CN113583957B - 一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，包括：获得猪肺脏样品；获得细胞洗涤液引流装置，包括：灌胃针头、输液器和用于装细胞洗涤液的容器；所述输液器包括输液管、设置在所述输液管上的开关，分别设置在所述输液管两端的进液接头和出液接头；所述进液接头与所述容器相连通，所述出液接头与所述灌胃针头相连接；将所述灌胃针头伸入所述猪肺脏样品中的肺主气管内，以注入细胞洗涤液，待所述猪肺脏样品中整个肺脏充盈时，取出所述灌胃针头并夹紧肺主气管，获得充盈肺脏；后装进自封袋并封口置于振动器上振动以洗脱肺泡巨噬细胞获得灌洗液；离心和固液分离获得PAM沉淀，细胞培养获得猪肺泡巨噬细胞。该方法可以减少污染率，提高细胞制备量。

Description

一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞制备技术领域，特别涉及一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法。
背景技术
巨噬细胞(macrophage)属免疫细胞，有多种功能，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)，主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞属不繁殖细胞群，多用做原代培养，难以长期生存。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage)由骨髓中的造血干细胞分化成单核细胞，穿透血管进入血液循环，到达肺脏后分化而成。其吞噬、免疫和分泌作用都十分活跃，是机体抵御病原体侵入的第一道防线，也是机体内吞食并处理大型异物、细胞排泄物等的主要细胞，还参与机体内炎症作用，是一种守护范围很广的白血球细胞。猪巨噬细胞(porcine alveolar macrophage)的制备研究因非洲猪瘟(Africanswine fever，ASF)病大流行而有所增多，非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，强毒株可在感染的5-14天使感染猪致死，死亡率接近100％，无有效疫苗，无特效药物。各阶段家猪、野猪和软蜱是非洲猪瘟病毒自然宿主，可在家猪和野猪之间直接传播，也可通过蜱虫叮咬传播，还可以通过污染了病毒的泔水、饲料及腌制火腿等猪肉产品跨国家和地区传播。2018年8月份，非洲猪瘟疫情首次在我国出现，然后迅速传遍全国，我国生猪养殖占世界50％以上。根据国外非洲猪瘟净化根除历史看，一旦发生非洲猪瘟疫情，要彻底根除，均需要花费漫长的时间，并付出重大的代价。非洲猪瘟病毒自发现100多年来，各种疫苗研制策略均未成功。目前，通过基因缺失致弱成为该疫苗研究重要的方向，但非洲猪瘟病毒只能通过极少数的原代细胞培养后配制成的疫苗才有效，其中，PAM就是其中一种重要的原代细胞。
肺泡巨噬细胞的常规制备方法采用灌洗法分离，适用于制备少量肺泡巨噬细胞，多用于实验室研究，但是常规制备方法主要存在以下几个问题，制备过程中的存在污染，血细胞混杂在目的细胞中，制备量不稳定，制备量少，操作时间过长，污染难控等问题，一直无法制备大量的目的细胞用于放大生产研究。
因此，如何有必要开发一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，以解决现有技术中存在污染和细胞制备量少的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，可以减少污染率，提高细胞制备量。
为了实现上述目的，本发明提供了一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，所述方法包括：
获得含有肺和气管的猪肺脏样品；
获得细胞洗涤液引流装置，所述细胞洗涤液引流装置包括：灌胃针头、输液器和用于装细胞洗涤液的容器；所述输液器包括输液管、设置在所述输液管上的开关，分别设置在所述输液管两端的进液接头和出液接头；所述进液接头与所述用于装细胞洗涤液的容器相连通，所述出液接头与所述灌胃针头相连接；
将所述细胞洗涤液引流装置中的所述灌胃针头伸入所述猪肺脏样品中的肺主气管内，打开所述开关以注入细胞洗涤液，待所述猪肺脏样品中整个肺脏充盈时，关上所述开关，取出所述灌胃针头并夹紧肺主气管，获得充盈肺脏；
将所述充盈肺脏装进自封袋并封口，置于振动器上振动以洗脱肺泡巨噬细胞，获得灌洗液；
将所述灌洗液离心和固液分离，获得PAM沉淀；
将所述PAM沉淀进行细胞培养，获得猪肺泡巨噬细胞。
进一步地，所述输液器上设有流量调节件以控制细胞洗涤液注入猪肺脏组织的速度与注入量。
进一步地，所述注入细胞洗涤液中，开始流速为10～30滴/秒，直至肺脏充盈度为80～90％时，调节所述流速为1～2滴/秒，至肺脏完全充盈停止注入所述细胞洗涤液。
进一步地，所述细胞洗涤液为含100IU/ml肝素、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的无菌磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述细胞洗涤液的注入量为1000～1500ml。
进一步地，所述灌胃针头为16～20号弯头灌胃针头。
进一步地，所述将所述充盈肺脏装进自封袋并封口，置于振动器上振动以洗脱肺泡巨噬细胞，获得灌洗液，包括：
将所述充盈肺脏装进自封袋并封口，置于振动器上振动2.5～3.5分钟；
后松开所述夹紧肺主气管的止血钳，将装自封袋内的肺脏翻面，再次振动2.5～3.5分钟；
松开所述止血钳，通过所述主气管倒出获得灌洗液。
进一步地，所述振动中，振动器频率均为2500～3000rpm。
进一步地，所述离心的转速为1000～1500rpm，所述离心的时间为5～10分钟。
进一步地，所述细胞培养中，培养基的配方为89％DMEM+10％FBS+1％双抗。所述百分比为体积分数。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供的一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，简单，高效，易操作，省时省力，能有较避免污染，提高细胞制备量；具体地：
(1)采用细胞洗涤液引流装置通过采用吊瓶输液方式，实现细胞洗涤液输入的稳定性和可控性，有效规避因用注射器反复注入洗涤液时可能引起的污染，且灌洗操作过程省时，省力，高效。
(2)运用灌胃针头控制细胞洗涤液的流向；避免注射器针头刺破肺组织引入血细胞污染风险和细胞洗涤液外流。使用灌胃针头，实现细胞洗涤液定向导流到肺脏组织各肺叶的支气管中，调控肺脏组织的充盈度，提高细胞制备量。使用灌胃针头，可分步充盈肺脏组织，调整肺脏组织各肺叶目的细胞洗涤顺序，减少因肺脏组织外伤导致洗涤液的外流或污染。
(3)振动器的使用可消除因人力操作不当，导致的肺脏组织内部损伤而引入血细胞污染，减少对后续操作带来影响。
(4)用吊瓶工艺将细胞洗涤液引流入肺脏组织，运用灌胃针头控制细胞洗涤液的流向和振动器振动作用实现肺泡巨噬细胞洗脱操作的标准化操作程序，减少人为操作不稳定带来的影响，可大量量化生产，满足大量肺泡巨噬细胞制备需求，达到省时省力，高效制备大量PAM的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例提供的一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法的流程图；
图2为本发明实施例中细胞洗涤液引流装置的图片和结构示意图；其中图2A为结构示意图；图2B为引流时的图片；图中标记为：1-容器；11-翻帽塞；2-输液器；21-输液管；22-开关；23-进液接头；24-出液接头；25-流量调节件；3-灌胃针头；
图3为灌胃针头与一次性输液器出液接头；
图4为灌胃针头与出液接头连接的示意图；
图5为灌洗前的肺脏图；
图6为灌胃针头插入指定肺叶图；
图7为灌洗液充盈第一肺叶的图片；
图8为灌洗液充盈第二肺叶的图片；
图9为灌洗液充盈整个肺脏的图片；
图10为充盈后的肺叶振动洗脱PAM的图片；
图11为PAM培养1d在40x显微镜下的图片；
图12为PAM培养3d在40x显微镜下的图片。
图13为PAM培养1d在40x显微镜下的图片；
图14为PAM培养3d在40x显微镜下的图片.
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为根据本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路根据下：
根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，如图5所示，所述方法包括：
步骤S1、获得含有肺和气管的猪肺脏样品；
所述步骤S1具体包括：
实验猪有麻醉状态下，前腔放血致死，倒置解剖台，沿胸腔锁骨处打开胸腔；切断锁骨，并沿主气管剖开喉头两侧表皮，分离出主气管；在近肺端距离喉头约2cm处用线扎紧主气管(如图5所示)；分离心脏，沿喉头边缘剪断主气管，将肺和气管作为整体取出猪胸腔；用PBS清洗外表面，浸泡于PBS，获得含有肺和气管的猪肺脏样品，冷藏带回实验室备用。
步骤S2、获得细胞洗涤液引流装置，如图2所示，所述细胞洗涤液引流装置包括：灌胃针头3、输液器2和用于装细胞洗涤液的容器1；所述输液器2包括输液管21、设置在所述输液管上的开关22，分别设置在所述输液管21两端的进液接头23和出液接头24；所述进液接头23与所述用于装细胞洗涤液的容器1相连通，所述出液接头24与所述灌胃针头3相连接；
作为一种具体的实施方式，所述获得细胞洗涤液引流装置，具体包括：
将用于装细胞洗涤液的容器倒置，取输液器2一端插破所述容器1(具体为输液瓶)的翻帽塞11，另一端连接灌胃针头3，排空所述输液器2里空气，关紧输液器2上设有的开关22，获得细胞洗涤液引流装置；
用动物实验常用的灌胃针头取代一次性输液器的静脉输液针头部分，灌胃针头的针栓连接于输液器的输液软管的出液接头，利用灌胃针头，可将细胞洗涤液定向引流到肺脏组织各肺叶的支气管中。
所述灌胃针头优选16～20号弯头灌胃针头，经实验发现16-20号弯头灌胃针头更有利于引流；灌胃针头的针栓连接于输液器的输液软管的出液接头(图3-图4)。利用灌胃针头的引流作用，可将细胞洗涤液定向引流到肺脏组织各指定肺叶的主支气管中(图6)。
步骤S3、将所述细胞洗涤液引流装置中的所述灌胃针头伸入所述猪肺脏样品中的肺主气管内，打开所述开关以注入细胞洗涤液，待所述猪肺脏样品中整个肺脏充盈时，关上所述开关，取出所述灌胃针头并夹紧肺主气管，获得充盈肺脏；
所述步骤S3中，
所述输液器2上设有流量调节件25以控制细胞洗涤液注入猪肺脏组织的速度与注入量。在其他实施方式中，开关即为流量调节件，所述流量调节件也可以充当开关的作用，可关闭流量调节件25，暂停注入洗涤液；灌胃针头和流量调节件25共同配合可用于调控肺脏组织的充盈度(图5和图9)，或指定肺脏组织各肺叶中目的细胞的洗涤顺序(图7和图8)，避开受损伤的肺脏组织，达到制备PAM时减少污染的目的。
所述注入细胞洗涤液中，开始流速为10～30滴/秒，直至肺脏充盈度为80～90％时，调节所述流速为1～2滴/秒，至肺脏完全充盈停止注入所述细胞洗涤液。这样设置有利于快速高效充盈肺脏，避免洗涤液外流，降低污染几率，保障目的细胞制备量和活力。刚开始快速充盈有利于缩短制备时间，提高制备效率，制备的细胞活力较优，若流速过小不利于细胞洗涤液的快速注入肺脏，洗涤过程耗时长，制备的细胞活力下降；肺脏充盈度为80～90％时调节所述流速为1～2滴/秒有利于控制洗涤液的输入量，获得较好的目的细胞制备量，此时若流速过大，不利于及时控制细胞洗涤液的输入量，引起细胞洗涤液的外流，减少目的细胞的制备量，增加污染的风险。
所述细胞洗涤液的注入量为1000～1500ml。正常肺脏约可注入1200ml细胞洗涤液。
所述细胞洗涤液为含100IU/ml肝素、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的无菌磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH7.4，PBS)。所述无菌磷酸盐缓冲液可以采用0.9％的生理盐水替代，但无菌磷酸盐缓冲液的pH改变更小，渗透压更稳定，对于目的细胞的保护优于0.9％的生理盐水。
步骤S4、将所述充盈肺脏装进自封袋并封口，置于振动器上振动以洗脱肺泡巨噬细胞，获得灌洗液；
所述步骤S4，具体包括：
将所述充盈肺脏装进自封袋并封口，置于振动器上振动2.5～3.5分钟；
后松开所述夹紧肺主气管的止血钳，将装自封袋内的肺脏翻面，再次振动2.5～3.5分钟；
松开所述止血钳，通过所述主气管倒出获得灌洗液。
上述技术方案中，振动器的使用可消除因人力操作不当，导致的肺脏组织内部损伤而引入血细胞污染，减少对后续操作带来影响。
所述振动中，振动器频率均为2500～3000rpm。振动频率若小于2500rpm不利于充分洗脱；若大于3000rpm容易导致的肺脏组织内部损伤而引入血细胞污染；
经实验发现，本发明实施例用振动器2500～3000rpm频率振动作用5～7分钟，两面各振动2.5～3.5分钟(图10)替代常规制备过程中手动揉搓或按摩操作，可以很好的进行洗脱同时不会导致的肺脏组织内部损伤而引入血细胞污染；若不翻面只采用一次振动，不利于整个肺脏的全面洗涤，洗脱的目的细胞偏少；
所述步骤S4中，可以指定肺脏组织各肺叶中目的细胞的洗涤顺序，避开受损伤的肺脏组织，达到制备PAM时减少污染的目的。
步骤S5、将所述灌洗液离心和固液分离，获得PAM沉淀；
所述离心的转速为1000～1500rpm，所述离心的时间为5～10分钟。所述步骤S5的离心和固液分离步骤可以重复1～3次，
步骤S6、将所述PAM沉淀进行细胞培养，获得猪肺泡巨噬细胞。
所述细胞培养中，培养基的配方为89％DMEM+10％FBS+1％双抗。
所述培养条件为：37℃，5％CO2的培养箱中培养；
综上可知，本发明通过采用吊瓶输液方式控制细胞洗涤液的使用(图2-图4)，运用灌胃针头控制细胞洗涤液的流向(图6)和振动器振动作用(图10)实现肺泡巨噬细胞洗脱操作的标准化操作程序，达到简单，高效，易操作，省时省力，避免污染，可广泛应用于大量PAM的提取的目的。
下面将结合实施例、对比实验数据对本申请的一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法进行详细说明。
实施例1
本发明实施例提供一种快速及有效的猪肺泡巨噬细胞提取方法，包括以下步骤：
步骤S1、从猪受试者分离获得含有肺和气管的猪肺脏样品；
具体地，实验猪有麻醉状态下，前腔放血致死，倒置解剖台，沿胸腔锁骨处打开胸腔；切断锁骨，并沿主气管剖开喉头两侧表皮，分离出主气管；在近肺端距离喉头约2cm处用线扎紧主气管(图5)；分离心脏，沿喉头边缘剪断主气管，将肺和气管作为整体取出猪胸腔；用PBS清洗外表面，浸泡于PBS，冷藏带回实验室制备PAM。
步骤S2、获得细胞洗涤液引流装置，具体地：
将装PBS的血清瓶倒置于输液架，取一次性无菌输液管插破翻帽塞，另一头接灌胃针头，排空输液管里空气，关紧开关，备用(高仿输液，图2)。
步骤S3、将所述细胞洗涤液引流装置中的所述灌胃针头伸入所述猪肺脏样品中的肺主气管内，打开所述开关以注入细胞洗涤液，待所述猪肺脏样品中整个肺脏充盈时，关上所述开关，取出所述灌胃针头并夹紧肺主气管，获得充盈肺脏；具体地，
(1)取出猪肺脏置于超净台中，用PBS清洗外表面。
(2)将灌胃针头伸入主气管内，打开输液管开关，注入PBS，待整个肺脏充盈时，关上输液管开关，取出灌胃针头，夹紧肺主气管；所述注入细胞洗涤液中，开始流速为30滴/秒，直至肺脏充盈度为85％时，调节所述流速为1滴/秒，至肺脏完全充盈停止注入所述细胞洗涤液。
步骤S4、将所述充盈肺脏装进自封袋并封口，置于振动器上振动以洗脱肺泡巨噬细胞，获得灌洗液；具体地，
(1)将充盈肺脏装进自封袋，自封袋封口；设置振动器频率为3000rpm，时间3分钟(图10)。
(2)将自封袋放置于振动器上，启动振动器。
(3)3分钟后，松开止血钳，将装自封袋内的肺脏翻面，再次振动3分钟。
(4)取下共计振动六分钟的肺脏，松开止血钳，将主气管伸入蓝盖瓶里，倒出灌洗液。
(5)按(3)～(4)步骤，重复灌洗猪肺脏步骤3次左右，收集全部的灌洗液。
步骤S5、将所述灌洗液离心和固液分离，获得PAM沉淀；
具体地，将灌洗液1000rpm离心5分钟，弃上清，并用PBS重悬PAM沉淀，并按相同方式离心，洗涤三遍，即得PAM沉淀。
步骤S6、将所述PAM沉淀进行细胞培养，获得猪肺泡巨噬细胞。
具体地：
(1)细胞计数：用PBS重悬细胞沉淀，计数。
(2)细胞培养：根据细胞计数结果，调整细胞密度，置37℃，5％CO2培养箱中静置培养，根据细胞的生长情况换液，每日观察细胞形态、生长状况。
实施例2
本发明实施例提供一种快速及有效的猪肺泡巨噬细胞提取方法，所述注入细胞洗涤液中，开始流速为20滴/秒，直至肺脏充盈度为80％时，调节所述流速为1滴/秒，至肺脏完全充盈停止注入所述细胞洗涤液。其他步骤均通实施例1。
实施例3
本发明实施例提供一种快速及有效的猪肺泡巨噬细胞提取方法，所述注入细胞洗涤液中，开始流速为10滴/秒，直至肺脏充盈度为90％时，调节所述流速为2滴/秒，至肺脏完全充盈停止注入所述细胞洗涤液。其他步骤均通实施例1。
实施例4
本发明实施例提供一种快速及有效的猪肺泡巨噬细胞提取方法，所述两次振动中，第一次振动中，振动器频率为2500rpm，振动2.5分钟；第二次振动中，振动器频率为2500rpm，振动2.5分钟；其他步骤均通实施例1。
实施例5
本发明实施例提供一种快速及有效的猪肺泡巨噬细胞提取方法，所述两次振动中，第一次振动中，振动器频率为3000rpm，振动3.5分钟；第二次振动中，振动器频率为3000rpm，振动3.5分钟；其他步骤均通实施例1。
对比例1
对比例1采用现有技术常规的灌洗法分离：大体步骤是用夹子夹住气管，向气管中注射无菌的生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡，用手按摩充盈后的肺脏组织，提起气管，松开夹子，将肺中的细胞洗涤液用注射器吸出后，注入离心管中。通过离心，收集细胞沉淀即可得到肺泡巨噬细胞。
对比例2
对比例2中，所述注入细胞洗涤液中，始终以最大的流速10～30滴/秒充盈。其他步骤均通实施例1。
对比例3
对比例3中，所述注入细胞洗涤液中，始终以1～2滴/秒的流速充盈。其他步骤均通实施例1。
对比例4
对比例4中，振动器频率为2000rpm；其他步骤均同实施例1。
对比例5
对比例5中，振动器频率为5000rpm；其他步骤均同实施例1。
实验例1
分别对实施例1-实施例5和对比例1-对比例5中步骤S6的细胞计数中统计PAM总量和存活率，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003209816580000091
Figure BDA0003209816580000101
由表1数据可知：
对比例1中，采用现有技术常用方法，PAM总量只有1.34×109cells，细胞存活率只有84％；整个制备过程耗时长，超过6小时，制备的PAM活率低。用注射器灌洗时费力，操作繁琐，长时间操作时极易刺破肺脏，引入血细胞污染，影响PAM纯度；还会引起细胞洗涤液的外流，减少PAM的制备量，增加污染几率。
对比例2中，始终以最大的流速充盈，存在控制流量调节件不及时，易引起细胞洗涤液的外流，减少PAM的制备量，增加污染几率等缺点；
对比例3中，始终以1～2滴/秒的流速充盈，存在整个制备过程耗时长，超过6小时，制备的PAM活率低等缺点；
对比例4中，振动器频率为2000rpm，小于本发明实施例2500～3000rpm的范围，存在细胞洗脱不完全，制备的PAM量少等缺点；
对比例5中，振动器频率为5000rpm，大于本发明实施例2500～3000rpm的范围，存在振动频率高对细胞影响较大，细胞活率低，且会损伤肺组织，引入血细胞污染等缺点；
本发明实施例1-实施5中，PAM总量共计3.71～3.97×109cells，细胞活率95～98％，制备耗时2.4～3.2h；细胞数量活率、总量和制备耗时等综合效果均优于对比例。
应用例1
采用本发明实施例1的方法统计了一批重约15kg健康仔猪制备猪肺泡巨噬细胞的相应数据，并列举出一头12.5kg的健康仔猪制备猪肺泡巨噬细胞数据。
1、经多次研究表明，经过本发明的该标准操作程序制备一头重约15kg仔猪的PAM总量约可达3.0～6.0×109个，制备的PAM活率基本在95％以上。实验室细胞制备过程可控制在2.5h左右，制备后的细胞培养时无污染。刚制备的PAM呈圆形，贴壁生长，37℃，5％CO2培养箱静置培养约2.0h，大部分细胞已贴壁，极少量会出现生长，呈长梭形。培养约24h时，PAM均已贴壁，小部分生长，呈长梭形，大部分正圆形(图11)。培养到约72h时，细胞状态佳，大部分细胞呈长梭形，少量正圆形，细胞铺满整个瓶底(图12)。
2、挑选一体重为12.5kg的健康仔猪，经麻醉，放血致死后取肺脏，称重为160.3g，冷藏运输回实验室，进行PAM制备。从肺表面清洗消毒，灌洗液输入，细胞洗涤液收集，经离心，计数到细胞培养，此次实验过程共计约耗时2.2h，制备PAM总量共计3.6×109cells，细胞活率98％，接种后24h和72h的培养效果见图13-图14。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
获得含有肺和气管的猪肺脏样品；
获得细胞洗涤液引流装置，所述细胞洗涤液引流装置包括：灌胃针头、输液器和用于装细胞洗涤液的容器；所述输液器包括输液管、设置在所述输液管上的开关、分别设置在所述输液管两端的进液接头和出液接头；所述进液接头与所述用于装细胞洗涤液的容器相连通，所述出液接头与所述灌胃针头相连接；所述输液器上设有流量调节件以控制细胞洗涤液注入猪肺脏组织的速度与注入量；所述灌胃针头为16～20号弯头灌胃针头；
将所述细胞洗涤液引流装置中的所述灌胃针头伸入所述猪肺脏样品中的肺主气管内，打开所述开关以注入所述细胞洗涤液，待所述猪肺脏样品中整个肺脏充盈时，关上所述开关，取出所述灌胃针头并采用止血钳夹紧肺主气管，获得充盈肺脏；所述注入细胞洗涤液过程中，开始流速为10～30滴/秒，直至肺脏充盈度为80～90%时，调节流速为1～2滴/秒，至肺脏完全充盈停止注入所述细胞洗涤液；
将所述充盈肺脏装进自封袋并封口，置于振动器上振动2.5～3.5分钟；将所述自封袋翻面，再次振动2.5～3.5分钟；松开所述止血钳，通过所述肺主气管倒出获得灌洗液；所述振动器频率均为2500～3000rpm；
将所述灌洗液离心和固液分离，获得猪肺泡巨噬细胞沉淀；
将所述猪肺泡巨噬细胞沉淀进行细胞培养，获得猪肺泡巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞洗涤液为含100IU/ml肝素、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的无菌磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞洗涤液的注入量为1000～1500ml。
4.根据权利要求1所述的一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述离心的
转速为1000～1500 rpm，所述离心的时间为5～10分钟。
5.根据权利要求1所述的一种猪肺泡巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞培养中，培养基的配方为89%DMEM+10%FBS+1%双抗。
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