CN117757738A

CN117757738A - 一种胎牛血清替代物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117757738A
Application number: CN202311779865.8A
Authority: CN
Inventors: 薛长湖; 殷浩文; 郑洪伟; 杨鲁; 闫晓萌
Original assignee: Quanzhou Marine Biological Industry Research Institute; Ocean University of China
Current assignee: Quanzhou Marine Biological Industry Research Institute; Ocean University of China
Priority date: 2023-12-22
Filing date: 2023-12-22
Publication date: 2024-03-26

Abstract

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种胎牛血清替代物及其制备方法和应用。胎牛血清替代物包括替代物和添加物；其中替代物为抗凝牛血经进行脱纤维处理后，再经离心、重悬、冻融、浓缩处理，得到的产物；所述添加物包括非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G。本发明得到了一种胎牛血清替代物，并进一步的将该替代物应用在肌肉干细胞培养的无血清培养中，得到了一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的无血清培养基，该培养基可以用于细胞培养肉中。这有效的促进了大黄鱼肌肉干细胞在细胞培养肉生产过程中快速增殖和稳定传代，为细胞培养肉提供了充足的细胞，有利于细胞培养肉产业化生产。

Description

一种胎牛血清替代物及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种胎牛血清替代物及其制备方法和应用。

背景技术：

世界范围内人口数量的激增及水质富营养化所产生的环境问题，使鱼类养殖业正面临前所有未的挑战。细胞培养肉作为综合细胞生物学、生物技术、食品技术的一个全新交叉领域，未来会对可持续肉类生产系统产生巨大影响。细胞培养肉是指在无菌环境下通过组织细胞培养产生的动物肌肉细胞，而不是传统的动物肌肉食品。细胞培养肉作为一项肉类生产的创新技术主要包括种子细胞提取、细胞扩增、细胞分化及食品化技术，可以大幅提高肉类生产效率。胎牛血清是采取自5-8个月胎龄的牛胚胎中的胎血，其富含细胞生长增殖所需的生长因子、激素、氨基酸及脂质等物质，广泛应用于细胞培养。传统细胞培养严重依赖胎牛血清培养基，本质上是不可持续的，并暴露出成本昂贵、动物伦理等问题，因此使用更符合人道的低成本胎牛血清替代物成为重要的研发趋势。

肌肉干细胞源于脊椎动物胚胎形成早期的中胚层，一种扁平、有突起的细胞，是骨骼肌再生的必要条件。肌纤维受损后，肌肉干细胞可以快速增殖分化融合形成新的肌纤维。同样，细胞培养肉在体外选择性获取肌肉干细胞后进行快速增殖并诱导分化，促使大量肌肉干细胞融合形成肌纤维。因此需要开发一种适应于大黄鱼肌肉干细胞长期增殖的胎牛血清替代物至关重要。

目前，领域内虽然有报道相关无血清培养基配方(CN107488625B；CN115896008A；CN104805054B)，但是不同细胞的营养需求、代谢差异等原因导致无血清培养基不具有普适性。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是传统细胞培养严重依赖胎牛血清培养基，本质上是不可持续的，并暴露出成本昂贵、动物伦理等问题，需要开发低成本胎牛血清替代物；另外，不同细胞的营养需求、代谢差异等原因导致无血清培养基不具有普适性，目前未见报道适应于大黄鱼肌肉干细胞培养的无血清培养基。

为解决上述问题，本发明经过不断的实验和探索，得到了一种胎牛血清替代物，并进一步的将该替代物应用在肌肉干细胞培养的无血清培养中，得到了一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的无血清培养基，该培养基可以用于细胞培养肉中。这有效的促进了大黄鱼肌肉干细胞在细胞培养肉生产过程中快速增殖和稳定传代，为细胞培养肉提供了充足的细胞，有利于细胞培养肉产业化生产。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，一种胎牛血清替代物，包括替代物和添加物；其中替代物为抗凝牛血经进行脱纤维处理后，再经离心、重悬、冻融、浓缩处理，得到的产物；所述添加物包括非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G。所述替代物是一种混合物，是牛血经过离心、重悬冻融、浓缩后的物质；里面主要是蛋白质等营养物质，但单纯的替代物不足以支撑细胞的生长，因此本发明筛选了一些促进细胞增殖的添加物，由替代物和添加物代替胎牛血清。在添加物中，非必需氨基酸的添加可以显著降低细胞自身生产非必需氨基酸的副作用；脂质作为细胞膜的结构组分，在信号传输过程中起到重要作用。ITS中包含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠；胰岛素可以促进细胞对葡萄糖和氨基酸的吸收、脂肪的生成并促进细胞增殖；转铁蛋白是铁离子的重要载体；亚硒酸钠是谷胱甘肽过氧化物酶及其它一些重要酶的辅助因子。人血清白蛋白可以运输脂肪酸、氨基酸、激素等作用。胎球蛋白是一种血浆糖蛋白，具有促进细胞黏附和生长的作用。Ultroser G是一种包含激素、生长因子、结合蛋白等细胞生长所必须的营养物质。单独添加以上替代物都不足以支撑细胞增殖，本发明经过筛选和实验得到了可以补足替代物不足的营养的添加物，实现替代物和添加物混合后可以代替胎牛血清促进细胞增殖。

进一步的，替代物和添加物按照体积比1：0.01～100的比例混合，优选为1:1；添加物中按体积比添加非必需氨基酸的浓度为0.01％-100％，脂质的浓度为0.01％-100％；ITS的浓度为0.01％-100％；ITS中包含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠，其中，胰岛素含量为0.01-100mg/mL，转铁蛋白含量为0.01-100mg/mL，亚硒酸钠含量为0.01-100μg/mL；人血清白蛋白的浓度为0.01-100mg/mL；胎球蛋白的浓度为0.01-1000μg/mL；Ultroser G的浓度为0.01～10％。优选为非必需氨基酸添加1％、脂质添加1％、ITS添加1％、人血清白蛋白添加1mg/mL、胎牛蛋白添加50μg/mL、UltroserG添加1％。

进一步的，所述替代物的制备方法包括以下步骤：

(1)收集抗凝牛血进行脱纤维处理：将浸泡氢氧化钠的玻璃珠加入抗凝牛血中，在4～60℃下，1-3000rpm的转速下转动1-120min；其中脱纤维的作用是脱除纤维蛋白原，防止后期配培养基的时候，培养基中的钙盐、镁盐促使凝血。

(2)步骤(1)得到的脱纤维牛血经过离心后取上清液；离心后的沉淀重悬后再次离心，取中层沉淀；将第一次离心的上清液和第二次离心的中层沉淀混合后冻融、浓缩处理，得到胎牛血清替代物。离心是去除血细胞，重悬是将沉淀物重新冲洗一遍，二次离心，最大程度留取初血细胞以外的物质。冻融是将牛血中除了血细胞以后的细胞通过冻融破裂细胞膜，释放细胞因子。

进一步的，步骤(1)抗凝牛血为向无菌牛血内加入抗凝剂的牛血。所述抗凝剂为肝素钠、EDTA、枸橼酸钠、氯化钠中的一种或多种；所述无菌牛血为使用无菌针管从牛颈动脉处取血，全程无菌操作得到的牛血。

进一步的，步骤(2)中离心步骤的参数为100-10000rpm离心1-120min；再次离心的参数为100-10000rpm离心1-120min。

进一步的，步骤(2)中将离心后的沉淀使用1：0.1～10的Dhanks液重悬。

进一步的，步骤(2)中将混合液于-20～-80℃中反复冻融2～10次。-20℃以下，可以更好的形成冰晶，刺破细胞膜释放细胞因子。反复冻融2-10次是为了充分刺破细胞膜。

进一步的，步骤(2)所述的浓缩为将反复冻融的溶液于40～60℃下旋转蒸发浓缩。

一种上述胎牛血清替代物的制备方法，将替代物和添加物混合后过膜灭菌、包装即可。优选为过0.22μm滤膜，可以保证无菌。

本发明得到的胎牛血清替代物颜色呈现浅黄色，澄清透明，其中各组分均为正常市售产品。

一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的培养基，包括上述胎牛血清替代物和基础培养基；所述胎牛血清替代物按照体积比1-20％的比例添加至基础培养基中。优选为按照20％的比例添加至基础培养基中。

进一步的，所述的基础培养基包括基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，其中基础培养基为MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种或多种组合。优选为DMEM/F12培养基，本发明研究表明通过添加上述添加物，DMEM/F12培养基比MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基更适合大黄鱼肌肉干细胞的生长。

进一步的，基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的体积比为99：1；青霉素-链霉素-两性霉素B溶液中，青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL以及两性霉素B的含量为25μg/mL。

本发明研究表明所述一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的培养基，可以满足大黄鱼肌肉干细胞的培养要求，细胞形态正常，相较于通用型生长培养基DMEM/F12含10％胎牛血清，本发明提供的一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物，不含胎牛血清成分，成本低廉，可以用于大规模产业化应用。

本发明还提供了所述一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的培养基在细胞培养肉中的应用。所述将大黄鱼肌肉干细胞接种于所述的胎牛血清替代物培养基中可以快速增殖并连续传代。

进一步的，将大黄鱼肌肉干细胞接种至所述的用于大黄鱼肌肉干细胞的培养基中，每两天换液一次，接种后第三天对细胞进行形态学观察并用TrypLE酶消化，得到细胞悬液计数后重新接种至新鲜的培养基中。

进一步的，大黄鱼肌肉干细胞接种量为1×10⁴～2×10⁵个/mL。

进一步的，大黄鱼肌肉干细胞培养条件为28℃的潮湿无菌环境。。

本发明的有益效果在于：

(1)大黄鱼肌肉干细胞的快速增殖是细胞培养肉生产的关键环节之一，本发明的一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物及其制备方法具有很好替代胎牛血清，并且其中不含有胎牛血清，用于大黄鱼肌肉干细胞培养时细胞生长状态稳定。

(2)本发明还提供了一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基，使大黄鱼肌肉干细胞至少连续传7代(21天)且快速增殖，消除了大黄鱼肌肉干细胞对胎牛血清的依赖，从而避免使用胎牛血清所带来的一系列问题，成本低廉，可以用于大规模产业化应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物中替代物的不同浓度对细胞活力影响情况：其中，与仅培养基组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图2为一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物中添加物的不同成分对细胞活力情况：其中，与仅培养基组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图3为一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物中添加物排除法比较细胞活力情况：其中，与DMEM/F12含10％胎牛血清组相比，##P＜0.01。

图4为一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物中添加物验证缺少β-巯基乙醇或胰岛素样生长因子对细胞活力的差异表现：其中，与DMEM/F12含10％胎牛血清组相比。

图5为一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物中替代物和添加物复配对细胞活力情况：其中，与DMEM/F12含10％胎牛血清组相比，##P＜0.01。

图6为一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基基础培养基对细胞活力情况：其中，与F10培养基组相比，@@P＜0.01。

图7为一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基。

图8为一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基培养大黄鱼肌肉干细胞传7代明场图。

具体实施方式：

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径获得试剂和材料。

大黄鱼肌肉干细胞为实验室采用常规方法制备所得，分离大黄鱼幼鱼肌肉组织，分别采用0.2％胶原酶Ⅰ和0.1％胰蛋白酶溶液酶解，使用100μm纱布过滤后并离心，使用完全培养基重悬后接种于T25瓶放在28℃的潮湿无菌环境中培养。

一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物的制备方法，所述胎牛血清替代物包括替代物和添加物，其中不含有胎牛血清。

实施例1一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物中替代物的制备

替待物的制备方法包括如下：收集抗凝牛血→脱纤维→离心→重悬→冻融→浓缩→替代物。

使用无菌针管从牛颈动脉出取血，全程无菌操作，收集100mL牛血，同时添加4％枸橼酸钠混匀抗凝处理。使用4M氢氧化钠浸泡玻璃珠过夜，清洗干净后放入新鲜采集的抗凝牛血中，在4℃下，放置摇床上200rpm摇动60min。将脱纤维牛血1800rpm离心60min，取上清备用，剩余的沉淀按照1：2添加Dhanks液，使用巴氏管轻微吹打重悬，1800rpm离心60min，取中层沉淀。将备用的上清和中层沉淀混匀后于-80℃反复冻融5次，在55℃旋转蒸发仪中将溶液浓缩至一半体积得到替代物，放置-80℃备用。

鼠尾胶原蛋白Ⅰ型铺板：用0.006M的无菌乙酸溶液将鼠尾胶原蛋白Ⅰ型稀释到0.012mg/mL，以5μg/cm2浓度添加至24孔细胞培养板中，置于4℃冰箱过夜，PBS润洗后用于细胞接种。

细胞接种：将约5×104个大黄鱼肌肉干细胞接种在预铺鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的24孔板中，在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，以CCK-8试剂测定细胞活力，评价用于大黄鱼肌肉干细胞的促增殖效果。

用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物基础培养基配制：DMEM/F12基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，DMEM/F12基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的体积比为99：1，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液中，青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL以及两性霉素B的含量为25μg/mL。

首先设置替代物的不同浓度，其中替代物添加量：1％、5％、10％，结果如图1所示，替代物5％和10％添加量同仅培养基组相比具有显著性差异(**P＜0.01)，且10％的添加量最优。

注：各组之间使用GraphPadPrism8.0进行单因素方差分析再使用Dunnett法进行多重比较；与仅培养基组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，大黄鱼肌肉干细胞在10％替代物添加的培养基中可以恢复细胞形态并且实现贴壁培养，但是大黄鱼肌肉干细胞增殖活力低。1％细胞少量贴壁，5％细胞正常贴壁但仅少量细胞恢复细胞形态。

实施例2一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物中添加物的促增殖效果探究

鼠尾胶原蛋白Ⅰ型铺板：用0.006M的无菌乙酸溶液将鼠尾胶原蛋白Ⅰ型稀释到0.012mg/mL，以5μg/cm²浓度添加至24孔细胞培养板中，置于4℃冰箱过夜，PBS润洗后用于细胞接种。

细胞接种：将约5×10⁴个大黄鱼肌肉干细胞接种在预铺鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的24孔板中，在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，以CCK-8试剂测定细胞活力，评价用于大黄鱼肌肉干细胞的促增殖效果。

按实施例1中10％的添加量添加替代物后，再加入ITS为胰岛素(1mg/mL)、转铁蛋白(0.6mg/mL)、亚硒酸钠(0.7μg/mL)。

首先设置添加物的不同成分的浓度，其中β-巯基乙醇添加量：0.5％、1％、2％；非必需氨基酸添加量：0.5％、1％、2％；脂质添加量：0.5％、1％、2％；ITS添加量：0.5％、1％、2％；胰岛素样生长因子添加量：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL；人血清白蛋白添加量：0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL；胎球蛋白添加量：5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL；Ultroser G添加量：0.5％、1％、2％，结果如图2所示，同仅培养基组相比，β-巯基乙醇添加量：0.5％、1％、2％；非必需氨基酸添加量：0.5％、1％、2％；脂质添加量：0.5％、1％、2％；ITS添加量：0.5％、1％、2％；胰岛素样生长因子添加量：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL；人血清白蛋白添加量：0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL；胎球蛋白添加量：5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL；Ultroser G添加量：0.5％、1％、2％，均可以实现细胞OD₄₅₀的上升，部分组具有显著性(*P＜0.05，**P＜0.01)，各组对细胞均有促进增殖的作用。因此上述添加物的不同成分的浓度均可以不同程度促进细胞增殖。选取各组中的OD₄₅₀最大值所对应的浓度即为最佳浓度。

在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，大黄鱼肌肉干细胞在单因子添加的培养基中无法恢复原始细胞形态，大黄鱼肌肉干细胞死亡率较高。

确定添加物的不同成分的最佳浓度后，将不同成分的最佳浓度组合起来以增加细胞活力水平并促使细胞恢复细胞形态。基于排除法，首轮排除实验分为以下六组：①，β-巯基乙醇、非必需氨基酸、脂质、ITS、胰岛素样生长因子、人血清白蛋白、胎球蛋白、UltroserG；②，β-巯基乙醇、非必需氨基酸、脂质、ITS、胰岛素样生长因子、人血清白蛋白、胎球蛋白；③，β-巯基乙醇、非必需氨基酸、脂质、ITS、胰岛素样生长因子、人血清白蛋白、Ultroser G；④，β-巯基乙醇、非必需氨基酸、脂质、ITS、胰岛素样生长因子、胎球蛋白、Ultroser G；⑤，β-巯基乙醇、非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G；⑥，β-巯基乙醇、非必需氨基酸、脂质、胰岛素样生长因子、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G；⑦，β-巯基乙醇、非必需氨基酸、ITS、胰岛素样生长因子、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G；⑧，β-巯基乙醇、脂质、ITS、胰岛素样生长因子、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G；⑨，非必需氨基酸、脂质、ITS、胰岛素样生长因子、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G分别添加至培养基中，结果如图3所示，同DMEM/F12含10％胎牛血清组比较，⑤和⑨组无显著性差异，其余组具有显著性差异(##P＜0.01)，同时，⑤组中具有最高OD₄₅₀值，即添加物缺少胰岛素样生长因子或β-巯基乙醇对细胞活力的影响均较小。

注：各组之间使用GraphPadPrism8.0进行单因素方差分析再使用Dunnett法进行多重比较；与DMEM/F12含10％胎牛血清组相比，##P＜0.01。

添加物缺少β-巯基乙醇或胰岛素样生长因子对增加细胞活力均较好。β-巯基乙醇是细胞培养基中用于防止氧自由基中毒的有效还原剂，胰岛素样生长因子是具有促生长作用的多肽类物质。为了进一步验证缺少β-巯基乙醇或胰岛素样生长因子对细胞活力的差异表现，第二轮排除实验分为以下三组：①β-巯基乙醇、非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G；②，非必需氨基酸、脂质、ITS、胰岛素样生长因子、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G；③，非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G，分别添加至培养基中，结果如图4所示，与DMEM/F12含10％胎牛血清组相比，各组均没有显著性，即培养基中缺少β-巯基乙醇和胰岛素样生长因子对细胞活力无影响。

注：各组之间使用GraphPadPrism8.0进行单因素方差分析再使用Dunnett法进行多重比较；与DMEM/F12含10％胎牛血清组相比。

培养基中缺少β-巯基乙醇和胰岛素样生长因子对细胞活力无影响。

最终经过筛选得到一种用于大黄鱼肌肉干细胞的胎牛血清替代物中添加物(表1)，其中添加物是经过后续排除法筛选的六种细胞培养补充因子：非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G，细胞形态正常，细胞死亡率低。

表1添加物

成分	添加量
		非必需氨基酸	1％
脂质	1％
		ITS	1％
人血清白蛋白	1mgmL
		胎球蛋白	50μg/mL
UltroerG	1％

实施例3一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基的制备

一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基的制备：基础培养基为DMEM/F12基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，DMEM/F12基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的体积比为99：1，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液中，青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL以及两性霉素B的含量为25μg/mL。

依据实施例1一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物中替代物的制备及最佳浓度及实施例2一种用于大黄鱼肌肉干细胞的胎牛血清替代物中添加物，其中添加物是六种细胞培养补充因子：非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、UltroserG，将替代物和添加物最佳浓度组合起来以增加细胞活力水平并促使细胞恢复细胞形态，设置三组实验：①替代物，②添加物，③替代物+添加物，结果如图5所示，同与DMEM/F12含10％胎牛血清组相比，单独添加替代物组具有显著性差异(##P＜0.01)。而③替代物+添加物组细胞长势良好。

在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，大黄鱼肌肉干细胞在③替代物+添加物培养基中可以恢复细胞形态并且实现贴壁培养，大黄鱼肌肉干细胞增殖活力最高且同DMEM/F12含10％胎牛血清组相比无显著性差异。

实施例4一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物基础培养基选择

一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物基础培养基选择：基础培养基为MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基。

基础培养基添加青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的体积比为99：1，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液中，青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL以及两性霉素B的含量为25μg/mL。

基础培养基添加实施例2中所述添加物的不同成分的最佳浓度、实施例1中10％的添加量添加替代物，结果如图6所示，DMEM/F12培养基组同F10培养基组相比具有显著性(@@P＜0.01)。且DMEM/F12培养基组OD₄₅₀值最高，因此确定DMEM/F12作为用于大黄鱼肌肉干细胞的基础培养基。

注：各组之间使用GraphPadPrism8.0进行单因素方差分析再使用Dunnett法进行多重比较；与F10培养基组相比，@@P＜0.01。

在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，大黄鱼肌肉干细胞形态正常，DMEM/F12培养基组细胞数量为1×10⁵个/mL，同MEM培养基、DMEM培养基、F10培养基组相比数量最高，大黄鱼肌肉干细胞培养状态最好。

实施例5一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基在细胞培养肉中的应用

肌肉干细胞的快速增殖和稳定传代是细胞培养肉生产过程中的关键步骤，通过实施例4制备一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基包含基础培养基(DMEM/F12)、替代物、添加物，其中添加物包括六种细胞培养补充因子：非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G，如图7所示。被应用在细胞培养肉生产过程中。

细胞接种：将约5×10⁴个大黄鱼肌肉干细胞接种在预铺鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的24孔板中，在28℃的潮湿无菌环境中培养3d。

细胞传代：记录细胞形态后使用TrypLE酶消化，得到细胞悬液计数后重新将约1×105个大黄鱼肌肉干细胞接种在预铺鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的24孔板中，至少传7代。

结果如图8所示，细胞接种在实施例4制备的一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基中并在28℃的潮湿无菌环境中培养3d可以达到传代条件并且至少传7代。通过实施例4制备的一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的胎牛血清替代物培养基有效的促进了大黄鱼肌肉干细胞在细胞培养肉生产过程中快速增殖和稳定传代，为细胞培养肉提供了充足的细胞，有利于细胞培养肉产业化生产。

除了通过实施例1-4制备的用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基包含基础培养基(DMEM/F12)和添加物，其中添加物包括基础添加物(维生素、非必需氨基酸、脂质、ITS、Hepes、谷丙二肽)和细胞补充因子(KnockOut、碱性成纤维生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白)的最优值外，其他浓度数值亦可应用于大黄鱼卫星细胞的增殖和传代，大黄鱼卫星细胞同样可以实现增殖和传代。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种胎牛血清替代物，其特征在于：包括替代物和添加物；其中替代物为抗凝牛血经进行脱纤维处理后，再经离心、重悬、冻融、浓缩处理，得到的产物；所述添加物包括非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G。

2.如权利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于：替代物和添加物按照体积比1：0.01～100的比例混合；添加物中按体积比添加非必需氨基酸的浓度为0.01％-100％，脂质的浓度为0.01％-100％；ITS的浓度为0.01％-100％；ITS的浓度为0.01％-100％；人血清白蛋白的浓度为0.01-100mg/mL；胎球蛋白的浓度为0.01-1000μg/mL；Ultroser G的浓度为0.01～10％。

3.如权利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于所述替代物的制备方法包括以下步骤：

(1)收集抗凝牛血进行脱纤维处理：将浸泡氢氧化钠的玻璃珠加入抗凝牛血中，在4～60℃下，1-3000rpm的转速下转动1-120min；

(2)步骤(1)得到的脱纤维牛血经过离心后取上清液；离心后的沉淀重悬后再次离心，取中层沉淀；将第一次离心的上清液和第二次离心的中层沉淀混合后冻融、浓缩处理，得到胎牛血清替代物。

4.如权利要求3所述的胎牛血清替代物，其特征在于：步骤(2)中离心步骤的参数为100-10000rpm离心1-120min；再次离心的参数为100-10000rpm离心1-120min。

5.如权利要求3所述的胎牛血清替代物，其特征在于：步骤(2)中将离心后的沉淀使用1：0.1～10的Dhanks液重悬。

6.如权利要求3所述的胎牛血清替代物，其特征在于：步骤(2)中将混合液于-20～-80℃中反复冻融2～10次；将反复冻融的溶液于40～60℃下旋转蒸发浓缩。

7.一种权利要求1所述的胎牛血清替代物的制备方法，其特征在于：将替代物和添加物混合后过膜灭菌、包装即可。

8.一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的培养基，其特征在于：包括权利要求1所述的胎牛血清替代物和基础培养基，所述胎牛血清替代物按照1-20％的比例添加至基础培养基中。

9.如权利要求8所述的培养基，其特征在于：所述的基础培养基包括基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，其中基础培养基为MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种或多种组合。

10.权利要求8所述的培养基在细胞培养肉中的应用。