CN113025559B - 一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法 - Google Patents

一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞分离技术领域，针对现有肠壁上皮细胞分离过程中蛋白酶稳定性差的问题，公开了一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，包括：将黄姑鱼浸泡在含有青霉素和链霉素的海水中禁食1‑2天；分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心2‑4次；同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，进行酶解消化；停止消化，处理后加入DMEM/F12培养液待用。引入具有负载能力强的蛋白酶载体，将消解蛋白酶固定在载体上，使得固定化蛋白酶具有较强的耐热性和更宽的pH值范围，保证固定化蛋白酶的性能稳定。

Description

一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，尤其是涉及一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法。
背景技术
细胞是生物体形态结构和功能活动的基本单位。细胞不同于非生命界的任何结构单位，其最独特的属性就是它是一个能独立生存，进行自我调节的开放体系，它同外界进行物质、能量、信息交换的条件下，处于动态平衡之中。所有生物体的细胞都具有随环境营养条件改变而做出适应性反应的能力。肠道细胞不仅承担着鱼体对营养物质消化吸收的功能，同时具有强大的免疫调节功能，是鱼类抵御肠道内有害物质和微生物的重要防线。而肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)是鱼类肠道细胞的主要功能细胞，是抵御外界环境最重要的屏障。近年来，高密度养殖条件下鱼类肠道炎症已经成为养殖鱼类高死亡率的主要原因，严重阻碍了水产养殖业的可持续发展。鱼类肠道粘膜易与腔内大量的细菌、病毒、生物化学毒素及植物性蛋白饲料接触而发生肠道炎症损伤，引起鱼类肠道粘膜增厚并充血，肠上皮细胞滤泡消失，微绒毛变短，杯状细胞增多等症状。因此，建立体外鱼类肠上皮细胞模型对鱼类肠道炎症损伤机制的研究具有重大意义。利用体外培养鱼类肠道上皮细胞对环境因素，包括植物性蛋白饲料抗营养因子、化学毒素、环境激素和内分泌干扰素等，进行污染监测和安全性评价，也是鱼类肠道上皮细胞培养的重要用途之一。
黄姑鱼为海水鱼类，对养殖条件要求较高；活体养殖试验为了获得稳定的统计数据，往往要求样本大，且试验周期长，人力需求量大等。使用鱼类肠道上皮细胞进行生理生化、肠道炎症的发生机制等研究，则具有试验周期短，试验数据获取较快，人力物力需求量不大，试验稳定性、重复性较好，能有效避免个体差异等优点。因此，开展黄姑鱼肠道上皮原代细胞培养技术的探索研究，不仅能丰富黄姑鱼肠道细胞学知识及在相关基础理论研究方面具有重要意义，在黄姑鱼肠道炎症损伤机制及饲料研究开发等应用性领域亦有重要价值。
细胞分离技术是决定后期肠道细胞培养过程能否顺利进行的关键步骤，若细胞提取技术分离不好，最终得到的细胞液中则会含有大量肠道中的蛋白组织或者肌肉组织，使得最终无法有效的将上皮细胞从肠壁中分离出来，进而影响后续的上皮细胞培养效果。
在蛋白质消融过程中游离蛋白酶的活性受环境影响较大，因为游离酶在实际应用中存在着性质较不稳定、耐酸碱性弱、耐热性不强等诸多的局限性，同时游离酶也容易使得蛋白质消解过度或者消解不到位，使得肠道上皮细胞的分离过程难以控制，因此，有效保证蛋白酶的性能稳定对整个上皮细胞分离过程的性能稳定控制具有重要的作用。
专利号CN202010590409.9，专利名称为“一种鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法”，本发明公开了一种鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法。a、选取45-55d虾虎鱼幼鱼，在无菌条件下获得其肝脏组织，将肝脏组织分散成块，获得组织块；b、将孔径20μm的细胞筛置于胰蛋白酶终止液中，在孔径20μm的细胞筛上方设置有孔径50μm的细胞筛；c、将组织块置于孔径50μm的细胞筛中，持续添加胰蛋白酶液于孔径50μm的细胞筛中消化组织块，流动持续消化，收集位于孔径20μm的细胞筛上的细胞，用10％FBS清洗，获得高脂存储肝细胞；d、将高脂存储肝细胞接种到培养基中培养。本发明的高脂存储肝细胞能贴壁后稳定一周，脂肪细胞可存活1个月左右，期间可用于细胞水平的实验，从而解决鱼类成熟脂肪细胞分离和培养困难的问题。
其不足之处在于，其胰蛋白酶为游离的胰蛋白酶，其活性受环境的影响较大，蛋白消解过程难以控制。
发明内容
本发明是为了克服现有肠壁上皮细胞分离过程中蛋白酶稳定性差的问题，公开了一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，本发明通过引入具有负载能力强的蛋白酶载体，将消解蛋白酶固定在载体上，使得固定化蛋白酶具有较强的耐热性和更宽的pH值范围，保证固定化蛋白酶的性能稳定，便于蛋白质消解过程的控制，使整个肠道上皮细胞提取分离过程更便捷有效，同时固定化蛋白酶能够进行重复循环使用，降低成本。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，包括以下步骤：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有青霉素和链霉素的海水中禁食1-2天；
(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；
(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心2-4次；
(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，进行酶解消化；
(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用。
本发明的分离方法中：步骤(1)中采用青霉素和链霉素的海水禁食的目的是减少肠道微生物污染，避免肠道细胞受肠道菌群的污染；步骤(2)中在无菌环境中进行肠壁分离操作能够保证肠壁洁净不受周围细菌的污染；步骤(3)中采用DMEM/F12培养液清洗并离心的作用是清洗组织块；步骤(4)中本发明采用固定化蛋白酶消化液来对肠道组织块进行酶解消化，能够更加有效的控制酶解消化过程，无需加入酶终止剂，即可根据需要来停止酶的酶解消化作用，整个酶解消化过程中固定化蛋白酶具有平稳的催化活性，其受ph值与温度变化的影响较小，在酶使用完毕后能够对固定化蛋白酶进行回收洗涤再利用，能够极大的降低原料成本，不会造成酶原料的浪费，酶的酶解消化效率也更高。本发明通过提供一种有效的黄姑鱼肠道细胞分离方法，所述的海水鱼类肠道细胞的有效分离能够为后续的进一步细胞培养研究提供夯实的基础，其肠壁上皮细胞分离效果的好坏将直接影响到细胞培养的结果，本发明可以用于特定的海水鱼类肠道营养和疾病的研究，不仅在相关基础理论研究方面具有重要意义，在饲料研究开发等应用性领域都具有重要价值。
作为优选，步骤(1)中，海水中青霉素和链霉素浓度分别为8-11万IU/L和80-100mg/L。
作为优选，所述DEME/F12培养液的渗透压为380-385mOsm/kg，pH为7.2-7.4。
鱼类IECs的原代培养技术已有报道，如一种鱼类(草鱼)肠道粘膜细胞分离方法，草鱼为淡水鱼类，本发明为海水鱼类的IECs的分离和培养方法。淡水鱼类的组织液存在着比介质高的渗透浓度，而海水鱼类的体液比它们生活的海水渗透浓度低。一般淡水鱼类的渗透压范围是265-325mosm/kg，而海水鱼类一般的渗透压浓度维持水平更高，因此海水鱼类需要不同于淡水鱼类的渗透调节机制。同样的，在体外培养细胞，因细胞的来源及种类的不同，其渗透压的耐受能力也是不同的，经过试验探究发现黄姑鱼肠道上皮细胞在上述渗透条件下适应得较好，具有较高的存活率。
作为优选，PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素9-12万IU/L，链霉素90-100mg/L。
青霉素和链霉素浓度应以不影响肠道细胞生长为宜，浓度过高会抑制肠道细胞生长，浓度过低则达不到防止肠道细胞被微生物污染的目的。
作为优选，步骤(4)中，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的3.5-4.5倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为30-35％，酶解消化的消化温度为22-30℃，消化时间为38-42min。
固定化蛋白酶由于载体的负载与保护作用，对酶解消化的条件如温度具有更宽的适应范围，游离酶的有效酶解消化温度仅为26-28℃，因此，固定化蛋白酶具有更好的稳定性与适应性。
作为优选，固定化蛋白酶消化液中含有固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶的制备步骤如下：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1-1.05g：70mL分散在乙醇中，超声处理20-30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1-1.2：2-4混合均匀得到混合溶液，搅拌30-40min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，80-95℃，搅拌1-1.4h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至130-140℃下搅拌2-2.5h，降至室温形成有序框架结构；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至70-80℃，保温20-24h，得到初步载体结构；
B、选择性溶解：往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌40-60min，静置0.3-0.5h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在26-30℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.6-0.8：1.5-2加入N,N-二甲基甲酰胺中，在65-75℃搅拌反应18-22h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，缓慢搅拌3-4h，过滤得到固定化蛋白酶。
本发明中制备固定化蛋白酶的过程中：步骤A中以Zn2+作为骨架核心，均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺作为配位体进行聚合，再加入四亚乙基五胺进行交联，形成有序排列的有序框架结构，有序框架结构中均苯三甲酸酯和乙烯基对苯二甲酸酯作为取代配体嵌入到有序框架结构的结构中，加入苯乙烯单体与引发剂过氧化月桂酰后，能够在有序框架结构中形成沿孔隙方向排列的聚苯乙烯，对苯二甲酸酯能够同时连接上Zn2+和孔道中的聚苯乙烯，将相邻孔道的聚合物链桥接在一起，形成稳定性高的框架结构；步骤B中加入氨基三乙酸三钠，氨基三乙酸三钠作为络合物，能够选择性溶解掉初步载体结构中的部分有机框架，在保证结构稳定性的前提下，使得有序框架结构中的孔隙直径更大，比表面积更大，对蛋白酶的吸附能力更强，便于后续蛋白酶的渗透及连接；步骤C中采用γ-环糊精来对金属-有机物载体进行活化改性，因为γ-环糊精上具有较大的环状与较多的羟基，能够稳定的连接到金属-有机物载体上，在增加羟基活性位点的同时，也促进金属-有机物载体的结构稳定；步骤D中，在活化金属-有机物载体表面形成较多的羟基位点，胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶-EDTA及嗜热菌蛋白酶上的羧基与氨基能够顺利稳固的连接到羟基上，形成酶解能力强、条件适应范围广、结构稳定性高的固定化蛋白酶。本发明中，采用先制备金属-有机物载体再连接蛋白酶的顺序来进行组合，能够较大程度保护蛋白酶的活性，避免包埋式蛋白酶在制备过程受试剂或温度的影响而失活的情况。
作为优选，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.25-0.3mg/ml，胶原酶Ⅳ0.25-0.27mg/ml，透明质酸酶0.15-0.18mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.3-0.35％，嗜热菌蛋白酶55-58mg/L。
胶原酶IV构成了基膜的网状构架，故IECs分离采用胶原酶IV为主，透明质酸酶为一种能水解透明质酸的酶(透明质酸为组织基质中具有限制水分及其他细胞外物质扩散作用的成分)，能暂时降低细胞间质的粘性；嗜热菌蛋白酶能分离下较多的健全绒毛隐窝单位，本发明联合运用胶原酶I和胶原酶IV，透明质酸酶、嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA进行肠道上皮细胞分离，所得细胞数量多，并可以获得较多的绒毛隐窝单位和细胞团，易于贴壁和生长能力好。
胶原酶是特异性作用于胶原蛋白、明胶的一类蛋白水解酶，它能够水解胶原蛋白的三维螺旋结构而不破坏其他蛋白与组织。胶原酶I可以消化肠道上皮组织的基质蛋白，胶原酶IV分布于肠组织的基底膜，联合胶原酶I和胶原酶IV酶可以将肠上皮细胞较好的从肠道组织中分离下来。而透明质酸酶可以降低细胞间质检的粘性，用透明质酸酶可以减少肠细胞分离时的损伤。嗜热菌蛋白酶与表皮-真皮连接处的相应蛋白成分之间有很强的亲和力，可以将上皮细胞很好的分离下来。胰蛋白酶-EDTA可以断开赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间糖蛋白及黏蛋白，从而影响细胞骨架，使细胞分离。但是钙、镁等金属离子会降低胰蛋白酶活性，所以需要胰蛋白酶-EDTA联合使用，EDTA是离子螯合剂，一方面可以通过与钙离子结合来影响钙黏蛋白形成，从而影响黏附连接的形成，另一方面则可以消除金属离子对胰蛋白酶的抑制作用，也为后续蛋白酶能够稳定并且高活性的固定在载体上打下良好的基础。联合运用几种酶，可以得到较完整且纯化的肠上皮细胞。各种酶之间都是相互配合，按照特定的比例进行添加，能够使得最终的酶解消化更加充分，所选用的蛋白酶除了具有较强的蛋白质酶解消化能力外，还含有大量的活性基团，如羧基、氨基及羟基等，能够较好的连接到金属-有机物载体上，且各蛋白酶与金属-有机物载体之间有较强的适应性，使得固定化蛋白酶的一体性更好，稳定性更高。
作为优选，步骤A中，Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3-4：0.6-0.8；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2-2.5：0.5-0.8。
作为优选，步骤B中，有序框架结构与氨基三乙酸三钠的质量比2-2.5：0.4-0.6。
作为优选，步骤D中，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.02-0.05g。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)公开了一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，本发明通过引入具有负载能力强的蛋白酶载体，将消解蛋白酶固定在载体上，使得固定化蛋白酶具有较强的耐热性和更宽的pH值范围适应能力；
(2)引入载体保证固定化蛋白酶的性能稳定，便于蛋白质消解过程的控制，使整个肠道上皮细胞提取分离过程更便捷有效，同时固定化蛋白酶能够进行重复循环使用，降低成本；
(3)通过提升引入载体的结构稳定性，扩大孔径，增加孔隙率及对其进行表面活化改性，来为蛋白酶的接枝载入提供有利条件，制备出催化活性高、适应能力强，结构稳定性好的依一体化固定化蛋白酶。
附图说明
图1是实施例1黄姑鱼肠道细胞分离结果显微镜40×10倍视野图。
图2是对比例1黄姑鱼肠道细胞分离结果显微镜40×10倍视野图。
图3是对比例2黄姑鱼肠道细胞分离结果显微镜40×10倍视野图。
图4是对比例3黄姑鱼肠道细胞分离结果显微镜40×10倍视野图。
图5是对比例4黄姑鱼肠道细胞分离结果显微镜40×10倍视野图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
总实施例
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1-1.05g：70mL分散在乙醇中，超声处理20-30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1-1.2：2-4混合均匀得到混合溶液，搅拌30-40min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，80-95℃，搅拌1-1.4h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至130-140℃下搅拌2-2.5h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3-4：0.6-0.8；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至70-80℃，保温20-24h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2-2.5：0.5-0.8；
B、选择性溶解：按照质量比2-2.5：0.4-0.6往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌40-60min，静置0.3-0.5h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在26-30℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.6-0.8：1.5-2加入N,N-二甲基甲酰胺中，在65-75℃搅拌反应18-22h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.02-0.05g，缓慢搅拌3-4h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.25-0.3mg/ml，胶原酶Ⅳ0.25-0.27mg/ml，透明质酸酶0.15-0.18mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.3-0.35％，嗜热菌蛋白酶55-58mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有8-11万IU/L青霉素和80-100mg/L链霉素的海水中禁食1-2天；
(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心2-4次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，22-30℃进行酶解消化38-42min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的3.5-4.5倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为30-35％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为380-385mOsm/kg，pH为7.2-7.4。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素9-12万IU/L，链霉素90-100mg/L。
实施例1
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.02g：70mL分散在乙醇中，超声处理25min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.1：3混合均匀得到混合溶液，搅拌35min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，88℃，搅拌1.2h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至135℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.5：0.7；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至75℃，保温22h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.3：0.65；
B、选择性溶解：按照质量比2.2：0.5往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌50min，静置0.4h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在28℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.7：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在70℃搅拌反应20h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.035g，缓慢搅拌3.5h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.32％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
实施例2
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1g：70mL分散在乙醇中，超声处理30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1：4混合均匀得到混合溶液，搅拌30min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，80℃，搅拌1h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至130℃下搅拌2.5h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3：0.8；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至80℃，保温20，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.5：0.5；
B、选择性溶解：按照质量比2：0.6往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌40min，静置0.5h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在26℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.6：2加入N,N-二甲基甲酰胺中，在65℃搅拌反应22h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.02g，缓慢搅拌4h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.25mg/ml，胶原酶Ⅳ0.27mg/ml，透明质酸酶0.15mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.35％，嗜热菌蛋白酶55mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有8万IU/L青霉素和100mg/L链霉素的海水中禁食2天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心2次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，22℃进行酶解消化42min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4.5倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为30％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为380mOsm/kg，pH为7.4。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素9万IU/L，链霉素100mg/L。
实施例3
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.05g：70mL分散在乙醇中，超声处理30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.2：2混合均匀得到混合溶液，搅拌40min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，95℃，搅拌1h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至140℃下搅拌2h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：4：0.6；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至70℃，保温24h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2：0.8；
B、选择性溶解：按照质量比2.5：0.4往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌60min，静置0.3h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在30℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.8：1.5加入N,N-二甲基甲酰胺中，在75℃搅拌反应18h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.05g，缓慢搅拌4h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.3mg/ml，胶原酶Ⅳ0.25mg/ml，透明质酸酶0.18mg/mL，胰蛋白酶-EDTA0.3％，嗜热菌蛋白酶58mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有11万IU/L青霉素和80mg/L链霉素的海水中禁食1天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心4次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，30℃进行酶解消化38min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4.5倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为30％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为385mOsm/kg，pH为7.2。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素12万IU/L，链霉素90mg/L。
实施例4
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.01g：70mL分散在乙醇中，超声处理22min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.05：2.5混合均匀得到混合溶液，搅拌32min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，85℃，搅拌1.1h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至132℃下搅拌2.1h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.2：0.65；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至78℃，保温21h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.1：0.6；
B、选择性溶解：按照质量比2.1：0.45往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌45min，静置0.35h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在27℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.65：1.6加入N,N-二甲基甲酰胺中，在68℃搅拌反应18.5h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.03g，缓慢搅拌3-4h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.27mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.16mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.32％，嗜热菌蛋白酶56mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有9.2万IU/L青霉素和85mg/L链霉素的海水中禁食1天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心4次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，24℃进行酶解消化38.5min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的3.8倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为381mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素9.8万IU/L，链霉素92mg/L。
实施例5
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.03g：70mL分散在乙醇中，超声处理20-30min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.15：3.5混合均匀得到混合溶液，搅拌38min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，92℃，搅拌1.3h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至138℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.8：0.75；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至72℃，保温23h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.4：0.7；
B、选择性溶解：按照质量比2.4：0.55往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌55min，静置0.42h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在29℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.75：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在72℃搅拌反应21h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.04g，缓慢搅拌3.8h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.265mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.34％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和95mg/L链霉素的海水中禁食2天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，28℃进行酶解消化41min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4.2倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为34％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为384mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素11万IU/L，链霉素98mg/L。
对比例1(与实施例1的区别在于，将固定化蛋白酶消化液替换成游离蛋白酶消化液。)2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和游离蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，游离蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍；所述游离蛋白酶消化液中酶的组分及浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.32％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。(5)加入酶停止液停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
对比例2(与实施例1的区别在于，固定化蛋白酶中省略了透明质酸酶。)
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.02g：70mL分散在乙醇中，超声处理25min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.1：3混合均匀得到混合溶液，搅拌35min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，88℃，搅拌1.2h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至135℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.5：0.7；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至75℃，保温22h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.3：0.65；
B、选择性溶解：按照质量比2.2：0.5往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌50min，静置0.4h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在28℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.7：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在70℃搅拌反应20h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.035g，缓慢搅拌3.5h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，胰蛋白酶-EDTA 0.32％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
对比例3(与实施例1的区别在于，固定化蛋白酶中省略了胰蛋白酶-EDTA。)
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.02g：70mL分散在乙醇中，超声处理25min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.1：3混合均匀得到混合溶液，搅拌35min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，88℃，搅拌1.2h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至135℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.5：0.7；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至75℃，保温22h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.3：0.65；
B、选择性溶解：按照质量比2.2：0.5往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌50min，静置0.4h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在28℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.7：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在70℃搅拌反应20h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.035g，缓慢搅拌3.5h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
对比例4(与实施例1的区别在于，固定化蛋白酶中省略了嗜热菌蛋白酶。)
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.02g：70mL分散在乙醇中，超声处理25min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.1：3混合均匀得到混合溶液，搅拌35min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，88℃，搅拌1.2h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至135℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.5：0.7；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至75℃，保温22h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.3：0.65；
B、选择性溶解：按照质量比2.2：0.5往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌50min，静置0.4h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在28℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.7：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在70℃搅拌反应20h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.035g，缓慢搅拌3.5h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA0.32％。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
对比例5(与实施例1的区别在于，固定化蛋白酶中省略了胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ。)1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.02g：70mL分散在乙醇中，超声处理25min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.1：3混合均匀得到混合溶液，搅拌35min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，88℃，搅拌1.2h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至135℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.5：0.7；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至75℃，保温22h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.3：0.65；
B、选择性溶解：按照质量比2.2：0.5往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌50min，静置0.4h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在28℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.7：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在70℃搅拌反应20h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.035g，缓慢搅拌3.5h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA0.32％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
对比例6(与实施例1的区别在于，制备金属-有机物载体过程中省略了步骤B的选择性溶解。)
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.02g：70mL分散在乙醇中，超声处理25min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.1：3混合均匀得到混合溶液，搅拌35min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，88℃，搅拌1.2h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至135℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.5：0.7；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至75℃，保温22h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.3：0.65。
C、接枝活性基团：将有序框架结构、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.7：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在70℃搅拌反应20h，过滤并洗涤，得到活化有序框架结构；
D、连接蛋白酶：将活化有序框架结构加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化有序框架结构及乙二胺的比例为1g：0.035g，缓慢搅拌3.5h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA0.32％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
对比例7(与实施例1的区别在于，制备金属-有机物载体过程中省略了步骤C的γ-环糊精接枝活化。)
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.02g：70mL分散在乙醇中，超声处理25min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.1：3混合均匀得到混合溶液，搅拌35min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，88℃，搅拌1.2h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至135℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.5：0.7；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至75℃，保温22h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.3：0.65；
B、选择性溶解：按照质量比2.2：0.5往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌50min，静置0.4h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在28℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.035g，缓慢搅拌3.5h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA0.32％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
对比例8(与实施例1的区别在于，将步骤C的γ-环糊精接枝活化替代为β-环糊精接枝活化。)
1、制备所述固定化蛋白酶的步骤：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O按照1.02g：70mL分散在乙醇中，超声处理25min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1.1：3混合均匀得到混合溶液，搅拌35min得到配位体溶液，然后将混合溶液迅速倒入Zn2+溶液中，88℃，搅拌1.2h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至135℃下搅拌2.3h，降至室温形成有序框架结构；Zn2+溶液、混合溶液及四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3.5：0.7；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至75℃，保温22h，得到初步载体结构；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2.3：0.65；
B、选择性溶解：按照质量比2.2：0.5往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌50min，静置0.4h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在28℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与β-环糊精按质量比1：0.7：1.8加入N,N-二甲基甲酰胺中，在70℃搅拌反应20h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，活化金属-有机物载及乙二胺的比例为1g：0.035g，缓慢搅拌3.5h，过滤得到固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.28mg/ml，胶原酶Ⅳ0.26mg/ml，透明质酸酶0.17mg/mL，胰蛋白酶-EDTA0.32％，嗜热菌蛋白酶57mg/L。
2、分离黄姑鱼肠道上皮细胞：
(1)先将黄姑鱼浸泡在含有10万IU/L青霉素和90mg/L链霉素的海水中禁食1.5天；(2)捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；(3)将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心3次；(4)往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，27℃进行酶解消化40min，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的4倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为32％；(5)停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；所述DEME/F12培养液的渗透压为383mOsm/kg，pH为7.3。
PBS和DEME/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素10.5万IU/L，链霉素95mg/L。
表1各项目中各个类型细胞的数目量及相关参数(×104)
Figure BDA0002962332690000191
Figure BDA0002962332690000201
结论：从实施例1-5可以看出，在本发明反应条件及反应参数范围内均能够制备得到的催化活性好的固定化蛋白酶，通过多孔隙率载体的引入，显著扩大了蛋白酶的温度和ph适应范围，实验证明，最终分离出来的目标细胞(上皮细胞)数量多，上皮细胞周围组织分离彻底，得到纯度高的游离肠道上皮细胞，具有较好的分离效果与分离效率。
对比例1与实施例1的区别在于，将固定化蛋白酶消化液替换成游离蛋白酶消化液；没有金属-有机物载体的固载保护，游离蛋白酶对酶解环境的条件要求苛刻，对ph值的适应范围较小，当肠壁组织中的蛋白酶解后，环境中的ph值会有所降低，会使得部分蛋白酶失活，蛋白酶的酶解能力降低。
对比例2与实施例1的区别在于，固定化蛋白酶中省略了透明质酸酶；透明质酸酶可以降低细胞间质检的粘性，用透明质酸酶可以减少肠细胞分离时的损伤。没有透明质酸酶，会造成肠上皮细胞在分离时受损，减少肠上皮细胞数量的获得。
对比例3与实施例1的区别在于，固定化蛋白酶中省略了胰蛋白酶-EDTA；胰蛋白酶-EDTA中胰蛋白酶可以断开赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间糖蛋白及黏蛋白，从而影响细胞骨架，使细胞分离。EDTA是离子螯合剂，一方面可以通过与钙离子结合来影响钙黏蛋白形成，从而影响黏附连接的形成，另一方面则可以消除金属离子对胰蛋白酶的抑制作用。没有胰蛋白酶-EDTA，会造成肠道细胞分离不纯，获得肠上皮细胞数量较少。
对比例4与实施例1的区别在于，固定化蛋白酶中省略了嗜热菌蛋白酶；嗜热菌蛋白酶与表皮-真皮连接处的相应蛋白成分之间有很强的亲和力，可以将上皮细胞很好的分离下来，获得较多的完整的绒毛隐窝单位。没有嗜热菌蛋白酶，则会造成获得的肠细胞隐窝单位较少，且不完整，肠上皮细胞数量偏少。
对比例5与实施例1的区别在于，固定化蛋白酶中省略了胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ；胶原酶是特异性作用于胶原蛋白、明胶的一类蛋白水解酶，它能够水解胶原蛋白的三维螺旋结构而不破坏其他蛋白与组织。胶原酶I可以消化肠道上皮组织的基质蛋白，胶原酶IV分布于肠组织的基底膜，联合胶原酶I和胶原酶IV酶可以将肠上皮细胞较好的从肠道组织中分离下来。如果没有胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ，胶原蛋白无法消解，细胞间的黏附连接无法消除，易造成肠道上皮细胞损伤，且获得肠上皮细胞数量偏少。
对比例6与实施例1的区别在于，制备金属-有机物载体过程中省略了步骤B的选择性溶解；未加入氨基三乙酸三钠对初步载体结构中的部分有机框架选择性溶解，会降低最终金属-有机物载体中的孔隙率及比表面积，进而降低金属-有机物载体的负载能力，最终使得蛋白酶有效负载量大大减少，并且孔隙内径较小，无法充分容纳蛋白酶，不能使蛋白酶得到有效的保护，因而相关的细胞数量及酶解效率会大打折扣。
对比例7与实施例1的区别在于，制备金属-有机物载体过程中省略了步骤C的γ-环糊精接枝活化；未对制备金属-有机物载体进行表面的活化接枝，会使得制备金属-有机物载体表面的活性位点数量减少，蛋白酶亦不能顺利或稳定的连接到金属-有机物载体上，也会使得固定化蛋白酶在使用过程中有大量的蛋白酶脱出游离，进而降低固定化蛋白酶的酶解效率与再使用效率。
对比例8与实施例1的区别在于，将步骤C的γ-环糊精接枝活化替代为β-环糊精接枝活化；γ-环糊精具有比β-环糊精更大的空腔，所以空腔可包合的客体分子范围更，室温时更好的水溶性，更能有效的兼容金属-有机物载体与蛋白酶，γ-环糊精的大空腔也能够为金属-有机物载体容纳蛋白酶提供更有利的助益，使得蛋白酶与金属-有机物载体的结合与容纳的关系更加稳固，本对比例替换后，会极大降低蛋白酶连接的稳定性，游离蛋白酶会增多，随着ph值变化，蛋白酶的活性会有所降低，进而降低其酶解效率。
图1中较大圆形的肠道上皮细胞很多，且出现细胞团，上皮细胞主要沿细胞团边缘爬出，说明这种方法可以较多较纯化的肠道上皮细胞，还有健全的隐窝细胞团；图2中肠道上皮细胞(较大圆形)数目较多，但仍有梭型的肌细胞，圆形(较小)的红细胞，说明这种方法中虽然可以得到较多肠上皮细胞，但纯化效果欠佳，仍然混杂有一些杂细胞；图3中有梭型的肌细胞，圆形(较小)的白细胞、红细胞，肠道上皮细胞(较大圆形)仍然较少，说明这种方法不能得到较多的肠道上皮细胞；图4中细胞类型较杂，有血细胞，成纤维细胞，肠道上皮细胞(较大圆形)则较少，说明这种方法不能得到较多的肠道上皮细胞，且易造成肠上皮细胞损伤；图5较大圆形的为肠道上皮细胞，图中肠道上皮细胞较少，说明这种方法不能得到较多的肠道上皮细胞，且易造成肠上皮细胞破碎。
由实施例1-5以及对比例1-8的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到最优的黄姑鱼肠道细胞的有效分离方法。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (5)

1.一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）先将黄姑鱼浸泡在含有青霉素和链霉素的海水中禁食1-2天；
（2）捞出黄姑鱼，酒精喷洒鱼体表面杀菌，在无菌室中，分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；
（3）将肠壁置于DMEM/F12培养液中，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心2-4次；
（4）往容器中同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，进行酶解消化；
（5）停止消化，过滤消化液，加入DMEM/F12培养液清洗并离心，后加入DMEM/F12培养液待用；
固定化蛋白酶消化液中含有固定化蛋白酶，所述固定化蛋白酶的制备步骤如下：
A、制成初步载体结构：将Zn(NO3)2·6H2O 按照1-1.05 g：70 mL分散在乙醇中，超声处理 20-30 min得到Zn2+溶液，将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1-1.2：2-4混合均匀得到混合溶液，搅拌30-40 min得到配位体溶液，然后将配位体溶液迅速倒入Zn2+溶液中，80-95℃，搅拌1-1.4h；再加入四亚乙基五胺溶液，升温至130-140℃下搅拌2-2.5h，降至室温形成有序框架结构；将有序框架结构加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，升温至70-80℃，保温20-24h，得到初步载体结构；Zn2+溶液，均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液，四亚乙基五胺溶液的体积比为1：3-4：0.6-0.8；有序框架结构、苯乙烯单体与过氧化月桂酰的质量比为3：2-2.5：0.5-0.8；
B、选择性溶解：往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，常温下搅拌40-60min，静置0.3-0.5 h后离心收集产物，乙醇洗涤三次后在26-30℃烘箱中过夜干燥，得到金属-有机物载体；有序框架结构与氨基三乙酸三钠的质量比2-2.5：0.4-0.6；
C、接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.6-0.8：1.5-2加入N,N-二甲基甲酰胺中，在65-75℃搅拌反应18-22h，过滤并洗涤，得到活化金属-有机物载体；
D、连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，继续加入乙二胺，缓慢搅拌3-4h，过滤得到固定化蛋白酶；所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.25-0.3 mg/ml，胶原酶Ⅳ0.25-0.27 mg/ml，透明质酸酶0.15-0.18mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.3-0.35%，嗜热菌蛋白酶55-58mg/L；活化金属-有机物载体及乙二胺的比例为1g:0.02-0.05g。
2.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，其特征是，步骤（1）中，海水中青霉素和链霉素浓度分别为8-11万IU/L和80-100mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，其特征是，所述DMEM/F12培养液的渗透压为380-385mOsm/kg，pH为7.2-7.4。
4.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，其特征是，PBS和DMEM/F12培养液中含有青霉素和链霉素，其浓度分别为青霉素9-12万IU/L，链霉素90-100mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，其特征是，步骤（4）中，固定化蛋白酶消化液是肠道组织块体积的3.5-4.5倍，固定化蛋白酶消化液中固定化蛋白酶的质量浓度为30-35%，酶解消化的消化温度为22-30℃，消化时间为38-42min。
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