CN111454891A - 一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用 - Google Patents

一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111454891A
CN111454891A CN202010164823.3A CN202010164823A CN111454891A CN 111454891 A CN111454891 A CN 111454891A CN 202010164823 A CN202010164823 A CN 202010164823A CN 111454891 A CN111454891 A CN 111454891A
Authority
CN
China
Prior art keywords
embryonic stem
cells
cell
stem cell
embryoid body
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010164823.3A
Other languages
English (en)
Inventor
曹哲厚
韦俊
王雪
郑海刚
吴立前
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Yuansheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Yuansheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Yuansheng Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Yuansheng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010164823.3A priority Critical patent/CN111454891A/zh
Publication of CN111454891A publication Critical patent/CN111454891A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用，属于生物技术领域。解决了现有分化得到的hESC‑MSCs纯度不高等问题。一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：将胚胎干细胞用EDTA在培养箱中消化，再加入PBS中止消化，得到胚胎干细胞悬浮液，并将胚胎干细胞悬浮液中的胚胎干细胞分散成单个细胞，将分散后悬浮液离心；弃去步骤S01中离心后的液体的上清液，加入PBS重悬细胞，取PBS重悬细胞液离心；弃去步骤S02中离心后的液体的上清液，加入拟胚体培养液，再次重悬细胞，将重悬细胞液加入经过预处理的拟胚体培养孔板中，经离心后放入培养箱中培养，培养得到拟胚体；拟胚体在MSC分化培养基中贴壁培养10天后就可获得hESC‑MSC。本发明具有分化所需时间短，可快速获得hESC‑MSCs等优点。

Description

一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。按照发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来自囊胚期的内细胞团，具有无限增殖和三胚层分化潜能。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是属于中胚层的一类多潜能干细胞，是最具代表性的成体干细胞之一，主要存在于结缔组织和器官间质中，如骨髓、脂肪、脐带、羊膜组织，间充质干细胞具有强大的增殖能力和免疫调节功能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。间充质干细胞由于具备多向分化和免疫调节功能，因此在治疗一些退行性和自身免疫性疾病等方面具有广阔的临床应用前景。国际干细胞协会对人MSCs的鉴定做了规定，要求满足以下几点。(1)MSCs在标准培养条件下能贴壁生长；(2)MSCs表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD14、CD34、HLA-DR、CD79a，其中CD105、CD73、CD90的阳性率应≥95％，其他阴性标志物的阳性率应≤2％；(3)MSCs在体外能向成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞分化。
MSCs可以从骨髓、脂肪组织、外周血和脐带血等不同的组织和器官里分离得到。从骨髓可以分离到较多的MSCs，但是需要通过做手术才能获得，脂肪组织、外周血和脐带血方便获得，但是分离出的MSCs数量偏少，同时也会受到供体疾病、体质、年龄的影响，质量不可靠，数量也有限。因此从这些组织和器官分离MSCs并不是高效的方式。将人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)诱导分化为间充质干细胞(MSCs)，即人胚胎干细胞源性的间充质干细胞(human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells,hESC-MSCs)。hESC-MSCs与成体MSCs具有相似的生物学特性和功能，来源丰富，不产生畸胎瘤，均一性好。hESC-MSCs结合了hESCs和成体MSCs的优点，为临床应用提供了充足的MSCs来源。
目前hESC-MSCs的诱导方法主要有三种：拟胚体诱导法、饲养层法及培养基直接诱导法。拟胚体诱导法是hESCs诱导分化的经典途径，通过拟胚体的形成启动分化过程，进而诱导获得MSCs。然而，由于拟胚体内部分化不均一，导致MSCs的纯化过程较长。饲养层法是将骨髓基质细胞系作为饲养层，诱导获得MSCs细胞，然而，在诱导过程中，由于诱导MSCs与基质细胞具有类似的形态，因此分化过程不易观察，获得的细胞需通过流式细胞进行分选纯化，增加了细胞的损失和实验步骤，且获得的细胞容易被动物源性成分污染，不利于hESC-MSCs的后期应用。培养基直接诱导法步骤简单，可避免由于饲养层细胞的使用导致的细胞污染问题。然而，该诱导方法中血清浓度较高，不能很好地抑制其他成纤维样细胞的分化，初始获得的MSCs纯度不高，需通过数次传代或流式分选进行纯化，延长了诱导时间(1-2个月)。因此，迫切需要能够制备安全的、稳定的、具有高诱导效率的hESC-MSCs的制备方法。
急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指在严重感染、休克、创伤及烧伤等非心源性疾病过程中，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成的弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致出现急性低氧性呼吸功能不全或衰竭，主要以肺容积减少、肺顺应性降低、严重的通气\/血流比例失调为病理生理特征，临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，肺部影像学上表现为非均一性的渗出性病变。目前的治疗方法包括机械通气治疗和辅助的抢救治疗，比如给予气管插管，呼吸机辅助呼吸或者给予无创呼吸机进行呼吸辅助治疗，同时还可以给予肺泡表面活性物质补充，对于β受体激动剂进行治疗，还可给予糖皮质激素进行抗炎治疗。体外膜肺氧合(ECMO)治疗适用于最严重ARDS其他治疗方式无效的患者，完全通过机器代替心脏和肺，使肺、心脏得到休息。但是这些治疗方式会给病人带来额外的痛苦，仅能缓解病情，治标不治本。
发明内容
本发明的第一个目的是为了克服现有技术的不足，提供一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法；本发明的第二个目的是提供一种采用上述制备方法制备得到的人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的的应用。
本发明的第一个目的可通过下列技术方案来实现：一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S01：将胚胎干细胞用EDTA在培养箱中消化，再加入PBS中止消化，得到胚胎干细胞悬浮液，并将胚胎干细胞悬浮液中的胚胎干细胞分散成单个细胞，将分散后悬浮液离心；
S02：弃去步骤S01中离心后的液体的上清液，加入PBS重悬细胞，取PBS重悬细胞液离心；
S03：弃去步骤S02中离心后的液体的上清液，加入拟胚体培养液，再次重悬细胞，将重悬细胞液加入经过预处理的拟胚体培养孔板中，经离心后放入培养箱中培养，培养得到拟胚体；
S04：将拟胚体接种在细胞培养皿中，使用间充质干细胞分化培养液培养，分化得到人胚胎干细胞源性的间充质干细胞。
优选地，步骤S01中，消化时间为5分钟，加入PBS的体积为EDTA体积的2-5倍，使用移液器吹打胚胎干细胞悬浮液，使胚胎干细胞分散成单个细胞，然后将分散后悬浮液加入离心管中，300g离心3分钟。
优选地，步骤S02中，加入PBS重悬细胞后，取含有300-600万个细胞的PBS重悬细胞液于离心管中，300g离心3分钟。
优选地，步骤S03中，加入拟胚体培养液后用移液器重悬细胞，将重悬细胞液加入经过预处理的拟胚体培养孔板中，100g离心3分钟，然后放入培养箱中培养，将得到的拟胚体取出放入超低吸附多孔板中继续培养，之后每2天更换一次拟胚体培养液。
优选地，所述的培养箱为37℃二氧化碳培养箱。
优选地，拟胚体培养孔板预处理的步骤如下：往拟胚体培养孔板中每孔加入防粘冲洗液，1000g离心3分钟，然后弃掉防粘冲洗液，每孔加预热后的拟胚体培养液，吹吸后弃掉，然后每孔再加入拟胚体培养液，放入37℃二氧化碳培养箱备用。
优选地，步骤S03中，所述的拟胚体培养液含有DMEM、KSR、L-谷氨酰胺、NEAA、beta-巯基乙醇和Y-27632。
优选地，步骤S04中，将拟胚体接种在细胞培养皿中，使用间充质干细胞分化培养液培养，每两天换液一次；培养得到人胚胎干细胞源性的间充质干细胞。
优选地，还包括步骤S05，S05：当细胞培养皿内，细胞汇合度达到80％以上，进行传代培养，之后的每次传代，当细胞汇合度达到80％以上时，再次传代。
本发明的第二个目的可通过下列技术方案来实现；一种采用上述制备方法得到的人胚胎干细胞源性的间充质干细胞在治疗急性呼吸窘迫综合征中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明采用了将胚胎干细胞(ESC)制作成拟胚体，且得到拟胚体均一性高，再由均一拟胚体分化得到hESC-MSCs，分化速度快、所需时间短，可快速获得hESC-MSCs。
2.本发明得到的hESC-MSCs纯度高，在低代次即可获得高纯度细胞。
3.本发明避免了使用抗体标记以及流式细胞仪进行纯化，节约了时间和成本。
4.本发明得到的hESC-MSCs可以用来治疗ARDS及其他炎症疾病。
5.本发明获得的hESC-MSCs具有多分化潜能，具有向成脂、成骨和成软骨细胞分化的潜能。
附图说明
图1是本发明hESC-MSCs分化示意图；
图2是本发明获得的拟胚体显微镜下的示意图；
图3是本发明hESC-MSCs分化各阶段形态示意图；
图4是本发明hESC-MSCs阳性蛋白标志物CD73检测结果图；
图5是本发明hESC-MSCs阳性蛋白标志物CD90检测结果图；
图6是本发明hESC-MSCs阳性蛋白标志物CD105检测结果图；
图7是本发明hESC-MSCs阴性蛋白标志物CD34检测结果图；
图8是本发明hESC-MSCs阴性蛋白标志物CD45检测结果图；
图9是本发明hESC-MSCs阴性蛋白标志物HLA-DR检测结果图；
图10是本发明hESC-MSCs阴性蛋白标志物CD14检测结果图；
图11是本发明hESC-MSCs阴性蛋白标志物CD79a检测结果图；
图12是本发明hESC-MSCs向脂肪细胞分化的示意图；
图13是本发明hESC-MSCs向成骨细胞分化的示意图；
图14是本发明hESC-MSCs向软骨细胞分化的示意图；
图15是本发明48h时，对照组和治疗组的炎性因子IL-6浓度对比图；
图16是本发明48h时，对照组和治疗组的抗炎因子IL-10浓度对比图；
图17是本发明48h时，对照组和治疗组中性粒细胞数量对比图；
图18是本发明48h时，对照组和治疗组巨噬细胞数量对比图；
图19是本发明鼠尾静脉注射PBS 24小时以后，肺组织切片染色结果图；
图20是本发明鼠尾静脉注射hESC-MSCs 24小时以后，肺组织切片染色结果图；
图21是本发明鼠尾静脉注射PBS 48小时以后，肺组织切片染色结果图；
图22是本发明鼠尾静脉注射hESC-MSCs 48小时以后，肺组织切片染色结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
实施例1
如图1所示，图1为hESC-MSCs分化示意图。
拟胚体(EB)制作：
1.往拟胚体培养孔板中每孔加入0.5ml Anti-Adherence Rinsing Solution溶液(防粘冲洗液，从市场上购买)，离心1000g，5min，然后弃掉Anti-AdherenceRinsingSolution溶液，每孔加1ml预热后的EB培养液(预热至37℃)，吹吸后弃掉，然后每孔再加入1ml预热后的EB培养液，放入37℃二氧化碳培养箱(二氧化碳的体积分数为5％)备用。
2.将胚胎干细胞(ESC)用EDTA(乙二胺四乙酸)在37℃二氧化碳培养箱消化5分钟后，加入2-5倍EDTA体积的PBS(磷酸缓冲盐溶液)中止消化，得到ESC悬液，使用1ml移液器吹打ESC悬液，使ESC分散成单细胞，将单细胞悬液加入15ml离心管中，300g离心3分钟；弃上清，加入1ml PBS重悬细胞，取20微升细胞悬液在细胞计数仪上计数；根据计数结果，取300-600万细胞于15ml离心管中，300g离心3分钟；弃上清，加入1ml拟胚体(EB)培养液(DMEM+KSR+L-glutamine+NEAA+beta-mercaptoethnol+Y-27632)，用1ml移液器重悬细胞，加入经过步骤1预处理后的备用的拟胚体培养孔板中(拟胚体培养孔板即底部含有微孔的Aggrewell孔板)，100g离心3分钟，放入二氧化碳培养箱中培养；
3.第2天将形成的拟胚体(EB)取出放到超低吸附6孔板中，培养2天后，更换EB培养液。
本发明得到的拟胚体(EB)如图2所示，得到均一的拟胚体。
本发明的EB培养液中是DMEM培养基、KSR培养基、L-glutamine(L-谷氨酰胺)、NEAA(非必须氨基酸)、b-mercaptoethnol(beta-巯基乙醇)、Y-27632(一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂)的混合。各组分均可以从市场上购买得到。
EB-MSCs分化：
(1)将EB接种在细胞培养皿中，使用间充质干细胞分化培养液(MSCs分化培养液组分：90％DMEM+10％FBS)培养，记为第0天，每两天换液一次；约10天后，有大量的hESC-MSCs从EB周围爬出，培养皿内细胞汇合度达到80％以上；(hESC-MSCs分化各阶段形态如图3所示。)
(2)将hESC-MSCs细胞传代至新的T75培养瓶中，此时细胞为P(-1)代次，用MSCs分化培养液培养；待细胞汇合度达到80％以上时，再次传代，此时为P0代次，用MSCs维持培养液(从市场上购买)培养；
(3)P0代次细胞汇合度达80％以上时，使用流式细胞仪鉴定hESC-MSCs的纯度。检测hESC-MSCs的阳性表面蛋白CD73、CD90，CD105和阴性表面蛋白CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR的比率。检测结果如图4-11所示。
如图4-6所示，hESC-MSCs阳性蛋白标志物CD73，CD90和CD105的比例均大于99％，表明本发明获得的阳性细胞纯度很高。
如图7-11所示，hESC-MSCs阴性蛋白标志物CD34，CD45,CD14,CD79a和HLA-DR的比例均小于1％，表明本发明获得的细胞中非MSCs细胞极少。
图12-14所示，图12-14是分化后的三种不同细胞的染色，代表hESC-MSCs具有向脂肪(图12)、成骨(图13)和软骨(图14)细胞分化的潜能。
hESC-MSCs治疗ARDS的动物实验
采用8周C57BL/6雄鼠，LPS(80uL 30mg/kg)气管内滴注，建立ARDS模型，建模后4h尾静脉注射hESC-MSCs(0.3million cell in 400uL PBS)，对照组尾静脉注射等量的PBS。实验中从不同组别的动物中取肺泡灌洗液(BALF)样本和全肺做组织切片染色。BALF样本用酶联免疫法定量检测炎性因子IL-6和抗炎因子IL-10浓度，并分别做中性粒细胞、巨噬细胞计数。图15-18、21-22为尾静脉注射48小时后的数据，图19-20为尾静脉注射24小时后的数据。
如图15-16所示，48h时，对照组的炎性因子IL-6浓度显著高于治疗组，而对照组的抗炎因子IL-10浓度显著低于治疗组。
如图17-18所示，48h时，对照组中性粒细胞计数显著高于治疗组，而对照组巨噬细胞技术显著低于治疗组。实验说明48h起hESC-MSCs对于肺部炎症已经开始起到抑制作用。
如图19-22所示，为肺组织切片染色结果，图19-尾静脉注射PBS 24小时以后，图20-尾静脉注射hESC-MSCs24小时以后，图21-尾静脉注射PBS 48小时以后，图22-尾静脉注射hESC-MSCs 48小时以后。24h起，对照组和治疗组均有一定程度的肺部损伤，对照组的损伤程度略高于治疗组。而到48h时，对照组因肺部炎症未得到及时控制，导致肺部泡上皮-内皮屏障进一步损伤，肺泡结构受损，肺部充血积液情况加重，而治疗组因及时控制过度炎性反应，hESC-MSCs对肺部组织起到较好的保护作用，进而治疗组的肺部结构相对完好，未发生进一步肺部损伤。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S01：将胚胎干细胞用EDTA在培养箱中消化，再加入PBS中止消化，得到胚胎干细胞悬浮液，并将胚胎干细胞悬浮液中的胚胎干细胞分散成单个细胞，将分散后悬浮液离心；
S02：弃去步骤S01中离心后的液体的上清液，加入PBS重悬细胞，取PBS重悬细胞液离心；
S03：弃去步骤S02中离心后的液体的上清液，加入拟胚体培养液，再次重悬细胞，将重悬细胞液加入经过预处理的拟胚体培养孔板中，经离心后放入培养箱中培养，培养得到拟胚体；
S04：将拟胚体接种在细胞培养皿中，使用间充质干细胞分化培养液培养，分化得到人胚胎干细胞源性的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S01中，消化时间为5分钟，加入PBS的体积为EDTA体积的2-5倍，使用移液器吹打胚胎干细胞悬浮液，使胚胎干细胞分散成单个细胞，然后将分散后悬浮液加入离心管中，300g离心3分钟。
3.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S02中，加入PBS重悬细胞后，取含有300-600万个细胞的PBS重悬细胞液于离心管中，300g离心3分钟。
4.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S03中，加入拟胚体培养液后用移液器重悬细胞，将重悬细胞液加入经过预处理的拟胚体培养孔板中，100g离心3分钟，然后放入培养箱中培养，将得到的拟胚体取出放入超低吸附多孔板中继续培养，之后每2天更换一次拟胚体培养液。
5.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述的培养箱为37℃二氧化碳培养箱。
6.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，拟胚体培养孔板预处理的步骤如下：往拟胚体培养孔板中每孔加入防粘冲洗液，1000g离心3分钟，然后弃掉防粘冲洗液，每孔加预热后的拟胚体培养液，吹吸后弃掉，然后每孔再加入拟胚体培养液，放入37℃二氧化碳培养箱备用。
7.根据权利要求6所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S03中，所述的拟胚体培养液含有DMEM、KSR、L-谷氨酰胺、NEAA、beta-巯基乙醇和Y-27632。
8.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S04中，将拟胚体接种在细胞培养皿中，使用间充质干细胞分化培养液培养，每两天换液一次；培养得到人胚胎干细胞源性的间充质干细胞。
9.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，还包括步骤S05，S05：当细胞培养皿内，细胞汇合度达到80％以上，进行传代培养，之后的每次传代，当细胞汇合度达到80％以上时，再次传代。
10.一种采用如权利要求1-9任意一项所述一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备方法得到的人胚胎干细胞源性的间充质干细胞在治疗急性呼吸窘迫综合征中的应用。
CN202010164823.3A 2020-03-11 2020-03-11 一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用 Pending CN111454891A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010164823.3A CN111454891A (zh) 2020-03-11 2020-03-11 一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010164823.3A CN111454891A (zh) 2020-03-11 2020-03-11 一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111454891A true CN111454891A (zh) 2020-07-28

Family

ID=71676643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010164823.3A Pending CN111454891A (zh) 2020-03-11 2020-03-11 一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111454891A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018123968A1 (ja) * 2016-12-28 2018-07-05 株式会社ツーセル 生体組織損傷の修復剤および当該修復剤の製造方法
CN109735488A (zh) * 2019-01-22 2019-05-10 杭州原生生物科技有限公司 一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法
CN110108883A (zh) * 2018-10-27 2019-08-09 广州呼吸健康研究院 用于筛选与靶治疗ards患者的msc精准医学的标志物组合

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018123968A1 (ja) * 2016-12-28 2018-07-05 株式会社ツーセル 生体組織損傷の修復剤および当該修復剤の製造方法
CN110108883A (zh) * 2018-10-27 2019-08-09 广州呼吸健康研究院 用于筛选与靶治疗ards患者的msc精准医学的标志物组合
CN109735488A (zh) * 2019-01-22 2019-05-10 杭州原生生物科技有限公司 一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIUSEPPE PETTINATO等: "Engineering Strategies for the Formation of Embryoid Bodies from Human Pluripotent Stem Cells", 《STEM CELLS AND DEVELOPMENT》 *
MARK KIBSCHULL: "Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into Embryoid Bodies in AggreWell Plates", 《COLD SPRING HARB PROTOC》 *
STEMCELL TECHNOLOGIES INC.: "Reproducible and Uniform Embryoid Bodies Using AggreWell™ Plates", 《WWW.STEMCELL.COM》 *
冯年花等: "人胚胎干细胞源性间充质干细胞的研究进展", 《中国细胞生物学学报》 *
刘广洋等: "间充质干细胞治疗新型冠状病毒肺炎的研究", 《药物评价研究》 *
姜芝峰等: "间充质干细胞在急性肺损伤治疗中的研究进展", 《中国临床医学》 *
胡嘉波等: "人胚胎干细胞向间充质干细胞分化的初步研究", 《临床检验杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating
Kang et al. Differentiating characterization of human umbilical cord blood‐derived mesenchymal stem cells in vitro
Summer et al. Isolation of an adult mouse lung mesenchymal progenitor cell population
US20120322152A1 (en) Culture Additives To Boost Stem Cell Proliferation And Differentiation Response
AU2018200619B2 (en) Improved stem cell composition
WO2008073331A2 (en) Method of generation and expansion of tissue-progenitor cells and mature tissue cells from intact bone marrow or intact umbilical cord tissue
Barachini et al. Morpho-functional characterization of human mesenchymal stem cells from umbilical cord blood for potential uses in regenerative medicine
CN115058391B (zh) 一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法
Petrini et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow
CN111484972B (zh) 一种从儿童包皮培养获得具备多向分化潜能和免疫调节功能间充质干细胞的方法
CN115851587A (zh) 一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法
Yuan et al. Therapeutic potential of dental pulp stem cells and their derivatives: Insights from basic research toward clinical applications
CN111826348A (zh) 一种人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞体外高效制备方法和应用
CN114438026A (zh) 一种尿源性干细胞的培养基、培养方法及其应用
CN110872574B (zh) 一种高效可靠的hESC-MSC制备方法
CN111454891A (zh) 一种人胚胎干细胞源性的间充质干细胞的制备及其应用
Conboy et al. Preparation of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells
Huang et al. Osteogenic differentiation from mouse adipose-derived stem cells and bone marrow stem cells
CN110628712B (zh) 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用
US20080081370A1 (en) Directed differentiation of human embryonic stem cells into mesenchymal/stromal cells
WO2013123607A1 (zh) 用于成体干细胞的体外无血清培养的方法和培养基
CN114540282B (zh) 多能干细胞诱导分化获得间充质干细胞的方法
CN114058573B (zh) 一种含有生物素的培养基
CN112481219B (zh) 一种基因高表达在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增殖方面的用途
CN110592007B (zh) 一种间充质干细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200728

RJ01 Rejection of invention patent application after publication