CN113061568A - 一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，针对现有肠壁上皮细胞分离过程中蛋白酶稳定性差的问题，公开了一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，包括：将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度，接种到细胞培养板孔中，接种后静止培养；再把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养。培养过程中采用的是单层细胞培养法，因为所有组织中都含有一定量的细胞间质‑纤维和基质等，对细胞生长有妨碍作用，过程中用胰蛋白酶消化能够除去间质，使组织松散，细胞相互分离，细胞易于生长，且能够获得较多较纯的肠上皮细胞，最终极大提升了细胞的生长速率及生长效果。

Description

一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法。
背景技术
细胞是生物体形态结构和功能活动的基本单位。细胞不同于非生命界的任何结构单位，其最独特的属性就是它是一个能独立生存，进行自我调节的开放体系，它同外界进行物质、能量、信息交换的条件下，处于动态平衡之中。所有生物体的细胞都具有随环境营养条件改变而做出适应性反应的能力。肠道细胞不仅承担着鱼体对营养物质消化吸收的功能，同时具有强大的免疫调节功能，是鱼类抵御肠道内有害物质和微生物的重要防线。肠道上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)是鱼类肠道的主要功能细胞，其参与肠道食物的消化、吸收、免疫屏障等功能。近年来，高密度养殖条件下鱼类肠道炎症已经成为养殖鱼类高死亡率的主要原因，严重阻碍了水产养殖业的可持续发展。鱼类肠道粘膜易与腔内大量的细菌、病毒、生物化学毒素与植物性蛋白饲料接触而发生肠道炎症损伤，引起鱼类肠道粘膜增厚并充血，肠上皮细胞滤泡消失，微绒毛变短，杯状细胞增多等症状。因此，建立体外鱼类肠上皮细胞模型对鱼类肠道炎症损伤机制的研究具有重大意义。利用体外培养鱼类肠道细胞对环境因素，包括植物性蛋白饲料抗营养因子、化学毒素、环境激素和内分泌干扰素等，进行污染监测和安全性评价，也是鱼类肠道细胞培养的重要用途之一。
黄姑鱼为海水鱼类，对养殖条件要求较高；活体养殖试验为了获得稳定的统计数据，往往要求样本大，且试验周期长，人力需求量大等。使用鱼类肠道细胞进行生理生化、肠道炎症的发生机制等研究，则具有试验周期短，试验数据获取较快，人力物力需求量不大，试验稳定性、重复性较好，能有效避免个体差异等优点。因此，开展黄姑鱼肠道细胞培养技术的探索研究，不仅能丰富黄姑鱼肠道细胞学知识及在相关基础理论研究方面具有重要意义，在黄姑鱼肠道炎症损伤机制及饲料研究开发等应用性领域亦有重要价值。
鱼类原代细胞培养方法最常用的培养方法为组织块培养法和单层细胞培养法(也即酶消化法)。传统的组织块法是将组织块剪成1mm×1mm×1mm后贴壁，让肠上皮细胞从贴壁的组织块中爬出来，但是组织块没有经过酶的消化作用，细胞爬出缓慢，耗时较长，不利于实验的开展，并且组织块上残留的结缔组织易爬出成纤维细胞，造成消化出的细胞纯度不高。因此，有效保证整个上皮细胞培养过程的有效与稳定增长具有重要的意义。
专利号CN201710816631.4，专利名称为“一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法”，本发明涉及一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。分离方法为：无菌操作取出肠道中后段，除去肠道外脂肪与肠系膜，纵向剖开肠管清除粪便，使用无菌弯头镊子刮除草鱼肠黏液与上皮细胞层，刮除时间15min；将除去黏液和上皮细胞层的肠段处理成碎块置于胶原酶IV消化液中消化，获得固有层单细胞悬液；再用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞。纯化方法为：采用差异贴壁法纯化肠巨噬细胞。原代培养方法为：用含草鱼自体血清的RPMI-1640完全培养液培养肠巨噬细胞，待细胞贴壁后用含脂多糖的RPMI-1640完全培养液换液一次，以后每隔2天换液一次，细胞至少可存活20天。
其不足之处在于，上述专利中培养过程所采用的培养基为完全培养液，细胞增长所需的成分添加量和浓度未进行精准控制，对于特定细胞种类的特异性营养供给较差。
发明内容
本发明是为了克服现有肠壁上皮细胞分离过程中蛋白酶稳定性差的问题，公开了一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，分离细胞时将消解蛋白酶固定在载体上，保证固定化蛋白酶的性能稳定。肠道原代细胞培养方法最常用的是组织块法和酶消化法，组织块法因为没有经过酶的消化作用，细胞爬出缓慢，耗时较长，不利于实验的开展，并且组织块上残留的结缔组织易爬出成纤维细胞，造成消化出的细胞纯度不高。本发明培养过程中采用的是单层细胞培养法(也即酶消化法)，因为所有组织中都含有一定量的细胞间质-纤维和基质等，对细胞生长有妨碍作用，过程中用胰蛋白酶消化能够除去间质，使组织松散，细胞相互分离，细胞易于生长，且能够获得较多较纯的肠上皮细胞，最终极大提升了细胞的生长速率及生长效果。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度，接种到细胞培养板孔中，接种后静止培养；
(2)静止培养后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
(3)传代培养：用质量浓度0.25-0.3％的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
本发明采用差速贴壁法对培养的肠道上皮细胞进行纯化，根据成纤维细胞和上皮细胞的贴壁时间不同，成纤维细胞贴壁速度比肠上皮细胞快，在培养90min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养。当细胞铺满底壁后，用0.25-0.3％的胰蛋白酶溶液消化细胞并转入新的培养板中进行传代培养。
作为优选，步骤(1)中，调整后细胞浓度为3-5×105/ml。
细胞生长需要一定的浓度，细胞浓度过高或过低均不利于细胞增殖生长。
作为优选，步骤(1)中，细胞培养板孔每孔加入2-2.5ml细胞液。
作为优选，步骤(1)中，静止培养条件：CO2环境下，培养箱中26-28℃恒温培养80-90min。
作为优选，所述培养液组分：表皮生长因子0.008-0.012mg/L、胎牛血清4-6％、转铁蛋白0.01-0.03mg/ml、胰岛素218-222U/L、IGF-I 68-72ng/ml、Gln 298-302mg/L、肝素98-102mg/mL、氢化可的松0.08-0.12mg/L、青霉素9-12万IU/L和链霉素90-100mg/L。
作为优选，所述培养液组分：表皮生长因子0.01mg/L、胎牛血清5％、转铁蛋白0.02mg/ml、胰岛素220U/L、IGF-I 70ng/ml、Gln 300mg/L、肝素100mg/mL、氢化可的松0.1mg/L、青霉素10.5万IU/L和链霉素95mg/L。
培养液的pH值设定为7.0-7.3，本发明在培养液中联合添加了Gln、IGF-1和氢化可的松，可以促进肠道细胞的快速贴壁增长并促进肠道细胞分化；胰岛素可以降低蛋白质和脂肪降解，增加氨基酸和葡萄糖的摄入，从而促进细胞的生长和增殖；转铁蛋白可以帮助细胞调节对铁的摄取从而维持细胞的稳态，促进细胞生长和增殖；而肝素则可有效抑制成纤维细胞的生长，同时具有促进上皮细胞的增殖作用；青霉素和链霉素防止细胞受到微生物污染；通过联合添加上述营养成分，可以达到促进肠上皮细胞生长和增殖的效果。
作为优选，步骤(2)中，培养液更换间隔时间为47.8-48.2h。
一般细胞在培养上述时长后，营养就会用尽，此时需要及时给细胞补充营养，否则会影响细胞生长速度。
作为优选，所述培养液的渗透压为380-385mOsm/kg，pH为7.2-7.4。
作为优选，步骤(1)中，所涉及细胞分离的过程为：将黄姑鱼浸泡禁食，在无菌环境中去除肠道上脂肪和腹膜，分离出肠壁，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用分离液清洗并离心，往肠道组织块中加入固定化蛋白酶消化液，进行酶解消化；结束后分离液交替清洗并离心，得到分离细胞。
本发明采用固定化蛋白酶消化液来对肠道组织块进行酶解消化，能够更加有效的控制酶解消化过程，无需加入酶终止剂，即可根据需要来停止酶的酶解消化作用，整个酶解消化过程中固定化蛋白酶具有平稳的催化活性，其受ph值与温度变化的影响较小，在酶使用完毕后能够对固定化蛋白酶进行回收洗涤再利用，能够极大的降低原料成本，不会造成酶原料的浪费，酶的酶解消化效率也更高。
作为优选，固定化蛋白酶为金属-有机物载体负载连接蛋白酶组合体。
所述固定化蛋白酶的具体步骤为：A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1-1.05g：70mL分散在乙醇中，超声处理20-30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1-1.2：2-4混合均匀得到混合溶液，搅拌30-40min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，80-95℃，搅拌1-1.4h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至130-140℃下搅拌2-2.5h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3-4：0.6-0.8；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至70-80℃，保温20-24h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2-2.5：0.5-0.8；B、选择性溶解：按照质量比2-2.5：0.4-0.6往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌40-60min，静置0.3-0.5h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在26-30℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.6-0.8：1.5-2加入N,N-二甲基甲酰胺中，在65-75℃搅拌反应18-22h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.02-0.05g，缓慢搅拌3-4h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.25-0.3mg/ml，胶原酶Ⅳ0.25-0.27mg/ml，透明质酸酶0.15-0.18mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.3-0.35％，嗜热菌蛋白酶55-58mg/L。
本发明中制备固定化蛋白酶的过程中：步骤A中以Zn2+作为骨架核心，均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺作为配位体进行聚合，再加入四亚乙基五胺进行交联，形成有序排列的有序框架结构，有序框架结构中均苯三甲酸酯和乙烯基对苯二甲酸酯作为取代配体嵌入到有序框架结构的结构中，加入苯乙烯单体与引发剂过氧化月桂酰后，能够在有序框架结构中形成沿孔隙方向排列的聚苯乙烯，对苯二甲酸酯能够同时连接上Zn2+和孔道中的聚苯乙烯，将相邻孔道的聚合物链桥接在一起，形成稳定性高的框架结构；步骤B中加入氨基三乙酸三钠，氨基三乙酸三钠作为络合物，能够选择性溶解掉初步载体结构中的部分有机框架，在保证结构稳定性的前提下，使得有序框架结构中的孔隙直径更大，比表面积更大，对蛋白酶的吸附能力更强，便于后续蛋白酶的渗透及连接；步骤C中采用γ-环糊精来对金属-有机物载体进行活化改性，因为γ-环糊精上具有较大的环状与较多的羟基，能够稳定的连接到金属-有机物载体上，在增加羟基活性位点的同时，也促进金属-有机物载体的结构稳定；步骤D中，在活化金属-有机物载体表面形成较多的羟基位点，胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶-EDTA 及嗜热菌蛋白酶上的羧基与氨基能够顺利稳固的连接到羟基上，形成酶解能力强、条件适应范围广、结构稳定性高的固定化蛋白酶。本发明中，采用先制备金属-有机物载体再连接蛋白酶的顺序来进行组合，能够较大程度保护蛋白酶的活性，避免包埋式蛋白酶在制备过程受试剂或温度的影响而失活的情况。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)公开了一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，培养过程中采用的是单层细胞培养法，因为所有组织中都含有一定量的细胞间质-纤维和基质等，对细胞生长有妨碍作用，过程中用胰蛋白酶消化能够除去间质，使组织松散，细胞相互分离，细胞易于生长，且能够获得较多较纯的肠上皮细胞；
(2)为分离出来的高纯度的上皮细胞提供特定营养成分的培养基，同时促进肠道上皮细胞的分化与增长，最终极大提升了细胞的生长速率及生长效果，呈现肠道细胞的快速贴壁增长的态势；
(3)通过引入具有负载能力强的蛋白酶载体，将消解蛋白酶固定在载体上，使得固定化蛋白酶具有较强的耐热性和更宽的pH值范围适应能力，分离出纯度高的上皮细胞，为细胞培养提供良好的基础支撑。
附图说明
图1是实施例1黄姑鱼肠道细胞培养增长图。
图2是对比例1黄姑鱼肠道细胞培养增长图。
图3是对比例2黄姑鱼肠道细胞培养增长图。
图4是实施例1、对比例1及对比例2的细胞生长曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
总实施例
1、制备所述固定化蛋白酶：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1-1.05g：70mL分散在乙醇中，超声处理20-30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1-1.2：2-4混合均匀得到混合溶液，搅拌30-40min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，80-95℃，搅拌1-1.4h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至130-140℃下搅拌2-2.5h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3-4：0.6-0.8；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至70-80℃，保温20-24h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2-2.5：0.5-0.8；
B、选择性溶解：按照质量比2-2.5：0.4-0.6往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌40-60min，静置0.3-0.5h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在26-30℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.6-0.8：1.5-2加入N,N-二甲基甲酰胺中，在65-75℃搅拌反应18-22h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.02-0.05g，缓慢搅拌3-4h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.25-0.3mg/ml，胶原酶Ⅳ0.25-0.27mg/ml，透明质酸酶0.15-0.18mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.3-0.35％，嗜热菌蛋白酶55-58mg/L。
2、分离黄姑鱼上皮肠道细胞：
(a)先将黄姑鱼浸泡在含有8-11万IU/L青霉素和80-100mg/L链霉素的海水中禁食1-2天；(b)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(c)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心2-4次；(d)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，22-30℃进行酶解消化38-42min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的3.5-4.5倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为30-35％；(e)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液交替清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用。
PBS和DMEM/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素9-12万IU/L，链霉素90-100mg/L。
3、培养黄姑鱼上皮肠道细胞：
(1)将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度为3-5×105/ml，接种到细胞培养板孔中，每孔加入2-2.5ml细胞液，CO2环境下，培养箱中26-28℃恒温培养80-90min；
(2)静止培养后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，间隔47.8-48.2h定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
(3)传代培养：用质量浓度0.25-0.3％的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
所述培养液的渗透压为380-385mOsm/kg，pH为7.2-7.4，培养液组分：表皮生长因子0.008-0.012mg/L、胎牛血清4-6％、转铁蛋白0.01-0.03mg/ml、胰岛素218-222U/L、IGF-I68-72ng/ml、Gln 298-302mg/L、肝素98-102mg/mL、氢化可的松0.08-0.12mg/L、青霉素9-12万IU/L和链霉素90-100mg/L。
实施例1
1、制备所述固定化蛋白酶：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.02g：70mL分散在乙醇中，超声处理25min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.1：3混合均匀得到混合溶液，搅拌35min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，88℃，搅拌1.2h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至135℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.5：0.7；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至75℃，保温22h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.3：0.65；
B、选择性溶解：按照质量比2.2：0.5往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌50min，静置0.4h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在28℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.7：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在70℃搅拌反应20h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.035g，缓慢搅拌3.5h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.32％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼上皮肠道细胞：
(a)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(b)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(c)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(d)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(e)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液交替清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用。
PBS和DMEM/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
3、培养黄姑鱼上皮肠道细胞：
(1)将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度为4×105/ml，接种到细胞培养板孔中，每孔加入2.3ml细胞液，CO2环境下，培养箱中27℃恒温培养85min；
(2)静止培养后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，间隔48h定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
(3)传代培养：用质量浓度0.28％的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
所述培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3，培养液组分：表皮生长因子0.01mg/L、胎牛血清5％、转铁蛋白0.02mg/ml、胰岛素220U/L、IGF-I 70ng/ml、Gln 300mg/L、肝素100mg/mL、氢化可的松0.1mg/L、青霉素10.5万IU/L和链霉素95mg/L。
实施例2
1、制备所述固定化蛋白酶：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1g：70mL分散在乙醇中，超声处理30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1：4混合均匀得到混合溶液，搅拌30min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，80℃，搅拌1h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至130℃下搅拌2.5h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3：0.8；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至80℃，保温20，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.5：0.5；
B、选择性溶解：按照质量比2：0.6往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌40min，静置0.5h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在26℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.6：2加入N,N-二甲基甲酰胺中，在65℃搅拌反应22h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.02g，缓慢搅拌4h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.25mg/ml，胶原酶Ⅳ0.27mg/ml，透明质酸酶0.15mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.35％，嗜热菌蛋白酶55mg/L。
2、分离黄姑鱼上皮肠道细胞：
(a)先将黄姑鱼浸泡在含有8万IU/L青霉素和100mg/L链霉素的海水中禁食2天；(b)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(c)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心2次；(d)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，22℃进行酶解消化42min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4.5倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为30％；(e)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液交替清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用。
PBS和DMEM/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素9万IU/L，链霉素100mg/L。
3、培养黄姑鱼上皮肠道细胞：
(1)将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度为5×105/ml，接种到细胞培养板孔中，每孔加入2.5ml细胞液，CO2环境下，培养箱中28℃恒温培养80min；
(2)静止培养后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，间隔48.2h定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
(3)传代培养：用质量浓度0.3％的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
所述培养液的渗透压为385mOsm/kg，pH为7.2，培养液组分：表皮生长因子0.012mg/L、胎牛血清4-6％、转铁蛋白0.03mg/ml、胰岛素218U/L、IGF-I 72ng/ml、Gln298mg/L、肝素102mg/mL、氢化可的松0.08mg/L、青霉素12万IU/L和链霉素90mg/L。
实施例3
1、制备所述固定化蛋白酶：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.05g：70mL分散在乙醇中，超声处理30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.2：2混合均匀得到混合溶液，搅拌40min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，95℃，搅拌1h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至140℃下搅拌2h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：4：0.6；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至70℃，保温24h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2：0.8；
B、选择性溶解：按照质量比2.5：0.4往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌60min，静置0.3h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在30℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.8：1.5加入N,N-二甲基甲酰胺中，在75℃搅拌反应18h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.05g，缓慢搅拌4h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.3mg/ml，胶原酶Ⅳ0.25mg/ml，透明质酸酶0.18mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.3％，嗜热菌蛋白酶58mg/L。
2、分离黄姑鱼上皮肠道细胞：
(a)先将黄姑鱼浸泡在含有11万IU/L青霉素和80mg/L链霉素的海水中禁食1天；(b)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(c)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心4次；(d)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，30℃进行酶解消化38min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4.5倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为30％；(e)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液交替清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用。
PBS和DMEM/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素12万IU/L，链霉素90mg/L。
3、培养黄姑鱼上皮肠道细胞：
(1)将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度为4.5×105/ml，接种到细胞培养板孔中，每孔加入2.4ml细胞液，CO2环境下，培养箱中26.5℃恒温培养82min；
(2)静止培养后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，间隔47.9h定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
(3)传代培养：用质量浓度0.26％的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
所述培养液的渗透压为380mOsm/kg，pH为7.4，培养液组分：表皮生长因子0.008mg/L、胎牛血清6％、转铁蛋白0.01mg/ml、胰岛素218U/L、IGF-I 72ng/ml、Gln 298mg/L、肝素102mg/mL、氢化可的松0.12mg/L、青霉素9万IU/L和链霉素100mg/L。
实施例4
1、制备所述固定化蛋白酶：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.01g：70mL分散在乙醇中，超声处理22min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.05：2.5混合均匀得到混合溶液，搅拌32min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，85℃，搅拌1.1h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至132℃下搅拌2.1h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.2：0.65；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至78℃，保温21h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.1：0.6；
B、选择性溶解：按照质量比2.1：0.45往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌45min，静置0.35h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在27℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.65：1.6加入N,N-二甲基甲酰胺中，在68℃搅拌反应18.5h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.03g，缓慢搅拌3-4h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.27mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.16mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.32％，嗜热菌蛋白酶56mg/L。
2、分离黄姑鱼上皮肠道细胞：
(a)先将黄姑鱼浸泡在含有9.2万IU/L青霉素和85mg/L链霉素的海水中禁食1天；(b)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(c)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心4次；(d)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，24℃进行酶解消化38.5min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的3.8倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(e)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液交替清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用。
PBS和DMEM/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素9.8万IU/L，链霉素92mg/L。
3、培养黄姑鱼上皮肠道细胞：
(1)将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度为4.5×105/ml，接种到细胞培养板孔中，每孔加入2.3ml细胞液，CO2环境下，培养箱中27℃恒温培养85min；
(2)静止培养后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，间隔48h定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
(3)传代培养：用质量浓度0.28％的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
所述培养液的渗透压为381mOsm/kg，pH为7.2，培养液组分：表皮生长因子0.009mg/L、胎牛血清4.5％、转铁蛋白0.015mg/ml、胰岛素219U/L、IGF-I 69ng/ml、Gln299mg/L、肝素99mg/mL、氢化可的松0.09mg/L、青霉素11.5万IU/L和链霉素92mg/L。
实施例5
1、制备所述固定化蛋白酶：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.03g：70mL分散在乙醇中，超声处理20-30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.15：3.5混合均匀得到混合溶液，搅拌38min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，92℃，搅拌1.3h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至138℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.8：0.75；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至72℃，保温23h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.4：0.7；
B、选择性溶解：按照质量比2.4：0.55往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌55min，静置0.42h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在29℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.75：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在72℃搅拌反应21h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.04g，缓慢搅拌3.8h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.265mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA0.34％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼上皮肠道细胞：
(a)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和95mg/L链霉素的海水中禁食2天；(b)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(c)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(d)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，28℃进行酶解消化41min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4.2倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为34％；(e)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液交替清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用。
PBS和DMEM/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素11万IU/L，链霉素98mg/L。
3、培养黄姑鱼上皮肠道细胞：
(1)将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度为4.5×105/ml，接种到细胞培养板孔中，每孔加入2.4ml细胞液，CO2环境下，培养箱中27.5℃恒温培养88min；
(2)静止培养后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，间隔48.1h定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
(3)传代培养：用质量浓度0.28％的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
所述培养液的渗透压为384mOsm/kg，pH为7.3，培养液组分：表皮生长因子0.0011mg/L、胎牛血清5.5％、转铁蛋白0.025mg/ml、胰岛素221U/L、IGF-I 71ng/ml、Gln301mg/L、肝素101mg/mL、氢化可的松0.11mg/L、青霉素9.5万IU/L和链霉素98mg/L。
对比例1(与实施例1的区别在于，将培养液的组分替换成培养液I。)
培养黄姑鱼上皮肠道细胞：
(1)将分离所得的细胞加入培养液I中，调整细胞浓度为4×105/ml，接种到细胞培养板孔中，每孔加入2.3ml细胞液，CO2环境下，培养箱中27℃恒温培养85min；
(2)静止培养后，把培养液I连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，间隔48h定期更换培养液I，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
(3)传代培养：用质量浓度0.28％的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
所述培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3，培养液I组分：表皮生长因子0.01mg/L、胎牛血清5％、转铁蛋白0.02mg/ml、胰岛素220U/L、Gln 300mg/L、青霉素11万IU/L和链霉素120mg/L。
对比例2(与实施例1的区别在于，将培养液的组分替换成培养液II。)
培养黄姑鱼上皮肠道细胞：
(1)将分离所得的细胞加入培养液II中，调整细胞浓度为4×105/ml，接种到细胞培养板孔中，每孔加入2.3ml细胞液，CO2环境下，培养箱中27℃恒温培养85min；
(2)静止培养后，把培养液II连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，间隔48h定期更换培养液II，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
(3)传代培养：用质量浓度0.28％的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
所述培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3，培养液II组分：表皮生长因子0.01mg/L、胎牛血清5％、转铁蛋白0.01mg/ml、IGF-I 70ng/ml、肝素100mg/mL、氢化可的松0.1mg/L、青霉素11万IU/L和链霉素120mg/L。
结论：
1、培养过程中采用的是单层细胞培养法，因为所有组织中都含有一定量的细胞间质-纤维和基质等，对细胞生长有妨碍作用，过程中用胰蛋白酶消化能够除去间质，使组织松散，细胞相互分离，细胞易于生长，且能够获得较多较纯的肠上皮细胞，最终极大提升了细胞的生长速率及生长效果；
2、在本发明反应条件及反应参数范围内均能够制备得到的催化活性好的固定化蛋白酶，通过多孔隙率载体的引入，显著扩大了蛋白酶的温度和ph适应范围，实验证明，最终分离出来的目标细胞(上皮细胞)数量多，上皮细胞周围组织分离彻底，得到纯度高的游离肠道上皮细胞，具有较好的分离效果与分离效率。
图1中本发明中实施例1的培养基组合，能够有效抑制成纤维细胞的生长，得到纯化的肠上皮细胞，细胞增殖快；图2中使用对比例1培养基，培养基中营养成分缺少了IGF-I，肝素和氢化可的松，IGF-I和氢化可的松作用是可以促进细胞贴壁增殖，肝素则可以抑制成纤维细胞生长。培养基中缺少这几种营养成分后得到的肠上皮明显较少，且增殖较慢；图3中使用对比例2培养基，培养基中营养成分缺少了胰岛素，胰岛素可以降低蛋白质和脂肪降解，增加氨基酸和葡萄糖的摄入，从而促进细胞的生长和增殖。培养基中缺少胰岛素后得到的肠上皮较少，且增殖较慢；图4是实施例1、对比例1及对比例2的细胞生长曲线图，实施例1、对比例1、对比例2中的细胞生长速度在第1天的时候没有显著差异，但是随着时间的延长，实例1中的促生长因子较多且充分，细胞生长速度后劲十足，显著高于对比例1和2中细胞的生长速度。
由实施例1-5以及对比例1-2的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到最优的黄姑鱼肠道细胞的培养方法。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度，接种到细胞培养板孔中，接种后静止培养；
（2）静止培养后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；
（3）传代培养：用质量浓度0.25-0.3%的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。
2.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，步骤（1）中，调整后细胞浓度为3-5×105/ ml。
3.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，步骤（1）中，细胞培养板孔每孔加入2-2.5 ml细胞液。
4.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，步骤（1）中，静止培养条件：CO2环境下，培养箱中26-28℃恒温培养80-90min。
5.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述培养液组分：表皮生长因子0.008-0.012mg/L、胎牛血清4-6%、转铁蛋白0.01-0.03mg/ml、胰岛素218-222U/L、IGF-I 68-72 ng/ml、Gln 298-302mg/L、肝素98-102mg/mL、氢化可的松 0.08-0.12mg/L、青霉素9-12万IU/L和链霉素90-100mg/L。
6.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述培养液组分：表皮生长因子0.01mg/L、胎牛血清5%、转铁蛋白0.02mg/ml、胰岛素220U/L、IGF-I 70ng/ml、Gln 300mg/L、肝素100mg/mL、氢化可的松 0.1mg/L、青霉素10.5万IU/L和链霉素95mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，步骤（2）中，培养液更换间隔时间为47.8-48.2h。
8.根据权利要求5或6所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述培养液的渗透压为380-385mOsm/kg，pH为7.2-7.4。
9.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，步骤（1）中，所涉及细胞分离的过程为：将黄姑鱼浸泡禁食，在无菌环境中去除肠道上脂肪和腹膜，分离出肠壁，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用分离液清洗并离心，往肠道组织块中加入固定化蛋白酶消化液，进行酶解消化；结束后分离液交替清洗并离心，得到分离细胞。
10.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，固定化蛋白酶为金属-有机物载体负载连接蛋白酶组合体。
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