CN101285050A - 利用差速消化实现细胞高度富集的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富集细胞的方法，它包括步骤：将蛋白酶与贴壁培养的细胞混合，使不同细胞差速脱壁，从而得到分离。本发明提供的方法安全、便捷、高效。本发明还公开了具体地使用所述方法分离纯化雪旺细胞(Schwann cell，SC)的方法。

Description

利用差速消化实现细胞高度富集的方法

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及利用差速消化法纯化制备细胞的方法和用途。

背景技术

从外周血、骨髓、外周淋巴器官或各种组织分离出来的细胞是多种细胞的混合物，如要研究某种特定细胞的结构、功能或表面标志等特征，首先要分离纯化细胞。细胞纯化可根据其大小、密度、表面荷电、吸附能力或表面抗原的差异而采用密度梯度沉降法、细胞电泳、贴附、亲和层析、花环形成、补体介导杀伤溶解以及流式细胞仪(FCM)等方法来进行纯化。尤其在组织工程领域，对细胞纯度、数量的要求很高，而上述列举的方法具有耗时、操作烦复不易掌握、设备试剂昂贵等缺点。

以雪旺细胞(Schwann cell，SC)为例，说明目前尚不能利用现有技术制备高纯度的SC。

SC起源于神经脊细胞，在成体的周围神经组织中包绕所有神经轴突纤维，并可分为两种类型：一种包绕有髓纤维形成髓鞘，另一种包绕无髓纤维但并不行成髓鞘；每个形成髓鞘的SC只包绕一根轴突纤维，而不形成髓鞘的SC可包绕多根无髓轴突纤维。形成髓鞘的SC相当于中枢神经系统中的少突胶质细胞(oligodendrocyte)，而不形成髓鞘的SC则相当于中枢中的星形细胞(astrocyte)。

SC不仅在周围神经的发育和功能维持中发挥着重要功能，更在周围神经的损伤再生中起着重要作用。在周围神经损伤后，损伤位点远侧的神经组织发生瓦勒变形(Wallerian degeneration)，其内的SC去分化为不成熟的SC(immature SC)并分裂增殖，形成Burger氏带，吞噬轴突碎片并分泌神经营养因子及细胞外基质(ECM)，刺激并诱导再生轴突的定向延长。

SC的体内外研究及组织工程化人工神经的构建都需要制备高纯度的SC。然而在SC的体外培养中，成纤维细胞的优势生长严重影响了培养所获得的SC纯度。在过去的30年，诸多研究者报道了多种纯化SC的方法，可归纳为下列几种：(1)抗有丝分裂处理，(2)抗有丝分裂处理结合抗体介导的细胞裂解法，(3)重复植块法，(4)差速贴壁法，(5)免疫选择法。然而这些方法各有其缺点存在。抗有丝分裂剂，如阿糖胞苷等，非特异地作用于所有的进行有丝分裂的细胞，因而不仅减少了快速增殖的成纤维细胞，同时也杀死了处于有丝分裂期的SC；而抗体介导的细胞裂解则需要价格昂贵的抗体及补体；重复植块法及差速贴壁法操作过程复杂且容易在纯化过程中丢失大量的SC；免疫选择法，无论是采用流式分选还是磁珠分选均需要采用特殊的设备及抗体，操作过程即不经济也不方便，细胞丢失量也较大。

因此，在本领域迫切需要一种方法简单、快速、经济且安全的细胞纯化方法。

发明内容

本发明旨在提供一种富集细胞的方法。

本发明的第二个目的是提供一种富集SC的方法。

本发明的第三个目的是提供一种富集内皮细胞的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种获得细胞的方法，它包括步骤：

(a)将贴壁培养的细胞群与蛋白酶混合，从而使待分离的细胞从贴壁细胞群上脱落下来，成为游离的待分离细胞，其中所述的贴壁培养的细胞群含有待分离的细胞以及待弃的细胞；所述的待分离的细胞和待弃的细胞是不同的细胞；

(b)将游离的待分离细胞与所述的细胞群分开，从而获得待分离的细胞。

更佳地，本发明提供了一种富集细胞的方法，它包括步骤：

(a)将贴壁培养的细胞群与蛋白酶混合，从而使待分离的细胞从贴壁细胞群上脱落下来，成为游离的待分离细胞，其中所述的贴壁培养的细胞群含有待分离的细胞以及待弃的细胞；所述的待分离的细胞和待弃的细胞是不同的细胞；

(b)将游离的待分离细胞与所述的细胞群分开，从而获得待分离的细胞。

在另一优选例中，所述的待分离的细胞和待弃的细胞具有不同的脱壁时间，所述的脱壁时间相差5min-36小时。

在另一优选例中，所述的细胞群含有雪旺细胞(Schwann cell，SC)和成纤维细胞。

在另一优选例中，所述的细胞群含有内皮细胞和成纤维细胞。

在另一优选例中，在步骤(b)后还包括步骤：

(c)用待分离细胞或待弃细胞重复步骤(a)、(b)，得到富集的待分离细胞或待弃细胞。

在另一优选例中，重复步骤(a)、(b)1-5次。

在另一优选例中，重复步骤(a)、(b)1-2次，更佳地，重复3次。

在本发明的第二方面，提供了一种富集SC的方法，它包括步骤：

(a)将贴壁培养的雪旺细胞和成纤维细胞形成的细胞群与蛋白酶混合，从而使雪旺细胞从贴壁细胞群上脱落下来，成为游离的细胞；

(b)将游离的SC与仍然保持贴壁的细胞群分开，从而获得纯度较高的雪旺细胞。

在本发明的第三方面，提供了一种富集内皮细胞的方法，它包括步骤：

(a)将贴壁培养的内皮细胞和成纤维细胞形成的细胞群与蛋白酶混合，从而使内皮细胞从贴壁细胞群上脱落下来，成为游离的细胞；

(b)将游离的内皮细胞与仍然保持贴壁的细胞群分开，从而获得内皮细胞。

在本发明提供的方法中，所述的蛋白酶包括胶原酶，胰酶，中性蛋白酶，胃蛋白酶，糜蛋白酶，组织蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

在另一优选例中，将浓度为1×10^-3-0.1％的蛋白酶与细胞群混合10-180min。较佳地，20-120min。更佳地，30-60min。

在另一优选例中，步骤(a)前还包括步骤(a’)：将细胞群接种培养，接种密度为0.5-10×10⁵细胞/cm²。较佳地，接种密度为0.8-8×10⁵细胞/cm²。更佳地，为1-6×10⁵细胞/cm²。

在本发明提供的获得细胞的方法中，还包括步骤：

(d)将获得的待分离细胞用作组织工程的种子细胞；或用于制备移植物。

在另一优选例中，将获得的雪旺细胞用作组织工程中神经组织种子细胞；或用于制备神经移植物。

据此，本发明提供了一种简单、快速、经济且安全的细胞纯化方法。

附图说明

图1显示了培养过程中成纤维细胞和SC的生长情况；其中，

A是成纤维细胞，B是在前48小时培养过程中，SC分裂速度较成纤维细胞快，C是72小时后，成纤维细胞加快增殖成为优势生长细胞，D是经过首次纯化后所得的高纯度SC，其中还残留少数成纤维细胞。

图2显示了复合胶原酶消化后，SC和成纤维细胞的变化；其中，

A和a是纯化前SC与成纤维细胞混合贴壁的状态，B和b经过一次纯化后几乎所有的成纤维细胞及少量SC仍然贴壁。

图3显示了从原代至两次纯化后SC的纯度及细胞量的变化。

图4显示了二次纯化后所得的高纯度SC及其S100b免疫荧光染色结果。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，利用蛋白酶消化贴壁培养的细胞群，由于各种细胞脱壁的时间不同，可以对它们进行分离，从而达到富集某些细胞的目的。

例如，采用一种混合胶原酶对贴壁培养的雪旺细胞或内皮细胞进行消化，使雪旺细胞或内皮细胞早于成纤维细胞收缩脱壁，达到纯化效果。

如本文所用，“细胞群”是指不同种类细胞的集合，所述的不同细胞种类可以是2-10种，较佳地是2-5种，更佳地为2-3种。细胞群中各种细胞是数量可以是相当的，也可以是相互之间有较大差异的。

如本文所用，“待分离细胞”是指在贴壁培养的细胞群中加入蛋白酶，经蛋白酶消化后，由于不同种类的细胞，其大小、粘附能力和/或细胞外基质分泌能力不同，它们在不同的时间发生脱壁现象，在贴壁的细胞群中早于其它细胞脱离培养器皿壁，成为游离细胞的细胞或细胞群的，称为待分离细胞。

如本文所用，“待弃细胞”是指在贴壁培养的细胞群中加入蛋白酶，经蛋白酶消化后，由于不同种类的细胞，其大小、粘附能力和/或细胞外基质分泌能力不同，它们在不同的时间发生脱壁现象，当贴壁的细胞群中有细胞脱离培养器皿壁，成为游离细胞时，那些仍然贴壁的细胞或细胞群称为待弃细胞。

根据实际需要，“待分离细胞”与“待弃细胞”可以互换，即经酶消化后游离下来的细胞为“待弃细胞”，而保持贴壁的细胞为“待分离细胞”。

不同细胞间发生收缩脱壁现象的时间差在5min-36小时，较佳地在10-300min，更佳地在10-180min。

本发明所述的细胞群中可以含有SC和成纤维细胞；也可以含有内皮细胞和成纤维细胞。其中优选的是主要由SC和成纤维细胞构成的细胞群；或主要由内皮细胞和成纤维细胞构成的细胞群。

可用于本发明提供的方法的蛋白酶包括复合胶原酶、胰酶、中性蛋白酶，胃蛋白酶，糜蛋白酶，组织蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

可以使用本领域常用的复合胶原酶，例如但不限于：Collagenase NB1，Collagenase NB4，Collagenase NB5，或Collagenase NB6，其中优选CollagenaseNB4。本发明提供的方法中使用0.01-0.1％复合胶原酶，较佳地0.02-0.08％，更佳地0.03-0.07％。本发明提供的方法中胰酶浓度较低，≤0.1％，较佳地≤0.05％，更佳地≤0.03％。

在本发明的一个优选例中，富集细胞的方法包括步骤：

(1)原代细胞群培养24-72小时，较佳地为48-60小时；

(2)加入蛋白酶混合10-180min，待分离细胞A游离入消化液；

(3)离心、重悬待分离细胞A；

(4)接种待分离细胞A继续培养24-72小时；

(5)重复步骤(2)-(3)，得到纯度极高的待分离细胞A。

或在步骤(2)后离心除去待分离细胞A后，得到待弃细胞群，重复步骤(2)-(3)，得到待分离细胞B。

在本发明的另一优选例中，富集细胞的方法包括步骤：

(1)原代细胞群(含有SC和成纤维细胞)培养24-72小时，较佳地为36-60小时；

(2)加入蛋白酶混合10-180min，SC游离入消化液；

(3)离心、重悬SC；

(4)接种SC继续培养24-72小时；

(5)重复步骤(2)-(3)，得到纯度极高的SC。

在本发明的另一优选例中，富集细胞的方法包括步骤：

(1)原代细胞群(含有内皮细胞和成纤维细胞)培养24小时-7天，较佳地为3-7天；

(2)加入蛋白酶混合10-180min，内皮细胞游离入消化液；

(3)离心、重悬内皮细胞；

(4)接种内皮细胞继续培养3-7天；

(5)重复步骤(2)-(3)，得到纯度极高的内皮细胞。

通过本发明的方法富集的细胞可以作为组织工程种子细胞或制备移植物。

在一个优选例中，可将由此得到的高纯度的SC(a)用作组织工程中神经组织种子细胞；或(b)用于制备神经移植物。体外培养扩增的SC接种到生物相容性良好并可被机体吸收的可降解生物材料上形成种子细胞-生物材料复合物，将这一“种子细胞-生物材料”复合物植入到缺损部位，随着生物材料的逐渐降解吸收，种子细胞继续增殖并分泌基质，最终替代生物材料而形成包裹相应部位神经轴突的髓鞘。

可用于本发明的组织工程化神经的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；

(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。

一种优选的材料为聚乳酸PLA和聚羟基乙酸PLGA的复合材料(PLA/PGA，PLGA)。

本发明的主要优点在于：

1、提供了一种全新的富集细胞的方法。

2、方法安全、便捷、高效。

3、本发明提供的方法分离得到的细胞纯度极高。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

分离纯化SC

LN铺盘

1.在培养瓶内加入100μl/cm²的LN溶液，摇晃培养瓶至液体均匀铺满瓶底；

2.将培养瓶放入细胞培养箱内，37℃孵育60min；

3.负压吸除LN溶液，拧紧培养瓶盖，放入4℃冰箱内待用(一周内使用)。SC获取与原代培养

1.取新生5-7天的小鼠10只，斩首处死后在75％酒精内浸泡消毒15min；

2.在解剖显微镜下手术获取双侧坐骨神经(SN)，将SN浸入装有40ml PBS的50ml离心管中，冰上孵育待用；

3.SN获取完毕后，600×g离心，负压吸除PBS，加入1ml 0.2％复合胶原酶，放入细胞培养箱内，37℃孵育90min，期间每30min摇晃一次；

4.加入0.25％胰酶1ml，用巴氏管反复吸打2-5min，致组织块呈细微碎片(此时消化液较混浊，无明显大组织块)，加入100μl FBS终止胰酶消化；

5.600×g离心5min，弃上清，加入SC培养液重悬至2-2.5×10⁵cells/ml，接种入LN铺盘后的培养瓶培养(100μl/cm²，即2-2.5×10⁴cells/cm²)。

SC的纯化与扩增

1.原代细胞培养48小时；

2.负压吸除培养液，加入0.05％复合胶原酶溶液，将培养瓶放入细胞培养箱内，37℃孵育30-40min(此时见多数SC收缩明显)；

3.水平方向快速摇晃培养瓶1-3min，使SC游离入消化液(摇晃时间需在显微镜下控制，大多数SC游离起即可)；

4.收集细胞悬液入15ml离心管，600×g离心5min，弃上清，加入SC培养液重悬细胞；

5.1∶1接种入新的培养瓶继续培养48小时；

6.重复步骤2至步骤4，1∶2接种入新的培养瓶，继续培养24-48小时(此时SC纯度在99％以上)。

SC的鉴定

形态学鉴定

在体外培养中，SC形态较特异，胞体细长呈梭形双极或三极样、浆核比例小、折光性强，依此很容易地能与胞体扁平不规则形、浆核比例较大、折光性差的成纤维细胞相鉴别。此外，在体外培养中，相邻的SC会首尾相连，形成链状或网状这一特异的形态，而成纤维细胞则互相融合成片。

免疫细胞化学鉴定

SC均特异地表达S100b蛋白而成纤维细胞均不表达，依此可鉴定SC。具体操作如下：

1.负压吸除SC培养液，加入0.05％Trypsin-EDTA消化1min，FBS终止消化；

2.600×g离心5min，弃上清，加入SC培养液重悬细胞至2-2.5×10⁶cells/ml；

3.将细胞悬液滴于载玻片上，100μl/张，在37℃细胞培养箱内孵育30-40min后，加入适量SC培养液培养24-48小时；

4.负压吸除SC培养液，加入4％多聚甲醛溶液，室温固定5min；

5.PBS漂洗3次，每次3min；

6.10％羊血清室温封闭10min；

7.加入兔抗S100b抗体(1∶100，PBS稀释)，37℃孵育30min；

8.PBS漂洗3次，每次5min；

9.加入FITC-羊抗兔IgG抗体(1∶200，PBS稀释)，37℃孵育30min；

10.PBS漂洗3次，每次5min；

11.PI核衬染10sec，PBS漂洗5min一次；

12.荧光封片剂封片，荧光显微镜观察及照片拍摄。

SC纯度计算

细胞培养过程中，在相差显微镜下每24小时对每个培养瓶随机挑选3个40×视野进行照片拍摄，共进行5次拍摄。随后根据细胞形态来统计每张图片中的SC纯度(SC纯度＝SC数量/(SC数量+成纤维细胞数量)×100％)，由每瓶每次拍摄的3张图片得出一个平均值，然后根据所有的平均值及瓶数得出一个总的纯度均值，用均值±标准差表示。

细胞计数

从每次纯化过程中所得细胞悬液取20μl，并用血细胞计数板进行细胞计数，此时获得的为纯化后所得的细胞量。第5天时，用0.05％Trypsin-EDTA消化1-3min以获得所有的贴壁细胞；细胞悬液收集后，取20μl用血细胞计数板进行细胞计数，此时所得为最终的细胞获得量。

结果

雪旺细胞的获取与原代培养

经酶及机械消化后，所获得的细胞接种于LN铺盘后的培养瓶；6小时后即见绝大多数细胞已经贴壁；随着进一步培养，贴壁细胞逐渐伸展，最终形成两类形态迥异的细胞：一类为SC，细胞较小，呈梭形双极或三极样，浆核比例小，胞核椭圆，胞体折光性强；另一类为成纤维细胞，细胞较大，呈扁平多边或不规则形，浆核比例大，胞核圆而大，胞体折光性差(图1，A)。在前48小时的培养过程中，SC分裂速度明显快于成纤维细胞(图1，B)；在72小时后，成纤维细胞增殖加快并迅速成为优势生长的细胞而铺满瓶底，此时多数SC被迫迁移并重叠到成纤维细胞的上方(图1，C)。

雪旺细胞的纯化与扩增

为了获取SC，在解剖纤维镜下经手术从10只6天龄的新生小鼠获得20根坐骨神经(自背侧神经节取至裹窝处，每根约长10mm)，随后将SC经消化后共获得约2.65×10⁶个细胞。将所获得的细胞平均分入5个培养瓶进行原代培养，每瓶得5.3×10⁵个细胞。

原代培养48小时后，进行第一次纯化：负压吸除培养液，加入经37℃预热的0.05％复合胶原酶溶液。将培养瓶放回培养箱孵育30-40min后，见大多数的双极和三极样的细胞收缩，折光性明显增加，而成纤维细胞则未见明显的形态学改变并贴壁牢固(图2，A，a)。将培养瓶放置在超净台面上，沿水平方向快速晃动1-3min，致大多数SC悬浮起即可(图2，B，b)，随即收集消化液，离心，弃上清后用SC培养液重悬，除取20μl样品进行细胞计数外，其余细胞按1∶1接种于新的培养瓶内。第一次纯化后，细胞贴壁培养24小时，经细胞形态学评估，SC纯度为95.8±0.7％。

尽管经过一次纯化后，SC纯度已经很高(图1，D)，但是由于残留的少量成纤维细胞仍然处于快速分裂状态，故而在48小时培养后仍需再进行一次纯化。经过二次纯化后24小时的形态学评估，SC纯度可达99.6％±0.3％，最终每个培养瓶所得的细胞量为102.8±5.9×10⁴(即从每只小鼠的坐骨神经可得约51.4×10⁴个细胞)。

该实验共重复了5次，所得的SC纯度均高于99％，结果详见表1：

表1五次独立实验的结果

实验编号	小鼠数量	N*	初始接种细胞量(×104细胞/瓶)	48小时SC纯度(％)	120小时后最终细胞量(×104细胞/瓶)	120小时最终SC纯度(％)
							#1	12	5	50.4	68.8±0.4	101.6±3.8**	99.7±0.3***
#2	10	4	51.5	64.3±0.3	98.5±10.8**	99.7±0.2***
							#3****	10	5	53.0	65.0±0.6	102.8±5.9**	99.6±0.3***
#4	12	4	57.0	69.4±0.5	111.0±8.7**	99.7±0.2***
							#5	25	8	60.5	68.7±0.9	99.8±10.0**	99.8±0.2***

^*每个实验中所用25-cm²培养瓶数量。

^**初始接种细胞量和最终细胞产量之间具显著性差异(P＜0.01)。

^***48小时SC纯度和最终SC纯度之间具显著性差异(P＜0.01)。

^****实验3的详细结果参见图3。

雪旺细胞的鉴定

将部分经过二次纯化后24小时培养的细胞制备成细胞爬片，其余细胞继续贴壁培养。经S100b蛋白的免疫荧光染色，发现几乎所有的双极及三极样细胞为阳性，而残余的扁平圆核不规则细胞则均为阴性(图4，B)。经体外继续培养的SC，在3天后大多排列成链状或网状(图4，A)。

讨论

本发明所采用的复合胶原酶是一种天然的胶原酶复合物，其中含有I型及II型胶原酶及其他一些具有蛋白水解活性的物质诸如梭菌蛋白酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶样物质。

此外采用低浓度的胰酶(0.005％)及含1mM EDTA的冷PBS也可达到近似的纯化效果。

在复合胶原酶的处理下，SC早于成纤维细胞被消化下来，这可能是因为成纤维细胞贴壁黏附性强于SC。不过，使用胰酶处理时，这种差速消化现象并不明显，这可能是由于复合胶原酶对于SC所分泌的ECM作用较为特异或强烈。

首次纯化后即便SC的纯度超过95％，但所残余的成纤维细胞仍具有快速分裂生长的能力，因而至少还应进行1-2次的纯化，这样能基本消除成纤维细胞对SC的污染。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1. 一种富集细胞的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)将贴壁培养的细胞群与蛋白酶混合，从而使待分离的细胞从贴壁细胞群上脱落下来，成为游离的待分离细胞，其中所述的贴壁培养的细胞群含有待分离的细胞以及待弃的细胞；所述的待分离的细胞和待弃的细胞是不同的细胞；

(b)将游离的待分离细胞与所述的细胞群分开，从而获得待分离的细胞。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待分离的细胞和待弃的细胞具有不同的脱壁时间，所述的脱壁时间相差5min-36小时。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞群含有雪旺细胞和成纤维细胞。

4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞群含有内皮细胞和成纤维细胞。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)后还包括步骤：

(c)用待分离细胞或待弃细胞重复步骤(a)、(b)，得到富集的待分离细胞或待弃细胞。

6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，重复步骤(a)、(b)1-5次。

7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)将贴壁培养的雪旺细胞和成纤维细胞形成的细胞群与蛋白酶混合，从而使雪旺细胞从贴壁细胞群上脱落下来，成为游离的细胞；

(b)将游离的SC与仍然保持贴壁的细胞群分开，从而获得纯度较高的雪旺细胞。

8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)将贴壁培养的内皮细胞和成纤维细胞形成的细胞群与蛋白酶混合，从而使内皮细胞从贴壁细胞群上脱落下来，成为游离的细胞；

(b)将游离的内皮细胞与仍然保持贴壁的细胞群分开，从而获得内皮细胞。

9. 如权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶包括胶原酶，胰酶，中性蛋白酶，胃蛋白酶，糜蛋白酶，组织蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤：

(d)将获得的待分离细胞用作组织工程的种子细胞；或用于制备移植物。

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