CN115261300A - 一种虾肠道细胞提取和培养的方法 - Google Patents
一种虾肠道细胞提取和培养的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115261300A CN115261300A CN202211056897.0A CN202211056897A CN115261300A CN 115261300 A CN115261300 A CN 115261300A CN 202211056897 A CN202211056897 A CN 202211056897A CN 115261300 A CN115261300 A CN 115261300A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- shrimp
- intestinal
- extracting
- intestinal tract
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 title claims abstract description 82
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 title claims description 28
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 25
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 21
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 12
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 7
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims abstract description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 29
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 24
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 24
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 24
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 24
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 15
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 14
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 12
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 12
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 12
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 12
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 12
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 12
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 claims description 12
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 12
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 claims description 11
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 8
- 230000037351 starvation Effects 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 claims description 5
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 5
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 3
- 241001454293 Tetranychus urticae Species 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- DVWJFTGEISXVSH-CWVFEVJCSA-N (1R,3S,5S,7Z,11R,12S,13Z,15Z,17Z,19Z,21R,23S,24R,25S)-21-[(2R,3S,4S,5S,6R)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-12-ethyl-1,3,5,25-tetrahydroxy-11-methyl-9-oxo-10,27-dioxabicyclo[21.3.1]heptacosa-7,13,15,17,19-pentaene-24-carboxylic acid Chemical compound CC[C@H]1\C=C/C=C\C=C/C=C\[C@@H](C[C@@H]2O[C@@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)C[C@@H](O)C[C@@H](O)C\C=C/C(=O)O[C@@H]1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](N)[C@@H]1O DVWJFTGEISXVSH-CWVFEVJCSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 229930183279 tetramycin Natural products 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于虾肠道细胞培养的技术领域，具体涉及一种虾肠道细胞提取和培养的方法。首先将对虾置于含四抗液的煮沸的2‰的海盐中饥饿处理一天，将对虾浸泡在75％的酒精中，对其表面进行消毒，在清洗肠道时使用5×的四抗液，可以有效抑制肠道内容物和肠道细菌的污染。所采用的培养基达到适合虾肠道细胞的生长的渗透压，防止细胞在低渗透压时破裂；使用鼠尾胶原I型蛋白包被培养板可以有效的促进虾细胞生长；以及使用消化液和细胞筛可以有效减少细胞碎片，且只需10min就可以从肠道组织里面释放出细胞，所使用的胶原蛋白酶Ⅳ和胶原蛋白酶Ⅰ混合使用有效地提取到虾肠细胞，此比例的使用显著提高了虾肠组织的消化效率，大大缩短了提取的时间。
Description
技术领域
本发明属于虾肠道细胞培养的技术领域，具体涉及一种虾肠道细胞提取和培养的方法。
背景技术
我国是对虾养殖大国，也是对虾需求量巨大的国家。但是虾病毒的频繁爆发对对虾的养殖带来了严重的打击。特别是虾肠道疾病最近几十年来一直都只能用抗生素去治疗，但是结果都是微乎其微，导致对虾养殖业可持续发展遇到了瓶颈。对虾的肠道细胞的培养可以为虾的肠道疾病提供科学的研究方法，但是虾肠道里有很多的内容物和各种菌群，给虾肠道细胞培养造成很大的困难。虽然国内外很多专家学者在对虾肠道细胞分离和培养方面进行了大量的探索和努力，但目前还没有较大的进展。
目前，有关对虾肠道样本提取和培养的技术鲜有报道。专利CN201910622127.X公开了一种对虾的外周血淋巴细胞的提取和3D培养的永生技术，虽然说此方法可以适用于其他的虾的器官，但是由于对虾肠道细胞的内容物和菌群比较多，很容易造成污染，且对虾肠道又比较小，操作较为困难。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种虾肠道细胞提取和培养的方法。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种虾肠道细胞提取和培养的方法，包括如下步骤：
1)饥饿处理：选取对虾，将其置于含四抗液的煮沸的2‰的海盐中进行饥饿处理一天；
所述四抗液为青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的混合溶液；
所述青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的使用体积比为1:1:1:1；
所述青霉素的使用浓度为100U/mL；
所述链霉素的使用浓度为0.1mg/mL；
所述庆大霉素的使用浓度为50μg/mL；
所述支原体清除剂MRA(ZT10002)的使用浓度为0.39μg/mL；
2)消毒：采用酒精对对虾的表面进行消毒处理，采用含5×四抗液的Dhanks液对虾肠道进行处理，可以有效抑制肠道内容物和肠道细菌的感染；
所述含5×四抗液的Dhanks液中，Dhanks液的成分成分包括NaCl、KCl、KH2PO4、NAHCO3；
3)肠道收集和消化：收集消毒后的虾肠道于细胞筛中，加入消化液进行研磨，吸取滤过细胞筛的消化液于EP管中，26～28℃、200rpm的摇床进行消化，将消化处理得到的消化液加入含胎牛血清的M199完全培养基终止消化；
所述消化液包括胶原蛋白酶IV和胶原蛋白酶I，其使用体积比为1：(1～3)；
所述胶原蛋白酶IV的使用浓度为0.1～0.3mg/mL；
所述胶原蛋白酶I的使用浓度为0.1～0.3mg/mL；
4)肠细胞的收集和培养：取消化液进行第一次离心处理，常温下300rpm离心5min，收集上清后弃沉淀；
再将上清液进行第二次离心处理，常温下500rpm离心5～8min，弃上清，用含胎牛血清的M199完全培养基进行细胞重悬；
对重悬后的细胞进行计数后铺于提前用鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板中，置于26～28℃、6％的CO2培养箱中培养，48h之后进行扩培或换液处理，得到虾肠道细胞；
所述鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板的制备为：配制24μL的鼠尾胶原+10mL0.06moL/L HAC形成0.012mg/mL胶原蛋白溶液，培养板的每一孔加600μL配好的0.012mg/mL胶原蛋白溶液，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净台上过夜晾干，也可以室温放置1h后，用PBS洗3～4次后直接使用。
所述M199完全培养基中的组分包括质量体积百分比为15％的胎牛血清、NaCl 5～6g/L，葡萄糖1～3g/L，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/L，余量为M199基础培养基，1×四抗液，渗透压为470～550mmol/kg。
本发明的有益效果如下：
本发明的虾肠道细胞提取和培养的方法，首先将对虾养在含四抗液的煮沸的2‰的海盐中饥饿处理一天，将对虾浸泡在75％的酒精中5～10min，对其表面进行消毒，在清洗肠道时使用5×的四抗液，可以有效抑制肠道内容物和肠道细菌的污染。使用梯度离心，有效去除碎片，得到比较干净的背景；所采用的培养基，使用NaCl和葡萄糖调节渗透压，达到适合虾肠道细胞的生长的渗透压，防止细胞在低渗透压时破裂；使用鼠尾胶原I型蛋白包被培养板可以有效的促进虾细胞生长；以及使用消化液和细胞筛可以有效减少细胞碎片，且只需10min就可以从肠道组织里面释放出细胞，所使用的胶原蛋白酶Ⅳ和胶原蛋白酶Ⅰ混合使用有效地提取到虾肠细胞，此比例的使用显著提高了虾肠道组织的消化效率，大大缩短了提取的时间。
附图说明
图1为对比例1处理的虾肠细胞状态图；
图2为对比例2的处理的虾肠细胞状态图；
图3为对比例3的处理的虾肠细胞状态图；
图4为200rpm，5min(72h)离心处理下的细胞状态；
图5为500rpm，5min(72h)离心处理下的细胞状态；
图6为1000rpm，5min(4h)离心处理下的细胞状态。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
一种虾肠道细胞提取和培养的方法
1)饥饿处理：选取对虾，将其置于含四抗液的煮沸的2‰的海盐中进行饥饿处理一天；
所述四抗液为青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的混合溶液，其使用体积比1:1:1:1；
所述青霉素的使用浓度为100U/mL；
所述链霉素的使用浓度为0.1mg/mL；
所述庆大霉素的使用浓度为50μg/mL；
所述支原体清除剂MRA(ZT10002)的使用浓度为0.39μg/mL；
2)消毒：采用酒精对对虾的表面进行消毒处理，采用5～8mL含5×四抗液的Dhanks液对虾肠道进行处理3～5遍，可以有效抑制肠道内容物和肠道细菌的感染；
所述含5×四抗液的Dhanks液中，Dhanks液的成分包括0.8g NaCl、0.4g KCl、0.06g KH2PO4、0.35g NAHCO3；
3)肠道收集和消化：收集消毒后的虾肠道于细胞筛中，加入消化液进行研磨，吸取滤过细胞筛的消化液于EP管中，26～28℃、200rpm进行消化，将消化处理得到的消化液加入含胎牛血清的M199完全培养基终止消化；
所述消化液为体积比为1:1的胶原蛋白酶IV和胶原蛋白酶I，胶原蛋白酶IV的使用浓度为0.1mg/mL，胶原蛋白酶I的使用浓度为0.1mg/mL；
4)肠细胞的收集和培养：取消化液进行第一次离心处理，常温下300rpm离心5min，收集上清后弃沉淀；
再将上清液进行第二次离心处理，常温下500rpm离心5～8min，弃上清，用含胎牛血清的M199完全培养基进行细胞重悬；
对重悬后的细胞进行计数后铺于提前用鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板中，置于26～28℃、6％的CO2培养箱中培养，48h之后进行扩培或换液处理，得到虾肠道细胞；
所述鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板的制备为：配制24μL的鼠尾胶原+10mL0.06moL/L HAC形成0.012mg/mL胶原蛋白溶液，培养板的每一孔加600μL配好的0.012mg/mL胶原蛋白溶液，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净台上过夜晾干，也可以室温放置1h后，用PBS洗3～4次后直接使用；
所述M199完全培养基中的组分包括质量体积百分比为15％的胎牛血清、NaCl 5g/L，葡萄糖3g/L，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/L，余量为M199基础培养基，1×四抗液，渗透压为500mmoL/kg。
实施例2
一种虾肠道细胞提取和培养的方法
1)饥饿处理：选取对虾，将其置于含四抗液的煮沸的2‰的海盐中进行饥饿处理一天；
所述四抗液为青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的混合溶液，其使用体积比1:1:1:1；
所述青霉素的使用浓度为100U/mL；
所述链霉素的使用浓度为0.1mg/mL；
所述庆大霉素的使用浓度为50μg/mL；
所述支原体清除剂MRA(ZT10002)的使用浓度为0.39μg/mL；
2)消毒：采用酒精对对虾的表面进行消毒处理，采用5～8mL含5×四抗液的Dhanks液(同实施例1)对虾肠道进行处理3～5遍，可以有效抑制肠道内容物和肠道细菌的感染；
3)肠道收集和消化：收集消毒后的虾肠道于细胞筛中，加入消化液进行研磨，吸取滤过细胞筛的消化液于EP管中，26～28℃、200rpm进行消化，将消化处理得到的消化液加入含胎牛血清的M199完全培养基终止消化；
所述消化液为体积比为1:3的胶原蛋白酶IV和胶原蛋白酶I，胶原蛋白酶IV的使用浓度为0.3mg/mL，胶原蛋白酶I的使用浓度为0.2mg/mL；
4)肠细胞的收集和培养：取消化液进行第一次离心处理，常温下300rpm离心5min，收集上清后弃沉淀；
再将上清液进行第二次离心处理，常温下500rpm离心5～8min，弃上清，用含胎牛血清的M199完全培养基进行细胞重悬；
对重悬后的细胞进行计数后铺于提前用鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板中，置于26～28℃、6％的CO2培养箱中培养，48h之后进行扩培或换液处理，得到虾肠道细胞；
所述鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板的制备为：配制24μL的鼠尾胶原+10mL0.06moL/L HAC形成0.012mg/mL胶原蛋白溶液，培养板的每一孔加600μL配好的0.012mg/mL胶原蛋白溶液，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净台上过夜晾干，也可以室温放置1h后，用PBS洗3～4次后直接使用；
所述M199完全培养基中的组分包括质量体积百分比为15％的胎牛血清、NaCl 5g/L，葡萄糖2g/L，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/L，余量为M199基础培养基，1×四抗液，渗透压为550mmoL/kg。
实施例3
一种虾肠道细胞提取和培养的方法
1)饥饿处理：选取对虾，将其置于含四抗液的煮沸的2‰的海盐中进行饥饿处理一天；
所述四抗液为青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的混合溶液，其使用体积比1:1:1:1；
所述青霉素的使用浓度为100U/mL；
所述链霉素的使用浓度为0.1mg/mL；
所述庆大霉素的使用浓度为50μg/mL；
所述支原体清除剂MRA(ZT10002)的使用浓度为0.39μg/mL；
2)消毒：采用酒精对对虾的表面进行消毒处理，采用5～8mL含5×四抗液的Dhanks液(同实施例1)对虾肠道进行处理3～5遍，可以有效抑制肠道内容物和肠道细菌的感染；
3)肠道收集和消化：收集消毒后的虾肠道于细胞筛中，加入消化液进行研磨，吸取滤过细胞筛的消化液于EP管中，26～28℃、200rpm进行消化，将消化处理得到的消化液加入含胎牛血清的M199完全培养基终止消化；
所述消化液为体积比为1:2的胶原蛋白酶IV和胶原蛋白酶I，胶原蛋白酶IV的使用浓度为0.2mg/mL，胶原蛋白酶I的使用浓度为0.3mg/mL；
4)肠细胞的收集和培养：取消化液进行第一次离心处理，常温下300rpm离心5min，收集上清后弃沉淀；
再将上清液进行第二次离心处理，常温下500rpm离心5～8min，弃上清，用含胎牛血清的M199完全培养基进行细胞重悬；
对重悬后的细胞进行计数后铺于提前用鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板中，置于26～28℃、6％的CO2培养箱中培养，48h之后进行扩培或换液处理，得到虾肠道细胞；
所述鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板的制备为：配制24μL的鼠尾胶原+10mL0.06moL/L HAC形成0.012mg/mL胶原蛋白溶液，培养板的每一孔加600μL配好的0.012mg/mL胶原蛋白溶液，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净台上过夜晾干，也可以室温放置1h后，用PBS洗3～4次后直接使用；
所述M199完全培养基中的组分包括质量体积百分比为15％的胎牛血清、NaCl 6g/L，葡萄糖1g/L，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/L，余量为M199基础培养基，1×四抗液，渗透压为470mmoL/kg。
对比例1
相比实施例1，当步骤1)对肠细胞的饥饿处理采用二抗或三抗，如图1所示，会出现肠道的内容物含有污染物种类特别多，使用常规的二抗或者三抗容易污染。
由于肠道里面有各种真菌和细菌、支原体，通过对比可见，使用四抗液可以有效抑制大部分的污染。
对比例2
相比实施例1，当消化液仅采用胰酶时，如图2所示，容易损伤虾细胞，消化完后恢复能力很差。
可见，使用胶原蛋白酶IV和胶原蛋白酶I，可以在10min内消化完成，明显缩短了消化时间。
虾细胞对胰酶很敏感，常用的消化细胞用的胰酶很容易损伤虾肠道细胞，消化完后恢复能力很差，通过使用来源于溶组织梭菌的胶原酶IV和中性的胶原酶I，胶原酶IV有利于消化切除的肠系膜组织，还有肠道结缔组织，有利于消化成单个细胞。
对比例3
相比实施例1，当培养基采用传统培养液，组分包括10％DMEM，10％的血清，1×的二抗，如图3所示，导致细胞破裂。
相比对比例3，本发明所采用的培养基调节了渗透压，达到适合虾肠道细胞生长的渗透压，防止细胞在低渗透压时破裂，常规培养基无法满足需求。
对比例4
当步骤4)中对肠细胞的收集和培养，采用传统的方法1000rpm离心5min，则会看到比较多的真菌和细菌污染物，当放大到400倍时会看到微生物在镜下明显蠕动，如图4所示。
如图5、图6所示，为实施例1对虾肠细胞的收集过程中的离心处理，可见，本发明利用差数离心的方法，可以有效去掉碎片和导致细胞污染的污染源。
Claims (8)
1.一种虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)饥饿处理：选取对虾，将其置于含四抗液的煮沸的2‰的海盐中进行饥饿处理一天；
2)消毒：采用酒精对对虾的表面进行消毒处理，采用含5×四抗液的Dhanks液对虾肠道进行处理，用于抑制肠道内容物和肠道细菌的感染；
3)肠道收集和消化：收集消毒后的虾肠道于细胞筛中，加入消化液进行研磨，吸取滤过细胞筛的消化液于EP管中进行消化，将消化处理得到的消化液加入含胎牛血清的M199完全培养基终止消化；
所述消化液包括胶原蛋白酶IV和胶原蛋白酶I，其使用体积比为1：(1～3)；
4)肠细胞的收集和培养：取消化液进行第一次离心处理，收集上清后弃沉淀；
再将上清液进行第二次离心处理，弃上清，用含胎牛血清的M199完全培养基进行细胞重悬；
对重悬后的细胞进行计数后铺于培养板中，置于培养箱中培养，之后进行扩培或换液处理，得到虾肠道细胞。
2.由权利要求1所述的虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，步骤1)所述四抗液为青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的混合溶液；
所述青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的使用体积比为1:1:1:1。
3.由权利要求2所述的虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，所述青霉素的使用浓度为100U/mL；
所述链霉素的使用浓度为0.1mg/mL；
所述庆大霉素的使用浓度为50μg/mL；
所述支原体清除剂的使用浓度为0.39μg/mL。
4.由权利要求1所述的虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，步骤2)所述含5×四抗液的Dhanks液中，Dhanks液的成分包括NaCl、KCl、KH2PO4、NAHCO3。
5.由权利要求1所述的虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，步骤3)所述胶原蛋白酶IV的使用浓度为0.1～0.3mg/mL；
所述胶原蛋白酶I的使用浓度为0.1～0.3mg/mL。
6.由权利要求1所述的虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，步骤3)所述M199完全培养基中的组分包括质量体积百分比为15％的胎牛血清、NaCl 5～6g/L，葡萄糖1～3g/L，碱性成纤维细胞生长因子20μg/L，余量为M199基础培养基，1×四抗液，渗透压为470～550mmol/kg。
7.由权利要求1所述的虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，步骤4)所述第一次离心处理为常温下300rpm，离心5min，所述第二次离心处理为常温下500rpm，离心5～8min。
8.由权利要求1所述的虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，步骤4)所述培养板为提前用鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板，其包被操作为：配制鼠尾胶原+0.06moL/L HAC形成胶原蛋白溶液，培养板的每一孔加配好的胶原蛋白溶液，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净台上过夜晾干，或室温放置1h后，用PBS洗3～4次后直接使用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211056897.0A CN115261300A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 一种虾肠道细胞提取和培养的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211056897.0A CN115261300A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 一种虾肠道细胞提取和培养的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115261300A true CN115261300A (zh) | 2022-11-01 |
Family
ID=83755191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211056897.0A Pending CN115261300A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 一种虾肠道细胞提取和培养的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115261300A (zh) |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1836034A (zh) * | 2003-06-13 | 2006-09-20 | 埃索拉根技术有限公司 | 生产神经元的方法 |
| CN101225372A (zh) * | 2007-01-19 | 2008-07-23 | 上海市东方医院 | 一种肌母细胞的制备方法 |
| CN105385650A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-03-09 | 华东师范大学 | 一种鱼类肠道上皮细胞的分离方法 |
| CN105754928A (zh) * | 2016-05-16 | 2016-07-13 | 中国海洋大学 | 一种对虾胚胎细胞的分离与培养方法 |
| CN106085950A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-11-09 | 山大生殖研发中心有限公司 | 分离卵巢中不同种类单细胞的方法 |
| CN106344493A (zh) * | 2016-10-12 | 2017-01-25 | 领航干细胞再生医学工程有限公司 | 含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法 |
| WO2017096607A1 (zh) * | 2015-12-11 | 2017-06-15 | 郭镭 | 一种从脐带外层羊膜组织中分离提取hUC-MSC的方法 |
| CN107236700A (zh) * | 2017-06-12 | 2017-10-10 | 新乡医学院 | 支气管原代上皮细胞的培养与鉴定方法 |
| CN110283777A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-27 | 中国海洋大学 | 一种对虾细胞连续培养方法 |
| CN110499287A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-11-26 | 博雅干细胞科技有限公司 | 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法 |
| CN111218422A (zh) * | 2018-11-27 | 2020-06-02 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种小鼠主动脉内皮细胞的分离及培养方法 |
-
2022
- 2022-08-31 CN CN202211056897.0A patent/CN115261300A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1836034A (zh) * | 2003-06-13 | 2006-09-20 | 埃索拉根技术有限公司 | 生产神经元的方法 |
| CN101225372A (zh) * | 2007-01-19 | 2008-07-23 | 上海市东方医院 | 一种肌母细胞的制备方法 |
| CN105385650A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-03-09 | 华东师范大学 | 一种鱼类肠道上皮细胞的分离方法 |
| WO2017096607A1 (zh) * | 2015-12-11 | 2017-06-15 | 郭镭 | 一种从脐带外层羊膜组织中分离提取hUC-MSC的方法 |
| CN105754928A (zh) * | 2016-05-16 | 2016-07-13 | 中国海洋大学 | 一种对虾胚胎细胞的分离与培养方法 |
| CN106085950A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-11-09 | 山大生殖研发中心有限公司 | 分离卵巢中不同种类单细胞的方法 |
| CN106344493A (zh) * | 2016-10-12 | 2017-01-25 | 领航干细胞再生医学工程有限公司 | 含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法 |
| CN107236700A (zh) * | 2017-06-12 | 2017-10-10 | 新乡医学院 | 支气管原代上皮细胞的培养与鉴定方法 |
| CN111218422A (zh) * | 2018-11-27 | 2020-06-02 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种小鼠主动脉内皮细胞的分离及培养方法 |
| CN110283777A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-27 | 中国海洋大学 | 一种对虾细胞连续培养方法 |
| CN110499287A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-11-26 | 博雅干细胞科技有限公司 | 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101824098B (zh) | 快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方法 | |
| CN110317847B (zh) | 一种动物组织来源的提取物及其制备方法和用途 | |
| CN105385650B (zh) | 一种鱼类肠道上皮细胞的分离方法 | |
| CN112931880A (zh) | 促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽及其制备方法 | |
| CN113249277B (zh) | 一株贝雷斯芽孢杆菌在水产品肝素提取中的应用 | |
| CN103232354B (zh) | 一种从缬氨酸发酵液中分离杂酸的方法 | |
| CN113004384B (zh) | 一种海参肠促成骨肽的制备方法及其应用 | |
| CN115261300A (zh) | 一种虾肠道细胞提取和培养的方法 | |
| CN117165490B (zh) | 一株海洋来源的交替单胞菌及其应用 | |
| CN113584108A (zh) | 一种脾氨肽的制备方法 | |
| CN103224973B (zh) | 一种发酵虾头制备活性物质、甲壳素和有机酸钙的方法 | |
| CN109182256B (zh) | 一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法 | |
| CN117286117A (zh) | 一株广谱沙门氏菌噬菌体SalmpYZU33及其应用 | |
| CN101596013B (zh) | 一种发酵－酶解耦联脱除柑橘橘片囊衣的方法 | |
| CN116606777A (zh) | 一种植物乳杆菌菌株及其饲料添加剂与饲料 | |
| CN101451121A (zh) | 褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法 | |
| CN109943507B (zh) | 一种兽用a型产气荚膜梭菌类毒素的制备方法及其应用 | |
| CN113583950A (zh) | 一种制备干细胞活性因子的方法及其应用 | |
| CN114672465B (zh) | 猪德尔塔冠状病毒的分离方法 | |
| CN111440835B (zh) | 一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法 | |
| CN109535273B (zh) | 一种嗜水气单胞菌生物被膜多糖的提取方法 | |
| CN117448178B (zh) | 一种紫红曲霉cewl18及其在制备护肝产品中的应用 | |
| NL2030682B1 (en) | Preparation method for sea cucumber intestine ostosis promoting peptide and application thereof | |
| CN113583957B (zh) | 一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法 | |
| LU500718B1 (en) | Method for preparing highly antioxidant black carp flesh anticancer peptide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |