KR102654077B1 - 생체 조직 손상의 수복제 및 그 수복제의 제조 방법 - Google Patents

생체 조직 손상의 수복제 및 그 수복제의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

생체 조직의 손상을 수복하기 위한 수복제 및 그 수복제의 제조 방법을 제공하기 위해, 본 발명은 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포를 이용한다.

Description

생체 조직 손상의 수복제 및 그 수복제의 제조 방법
본 발명은 생체 조직 손상의 수복제 및 그 수복제의 제조 방법에 관한 것이다.
간엽계 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는, 골수, 지방, 활막, 치조골 및 치근막 등의 조직으로부터 뿐만 아니라, 태반, 제대혈 및 탯줄 등 여러 가지 조직으로부터도 단리할 수 있는 세포이고, 또한 생체외에서 배양해 증식시킬 수 있는 세포이다. 게다가 간엽계 줄기세포는, 간엽계의 세포(예를 들면, 골아세포, 지방세포 및 연골세포) 뿐만 아니라, 비간엽계의 세포(예를 들면, 신경 전구세포 및 간세포)로 분화 가능한 다분화능을 갖는 것으로부터, 재생 의료나 세포 치료에 이용되는 세포를 제조하기 위한 원료로서의 이용이 기대되고 있다.
간엽계 줄기세포의 배양 수단으로, 예를 들면 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 함유하는 배지를 이용하는 것 외에, 이종 동물 유래 단백질의 혼입이 적은 무혈청 배지를 이용하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 특허 문헌 1∼3에는, 간엽계 줄기세포의 배양에 이용되는 무혈청 배양이 기재되어 있다.
특허 문헌 1: 국제 공개 제2007/080919호(2007년 7월 19일 공개) 특허 문헌 2: 국제 공개 제2011/111787호(2011년 9월 15일 공개) 특허 문헌 3: 국제 공개 제2015/016357호(2015년 2월 5일 공개)
간엽계 줄기세포가 갖는 기능은 다종 다양하여, 현재 이용되고 있는 간엽계 줄기세포의 기능은 그 일부에 지나지 않고, 미지의 기능이 많이 존재할 것으로 기대되고 있다.
본 발명의 일 형태는, 상기 문제점을 감안하여 이루어진 것으로, 생체 조직의 손상을 수복하기 위한 수복제 및 그 수복제의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 간엽계 줄기세포가 생체 조직 손상에 미치는 영향에 대해 예의 검토하는 과정에서, (1) 특정 성분을 포함하는 무혈청 배지중에서 배양한 간엽계 줄기세포는, 혈청 배지중에서 배양한 간엽계 줄기세포에 비해 현저히 높은 생체 조직 손상의 수복 효과(예를 들면, 섬유화 억제 효과, 염증 세포 침윤 억제 효과, 대식세포(macrophage) 활성 제어 효과)를 갖고 있는 점, 및 (2) 혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포에 비해 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는, 보다 많은 양의 TSG-6을 발현하고 있는 점을 알아내, 본 발명의 완성에 이르렀다.
본 발명에 따른 생체 조직 손상의 수복제는, 상기 과제를 해결하기 위해, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에 따른 생체 조직 손상 수복제의 제조 방법은, 상기 과제를 해결하기 위해, 무혈청 배지중에서 간엽계 줄기세포를 배양하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에 따른 생체 조직 손상의 수복제는 TSG-6(TNF-stimulated gene 6 protein)을 함유하고, 상기 생체 조직 손상은 만성 신부전, 만성 신장병, 간경변, 폐섬유증, 열상, 간질성 폐렴, 약제성 폐렴, 방사선 폐장염, 만성 폐색성 폐질환, 급성 호흡 촉진 증후군, 연골 손상, 골결손, 척수 손상, 치주병, 다발성 경화증, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 루푸스, 크론병, 당뇨병, 동맥 경화, 심근경색, 뇌졸중, 알츠하이머병, 황반변성증, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 비알코올성 지방간염, 턱뼈 재건, 구개열, 골치환재, 골결손, 골계통 질환, 안구 건조증, 각막 장애, 인두염, 관절염, 암 또는 섬유증에 수반하는 조직 손상인 것을 특징으로 하고 있다.
한편, 본 발명은 생체 조직 손상의 수복제를 구성하는 간엽계 줄기세포를 '무혈청 배지중에서 배양' 등의 제조 공정으로 특정하고 있다. 본 발명자들은, 본 발명에 이용되는 간엽계 줄기세포와, 종래의 간엽계 줄기세포(구체적으로는, 혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포) 사이에서, 발현량이 상이한 유전자(환언하면, 유전자 마커)가 존재하지 않는지에 대해 시험을 실시했다. 그 결과, 방대한 종류의 유전자의 발현량이 상이한 것이 밝혀졌지만, 이들 유전자 중 어떤 유전자가, 본 발명에 이용되는 간엽계 줄기세포와 종래의 간엽계 줄기세포를 구별하는데 있어서 중요한지 특정하기에 이르른 것은 TSG-6뿐이었다. 본 발명에 이용되는 간엽계 줄기세포와 종래의 간엽계 줄기세포를 구별하는데 있어서 어떤 유전자가 중요한지를 특정하기 위해서는, 더욱 방대한 시간과 노력이 필요하다. 그러므로, 출원시에 본 발명에 따른 생체 조직 손상의 수복제에서의 간엽계 줄기세포를 구조 또는 특성에 의해 직접 특정하는 것은 불가능하거나 또는 실제적이지 않은 사정이 존재한다고 결론 지었다.
본 발명에 이용하는 간엽계 줄기세포는, 혈청 배지중에서 배양한 간엽계 줄기세포에 비해 현저히 높은 조직 섬유화 억제 효과, 염증 세포 침윤 억제 효과 및 염증 억제계의 대식세포를 증가시키는 효과를 갖는다. 또한, 본 발명에 이용하는 간엽계 줄기세포는, TSG-6을 고발현함으로써, 염증을 조기에 진정시키는 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명은, 혈청 배지중에서 배양한 간엽계 줄기세포를 이용하는 경우에는 실현될 수 없는, 현저히 높은(환언하면, 임상 현장에서 이용 가능한 정도로 높은) 생체 조직 손상의 회복 효과를 나타낸다.
도 1은 TGF-β1의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 2의 (A)는 웨스턴 블롯법에 의한 TGF-β1의 검출 결과를 나타낸 상이고, (B)는 TGF-β1의 단백질 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서의 형광 면역 염색 결과의 상이다.
도 4는 α-SMA의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 5의 (A)는 웨스턴 블롯법에 의한 α-SMA의 검출 결과를 나타낸 상이고, (B)는 α-SMA의 단백질 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 6의 (A)는 본 발명의 일 실시예에서의 면역 염색 결과의 상이고, (B)는 (A)에 나타낸 상의 단위 면적당 α-SMA 양성 세포의 수를 카운트한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7의 (A)는 CD3의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이고, (B)는 CD68의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서의 면역 염색의 결과를 나타낸 상이다.
도 9의 (A)는 도 8에 나타낸 상의 단위 면적당 CD3 양성 세포의 수를 카운트한 결과를 나타낸 그래프이고, (B)는 도 8에 나타낸 상의 단위 면적당 CD68 양성 세포의 수를 카운트한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 M1형 대식세포로부터 M2형 대식세포로의 분화 유도를 나타낸 도면이다.
도 11의 (A)는 CD163 양성 세포의 증가를 나타낸 그래프이고, (B)는 CD206 양성 세포의 증가를 나타낸 그래프이다.
도 12의 (A)는 CD163 양성 세포의 증가를 나타낸 그래프이고, (B)는 CD206 양성 세포의 증가를 나타낸 그래프이다.
도 13은 HGF의 단백질 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 14는 PGE2의 단백질 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 15는 IL-6의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 16은 TSG-6의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 17은 TSG-6의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 18은 CD163 양성 세포의 증가를 나타낸 그래프이다.
도 19의 (A)는 MCP-1의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이고, (B)는 TNF-α의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 20은 TSG-6의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 21의 (A)는 웨스턴 블롯법에 의한 TGF-β1 및 α-SMA의 검출 결과를 나타낸 상이고, (B)는 TGF-β 및 α-SMA의 발현 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 22의 (A)는 CD68의 면역 염색 결과의 상이고, (B)는 CD68을 발현하고 있는 세포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에서, 모델 래트의 체중의 추이를 나타낸 그래프이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에서, 모델 래트의 LDH의 값을 나타낸 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에서, 모델 래트의 γ-GTP의 값을 나타낸 그래프이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에서, 모델 래트의 시리우스 레드 염색의 상을 나타낸다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해 상세히 설명한다. 단, 본 발명이 이것으로 한정되는 것은 아니며, 청구항에 기재하는 범위에서 여러 가지 변경이 가능하고, 다른 실시 형태 및 실시예에 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합해 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 한편, 본 명세서에 있어서 특별히 기재하지 않는 한, 수치 범위를 나타내는 'A∼B'는 'A 이상 B 이하'를 의미한다.
[1-1. 수복제의 제조 방법]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 생체 조직 손상 수복제의 제조 방법(이하, '본 실시 형태의 제조 방법'이라고도 한다)은, 무혈청 배지중에서 간엽계 줄기세포를 배양하는 공정을 갖는 방법이다.
상기 무혈청 배지의 조성은, 간엽계 줄기세포를 배양할 수 있는 무혈청 배지라면 특별히 한정되지 않고, 공지의 무혈청 배지를 적절히 사용할 수 있다. 공지의 무혈청 배지로는, 예를 들면 STK1(주식회사 투셀 제품), STK2(주식회사 투셀 제품), 인간 간엽계 줄기세포 전용 완전 합성 배지 키트(MSCGM-CD BulletKit)(Lonza), 간엽계 줄기세포 증식 배지 DXF: Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF(Ready-touse)(PromoCell GmbH.), Stem Pro MSC SFM Xeno free(Thermo Fisher Scientific Inc.) 및 MesenCult-ACF Medium Kit(STEMCELL Technologies Inc.) 등을 이용할 수 있다.
상기 무혈청 배지의 구체적인 조성으로는, 예를 들면, (i) FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지, (ⅱ) FGF, PDGF, EGF, TGF-β(transforming growth factor-β), 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지, (ⅲ) FGF, PDGF, EGF, 덱사메타손, 인슐린, 혈청 알부민, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지, (ⅳ) FGF, PDGF, EGF, TGF-β, 덱사메타손, 인슐린, 혈청 알부민, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지를 들 수 있다.
한편, 상기 (i) 및 (ⅲ)의 무혈청 배지는, TGF-β 및/또는 HGF를 함유하지 않는 것이라도 된다. 또한, 상기 (ⅱ) 및 (ⅳ)의 무혈청 배지는, HGF를 함유하지 않는 것이라도 된다.
상기 인지질로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜글리세롤 등을 들 수 있으며, 이들 인지질을 단독으로 이용해도 되고, 조합하여(예를 들면, 포스파티드산과 포스파티딜콜린을 조합하여) 이용해도 된다. 이들 인지질은, 동물 유래의 것이라도 되고, 식물 유래의 것이라도 무방하다.
상기 지방산으로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 리놀레산, 올레인산, 리놀렌산, 아라키돈산, 미리스트산, 팔미토일산, 팔미트산 및 스테아린산 등을 들 수 있으며, 이들 지방산을 단독으로 이용해도 되고, 조합하여 이용해도 된다.
본 실시 형태에서 사용되는 무혈청 배지는, 임의로, 전술한 조성 이외의 성분(예를 들면, 콜레스테롤 및/또는 HGF(hepatocyte growth factor) 등)을 함유해도 된다. 후술하는 기초 배지에 대한 HGF의 함유량은, 최종 농도로, 0.1∼50 ng/㎖인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 5 ng/㎖이다. 물론, 이들 성분은 본원 발명에 있어서 필수의 성분은 아니다.
이하, 본 실시 형태의 제조 방법을 보다 구체적으로 설명한다.
(A. 제1 공정)
본 실시 형태의 제조 방법에서는, 간엽계 줄기세포를, FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지, 보다 바람직하게는, 덱사메타손, 인슐린 및 혈청 알부민 중 적어도 어느 1개를 더 함유하는 무혈청 배지에서 배양한다(이하, 제1 공정이라고 한다). 한편, 무혈청 배지는 TGF-β 및/또는 HGF를 함유하지 않는 것이라도 된다.
한편, 무혈청 배지가 덱사메타손, 인슐린 및 혈청 알부민 중 적어도 어느 1개를 함유하고 있으면, 간엽계 줄기세포의 생존 기간의 연장 및 간엽계 줄기세포의 증식 항진이라는 효과를 나타낸다.
제1 공정에 이용하는 무혈청 배지를 구성하기 위한 기초 배지는, 당해 분야에서 주지의 동물세포용 배지라면 특별히 한정되지 않고, 바람직한 기초 배지로는, 예를 들면, Ham's F12 배지, DMEM 배지, RPMI-1640 배지, MCDB 배지 등을 들 수 있다. 이들 기초 배지는 단독으로 사용되어도 되고, 복수를 혼합해 사용되어도 무방하다. 일 실시 형태에서, 무혈청 배지를 구성하기 위한 기초 배지는, MCDB와 DMEM을 1:1의 비율로 혼합한 배지가 바람직하다. 일 실시 형태에서, 상기 기초 배지에 FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 첨가한 무혈청 배지를 제1 공정에 이용하면 된다.
기초 배지에 대한 FGF의 함유량은, 최종 농도로, 0.1∼100 ng/㎖인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 3 ng/㎖이다. 기초 배지에 대한 PDGF의 함유량은, 최종 농도로, 0.5∼100 ng/㎖인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 10 ng/㎖이다. 기초 배지에 대한 EGF의 함유량은, 최종 농도로, 0.5∼200 ng/㎖인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 20 ng/㎖이다. 기초 배지에 대한 인지질의 총함유량은, 최종 농도로, 0.1∼30 ㎍/㎖인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 10 ㎍/㎖이다. 기초 배지에 대한 지방산의 총함유량은, 기초 배지의 중량의 1/1000∼1/10인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 1/100이다.
기초 배지에 대한 덱사메타손의 함유량은, 최종 농도로, 10-10∼10-5 M인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10-9∼10-6 M이다. 기초 배지에 대한 인슐린의 함유량은, 최종 농도로, 0.01∼500 ㎍/㎖인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.1∼50 ㎍/㎖이다. 기초 배지에 대한 혈청 알부민의 함유량은, 최종 농도로, 0.01∼50 ㎎/㎖인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.1∼5 ㎎/㎖이다.
이와 같은 무혈청 배지를 사용함으로써, 무혈청 배지중에 이종 단백질이 혼입되는 것을 막으면서, 혈청 함유 배지와 동등 이상의 증식 촉진 효과가 얻어지고, 간엽계 줄기세포를 원하는 대로 증식시킬 수 있다.
무혈청 배지가 함유하는 인지질 및 지방산은, 이미 설명한 구체적인 인지질 및 지방산일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 경우, FGF는 섬유아세포 증식 인자(FGF: fibroblast growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되고, FGF-2(bFGF)인 것이 바람직하지만, FGF-1 등 다른 FGF 패밀리로부터 선택되어도 된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우, PDGF는 혈소판 유래 증식 인자(PDGF: platelet derived growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되며, PDGF-BB 또는 PDGF-AB인 것이 바람직하다.
EGF는, 상피 증식 인자(EGF: epidermal growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도된다.
또한, 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지는 결합 조직 증식 인자(CTGF: connective tissue growth factor), 혈관내피 증식 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor) 및 아스코르브산 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 인자를 더 함유하고 있어도 된다.
본 명세서에서 사용되는 경우, 아스코르브산 화합물은 아스코르브산(비타민 C) 혹은 아스코르브산-2-인산, 또는 이들과 유사한 화합물이 의도된다.
일 국면에서 무혈청 배지는, 지방질 산화 방지제를 함유하는 것이 바람직하다. 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지에 함유되는 지방질 산화 방지제는, DL-α-토코페롤아세테이트(비타민 E)일 수 있다. 무혈청 배지는 계면활성제를 더 함유하고 있어도 된다. 일 실시 형태에서, 무혈청 배지에 함유되는 계면활성제는 Pluronic F-68 또는 Tween 80일 수 있다.
무혈청 배지는 인슐린, 트랜스페린, 덱사메타손, 혈청 알부민 및 셀레네이트를 더 함유하고 있어도 된다. 본 명세서에서 사용되는 경우, 인슐린은 인슐린 유사 증식 인자라도 되고, 천연의 세포 유래라도 되고, 유전자 재조합에 의해 제조된 것 이라도 된다.
제1 공정에서는, 전술한 무혈청 배지에 인간 등의 동물 조직으로부터 종래 공지의 방법에 의해 단리된 간엽계 줄기세포를 파종해, 원하는 세포수로 증식할 때까지 배양한다(물론, 제1 공정에서는 간엽계 줄기세포를 증식시키지 않고, 무혈청 배지중에 유지하기만 해도 무방하다). 배양 조건으로, 배지 1㎖에 대해, 1∼500㎎의 조직편(간엽계 줄기세포를 포함한다)으로부터 분리한 간엽계 줄기세포를 파종하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 37℃±1℃, 5% CO2 분위기인 것이 바람직하다. 한편, 배양 시간은 간엽계 줄기세포가 목적하는 농도에 도달하는 배양 시간이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 배양 시간은 1∼5시간이라도 되고, 1∼10시간이라도 되고, 1∼20시간이라도 되고, 1시간∼1일간이라도 되고, 1시간∼10일간이라도 되고, 1시간∼30일간이라도 되고, 1시간∼50일간이라도 되고, 1시간∼60시간이라도 되고, 1시간∼70시간이라도 되고, 30시간∼70시간이라도 되고, 40시간∼70시간이라도 되고, 50시간∼70시간이라도 된다.
제1 공정에 제공되는 간엽계 줄기세포에 특별히 제한은 없지만, 초기의 간엽계 줄기세포, 즉, 인간 등의 동물 조직으로부터 채취하고 나서 한번도 계대 배양을 거치지 않은 세포인 것이 바람직하다.
또한, 제1 공정에서 간엽계 줄기세포를 보다 효율적으로 증식시키기 위해, 제1 공정에서 배양시키는 대상이 되는 간엽계 줄기세포(이하, '제1 공정 대상 세포'라고도 한다)마다, 배양에 적합한 배양 용기를 이용해 제1 공정을 실시하는 것이 바람직하다. 제1 공정 대상 세포의 배양에 적합한 배양 용기의 선택 방법으로는, 예를 들면, 최적의 배양 용기를 제1 공정 대상 세포에 선택시키는 방법을 들 수 있다. 구체적으로 설명하면, 복수 종류의 배양 용기를 준비해, 배양 용기의 종류가 다른 것 외에는 동일한 배양 조건으로 제1 공정 대상 세포를 증식시키고, 배양 개시부터 2주 후의 세포수를 공지의 방법에 따라 계측해, 세포수가 많은 것으로부터 차례로 제1 공정 대상 세포의 배양에 적합한 배양 용기라고 판단할 수 있다. 또한, 상기 제1 공정 대상 세포의 증식 속도가 빠른 경우는, 배양 개시부터 2주가 경과하기 전이라도, 컨플루언트(confluent) 상태의 80∼90%의 세포수에 도달하는 기간이 짧은 것으로부터 차례로 제1 공정 대상 세포의 배양에 적합한 배양 용기라고 판단할 수 있다.
본 실시 형태의 제조 방법의 제1 공정에서는, 제1 공정 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기가 이미 밝혀져 있는 경우에는 그 배양 용기를 이용하면 된다. 이에 대해, 제1 공정 대상 세포의 배양에 적합한 배양 용기가 밝혀지지 않은 등의 경우에는, 본 실시 형태의 제조 방법은, 제1 공정 대상 세포의 배양에 적합한 배양 용기를 선택하기 위한 '배양 용기 선택 공정'을 제1 공정의 앞에 더 포함하고 있어도 된다.
한편, 간엽계 줄기세포의 증식에는 세포가 배양 용기에 접착하는 것이 필수 조건이므로, 배양 용기에 대한 간엽계 줄기세포의 접착이 약한 경우에는, 제1 공정에서 상기 무혈청 배지에 세포 접착 분자를 더 함유시키는 것이 바람직하다. 상기 '세포 접착 분자'로는, 예를 들면, 피브로넥틴, 콜라겐, 젤라틴 등을 들 수 있다. 이들 세포 접착 분자는 1종을 단독으로 이용해도 되고, 복수 종류를 조합해 이용해도 된다.
또한, 제1 공정에서는, 간엽계 줄기세포를 적어도 1회 계대해도 된다. 간엽계 줄기세포는 부착 의존적으로 증식(anchorage dependent growth)하므로, 간엽계 줄기세포가 국소적으로 치우쳐 증식하고 있는 등의 경우에, 제1 공정의 중간에서 간엽계 줄기세포를 계대함으로써 배양 조건을 개선할 수 있다. 한편, 배양 제1 공정은, 초대 배양(P0)∼계대 3회째(P3)까지의 기간에 실시하는 것이 바람직하다.
간엽계 줄기세포의 계대 방법으로는 특별히 한정되지 않고, 종래 공지의 간엽계 줄기세포의 계대 방법을 이용해 계대할 수 있다. 계대 후의 간엽계 줄기세포 상태가 양호한 것으로부터, 상기 제1 공정에서는, 계대를 실시하는 경우에 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제를 이용해 상기 간엽계 줄기세포를 박리하는 것이 바람직하다. 상기 '포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제'로는, 예를 들면, ACCUTASE(Innovative Cell Technologies, Inc.)를 들 수 있다.
여기에서, 상기 '포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제'로서 ACCUTASE를 이용하는 경우의 계대 방법의 일례를 설명한다. (i)∼(ⅵ)의 순서에 따라 간엽계 줄기세포를 박리하고 계대한다. 한편, 이하에 설명하는 계대 방법에서는, 배양 용기로서 T-25 플라스크(팔콘 제품)를 이용한 경우에 대해 설명한다.
(i) 플라스크상의 세포층을 PBS(-) 5㎖를 이용해 세정한다.
(ⅱ) 세포층에 ACCUTASE를 2㎖ 첨가한다.
(ⅲ) 세포층을 실온에서 2분 정도 가만히 두고, 플라스크로부터의 세포의 박리를 확인한 후, 원심관에 박리한 세포를 포함하는 PBS(-)를 옮긴다.
(ⅳ) 플라스크에 PBS(-)를 7㎖ 첨가해, 당해 플라스크의 바닥면을 린스한다.
(v) 상기 (ⅲ)의 원심관에 상기 (ⅳ)의 용액을 옮기고, 1500 rpm(200∼1000×g)로 5분간 원심한다.
(ⅵ) 원심관으로부터 상청액을 제거하고, 5,000개-세포/㎠의 파종 농도로 무혈청 배지를 이용해 세포를 새로운 플라스크상에 파종한다.
(B. 제2 공정)
본 실시 형태의 제조 방법은, 상기 제1 공정의 이후에, FGF, PDGF, TGF-β, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지, 보다 바람직하게는, 덱사메타손, 인슐린 및 혈청 알부민 중 적어도 어느 1개를 더 함유하는 무혈청 배지에서, 간엽계 줄기세포를 배양하는 제2 공정을 더 갖고 있어도 된다. 한편, 무혈청 배지는 HGF를 함유하지 않는 것이라도 된다.
여기에서, 제2 공정에서의 '무혈청 배지'는 TGF-β를 함유한다는 점에서, 제1 공정의 항에서 설명한 무혈청 배지와는 다르다. 본 명세서에서는 제1 공정에서 사용하는 무혈청 배지를 '무혈청 배지 A'라고 칭하고, 제2 공정에서 사용하는 무혈청 배지를 '무혈청 배지 B'라고 칭하는 경우가 있다. TGF-β 이외의 성분(FGF, PDGF, EGF, 덱사메타손, 인슐린, 혈청 알부민, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산 등) 및 기초 배지에 대해서는, 상기 제1 공정의 항에서 무혈청 배지 A에 관해 설명했던 바와 같으므로, 여기에서는 설명을 생략한다. 또한, 제2 공정에서 사용하는 무혈청 배지 B에 함유되어 있는 상기 성분의 함유량은, 무혈청 배지 A에 관해 설명한 함유량과 같을 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 상기 기초 배지에 대한 TGF-β의 함유량은, 최종 농도로, 0.5∼100 ng/㎖인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 10 ng/㎖이다.
제2 공정에 있어서는, 전술한 무혈청 배지 B에, 제1 공정에 의해 얻어진 간엽계 줄기세포를 파종하고, 원하는 수로 증식할 때까지 배양한다(물론, 제2 공정에서는, 간엽계 줄기세포를 증식시키지 않고, 무혈청 배지 B 중에 유지하기만 해도 된다). 배양 조건으로는, 배지 1㎖에 대해 1∼2×104개의 간엽계 줄기세포를 파종 하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 37℃±1℃, 5% CO2 분위기인 것이 바람직하다. 한편, 세포 배양 시간은, 목적하는 세포의 농도가 충분히 얻어지는 배양 시간이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 배양 시간은 1∼5시간이라도 되고, 1∼10시간이라도 되고, 1∼20시간이라도 되고, 1시간∼1일간이라도 되고, 1시간∼10일간이라도 되고, 1시간∼30일간이라도 되고, 1시간∼50일간이라도 되고, 1시간∼60시간이라도 되고, 1시간∼70시간이라도 되고, 30시간∼70시간이라도 되고, 40시간∼70시간이라도 되고, 50시간∼70시간이어도 된다. 이와 같이 배양함으로써, 생체 조직 손상의 회복능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기세포를 효율적으로 대량으로 얻을 수 있다.
제2 공정에서 배양에 이용하는 배양 용기는, 간엽계 줄기세포가 증식할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 팔콘 제품 75㎠ 플라스크, 스미토모 베이크라이트 제품 75㎠ 플라스크 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 단, 세포에 따라서는, 이용하는 배양 용기의 종류에 따라 세포의 배양이 영향을 받는 경우가 있다. 이 때문에, 간엽계 줄기세포를 보다 효율적으로 배양시키기 위해, 배양시키는 대상이 되는 간엽계 줄기세포(이하, '배양 대상 세포'라고도 한다)별로 배양에 적합한 배양 용기를 이용해 제2 공정을 실시하는 것이 바람직하다. 제2 공정 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기의 선택 방법으로는, 상기 '제1 공정'의 항에서 설명한 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.
또한, 배양 용기에 대한 간엽계 줄기세포의 접착이 약한 경우에는, 상기 무혈청 배지 B에 세포 접착 분자를 더 함유시켜도 된다. 상기 세포 접착 분자에 대해서는, 상기 '제1 공정'의 항에서 설명한 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.
제2 공정에서는, 간엽계 줄기세포를 적어도 1회 계대해도 된다. 제2 공정의 중간에 간엽계 줄기세포를 계대함으로써 배양 조건을 개선할 수 있다.
한편, 제2 공정에는, 인간 등의 동물 조직으로부터 채취하고 나서 계대 1회째(P1) 이후의 간엽계 줄기세포를 제공하는 것이 바람직하다.
상기 제1 공정의 중간에 간엽계 줄기세포를 계대하는 방법 및 제1 공정 후의 세포를 제2 공정에 제공할 때의 계대 방법에 대해서는, 상기 '제1 공정'의 항에서 설명한 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.
본 실시 형태의 제조 방법은, 상기 제2 공정의 이전(또는 상기 제1 공정의 이전)에, 간엽계 줄기세포의 증식에 적합한 배양 용기를 선택하는 배양 용기 선택 공정을 더 포함하고 있어도 된다. 간엽계 줄기세포의 증식에 적합한 배양 용기의 선택 방법으로는, 상기 '제1 공정'의 항에서 설명한 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.
전술한 바와 같이, 본 실시 형태의 제조 방법은 제1 공정 및 제2 공정을 가질 수 있지만, 본 발명은 이것으로 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 실시 형태의 제조 방법은, 제1 공정 및 제2 공정 중 제1 공정만을 갖는 방법이라도 되고, 제2 공정만을 갖는 방법이라도 된다.
(C. 스크리닝 공정)
본 실시 형태의 제조 방법은, 제1 공정 및/또는 제2 공정 이후에, 간엽계 줄기세포로부터, 종양형성능(tumorigenicity)을 갖지 않는 간엽계 줄기세포를 스크리닝하는 스크리닝 공정을 더 포함해도 된다.
스크리닝 공정에서 선별한 간엽계 줄기세포를 수복제로서 사용함으로써, 종양형성능을 갖지 않는 간엽계 줄기세포를 함유하는 수복제를 실현할 수 있어 수복제의 안전성을 향상시킬 수 있다.
스크리닝 공정에서는, 간엽계 줄기세포의 종양형성능에 대해, in vivo의 고감도 면역 부전 마우스(NOG 마우스)에 의한 종양형성능 시험법에 의해 검토하는 것이 가능하다.
구체적으로는, 전술한 무혈청 배지에서 배양한 간엽계 줄기세포(예를 들면, 1,000,000개) 및 Hela 세포(예를 들면, 1,000개)를, 각각, NOG 마우스의 피하 10개소에 이식한다. 이 때, Hela 세포의 종양형성능(구체적으로는, 이식 개소에서의 종양의 발생)을 확인할 수 있는 조건하(예를 들면, 특정 마우스 사육 시간 등)에서, 무혈청 배지에서 배양한 간엽계 줄기세포의 종양형성능을 확인할 수 없으면, 당해 간엽계 줄기세포는 종양형성능을 갖지 않는 간엽계 줄기세포라고 판정할 수 있다.
[1-2. 생체 조직 손상의 수복제]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 생체 조직 손상의 수복제(이하 '본 실시 형태의 수복제'라고 한다)는, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.
여기에서, 본 실시 형태의 수복제는 생체 조직 손상의 회복을 촉진하는 효과를 갖는 약제를 의도한다. 본 실시 형태의 수복제는, 생체 조직의 섬유화를 억제하기 위한 약제(환언하면, 섬유화 억제제)라고도 할 수 있고, 염증 세포의 침윤을 억제하기 위한 약제(환언하면, 염증 세포의 침윤 억제제)라고도 할 수 있고, 또한 대식세포의 활성을 제어하기 위한 약제(환언하면, 대식세포 활성 제어제)라도고 할 수 있다.
여기에서 '생체 조직의 섬유화를 억제한다'란, 결합 조직의 이상 증식 혹은 결합 조직에서의 콜라겐의 이상 축적에 의한 조직 경화를 억제하는 것을 의도한다. 예를 들면, 생체 조직이 손상을 받으면, 치유의 과정에서 생체 조직을 구성하는 결합 조직이 이상 증식 하는 경우가 있다. '생체 조직의 섬유화를 억제한다'란, 예를 들면, 생체 조직이 손상을 받은 후에, 생체 조직을 구성하는 결합 조직이 이상 증식, 혹은 결합 조직에서의 콜라겐의 이상 축적에 의한 조직 경화를 억제하는 것을 의도한다.
여기에서 '염증 세포의 침윤을 억제한다'란, 염증 세포(예를 들면, 대식세포, 임파구 및 호중구 등)가 조직을 파괴하는 것, 또는, 조직내에 침입해 증식하는 것을 억제하는 것을 의도한다.
여기에서 '대식세포 활성을 제어한다'란, 대식세포의 표현형을 변화시키는 것을 의도한다. '대식세포 활성을 제어한다'란, 예를 들면, 대식세포를, 조직의 염증을 촉진하는 Pro-inflammatory phenotype(M1형) 대식세포로부터 Immune-regulatory phenotype(M2형) 대식세포로 변화시키는 것을 의도한다. 대식세포를 M1형으로부터 M2형으로 변화시킴으로써 조직의 염증을 진정시킬 수 있다.
또한, 상기 수복제에는 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포가 포함된다. 한편, 본 명세서에서 '무혈청 배지'란, 혈청을 함유하지 않는 배지, 환언하면 혈청이 일절 첨가되지 않고 조제된 배지인 것이 의도된다. 또한 '무혈청 배양'이란, 무혈청 배지를 이용한 배양인 것이 의도된다. 또한, 간엽계 줄기세포를 배양하는 경우에는, 단일의 무혈청 배지중에서만 간엽계 줄기세포를 배양해도 되고, 복수의 무혈청 배지중에서 간엽계 줄기세포를 배양해도 된다. 복수의 무혈청 배지중에서 간엽계 줄기세포를 배양하는 경우에는, 예를 들면, 원하는 무혈청 배지중에서 간엽계 줄기세포를 배양한 후, 당해 원하는 무혈청 배지를 다른 무혈청 배지로 치환해, 그 다른 무혈청 배지중에서 간엽계 줄기세포를 더 배양해도 된다.
상기 무혈청 배지의 조성은, 간엽계 줄기세포를 배양할 수 있는 무혈청 배지이면 특별히 한정되지 않고, 공지의 무혈청 배지를 적절히 사용할 수 있다. 공지의 무혈청 배지로는, 예를 들면 STK1(주식회사 투셀 제품), STK2(주식회사 투셀 제품), 인간 간엽계 줄기세포 전용 완전 합성 배지 키트(MSCGM-CD BulletKit)(Lonza), 간엽계 줄기세포 증식 배지 DXF: Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF(Ready-touse)(PromoCell GmbH.), Stem Pro MSC SFM Xeno free(Thermo Fisher Scientific Inc.) 및 MesenCult-ACF Medium Kit(STEMCELL Technologies Inc.) 등을 이용할 수 있다.
상기 무혈청 배지의 구체적인 조성으로는, 예를 들면, (i) FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지, 및 (ⅱ) FGF, PDGF, EGF, TGF-β, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지, (ⅲ) FGF, PDGF, EGF, 덱사메타손, 인슐린, 혈청 알부민, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지, (ⅳ) FGF, PDGF, EGF, TGF-β, 덱사메타손, 인슐린, 혈청 알부민, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지를 들 수 있다.
상기 인지질로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜글리세롤 등을 들 수 있으며, 이들 인지질을 단독으로 이용해도 되고, 조합하여(예를 들면, 포스파티드산과 포스파티딜콜린을 조합하여) 이용해도 된다. 이들 인지질은 동물 유래의 것이라도 되고, 식물 유래의 것이라도 무방하다.
상기 지방산으로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 리놀레산, 올레인산, 리놀렌산, 아라키돈산, 미리스트산, 팔미토일산, 팔미트산 및 스테아린산 등을 들 수 있으며, 이들 지방산을 단독으로 이용해도 되고, 조합하여 이용해도 된다.
본 실시 형태에서 사용되는 무혈청 배지는, 임의로, 전술한 조성 이외의 성분(예를 들면, 콜레스테롤, HGF 등)을 함유하고 있어도 된다. 물론, 이들 성분은 본원 발명에 있어서 필수의 성분은 아니다.
본 실시 형태에서 사용되는 무혈청 배지에서의 각종 조성의 농도는 전술한 [1-1]항에서 설명하였으므로, 여기에서는 그 설명을 생략한다.
본 실시 형태의 수복제에 이용되는 간엽계 줄기세포는, 골수, 지방, 활막, 치조골 및 치근막 등의 조직으로부터 단리된 간엽계 줄기세포 뿐만 아니라, 태반, 제대혈 및 탯줄 등의 조직으로부터 단리된 간엽계 줄기세포도 포함한다. 또한, 본 실시 형태의 수복제에 이용되는 간엽계 줄기세포는, 인간 간엽계 줄기세포(예를 들면, 채취된 인간 간엽계 줄기세포)라도 되고, 래트 및 마우스 등의 비인간 동물 유래 간엽계 줄기세포라도 된다.
상기 수복제가 치료 대상으로 하는 생체 조직은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 신장, 간장, 폐, 피부, 연골, 뼈, 척수, 치아, 관절, 혈관(동맥 및 정맥), 심장, 뇌, 턱, 입, 눈, 각막 및 인두를 들 수 있다. 즉, 상기 수복제는, 이들 생체 조직의 손상을 수복하는 것일 수 있다.
상기 수복제가 효능을 나타내는, 생체 조직 손상을 수반하는 질환은 특별히 한정되지 않는다. 질환의 예를 들면, 만성 신부전, 만성 신장병, 간경변, 폐섬유증, 화상, 간질성 폐렴, 약제성 폐렴, 방사선 폐장염, 만성 폐색성 폐질환, 급성 호흡 촉진 증후군, 연골 손상, 골결손, 척수 손상, 치주병, 다발성 경화증, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 루푸스, 크론병, 당뇨병, 동맥 경화, 심근경색, 뇌졸중, 알츠하이머병, 황반변성증, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 비알코올성 지방간염, 턱뼈 재건, 구개열, 골치환재, 골결손, 골계통 질환, 안구 건조증, 각막 장애, 인두염, 관절염, 암 또는 섬유증 등을 들 수 있다.
본 실시 형태의 수복제는, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포로 이루어지는 약제라도 되지만, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포 외에 약학적으로 허용되는 첨가제(예를 들면, 완충제, 산화 방지제, 증점제 및 부형제)를 포함할 수 있다.
상기 첨가제의 양은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 본 실시 형태의 수복제의 0.01∼50 중량%, 0.01∼40 중량%, 0.01∼30 중량%, 0.01∼20 중량%, 0.01∼10 중량% 또는 0.01∼1 중량%일 수 있다.
본 실시 형태의 수복제에 함유되는 간엽계 줄기세포의 수는, 특별히 한정되지 않고, 투여 대상의 체중에 따라 적절히 설정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 1봉(투여)당 1×102 세포∼1×1010 세포, 1×103 세포∼1×1010 세포, 1×104 세포∼1×1010 세포, 1×105 세포∼1×1010 세포, 1×106 세포∼1×1010 세포일 수 있다. 물론, 1봉(투여)당 1010 세포 이상이라도 된다.
상기 수복제의 투여 방법으로 예를 들면, 정맥 주사, 동맥 주사 및 국소(척수(예를 들면, 척수강), 근육, 관절, 뇌 등)에의 주사를 들 수 있다. 이들 투여 방법 중, 카테터를 이용한 국소 근방의 동맥에의 투여 방법이라면, 투여에 필요한 세포수를 감소시킬 수 있다는 유리한 효과를 나타낸다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 생체 조직 손상 수복제의 투여 대상은, 특별히 한정되지 않는다. 상기 투여 대상으로, 인간 및 인간 이외의 포유류(소, 돼지, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 마우스, 래트 등)를 들 수 있다.
본 실시 형태의 수복제의 투여량은, 특별히 한정되지 않지만, 투여 대상의 체중 1㎏당 투여되는 간엽계 줄기세포의 수가 1×102 세포∼1×1010 세포, 1×103 세포∼1×1010 세포, 1×104 세포∼1×1010 세포, 1×105 세포∼1×1010 세포, 1×106 세포∼1×1010 세포가 되는 양일 수 있다.
[1-3. 생체 조직 손상의 수복제-2]
본 실시 형태의 수복제는, TNF-stimulated gene 6 protein(TSG-6)을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명자들은, 혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포에 비해 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포가 보다 높은 양의 TSG-6을 발현하고 있는 것을 알아냈다. 또한, 본 발명자들은 TSG-6이 여러 가지 질환(특히 신장에서의 질환)에서 항염증 작용을 갖는 것을 새롭게 알아냈다. 본 실시 형태의 수복제에 의하면, 예를 들면, (i) 염증 세포의 침윤을 조기부터 억제할 수 있고, (ⅱ) 염증을 조기에 진정시킬 수 있고, 및/또는, (ⅲ) 생체 조직의 섬유화를 억제할 수 있다.
본 실시 형태의 수복제는, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포 유래의 TSG-6(보다 구체적으로는, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포 자체)을 함유하고 있는 것이 바람직하다. 한편, 간엽계 줄기세포 유래의 TSG-6을 함유하는 수복제에 대한 상세한 설명은, [1-2. 생체 조직 손상의 수복제]에서 설명한 바와 같으므로, 여기에서는 설명을 생략한다.
본 실시 형태의 수복제는, 생체 조직 손상의 회복을 촉진하는 효과를 갖는 약제를 의도한다. 본 실시 형태의 수복제는, 생체 조직의 섬유화를 억제하기 위한 약제(환언하면, 섬유화 억제제)라도 되고, 염증 세포의 침윤을 억제하기 위한 약제(환언하면, 염증 세포의 침윤 억제제)라도 된다.
여기에서, '생체 조직의 섬유화를 억제한다' 및 '염증 세포의 침윤을 억제한다'란, [1-2. 생체 조직 손상의 수복제]에서 설명한 바와 같으므로, 여기에서는 설명을 생략한다.
본 실시 형태의 수복제에는, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포가 함유될 수 있다. 무혈청 배지의 조성 및 농도, 간엽계 줄기세포의 종류 등에 대해서는 [1-2. 생체 조직 손상의 수복제]에서 설명한 바와 같으므로, 여기에서는 설명을 생략한다.
상기 수복제가 치료 대상으로 하는 생체 조직은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 신장, 간장, 폐, 피부, 연골, 뼈, 척수, 치아, 관절, 혈관(동맥 및 정맥), 심장, 뇌, 턱, 입, 눈, 각막 및 인두를 들 수 있다. 즉, 상기 수복제는 이들 생체 조직의 손상을 수복하는 것일 수 있다.
상기 수복제가 효능을 나타내는, 생체 조직 손상을 수반하는 질환은 특별히 한정되지 않는다. 질환의 예를 들면, 만성 신부전, 만성 신장병, 간경변, 폐섬유증, 화상, 간질성 폐렴, 약제성 폐렴, 방사선 폐장염, 만성 폐색성 폐질환, 급성 호흡 촉진 증후군, 연골 손상, 골결손, 척수 손상, 치주병, 다발성 경화증, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 루푸스, 크론병, 당뇨병, 동맥 경화, 심근경색, 뇌졸중, 알츠하이머병, 황반변성증, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 비알코올성 지방간염, 턱뼈 재건, 구개열, 골치환재, 골결손, 골계통 질환, 안구 건조증, 각막 장애, 인두염, 관절염, 암 또는 섬유증 등을 들 수 있다.
본 실시 형태의 수복제는, TSG-6(또는, TSG-6을 고발현하고 있는, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포)으로 이루어지는 약제라도 되지만, TSG-6(또는, TSG-6을 고발현하고 있는, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포) 외에, 약학적으로 허용되는 첨가제(예를 들면, 완충제, 산화 방지제, 증점제 및 부형제)를 함유할 수 있다.
본 실시 형태의 수복제에 함유되는 첨가제의 양은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 수복제를 100 중량%라고 하는 경우, 0 중량%∼99.999 중량%라도 되고, 0 중량%∼99.99 중량%라도 되고, 0 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 5 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 10 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 20 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 30 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 40 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 50 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 60 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 70 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 80 중량%∼99.9 중량%라도 되고, 90 중량%∼99.9 중량%라도 된다.
상기 수복제의 투여 방법으로는 예를 들면, 정맥 주사, 동맥 주사 및 국소(척수(예를 들면, 척수강), 근육, 관절, 뇌 등)에의 주사를 들 수 있다. 이들 투여 방법 중 카테터를 이용한 국소 근방의 동맥에의 투여 방법이라면, 투여에 필요한 수복제의 양을 감소시킬 수 있다고 하는 유리한 효과를 나타낸다.
본 실시 형태에 따른 생체 조직 손상 수복제의 투여 대상은, 특별히 한정되지 않는다. 상기 투여 대상으로는 인간 및 인간 이외의 포유류(소, 돼지, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 마우스, 래트 등)를 들 수 있다.
TSG-6은 천연의 단백질이라도 되고, 합성된 단백질이라도 되고, 재조합 단백질이라도 된다.
본 실시 형태의 수복제에 함유되고 있는 TSG-6의 양은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 수복제를 100 중량%라고 하는 경우, 0.001 중량%∼100 중량%라도 되고, 0.01 중량%∼100 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼100 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼95 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼90 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼80 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼70 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼60 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼50 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼40 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼30 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼20 중량%라도 되고, 0.1 중량%∼10 중량%라도 된다.
본 발명은, 이하와 같이 구성할 수도 있다.
본 발명의 생체 조직 손상의 수복제는, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 수복제는, 생체 조직의 섬유화를 억제하기 위한 것이 바람직하다.
본 발명의 수복제는, 염증 세포의 침윤을 억제하기 위한 것이 바람직하다.
본 발명의 수복제는, 대식세포의 활성을 제어하기 위한 것이 바람직하다.
본 발명의 수복제에서, 상기 무혈청 배지는 FGF(fibroblast growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), EGF(epidermal growth factor), 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 수복제에서, 상기 생체 조직 손상은, 만성 신부전, 만성 신장병, 간경변, 폐섬유증, 화상, 간질성 폐렴, 약제성 폐렴, 방사선 폐장염, 만성 폐색성 폐질환, 급성 호흡 촉진 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 연골 손상, 골결손, 척수 손상, 치주병, 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 관절 류머티즘, 전신성 홍반 루푸스(systemic lupus erythematodes, SLE), 크론병, 당뇨병, 동맥 경화, 심근경색, 뇌졸중, 알츠하이머병, 황반변성증, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 비알코올성 지방간염, 턱뼈 재건, 구개열, 골치환재, 골결손, 골계통 질환, 안구 건조증, 각막 장애, 인두염, 관절염, 암 또는 섬유증에 수반하는 조직 손상인 것이 바람직하다.
본 발명의 수복제에서, 상기 간엽계 줄기세포는 스크리닝된 종양형성능을 갖지 않는 간엽계 줄기세포인 것이 바람직하다.
본 발명의 수복제에서, 상기 간엽계 줄기세포는 적어도 1회 계대된 것이 바람직하다.
본 발명의 수복제에서는, 상기 계대에서 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하지 않는 세포 박리제를 이용해 상기 간엽계 줄기세포를 박리하는 것이 바람직하다.
본 발명의 수복제에서, 상기 간엽계 줄기세포는, 당해 간엽계 줄기세포의 배양에 적합한 배양 용기를 이용해 배양된 것이 바람직하다.
본 발명의 생체 조직 손상 수복제의 제조 방법은, 무혈청 배지중에서 간엽계 줄기세포를 배양하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 생체 조직 손상 수복제의 제조 방법에서, 상기 무혈청 배지는 FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 생체 조직 손상 수복제의 제조 방법은, 상기 배양하는 공정 이후에, 종양형성능을 갖지 않는 간엽계 줄기세포를 스크리닝하는 공정을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 생체 조직 손상 수복제의 제조 방법은, 상기 배양하는 공정에서 간엽계 줄기세포를 적어도 1회 계대하는 것이 바람직하다.
본 발명의 생체 조직 손상 수복제의 제조 방법은, 상기 계대에서 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하지 않는 세포 박리제를 이용해 상기 간엽계 줄기세포를 박리하는 것이 바람직하다.
본 발명의 생체 조직 손상 수복제의 제조 방법은, 상기 배양하는 공정에서 상기 간엽계 줄기세포의 배양에 적합한 배양 용기를 이용해 당해 간엽계 줄기세포를 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 생체 조직 손상의 수복제는, TSG-6(TNF-stimulated gene 6 protein)을 함유하고, 상기 생체 조직 손상은 만성 신부전, 만성 신장병, 간경변, 폐섬유증, 화상, 간질성 폐렴, 약제성 폐렴, 방사선 폐장염, 만성 폐색성 폐질환, 급성 호흡 촉진 증후군, 연골 손상, 골결손, 척수 손상, 치주병, 다발성 경화증, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 루푸스, 크론병, 당뇨병, 동맥 경화, 심근경색, 뇌졸중, 알츠하이머병, 황반변성증, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 비알코올성 지방간염, 턱뼈 재건, 구개열, 골치환재, 골결손, 골계통 질환, 안구 건조증, 각막 장애, 인두염, 관절염, 암 또는 섬유증에 수반하는 조직 손상인 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 생체 조직 손상의 수복제는, 생체 조직의 섬유화를 억제하기 위한 것이 바람직하다.
본 발명의 생체 조직 손상의 수복제는, 염증 세포의 침윤을 억제하기 위한 것이 바람직하다.
《실시예》
(실시예 1)
무혈청 배지에서 배양한 간엽계 줄기세포의 이식에 의한 신장 섬유화의 억제 효과에 관한 검토를 실시했다.
Sprague Dawley 래트(6∼7주령)의 대퇴골 또는 경골로부터, 주지의 방법(예를 들면, Ueno et al., "Mesenchmal stem cells ameliorate experimental peritoneal fibrosis by suppressing inflammation and inhibiting TGF-β signaling" International Society of Nephrology, 2013, p1-11 참조)에 따라 간엽계 줄기세포를 분리했다.
분리한 간엽계 줄기세포를, 무혈청 배지 STK1(주식회사 투셀 제품: 'FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지'에 대응) 또는 10% 소 혈청 함유 DMEM 배지(Sigma-Aldorich 제품)중에서, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 7일간 초대 배양했다.
그 후, 무혈청 배지 STK1에서 초대 배양한 간엽계 줄기세포는 무혈청 배지 STK2(주식회사 투셀 제품: 'FGF, PDGF, EGF, TGF-β, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 무혈청 배지에 대응')중에서, 10% 소 혈청 함유 DMEM 배지중에서 초대 배양한 간엽계 줄기세포는 10% 소 혈청 함유 DMEM 배지중에서, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 12일간 배양했다. 또한, 계대에는 ACCUTASE를 이용했다.
다음으로, 신장의 섬유화 모델로서 일반적인 래트의 일측 요관 결찰 모델을 제작했다. 제작 수단은 공지의 수단에 의해 행했다(예를 들면, Masaki et al., "Activation of the ERK pathway precedes tubular proliferation in the obstructed rat kidney" Kidney International, Vol. 63(2003), p1256-1264).
요관을 결찰한 날로부터 4일 후에, STK2를 이용해 배양한 간엽계 줄기세포 또는 10% 소 혈청 함유 DMEM 배지를 이용해 배양한 간엽계 줄기세포를, 각각에 대해 5×106개를, 일측 요관 결찰 모델 래트의 꼬리 정맥에 투여했다. 이 때, 대조군으로서 인산 완충 생리 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)를 상기와 마찬가지로 일측 요관 결찰 모델 래트의 꼬리 정맥에 투여했다. 간엽계 줄기세포를 투여하고 나서 3일 후 및 6일 후에, 상기 일측 요관 결찰 모델 래트를 도살한 후, 신장을 적출했다.
채취된 신장 세포에서, 섬유화의 지표인 TGF-β1 및 α-SMA의 발현 레벨을 확인하고, 섬유화 억제 효과의 평가를 실시했다.
mRNA의 발현 레벨은 주지의 리얼타임 PCR법의 프로토콜에 기초해 확인했다. 또한, 단백질의 발현 레벨은 주지의 웨스턴 블롯법의 프로토콜에 기초해 확인했다. 또한, 형광 면역 염색은 시판의 항체를 이용해 주지의 프로토콜에 기초해 행했다.
도 1∼도 9에서의 'sham'는 '모의 수술'을, 'PBS'는 'PBS를 투여한 경우의 시험 결과'를, '10% MSCs'는 '10% 소 혈청 함유 DMEM 배지에서 배양한 간엽계 줄기세포를 투여한 경우의 시험 결과'를, 'SF-MSCs'는 '무혈청 배지 STK2에서 배양한 간엽계 줄기세포를 투여한 경우의 시험 결과'를 의도한다.
한편, 도 1∼도 3의 시험 결과는 'n=5∼6', '*: P＜0.05', '＃: P＜0.01' 및 '관찰 배율 200배'의 조건하에서 얻어진 것이다. 도 4∼도 6의 시험 결과는 'n=5∼6', '*: P＜0.05', '＃: P＜0.01' 및 '관찰 배율 200배'의 조건하에서 얻어진 것이다. 도 7∼도 9의 시험 결과는 'n=5∼6', '*: P＜0.05' 및 '＃: P＜0.01'의 조건하에서 얻어진 것이다. 도 10∼도 11의 시험 결과는 'n=6', '*: P＜0.05' 및 '＃: P＜0.01'의 조건하에서 얻어진 것이다.
도 1은, 래트에게 간엽계 줄기세포를 투여한 3일 후(Day 3) 및 6일 후(Day 6)에서의 TGF-β1의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. Day 3의 그래프에 나타낸 바와 같이, 대조군의 PBS를 투여한 경우에 비해, 10% MSCs를 투여한 경우에는 TGF-β1의 mRNA 발현 레벨이 저하되었다. 또한, 10% MSCs를 투여한 경우에 비해, SF-MSCs를 투여한 경우에는, TGF-β1의 mRNA 발현 레벨이 현저히 저하되었다. 상기 결과는 Day 6에서도 같은 결과였다.
도 2의 (A)는 웨스턴 블롯법에 의한 TGF-β에 대한 시험의 결과를 나타낸다. 10% MSCs를 투여한 경우에 비해 SF-MSCs를 투여한 경우에는, TGF-β1의 단백질 발현 레벨이 더욱 저하되었다. 도 2의 (B)는 TGF-β1의 단백질 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. 대조군의 PBS를 투여한 경우에 비해 10% MSCs를 투여한 경우에는, TGF-β1의 단백질 발현 레벨이 저하되었다. 또한, 10% MSCs를 투여한 경우에 비해 SF-MSCs를 투여한 경우에는, TGF-β1의 단백질 발현 레벨이 현저히 저하되었다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서의 형광 면역 염색 결과의 상이다. SF-MSCs를 투여한 경우는 TGF-β1의 발현이 현저히 억제되었다.
도 4는 α-SMA의 mRNA량을 나타낸 그래프이다. TGF-β1의 결과와 마찬가지로, SF-MSCs를 투여한 경우, Day 3에서 α-SMA의 발현이 현저히 억제되고 있었다. Day 6에서도 상기와 같은 결과였다.
도 5는 웨스턴 블롯법에 의한 α-SMA에 대한 시험 결과를 나타낸다. Day 3 및 Day 6에서, SF-MSCs를 래트에게 투여한 경우, α-SMA의 단백질 발현 레벨이 가장 낮았다. 도 5의 (B)는 α-SMA의 단백질량을 정량화한 그래프이다. Day 3, Day 6의 양쪽 모두에서, SF-MSCs를 래트에게 투여한 경우, α-SMA량이 현저히 감소하고 있었다.
도 6의 (A)는 본 발명의 일 실시예에서의 면역 염색 결과의 상이다.
도 6의 (B)는 도 6의 (A)에 나타낸 상의 단위 면적당 α-SMA 양성 세포의 수를 카운트한 결과이다. 도 6의 (A) 및 도 6의 (B)로부터 분명한 바와 같이, α-SMA 양성 세포의 수는 SF-MSCs를 래트에게 투여한 경우에 현저히 적었다.
도 1∼도 6의 결과로부터, 혈청 배지에 비해 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포가 현저히 높은 섬유화 억제 효과를 갖는 것이 나타났다. 즉, 혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는 섬유화 억제 효과가 낮아, 약제로서 이용하기에는 불충분했다. 한편, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는 섬유화 억제 효과가 현저히 높아, 약제로서 이용하기에 충분했다.
(실시예 2)
무혈청 배지에서 배양한 간엽계 줄기세포 이식에 의한 염증 세포 침윤의 억제 효과를 조사했다. 세포 배양 조건 및 방법 등은 실시예 1에 기재한 대로 행했다. T 임파구의 지표인 CD3 및 대식세포의 지표인 CD68을 이용해, 요관을 결찰한 래트의 신장에서 염증 세포 침윤의 평가를 실시했다.
도 7의 (A)는 래트에게 간엽계 줄기세포를 투여하고 3일 후(Day 3) 및 6일 후(Day 6)에서의, CD3 및 CD68의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. Day 3의 그래프에 나타낸 바와 같이, 대조군의 PBS를 투여한 경우에 비해 10% MSCs를 투여한 경우에는, CD3의 mRNA 발현 레벨이 저하되었다. 또한, 10% MSCs를 투여한 경우에 비해 SF-MSCs를 투여한 경우에는, CD3의 mRNA 발현 레벨이 현저히 저하되었다.
도 7의 (B)는 래트에게 간엽계 줄기세포 투여하고 3일 후(Day 3) 및 6일 후(Day 6)에서의, CD68의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. Day 3 및 Day 6의 모두에서, 대조군의 PBS를 투여한 경우에 비해 10% MSCs를 투여한 경우에는, CD68의 mRNA 발현 레벨이 저하되었다. 또한, 10% MSCs를 투여한 경우에 비해 SF-MSCs를 투여한 경우에는, CD68의 mRNA 발현 레벨이 현저히 억제되고 있었다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서의 면역 염색의 결과를 나타낸 상이다. 당해 상 안에 보여지는 검은 점이 CD3 및 CD68이 발현하고 있는 개소를 나타내고 있다. CD3 및 CD68의 양쪽 모두에서, SF-MSCs를 투여한 경우에는 그 외의 경우에 비해 CD3 및 CD68의 발현이 현저히 억제되고 있었다.
도 9는 도 8에 나타낸 상의 단위 면적당 CD3 및 CD68 양성 세포의 수를 카운트한 결과를 나타낸다. 도 8의 결과와 마찬가지로, CD3 및 CD68에서의 양성 세포의 수는 SF-MSCs를 래트에게 투여한 경우에 현저히 적었다.
도 7∼도 9의 결과로부터, 혈청 배지에 비해 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는, 현저히 높은 염증 세포의 침윤 억제 효과를 갖는 것이 나타났다. 즉, 혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는 염증 세포의 침윤 억제 효과가 낮아, 약제로서 이용하기에는 불충분했다. 한편, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는 염증 세포의 침윤 억제 효과가 현저히 높아, 약제로서 이용하기에 충분했다.
(실시예 3)
무혈청 배지에서 배양한 골수 유래 간엽계 줄기세포에 의한, 대식세포의 활성 제어능를 평가했다.
인간 단아구성 세포(Human monoblastoid cell, THP-1)를 배양한 후, 당해 세포를 PMA 160nM으로 48시간 자극해 Pro-inflammatory phenotype(M1) 대식세포로 분화시켰다. 인간 골수 유래 간엽계 줄기세포(hMSCs: Bio Whittaker(Walkersville, MD))를 10% 소 혈청 함유 DMEM 배지(10% MSCs) 또는 무혈청 배지 STK2(SF-hMSCs)에서 배양해, THP-1과의 공배양 실험(트랜스웰 실험)에 사용했다.
＜공배양 조건＞
10% MSCs 및 SF-hMSCs를, 트랜스웰 시스템(transwell system)을 이용해 THP-1과 공배양했다. 공배양 72시간 후에 THP-1을 회수해, Immune-regulatory phenotype(M2) 대식세포의 마커인 CD163 및 CD206의 발현을 FACS법으로 정량했다.
도 10은, M1형 대식세포로부터 M2형 대식세포로의 분화를 유도하는 것을 나타낸 도면이다. M1형 대식세포를 10% hMSCs와 공배양한 경우에 비해, M1형 대식세포를 SF-hMSCs와 공배양한 경우에는, M1형으로부터 M2형으로의 대식세포의 분화가 현저히 유도되고 있었다.
도 11의 (A)는 CD163 양성 세포의 증가를, 도 11의 (B)는 CD206 양성 세포의 증가를 나타낸 그래프이다.
SF-MSCs와 공배양한 M1형 대식세포는, 10% hMSCs와 공배양한 M1형 대식세포에 비해, CD163 양성 세포 및 CD206 양성 세포의 비율이 현저히 높았다.
도 10 및 도 11의 결과로부터, 무혈청 배지에서 배양한 간엽계 줄기세포는 대식세포를 M1형으로부터 M2형으로 현저히 변화시키는 것이 확인되었다. 즉, 혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는 염증 억제계의 대식세포를 증가시키는 효과가 낮아, 약제로서 이용하기에는 불충분했다. 한편, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는 염증 억제계의 대식세포를 증가시키는 효과가 현저히 높아, 약제로서 이용하기에 충분했다.
(실시예 4)
무혈청 배지에서 배양한 지방 유래 간엽계 줄기세포에 의한 대식세포의 활성 제어능를 평가했다.
인간 단아구성 세포(THP-1)를 배양한 후, 당해 세포를 PMA 160nM으로 48시간 자극해 Pro-inflammatory phenotype(M1) 대식세포로 분화시켰다. 인간 지방 유래 간엽계 줄기세포(hAMSCs: 인간 성체 줄기세포(피하지방 조직 유래(Cat＃: BBASCF)))를 10% 소 혈청 함유 DMEM 배지(10% hAMSCs) 또는 무혈청 배지 STK2(SF-hAMSCs)에서 배양해, THP-1과의 공배양 실험(트랜스웰 실험)에 사용했다.
＜공배양 조건＞
10% hAMSCs 및 SF-hAMSCs를 트랜스웰 시스템을 이용해 THP-1과 공배양했다. 공배양 72시간 후에 THP-1을 회수해, Immune-regulatory phenotype(M2) 대식세포의 마커인 CD163 및 CD206의 발현을 FACS법으로 정량했다.
도 12의 (A)는 CD163 양성 세포의 증가를, 도 12의 (B)는 CD206 양성 세포의 증가를 나타낸 그래프이다.
SF-hAMSCs와 공배양한 M1형 대식세포는, 10% hAMSCs와 공배양한 경우에 비해, CD163 양성 세포 및 CD206 양성 세포의 비율이 현저히 높았다.
이 결과로부터, 골수 유래 간엽계 줄기세포 뿐만 아니라, 지방 유래 간엽계 줄기세포에 있어서도, 무혈청 배지에서 배양된 간엽계 줄기세포가 대식세포를 M1형으로부터 M2형으로 현저히 변화시키는 것이 확인되었다. 즉, 골수 유래 간엽계 줄기세포 뿐만 아니라 지방 유래 간엽계 줄기세포에 있어서도, 혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는 염증을 억제하는 작용이 낮아, 약제로서 이용하기에는 불충분했다. 한편, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는 염증을 억제하는 작용이 현저히 높아, 약제로서 이용하기에 충분했다.
(실시예 5)
무혈청 배지에서 배양한 골수 유래 간엽계 줄기세포의 염증 억제 효과를 평가했다. 섬유화의 지표인 HGF, 신장 장애의 지표인 PGE2, 염증의 지표인 IL-6 및 염증 효과 억제 작용의 지표인 TSG-6을 이용해, 세포의 염증 억제 효과를 확인했다.
10% FBS 배지에서 배양한 Human kidney-2(HK-2) 세포, 10% FBS 함유 DMEM 배지에서 배양한 인간 MSC(hMSCs) 및 STK2에서 배양한 hMSCs의 각각에 대해, 배양하는 배지를 FBS 무첨가의 DMEM 배지로 교환한 후, 48시간 배양했다. 그 후, 각 배지를 채취했다. 다음으로, Elisa법에 따라, 채취한 배지에 함유되는 HGF 및 PGE2의 단백질 레벨을 정량했다.
또한, 10% FBS 함유 DMEM 배지에서 배양한 hMSCs 및 STK2에서 배양한 hMSCs의 각각으로부터 mRNA를 채취해, RT-PCR에 의해 IL-6 및 TSG-6의 mRNA 발현을 정량 했다.
도 13∼도 16에서의 'HK-2'는 '10% FBS 배지에서 배양한 HK-2의 시험 결과'를, '10% MSCs'는 '10% 소 혈청 함유 DMEM 배지에서 배양한 간엽계 줄기세포의 시험 결과'를, 'SF-MSCs'는 '무혈청 배지 STK2에서 배양한 간엽계 줄기세포의 시험 결과'를 의도한다.
도 13은 HGF의 단백질 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. 또한 도 14는 PGE2의 단백질 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. SF-MSCs에서의 HGF 및 PGE2의 단백질 발현 레벨은, HK-2에 비해 높기는 하지만, 10% MSCs에 비해 유의미하게 낮았다.
도 15는 IL-6의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. 10% MSCs에서의 IL-6의 mRNA 발현 레벨은, HK-2에서의 IL-6의 mRNA 발현 레벨에 비해 유의미하게 낮았다. 한편, SF-MSCs에서의 IL-6의 mRNA 발현 레벨은, 10% MSCs에서의 IL-6의 mRNA 발현 레벨에 비해 한층 더 낮았다.
도 16은 TSG-6의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. SF-MSCs에서의 TSG-6 mRNA의 발현 레벨은, 10% MSCs에서의 TSG-6 mRNA의 발현 레벨에 비해 약 4.5배였다. 또한, HK-2에서는 TSG-6 mRNA의 발현이 거의 인정되지 않았다.
다음으로, STK2에서 배양한 hMSCs(3×105 cells/10㎝ dish로 파종해, STK2에서 30% confluent까지 배양)에 Negative Control siRNA(Santa Cruz Biotechnology)를 트랜스펙션(transfection)한 hMSCs를 제작했다. 마찬가지로, STK2에서 배양한 hMSCs에 TSG-6 siRNA(Santa Cruz Biotechnology)를 트랜스펙션한 hMSCs를 제작했다. 여기에서, siRNA는 각각 20 nM을 각 세포에 트랜스펙션하고, 트랜스펙션에는 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific)를 이용했다. 트랜스펙션하고 나서 24시간 후에 배지를 STK2로 교환해, 각 세포를 서브컨플루언트(sub-confluent)가 될 때까지 배양했다. 트랜스펙션 효율을 조사하기 위해, 상기 세포로부터 mRNA를 채취해, TSG-6의 mRNA 발현 레벨을 RT-PCR법으로 정량했다.
도 17은 TSG-6의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. 여기에서, 'NC siRNA/SF-hMSCs'는, 'STK2에서 배양한 hMSCs에 Negative Control siRNA를 트랜스펙션한 경우의 시험 결과'를 나타낸다. 한편, 'TSG-6 siRNA/SF-MSCs'는, 'STK2에서 배양한 hMSCs에 TSG-6 siRNA를 트랜스펙션한 경우의 시험 결과'를 나타낸다. TSG-6 siRNA/SF-MSCs에서의 TSG-6의 mRNA 발현 레벨이, NC siRNA/SF-hMSCs에서의 TSG-6의 mRNA 발현 레벨과 비교해 유의미하게 감쇠하고 있는 것으로부터, TSG-6 siRNA가 유효한 녹다운 효과를 갖고 있는 것이 확인되었다.
다음으로, 인간 단아구성 세포(THP-1)를 배양한 후, 160 nM의 PMA에 의해 48시간 자극했다. 마찬가지로, 20 ng/㎖의 IFN-γ를 THP-1에 첨가하고 24시간 자극해, Pro-inflammatory phenotype(M1) 대식세포로 분화시켰다. 상기 NC siRNA/SF-hMSCs 및 TSG-6 siRNA/SF-MSCs를 트랜스웰 시스템을 이용해 THP-1과 공배양했다. 72시간 후에 THP-1을 회수해, THP-1에서의 Immune-regulatory phenotype(M2) 대식세포의 마커인 CD163의 발현을 FACS법으로 정량했다.
도 18은 CD163 양성 세포의 증가를 나타낸 그래프이다. 여기에서, 'NC siRNA/SF-hMSCs/TW'는 'STK2에서 배양한 hMSCs에 Negative Control siRNA를 트랜스펙션한 경우의 시험 결과'를 나타낸다. 'TSG-6 siRNA/SF-MSCs/TW'는 'STK2에서 배양한 hMSCs에 TSG-6 siRNA를 트랜스펙션한 경우의 시험 결과'를 나타낸다. TSG-6 siRNA/SF-MSCs/TW는, NC siRNA/SF-hMSCs/TW와 비교해 유의미한 차이는 인정되지 않았다. 즉, STK2를 이용해 배양한 MSCs는, 대식세포를 Pro-inflammatory phenotype(M1)으로부터 Immune-regulatory phenotype(M2)으로 변화시킨다. 그러나, STK2에 의해 발현 레벨이 상승하는 TSG-6은 이 변화에 관여하지 않는 것이 시사되었다.
전술한 방법과 마찬가지로, Negative Control siRNA를 시행한 hMSCs 및 TSG-6 siRNA를 시행한 hMSCs를 배양하고 있는 배지를 FBS 무첨가의 DMEM 배지로 교환한 후, 48시간 배양한 것(이하, 순화 배지(conditioned medium)라고 한다)을 이하의 실험에 이용했다.
HK-2 세포를 6 well dish에 1×105 cells/well로 파종해, 18시간 후 서브컨플루언트가 된 것을 확인하고, 배지를 상기 순화 배지로 교환했다. 24시간 후에 10 ng/㎖ recombinant human TGF-β1(R＆D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 첨가하고, 12시간 후에 mRNA를 채취했다. 그 후, TGF-β1에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 MCP-1, 및 TNF-α의 mRNA 발현을, RT-PCR을 이용해 검토했다.
도 19의 (A)는 MCP-1의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. 또한, 도 19의 (B)는 TNF-α의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. TGF-β1에 의해, HK-2 cells의 MCP-1 및 TNF-α의 mRNA 발현 레벨은 상승했다. 여기에서, 'DMEM'는 'TGF-β1을 첨가한 DMEM중에서 배양된 경우의 시험 결과'를 나타낸다. 또한, 'NC siRNA SF-hHMCs-CM'은, 'Negative Control siRNA를 시행한 hMSCs를 함유하는 배양액에서 배양한 경우의 시험 결과'를 나타낸다. 또한, 'TSG-6 siRNA SF hMSCs-CM'는, 'TSG-6 siRNA를 시행한 hMSCs를 함유하는 배양액에서 배양한 경우의 시험 결과'를 나타낸다. NC siRNA SF-hHMCs-CM군에서는, MCP-1 및 TNF-α의 mRNA 레벨이 유의미하게 억제되고 있었다. 한편, TSG-6 siRNA SF hMSCs-CM군에서는, MCP-1 및 TNF-α의 mRNA 발현 억제 효과가 유의미하게 감쇠하고 있었다. 즉, STK2에서 배양한 MSCs에서 고발현하는 TSG-6을 녹다운 하면, TGF-β1의 첨가에 의해 유도되는 염증성 사이토카인의 억제 효과가 감쇠하는 것이 시사되었다. 본 실시예의 결과로부터, 무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포는 TSG-6의 발현에 의해 염증을 억제하는 작용이 현저히 높아, 약제로서 이용하기에 충분하다는 것이 밝혀졌다.
(실시예 6)
Sprague Dawley 래트(6∼7주령)의 대퇴골 또는 경골의 골수로부터 채취한 MSCs를, 무혈청 배지(STK1 또는 STK2)에서 단리하고 배양해 증식시켜, 무혈청 배지 배양 MSCs(이후 SF-MSCs라고도 한다)를 얻었다. 그 MCSs에 Negative Control siRNA, 또는 TSG-6 siRNA(각 20 nM)를 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 후의 세포를, 제작 4일 후의 래트 일측성 요세관 결찰 모델의 꼬리 정맥에 투여했다. 여기에서, 상기 Negative Control siRNA를 트랜스펙션한 SF-MSCs를 투여한 군, TSG-6 siRNA를 트랜스펙션한 SF-MSCs를 투여한 군, 또는 PBS만을 투여한 군, 요세관의 결찰을 실시하지 않은 대조군을 각 5군씩 준비했다. 일측성 요세관 결찰술로부터 10일 후에 각 군의 래트를 도살하고 신장을 적출해, TSG-6의 항염증 효과에 대해 확인했다.
도 20은 TSG-6의 mRNA 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. 래트 MSCs에서도 인간 MSCs와 마찬가지로, 혈청 함유 배지에서 배양한 MSCs(10% MSCs)와 비교해, SF-MSCs에서의 TSG-6의 mRNA 레벨은 유의미하게 상승하고 있었다. Negative Control siRNA를 시행한 SF-MSCs와 비교해, TSG-6 siRNA를 시행한 SF-MSCs에서는 TSG-6의 mRNA 레벨이 유의미하게 감쇠하고 있는 것으로부터, TSG-6 siRNA의 녹다운 효과가 확인되었다.
도 21의 (A)는 웨스턴 블롯법에 의한 TGF-β1 또는 α-SMA의 검출 결과를 나타낸 상이다. 또한, (B)는 TGF-β1 및 α-SMA의 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. 한편, (B)의 시험 결과는 'n=5, *: P＜0.05, ＃P＜0.01'의 조건하에서 얻어진 것이다. TGF-β1 및 α-SMA 단백질의 발현 레벨은 PBS군에서 가장 높았다. 또한, NC siRNA/SF-MSCs를 투여한 군에서는, TGF-β1 및 α-SMA 단백질의 발현 레벨이 유의미하게 저하되고 있었다. 한편, NC siRNA/SF-MSCs를 투여한 군에 비해, TSG-6을 녹다운한 TSG-6 siRNA/SF-MSCs를 투여한 군에서는, TGF-β1 및 α-SMA 단백질의 발현 레벨이 높았다. 즉, TSG-6을 녹다운한 경우, TGF-β1 및 α-SMA 단백질의 발현 억제 효과가 유의미하게 감쇠하는 것을 알 수 있었다.
도 22의 (A)는 CD68의 면역 염색 결과의 상이다. 또한, 도 22의 (B)는 CD68을 발현하고 있는 세포의 수를 나타낸 그래프이다. 각 군의 CD68 양성 세포수는 PBS군에서 가장 많았다. 또한, NC siRNA/SF-MSCs군에서는, CD68 양성 세포수에 유의미한 감소가 인정되었다. NC siRNA/SF-MSCs군과 비교해, TSG-6 siRNA/SF-MSCs군에서는 CD68 양성 세포의 유의미한 증가가 인정되었다.
무혈청 배지중에서 배양된 간엽계 줄기세포의 항염증 작용 및 항섬유화 작용에, 염증을 조기에 진정시킬 수 있는 TSG-6이 관여하고 있는 것이 밝혀졌다.
(실시예 7)
간장의 섬유화가 진행됨에 따라, 간조직중에는 콜라겐을 주성분으로 하는 세포외 매트릭스가 과잉 침착되어, 그 종말상(終末像)으로서 간장의 섬유화(예를 들면, 간경변, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 비알코올성 지방간염)에 이른다. 본 실시예에 있어서는, 무혈청 배지에서 배양한 간엽계 줄기세포의 이식에 의한 간장의 섬유화(예를 들면, 간경변, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 비알코올성 지방간염)의 억제 효과에 관한 검토를 실시했다.
＜방법: 세포의 채취 및 배양＞
본 시험에 있어서, Sprague Dawley 래트(7주령, 수컷)의 대퇴골 또는 경골로부터, 실시예 1의 기재와 같은 방법으로, 간엽계 줄기세포를 채취하고, 당해 간엽계 줄기세포를 배양 및 계대했다.
＜방법: 질환 모델의 제작＞
간장의 섬유화 모델로서, 일반적인 사염화탄소를 이용한 모델 래트를 제작했다.
본 시험에서는, Sprague Dawley 래트(5주령, 수컷)를 1주간 순화한 후에, 6주령째부터, 당해 래트에 대해 질환 유도제(질환 유도 물질:사염화탄소(40 w/w%), 용매: 콘 오일)를 5주간에 걸쳐 총 10회 복강내 투여했다.
각각의 주에서 질환 유도제를 투여하는 타이밍은, 일정한 간격을 두고 매주 2회씩 실시했다(예를 들면, 제1주째에는 Day 0 및 Day 2의 2회, 제5주째에는 Day 28 및 Day 31의 2회).
각 회의 질환 유도제의 투여량은, 각 개체의 체중에 기초해 규격화한 양(2 ㎖/kg)으로 했다. 한편, 날짜 기산의 기점이 되는 날(즉, Day 0)은 질환 유도제의 첫회 투여일로 했다. 상기 질환 유도를 실시한 군을 이하에서는 '질환 유도군'이라 칭한다. 또한, 상기 간장의 섬유화 모델의 음성 대조로서, 상기와 같은 타임 코스 및 투여량으로 질환 유도 물질을 함유하지 않는 용매만을 Sprague Dawley 래트에게 투여한 '건강군'을 별도로 마련했다.
＜방법: 약제의 투여＞
상기 질환 모델인 '질환 유도군'에 대해, 질환 유도제의 최종 투여를 실시한 날(Day 31)의 다음날(Day 32)에 부분 채혈을 실시했다.
그 때, 아스파라긴산 아미노기 전이 효소(AST)의 값, 및, 체중의 값이 균일하게 되도록 래트를 추출해, 당해 래트를 '질환 유도군'으로 하였다.
상기 '질환 유도군'에 속하는 동물들을 'STK군'(n=5), '유혈청군'(n=8) 및 '위약군'(n=11)의 3군으로 나누었다. 이후, 'STK군' 및 '유혈청군'을 총칭해 '세포 투여군'이라고 칭한다.
Day 33에, 'STK군'의 동물에 대해서는 STK1 및 STK2를 이용해 실시예 1의 방법으로 배양한 간엽계 줄기세포를, '유혈청군'의 동물에 대해서는 실시예 1의 방법으로 10% 소태아 혈청 함유 DMEM 배지를 이용해 배양한 간엽계 줄기세포를, 꼬리 정맥에 정맥 주사했다.
'세포 투여군'에 대해서는, 세포를 인산 완충 생리 식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)중에 2×106 cells/㎖의 농도로 현탁하고, 당해 현탁액을 500 ㎕/래트로 투여(따라서, 각 래트에게 투여된 세포수는 1×106 cells이다)했다.
'위약군'의 동물에 대해서는, 위약(PBS만)을 500 ㎕/래트로 마찬가지로 투여했다. 모든 투여는 통상의 방법으로 래트를 움직이지 않게 한 상태에서 몇 초 이내에 행해졌다. 한편, '건강군'에 있어서는, 세포 및 위약의 어느 것도 투여하지 않았다.
＜방법: 도살 및 샘플링＞
약제 투여 후, 2주간의 관찰 기간을 거친 후의 Day 47에, 전체 군에 대해 이소플루란 마취하에서 도살(방혈 안락사) 및 샘플링을 실시했다. 샘플링에 있어서는, 조직학적 평가에 제공하는 간장의 내측엽 및 외측 좌엽 외에, 생화학적 검사에 제공하는 혈액 검체를 채취(전채혈)했다. 채취한 간장의 내측엽 및 외측 좌엽을 포르말린에 의해 고정한 후, 파라핀 블록으로 만들었다. 그 후, 파라핀 블록을 얇게 잘라 시리우스 레드 염색 표본을 제작했다.
＜결과: 행동 관찰＞
'질환 유도군'에서는, Day 0으로부터 Day 31까지의 질환 유도제의 투여 기간에 걸쳐, 질환 유도제 투여 직후에는 매회 웅크림이 전 개체에서 보여지는 등, 본 질환 유도제의 투여에 수반해 상정될 수 있는 관찰 소견이 보여졌다. '건강군'에서는, 그와 같은 관찰 소견은 인정되지 않았다. '세포 투여군'에 있어서는, 세포 투여 후 2주간에 걸친 평가 기간에서, 세포 치료에서 고려해야 할 어떤 이상 소견(예를 들면, 거절반응 등)도 인정되지 않았다.
＜결과: 체중의 추이＞
첫회 투여일(Day 0)부터 도살을 실시한 날(Day 47)에 이를 때까지의 각 군의 체중의 추이는, 도 23에 나타낸 바와 같다. 한편, 도 23 및 후술하는 도 24∼도 26에 있어서, (a)는 '건강군'의 시험 결과이고, (b)는 '위약군'의 시험 결과이고, (c)는 '유혈청군'의 시험 결과이고, (d)는 'STK군'의 시험 결과이다.
질환 유도제의 첫회 투여일(Day 0)에서, 건강군도 포함하여 각 군의 평균 체중은 동일했다. Day 33에서는, '건강군' 이외의 각 군의 체중이 동일하게 되도록 군을 나누었다. 세포 투여 후의 2주간의 관찰 기간에서, 각 군의 체중은 'STK군'='건강군'＞'유혈청군'='위약군'이 되었다.
일반적으로, 사염화탄소를 이용한 모델 래트에 있어서는, 통상의 사육에 비해 체중이 감소하는 경향을 나타낸다. 'STK군'의 체중과 '건강군'의 체중이 대략 동일한 것은, '세포 투여군'(특히, 'STK군')에서 전신적인 건강 상태의 회복이 강한 것을 나타내고 있다.
＜결과: 생화학적 검사＞
Day 47의 혈액 검체로부터 혈청을 분리했다. 이하, 'AST'는 아스파라긴산 아미노기 전이효소를, 'LDH'는 락트산 탈수소효소를, 'γ-GTP'는 γ-글루타밀트랜스 팹티다아제를 나타낸다.
'LDH' 및 'γ-GTP'에 대해서는, '세포 투여군'(특히 'STK군')에서 '건강군'과 동등 혹은 그 이하의 값으로 개선되어 있었다. 한편, '건강군'에 있어서는, 용매(즉, 콘 오일)의 투여에 의해, 동효소 활성치가 정상치보다 증가 경향을 나타내고 있었다.
AST: 'STK군'(n=5), '유혈청군'(n=8) 및 '위약군'(n=11) 모두, 군을 나누었을 때(Day 32)의 값과 비교해, 'AST'의 값이 유의미하게 저하되었다(P＜0.01). '질환 유도군'의 전체 군에서, Day 47의 혈액 검체에서의 'AST'의 값은 '건강군'과 차이가 인정되지 않고, 정상치의 범위까지 저하되어 있었다.
LDH: Day 47에서의 'LDH'의 값만 측정했다. 각 군에서의 'LDH'의 평균치는, 'STK군'(946.2 U/L), '유혈청군'(1086.4 U/L), '위약군'(1027.9 U/L), '건강군'(852.7 U/L)로(도 24 참조), 'STK군'에서는 '유혈청군' 및 '위약군'보다 'LDH'의 값이 저하되었다.
γ-GTP: Day 47에서의 'γ-GTP'의 값만 측정했다. 각 군에서의 'γ-GTP'의 평균치는, 'STK군'(0.9 U/L), '유혈청군'(1.09 U/L), '위약군'(1.26 U/L), '건강군'(1.16 U/L)로, 'STK군'에서는 '유혈청군' 및 '위약군'보다 'γ-GTP'의 값이 저하되었다(도 25 참조).
＜결과: 조직학적 평가＞
시리우스 레드 염색 표본에 있어서, 각 개체의 각 엽(내측엽 및 외측 좌엽의 각각)에 대해, 중심 정맥을 중심으로 하여 3시야(각 개체별 6 시야(=2엽×3시야))의 현미화상을 촬상해(대물렌즈 10배), 화상 해석 장치로 섬유화 면적을 산출했다.
시리우스 레드 염색상에서, 섬유성 콜라겐이 침착된 부위는 적색으로 착색된다(도 26의 (a)∼(d)의 흑백 화상에서는, 검은 선상의 부위가 적색으로 착색된 부위에 상당한다). 이들 화상에 대해, 각 시야의 섬유화율((섬유화 면적/시야의 면적)×100)을 구했다.
도 26의 (a)에 '건강군', 도 26의 (b)에 '위약군', 도 26의 (c)에 '유혈청군', 도 26의 (d)에 'STK군'의 시리우스 레드 염색의 상을 나타낸다. 각각의 화상에서, 섬유화율은 각각 '건강군'(1.1%), '위약군'(4.4%), 'STK군'(1.1%), '유혈청군'(2.4%)로, 'STK군'은 '위약군' 및 '유혈청군'보다 섬유화율이 낮았다(도 26 참조).
＜총괄＞
본 실시예에 있어서, 'STK군'에서는 세포 투여 후에, 거절반응 등의 세포 치료에서 고려해야 할 이상 소견은 인정되지 않았다. 그러므로, 본 발명의 수복제는 안전성이 높다고 생각된다.
본 실시예에서는 전체적으로 염증이 낮았음에도 불구하고, 'STK군'에서는 'LDH' 및 'γ-GTP'의 값이 저하되고 있었다. 또한, 각 군의 체중은 'STK군'='건강군'＞'유혈청군'='위약군'으로, 'STK군'은 '건강군'에 가까운 체중까지 회복되었다. 이들로부터, 'STK군'에서는 간장의 염증이 억제되어, 전신적인 건강 상태가 회복된 것이 나타났다.
본 발명은 생체 조직 손상의 회복을 목적하는 재생 의료에 바람직하게 이용 가능하다.

Claims (19)

  1. 무혈청 배지 중에서 배양된 간엽계 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 손상의 수복제로서,
    상기 생체 조직 손상은 간경변, 바이러스성 간염, 알코올성 간염 또는 비알코올성 지방간염에 수반하는 조직 손상이고,
    상기 무혈청 배지는, FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 것인, 수복제.
  2. 제1항에 있어서,
    생체 조직의 섬유화를 억제하기 위한 것인, 수복제.
  3. 제1항에 있어서,
    염증 세포의 침윤을 억제하기 위한 것인, 수복제.
  4. 제1항에 있어서,
    대식세포의 활성을 제어하기 위한 것인, 수복제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 간엽계 줄기세포는, 스크리닝된 종양형성능을 갖지 않는 간엽계 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 수복제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 간엽계 줄기세포는, 적어도 1회 계대된 것인, 수복제.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 계대에서는, 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하지 않는 세포 박리제를 이용해 상기 간엽계 줄기세포를 박리하는 것을 특징으로 하는, 수복제.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 간엽계 줄기세포는, 당해 간엽계 줄기세포의 배양에 적합한 배양 용기를 이용해 배양된 것을 특징으로 하는, 수복제.
  9. 무혈청 배지 중에서 간엽계 줄기세포를 배양하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 손상 수복제의 제조 방법으로서,
    상기 생체 조직 손상은 간경변, 바이러스성 간염, 알코올성 간염 또는 비알코올성 지방간염에 수반하는 조직 손상이고,
    상기 무혈청 배지는, FGF, PDGF, EGF, 적어도 1개의 인지질 및 적어도 1개의 지방산을 함유하는 것인, 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 배양하는 공정 이후에, 종양형성능을 갖지 않는 간엽계 줄기세포를 스크리닝하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 배양하는 공정에서는, 간엽계 줄기세포를 적어도 1회 계대하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 계대에서는, 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하지 않는 세포 박리제를 이용해 상기 간엽계 줄기세포를 박리하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양하는 공정에서는, 상기 간엽계 줄기세포의 배양에 적합한 배양 용기를 이용해 당해 간엽계 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017388339B2 (en) * 2016-12-28 2024-02-29 Hiroshima University Repair agent for living tissue damage and method for producing said repair agent
EP3591037A4 (en) * 2017-03-03 2020-11-11 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. MESENCHYMATIC STEM CELL AND THERAPEUTIC AGENT AGAINST LIVER DISEASES
EP4035670A4 (en) * 2019-09-26 2023-11-08 Two Cells Co., Ltd METHOD FOR PRODUCING A REPAIR AGENT FOR BIOLOGICAL TISSUE DAMAGE AND REPAIR AGENT FOR BIOLOGICAL TISSUE DAMAGE
CN111297899A (zh) * 2020-02-21 2020-06-19 云南雅盛医疗科技有限公司 一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用
CN111454891A (zh) * 2020-03-11 2020-07-28 杭州原生生物科技有限公司 一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用
JP2023524150A (ja) * 2020-05-07 2023-06-08 シンテラ エービー 呼吸器疾患治療のための幹細胞
TWI818286B (zh) * 2020-07-17 2023-10-11 南韓商Ｌｇ化學股份有限公司 包括表現腫瘤壞死因子可誘導基因６的間葉幹細胞之組成物及藥物組成物
CN112826833A (zh) * 2020-07-30 2021-05-25 中国人民解放军总医院第五医学中心 间充质干细胞在制备新冠肺炎引起的肺损伤修复药物中的应用
CN115867296A (zh) * 2020-09-03 2023-03-28 智再如股份有限公司 中枢神经疾病治疗用组合物、中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法以及中枢神经疾病治疗用制剂的制造方法
WO2022259721A1 (ja) * 2021-06-10 2022-12-15 味の素株式会社 間葉系幹細胞の製造方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4791113B2 (ja) * 2005-09-12 2011-10-12 オンセミコンダクター・トレーディング・リミテッド 半導体装置
JP4385076B2 (ja) * 2006-01-13 2009-12-16 独立行政法人科学技術振興機構 動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤、キット及びこれらの利用
US10046011B2 (en) * 2008-01-31 2018-08-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions for inducing or suppressing an immune response
EP3029061B1 (en) * 2008-06-18 2017-09-13 The Texas A&M University System Mesenchymal stem cells, compositions, and methods for treatment of cardiac tissue damage
CN102791276B (zh) 2010-03-10 2015-03-04 智再如股份有限公司 含有间充质干细胞的细胞制品及其制造方法
JP5993113B2 (ja) * 2011-01-31 2016-09-14 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ アルツハイマー病治療に向けたヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞
CN102925409B (zh) * 2012-11-19 2014-07-02 上海市第六人民医院 尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法和应用
KR101669124B1 (ko) * 2013-07-11 2016-10-25 서울대학교병원 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및 치료용 조성물
JP6191694B2 (ja) * 2013-08-01 2017-09-06 株式会社ツーセル 軟骨損傷治療剤及びその製造方法
CN103550117A (zh) * 2013-10-18 2014-02-05 上海润生生物技术有限公司 可促进皮肤修复与再生的美容护肤品及其制备方法和应用
US11000694B2 (en) * 2014-10-24 2021-05-11 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Use of lasers for treating and reversing fibrosis
CN104666347B (zh) * 2015-02-28 2019-08-09 广州医科大学附属第一医院 脐带间充质干细胞在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用
AU2017388339B2 (en) * 2016-12-28 2024-02-29 Hiroshima University Repair agent for living tissue damage and method for producing said repair agent

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2014 年度 ?究成果報告書, "各種腎?疾患における無血?培地を用いた間葉系幹細胞の治療?果：臨床?用を目指して" (2016. 6. 3. 공개)*
Sihyung Wang 외, "Tumor necrosis factor-inducible gene 6 promotes liver regeneration in mice with acute liver injury", Stem Cell Research & Therapy, 제6권, 논문번호 20 (2015년 공개)*

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