CN106337035B - 一种应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的工艺 - Google Patents
一种应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的工艺,所述工艺包括鱼成纤维细胞在BC‑7L生物反应器中贴壁悬浮培养以及在BC‑75L生物反应器中在线放大培养的工艺。本发明提供的鱼类成纤维细胞应用生物反应器大规模培养工艺,既可以保证细胞的高培养密度,又可以提高培养过程细胞的活力,实现了鱼细胞自动化培养传代放大技术,培养得到的鱼成纤维细胞形态饱满,细胞分裂生长同步性好,M期细胞活力强,分裂细胞数量倍增,保持了原细胞的活力和遗传特性,增强了细胞对病毒的易感性和繁殖病毒的能力,可用于繁殖和大规模生产鱼类病毒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的工艺。
背景技术
鱼类细胞培养始于20世纪60年代,主要用于病毒学的研究。目前鱼类细胞系(株)的应用已经很广泛,由单纯的病毒分离和鉴定扩展到鱼类胚胎干细胞、免疫学、毒理学和肿瘤学、生理学和内分泌学、遗传育种和基因工程、活性物质、抗病毒药物和药物检测以及鱼类资源保护等方面的研究中。
鱼类细胞培养技术,包括培养基和培养条件等,对细胞培养成功起着至关重要的作用。鱼类细胞培养的与哺乳动物细胞比,鱼类细胞的耐温和耐受的渗透压范围更为宽广,因此培养条件相对没那么严格,同时,与哺乳动物细胞培养不同,鱼类细胞不需要频繁地传代以维持细胞活力,传代后的培养条件也不需要经常改变。但由于鱼类细胞培养起步较晚,目前鱼类细胞培养的原理以及技术都是借鉴哺乳动物细胞培养,鱼类细胞的培养条技术有待进一步优化,研究鱼类细胞培养的最佳方法是目前鱼类细胞研究的重点之一。随着鱼类疫苗、细胞因子、生长因子、单克隆抗体、酶等细胞生物产品的研究、开发和生产,鱼类细胞培养趋于大规模化。
目前国内外鲜见应用生物反应器大规模培养鱼类细胞并自动放大培养的报道,多见于用于科学研究的小规模的培养方式。如:刘秋凤等发表的论文“微载体规模化培养草鱼细胞与病毒的工艺及优化”公开了在4L双侧臂细胞培养瓶和磁力搅拌装置组成的悬浮培养系统中使用微载体Cephodex规模化培养草鱼肾脏组织细胞CIK的条件;陈志宏等发表的论文“生物反应器微载体系统大规模培养草鱼细胞及病毒”公开了在1.5LCelliGen细胞培养系统中使用微载体GT-2和Cytodex3规模化培养草鱼吻端细胞的工艺条件。现有应用微载体大规模培养鱼类贴壁细胞并自动放大培养技术,在实践中发现存在细胞贴壁率低,细胞培养密度低,细胞收率低,培养过程微载体易聚集等问题,需要进一步的研究和完善。经检索,到目前为止,未见有关7L到75L生物反应器大规模在线自动化放大培养,自动化消化,微载体悬浮培养鱼成纤维细胞的工艺的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的技术缺陷,提供一种应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的工艺。本发明实现了鱼细胞在BC-7L生物反应器中贴壁悬浮培养以及在BC-75L生物反应器中在线自动化放大培养,打破了应用二级生物反应器在线培养鱼成纤维细胞不成功的神话,突破了鱼类细胞培养的难点。
本发明提供的鱼类成纤维细胞应用生物反应器大规模培养工艺,既可以保证细胞的高培养密度,又可以提高培养过程细胞的活力,实现了鱼细胞自动化培养传代放大技术,培养得到的鱼成纤维细胞形态饱满,细胞分裂生长同步性好,M期细胞活力强,分裂细胞数量倍增,保持了原细胞的活力和遗传特性,增强了细胞对病毒的易感性和繁殖病毒的能力,可用于繁殖和大规模生产鱼类病毒。
本发明的技术方案如下:
一种应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的工艺,包括如下步骤:
S1:取生长良好的鱼成纤维细胞,细胞计数后接种至含有细胞生长液和已进行预处理的微载体的7L生物反应器中进行自动化培养,其中,细胞生长液加入量为2.5-4L,微载体加入量为5-6g/L,细胞接种密度为1.0-1.5×104个/mL,细胞接种时间为1-3min,生物反应器自动化控制技术参数设置为:溶氧40-50%,pH 7.1-7.3,温度34℃,搅拌转速50-80rpm;
S2:细胞在生物反应器中连续自动化培养5-7天至细胞长成致密单层后,停止搅拌,使微载体自然沉降5-10min,弃细胞生长液,用PBS溶液冲洗微载体2-3次,冲洗过程反应器转速40-60rpm;
S3:在7L生物反应器内加入1-2L 0.1-0.2%胰蛋白酶消化液室温搅拌消化5-10min,搅拌转速为30-50rpm,最后停止搅拌,加入2-4L细胞生长液终止消化,静置5-10min使微载体自然沉降,得细胞悬液;
S4:将S3所得细胞悬液在线自动传输放大到含有细胞生长液和已进行预处理的微载体的75L生物反应器中进行培养,其中,细胞生长液的加入量为35-45L,微载体加入量为2-2.5g/L,细胞接种密度为1.1-1.5×104个/mL,生物反应器自动化控制技术参数设置为:溶氧40-50%,pH 7.1-7.3,温度34℃,转速40-60rpm,连续自动化培养7天。
本发明提供的应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的工艺中,生物反应器可在线实现细胞自动消化,自动传输和自动放大培养的过程,并可通过细胞生长代谢趋势PID曲线监控细胞培养过程中细胞的生长趋势。
优选地,所述步骤S2中,PBS溶液的pH值为7.3-7.6。
优选地,所述细胞生长液包括基础培养基,按体积百分比计,还包括胎牛血清5-8%。
优选地,所述基础培养基选自L-15、DMEM、RPMI1640、MEM和DMEM/F12中的一种。
优选地,所述微载体的预处理包括如下步骤:取微载体,加入微载体3-4倍重量的PBS溶液,搅拌均匀后在室温下浸泡中和2-3h,弃去上清;再用相同体积的PBS溶液清洗2次;加入微载体重量9-12倍量的PBS溶液,搅拌均匀后121℃蒸汽高压灭菌25-30min,备用。
优选地,所述微载体的预处理步骤中,所述PBS溶液的pH值为7.3-7.6。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明提供的应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的工艺,实现了鱼成纤维细胞的大规模微载体培养和自动放大培养,实现了鱼细胞在BC-7L生物反应器中贴壁悬浮培养以及在BC-75L生物反应器中在线自动化放大培养,打破了应用二级生物反应器在线培养鱼成纤维细胞不成功的神话,突破了鱼类细胞培养的难点;
(2)本发明提供的应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的工艺中,生物反应器可在线实现细胞自动消化,自动传输和自动放大培养的过程,并可通过细胞生长代谢趋势PID曲线监控细胞培养过程中细胞的生长趋势。
(3)本发明提供的鱼类成纤维细胞应用生物反应器大规模培养工艺,既可以保证细胞的高培养密度,又可以提高培养过程细胞的活力,实现了鱼细胞自动化培养传代放大技术,培养得到的鱼成纤维细胞形态饱满,细胞分裂生长同步性好,M期细胞活力强,分裂细胞数量倍增,保持了原细胞的活力和遗传特性,增强了细胞对病毒的易感性和繁殖病毒的能力,可用于繁殖和大规模生产鱼类病毒;
附图说明
图1鱼成纤维细胞应用BC-7L生物反应器悬浮培养过程的细胞生长曲线。
图2应用BC-7L生物反应器悬浮培养24h、48h、72h、96h时利用光学显微镜观察到的鱼成纤维细胞在微载体上的生长形态。
图3鱼成纤维细胞应用BC-7L生物反应器悬浮培养过程的细胞生长代谢趋势PID曲线;其中,曲线1表示细胞培养过程中氧饱和度变化,曲线2表示细胞培养过程中pH的变化,曲线3表示细胞培养过程中温度的变化,曲线4表示细胞培养过程中搅拌转速的变化,曲线5为PID曲线,代表细胞生长趋势,表示细胞培养过程中细胞耗氧量的变化值,耗氧量增加细胞数增加。
图4鱼成纤维细胞应用BC-75L生物反应器在线放大传代悬浮培养过程的细胞生长曲线。
图5应用BC-75L生物反应器在线放大传代悬浮培养24h、48h、72h、96h时利用光学显微镜观察到的鱼成纤维细胞在微载体上的生长形态。
图6鱼成纤维细胞应用BC-75L生物反应器在线放大传代悬浮培养过程的细胞生长代谢趋势PID曲线;其中,曲线1表示细胞培养过程中氧饱和度变化,曲线2表示细胞培养过程中pH的变化,曲线3表示细胞培养过程中温度的变化,曲线4表示细胞培养过程中搅拌转速的变化,曲线5为PID曲线,代表细胞生长趋势,表示细胞培养过程中细胞耗氧量的变化值,耗氧量增加细胞数增加。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明,但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内,对本发明所述的药物组合物进行适当改进、替换功效相同的组分,对于本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明的范围之内。
本发明实施例中部分设备和材料的来源如下:
名称 | 生产企业 |
鱼成纤维细胞 | 引自ATCC库 |
DMEM/F12培养基 | GiBCO公司 |
胎牛血清 | GiBCO公司 |
胰蛋白酶 | GiBCO公司 |
球状微载体 | 广州齐志生物工程设备有限公司 |
BC-7L生物反应器 | 广州齐志生物工程设备有限公司 |
BC-75L生物反应器 | 广州齐志生物工程设备有限公司 |
实施例1 细胞生长液配制
取DMEM/F12基础培养基,调节溶液pH值为7.2,按体积百分比计,加入6%胎牛血清,混匀后,采用0.22μm除菌过滤膜除菌过滤,即得细胞生长液。
实施例2 微载体预处理
取微载体,加入微载体3倍重量的pH值为7.4的PBS溶液,搅拌均匀后室温下浸泡中和2-3h,弃去上清;再用相同体积的PBS溶液清洗2次;加入微载体重量10倍量的PBS溶液,搅拌均匀后121℃蒸汽高压灭菌30min,备用。
实施例3 应用BC-7L生物反应器悬浮培养鱼成纤维细胞工艺
取生长良好的鱼成纤维细胞,细胞计数后接种至含有细胞生长液和已进行预处理的微载体的BC-7L生物反应器中进行自动化培养,其中,细胞生长液加入量为3L,微载体加入量为16g,细胞接种密度为1.11×104个/mL,细胞接种时间为2min,生物反应器自动化控制技术参数设置为:溶氧45%,pH 7.2,温度34℃,转速60rpm,全自动化连续培养6天。
细胞培养过程中,间隔24h取样,观察细胞生长状态和进行细胞计数。细胞生长密度变化情况见表1,细胞生长曲线、生长状态和生长代谢趋势PID曲线见附图1-3。
表1 BC-7L生物反应器悬浮培养过程细胞密度变化情况(×104个/mL)
时间 | 0h | 24h | 48h | 72h | 96h | 120h | 144h |
悬浮细胞数 | 111 | 109 | 167 | 206 | 220 | 231 | 218 |
实施例4 应用生物反应器中在线放大传代悬浮培养鱼成纤维细胞工艺
S1:取生长良好的鱼成纤维细胞,细胞计数后接种至含有细胞生长液和已进行预处理的微载体的BC-7L生物反应器中进行自动化培养,其中,细胞生长液加入量为3L,微载体加入量为16g,细胞接种密度为1.11×104个/mL,细胞接种时间为2min,生物反应器自动化控制技术参数设置为:溶氧40%,pH 7.2,温度34℃,转速65rpm;
S2:细胞在BC-7L生物反应器中连续自动化培养6天至细胞长成致密单层后,停止搅拌,使微载体自然沉降10min,弃细胞生长液,用微载体重量3倍量的pH值为7.4的PBS溶液冲洗微载体2次,冲洗过程反应器转速40rpm;
S3:在BC-7L生物反应器内加入1L 0.125%胰蛋白酶消化液室温搅拌消化5min,搅拌转速为40rpm,最后停止搅拌,加入3L细胞生长液终止消化,静置10min使微载体自然沉降,得细胞悬液;
S3:将S3所得细胞悬液在线自动传输放大到含有细胞生长液和已进行预处理的微载体的BC-75L生物反应器中进行培养,其中,细胞生长液的加入量为40L,微载体加入量为80g,细胞接种密度为1.10×104个/mL,生物反应器自动化控制技术参数设置为:溶氧45%,pH 7.2,温度34℃,转速50rpm,连续自动化培养7天。
细胞在BC-75L生物反应器培养过程中,间隔24h取样,观察细胞生长状态和进行细胞计数。细胞生长密度变化情况见表2,细胞生长曲线、生长状态和生长代谢趋势PID曲线见附图4-6。
表2 BC-75L生物反应器在线放大传代悬浮培养过程细胞生长密度变化情况(×104个/mL)
时间 | 0h | 24h | 48h | 72h | 96h | 120h | 144h |
悬浮细胞数 | 110 | 108 | 240 | 207 | 210 | 240 | 498 |
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种应用生物反应器大规模培养鱼成纤维细胞的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
S1:取生长良好的鱼成纤维细胞,细胞计数后接种至含有细胞生长液和已进行预处理的微载体的7L生物反应器中进行自动化培养,其中,细胞生长液加入量为2.5-4L,微载体加入量为5-6g/L,细胞接种密度为1.0×104-1.5×104个/mL,细胞接种时间为1-3min,生物反应器自动化控制技术参数设置为:溶氧40-50%,pH7.1-7.3,温度34℃,搅拌转速50-80rpm;
S2:细胞在生物反应器中连续自动化培养5-7天至细胞长成致密单层后,停止搅拌,使微载体自然沉降5-10min,弃细胞生长液,用PBS溶液冲洗微载体2-3次,冲洗过程反应器转速40-60rpm;
S3:在7L生物反应器内加入1-2L0.1-0.2%胰蛋白酶消化液室温搅拌消化5-10min,搅拌转速为30-50rpm,最后停止搅拌,加入2-4L细胞生长液终止消化,静置5-10min使微载体自然沉降,得细胞悬液;
S4:将S3所得细胞悬液在线自动传输放大到含有细胞生长液和已进行预处理的微载体的75L生物反应器中进行培养,其中,细胞生长液的加入量为35-45L,微载体加入量为2-2.5g/L,细胞接种密度为1.1×104-1.5×104个/mL,生物反应器自动化控制技术参数设置为:溶氧40-50%,pH7.1-7.3,温度34℃,转速40-60rpm,连续自动化培养7天;所述步骤S2、S3和S4中生物反应器在线实现细胞自动消化,自动传输和自动放大培养的过程,并通过细胞生长代谢趋势PID曲线监控细胞培养过程中细胞的生长趋势;
所述步骤S2中,PBS溶液的pH值为7.3-7.6;所述细胞生长液包括基础培养基,按体积百分比计,还包括胎牛血清5-8%;所述基础培养基选自L-15、DMEM、RPMI1640、MEM和DMEM/F12中的一种;
所述微载体的预处理包括如下步骤:取微载体,加入微载体3-4倍重量的PBS溶液,搅拌均匀后在室温下浸泡中和2-3h,弃去上清;再用相同体积的PBS溶液清洗2次;加入微载体重量9-12倍量的PBS溶液,搅拌均匀后121℃蒸汽高压灭菌25-30min,备用;所述微载体的预处理步骤中,所述PBS溶液的pH值为7.3-7.6。
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