KR20080091809A - 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지 첨가물, 키트 및 이의 용도 - Google Patents

동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지 첨가물, 키트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 성장 인자 및 적어로 하나의 인지질을 포함하는 배양 배지; 상기 배양 배지의 제조를 위한 조성물; 키트; 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 무혈청 또는 저-혈청 배양 배지를 사용하며, 동물 세포의 증식에 있어서 혈청을 포함하는 배양 배지에서의 배양에 의한 촉진 효과와 유사한 촉진 효과를 제공할 수 있다.
배양 배지, 인지질, 지방산, 성장 인자

Description

동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지 첨가물, 키트 및 이의 용도 {Culture Medium Additive for Use in Serum-Free Culturing of Animal Cell, Kit, and Use Thereof}
본 발명은 동물 세포 배양을 위한 배양 배지에 첨가되는 조성물, 키트, 및 이의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 무혈청 조건 또는 낮은-혈청 조건 하에서 동물 세포를 배양하기 위한 조성물, 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)은 체세포줄기세포(somatic stem cell)의 하나이며, 골수 등에 존재한다. 중간엽 줄기세포는 지방 세포, 골 세포, 연골 세포 등으로 분화될 수 있는 다분화능(pluripotency)을 가지며 자가 재생능을 가지는 줄기 세포로 알려져 있다. 현재, 중간엽 줄기세포는 재생 의료 분야에서 이식을 위한 세포로 사용되고 있다. 중간엽 줄기세포는 골 손상(bone defect), 연골 손상(cartilage defect), 치주 질환 (periodontal disease), 심근경색(myocardial infarction), 난치성 피부 질환(refractory cutaneous disease), 골다공 증(osteoporosis), 변형성 관절증(osteoarthrosis), 척수 손상(spinal cord injury), 조혈 지지체(hematopoietic support), 및 기관 이식에서의 거부 억제(antirejection)와 같은 다양한 질환에 적용된다. 중간엽 줄기세포는 장래에 더욱더 다양한 질환에 적용될 것으로 기대된다 (예를 들면 뇌경색(cerebral infarction), 폐쇄성 동맥경화증 (arteroisclerosis obliterans), 신장 장애(kidney disorder) 등).
중간엽 줄기세포는 골수, 골막(periostea) 등에 존재한다. 이러한 조직에서 수득한 중간엽 줄기세포는 증식하며 의도한 세포로 더 분화되므로, 조직 재생용 의료 용도로 사용될 수 있는 조직으로 제조된다. 그러나 살아있는 조직에 존재하는 중간엽 줄기세포의 수는 매우 적기 때문에, 이식을 위한 중간엽 줄기세포를 이식 용도로 사용하기 위해서는 조직으로부터 수득한 세포를 충분한 증식시킬 것이 요구된다.
일반적으로, 동물 세포는 우태 혈청(fatal bovine serum) 등과 같은 5 내지 20% 비인간 동물-유래 혈청에 배양 배지를 사용하여 배양한다. 혈청은 시험관 내(in vitro) 세포 성장 및/또는 증식을 촉진하기 위한 영양원, 또는 호르몬 등과 같은 생물학적 활성 물질의 공급원(resource)으로 사용된다. 그러나 혈청은 경제적으로 부담이 매우 크며, 또한 자연 생성물이기 때문에 혈청의 구성 성분은 혈청마다 매우 다르다. 더욱이, 배양된 세포로부터 혈청-유래 단백질 등을 제거함으로써 배양된 세포를 정제해야만 하므로, 복잡합 과정을 야기한다. 더 나아가 배양된 세포가 (바이러스, 병원성 프라이온 등) 알려지지 않은 병원체에 감염될 위험이 있 다.
한편, 비인간 동물-유래 혈청을 사용하지 않고 동물세포를 배양하기 위한 기술이 발전되어 왔다. 예를 들어, (환자로부터 수득한 세포를 배양하고 배양된 세포를 환자에게 이식하는) 자가 이식 치료를 위한 세포의 배양은 동일 환자로부터 수득된 자가 인간 혈청을 사용한다. 이러한 방법으로 배양된 세포의 오염을 피할 수 있다. 그러나 혈청을 생산하기 위하여 많은 양의 혈액이 요구되며, 이는 환자에게 큰 부담이 된다.
이러한 문제를 피하기 위하여, 혈청이 포함되지 않은(무혈청 배양 배지) 배양 배지 또는 혈청 성분을 적게 포함하고 있는 배양 배지 (저-혈청 배양 배지)가 발달하여 왔다. 배양 배지 내에 혈청이 저농도로 포함된 경우 세포의 증식 능력이 현저하게 감소하거나 세포가 사멸한다. 이러한 이유로, 증식능을 잃지 않고 세포를 배양할 수 있는 배양 배지를 생산하기 위하여, 배양 배지 내에 혈청을 대신할 수 있는 세포 성장 인자를 첨가하라 필요가 있다. 일반적으로, 펩타이드 호르몬, 성장 인자 등과 같은 다양한 물질이 혈청을 대체할 세포 성장 인자로서 사용되고 있다(예, 특허 문헌 1 및 2 참조). 예를 들면, 그러한 무혈청 배양 배지로서 기저배지로 HAM's 12 배양 배지를 사용하는 무혈청 배양 배지 및 인슐린, 트랜스페린등이 첨가된 무혈청 배양 배지가 알려져 있다.
또한, 의학적 치료에 사용하기 위한 연골세포를 성장 인자 및 지방산이 첨가된 무혈청 배양 배지에 배양시키는 방법이 알려져 있다 (예, 특허문헌 3 및 4 참조). 나아가 특허 문헌 5는 신경 줄기 세포를 장기간 배양하기 위한 방법 및 조성 물에 대하여 개시하고 있다.
[특허 문헌 1]
일본 미심사 특허 공개 공보, Tokukaihei, No.8-308561 (1996년11월26일 공개)
[특허 문헌 2]
일본 미심사 특허 공개 공보, Tokukaihei, No.9-191874 (1997년07월29일 공개)
[특허 문헌 3]
PCT 국제출원 일본어 번역문, Tokuhyo, No.2005-515777 (2005년06월02일 공개)
[특허 문헌 4]
PCT 국제출원 일본어 번역문, Tokuhyo, No.2002-529071 (2002년09월10일 공개)
[특허 문헌 5]
PCT 국제출원 일본어 번역문, Tokuhyo, No.2003-516141 (2003년05월13일 공개)
발명의 상세한 설명
그러나 이전에 개시된 배양 배지의 사용은 혈청의 10%를 포함하는 배양 배지의 사용과 비교하여 충분하게 세포 증식을 촉진시킬 수 없다. 특히, 통상적인 기술로는, 대규모 배양을 위하여 필요한 장기간 배양을 수행하기 어렵다.
본 발명은 상기 문제점을 고려하여 수행되었다. 본 발명의 목적은 무혈청 배양 배지를 사용하고 10% 혈청을 함유하는 배양 배지에서와 비교하여 동물 세포의 증식을 촉진시킬 수 있는 기술을 제공하는 데 있다. 동물 세포의 무혈청 배양에 이용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 FGF, PDGF, TGF-β 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자, 및 적어도 하나의 인지질을 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 지방산이 바람직하며, 영양학적으로-필수 지방산인 아라키돈산이 특히 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E), L-글루타치온(L-glutathione), 또는 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)가 바람직하나, 다른 환원제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 염화 리튬(lithium chloride)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 계면활성제(surfactant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 덱사메타손(dexamethasone), 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 동물 세포는 미분화된 세포(undifferentiated cell)인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 동물세포가 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)이 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 동물 세포는 특정한 분화능을 잃어서 거의 미분화 상태에 있는 세포(예를 들면, 원숭이 신장-유래 COS 세포)가 바람직하다.
동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지는 배양 배지 첨가제 조성물을 포함한다.
동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 방법은 배양 배지에서 동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 배양 배지 첨가제를 포함한다.
동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장인자; 및 적어도 하나의 인지질을 각각 포함한다.
본 발병의 배양 배지 첨가제 키트는 적어도 지방산을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 지방산인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E), L-글루타치온(L-glutathione), 또는 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)가 바람직하나, 다른 환원제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 염화 리튬(lithium chloride)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 계면활성제(surfactant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 덱사메타손(dexamethasone), 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 동물 세포는 미분화된 세포(undifferentiated cell)인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 동물세포가 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)이 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 동물 세포는 특정한 분화능을 잃어서 거의 미분화 상태에 있는 세포(예를 들면, 원숭이 신장-유래 COS 세포)인 것이 바람직하다.
동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지는 배양 배지 첨가제 키트에 포함되는 구성성분들을 포함한다.
동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 방법은 배양 배지 내에 동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 방법은 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장인자; 및 적어도 하나의 인지질을 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 배양 방법은 기저 배지에 적어도 하나의 지방산을 더 첨가하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
분화능을 유지하면서 줄기 세포를 계속적으로 계대배양 하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 것이 바람직하다.
분화능을 유지하면서 줄기 세포를 계속적으로 계대배양 하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함한다.
본 발명의 배양 배지는 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 것이 바람직하다.
분화능을 유지하면서 줄기 세포를 계속적으로 계대배양 하기 위하여, 본 발명의 배양 배양 방법은 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장인자; 및 적어도 하나의 인지질을 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 배양 방법은 적어도 하나의 지방산을 기저 배지에 더 첨가하는 단계를 포함한다.
1차-배양된 줄기 세포의 배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 FGF, TFG-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 것이 바람직하다. 영양학적으로 필수 지방산인 리놀레산, 리놀렌산, 및 아라키돈산이 특히 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E)가 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 계면활성제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 덱사메타손(dexamethasone), 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
1차-배양된 줄기 세포의 배양에 사용하기 위하여, 배양 배지 첨가제 키트는 PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 FGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 것이 바람직하다. 영양학적으로 필수 지방산인 리놀레산, 리놀렌산, 및 아라키돈산이 특히 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E)가 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 계면활성제(surfactant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 덱사메타손(dexamethasone) 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
1차-배양된 줄기 세포의 배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 방법은 PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 기저 세포에 동시에 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 배양 방법은 FGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 기저 배지에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
마우스 섬유아세포(fibroblast)의 계속적인 계대배양(subculturing)에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 TGF-β; PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 FGF 및/또는 HGF를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 것이 바람직하다. 영양학적으로 필수 지방산인 리놀레산, 리놀렌산, 및 아라키돈산이 특히 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E)가 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 계면활성제(surfactant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 덱사메타손(dexamethasone) 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
마우스 섬유아세포의 계속적인 계대배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 TGF-β; PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산, 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 FGF 및/또는 HGF를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 것이 바람직하다. 영양학적으로 필수 지방산인 리놀레산, 리놀렌산, 및 아라키돈산이 특히 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E)가 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 계면활성제(surfactant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 덱사메타손(dexamethasone), 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
마우스 섬유아세포의 계속적인 계대배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 방법은 TFG-β; PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인지질을 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 배양 방법은 FGF 및/또는 HGF를 기저 배지에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
중국 햄스터 난소-유래 세포 (Chinese hamster ovary-derived cell)의 계속적인 계대배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 FGF, TFG-β, 및 HGF를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배지 배양 첨가제에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 것이 바람직하다. 영양학적으로 필수 지방산인 리놀레산, 리놀렌산, 및 아라키돈산이 특히 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E)가 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 계면활성제(surfactant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 덱사메타손(dexamethasone) 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
중국 햄스터 난소-유래 세포의 계속적인 계대배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 FGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 인자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 것이 바람직하다. 영양학적으로 필수 지방산인 리놀레산, 리놀렌산, 및 아라키돈산이 특히 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E)가 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 계면활성제(surfactant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 덱사메타손(dexamethasone), 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
중국 햄스터 난소-유래 세포의 계속적인 계대배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 방법은 PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인지질을 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 배양 방법은 FGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 기저 배지에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
인간 피부-유래 섬유아세포 (human skin-derived fibroblast cell)의 계속적인 계대배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 FGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 TGF-β, HGF 및 PDGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 것이 바람직하다. 영양학적으로 필수 지방산인 리놀레산, 리놀렌산, 및 아라키돈산이 특히 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E)가 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 계면활성제(surfactant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 덱사메타손(dexamethasone) 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
인간 피부-유래 섬유아세포의 계속적인 계대배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 FGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 TGF-β, HGF, 및 PDGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 인자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인지질인 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 것이 바람직하다. 영양학적으로 필수 지방산인 리놀레산, 리놀렌산, 및 아라키돈산이 특히 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 지질 산화 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E)가 바람직하다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 계면활성제(surfactant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)이 바람직하나, 다른 계면활성제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 덱사메타손(dexamethasone), 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
인간 피부-유래 섬유아세포의 계속적인 계대배양에 사용하기 위하여, 본 발명의 배양 방법은 FGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인지질을 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 배양 방법은 TGF-β, HGF 및 PDGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 기저 배지에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 본질 및 장점을 더 잘 이해할 수 있게 하기 위하여, 이하, 첨부된 도면과 함께 상세한 설명을 제공한다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
상술한 바와 같이, 혈청을 포함하지 않는 배양 배지(무혈청 배양 배지)에는 다양한 펩타이드 호르몬의 다양성, 성장 인자, 지질 등이 사용되므로, 세포는 증식 능을 잃지 않고 배양된다. 그러나, 혈청을 대체하는 상기 구성성분들이 첨가된 배양 배지는 혈청을 포함하는 배양 배지와 비교했을 때 세포 증식에 있어서 반드시 충분한 세포 증식 촉진 효과를 갖는 것은 아니다. 이러한 이유로, 본 발명의 발명자들은 저혈청 (0.25 내지 2%) 조건하에서도 10% 혈청이 포함된 배양 배지를 사용하는 통상적인 배양 방법과 동등한 효과를 가지는 인간 중간엽 줄기세포 배양 방법에 대하여 연구하였다. 그 결과, 본 발명자들은 특정 성장 인자군 및 지방산 복합체가 기저 배지에 첨가되는 경우, 저-혈청 조건하에서조차, 10% 혈청을 포함한 배양 배지를 사용한 경우와 동일하거나 그보다 더 많은 세포 증식을 얻을 수 있다는 것을 발견하고, 인간 중간엽 줄기세포를 배양하기 위한 "기저 배지"를 완성하였다. 또한, 본 발명자들은 더 다양한 조건에서 연구를 수행하였으며, 그 결과 무혈청 조건 하에서라도 특정 인자가 더 첨가되는 경우에는 10% 혈청을 포함하는 배양 배지를 사용한 경우와 동등하거나 그보다 많은 세포 증식이 가능함을 발견하였다.
본 발명을 사용함으로써, 저-혈청 조건 또는 무혈청 조건하의 배양 시스템에서 대규모로 동물세포를 증식하는 것이 가능하다. 특히, 본 발명은 테스트 튜브에서 뿐만 아니라 상업적 규모로 재생 의료 목적을 가지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포를 증식하는 것을 가능하게 하며, 더 나아가 생산가격을 크게 감소시킬 수 있다.
(1) 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하는 배양 배지 첨가제
본 발명은 동물 세포의 무혈청 배양에 사용되는 배양 배지 첨가제를 제공한다. 본 발명의 배양 배지 첨가제는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 포함된 인지질은, 예를 들면, 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)을 포함한다. 배양 배지 첨가제는 이러한 인지질을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다. 하나의 구체적인 양태로서, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 포스파티딘산 및 포스파티딜 콜린의 조합을 포함한다. 이러한 인지질은 동물 또는 식물로부터 유래될 수 있다.
하나의 구체적인 양태로서, 배양 배지 첨가제는 적어도 하나의 지방산을 포함한다. 본 발명의 배양 배지 첨가제에 포함되는 지방산은, 예를 들면, 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)을 포함한다. 본 발명의 배양 배지 첨가제는 지방산을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 지방산과 함께 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 FGF는 섬유아세포 성장 인자군(fibroblast growth factor family)으로부터 선택된 성장인자를 의미하며, 바람직하게는 FGF-2(bFGF)이다. 또한 FGF는 다른 군으로부터 선택된 FGF-1 또는 이의 유사체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 PDGF는 혈소판 유래 성장 인자군(platelet derived groth factor family)으로부터 선택된 성장인자를 의미하며, PDGF-BB 또는 PDGF-AB가 바람직하다. 또한 본 명세서에서 사용된 TGF-β는 변형 성장 인자-β군(transforming growth factor-β family)로부터 선택된 성장인자를 의미하며, TGF-β3이 바람직하다. TGF-β는 다른 TGF-β 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 배양배지 첨가제는 EGF(epidermal growth factor), CTGF(connective tissue growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), 및 아스코르브산(ascorbic acid) 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 아스코르브산 화합물은 아스코르브산(vitamin C) 또는 아스코르브산 2-인산염(ascorbic acid 2-phosphate), 또는 이와 유사한 화합물을 의미한다.
본 발명의 배양 배지 첨가제에 포함된 성장 인자는 천연 생성물 또는 유전적으로 변형된 생성물일 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 지질 산화 억제제를 포함한다. 하나의 양태로서, 본 발명의 배양 배지 첨가제에 포함되는 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트 (DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E)일 수 있다. 본 발명의 배양 배지 첨가제는 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 하나의 구체적인 양태로서, 배양 배지 첨가제에 포함되는 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)일 수 있다.
본 발명의 배양 배지 첨가제는 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 인슐린은 인슐린-유사 성장 인자 및 천연세포에서 유래된 생성물 또는 유전학적으로 변형된 생성물일 수 있다. 본 발명의 배양 배지 첨가제는 덱사메타손(dexamethasone) 또는 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 더 포함할 수 있다.
(2) 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 키트
본 발명은 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지 첨가제 키트를 제공한다. 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함한다. 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 동일 용기 내에 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함할 수 있고, 또는 이러한 구성성분을 각각으로 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 양태로서, 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 적어도 하나의 지방 산을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 동일 용기 내에, FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질; 및 적어도 하나의 지방산을 포함할 수 있고, 또는 이러한 구성성분을 각각으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "조성물"은 각 주요 구성성분이 하나의 물질 내에 포함되어 있는 형태를 의미하며, "키트"는 주요 구성성분의 적어도 하나가 서로 다른 물질 내에 포함되어 있는 형태를 의미한다. 따라서 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트 내에 포함되는 성장 인자, 인지질, 및 지방산은 배양 배지 첨가제에 관하여 상기 기술한 것들과 같다는 것을 쉽게 알 수 있다.
(3) 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지
본 발명은 동물 세포의 무혈청 배양에서 사용하기 위한 배양 배지를 제공한다. 본 발명의 배양 배지는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함한다.
이러한 구성성분은 동시에 또는 각각 기저 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 상기 언급한 배양 배지 첨가제에 포함된 구성 성분, 또는 상기 언급한 배양 배지 첨가제 키트에 포함된 구성 성분을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 양태로서, 본 발명의 배양 배지는 적어도 하나의 지방산을 포함한다. 본 양태에 따른 배양 배지는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 적어도 하나의 인지질; 및 적어도 하나의 지방산을 포함할 수 있다. 이러한 구성 성분은 동시에 또는 각각 기저 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 상기 언급한 배양 배지 첨가제에 포함된 구성 성분, 또는 상기 언급한 배양 배지 첨가제 키트에 포함된 구성성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지를 구성하는 기저 배지에는 특별한 제한이 없으며, 당업계에 잘 알려진 동물 세포의 배양 배지일 수 있다. 바람직한 기저 배지로는, 예를 들면, Ham's F12 배양 배지, DMEM 배양 배지, RPMI-1640 배양 배지, 및 MCDB 배양 배지를 포함한다. 이러한 기저 배지는 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 하나의 구체적인 양태로서, 본 발명의 배양 배지를 구성하는 기저 배지는 MCDB 및 DMEM이 1:1 비율로 섞인 배양 배지가 바람직하다.
(4) 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 방법
본 발명은 동물 세포의 무혈청 배양을 위한 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 배양 방법은 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함하는 배양 배지에서 동물세포를 배양하는 단계를 포함한다. 배양 배지는 적어도 하나의 지방산을 더 포함할 수 있다. 그 결과, 본 발명의 배양 방법은 동물세포를 배양하기 위한 상기 언급한 배양 배지를 사용할 수 있다.
하나의 구체적인 양태로서, 본 발명의 배양 방법은 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 기저 배지는 특별하게 한정되는 것은 아니며, 상기 기술한 바와 같이 당업계에 알려진 동물세포에 사용되는 배양 배지일 수 있다.
(5) 다른 용도
그러므로, 본 발명에 따르면, 무혈청 배양 배지가 사용되는 경우에도, 동물세포는 10% 혈청이 포함된 배양 배지에서 배양된 동물세포의 경우와 비교하여 동등하거나 그보다 더 빠른 속도로 그 증식능을 유지한 채로 증식될 수 있다. 줄기 세포(특히, 인간 중간엽 줄기세포)가 본 발명에 따라 배양되는 경우, 높은 수준으로 그 특성(골원성 분화능, 지방 분화능, 및 이와 유사한 특성)을 유지하면서 줄기세포를 계속적으로 계대배양 할 수 있다. 실시예에서 보는 것과 같이, 본 발명의 무혈청 배양 배지를 사용함으로써, 배양 시초와 비교하여 적어도 10000 배 또는 그 이상의 세포 수를 증가시킬 수 있다. 이러한 이유로, 본 발명은 또한 각각의 배양 배지 첨가제, 배양 배지 첨가제 키트, 배양 배지, 및 배양 방법을 또한 제공하며, 이들은 각각 줄기세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 줄기 세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 배양 배지 첨가제를 제공한다. 본 발명의 배양 배지 첨가제는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질 포함한다. 본 발명의 배양 배지 첨가제는 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 것이 바람직하다.
다른 양태로서, 본 발명은 줄기세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 배양 배지 첨가제 키트를 제공한다. 본 발명의 배양 배지 첨가제 키트는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질 포함한다. 하나의 구체적인 양태로서, 본 발명의 배양 배지 첨가제는 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 줄기 세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 배양 배지를 제공한다. 본 발명의 배양 배지는 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질 포함한다. 본 발명의 바람직한 하나의 양태로서, 배양 배지는 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 줄기 세포의 계속적인 계대배양을 위한 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 배양 방법은 FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질 포함하는 배양 배지에서 동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 배양 배지는 적어도 하나의 지방산을 더 포함할 수 있다. 그 결과, 본 발명의 배양 방법은 줄기세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 상기 언급한 배양 배지를 사용할 수 있다.
실시예에서 기술하는 바와 같이, 본 발명은 줄기세포와 같은 미분화 세포에 더 큰 효과를 가지며, 더 나아가 특정한 분화능을 잃어서 미분화 상태에 가까운 세포(예로, 원숭이 신장-유래 COS 세포(monkey kidney-derived COS cell))의 무혈청 배양에 있어서 큰 효과를 나타낸다. 본 발명이 적용될 수 있는 세포는 바람직하게는 미분화된 세포이다. 미분화된 세포는 골수-유래 미분화 중간엽 줄기 세포(bone marrow-derived undifferentiated mesenchymal stem cell), 골격근 줄기 세포(skeletal muscle stem cell), 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell), 신경 줄기 세포(neural stem cell), 간 줄기세포(hepatic stem cell), 지방-유래 줄기 세포(adipose-derived stem cell), 지방-유래 전구 세포(adipose-derived progenitor cell), 혈관 표피 전구 세포(vascular endothelial progenitor cell), NK 전구 세포(NK progenitor cell), 배아 줄기 세포(embryo stem cell), 또는 섬유아세포(fibroblast)와 같은 줄기세포일 수 있다. 중간엽 줄기세포가 더욱 바람직하다. 이러한 세포들을 배양하기 위해 고려되는 배양 방법은 각 세포를 배양하기 위해 잘 알려진 배양 방법을 따를 수 있다.
상기 서술된 설명을 뒷바침하기 위한 바람직하고 구체적인 실시예는 본 발명의 기술적인 내용을 나타내기 위해 제공된 것으로서, 본 발명이 이러한 바람직하고 구체적인 실시예 내의 범위로 제한되는 것은 아니며, 오히려 본 발명은 본 발명의 사상 내에서 다양한 변형 적용이 가능하고, 하기의 특허 청구 범위의 영역을 초과하지 않는 한 변형이 가능하다.
본 발명에 언급된 모든 학술 문헌 및 특허 문헌은 본 발명의 상세한 설명에 일체로서 포함된다.
도 1은 무혈청 배양 배지에서 혈청을 대체하는 물질 대체체의 첨가가 인간 MSC (mesenchymal stem cells)의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 무혈청 배양 배지에서 배양된 인간 MSC의 형태적 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 무혈청 배양 배지에서 배양된 인간 MSC의 골원성 분화능(osteogenic differentiation potentials) 을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 무혈청 배양 배지에서 배양된 인간 MSC의 지방 분화능(adipogenic differentiation potentials) 을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 무혈청 배양 배지에서 배양된 인간 MSC의 연골 분화능(chondrogenic differentiation potentials) 의 측정값을 나타낸 그래프이다.
도 6은 무혈청 배양 배지에서 배양된 인간 MSC의 연골 분화능(chondrogenic differentiation potentials) 의 측정값을 나타내었다.
도 7은 무혈청 배양 배지에서 혈청을 대체하는 물질의 첨가가 인간 MSC (mesenchymal stem cells)의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 무혈청 배양 배지에서 혈청을 대체하는 물질의 첨가가 인간 MSC (mesenchymal stem cells)의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9는 무혈청 배양 배지에서 혈청을 대체하는 물질의 첨가가 인간 MSC (mesenchymal stem cells)의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 무혈청 배양 배지에서 혈청을 대체하는 물질의 첨가가 C2C12 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 무혈청 배양 배지에서 혈청을 대체하는 물질의 첨가가 인간 MSC의 세포 분열 신호 전달 체계(mitogenic signal transduction system)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 무혈청 배양 배지에서 혈청을 대체하는 물질의 첨가가 인간 MSC의 세포 분열 신호 전달 체계(mitogenic signal transduction system)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 13은 MSC의 무혈청 배양 배지에 첨가되는 혈청 대체 물질을 나타낸 표이다.
도 14는 C2C12 세포의 무혈청 배양 배지에 첨가되는 혈청 대체 물질을 나타낸 표이다.
도 15(a)는 무혈청 배양 배지에 혈청에 대한 물질 대체체의 첨가가 인간 MSC의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 15(b)는 무혈청 배양 배지에 혈청 대체 물질의 첨가가 인간 MSC의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 16(a)는 무혈청 배양 배지에 혈청 대체 물질의 첨가가 초기 인간 MSC의 증식(primary human mesenchymal stem cells)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 16(b)는 무혈청 배양 배지에 혈청 대체 물질의 첨가가 초기 인간 MSC의 증식(primary human mesenchymal stem cells)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 17(a)는 무혈청 배양 배지에 혈청에 대한 물질 대체체의 첨가가 인간 10T1/2 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 17(b)는 무혈청 배양 배지에 혈청 대체 물질의 첨가가 인간 CHO 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 17(c)는 무혈청 배양 배지에 혈청 대체 물질의 첨가가 인간 피부-유래 섬유아세포(human skin-derived fibroblasts)의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
[구성 성분의 제조]
계란 난황(egg yolk)으로부터 3-sn-포스파티딜콜린(3-sn-phophatidyl choline)(PC, Wake: 163-21181) 또는 3-sn-포스파티딘산(3-sn-phosphatidic acid) 10 ㎎을 0.01% 트윈-80(-) (Tween-80(-))를 포함하는 PBS 10 ㎖에 첨가하였다. 이와 같이 준비된 용액에 5 분 동안 초음파(ultrasonically) 처리하여 현탁물을 제조하였다. 상기 현탁물을 30초 동안 아이스에서 초음파 처리하였고, 주변 온도(ambient temperature)에서 5분간 2500rpm으로 원심분리하였다. 형성된 침전물이 있는 경우, 현탁물을 영하에서 5분 동안 더 초음파 처리하였다.이러한 과정을 침전물이 형성되지 않을 때까지 반복하였다. 결과 용액을 메쉬 크기(mesh size) 0.45 μm 필터에 걸렀다. 용액을 질소가스로 충진하여 밀봉하고, 암실에 냉장보관하였다. 각 용액은 배양 배지 1/100의 양으로 배양 배지에 첨가되도록 준비하였다. 지방산 복합체인 화학적으로 정의된 지질 농도(CD, Gibco: 11905-031)를 배양 배지의 1/100의 양으로 배양 배지에 첨가하였다. 도 13 및 도 14는 지방산 복합체에서 포함된 지질을 나타낸다. 도 13은 MSC(mesenchymal stem cell)를 배양하기 위해 사용된 배양 배지 내의 구성 성분을 나타낸다. 도 14는 C2C12 세포를 배양하는데 사용되는 배양 배지내의 구성 성분을 나타낸다. 각 구성성분은 도 13 또는 도 14에서 나타난 최적 농도의 상한 보다 더 높은 농도를 가질 수 있다.
FGF-2 300 ng/㎖을 BSA (Bovine Serum Albumin) 1 ㎎/㎖를 포함하는 배양 배지에 용해시켜 스톡 용액(100배 용액)을 제조하였다. EGF 1000 ng/㎖을 배양 배지에 용해시켜 스톡 용액(100배 용액)을 제조하였다. 인슐린 1000 ㎍/㎖을 배양 배지에 용해시켜 스톡 용액(100배 용액)을 제조하였다. 이러한 스톡 용액은 사용을 위 하여 100 배로 희석하였다. 덱사메타손은 최종 농도 10-8M로 사용하였다.
[ 실시예1 : 골수 유래 MSC 의 무혈청 배양]
[I: 인지질의 효과]
인간 장골-골수-유래 MSC (human ilium-marrow-derived mesenchymal stem cells)(세 번째 계대배양: Bio-Whittaker Inc.으로부터 구입(Walkersville, MD))를 (ⅰ) 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배양 배지와 함께 세 번 세척하고, (ⅱ) 5000 cells/㎠ 농도의 24-웰 플레이트상에 주입한 뒤, (ⅲ) 5% CO2를 포함하는 CO2 배양기에서 37℃로 배양하였다.
배양은 기저 배지가 DMEM/MCDB=1:1이고 다음의 첨가제가 첨가된 다음의 배양 배지에서 수행하였다.
(배양 배지 1) 첨가제 없음
(배양 배지 2) 10% FBS (fatal bovine serum)
(배양 배지 3) 성장 인자 및 지방산
(배양 배지 4) 성장 인자, 지방산, 및 인지질(PA, PC)
FBS의 구성 성분은 경우에 따라 다르다. 그러므로 배양된 세포의 성장 효과 또한 경우 따라 다르다. 이러한 관점에서 본 실시예에서는, 중간엽 줄기세포상의 높은 증식 효과를 특별히 달성하기 위하여 FBS로 배양 배지 2를 제조하였다.
표 1은 무혈청 배양 배지의 기저 배지 조성물을 나타낸다. 기저 배지에 첨가 되는 구성 성분은 도 13 및 도 14에서 언급한 회사로부터 구입하였다. 닭 배아 섬유아세포의 클로날 증식을 위해 기저 배지인 MCDB201 배양 배지 (Sigma: M-6770)를 개발하였다. MCDB201 배양 배지는 전 미량 원소 (trace element)를 포함한다. 중간엽 줄기 세포 배양을 위한 통상적인 기저 배지인 DMEM 또는 DMEM/Ham's F-12과는 달리, MCDB201/DMEM(1:1)의 도입은 중간엽 줄기세포의 증식에 있어서 최적의 촉진 효과를 나타내었다(데이터는 제시하지 않음).
조성물 DMEM/F-12 (g/L) MCDB201/DMEM (g/L)
아미노산
L-Alamine 0.00445 0.00445
L-Arginine·HCl 0.1474 0.0736
L-Asparagine·H2O 0.0075 0.0075
L-Aspartic Acid 0.00665 0.00665
L-Cystine·HCl·H2O 0.03129 0.01756
L-Cystine·2HCl 0.01756 0.0313
L-Glutamic Acid 0.00735 0.00735
L-Glutamine 0.365 0.292
Glycine 0.01875 0.01875
L-Histidine·HCl·H2O 0.0314 0.0314
L-Isoleucine 0.05447 0.05906
L-Leucine 0.05905 0.07217
L-Lysine·HCl 0.09125 0.09125
L-Methionine 0.01724 0.01724
L-Phemylalnine 0.03548 0.03548
L-Proline 0.01725 0.00288
L-Serine 0.02625 0.03676
L-Threonine 0.05345 0.06537
L-Tryptophan 0.00902 0.01106
L-Tyrosine·2Na·2H2O 0.05579 0.05757
L-Valine 0.05285 0.06456
비타민
D-Biotin 0.0000035 0.0000035
Choline Chloride 0.00898 0.00898
Folic Acid 0.00266 0.00266
Folinic Acid·Ca - 0.00000256
myo-Inositol 0.0126 0.0126
Niacinamide 0.00202 0.00505
D-Pantothenic Acid·1/2Ca 0.00224 0.00224
Pyridoxal·HCl 0.0020506 -
Pyridoxine·HCl - 0.0020308
Riboflavin 0.000219 0.0002565
DL-Thioctic Acid 0.000105 0.000105
Thiamine·HCl 0.00219 0.00219
Vitamin B-12 0.00068 0.00068
무기염류(MAGOR INORGANIC SALTS)
CaCl2·2H2O 0.1545 0.2795
KCl 0.3118 0.3118
MgSO4 0.04884 0.13912
NaCl 6.996 6.996
NaHCO3 1.2 1.85
Na2HPO4 (anhyd) 0.07102 0.0355
Na2HPO4 0.0543 0.0543
미량 원소 (TRACE ELEMENTS)
CuSO4·5H2O 0.0000013 0.00000025
FeSO4·7H2O 0.000417 0.000834
Fe(NO3)3·9H2O 0.00005 0.00005
Na2SeO3 - 0.0000004325
NaSiO3·9H2O - 0.000071
(NH4)2MO4·4H2O - 0.000000309
NH4VO3 - 0.000000003
NiCl2·6H2O - 0.0000000006
MgCl·6H2O 0.0612 -
MnSO4 - 0.000000375
ZnSO4·7H2O 0.000432 0.00001437
기타 유기 화합물(OTHER ORGANIC COMPOUNDS)
Adenine - 0.00086
D-Glucose 3.15 1.2205
HEPES - 3.5745
Hypoxanthine 0.0021 -
Linoleic Acid 0.000042 0.000042
Phenol Red·Na 0.00863 0.00863
Putrescine·HCl 0.000081 0.0000000805
Pyruvic Acid·Na 0.055 0.0275
Thymidine 0.000365 0.00003635
본 발명의 기저 배지 (배양 배지 3)는 성장 인자(FGF, HGF, TGF-β, 및 PDGF) 및 지방산 복합체(아라키돈산(arachidonic acid), 레티노익산 (retinoic acid), 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid))를 포함하였다. 또한 기저 배지는 배지 첨가제로서 알려진 인슈린, 트랜스페린, 셀렌산염(소듐 셀레네이트 등), 콜레스테롤, 덱사메타손(Dex), 및 BSA(bovine serum albumin)을 포함한다. 또한 기저 배지는 지질 산화 억제제로서 비타민 E, 계면활성제로서 플루로닉 F-68 및 트윈-80을 포함한다.
배양 배지 당 세 샘플로 실험을 수행하였다(n=3). 배양 배지를 2 내지 3일 마다 교체하였다. 중간엽 줄기세포는 컨플루언트가 되기 전에 PBS로 두 번 세척하였고, 그 수 0.05% 트립신 및 0.2mM EDTA을 포함한 PBS에 2 분동안 배양한 뒤, 중간엽 줄기세포를 플레이트로부터 분리하였다. 다음으로, 중간엽 줄기 세포를 혈청을 포함하지 않은 식물-유래 트립신 억제제(Sigma: T6522)로 재현탁하였다. 중간엽 줄기 세포를 혈청을 함유하지 않는 DMEM 배양 배지로 세 번 세척한 뒤, 세포의 수를 Coulter counter(Z1, single, Coulter Inc.)를 사용하여 측정하였다. 도 1은 그 결과를 나타낸다.
중간엽 줄기세포의 계대배양을 위하여, 각 배양 배지를 사용하여, 재-현탁된 중간엽 줄기세포를 5000 cell/㎠의 농도로 24-웰 플레이트상에 재접종하였다. 계대배양은 5회 계대배양 될 때까지 7일마다 반복하였다. 도 1은 배양 배지당 세 개의 샘플로 수행한 실험결과로서, 평균값±SD 을 나타낸다(n=3).
본 발명의 기저배지 (배양 배지 3)에 2%의 FBS가 첨가한 경우 세포 증식 효과는 10% FBS를 포함하는 통상적인 배양배지의 그것과 동등하였다. 무혈청 조건에서 기저배지의 사용으로, 10% FBS를 포함한 배양 배지의 세포 증식 효과보다는 못했으나, 뛰어난 세포 증식 효과를 나타내었다. 즉, 10% FBS를 포함한 배양 배지에 의한 효과의 약 45% 정도를 나타내었다(도 1 참조). 동물-유래 인지질(포스파티딘산(phosphatidic acid, PA) 및 포스파티딜콜린(phosphatidylcolin(PC))을 기저 배지 (배양 배지 3)에 첨가하여 배양 배지 4를 제조하였다. 배양 배지 4의 사용은, 무혈청 조건에서도 뛰어난 세포 증식 효과를 나타내었다. 즉, 10% FBS를 포함한 배양 배지에 의한 효과보다 약 8.5 배 높은 효과를 나타내었다(도 1 참조).
이러한 실험으로, 성장 인자 및 지방산을 포함하는 무혈청 배양 배지에 인지질을 첨가함으로써 인간 중간엽 줄기세포의 무혈청 배양이 현저하게 향상되었음을 알 수 있다.
[Ⅱ. 지방산의 효과]
기저 배지에서 지방산의 중요성에 관한 추가적인 연구를 수행하였다.
(배양 배지 1) 첨가제 없음
(배양 배지 2) 10% FBS(fetal bovine serum)
(배양 배지 3) 성장 인자 및 지방산
(배양 배지 5) 성장 인자 + 리놀렌산(linolenic acid) + 레시틴(lecithin) + EGF + 비타민 C(VC)
배양 배지 5는 기저 배지(배양 배지 3)에 유사한 배지이나, 리놀렌산을 제외한 지방산이 첨가 되지 않았고, 식물-유래 인지질(레시틴)이 더 첨가되었다. 식물-유래 인지질(레시틴)은 다음과 같은 방법으로 제조되었다.
식물-유래 레시틴(콩(Soybean)으로부터의 레시틴, Wako:120-00832) 200 ㎎을 클로로포름(choloroform)에 첨가하였다. 그 결과물을 질소가스를 증류함으로써 건조시키고 20 ㎖ PBS를 상기 건조된 결과물에 첨가하였다. 상기 제조된 용액을 주변 온도에서 15분 동안 초음파로 처리하여 용액을 평형화하였다. 질소 가스에서, 용액을 영하에서 30초 내지 2분의 범위에서 더 초음파 처리하였다. 용액을 주변 온도에서 5분 동안 원심분리(2500 rpm)하였다. 침전물이 형성되는 경우, 용액을 아이스에서 5 분간 더 초음파처리하였고, 그 후 5분 동안 주변온도에서 원심분리(2500 rpm)하였다. 이러한 과정을 반복한 뒤에, 상청액(supernatant)을 수집하였다. 상청액을 메쉬 크기가 0.45 μm인 필터로 걸렀다. 상청액을 질소 가스로 충진하여 밀봉하였고, 암실에서 냉장 보관하였다.
도 1에서 나타낸 바와 같이, 배양 배지 5를 사용함으로써, 무혈청 조건에서도 뛰어난 세포 증식 효과을 얻었다. 그 효과는 기저 배지(배양 배지 3)에서와 동등하였고 10% FBS을 포함하는 배양 배지의 약 40%였다(도 1 참조).
실시예가 보여주는 것과 같이, 성장 인자를 포함하는 무혈청 배양 배지가 적어도 하나의 지방산을 더 포함한 경우, 인간 MSC의 무혈청 배양에 있어서 세포 증식상의 인지질의 효과를 얻을 수 있다.
[Ⅲ: 성장 인자의 효과]
특정한 어느 하나의 성장인자를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 기저 배지(배양 배지 3)와 유사한 배양 배지의 사용과 MSC의 무혈청 증식의 결과를 비교함으로써 배양 배지에 첨가된 성장 인자에 대한 추가적인 실험을 수행하였다.
(배양 배지 1) 첨가제 없음
(배양 배지 3) 성장 인자 및 지방산
(배양 배지 3-1) 배양 배지 3에서 PDGF만을 제외하였다.
(배양 배지 3-2) 배양 배지 3에서 TGF-β만을 제외하였다.
(배양 배지 3-3) 배양 배지 3에서 HGF만을 제외하였다.
(배양 배지 3-4) 배양 배지 3에서 FGF만을 제외하였다.
(배양 배지 3-5) 배양 배지 3에서 덱사메타손(dexamethasone, Dex)만을 제외하였다.
(배양 배지 3-6) 배양 배지 3에서 인슐린, 트랜스페린, 및 셀렌산염만을 제외하였다.
도 1에서 도시하고 있는 바와 같이, 무혈청 조건하에서 성장 인자 중 어느 하나가 결손되면 중간엽 줄기세포의 활성 증식이 억제되는 것을 알 수 있다. 예를 들면, HGF 또는 TGF-β 각각의 결손은 본 배양에서 증식을 명백하게 감소시켰다. 또한, HGF 및 TGF-β 모두가 결손되는 경우 세포 증식을 현저하게 억제시켰다(여기에 결과 데이터는 제시되지 않음).
EGF 및 VC가 인지질에 추가적으로 첨가된 배양 배지(배양 배지 4 + EGF + VC)의 사용은 도 1에 제시되어 있지는 않으나, 무혈청 배양 배지에서 중간엽 줄기세포의 증식을 더 촉진시킬 수 있다(도 10 참조 : 배양 배지 4-2).
[Ⅳ: 중간엽 줄기세포의 형태학상에서의 효과]
도 2는 본 실시예의 무혈청 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 형태를 나타낸다. 도 2에서 보는 바와 같이 10% FBS를 포함하는 배양 배지에서 배양된 세포와 비교할때, 무혈청 배지 (3번째 계대배양)에서 배양된 세포는 중간엽 줄기세포의 전형적인 형태인 방추 형태 (spindle shape)을 보였다. TGF-β 또는 HGF 중 어느 하나가 결손된 무혈청 배양 배지를 사용하는 경우에는 세포 증식의 감소를 보였다.
[ 실시예 2: 무혈청 조건하에서 배양된 중간엽 줄기세포의 분화능 측정]
[Ⅰ: 조골세포(osteoblast)의 분화 유도]
실시예 1의 무혈청 배지를 사용하여 증식된 중간엽 줄기세포의 분화능을 측정하기 위하여, 무혈청 배양 배지를 이용하여 계속적으로 계대 배양함으로써 수득한 인간 장골-유래 중간엽 줄기세포(human ilium-derived mesenchymal stem cells)의 세 번째 계대배양 세포를 수집하고, α-MEM, 10% FBS, 덱사메타손 100nM, β-글리세로인산(β-glycerophosphoric acid), 및 50㎍/㎖ L-아스코르브산 2-인산염(L-ascorbic acid 2-phosphate)을 포함한 골원성-분화 유도성 배양 배지에 옮겼다. 골원성-분화-유도성 배양 배지에서의 중간엽 줄기세포를 그 전체로 28일 동안 5% 이산화탄소 가스에 37℃로 배양하였다. 동일한 구성성분을 가진 배지로 매 2 내지 3일마다 교체해주었다. 뼈로 분화된 후 경화된 세포층을 알리자린 크림슨색(alizarin crimson)으로 염색하였다. 도 3에 결과를 나타내었다.
무혈청 배양 배지에 배양된 중간엽 줄기세포(네 번째 계대 배양)는 골원성-분화 유도성 배양 배지에 28일 동안 배양하였다. 그 결과, 도 3에서 보는 것처럼, 중간엽 줄기세포는 알리자린 크림슨 염색성을 보였는데, 이는 특정하게 조골세포(osteoblast cell)로 경화되었음을 의미한다. 따라서, 칼슘 침전물이 관찰되었다. 또한, 무혈청 배양 배지에서 배양된 각 중간엽 줄기세포는 10% FBS를 포함하는 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포와 비교하여 높은 골원성 분화능(경화능(calcification potential)을 가졌다. 특히, 두 종류의 인지질이 첨가된 배지는 가장 높은 골원성 분화능을 가진 중간엽 줄기세포를 야기한다는 것이 관찰되었다.
[Ⅱ: 지방 세포의 분화 유도]
실시예 1의 무혈청 배지를 사용하여 증식된 중간엽 줄기세포의 분화능을 측정하기 위하여, 무혈청 배양 배지에 계속적으로 계대 배양함으로써 수득한 인간 장골-유래 중간엽 줄기세포(human ilium-derived mesenchymal stem cells)의 세 번째 계대배양 세포를 세포가 컨플루언트될 때까지 증식시켰다. 트립신으로 세포를 분산시키고 수집하였다. 그 후, 세포를 고-글루코스 DMEM, 10㎍/㎖ 인슐린, 0.2mM 인도메타신(indomethacin), 1 μM 덱사메타손, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthin), 및 10% FBS가 포함된 지방-분화 유도성 배양 배지에 옮겼다. 지방-분화-유도성 배양 배지내의 중간엽 줄기세포는 그 전체로 28일 동안 5% 이산화탄소 가스에 37℃로 배양하였다. 동일한 구성성분을 가진 배지로 매 2 내지 3일마다 교체해주었다.지방 분화를 측정하기 위하여 Oil Red O 로 중간엽 줄기세포를 염색하였다. 도 4에 결과를 나타내었다.
무혈청 배양 배지에 배양된 중간엽 줄기세포(네 번째 계대 배양)를 지방-분화 유도성 배양 배지에서 28일 동안 배양하였다. 그 결과, 도 4에서 보는 것처럼, 중간엽 줄기세포는 Oil Red O 염색성을 보였다. 이 염색성은 지방을 가리킨다. 또한 무혈청 배양 배지에서 배양된 각 중간엽 줄기세포는 10% FBS를 포함하는 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포와 비교하여 높은 지방-분화능 (adipogenic-differentiation potential)을 가졌다.
[Ⅲ. 연골세포의 분화 유도]
실시예 1의 무혈청 배지를 사용하여 증식된 중간엽 줄기세포의 분화능을 측정하기 위하여, 무혈청 배양 배지를 이용하여 계속적으로 계대 배양함으로써 수득한 인간 장골-유래 중간엽 줄기세포(human ilium-derived mesenchymal stem cells)의 다섯 번째 계대배양 세포를 수집하고, 고-글루코스 α-MEM, 10ng/㎖ TGF-β3, 덱사메타손 100nM, 50㎍/㎖ L-아스코르브산 2-인산염(L-ascorbic acid 2-phosphate), 100㎍/㎖ 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 및 ITS plus(6.25㎍/㎖ 트랜스페린, 6.25㎍/㎖ 인슐린, 6.25ng/㎖ 셀렌산염, 5.33㎍/㎖ 리놀레산, 및 1.25㎎/㎖ BSA(bovine serum albumin))를 포함한 연골성-분화 유도성 배양 배지에 옮겼다. 200,000개의 중간엽 줄기세포를 15 ㎖ 원심분리 튜브에 넣었다. 세포를 배양 배지의 0.5 내지 1㎖까지 접종하였다. 한편, 몇몇 중간엽 줄기세포를 연골성-분화-유도성 배양 배지에서 TGF-β가 결여된 대조군 배양 배지로 옮겼다. 연골성-분화-유도성 배양 배지 내의 중간엽 줄기 세포 및 대조군 배양 배지 내의 세포를 5% 이산화탄소 가스에 37 ℃로 배양하였다. 배양 개시로부터 24시간 후에 세포는 광범위한 펠렛(pellets)를 형성하였다. 세포를 21일 동안 배양하였다. 동일한 구성성분을 가진 배지로 매 2 내지 3일마다 교체해주었다. 배양된 후 형성된 펠렛 내 GAG의 양은 황산 GAG(sulfated glycosaminoglycan) 분석 키트(Biocolor, Ltd.)를 사용하여 측정하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다. GAG의 양을 세포의 DNA 양에 따라 표준화하였다. 배양 후, 연골성-분화-유도성 배양 배지 내 연골성-분화가 수행된 세포를 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색하였다. 도 6에 결과를 나타내었다.
무혈청 배양 배지 내에서 배양된 중간엽 줄기세포 및 10% FBS를 포함하는 배양 배지 내에서 배양된 세포를 21일 동안 연골성-분화-유도성 배양 배지에서 배양하였다. 그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 무혈청 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기 세포(다섯 번째 계대배양)는 10% FBS를 포함하는 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 그것과 비교하여 현저하게 높은 양의 GAG(p<0.01)를 함유하였다. 반대로, 무혈청 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포 및 10% FBS를 포함하는 배양 배지에서 배양된 세포들을 각각 21일 동안 대조군 배양 배지 내에서 배양하였다. 그 결과, 대조군 배지의 양쪽 모두에서 GAG 양의 증가가 관찰되지 않았다(분수값은 평균값±SD값을 가리키며, 실험결과는 세 개의 샘플로 수행하였다).
무혈청 배양 배지에 배양된 중간엽 줄기세포 및 10% FBS를 포함하는 배양 배지에서 배양된 세포를 21일 동안 연골성-분화-유도성 배양 배지에 배양하였다. 그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 무혈청 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포(다섯 번째 계대배양)는 10% FBS를 포함하는 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포와 비교하여 현저하게 높은 톨루이딘 염색성을 나타내었다. 따라서, 매트릭스 축적이 관찰되었다.
[ 실시예 3: 골수-유래 중간엽 줄기세포의 무혈청 배양에서 성장 인자의 효과]
인간 장골-골수-유래 중간엽 줄기세포 (세 번째 계대배양)를 (ⅰ) 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배양 배지와 함께 세 번 세척하고, (ⅱ) 5000 cells/㎠ 농도로 24-웰 플레이트에 접종한 뒤, (ⅲ) 5% CO2로 CO2 배양기에서 37℃로 배양하였다.
기저 배지가 DMEM/MCDB=1:1이고 다음의 첨가제가 첨가된 다음과 같은 배양 배지에서 배양을 수행하였다.
(배양 배지 1) 첨가제 없음
(배양 배지 2) 10% FBS (fetal bovine serum)
(배양 배지 3) 성장 인자 및 지방산
(배양 배지 3-2) 배양 배지 3에서 TGF-β만을 제외하였다.
(배양 배지 3-3) 배양 배지 3에서 HGF만을 제외하였다.
(배양 배지 3-7) 배양 배지 3에서 TGF-β 및 HGF를 제외하였다.
(배양 배지 3-8) 배양 배지 3 + EGF
(배양 배지 3-9) 배양 배지 3 + VC
(배양 배지 4) 성장 인자, 지방산, 및 인지질(PA, PC)
(배양 배지 4-1) 배양 배지 4 + EGF + 비타민 C(VC) + 비타민 E(VE)
(배양 배지 5) 성장 인자 + 리놀렌산 + 레시틴 + EGF + VC
배양 배지 당 세 개의 샘플로 실험을 수행하였다(n=3). 배양 배지를 매 2 내지 3일 마다 교체하여 주었다. 세포 카운팅 키트 WST-8 (Dojindo Lab.)을 사용하여 배양 8일째의 세포의 수를 측정하였다. 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 무혈청 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포(배양 배지 3-8, 4, 4-1, 또는 5)는 배양 배지 3에서 배양된 중간엽 줄기세포와 비교할 때 배양 8일째 높은 세포 증식을 보여주었다(분수값은 평균값 ±SD값을 가리키며, 실험결과는 세 개의 샘플로 수행하였다). 특히 배양 배지 4 및 4-1 에서 배양된 세포에서 그 효과가 현저하게 나타났다. 이러한 결과는 중간엽 줄기세포의 증식은 인지질에 의해서 뿐만 아니라 EGF, VC 및 높은 농도의 VE에 의해서도 효과적으로 촉진된다는 것을 의미한다. 반대로 기저 배지(배양 배지 3)로부터 TGF-β 및 HGF 중 적어도 하나가 결핍된 배지는 중간엽 줄기세포의 증식이 현저하게 감소하였다. 이는 결과는 TGF-β 및 HGF 가 중간엽 줄기세포의 무혈청 배양에서 필수적이라는 것을 나타낸다.
또한, 이러한 결과는 중간엽 줄기세포의 무혈청 배양은 그 주요 구성 성분으로서 여러 지질 혼합물을 포함하는 배양 배지(즉, 배양 배지 4)의 경우처럼, 그 주요 구성 성분으로 (동물-유래 포스파티딜콜린(PC)에 대응하는) 식물-유래 레시틴(plant-derived lecithin)을 포함한 지질 혼합물을 포함하는 배지를 사용함으로써 효과적으로 촉진됨을 나타내는 것이다 (도 7 참조).
[실시예 4: 인간-골수-유래 중간엽 줄기세포의 무혈청 배양에서의 추가적인 성장 인자의 효과]
인간 장골-골수-유래 중간엽 줄기세포(세 번째 계대배양)는 (ⅰ) 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배양 배지와 함께 세 번 세척하고, (ⅱ) 5000 cells/㎠ 농도로 24-웰 플레이트에 접종한 뒤, (ⅲ) 5% CO2로 CO2 배양기에서 37℃로 배양하였다.
기저 배지가 DMEM/MCDB=1:1이고 다음의 첨가제가 첨가된 다음과 같은 배양 배지에서 배양을 수행하였다.
(배양 배지 1) 첨가제 없음
(배양 배지 3) 성장 인자 및 지방산
(배양 배지 6) 배양 배지 3 + VEGF
(배양 배지 7) 배양 배지 3 + CTGF
배양 배지 당 세 개의 샘플로 실험을 수행하였다(n=3). 배양 배지를 매 2 내지 3일 마다 교체하여 주었다. 세포 카운팅 키트 WST-8 (Dojindo Lab.)을 사용하여 배양 8일째의 세포의 수를 측정하였다. 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 무혈청 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포(배양 배지 6 또는 7)는 배양 배지 3에서 배양된 중간엽 줄기세포와 비교할 때 배양 8일째 높은 세포 증식을 보여주었다(분수값은 평균값 ±SD값을 가리키며, 실험결과는 세 개의 샘플로 수행하였다).
[ 실시예 5: 골수-유래 중간엽 줄기세포의 무혈청 배양]
인간 장골-골수-유래 중간엽 줄기세포(세 번째 계대배양)는 (ⅰ) 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배양 배지와 함께 세 번 세척하고, (ⅱ) 5000 cells/㎠ 농도로 24-웰 플레이트에 접종한 뒤, (ⅲ) 5% CO2로 CO2 배양기에서 37℃로 배양하였다.
기저 배지가 DMEM/MCDB=1:1이고 다음의 첨가제가 첨가된 다음과 같은 배양 배지에서 배양을 수행하였다.
(배양 배지 1) 첨가제 없음
(배양 배지 3) 성장 인자 및 지방산
(배양 배지 7) 성장 인자 + 리놀렌산 + PC
(배양 배지 8) 성장 인자 + 리놀렌산 + PA
(배양 배지 9) 성장 인자 + 리놀렌산 + 레시틴
배양 배지 당 세 개의 샘플로 실험을 수행하였다(n=3). 배양 배지를 매 2 내지 3일 마다 교체하여 주었다. 세포 카운팅 키트 WST-8 (Dojindo Lab.)을 사용하여 배양 8일째의 세포의 수를 측정하였다. 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 무혈청 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포(배양 배지 7 또는 8)는 배양 배지 3에서 배양된 세포 증식과 동등한 세포 증식을 보여주었다(분수값은 평균값 ±SD값을 가리키며, 실험결과는 세 개의 샘플로 수행하였다). (ⅰ) 식물-유래 인지질인 레시틴을 주요 구성 성분으로 하는 지질혼합물 및 (ⅱ) 레티논산(retinoic acid)(즉, 배양 배지 9)을 포함하는 배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포도 또한 기저 배지(즉, 배양 배지 3)에서 배양된 세포의 증식과 동등한 세포증식을 나타내었다. 즉, 본 발명에 따라 특성화된 성장인자가 배양 배지 내에 포함되는 경우에는, 그 성장 인자의 조합이 한 종류의 지방산 및 한 종류의 인지질인 경우에서조차, 중간엽 줄기세포가 그 성장률은 비록 낮기는 하나 증식이 가능하였다. 이러한 결과는 더 많은 지질의 조합이 (ⅰ) 어느 한 종류의 지방산 및 어느 한종류의 인지질의 조합, (ⅱ) 주요 구성성분으로서 많은 지방산을 포함하는 지질 복합체, 또는 (ⅲ) 식물-유래 인지질인 레시틴을 주요 구성성분으로 포함하는 지질 혼합물보다 더 빠른 대규모 배양(mass culture)을 수행할 수 있게 한다는 것을 나타낸다 (도 1과 도 9을 비교).
[ 실시예 6: 미분화 세포주의 무혈청 배양]
마우스 중간엽 줄기세포 C2C12 세포(또는 마우스 연골성 세포 주 ATDC5, 또는 원숭이 신장-유래 미분화 세포주 COS7 세포)를 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배양 배지를 포함하는 10cm-플레이트상에 5% CO2, 37℃로 CO2 배양기에 배양하였다. 세포를 PBS로 두 번 세척하고 0.05% 트립신 및 0.2mM EDTA를 포함하는 PBS에 2분 동안 배양한 후 세포를 플레이트로부터 분리하였다. 그 후 세포를 식물-유래 트립신 억제제(Sigma T6522)로 재-현탁시켰다. 혈청을 포함하지 않는 DMEM 배양 배지에 세 번 세척한 뒤, Coulter counter(Z1 Single, Coulter co.)를 사용하여 세포 개수를 측정하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.
또한 재-현탁된 세포를 다음의 서로 다른 배양 배지를 사용하여 5000 cells/㎠ 농도로 24-웰 플레이트상에 재-접종하였다.
(배양 배지 1) 첨가제 없음
(배양 배지 2) 10% FBS
(배양 배지 4-2) 성장 인자, 지방산 및 인지질 (PA, PC) + EGF + VC
(배양 배지 4-3) 성장 인자, 지방산 및 인지질 (PA, PC)+ EGF + VC-HGF
배양 배지 당 세 개의 샘플로 실험을 수행하였다(n=3). 배양 배지를 매 2 내지 3일 마다 교체하여 주었다. 세포 카운팅 키트 WST-8 (Dojindo Lab.)을 사용하여 배양 8일째의 세포의 수를 측정하였다. 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 무혈청 배양 배지(배양 배지 4-2)에서 배양된 C2C12 세포는 10% FBS를 포함하는 일반적인 배양 배지에서 배양된 세포보다 더 많은 세포 증식을 보였다. 그러나, 배양 배지 4-2로부터 HGF가 결손된 배양 배지(배양 배지 4-3)를 사용하는 경우, 세포주의 증식능은 현저하게 감소하였다(분수값은 평균값±SD값을 가리키며, 실험결과는 세 개의 샘플로 수행하였다).
중간엽 줄기세포로부터 연골로 이미 분화된 마우스 세포주 ATDC5의 경우에는, 무혈청 배양 배지 (배양 배지 4-2)가 사용되는 경우에서 조차, 10% FBS를 포함하는 배양 배지(배양 배지 2)에서 배양됨으로써 수득되는 촉진 효과와 비교하여 세포 증식상의 촉진 효과를 기대하기 어려웠다. 즉, 무혈청 배양 배지(배양 배지 5)는 미분화된 세포상에서 특별히 증가된 효과를 가진다는 것을 의미한다. 또한 본 발명의 무혈청 배양 배지는 특정 분화능을 잃어서 거의 미분화 상태가 된 세포(예를 들면, 원숭이 신장-유도 COS7 세포)를 무혈청 배양하는데 효과적이었다. 이러한 경우, 10% FBS를 포함하는 배양 배지에서 배양됨으로써 수득된 촉진효과와 유사한 세포 증식에 있어서의 촉진 효과를 얻을 수 있다.
[ 실시예 7: 무혈청 배양 배지에서의 세포 증식 메카니즘 ]
무혈청 배양 배지에서 세포 증식 메카니즘을 규명하기 위하여, 무혈청 배양 배지에 첨가되는 각 첨가 인자에 의하여 야기되는 미토겐 신호 전달 체계(mitogen signal transduction system)의 활성화에 관한 연구를 추가로 수행하였다. 본 발명에서는 각 첨가 인자에 의해 야기되는 세포분열 신호 전달 체계(mitogenic signal transduction system)의 활성화 상태는 웨스턴 블롯(western blot)방법에 의하여 분석하였다. 본원 실시예에서는, 세포 증식과 특히 밀접하게 관련되어 있는 단백질 인산화효소(protein phosphoenzymes) 중에서, 세포 밖 신호 조절 카이네이즈 Erk 1/2 및 Akt (PI3K의 다운스트림에 위치하며, 세포 기능의 조절과 관련된 단백질 인산화 효소)에 집중하였다. Erk1 1/2 및 Akt가 인산화 되었을 때 그들은 활성 형태로 전환한다. 12-웰 플레이트 상의 10% FBS를 포함하는 배양 배지에서, 인간 중간엽 줄기세포(세 개의 세포주)를 세포가 서브컨플루언트(subconfluent) 상태가 될 때까지 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 두 번 세척한 뒤, BSA(bovine serum albumin) 1.25 ㎎/㎖를 포함하는 무혈청 배양 배지에 16시간 동안 더 배양하였다. 그 후, 배양된 세포를 다음의 조건에서 각각 배양하였다: (ⅰ) 성장 인자(E: EGF, F:FGF, G:PDGF, H: HGF, I: 인슐린, J: TGF-β), 덱사메타손(D), 트랜스페린(T)을 각각 포함하는 촉진 용액 내, (ⅱ) 지방산 인자(A1: 아라키돈산, A2: 리놀레산, A3: 리놀렌산, A4: 올레산, A5: B1, A6: 포스파디딘산, A7: 포스파티딜콜린)를 각각 포함하는 촉진 용액 내; 및 (ⅲ) 이들을 포함하지 않은 대조군 용액 내에서 각각 5분 동안 배양하였다. 또한, 각 촉진 용액, 및 대조군 용액을 아이스에서 석션(suction)함으로써 제거한 뒤, 세포를 PBS로 두 번 세척하였다. 상기와 같이 세척된 세포를 용해 버퍼(lysis buffer)에 용해시켰다. 결과물 세포 용해 용액을 10 분동안 6,500xg 에서 원심분리하였고, 상청액을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤(SDS-polyacrylamide gel)상에서 전기영동(electrophoresed)하였다. 단편으로 분리된 단백질을 PVDF 막(Millipore Co. 에서 제조)위로 옮겼고, 단편을 항인산화-특이적 Erk 1/2 항체 또는 항인산화-특이적 Akt 항체(양쪽 모두 Cell Signaling technology Inc.에 의해 제조)로 분석하였다. 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
도 11은 성장 인자(E 에서 J), 덱사메타손(D), 및 트랜스페린(T)으로 자극받은 세포로부터 수득한 단백질의 단편을 나타낸다. 도 11에서 보는 바와 같이, 자극되지 않은 대조군 세포와 비교하여, Erk 1/2는 EGF(E), FGF(F), PDGF(G), 인슐린(I), 및 HGF(H)에 의해 자극된 세포에서 더욱 인산화되었다. 특히, HGF에 의해 자극된 세포에서, 농도 의존적으로 Erk 1/2의 인산화가 촉진되었고, Akt의 인산화 또한 촉진되었다.
도 12는 지방산 인자(A1에서 A7)에 의해 자극된 세포로부터 수득된 단백질의 단편을 나타낸다. 도 12에서 보는 바와 같이, 대조군 세포와 비교하여, Erk 1/2의 인산화 및 Akt는 포스파티딘산(A6)에 의하여 자극된 세포에서 강하게 촉진되었다. 또한, Erk 1/2의 인산화는 아라키돈산(A1), 리놀레산(A2), 리놀렌산(A3), 올레산(A4), 및 포스파티딜콜린(A7)에 의해 자극된 세포에서 촉진되었다. 즉, 이는 이러한 지방산 인자가 에너지 자체 및 배양된 세포의 막 구성성분으로 제공될 뿐만 아니라, 성장인자 및 활성화된 세포분열 신호 전달 체계에 작용한다는 사실을 보여준다.
[ 실시예 8: 인간 골수-유도 중간엽 줄기세포의 무혈청 배양에 추가되는 기초 인자( base factor)의 효과]
10% FBS를 포함하는 배양 배지에 염화리튬(lithium chloride, LiCl)을 첨가하면 wnt(wingless/int) 신호 경로가 활성화되며, 이에 따라 인간 중간엽 줄기세포의 증식을 촉진시킨다는 것이 알려져 있다. 또한 항산화제(환원제(reducing agent))로서 작용하는 L-글루타치온(L-glutathione)이 인간 배아-줄기 세포(embryo-stem cell(ES cell))의 무혈청 배양에 사용되어 왔다. 염화리튬 및 L-글루타치온이 중간엽 줄기세포의 증식에 어떠한 영향을 미치는지에 대하여 알아보기 위하여, 인간 배아-줄기 세포를 하기에 기술된 무혈청 배양 배지에 염화 리튬 또는 L-글루타치온을 첨가함으로써 제조된 각각의 배양 배지를 사용하여 배양하였다.
인간 장골 골수액-유도 중간엽 줄기 세포(human iliac bone marrow fluid-derived mesenchymal stem cells)를 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지를 포함하는 10cm 플레이트 상에서 5% CO2에 37℃로 CO2 배양기에서 배양하였다. 서브컨플루언트 상태가 시작된 후, 세포를 PBS(-)에 두 번 세척한 뒤, 0.05% 트립신 및 0.2mM EDTA를 포함하는 PBS에서 2 분 동안 배양하여 세포를 분산시켰다. 상기 과정을 거친세포를 혈청을 포함하지 않은 식물-유래 트립신 억제제(Sigma T6522)와 함께 재현탁하였다. 또한 혈청을 포함하지 않은 DMEM 배양 배지와 함께 세 번 세척한 뒤, 배양된 세포를 Coulter counter(Z1 Signal, Coulter Co.)를 사용하여 세포 개수를 측정하였다. 재현탁된 세포를 다음의 서로 다른 배양 배지를 사용하여 5000 cells/㎠ 농도로 96-웰 플레이트 상에 재접종하였다.
(배양 배지 2) 10% FBS
(배양 배지 4-2) 성장 인자, 지방산 및 인지질 (PA, PC) + EGF + VC
(배양 배지 4-3) 성장 인자, 지방산 및 인지질 (PA, PC)+ EGF + VC-HGF
(배양 배지 4-4) 배양 배지 4-2 + 염화 리튬 (1 mM, Sigma L4408)
(배양 배지 4-5) 배양 배지 4-2 + L-글루타치온(2 ㎍/㎖, Sigma G6013)
배양 배지 당 세 개의 샘플로 실험을 수행하였다(n=3). 배양 배지를 매 2 내지 3일 마다 교체하였다. 세포 카운팅 키트 WST-8 (Dojindo Lab.)을 사용하여 배양 8일째의 세포의 수를 측정하였다. 결과는 도 15(a) 및 (b)에 나타내었다.
도 15(a)에서 보는 바와 같이, 배양 배지 4-2 및 배양 배지 2에서 배양된 세포의 증식능(proliferation potentials)과 비교해보면, 배양 배지 4-4에서 배양된 세포의 증식능이 배양 8일째에 현저하게 높아졌다(분수값은 평균값 ±SD값을 가리키며, 실험결과는 배양 배지 당 세 개의 샘플로 수행하였다).
도 15(b)에서 보는 바와 같이, 배양 배지 4-2 및 배양 배지 2에서 배양된 세포의 증식능(proliferation potentials)과 비교해보면, 배양 배지 4-5에서 배양된 세포의 증식능이 배양 8일째에 현저하게 높아졌다(분수값은 평균값 ±SD값을 가리키며, 실험결과는 배양 배지 당 세 개의 샘플로 수행하였다).
[ 실시예 9: 골수-유래 중간엽 줄기세포의 무혈청 초기 배양에서 성장 인자의 효과]
초기 배양된 줄기 세포를 배양하기 위한 배양 배지에 첨가되는 성장 인자를 연구하기 위하여, 장골-유래 골수액을 히로시마 대학 병원 및 환자 윤리 위원회의 동의로 히로시마 대학 병원(Hiroshima University Hospital)의 환자로부터 수득하였다. 밀도 구배 원심 분리 방법을 사용하여, 단핵 세포 단편 (MSCs 포함)을 장골-유도 골수액으로부터 분리하였다. 단핵구 세포 단편을 다음의 배양 배지를 사용하여 1 x 106 (핵) cell/㎠의 밀도로 24-웰 플레이트상에 5% CO2, 37℃로 CO2 배양기에서 배양하였다.
기저 배지가 DMEM/MCDB=1:1이고 다음의 첨가제가 첨가된 다음과 같은 배양 배지에서 배양을 수행하였다.
(배양 배지 1) 첨가제 없음
(배양 배지 2) 10% FBS (fatal bovine serum)
(배양 배지 3) 성장 인자 및 지방산
(배양 배지 4) 성장 인자, 지방산, 및 인지질 (PA, PC) + EGF + VC (도 10의 배양 배지 4-2)
(배양 배지 10-1) 배양 배지 10에서 FGF만을 제외하였다.
(배양 배지 10-2) 배양 배지 10에서 TGF-β만을 제외하였다.
(배양 배지 10-3) 배양 배지 10에서 HGF만을 제외하였다.
(배양 배지 10-4) 배양 배지 10에서 FGF 및 TGF-β를 제외하였다.
(배양 배지 10-5) 배양 배지 10에서 FGF 및 HGF를 제외하였다.
(배양 배지 10-6) 배양 배지 10에서 TGF-β 및 HGF를 제외하였다.
(배양 배지 10-7) 배양 배지 10에서 FGF, TGF-β 및 HGF를 제외하였다.
(배양 배지 11) 중간엽 줄기세포 증식을 위한 MF-배지 (TMMFM-001, TOYOBO Co.에서 제조)
배양 배지 당 세 개의 샘플(3 배양 시스템)로 실험을 수행하였다(n=3). 배양 배지를 매 2 내지 3일 마다 교체하여 주었다. 배양 14일 후, 배양 배지를 PBS로 두 번 세척하고, 0.05% 트립신 및 0.2mM EDTA를 포함하는 PBS에 배양하였다. 상기와 같은 세포를 수득하였다. 배양된 세포를 Coulter counter(Z1 Signal, Coulter Co.)를 사용하여 세포 개수를 측정하였다. 그 결과를 도 16(a) 및 (b)에 나타내었다.
도 16(a)에서 보는 바와 같이, 계대 배양에 있어서 높은 세포 증식 효과를 나타내었던 배양 배지 3 및 10 모두에서, 골수-유래 중간엽 줄기 세포의 초기 배양에서 세포 증식의 낮은 촉진 효과를 나타내었다. 이는 MSC를 제외한 골수 단핵구 집단 내의 조혈 계통 세포의 수가 MSC 의 증식에 영향을 주었기 때문인 것으로 보인다. 이러한 비접착성(nonadherent) 조혈 계통 세포는 배양 배지를 매 교체할 때 제거되기 때문에, 일단 계대배양이 시작된 후에는 비접착성 조혈 계통 세포가 존재하기 힘들다. 반면에, 배양 배지 10 (즉,배양 배지 10-1 에서 10-7)으로부터 세 가지 성장인자 중 어느 하나가 결손되는 경우, 무혈청 조건 하에서 배양된 중간엽 줄기 세포의 증식능이 향상되었다. 예를 들면, 배양 배지 10-1에서, 배양된 세포의 증식이 촉진되었다. 또한 배양 배지 10-4에서, 배양된 세포의 증식능이 향상되었다. 또한 배양된 세포의 증식능은 배양 배지 10-7에서 현저하게 증가하였다(분수값은 평균값 ±SD값을 가리키며, 실험결과는 배양 배지 당 세 개의 샘플로 수행하였다). 따라서, 중간엽 줄기세포를 제외한 많은 세포들, 예컨대 조혈 세포가 단일 무혈청 배지에 존재하는 경우에는 혈청을 대체할 물질의 조성을 변화시킬 필요가 있다.
더 나아가, 도 16(b) 에 나타난 바와 같이, 골수액에서 분리한 초기 MSC 를 상업적으로 이용가능한 배양 배지 2 및 배양 배지 11에서 배양한 경우와 비교했을 때, 골수액에서 분리한 초기 MSC 를 배양 배지 10-7에서 배양한 경우에는 그 배양된 세포의 세포 증식이 훨씬 증가하였다.
[ 실시예 10 : 미분화된 세포주의 무혈청 배양]
미분화된 세포를 계대배양하기 위한 배양 배지에 첨가되는 성장 인자를 알아보기 위하여, 마우스 중간엽 세포주 10T 1/2 (RIKEN BioResource Center 에서 제공), 중국 햄스터 난소-유래 세포주 CHO 세포 (RIKEN BioResource Center 에서 제공), 및 인간 피부-유래 섬유아세포 (Health Science Research Resource Bank, HSRRB) 를 다음의 배양 배지에서 배양하였다.
기저 배지가 DMEM/MCDB=1:1이고 다음의 첨가제가 첨가된 다음과 같은 배양 배지에서 배양을 수행하였다.
(배양 배지 1) 첨가제 없음
(배양 배지 2) 10% FBS (fatal bovin serum)
(배양 배지 10-5) 배양 배지 10에서 FGF 및 HGF를 제외하였다.
(배양 배지 10-7) 배양 배지 10에서 FGF, TGF-β 및 HGF를 제외하였다.
(배양 배지 10-8) 배양 배지 10에서 FGF, TGF-β, HGF 및 PDGF를 제외하였다.
10T 1/2 세포, CHO 세포 및 섬유아세포를 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지를 포함하는 10cm 플레이트 상의 5% CO2에 37℃로 CO2 배양기에서 배양하였다. 서브컨플루언트가 되기 시작한 후, 세포를 PBS(-)에 세척한 뒤, 0.05% 트립신 및 0.2mM EDTA를 포함하는 PBS에서 2 분 동안 배양한 후 플레이트에서 분리하였다. 분리된 세포는 혈청을 함유하지 않는 식물-유래 트립신 억제제(Sigma T6522)로 재현탁하였다. 또한 혈청을 포함하지 않은 DMEM 배양 배지와 함께 세 번 세척한 뒤, 배양된 세포를 Coulter counter(Z1 Signal, Coulter Co.)를 사용하여 세포 개수를 측정하였다. 재현탁된 세포를 상기의 서로 다른 배양 배지를 사용하여 5000 cells/㎠ 농도로 96-웰 플레이트 상에 재접종하였다. 실험은 배양 배지당 세 개의 샘플로 수행하였다. 배양 배지는 매 2일 또는 3일마다 교체하였다. 배양 8일 째에, 세포를 WST-8 키트(Dogindo Lab.)를 이용하여 계수하였다. 그 결과를 도 17(a) 내지 (c) 에 나타내었다.
도 17(a) 에 나타난 바와 같이, 배양 배지 10-5에서 배양된 세포주 10T 1/2 세포는 배양 배지 2에서 배양된 10T 1/2 세포와 충분히 동등한 세포 증식능을 보였다 (분수값은 평균값±SD값을 가리키며, 실험결과는 배양 배지 당 세 개의 샘플로 수행하였다). 또한, 도 17(b) 에 나타난 바와 같이, 배양 배지 10-7에서 배양된 CHO 세포는 효과적인 세포 증식능을 보였다 (분수값은 평균값±SD값을 가리키며, 실험결과는 배양 배지 당 세 개의 샘플로 수행하였다). 나아가, 도 17(c) 에 나타난 바와 같이, 배양 배지 2에서 배양된 섬유아세포와 비교했을 때, 배양 배지 10-8에서 배양된 섬유아세포는 배양 8일째에 현저하게 높은 세포 증식능을 보였다 (분수값은 평균값±SD값을 가리키며, 실험결과는 배양 배지 당 세 개의 샘플로 수행하였다).
본 발명에 따르면, 무혈청 배양 배지에서조차, 동물 세포는 10% 혈청을 포함하는 배양 배지에서의 배양과 동등하거나 더 빠른 속도로 증식할 수 있고, 그 특성을 잃지 않고 증식할 수 있다. 세포 증식은 혈청으로 인하여 개별적으로 각각 그 효과가 다르다. 그러나, 본 발명에 따르면, 개별적인 차이를 고려할 필요가 없다. 또한, 본 발명에 따르면, 인간 중간엽 줄기 세포의 특성(예컨대, 골원성 분화능 및 지방 분화능)을 높은 수준으로 유지하면서 계속적으로 계대배양 하는 것이 가능하다.
이상 기술된 본 발명은 다양한 방식으로 변형이 가능하다는 것이 자명하다. 그러한 변형은 본 발명의 사상 및 범위로부터 떨어져 있는 것이 아니며, 그러한 모든 변형이 이하의 특허청구항의 범위 안에 포함된다는 것은 당업계에 자명하다.
본 발명은 세포 배양을 위해 필요한 혈청의 농도를 감소시킴으로써 비용을 절감시킬 수 있고, 재생 의학에 사용되는 중간엽 줄기세포를 안전하고 낮은 비용으로 제공할 수 있다.

Claims (55)

  1. FGF, PDGF, TFG-β, 및 HGF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함하는, 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지 첨가제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 배양 배지 첨가제.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 배양 배지 첨가제.
  5. 제4항에 있어서, 콜레스테롤을 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  6. 제1항에 있어서, EGF, CTGF, VEGF 및 아스코르브산(ascorbic acid) 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  7. 제1항에 있어서, 지질 산화 억제제를 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E), L-글루타치온(L-glutathione), 또는 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)인 배양 배지 첨가제.
  9. 제1항에 있어서, 염화 리튬(lithium chloride)을 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  10. 제1항에 있어서, 계면활성제를 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)인 배양 배지 첨가제.
  12. 제1항에 있어서, 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  13. 제1항에 있어서, 덱사메타손(dexamethasone)을 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  14. 제1항에 있어서, 상기 동물 세포는 미분화된 세포인 배양 배지 첨가제.
  15. 제1항에 있어서, 상기 동물 세포는 중간엽 줄기세포인 배양 배지 첨가제.
  16. 제1항의 배양 배지 첨가제의 조성물을 포함하는, 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지.
  17. 제16항의 배양 배지 내에서 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는, 동물 세포의 무혈청 배양 방법.
  18. 제1항의 배양 배지 첨가제를 포함하는, 동물세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지 첨가제 키트.
  19. FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성 장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 각각 포함하는, 동물세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지 첨가제 키트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민( phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인지질인 배양 배지 첨가제 키트.
  21. 제19항에 있어서, 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 배양 배지 첨가제 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 지방산은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 미리스틱산(myristic acid), 팔미토일산(palmitoyl acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 스테아르산(stearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지방산인 배양 배지 첨가제 키트.
  23. 제22항에 있어서, 콜레스테롤을 더 포함하는 배양 배지 첨가제 키트.
  24. 제19항에 있어서, EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 더 포함하는 배양 배지 첨가제 키트.
  25. 제19항에 있어서, 지질 산화 억제제를 더 포함하는 배양 배지 첨가제 키트.
  26. 제25항에 있어서, 상기 지질 산화 억제제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(DL-α-tocopherol acetate)(비타민 E), L-글루타치온(L-glutathione), 또는 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)인 배양 배지 첨가제 키트.
  27. 제19항에 있어서, 염화 리튬을 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  28. 제19항에 있어서, 계면활성제를 더 포함하는 배양 배지 첨가제 키트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 계면활성제는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 또는 트윈-80(Tween-80)인 배양 배지 첨가제 키트.
  30. 제19항에 있어서, 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 및 셀렌산염(selenate)을 더 포함하는 배양 배지 첨가제 키트.
  31. 제19항에 있어서, 덱사메타손(dexamethasone)을 더 포함하는 배양 배지 첨가제 키트.
  32. 제19항에 있어서, 상기 동물 세포는 미분화된 세포인 배양 배지 첨가제 키트.
  33. 제19항에 있어서, 상기 동물세포는 중간엽 줄기세포인 배양 배지 첨가제 키트.
  34. 제19항의 배양 배지 첨가제 키트 내에 포함된 구성성분을 포함하는, 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지.
  35. 제34항의 배양 배지 내에 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 동물 세포의 무혈청 배양 방법.
  36. FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 기저 배지에 동시에 첨가하는 단계를 포함하는, 동물 세포의 무혈청 배양 방법.
  37. 제36항에 있어서, 기저 배지에 적어도 하나의 지방산을 더 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  38. FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함하는 배양 배지 첨가제에 있어서, 분화능을 유지하면서 줄기 세포를 계속적으로 계대배양(subculturing) 하기 위한 배양 배지 첨가제.
  39. 제38항에 있어서, 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 배양 배지 첨가제.
  40. FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 포함하는 배양 배지 첨가제 키트에 있어서, 분화능을 유지하면서 줄기 세포를 계속적으로 계대배양(subculturing) 하기 위한 배양 배지 첨가제 키트.
  41. 제40항에 있어서, 적어도 하나의 지방산을 더 포함하는 배양 배지 첨가제 키트.
  42. FGF, PDGF, TGF-β, 및 HGF로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 성장 인자; 및 적어도 하나의 인지질을 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함하는, 분화능을 유지하면서 줄기 세포를 계속적으로 계대배양(subculturing) 하기 위 한 방법.
  43. 제42항에 있어서, 기저 배지에 적어도 하나의 지방산에 기저 배지를 더 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  44. PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함하는, 1차-배양된 중간엽 줄기 세포를 배양하기 위한 배양 배지 첨가제.
  45. PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함하는, 1차-배양된 중간엽 줄기 세포를 배양하기 위한 배양 배지 첨가제 키트.
  46. PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함하는, 1차-배양된 중간엽 줄기 세포를 배양하기 위한 방법.
  47. TGF-β; PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함하는, 마우스 섬유아세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 배양 배지 첨가제.
  48. TGF-β; PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함하는, 마우스 섬유아세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 배양 배지 첨가제 키트.
  49. TGF-β; PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 기저 배지에 동시에 첨가하는 단계를 포함하는, 마우스 섬유아세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 방법.
  50. PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함하는, 중국 햄스터 난소-유래 세포(Chinese hamster ovary-derived cell)를 계속적으로 계대배양 하기 위한 배양 배지 첨가제.
  51. PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함하는, 중국 햄스터 난소-유래 세포(Chinese hamster ovary-derived cell)를 계속적 으로 계대배양 하기 위한 배양 배지 첨가제 키트.
  52. PDGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 중국 햄스터 난소-유래 세포(Chinese hamster ovary-derived cell)를 계속적으로 계대배양 하기 위한 방법.
  53. FGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함하는, 인간 섬유아세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 배양 배지 첨가제.
  54. FGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 포함하는, 인간 섬유아세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 배양 배지 첨가제 키트.
  55. FGF; 적어도 하나의 인지질; 적어도 하나의 지방산; 및 EGF, CTGF, VEGF, 및 아스코르브산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 인자를 동시에 기저 배지에 첨가하는 단계를 포함하는, 인간 섬유아세포를 계속적으로 계대배양하기 위한 방법.
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