF-MSCs共培养的M1型巨噬细胞的CD163阳性细胞及CD206阳性细胞的比例显著增加。
基于图10～图11的结果可以确认：在无血清培养基中培养的间充质干细胞显著地使巨噬细胞从M1型向M2型改变。也就是说，就在血清培养基中培养的间充质干细胞而言，使炎症控制系统的巨噬细胞增加的效果较低，不足以作为药剂使用。另一方面，就在无血清培养基中培养的间充质干细胞而言，使炎症控制系统的巨噬细胞增加的效果显著较高，足以作为药剂使用。
(实施例4)
对于在无血清培养基中培养的来源于脂肪的间充质干细胞所带来的巨噬细胞的活性控制能力进行评价。
对人单核细胞(THP-1)进行培养之后，用160nM的PMA刺激该细胞48小时，使其向促炎表型(M1)巨噬细胞分化。将来源于人脂肪的间充质干细胞(hAMSCs:人成体干细胞(来源于皮下脂肪组织(Cat#:BBASCF)))在含10％牛血清的DMEM培养基(10％hAMSCs)或者无血清培养基STK2(SF-hAMSCs)中进行培养，并将其用于与THP-1的共培养试验(Transwell试验)中。
＜共培养条件＞
使用Transwell系统将10％hAMSCs及SF-hAMSCs与THP-1共培养。在共培养72小时之后，回收THP-1,通过FACS法对作为抗炎表型(M2)巨噬细胞标记物的CD163和CD206的表达进行定量。
图12(A)是表示CD163阳性细胞的增加的图表，图12(B)是表示CD206阳性细胞的增加的图表。
相比于与10％hAMSCs共培养的情况，与SF-hAMSCs共培养的M1型巨噬细胞的CD163阳性细胞及CD206阳性细胞的比例显著增加。
基于该结果可以确认：就在无血清培养基中培养的间充质干细胞而言，不仅在来源于骨髓的间充质干细胞中，在来源于脂肪的间充质干细胞中，也显著地使巨噬细胞从M1型向M2型改变。也就是说，就在血清培养基中培养的间充质干细胞而言，不仅在来源于骨髓的间充质干细胞中，在来源于脂肪的间充质干细胞中，其对炎症进行抑制的作用也较低，不足以作为药剂使用。另一方面，在无血清培养基中培养的间充质干细胞对炎症进行抑制的作用显著较高，足以作为药剂使用。
(实施例5)
关于在无血清培养基中培养的来源于骨髓的间充质干细胞的炎症抑制效果进行评价。使用纤维化指标HGF、肾脏疾病指标PGE2、炎症指标IL-6及炎症效果抑制作用指标TSG-6，对细胞的炎症抑制效果进行确认。
针对在10％FBS培养基中培养的Human kidney-2(HK-2)细胞、在含10％FBS的DMEM培养基中培养的人MSC(hMSCs)以及在STK2中培养的hMSCs，分别将进行培养的培养基更换为不添加FBS的DMEM培养基，然后培养48小时。然后，提取各培养基。接着，通过Elisa法对提取的培养基中含有的HGF及PGE2的蛋白质水平进行定量。
另外，分别从在含10％FBS的DMEM培养基中培养的hMSCs以及在STK2中培养的hMSCs中提取mRNA，并通过RT-PCR对IL-6及TSG-6的mRNA表达进行定量。
图13～图16中，“HK-2”是指“在10％FBS培养基中培养的HK-2的试验结果”，“10％MSCs”是指“在含10％牛血清的DMEM培养基中培养的间充质干细胞的试验结果”，“SF-MSCs”是指“在无血清培养基STK2中培养的间充质干细胞的试验结果”。
图13是表示HGF的蛋白质表达水平的图表。另外，图14是表示PGE2的蛋白质表达水平的图表。就SF-MSCs中的HGF及PGE2的蛋白质表达水平而言，其比HK-2多，但与10％MSCs相比则显著较低。
图15是表示IL-6的mRNA表达水平的图表。10％MSCs中的IL-6的mRNA表达水平显著低于HK-2中的IL-6的mRNA表达水平。另一方面，SF-MSCs中的IL-6的mRNA表达水平进一步低于10％MSCs中的IL-6的mRNA表达水平。
图16是表示TSG-6的mRNA表达水平的图表。与10％MSCs中的TSG-6的mRNA表达水平相比，SF-MSCs中的TSG-6的mRNA表达水平约为4.5倍。另外，在HK-2中，基本未确认到TSG-6的mRNA的表达。
接着，制作对在STK2中培养的hMSCs(以3×105cells/10cm dish进行播种，并在STK2中培养至融合30％)转染阴性对照siRNA(Santa Cruz Biotechnology)而得到的hMSCs。同样地，制作对在STK2中培养的hMSCs转染TSG-6siRNA(Santa CruzBiotechnology)而得到的hMSCs。这里，分别向各细胞转染20nM的siRNA，转染使用的是Lipofectamine 2000转染试剂(Thermo Fisher Scientific公司)。自转染开始24小时后，将培养基更换为STK2，并对各细胞进行培养直至达到亚融合。为了研究转染效率，从上述细胞提取mRNA，并通过RT-PCR法对TSG-6的mRNA表达水平进行定量。
图17是表示TSG-6的mRNA表达水平的图表。这里，“NC siRNA/SF-hMSCs”表示“对在STK2中培养的hMSCs转染了阴性对照siRNA时的试验结果”。另一方面，“TSG-6 siRNA/SF-MSCs”表示“对在STK2中培养的hMSCs转染了TSG-6siRNA时的试验结果”。TSG-6siRNA/SF-MSCs中的TSG-6的mRNA表达水平与NC siRNA/SF-hMSCs中的TSG-6的mRNA表达水平相比显著减弱，由此可以确认TSG-6siRNA具有有效的击倒效果。
接着，对人单核细胞(THP-1)进行培养之后，用160nM的PMA刺激48小时。同样地，向THP-1中添加20ng/mL的IFN-γ，刺激24小时，使其向促炎表型(M1)巨噬细胞分化。使用Transwell系统将上述的NC siRNA/SF-hMSCs及TSG-6siRNA/SF-MSCs与THP-1共培养。72小时后，回收THP-1,通过FACS法对THP-1中的作为抗炎表型(M2)巨噬细胞标记物的CD163的表达进行定量。
图18是表示CD163阳性细胞的增加的图表。这里，“NC siRNA/SF-hMSCs/TW”表示“对在STK2中培养的hMSCs转染了阴性对照siRNA时的试验结果”。“TSG-6 siRNA/SF-MSCs/TW”表示“对在STK2中培养的hMSCs转染了TSG-6siRNA时的试验结果”。TSG-6siRNA/SF-MSCs/TW与NC siRNA/SF-hMSCs/TW相比，未观察到显著的差异。也就是说，使用STK2培养的MSCs使巨噬细胞从促炎表型(M1)改变为抗炎表型(M2)。但启示了下述情况：表达水平因STK2而上升的TSG-6未参与该改变。
与上述方法同样地，将对实施了阴性对照siRNA的hMSCs以及实施了TSG-6siRNA的hMSCs进行培养的培养基更换为不添加FBS的DMEM培养基，然后培养48小时，将得到的培养基(以下称为条件培养基)用于以下的试验。
将HK-2细胞以1×105cells/well播种于6孔培养皿中，18小时后对达到亚融合这一情况进行确认，并将培养基更换为上述的条件培养基。24小时之后，添加10ng/mL的recombinant human TGF-β1(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)，12小时之后，提取mRNA。然后，使用RT-PCR对由TGF-β1诱导的炎症性细胞因子即MCP-1及TNF-α的mRNA表达进行研究。
图19(A)是表示MCP-1的mRNA表达水平的图表。另外，图19(B)是表示TNF-α的mRNA表达水平的图表。HK-2细胞的MCP-1和TNF-α的mRNA表达水平因TGF-β1而上升。这里，“DMEM”表示“在添加了TGF-β1的DMEM中培养时的试验结果”。另外，“NC siRNA SF-hHMCs-CM”表示“在含有实施了阴性对照siRNA的hMSCs的培养液中培养时的试验结果”。进而，“TSG-6siRNASF hMSCs-CM”表示“在含有实施了TSG-6 siRNA的hMSCs的培养液中培养时的试验结果”。在NC siRNA SF-hHMCs-CM组中，MCP-1及TNF-α的mRNA水平被显著抑制。另一方面，在TSG-6siRNA SF hMSCs-CM组中，MCP-1及TNF-α的mRNA表达抑制效果显著减弱。即启示了下述情况：当击倒在STK2中培养的在MSCs中高表达的TSG-6时，由于添加TGF-β1而诱导的炎症性细胞因子的抑制效果减弱。由本实施例结果可知：在无血清培养基中培养的间充质干细胞，由于表达TSG-6，对炎症进行抑制的作用显著较高，足以作为药剂使用。
(实施例6)
通过无血清培养基(STK1或STK2)分离从Sprague Dawley大鼠(6～7周龄)的大腿骨或胫骨的骨髓中提取的MSCs，进行培养并使其增殖，得到无血清培养基培养的MSCs(以下也称为SF-MSCs)。对该MCSs转染阴性对照siRNA或TSG-6siRNA(各20nM)。将转染后的细胞施用于制作4天后的大鼠单侧肾小管结扎模型的尾静脉中。这里，对于下述组，准备各5组：施用了上述转染阴性对照siRNA得到的SF-MSCs的组、施用了转染TSG-6 siRNA得到的SF-MSCs的组、或仅施用了PBS的组、未进行肾小管结扎的对照组。在单侧肾小管结扎术10天之后，屠宰各组大鼠，取出肾脏，关于TSG-6的抗炎效果进行确认。
图20是表示TSG-6的mRNA表达水平的图表。在大鼠MSCs中也与人MSCs同样地，SF-MSCs中的TSG-6的mRNA水平与在含血清培养基中培养的MSCs(10％MSCs)相比显著上升。与施用了阴性对照siRNA的SF-MSCs相比，在施用了TSG-6siRNA的SF-MSCs中，TSG-6的mRNA水平显著减弱，由此确认了TSG-6siRNA的击倒效果。
图21(A)是表示通过蛋白质印迹法对TGF-β1或α-SMA进行检测的检测结果的图像。另外，(B)是表示TGF-β1及α-SMA的表达水平的图表。此外，(B)的试验结果是在“n＝5～6、*：P＜0.05、#：P＜0.01”的条件下得到的。TGF-β1及α-SMA的蛋白质表达水平在PBS组中最高。此外，在施用了NC siRNA/SF-MSCs的组中，TGF-β1及α-SMA的蛋白质表达水平显著降低。另一方面，与施用了NC siRNA/SF-MSCs的组相比，在施用了TSG-6被击倒的TSG-6siRNA/SF-MSCs的组中，TGF-β1及α-SMA的蛋白质表达水平较高。即可知在TSG-6被击倒的情况下，TGF-β1及α-SMA的蛋白质表达抑制效果显著减弱。
图22(A)是CD68的免疫染色结果的图像。另外，图22(B)是表示表达CD68的细胞的数量的图表。各组的CD68阳性细胞数在PBS组中最多。另外，可以观察到：在NC siRNA/SF-MSCs组中，CD68阳性细胞数显著减少。可以观察到：与NC siRNA/SF-MSCs组相比，在TSG-6siRNA/SF-MSCs组中，CD68阳性细胞显著增加。
可以明确的是：能够使炎症在早期稳定化的TSG-6参与了在无血清培养基中培养的间充质干细胞的抗炎症作用和抗纤维化作用。
(实施例7)
随着肝脏纤维化的发展，在肝组织中以骨胶原为主要成分的细胞外基质过剩地沉积，作为其终末像演变为肝脏纤维化(例如肝硬化、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎)。在本实施例中，关于在无血清培养基中培养的间充质干细胞的移植所带来的对肾脏纤维化(例如肝硬化、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎)的抑制效果进行研究。
＜方法：细胞的提取以及培养＞
在本试验中，通过与实施例1的记载相同的方法，从Sprague Dawley大鼠(7周龄、雄性)的大腿骨或胫骨中提取间充质干细胞，并对该间充质干细胞进行培养及继代。
＜方法：疾病模型的制作＞
作为肝脏纤维化的模型，制作了一般的使用四氯化碳的模型大鼠。
在本试验中，将Sprague Dawley大鼠(5周龄、雄性)驯化1周后，从第6周龄开始，持续5周、共计10次对该大鼠进行腹腔内施用疾病诱导剂(疾病诱导物质：四氯化碳(40w/w％)、溶剂：玉米油)。
就各周中的疾病诱导剂施用时机而言，隔开一定的间隔每周进行2次(例如，在第1周为第0天和第2天的2次，在第5周为第28天和第31天的2次)。
就每次疾病诱导剂的施用量而言，设定为基于各个体的体重而标准化的量(2ml/kg)。另外，作为天数起算的起点日(即第0天)，设定为疾病诱导剂的初次施用日。以下，将进行了上述疾病诱导的组称为“疾病诱导组”。另外，作为上述肝脏的纤维化模型的阴性对照，另外设置了“健康正常组”，该“健康正常组”是以与上述同样的时间曲线以及施用量而对Sprague Dawley大鼠仅施用了不含疾病诱导物质的溶剂的组。
＜方法：药剂的施用＞
在疾病诱导剂的最终施用进行日(第31天)的第二天(第32天)，对作为上述疾病模型的“疾病诱导组”进行部分采血。
此时，以天冬氨酸氨基转移酶(AST)的值和体重的值均匀的方式提取大鼠，将该大鼠作为“疾病诱导组”。
将属于上述“疾病诱导组”的动物们分成三组：“STK组”(n＝5)、“有血清组”(n＝8)以及“安慰剂组”(n＝11)。以下，将“STK组”和“有血清组”统称为“细胞施用组”。
在第33天，对于“STK组”的动物，将按照实施例1的方法使用STK1和STK2培养的间充质干细胞静脉注射到尾静脉中，另一方面，对于“有血清组”的动物，将按照实施例1的方法使用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养的间充质干细胞静脉注射到尾静脉中。
对于“细胞施用组”，使细胞以2×106cells/ml的浓度悬浮于磷酸缓冲生理盐水(Phosphate Buffered saline,PBS)中，并按照500μL/大鼠施用该悬浮液(因此，对各大鼠施用的细胞数为1×106cells)。
对于“安慰剂组”的动物，同样按照500μL/大鼠施用安慰剂(仅PBS)。任何施用都是在保证大鼠的状态下通过通常的方法在数秒以内进行的。另外，在“健康正常组”中，细胞和安慰剂均未施用。
＜方法:屠宰以及采样＞
药剂施用后，在经过2周观察期后的第47天，在异氟烷麻醉下对所有组进行屠宰(放血安乐死)以及采样。在采样中，除了用于组织学评价的肝脏的内侧叶和外侧左叶以外，还采集用于生化检查的血液检体(全采血)。将提取的肝脏的内侧叶和外侧左叶用福尔马林固定，然后包裹在石蜡块中。然后，将石蜡块切成薄片，制作天狼星红染色标本。
＜结果：行动观察＞
在“疾病诱导组”中，在从第0天到第31天的整个疾病诱导剂施用期间内，都可以看到在刚施用疾病诱导剂后每次都发现在所有个体中立着前腿坐等伴随着本疾病诱导剂的施用可以设想的观察所见。在“健康正常组”中，没有观察到这样的观察所见。而在“细胞施用组”中，在细胞施用后持续2周的评价期间内，没有观察到细胞治疗中应考虑的任何异常所见(例如排斥反应等)。
＜结果：体重的推移＞
从初次施用日(第0天)到屠宰进行日(第47天)为止的各组的体重的推移如图23所示。另外，在图23和后述的图24～图26中，(a)是“健康正常组”的试验结果，(b)是“安慰剂组”的试验结果，(c)是“有血清组”的试验结果，(d)是“STK组”的试验结果。
在疾病诱导剂的初次施用日(第0天)，包括健康正常组在内的各组的平均体重相同。在第33天，按照除了“健康正常组”以外的各组的体重相同的方式被分组。在细胞施用后2周的观察期内，各组的体重如下：“STK组”＝“健康正常组”＞“有血清组”＝“安慰剂组”。
一般地，在使用四氯化碳的模型大鼠中，与正常饲养相比，显示出体重减少的倾向。“STK组”的体重与“健康正常组”的体重大致相同，这表示在“细胞施用组”(特别是“STK组”)中，全身性的健康状态的恢复较强。
＜结果：生化检查＞
从第47天的血液检体中分离出血清。以下，“AST”表示天冬氨酸氨基转移酶，“LDH”表示乳酸脱氢酶，“γ-GTP”表示γ-谷氨酰转肽酶。
关于“LDH”和“γ-GTP”，在“细胞施用组”(特别是“STK组”)中，改善为与“健康正常组”同等或其以下的值。另外，在“健康正常组”中，通过施用溶剂(即玉米油)，显示出该酶活性值比正常值增加的倾向。
AST：与分组时(第32天)的值相比，“STK组”(n＝5)、“有血清组”(n＝8)以及“安慰剂组”(n＝11)的“AST”的值均显著降低(P＜0.01)。在“疾病诱导组”的所有组中，第47天的血液检体中的“AST”的值与“健康正常组”没有差异，并且降低到正常值的范围。
LDH：仅测量第47天的“LDH”的值。各组中的“LDH”的平均值如下：“STK组”(946.2U/L)；“有血清组”(1086.4U/L)；“安慰剂组”(1027.9U/L)；“健康正常组”(852.7U/L)(参见图24)，在“STK组”中，与“有血清组”和“安慰剂组”相比，“LDH”的值降低。
γ-GTP：仅测量第47天的“γ-GTP”的值。各组中的“γ-GTP”的平均值如下：“STK组”(0.9U/L)；“有血清组”(1.09U/L)；“安慰剂组”(1.26U/L)；“健康正常组”(1.16U/L)，在”SK组”中，与“有血清组”和“安慰剂组”相比，“γ-GTP”的值降低(参见图25)。
＜结果：组织学评价＞
在天狼星红染色标本中，对于各个体的各叶(分别为内侧叶及外侧左叶)，以中心静脉作为中心，拍摄3个视野(每个个体6个视野(＝2叶×3个视野))的显微图像(物镜10倍)，并使用图像分析装置算出纤维化面积。
在天狼星红染色图像中，纤维性骨胶原沉积的部位被着色为红色(在图26的(a)～(d)的黑白图像中，黑色线状部位相当于被着色为红色的部位)。针对这些图像，求出各视野的纤维化率((纤维化面积/视野的面积)×100)。
图26的(a)表示“健康正常组”的天狼星红染色图像，图26的(b)表示“安慰剂组”的天狼星红染色图像，图26的(c)表示“有血清组”的天狼星红染色图像，图26的(d)表示“STK组”的天狼星红染色图像。在各图像中，纤维化率分别如下：“健康正常组”(1.1％)；“安慰剂组”(4.4％)；“STK组”(1.1％)；“有血清组”(2.4％)，“STK组”的纤维化率低于“安慰剂组”和“有血清组”(参见图26)。
＜总结＞
在本实施例中，在“STK组”中，施用细胞之后未观察到排斥反应等在细胞治疗中应考虑的异常所见。因此，可以认为本发明的修复剂的安全性高。
虽然在本实施例中整体上炎症较低，但在“STK组”中，“LDH”及“γ-GTP”的值降低。另外，各组的体重如下：“STK组”＝“健康正常组”＞“有血清组”＝“安慰剂组”，“STK组”恢复至接近“健康正常组”的体重。这些情况表示：在“STK组”中，肝脏的炎症得到抑制，恢复了全身性的健康状态。
产业上的可利用性
本发明能够适用于以恢复活体组织损伤为目的的再生医疗。

Claims (19)

1.一种活体组织损伤的修复剂，其特征在于，
含有在无血清培养基中培养的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的修复剂，其特征在于，
该修复剂是用于抑制活体组织纤维化的修复剂。
3.根据权利要求1所述的修复剂，其特征在于，
该修复剂是用于抑制炎症细胞浸润的修复剂。
4.根据权利要求1所述的修复剂，其特征在于，
该修复剂是用于控制巨噬细胞的活性的修复剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的修复剂，其特征在于，
上述无血清培养基含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的修复剂，其特征在于，
上述活体组织损伤是伴随着慢性肾功能衰竭、慢性肾脏病、肝硬化、肺纤维症、烫伤、间质性肺炎、药剂性肺炎、放射性肺炎、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、软骨损伤、骨缺损、脊髓损伤、牙周病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病、糖尿病、动脉硬化、心肌梗塞、中风、阿尔茨海默病、黄斑变性、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、颚骨重建、腭裂、骨替代材料、骨缺损、骨系统疾病、干眼症、角膜疾病、咽炎、关节炎、癌症或者纤维症的组织损伤。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的修复剂，其特征在于，
上述间充质干细胞是经筛选的不具致瘤性的间充质干细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的修复剂，其特征在于，
上述间充质干细胞至少继代一次。
9.根据权利要求8所述的修复剂，其特征在于，
在上述继代中，使用不含来源于哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂来剥离上述间充质干细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的修复剂，其特征在于，
使用适于培养上述间充质干细胞的培养容器来培养该间充质干细胞。
11.一种活体组织损伤的修复剂的制造方法，其特征在于，
具有在无血清培养基中培养间充质干细胞的工序。
12.根据权利要求11所述的制造方法，其特征在于，
上述无血清培养基含有FGF、PDGF、EGF、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸。
13.根据权利要求11或12所述的制造方法，其特征在于，
在上述培养工序之后具有筛选不具致瘤性的间充质干细胞的工序。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的制造方法，其特征在于，
在上述培养工序中，将间充质干细胞至少继代一次。
15.根据权利要求14所述的制造方法，其特征在于，
在上述继代中，使用不含来源于哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂来剥离上述间充质干细胞。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的制造方法，其特征在于，
在上述培养工序中，使用适于培养上述间充质干细胞的培养容器来培养该间充质干细胞。
17.一种活体组织损伤的修复剂，其含有TSG-6，该修复剂的特征在于，
上述活体组织损伤是伴随着慢性肾功能衰竭、慢性肾脏病、肝硬化、肺纤维症、烫伤、间质性肺炎、药剂性肺炎、放射性肺炎、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、软骨损伤、骨缺损、脊髓损伤、牙周病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病、糖尿病、动脉硬化、心肌梗塞、中风、阿尔茨海默病、黄斑变性、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、颚骨重建、腭裂、骨替代材料、骨缺损、骨系统疾病、干眼症、角膜疾病、咽炎、关节炎、癌症或者纤维症的组织损伤。
18.根据权利要求17所述的修复剂，其特征在于，
该修复剂是用于抑制活体组织纤维化的修复剂。
19.根据权利要求17所述的修复剂，其特征在于，
该修复剂是用于抑制炎症细胞浸润的修复剂。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111297899A (zh) * 2020-02-21 2020-06-19 云南雅盛医疗科技有限公司 一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用
CN114450016A (zh) * 2019-09-26 2022-05-06 智再如股份有限公司 生物组织损伤修复剂的制造方法及生物组织损伤修复剂

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018123968A1 (ja) * 2016-12-28 2018-07-05 株式会社ツーセル 生体組織損傷の修復剤および当該修復剤の製造方法
CN116590227A (zh) * 2017-03-03 2023-08-15 日本乐敦制药株式会社 间充质干细胞和肝疾病治疗剂
CN111454891A (zh) * 2020-03-11 2020-07-28 杭州原生生物科技有限公司 一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用
IL297902A (en) * 2020-05-07 2023-01-01 Xintela Ab Stem cells for the treatment of respiratory disorders
MX2023000780A (es) * 2020-07-17 2023-02-14 Lg Chemical Ltd Composicion para prevenir o tratar la osteoartritis, que comprende celulas madre mesenquimales que expresan el gen 6 inducible por el factor de necrosis tumoral.
CN112826833A (zh) * 2020-07-30 2021-05-25 中国人民解放军总医院第五医学中心 间充质干细胞在制备新冠肺炎引起的肺损伤修复药物中的应用
US20230302055A1 (en) * 2020-09-03 2023-09-28 Two Cells Co., Ltd. Composition for treating central nervous system diseases, method for producing composition for treating central nervous system diseases, and method for producing therapeutic formulation for central nervous system diseases
CA3222761A1 (en) * 2021-06-10 2022-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing mesenchymal stem cells

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100278790A1 (en) * 2008-06-18 2010-11-04 The Texas A&M University System Mesenchymal stem cells, compositions, and methods for treatment of cardiac tissue damage
JP2012157263A (ja) * 2011-01-31 2012-08-23 Seems Inc アルツハイマー病治療に向けたヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞
CN102925409A (zh) * 2012-11-19 2013-02-13 上海市第六人民医院 尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法和应用
CN103550117A (zh) * 2013-10-18 2014-02-05 上海润生生物技术有限公司 可促进皮肤修复与再生的美容护肤品及其制备方法和应用
CN104666347A (zh) * 2015-02-28 2015-06-03 广州医科大学附属第一医院 脐带间充质干细胞在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用
CN105392489A (zh) * 2013-08-01 2016-03-09 智再如股份有限公司 软骨损伤治疗剂及其制造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4791113B2 (ja) * 2005-09-12 2011-10-12 オンセミコンダクター・トレーディング・リミテッド 半導体装置
KR101107835B1 (ko) * 2006-01-13 2012-02-09 가부시키가이샤 투셀 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지 첨가물, 키트 및 이의 용도
US10046011B2 (en) * 2008-01-31 2018-08-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions for inducing or suppressing an immune response
CN102791276B (zh) * 2010-03-10 2015-03-04 智再如股份有限公司 含有间充质干细胞的细胞制品及其制造方法
KR101669124B1 (ko) 2013-07-11 2016-10-25 서울대학교병원 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및 치료용 조성물
US11000694B2 (en) 2014-10-24 2021-05-11 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Use of lasers for treating and reversing fibrosis
WO2018123968A1 (ja) * 2016-12-28 2018-07-05 株式会社ツーセル 生体組織損傷の修復剤および当該修復剤の製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100278790A1 (en) * 2008-06-18 2010-11-04 The Texas A&M University System Mesenchymal stem cells, compositions, and methods for treatment of cardiac tissue damage
JP2012157263A (ja) * 2011-01-31 2012-08-23 Seems Inc アルツハイマー病治療に向けたヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞
CN102925409A (zh) * 2012-11-19 2013-02-13 上海市第六人民医院 尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法和应用
CN105392489A (zh) * 2013-08-01 2016-03-09 智再如股份有限公司 软骨损伤治疗剂及其制造方法
CN103550117A (zh) * 2013-10-18 2014-02-05 上海润生生物技术有限公司 可促进皮肤修复与再生的美容护肤品及其制备方法和应用
CN104666347A (zh) * 2015-02-28 2015-06-03 广州医科大学附属第一医院 脐带间充质干细胞在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114450016A (zh) * 2019-09-26 2022-05-06 智再如股份有限公司 生物组织损伤修复剂的制造方法及生物组织损伤修复剂
CN111297899A (zh) * 2020-02-21 2020-06-19 云南雅盛医疗科技有限公司 一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用

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