CN105385650A - 一种鱼类肠道上皮细胞的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鱼类肠道上皮细胞分离培养的方法，所述方法包括：鱼类肠道分离清洗；蛋白酶消化组织块；收集细胞，分离酶液与细胞；细胞培养。本发明首次提出了鱼类物肠道上皮细胞培养的可行方法，所述方法具有操作简单、成本低、成功率高、效率高、分离的鱼类肠上皮细胞稳定的特点，解决了肠道上皮细胞易污染的问题。

Description

一种鱼类肠道上皮细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及鱼类肠道上皮细胞的分离培养方法。

背景技术

鱼类分布广，几乎栖居于所有水环境中，从淡水的湖泊到咸水的海洋。也是中国人餐桌上不可多得的一道美食，可以提供丰富的蛋白质，又是唯一的天然多不饱和脂肪酸(n3)来源。近年来，人们对鱼类需求的日益增高，促进了水产养殖业的发展，同时也吸引了大量优秀研究人员的目光。肠道是鱼重要的免疫器官，包涵许多淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。同时鱼体的消化能力和吸收功能依靠着肠道健康。在细胞层面上利用鱼类肠道上皮，可以进行营养代谢如细胞自噬，肠道健康如肠屏障，和肠道发育等等各方面的研究。但是市场上由于技术瓶颈，肠上皮细胞系鲜有见到，对于鱼类而言目前国内外各大细胞库内均没有销售。

原代细胞培养是目前鱼类肠细胞培养的唯一手段。但是由于低等脊椎动物细胞培养操作繁琐，易污染，成本较高，还未见到公开发表的专利。已有文献中仅参考哺乳类肠原代细胞培养进行鱼类细胞培养，并不能完全适用，导致原代肠上皮细胞状态不稳定，成功率低，易污染等。因此提供一种可靠的，可行性高的鱼类肠上皮细胞培养方法迫在眉睫。

发明内容

本发明针对低等脊椎动物的特点，提出了一种高效的，低成本的肠原代细胞分离培养方法。本发明的方法分离得到的鱼类肠上皮细胞稳定，成功率高，无污染。

本发明提出了一种分离培养鱼肠道上皮细胞的方法，所述方法包括：

(1)实验用鱼准备：彻底排空肠道；

(2)肠道组织清洗；在清洗培养基中清洗鱼肠道组织；

(3)蛋白酶消化：将上述肠道组织在蛋白酶中消化，得到消化产物；

(4)细胞过滤和收集：过滤上述消化产物，收集细胞，得到过滤物；

(5)铺明胶：利用明胶对细胞培养板进行铺板；

(6)细胞培养：在培养基中培养细胞。

具体地，所述方法包括：

(1)实验用鱼准备：饥饿24hr，彻底排空肠道。

(2)鱼类肠道组织清洗：取出鱼肠道，短暂在酒精中浸泡，去除靠近肛门端约2cm后，在hanks平衡盐中清洗第一道。后剪成约1cm小段，分段挤出内容物，并在清洗培养基中清洗。接着剪开肠段，在新的培养基中清洗。重复此过程。

(3)蛋白酶消化：在酶混液中消化，得到消化产物。

(4)细胞过滤和收集：利用细胞筛，得到过滤物。转速不大于1000rpm，离心重悬5次。

(5)铺板：利用明胶进行铺板。

(6)细胞培养：28±0.5℃的温度，5％CO₂浓度下，利用DMEM并添加其他营养物质培养。

优选地，所述鱼的大小为100g左右。

所述步骤(1)中，所述排空肠道的方法为饥饿12～24h，优选地，排空肠道时间应大于20h，肠道取出后在酒精中浸泡5s～10s，再在清洗培养基中进行清洗。优选地，所述酒精浓度应为75％；所述清洗过程应在清洗培养基中洗涤大于8次。

所述步骤(2)中，所述清洗培养基为包括双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基。

其中，所述青霉素、链霉素的添加量分别为200IU/ml、200IG/ml。

所述步骤(3)中，所述蛋白酶为胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I的混合液，或胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的混合液，所述酶混合液的用量为所述酶混合液的用量与组织多少及容器大小有关，浸没过组织块即可。

其中，所述胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I的重量比为4:1，所述胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的重量比为1:1.2。具体地，所述酶浓度可以为1.2mg/ml胶原蛋白酶XI和0.3mg/ml中性蛋白酶的混合液或者胰蛋白酶1mg/ml和1.2mg/ml胶原蛋白酶XI的混合液。

其中，当采用胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I消化肠道组织时，应在37℃水浴摇床条件下，对清洁后的肠组织消化30min；或者当采用胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI消化肠道组织时，应在37℃水浴摇床条件下，先用胰蛋白酶消化10min～15min，后去除胰蛋白酶液，换为胶原蛋白酶XI消化15min～20min。

所述步骤(4)中，利用细胞筛对消化产物进行过滤，细胞筛大小为100μm，在转速不大于1000rpm下，离心重悬。优选地，离心重悬5次。

所述步骤(5)中，铺板明胶浓度应为0.01g/ml明胶，在37℃下孵育1h。

所述步骤(6)中，所述细胞在温度为28±0.5℃，CO₂浓度为5％的条件下培养。

其中，所述步骤(6)中，所述培养基为含10％胎牛血清，0.01mg/ml胰岛素，0.02mg/ml转铁蛋白，10mmol/LHEPES，100IU/ml青霉素和100IG/ml链霉素的DMEM培养基，其中，所述培养基PH为7.2～7.4。

本发明还提出了一种清洗培养基，其特征在于，所述清洗培养基为包括青霉素和链霉素的DMEM培养基。其中，所述青霉素和链霉素为双抗；所述青霉素、链霉素的添加量分别为200IU/ml、200IG/ml。

本发明还提出了一种细胞消化液，其特征在于，所述细胞消化液为酶混合液，包括胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I，或胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI。所述细胞消化液用于如上所述的鱼类肠道细胞的分离。

其中，所述胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I的重量比为4:1，或者所述胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的重量比为1:1.2。

本发明进一步提出了一种培养基，所述培养基为含10％胎牛血清，0.01mg/ml胰岛素，0.02mg/ml转铁蛋白，10mmol/LHEPES，100IU/ml青霉素和100IG/ml链霉素的DMEM培养基，所述培养基pH为7.4。

优选地，所述方法所用液体经过0.22μm无菌筛进行过滤。

清洗培养基中所用青霉素和链霉素浓度分别是培养用培养基中青霉素和链霉素的二倍。清洗培养基中的青霉素和链霉素用于杀菌；培养用培养基中的青霉素和链霉素用于抑制细菌生长，由于高浓度青霉素和链霉素会对细胞产生不利影响，因此采用含适宜浓度的抗生素如青霉素和链霉素对得到合适的细胞分离结果至关重要。

本发明的有益效果在于：本发明提出了一种用于分离鱼类肠上皮细胞的方法，所述方法采用的原料简单易得，价格低廉，所述方法操作简单，分离得到的肠上皮细胞稳定，成功率高，无污染。

附图说明

图1为鱼类肠道上皮细胞最初分离时细胞形态图，显微镜200倍(酶液为重量比为1:1.2的胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的混合液)。

图2为鱼类肠道上皮细胞分离培养2天时细胞形态图，显微镜200倍(酶液为重量比为1:1.2的使用胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的混合液)。

图3为鱼类肠道上皮细胞分离培养4天时细胞形态图，显微镜200倍(酶液为重量比为1:1.2的使用胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的混合液)。

图4为鱼类肠道上皮细胞分离培养8天时细胞形态图，显微镜200倍(酶液为重量比为1:1.2的使用胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的混合液)。

图5为鱼类肠道上皮细胞分离培养4天时细胞形态图，显微镜200倍(酶液为重量比为4:1的使用胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶的混合液)。

图6为鱼类肠道上皮细胞分离培养使用不同清洗手段，2天时细胞形态图，显微镜200倍。

图7为鱼类肠道上皮细胞分离培养使用单一酶液(胶原蛋白酶XI)消化细胞，1天时细胞形态图，显微镜200倍。

图8为鱼类肠道上皮细胞分离培养使用单一酶液消化细胞(胰蛋白酶消化10min)，1天时细胞形态图，显微镜200倍。

图9为鱼类肠道上皮细胞分离培养使用单一酶液消化细胞(胰蛋白酶消化20min)，1天时细胞形态图，显微镜200倍。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

本发明给予的实施例是为了更好的讲解说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。相关技术人员在不背离创新宗旨和精神的情况下，可以对本发明的任一步骤进行合理改进。

实施例1鱼类肠上皮细胞的分离

(一)实施动物：80g左右罗非鱼

(二)实验试剂：Hanks平衡盐(sigma公司)，DMEM(gibco公司)，胎牛血清(gibco公司)，胶原蛋白酶XI(sigma公司)，胰蛋白酶(sigma公司)，胰岛素(sigma公司)，转铁蛋白(sigma公司)，HEPES(sigma公司)

(三)实施步骤：将实验所需试剂过0.22μm无菌筛；将实验所需六孔细胞板铺上0.01g/ml明胶37℃孵育1hr，弃掉明胶。取80g罗非鱼在28℃过夜曝气静水中饥饿约24hr，后麻醉。在无菌环境下取出鱼肠道整肠，短暂在75％酒精中浸泡，去除末端2cm，将整肠浸泡在Hanks平衡盐溶液中，剪成约1cm小段，清洗内容物，进行第一遍清洁。后换成含二倍浓度双抗的DMEM培养基进行洗涤，将肠段剖开，洗净内容物。该过程重复八次。将洗净的肠组织收入10ml离心管加入1mg/ml胰蛋白酶6ml，水浴摇床10min后，800rpm离心倒掉上清。向离心管中加入1.2mg/ml胶原蛋白酶XI6ml，重悬，水浴摇床20min后，800rpm离心倒掉上清。加入含200IU/ml青霉素和200IG/ml链霉素的DMEM重复此过程4遍。将得到细胞用含10％胎牛血清，0.01mg/ml胰岛素，0.02mg/ml转铁蛋白，10mmol/LHEPES，100IU/ml青霉素和100IG/ml链霉素的6mlDMEM培养基重悬。取出六孔细胞板，每孔加入1ml细胞悬液，后补培养基1ml放入28±0.5℃5％CO₂中培养，平均每12hr换液一次。

(四)实验结果：如图1所示，鱼类肠上皮在24hr左右贴壁，生长状况良好。如图2所示，2天后得到稳定的可进行其他研究的细胞；如图3所示，细胞大小均一，形态完整，无污染现象。细胞经连续培养后愈发密集。如图4所示，可以见到细胞分裂现象，细胞已经铺满整个细胞培养孔，无污染现象。

其他条件如实施例1，当将胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI替换为重量比为4:1的胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶的混合液时，实验结果如图5所示，细胞大小均一，形态完整，无污染现象。细胞经连续培养后愈发密集。但是此方法中性蛋白酶成本较高。

实施例2鱼类肠上皮细胞分离(不同的清洗方式以及未采用清洗培养基)

(一)实施动物：80g左右罗非鱼

(二)实验试剂：Hanks平衡盐(sigma公司)，DMEM(gibco公司)，胎牛血清(gibco公司)，胶原蛋白酶XI(sigma公司)，胰蛋白酶(sigma公司)，胰岛素(sigma公司)，转铁蛋白(sigma公司)，HEPES(sigma公司)

(三)实施步骤：将实验所需试剂过0.22μm无菌筛；将实验所需六孔细胞板铺上0.01g/ml明胶37℃孵育1hr，弃掉明胶。取80g罗非鱼在28℃过夜曝气静水中饥饿约24hr，后麻醉。在无菌环境下取出鱼肠道整肠，将整肠浸泡在Hanks平衡盐溶液中，剪成约1mm小段，在含有200IU/ml青霉素和200IG/ml链霉素的Hanks平衡盐中清洗八次，即，将组织块用镊子架起，在Hanks平衡盐中涮洗，替换Hanks平衡盐，重复此过程。将洗净的肠组织收入10ml离心管加入1mg/ml胰蛋白酶6ml，水浴摇床10min后，800rpm离心倒掉上清。向离心管中加入1.2mg/ml胶原蛋白酶XI6ml，重悬，水浴摇床20min后，800rpm离心倒掉上清。加入含200IU/ml青霉素和200IG/ml链霉素的二倍双抗DMEM重复此过程4遍。将得到细胞用含10％胎牛血清，0.01mg/ml胰岛素，0.02mg/ml转铁蛋白，10mmol/LHEPES，100IU/ml青霉素和100IG/ml链霉素的6mlDMEM培养基重悬。取出六孔细胞板，每孔加入1ml细胞悬液，后补培养基1ml放入28±0.5℃5％CO2中培养，平均每12hr换液一次。

(四)实验结果：仅按照文献所述的方法在Hanks平衡盐中涮洗不利于细胞的清洁，如图6所示，细胞在2天时出现污染，图中黑色线状为细菌，细胞形态变化，且细胞浓度大幅下降。从而进一步说明本发明实施例1中所述的将肠段剖开清洗，并使用含有200IU/ml青霉素和200IG/ml链霉素的清洗培养基，能够减少细胞污染概率。

实施例3鱼类肠上皮细胞分离(细胞消化液为单一的胶原蛋白酶XI)

(一)实施动物：80g左右罗非鱼

(二)实验试剂：Hanks平衡盐(sigma公司)，DMEM(gibco公司)，胎牛血清(gibco公司)，胶原蛋白酶XI(sigma公司)，胰蛋白酶(sigma公司)，胰岛素(sigma公司)，转铁蛋白(sigma公司)，HEPES(sigma公司)

(三)实施步骤：将实验所需试剂过0.22μm无菌筛；将实验所需六孔细胞板铺上0.01g/ml明胶37℃孵育1hr，弃掉明胶。取80g罗非鱼在28℃过夜曝气静水中饥饿约24hr，后麻醉。在无菌环境下取出鱼肠道整肠，短暂在75％酒精中浸泡，去除末端2cm，将整肠浸泡在Hanks平衡盐溶液中，剪成约1cm小段，清洗内容物，进行第一遍清洁。后换成含200IU/ml青霉素和200IG/ml链霉素的DMEM培养基进行洗涤，将肠段剖开，洗净内容物。该过程重复八次。将洗净的肠组织收入10ml离心管加入1.2mg/ml胶原蛋白酶XI6ml，重悬，水浴摇床20min后，800rpm离心倒掉上清。加入含200IU/ml青霉素和200IG/ml链霉素的二倍双抗DMEM重复此过程4遍。将得到细胞用含10％胎牛血清，0.01mg/ml胰岛素，0.02mg/ml转铁蛋白，10mmol/LHEPES，100IU/ml青霉素和100IG/ml链霉素的6mlDMEM培养基重悬。取出六孔细胞板，每孔加入1ml细胞悬液，后补培养基1ml放入28±0.5℃5％CO2中培养，平均每12hr换液一次。

(四)实验结果：如图7所示，虽然已分离的细胞大小形态均正常，但是明显见到细胞成块状聚集，证明采用单一的胶原蛋白酶XI作为细胞消化液时，由于细胞间胶连蛋白成分复杂，单一酶液作用位点单一，未能有效分离出单一细胞。

其它条件同实施例3，当采用单一的胰蛋白酶作为细胞消化液消化10min时，细胞大小和形态与采用单一胶原蛋白酶XI作为细胞消化液时类似，实验结果如图8所示。由于胰蛋白酶特性，位点特异性不强，当消化20min时，细胞破损，数量减少，如图9所示。又由于实验动物如鱼类的个体差异，消化时间不好摸索。不如实施例1中提供的两种酶消化的方法操作简便，省去大量摸索时间。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (17)

1.一种分离培养鱼类肠道上皮细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)实验用鱼准备：彻底排空肠道；

(2)肠道组织清洗：在清洗培养基中清洗鱼肠道组织；

(3)蛋白酶消化：将上述肠道组织在蛋白酶中消化，得到消化产物；

(4)细胞过滤和收集：过滤上述消化产物，收集细胞，得到过滤物；

(5)铺明胶：利用明胶对细胞培养板进行铺板；

(6)细胞培养：在培养基中培养细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述排空肠道的方法为饥饿12～24h处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，肠道取出后在酒精中浸泡5s～10s，再在清洗培养基中进行清洗。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述清洗培养基为包括青霉素和链霉素的DMEM培养基。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述青霉素、链霉素的添加量分别为200IU/ml、200IG/ml。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述蛋白酶为胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I的混合液，或胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的混合液，所述酶混合液的用量与组织多少及容器大小有关，浸没过组织块即可。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I的重量比为4:1，所述胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的重量比为1:1.2。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当采用胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I消化肠道组织时，应在37℃水浴摇床条件下对清洁后的肠组织消化30min～40min；当采用胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI消化肠道组织时，应在37℃水浴摇床条件下先用胰蛋白酶消化10min～15min，然后去除胰蛋白酶液，最后更换为胶原蛋白酶XI消化15min～20min。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，利用细胞筛对消化产物进行过滤，细胞筛大小为100μm，在转速不大于1000rpm下，离心重悬。

10.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，铺板明胶的浓度为0.01g/ml，在37℃下孵育1h。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述细胞在温度为28±0.5℃，CO₂浓度为5％的条件下培养。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述培养基为含10％胎牛血清，0.01mg/ml胰岛素，0.02mg/ml转铁蛋白，10mmol/LHEPES，100IU/ml青霉素和100IG/ml链霉素的DMEM培养基，所述培养基pH为7.2～7.4。

13.一种清洗培养基，其特征在于，所述清洗培养基为包括青霉素和链霉素的DMEM培养基。

14.如权利要求13所述的清洗培养基，其特征在于，所述青霉素、链霉素的添加量分别为200IU/ml、200IG/ml。

15.一种细胞消化液，其特征在于，所述细胞消化液为酶混合液，包括胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I，或胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI。

16.如权利要求15所述的细胞消化液，其特征在于，所述胶原蛋白酶XI和中性蛋白酶I的重量比为4:1，或者所述胰蛋白酶和胶原蛋白酶XI的重量比为1:1.2。

17.一种培养基，其特征在于，所述培养基为含10％胎牛血清，0.01mg/ml胰岛素，0.02mg/ml转铁蛋白，10mmol/LHEPES，100IU/ml青霉素和100IG/ml链霉素的DMEM培养基。