CN112492875A - 用于使非洲猪瘟病毒在胎猪肺泡巨噬细胞中生长的方法 - Google Patents

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Abstract

用于产生非洲猪瘟(ASF)病毒子代的方法，其包括：提供能够使ASF病毒复制的分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞，其中所述细胞被培养至少5代；将细胞暴露于ASF病毒；使ASF病毒在细胞中复制；从而产生ASF病毒子代。

Description

用于使非洲猪瘟病毒在胎猪肺泡巨噬细胞中生长的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月11日提交的美国临时专利申请系列号62/873,075和2019年12月23日提交的美国临时专利申请系列号62/952,889的优先权，它们各自以全文引用的方式并入本文。
关于联邦资助研究或开发的声明
不适用。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)是对家猪和野猪具有高度传染性的出血性病毒疾病，可导致严重的经济和生产损失。ASF也是一种跨界动物疾病。跨界动物疾病是具有高度传染性的流行病，可以不分国界地迅速传播。此类疾病在动物中引起很高的死亡率和发病率，从而造成严重的社会经济后果，有时甚至危害公共卫生，同时对畜牧业者的生计构成持续威胁。如果发生ASF暴发，有可能在猪中产生很高的死亡率和发病率，从而会大幅度降低猪肉的数量和质量。对控制ASF疾病的主要限制是缺乏可用的有效细胞和方法来对ASF病毒和疫苗做实验，并且缺乏能够针对ASF疾病的诊断技术。
发明内容
根据一个实施方案，用于产生非洲猪瘟(ASF)病毒子代的方法可以包括：提供能够使ASF病毒复制的分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞，其中所述细胞可以被培养至少5代；将细胞暴露于ASF病毒；使ASF病毒在细胞中复制；从而产生ASF病毒子代。
在一些实施方案中，细胞可以为ZMAC细胞或其衍生物。
在一些实施方案中，细胞可以选自ZMAC-1、ZMAC-4、具有美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括使细胞与生长因子组合物接触。
在一些实施方案中，生长因子组合物可以包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
在一些实施方案中，细胞可以获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
在一些实施方案中，细胞可以被培养至少10代。
在一些实施方案中，细胞可以被培养至少20代。
根据另一个实施方案，用于制备ASF疫苗的方法可以包括：提供ASF病毒的经修饰活病毒(MLV)株；使MLV株在分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞中生长，所述胎猪肺泡巨噬细胞能够使ASF MLV株复制。
在一些实施方案中，细胞可以为原代细胞、细胞群、细胞系、或者其变体或衍生物。
在一些实施方案中，细胞可以为ZMAC细胞或其衍生物。
在一些实施方案中，细胞可以选自ZMAC-1、ZMAC-4、具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括使细胞与生长因子组合物接触。
在一些实施方案中，生长因子组合物可以包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
在一些实施方案中，细胞可以获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
在一些实施方案中，细胞可以为细胞系。
根据另一个实施方案，用于使ASF病毒生长的方法可以包括：从猪胎肺分离胎猪肺泡巨噬细胞，包括提供猪胎受试者，从所述受试者获得包含细胞的支气管肺泡灌洗样品，以及从所述样品中分离巨噬细胞；培养细胞；使细胞与ASF病毒接触，以使病毒复制；从而使ASF病毒生长。
在一些实施方案中，培养可以包括使细胞传代至少5代、或进行至少10天的连续培养来使细胞生长、或它们的组合。
在一些实施方案中，培养可以包括使细胞与生长因子组合物接触。
在一些实施方案中，生长因子组合物可以包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
在一些实施方案中，细胞可以获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
在一些实施方案中，培养可以包括使细胞传代至少20代。
根据另一个实施方案，用于检测猪受试者中ASF病毒的存在的方法可以包括：提供能够使ASF病毒复制的分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞，其中所述细胞可以被培养至少5代；使细胞与样品接触；在合适的条件下孵育细胞；和检测细胞中ASF病毒的存在。
在一些实施方案中，细胞可以为ZMAC细胞或其衍生物。
在一些实施方案中，细胞可以选自ZMAC-1、ZMAC-4、具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括使细胞与生长因子组合物接触。
在一些实施方案中，生长因子组合物可以包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
在一些实施方案中，细胞可以获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
在一些实施方案中，样品可以选自血液、血清、血浆、淋巴、唾液、鼻分泌物、粪便、尿液、精液、痰、脑脊液、泪液、粘液、汗液、乳汁和组织细胞。
在一些实施方案中，组织细胞可以选自胸腺、淋巴结、脾脏、骨髓和扁桃体。
在一些实施方案中，检测可以包括使用血细胞吸附测定法或免疫荧光法。
根据另一个实施方案，疫苗可以包含在载体中的本公开的ASF病毒子代。
在一些实施方案中，疫苗可以进一步包含佐剂。
根据另一个实施方案，在猪中诱发抗ASFV免疫应答的方法可以包括向猪施用有效量的本公开的疫苗。
在一些实施方案中，施用途径可以选自肠胃外、口服、鼻内和粘膜施用。
该发明内容并非旨在标识所要求保护的主题名称的关键或必要特征，也非旨在用于协助限制所要求保护的主题名称的范围。本公开进一步的实施方案、形式、特征和方面将通过与此提供的描述和附图而变得显而易见。
附图说明
通过参考结合附图的描述，将更好地理解本公开的一些实施方案的教导，其中：
图1示出根据一个实施方案在生长因子存在下的ZMAC-1细胞的生长；
图2示出根据一个实施方案的ZMAC细胞产率；
图3示出根据一个实施方案的ZMAC-4细胞的各种特征；
图4示出根据一个实施方案的ZMAC-4细胞被ASFV感染；
图5示出根据一个实施方案在ZMAC和猪骨髓(PBM)培养物中在72小时感染期间获得的ASFV-Georgia 2007/1滴度；
图6示出根据一个实施方案的在ZMAC细胞中感染五天的子代病毒滴度；
图7示出根据一个实施方案在Pirbright研究所用减毒株OURT88/3免疫接种的猪在被OURT88/1毒性分离株攻击后的不同天数的临床评分；
图8示出根据一个实施方案，猪在用ZMAC-4细胞中传代的OURT88/3免疫接种之后的体温；
图9示出根据一个实施方案在用OURT88/3株免疫接种之后或在未用OURT88/3免疫接种的情况下在Pirbright研究所经毒性株OURT88/1攻击的猪器官的解剖；
图10示出根据一个实施方案，在用ZMAC-4细胞中传代的OURT88/3免疫接种猪之后的每毫升血液中的病毒基因组水平；以及
图11示出根据一个实施方案，通过定量PCR估算的在感染血液中ASFV基因组拷贝的滴度。
具体实施方式
虽然本公开的构思易于进行各种修改和替代形式，但是其具体的实施方案已在附图中以举例方式示出并将在本文进行详细描述。然而，应理解并非旨在将本公开的构思限制于所公开的特定形式，相反，旨在覆盖与本公开和所附权利要求书相一致的所有修改、等效形式和替代。
说明书中提及“一些实施方案”、“一个实施方案”、“实施方案”、“示例性实施方案”等，表示所描述的实施方案可以包括特定的特征、结构或特性，但是每个实施方案可以包括所述特定的特征、结构或特性，或者可以不必要包括所述特定的特征、结构或特性。而且，这样的用语不一定是指相同的实施方案。此外，当结合一个实施方案来描述特定的特征、结构或特性时，可认为本领域技术人员知晓可结合其它实施方案来实施这样的特征、结构或特性，无论是否明确描述所述其它实施方案。
本公开提供用于产生非洲猪瘟(ASF)病毒子代的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括：提供能够使ASF病毒复制的分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞，其中所述细胞可以被培养至少5代；将细胞暴露于ASF病毒；和使ASF病毒在细胞中复制；从而产生ASF病毒子代。非洲猪瘟在本文中也可以称为ASF。非洲猪瘟病毒在本文中也可以称为ASFV。在一些实施方案中，将细胞暴露于ASFV可以指用ASFV感染细胞。
如本文所用，术语“猪”是指作为生物家族猪科(Suidae)成员的任何野生或家养动物，非限制性地包括鹿猪(Babyrousa babyrussa)或金猪(Golden Babirusa)、西里伯斯鹿豚(Babyrousa celebensis)或苏拉威西岛野猪(Sulawesi Babirusa)、托吉安鹿豚(Babyrousa togeanensis或Togian Babirusa、大林猪(Hylochoerus meinertzhageni)或大森林猪(Giant Forest Hog)、荒漠疣猪(Phacochoerus aethiopicus)或者岬疣猪(Cape)、索马里疣猪(Somali Warthog)或沙漠疣猪(Desert Warthog)、普通疣猪(Phacochoerus africanus)或常见疣猪(Common Warthog)、侏儒猪(Porcula salvania)或倭猪(Pygmy Hog)、假面野猪(Potamochoerus larvatus)或南非野猪(Bushpig)、丛林猪(Potamochoerus porcus)或红河猪(Red River Hog)、Sus ahoenobarbus或巴拉望须猪(Palawan Bearded Pig)、婆罗洲须猪(Sus barbatus)或须猪(Bearded Pig)、大嘴野猪(Sus bucculentus)或越南疣猪(Vietnamese Warty Pig)、卷毛野猪(Sus cebifrons)或米沙鄢疣猪(Visayan Warty Pig)、印尼野猪(Sus celebensis)或苏拉威西岛疣猪(CelebesWarty Pig)、霍氏野猪(Sus heureni)或弗洛雷斯疣猪(Flores Warty Pig)、奥利维猪(Susoliveri)或民都洛岛疣猪(Mindoro Warty Pig)、菲律宾猪(Sus philippensis)或菲律宾疣猪(Philippine Warty Pig)、欧亚野猪(Sus scrofa)或者野猪(Wild Boar)或家猪(Domestic Pig)、爪哇野猪(Sus verrucosus)或爪哇疣猪(Javan Warty Pig)、以及任何其它公猪(boar)、母猪(sow)、仔猪(piglet)、小猪(farrow)、中猪(shoat)、小母猪(gilt)、阉公猪(barrow)、肥猪(hog)、生猪(swine)，或者任何性别或任何年龄的野猪(sus)。
如本文所用，术语“细胞”可以指代本领域中所理解的生物学实体，并且其旨在涵盖可被描述为原代细胞或细胞系的具体实体。当在本文中使用这些术语中的数个术语时，将理解的是这种用法仅是为了强调众所周知的区别。例如，用语“细胞或细胞系”可以强调原始的原代分离株和永生化形式之间的对照，所述永生化形式可能是所述原始的原代分离株的直接衍生物。在一些实施方案中，本公开的细胞或细胞系可以是本文所述的原代细胞或细胞系的自发永生化变体、特意转化的衍生物、其它变体或衍生物、和其它永生化形式中的一种或多种。
在一些实施方案中，本公开的细胞系可以是猪肺泡巨噬细胞系，其能够支持ASF的生长。在一些实施方案中，本公开的细胞可以获自猪胎肺样品。在一些实施方案中，本公开的细胞可以是胎猪肺泡巨噬细胞。在一些实施方案中，本公开的细胞可以为ZMAC细胞。ZMAC细胞可以被表征为和/或被观察到具有支持ASFV感染和生长的能力。在一些实施方案中，本公开的细胞可以被指定为ZMAC-1。在一些实施方案中，本公开的细胞可以被指定为具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏物或其衍生物。如本文所用，术语“ATCC”可以指代美国典型培养物保藏中心。在一些实施方案中，本公开的细胞可以被指定为ZMAC1107-4。ZMAC1107-4在本文中也可以被称为ZMAC-4，此类术语在本文中可互换使用。在一些实施方案中，本公开的细胞可以包括任何细胞，或具有任何细胞的特征，如在美国专利号8,202,717、8,663,984和9,169,465(它们各自以全文引用的方式并入本文)中所述。在这些在先专利与本公开之间存在任何不一致的情况下，应优先考虑本公开。
在包含本公开的获自猪胎肺样品的细胞的实施方案中，猪胎肺可以来自胎龄为约20天至约80天的猪胎儿。在一些实施方案中，猪胎肺可以来自胎龄为约50天至约70天的猪胎儿。在一些实施方案中，猪胎肺可以来自胎龄为约30天至约90天的猪胎儿。应当理解，具有其它胎龄的猪胎儿也被认为在本公开的范围内。
如本文所用，术语“分离(isolating)”、“分离(isolate)”、“分离的(isolated)”等可以指代这样的被操纵的状态，即所述被操纵的状态与天然状态不同和/或相对于起始材料经过修饰，在这种情况下该术语意在与被纯化的概念一致。例如，分离的原代细胞从宿主生物体的天然组织或其它来源中切除，并与原始来源保持分开。又例如，可以将细胞组分置于培养物中或与基于肺灌洗液的样品进一步分离，从而获得相对分离的细胞。
如本文所用，术语“纯化的”可以指代其中相对于起始材料而言使得物质被相对富集、分离和/取出的状态。该术语可以涵盖至少部分纯化的状态，而不必指绝对的纯化状态。例如，该术语可以适用于这样的细胞，即所述细胞能够使ASF病毒繁殖并存在于混合培养物中，也可独立适用于通常所认为的纯培养物。该术语可以适用于任选地为混合培养物的原代细胞培养物。该术语可以适用于细胞系。
如本文所用，术语“培养(culture)”、“培养的(cultured)”、“培养(culturing)”和类似术语是指细胞在受控条件下且通常在其天然环境之外生长的过程。在一些实施方案中，可以首先从猪中取出细胞，然后在有利的人工环境中使其生长。在一些实施方案中，可以直接从组织中取出细胞并且在培养之前通过酶或机械手段将其解聚。在一些实施方案中，细胞可以源自已建立的细胞系或细胞株。
如本文所用，术语“代(passage)”、“多代(passages)”、“传代的(passaged)”、“传代(passaging)”和类似术语是指传代培养细胞，其可以包括去除培养基并将细胞从先前的培养物转移至新鲜的生长培养基中，从而使细胞能够进一步增殖。在一些实施方案中，本公开的细胞可以被培养至少5代。在一些实施方案中，本公开的细胞可以被培养至少10代。在一些实施方案中，本公开的细胞可以被培养进行至少15代。在一些实施方案中，本公开的细胞可以被培养至少20代。在一些实施方案中，本公开的细胞可以被培养至少50代。在一些实施方案中，培养可以包括使本公开的细胞传代至少5代和/或进行至少10天的连续培养来使本公开的细胞生长。应当理解，本公开可考虑以其它传代间隔培养本公开的细胞。
本公开的方法可以进一步包括使本公开的细胞与生长因子组合物接触。在一些实施方案中，生长因子组合物可以包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)。在一些实施方案中，生长因子组合物可以包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
本公开还提供用于制备ASF疫苗的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括：提供ASF病毒的经修饰活病毒(MLV)株；使MLV株在分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞中生长，所述胎猪肺泡巨噬细胞能够使ASF MLV株复制。
在本公开的方法和组合物中使用的ASFV病毒可以是活的、减毒的或灭活的。如本文所用，术语“减毒”、“经修饰的活病毒”、“MLV”等可以指代一定量的ASFV，该ASFV已经被改变使其不再能够引起ASF，但是仍然能够感染本公开的细胞并在其中复制。如本文所用，术语“灭活的”、“杀死的”、“死亡的”和类似术语可以指代杀死的ASFV。如本文所用，术语“疫苗”可以指代ASFV的MLV株、或杀死的ASFV、或ASFV结构的一部分，其在施用时可刺激抗ASFV的抗体产生，但不会引起严重感染。
本公开还提供用于使ASF病毒生长的方法。该方法可以包括：从猪胎肺分离胎猪肺泡巨噬细胞，包括提供猪胎受试者，从所述受试者获得包含细胞的支气管肺泡灌洗样品，以及从所述样品中分离巨噬细胞；培养细胞；和使细胞与ASF病毒接触，以使病毒复制；从而使病毒生长。
本公开还提供用于检测猪受试者中ASF病毒的存在的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括：提供能够使ASF病毒复制的分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞，其中所述细胞被培养至少5代；使细胞与样品接触；在合适的条件下孵育细胞；检测细胞中ASF病毒的存在。这种检测方法可以用于诊断ASF。
如本文所用，术语“样品”可以指代血液、血清、血浆、淋巴、唾液、鼻分泌物、组织细胞、血清、唾液、精液、痰、脑脊液(CSF)、泪液、粘液、汗液、乳汁或脑提取物。身体组织可以包括胸腺、淋巴结、脾脏、骨髓或扁桃体组织。
如本文所用，在孵育本公开的细胞的情况中，术语“合适的条件”可以指代温度、湿度、环境中的气体混合物等的合适条件。在一些实施方案中，温度可以为37℃(即摄氏度)。
在一些实施方案中，检测ASF病毒的存在可以包括使用血细胞吸附测定法或免疫荧光法。应当理解，本公开可考虑用于检测ASF病毒的存在的其它技术。
本公开还提供包含载体中的ASF病毒子代的疫苗。疫苗可以通过使猪受试者的免疫系统准备好对ASFV发生应答而发挥作用。在一个实施方案中，疫苗可以包含这样的抗原，即所述抗原可以为本公开的ASFV的子代，或其部分，其可以以无毒、无感染性和/或非致病性形式被引入待接种的猪受试者的体内。本公开的疫苗中的ASFV抗原可以引起猪受试者的免疫系统针对源自该抗原的ASFV的“引发(primed)”或“致敏”。猪受试者的免疫系统随后暴露于ASFV可引起快速而稳健的特异性免疫应答，该免疫应答在ASFV于宿主猪受试者中繁殖并感染或损害足够多的细胞从而导致疾病症状之前，可以控制或破坏ASFV。
在一个实施方案中，可能有必要增强对疫苗中存在的抗原的免疫应答，以充分刺激免疫系统以使疫苗有效，即提供免疫力的程度。为此，已经设计了被称为佐剂(或免疫增强剂)的添加剂，其可以增强对疫苗组合物中的抗原的体内免疫应答。在一些实施方案中，本公开的疫苗可以进一步包含佐剂。
佐剂可以是改进其它试剂(例如本文所述的抗原)的作用的任何组合物、药学试剂或免疫试剂。佐剂的示例可以非限制性地包括分枝杆菌裂解物(包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)全细胞裂解物)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(包括耻垢分枝杆菌全细胞裂解物)、霍乱毒素B亚单位和大肠杆菌热不稳定突变毒素。佐剂的其它示例可以包括进化保守的分子(所谓的PAMP)，其可以包括脂质体、脂多糖(LPS)、抗原的分子笼、细菌细胞壁的成分、和内吞性核酸例如双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)和含未甲基化的CpG二核苷酸的DNA。佐剂的其他示例可以非限制性地包括含铝佐剂，其可以包括其上可吸附抗原的矿物质(或矿物盐，例如氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝)的混悬剂。佐剂的其他示例可以非限制性地包括无铝佐剂，其可以在不存在任何所述铝盐的情况下进行配制。无铝佐剂可以包括油水乳剂如油包水型、水-油-水型和水包油型(及其变体，包括双重乳剂和可逆乳剂)，脂糖(liposaccharide)，脂多糖，免疫刺激性核酸(例如CpG寡核苷酸)，脂质体，Toll样受体激动剂(尤其是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)，以及这些成分的各种组合。
可在本公开的疫苗中使用的载体的非限制性清单可以非限制性地包括水或生理盐水、凝胶、药膏、溶剂、油、稀释剂、液体软膏基质、脂质体、胶束、巨胶束、合成聚合物、乳剂、由脂质制成的固体颗粒等。应当理解，根据本公开可以使用本领域中已知的任何稀释剂。在本公开的一些实施方案中，稀释剂可以是水溶性的。在本公开的一些实施方案中，稀释剂可以是非水溶性的。如本文所用，术语“稀释剂”可以非限制性地包括水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、右旋糖、甘油、乙醇、乙酸钠或乙酸铵缓冲溶液等及其组合。
本公开还提供在猪中引发抗ASFV免疫应答的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括向猪施用有效量的本公开的疫苗。免疫应答可以对猪具有保护作用。
在实施本公开的方法中，向猪施用有效量的疫苗。如本文所用，在施用的情况中，术语“有效量”是指施用于猪时的足以产生针对ASFV的免疫应答的疫苗量。这样的量应该在猪中不会或几乎不会导致不良事件。类似地，这样的量应该不会或几乎不会引起毒性作用。应当理解，疫苗量可以根据许多因素进行变化，非限制性地包括所治疗的猪的类型、猪的年龄、大小、体重、总体身体状况和给药方案。
如本文所用，“免疫应答”可以是免疫系统的细胞例如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激的应答。免疫应答可以是B细胞应答，其引起特异性抗体例如抗原特异性中和抗体的产生。免疫应答还可以是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在一些实施方案中，应答可以对特定抗原具有特异性(即“抗原特异性应答”)。免疫应答还可以包括先天性应答。如果抗原源自病原体，则抗原特异性应答是“病原体特异性应答”。“保护性免疫应答”是这样的免疫应答，即其抑制病原体的有害功能或活性、减少病原体的感染、或减少因病原体的感染而导致的症状(包括死亡)。例如通过在空斑减少测定法或ELISA中和测定法中抑制病毒复制或空斑形成，或通过测量体内对病原体攻击的抗性，可以测量保护性免疫应答。
应当理解，可以采用多种适用途径来施用在本公开的方法中使用的疫苗，非限制性地包括口服、静脉内(“IV”)、皮下(“SC”)、肌肉内(“IM”)、腹膜内、皮内、眼内、肺内、鼻内、经皮、皮下(subdermal)、局部、粘膜、鼻腔、皮内印痕(impression into skin)、阴道内、子宫内、宫颈管内和直肠施用。在本公开的一些实施方案中，鼻内施用途径可以包括鼻内滴剂。在本公开的一些实施方案中，鼻内施用途径可以包括鼻内气雾剂递送。在本公开的一些实施方案中，鼻内气雾剂递送可以包括鼻腔喷雾剂递送。
本公开通过提供本公开的细胞和方法解决了ASF疾病的问题。体内ASFV复制的主要靶细胞是单核细胞和巨噬细胞。与使ASFV复制的体内靶细胞类似的猪巨噬细胞系的缺乏限制了对病毒宿主相互作用的研究，限制了减毒活疫苗的开发，并使病毒的诊断更加繁琐。采用源自非洲绿猴肾脏的已建立的细胞系(例如Vero和COS-1)使得能够扩增ASFV以用于研究目的。但是，其使用需要首先使病毒适应在这类细胞系中的生长，这将限制其用于数量有限的实验室株中，所述实验室株必须经过长时间的适应过程才能在细胞培养物中有效生长。由于发现自然暴发的野生型ASFV分离株不能在这些常规的猿猴来源的已建立细胞培养物中复制，因此猪单核细胞和巨噬细胞是被选择用以使病毒原液生长并模拟天然ASFV感染的体外系统。尽管这可能足以满足研究目的，但不足以开发商业疫苗，因为对于美国农业部兽医生物制品中心(CVB)的监管批准而言，原代细胞用作生产充分授权的商业疫苗的细胞基质是不合适的。已经尝试使用已建立的细胞系来开发ASFV的减毒株。不幸地，出于开发减毒疫苗株的目的在Vero细胞中对Georgia 2007野生型ASFV株进行110次的连续传代使得病毒减毒，但也导致疫苗效力丧失。因此，在源自外周血或骨髓的猪巨噬细胞的原代培养物中进行野外分离株的培养，甚至是最近开发的Georgia 2007基因缺失的ASFV疫苗候选株的培养。相反，如本公开中所示，野生型ASFV株Georgia 2007/1以及数种其它ASFV野生型和减毒株能够在ZMAC细胞中容易且有效地复制。此外，如本公开中所示，减毒株ASFV OURT88/3在ZMAC细胞中经过十二代并没有降低其在猪中诱导抗毒性病毒攻击的保护性免疫的能力。
存在的病毒感染所需的特异性受体在宿主细胞膜上表达，因此构成病毒嗜性和内在化的决定因素。据报道，具有较高的成熟和分化状态的单核细胞/巨噬细胞是被ASFV优先感染的细胞亚群。在这方面，已经描述了较高百分比的成熟单核细胞/巨噬细胞被野生型ASFV感染与CD163和SWC9/CD203a的较高表达有关。尽管最初认为CD163的细胞表面表达是细胞感染ASFV所必需的，但随后的研究与该观察结果相矛盾，所述研究表明CD163阴性单核细胞可以被ASFV感染。此外，缺乏CD163的基因编辑的猪以及源自它们的单核细胞和巨噬细胞完全易感染ASFV的野生型Georgia 2007/1株。因此，似乎ASFV感染不需要CD163。在SWC9/CD203a的情况中，单核细胞和巨噬细胞对该分子的表达的上调与它们分化并成熟为巨噬细胞有关。单核细胞不表达SWC9/CD203a，并且主要抗ASFV感染。当这些细胞分化为成熟的巨噬细胞时，它们会上调SWC9/CD23a的表达，变得易受ASFV感染。如本公开中所示，ZMAC细胞不表达SWC9/CD203a，因此可以视为未成熟类型的巨噬细胞。因此，ZMAC细胞使野生型ASFV株有效复制的能力是出乎意料的，因为这些细胞似乎是未成熟的巨噬细胞，并不表达与ASFV感染的易感性相关的细胞表面分子(SWC9/CD203a)。此外，ZMAC细胞使野生型ASFV有效复制的能力是前所未有的，因为Weingartl等人(Weingartl HM、Sabara M、Pasick J、vanMoorlehem E、Babiuk L)(Continuous porcine cell lines developed from alveolarmacrophages:partial characterization and virus susceptibility.J VirolMethods.2002；104(2):203-216.Doi:10.1016/s0166-0934(02)00085-x)描述的猪肺泡巨噬细胞系3D4/2、3D4/21和3D4/3未有效地被野生型ASFV感染，并且不支持ASFV的连续传代。如本公开中所述，ZMAC细胞能够有效地使野生型ASFV株Georgia 2007/1生长，产生高滴度。
本公开中除了在其它地方描述和提供的方面和实施方案之外，还可考虑以下非限制性的实施方案清单。
1.一种用于产生非洲猪瘟(ASF)病毒子代的方法，其包括:
提供能够使ASF病毒复制的分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞，其中所述细胞被培养至少5代；
将细胞暴露于ASF病毒；以及
使ASF病毒在细胞中复制；
从而产生ASF病毒子代。
2.根据第1项所述的方法，其中，所述细胞选自ZMAC、具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
3.根据第1项所述的方法，其中，所述细胞选自ZMAC-1、ZMAC-4、具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
4.根据第1项所述的方法，所述方法进一步包括使细胞与生长因子组合物接触。
5.根据第4项所述的方法，其中，所述生长因子组合物包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
6.根据第1项所述的方法，其中，所述细胞获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
7.一种用于制备ASF疫苗的方法，其包括：
提供ASF病毒的经修饰活病毒(MLV)株；和使MLV株在分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞中生长，所述胎猪肺泡巨噬细胞能够使ASF MLV株复制。
8.根据第7项所述的方法，其中，所述细胞为原代细胞、细胞群、细胞系、或者其变体或衍生物。
9.根据第7项所述的方法，其中，所述细胞选自ZMAC、具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
10.根据第7项所述的方法，其中，所述细胞选自ZMAC-1、ZMAC-4、具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
11.根据第7项所述的方法，其中，所述方法进一步包括使细胞与生长因子组合物接触。
12.根据第11项所述的方法，其中，所述生长因子组合物包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
13.根据第7项所述的方法，其中，所述细胞获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
14.一种用于使ASF病毒生长的方法，其包括：
通过以下步骤从猪胎肺分离胎猪肺泡巨噬细胞，所述步骤包括提供猪胎受试者，从所述受试者获得包含细胞的支气管肺泡灌洗样品，以及从所述样品中分离巨噬细胞；
培养细胞；以及
使细胞与ASF病毒接触，以使病毒复制；
从而使病毒生长。
15.根据第14项所述的方法，其中，培养包括使细胞传代至少5代和/或进行至少10天的连续培养来使细胞生长。
16.根据第14项所述的方法，其中，培养包括使细胞与生长因子组合物接触。
17.根据第16项所述的方法，其中，所述生长因子组合物包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
18.根据第14项所述的方法，其中，所述细胞获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
19.根据第1项所述的方法，其中，所述细胞被培养至少10代。
20.根据第1项所述的方法，其中，所述细胞被培养至少20代.
21.根据第1项所述的方法，其中，所述细胞为细胞系。
22.根据第7项所述的方法，其中，所述细胞为细胞系。
23.根据第14项所述的方法，其中，培养包括使细胞传代至少20代。
24.一种分离的胎猪肺泡巨噬细胞，其中，所述细胞能够被ASF病毒感染和/或使ASF病毒繁殖，并且其中所述细胞被培养至少5代。
25.根据第24项所述的细胞，其中，所述细胞在培养中增殖至少10代。
26.根据第24项所述的细胞，其中，所述细胞在培养中增殖至少20代。
27.根据第24项所述的细胞，其中，所述细胞在培养中增殖至少50代。
28.根据第24项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少104TCID50/m1的滴度生长。
29.根据第24项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约3.16x105TCID50/m1的滴度生长。
30.根据第24项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约3.16x106TCID50/m1的滴度生长。
31.根据第24项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约3.16x107TCID50/m1的滴度生长。
32.根据第24项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约6.81x107TCID50/m1的滴度生长。
33.根据第24项所述的细胞，其中，所述细胞来自胎龄为约30天至约90天的猪胎儿。
34.一种胎猪肺泡巨噬细胞系，其中，所述细胞系能够被ASF病毒感染和/或使ASF病毒繁殖。
35.根据第34项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少104TCID50/m1的滴度生长。
36.根据第34项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约3.16x105TCID50/m1的滴度生长。
37.根据第34项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约3.16x106TCID50/m1的滴度生长。
38.根据第34项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约3.16x107TCID50/m1的滴度生长。
39.根据第34项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约6.81x107TCID50/m1的滴度生长。
40.根据第34项所述的细胞系，其中，所述细胞系来自胎龄为约30天至约90天的猪胎儿的细胞。
41.一种分离的ZMAC-1细胞，其以具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏物为代表或从其衍生。
42.根据第41项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少104TCID50/m1的滴度生长。
43.根据第41项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约3.16x105TCID50/m1的滴度生长。
44.根据第41项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约3.16x106TCID50/m1的滴度生长。
45.根据第41项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约3.16x107TCID50/m1的滴度生长。
46.根据第41项所述的细胞，其中，所述细胞能够使ASF病毒以至少约6.81x107TCID50/m1的滴度生长。
47.一种从猪胎肺分离细胞的方法，其包括以下步骤：
提供猪胎受试者；
从所述受试者获得包含细胞的样品；
从所述样品中分离细胞，培养所述细胞至少5代，其中所述细胞能够使ASF病毒复制；
从而分离细胞。
48.一种从猪胎肺分离细胞的方法，其包括以下步骤：
提供猪胎受试者；
从所述受试者获得包含细胞的样品，其中所述包含细胞的样品为支气管肺泡灌洗样品；以及
从所述样品中分离细胞，其中所述细胞能够使ASF病毒复制；
从而分离细胞。
49.根据第47项所述的方法，其中，分离步骤通过密度梯度离心进行。
50.根据第47项所述的方法，其中，所述细胞为巨噬细胞。
51.根据第47项所述的方法，所述方法进一步包括进行至少10天的连续培养来使细胞生长。
52.根据第47项所述的方法，其中，培养进行至少10、20或50代。
53.根据第47项所述的方法，其中，所述猪胎受试者的胎龄为约30天至约90天。
54.一种从猪胎肺分离细胞的方法，其包括以下步骤：提供猪胎受试者，来自所述受试者的包含细胞的样品，从所述样品中分离细胞，以及亚克隆细胞，其中所述细胞能够使ASF病毒复制；从而分离细胞。
55.根据第47项所述的方法，所述方法进一步包括在包含生长因子组合物的生长培养基中培养细胞。
56.根据第55项所述的方法，其中，所述生长因子组合物包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
57.根据第55项所述的方法，其中，所述生长因子组合物包含浓度为5至10ng/ml的MCSF。
58.根据第48项所述的方法，其中，所述细胞为巨噬细胞。
59.根据第48项所述的方法，所述方法进一步包括培养细胞至少5代的步骤。
60.根据第48项所述的方法，其中，所述猪胎受试者的胎龄为约30天至约90天。
61.根据第48项所述的方法，所述方法进一步包括在生长培养基中培养细胞，所述生长培养基包含MCSF或GMCSF的生长因子组合物。
62.根据第54项所述的方法，其中，所述细胞为巨噬细胞。
63.根据第54项所述的方法，所述方法进一步包括培养细胞至少5代的步骤。
64.根据第54项所述的方法，其中，所述猪胎受试者的胎龄为约30天至约90天。
65.根据第54项所述的方法，所述方法进一步包括在生长培养基中培养细胞，所述生长培养基包含MCSF或GMCSF的生长因子组合物。
66.根据第50项所述的方法，其中，所述巨噬细胞为肺泡巨噬细胞。
67.根据第58项所述的方法，其中，所述巨噬细胞为肺泡巨噬细胞。
68.根据第62项所述的方法，其中，所述巨噬细胞为肺泡巨噬细胞。
69.一种能够使ASF病毒繁殖的分离的非猿猴细胞，其中，所述非猿猴细胞获自个体动物，并且被培养经过至少5代。
70.一种分离的猪胎肺细胞，其能够被ASF病毒感染和/或使ASF病毒繁殖。
71.根据第70项所述的细胞，其中，所述细胞为肺泡巨噬细胞。
72.根据第70项所述的细胞，其中，所述细胞在培养中增殖至少5代。
73.根据第70项所述的细胞，其中，所述细胞在培养中增殖至少10代、20代和/或50代。
74.一种分离的原代细胞或细胞群，其获自猪胎儿的肺。
75.根据第74项所述的细胞或细胞群，其中，所述胎儿的胎龄为约30天至约90天。
76.根据第74项所述的细胞或细胞群，其中，所述细胞为肺泡巨噬细胞或所述细胞群包含至少一个肺泡巨噬细胞。
77.第69至71和74至76项中任一项所述的细胞的永生化细胞变体或衍生物。
78.一种命名为ZMAC的细胞或细胞系。
79.一种疫苗，其包含在载体中的第1项所述的ASF病毒子代。
80.根据第79所述的疫苗，其进一步包含佐剂。
81.一种在猪中诱发抗ASFV免疫应答的方法，其包括向猪施用第79项所述的疫苗。
82.根据第81项所述的方法，其中，经肠胃外施用所述疫苗。
83.根据第81项所述的方法，其中，经口服施用所述疫苗。
84.根据第81项所述的方法，其中，经鼻内施用所述疫苗。
85.根据第81项所述的方法，其中，经粘膜施用所述疫苗。
实施例
下面描述与本公开有关的实施例。在一些实施方案中，可以使用替代技术。这些实施例旨在说明而不是限制或约束如权利要求所述的本发明的范围。
实施例1：细胞材料与细胞生长
细胞材料：制备来自猪肺泡巨噬细胞系的命名为ZMAC-1的细胞，并根据布达佩斯条约将其保藏在公认的国际保藏机构美国典型培养物保藏中心(ATCC；10801大学大道，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)。以欧亚野猪(Sus scrofa)(猪/猪)肺组织来源为特征的细胞的登记编号为ATCC专利保藏编号PTA-8764。根据日期为2007年12月7日的ATCC保藏证明文件(国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约；国际表格；依照第7.3条发布原始保藏的接收以及依照第10.2条发布存活声明)，
Figure BDA0002633331450000141
专利保藏名称PTA-8764的培养物接收日期为2007年11月14日。
细胞生长：在一些实施方案中，在体外培养细胞例如ZMAC-1细胞。通常，应用哺乳动物细胞培养的原理。例如，可以在抗生素存在下培养细胞；可使用庆大霉素，但其并非必需的。
如下制备细胞。培养基是RPMI-1640，其补充有10％胎牛血清、丙酮酸钠(1mM；Mediatech Cellgro,Cat.No.25000-C1)、非必需氨基酸(1X；Mediatech CellgroCat.No.25-025-C1)和庆大霉素(50mcg/ml；Gibco,Cat.No.15750-060)。细胞维持在每毫升约1至5x10e5的细胞浓度。这些细胞通常悬浮生长。会形成松散贴壁细胞的不连续集落，但大多数细胞将悬浮生长。标准培养物会产生漂浮的细胞团簇。为减少贴壁，培养瓶的优选类型是用于悬浮细胞的带有PE通气帽的Sarstedt组织培养瓶(Cat.No.83.1813.502)。每隔4至5天可收获已建立的培养瓶，同时去除2/3的液体并添加新鲜的培养基。通过在T25培养瓶中以20ml体积添加至少3至6百万个细胞(最低1.5x10e5个细胞/ml)来建立新的培养瓶。可以通过添加2至10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(小鼠；Sigma-Aldrich产品编号M9170)来促进生长。可以通过将等体积的冰冷细胞悬浮液(每毫升4至8百万个细胞)与冰冷冷冻培养基(90％血清，10％DMSO)混合来完成细胞冷冻。冷冻的冷冻管装入悬浮在冷冻培养基中的细胞，并在此过程中保持冰冷的温度。
现在参考图1，其示出在生长因子存在下的ZMAC-1细胞的生长。在无外源性生长因子的情况下，或者在指定浓度的巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的存在下，将1.2x105个细胞/毫升的ZMAC-1细胞培养8天。在培养的第四天和第八天借助于血细胞计数器测定细胞浓度。y轴表示细胞数/毫升(x105)。
实施例2：细胞材料的产生和从胎猪样品中分离的方法
开发了进一步的组合物和方法。在一项独立的尝试中，材料是从伊利诺伊大学兽医研究农场的猪群中妊娠60天的母猪(标识为母猪编号5850)获得的。安乐死后，将子宫从腹腔中无菌取出并转移到细胞培养实验室。通常在无菌条件下使用生物安全操作台进行操作。从子宫中无菌收获六只胎儿，并将它们置于塑料皮氏培养皿(Petri dish)中。与心脏、食道和其它膜解剖分离出具有与肺连接的完整气管的肺器官。用无菌汉克平衡盐溶液(HBSS)彻底冲洗肺的外部，以去除任何可见的血液和其它污染的残留组织。通过将肺置于干净无菌的皮氏培养皿中并用10ml无菌HBSS填充气道来进行支气管肺泡灌洗，从而分别分离6只胎儿各自的肺气道中的细胞。借助于插入气管腔的10cc注射器和1英寸18g针头，将10毫升HBSS推入肺中。轻柔地推动液体经过气管，同时用钳子压迫来限制气管以防止HBSS回流，从而使得肺明显被液体膨胀。然后，通过简单地松开气管压迫，将含有肺灌洗细胞的液体从肺中自行排出。将在皮氏培养皿中收集的细胞悬浮液转移到无菌的15ml圆锥形塑料管中，并将3至4ml温的Ficoll-Hypaque 1077置于其下。之后立即通过等密度离心(400g，在室温下30分钟)纯化细胞悬浮液。
在一个实施方案中，可以在分离当天或在稍后的时间例如1周、2周或3周后，通过使用Ficoll-Hypaque 1077的等密度离心来纯化细胞。公认的是，该纯化程序可以促进去除原始制剂中存在的某些成分，例如红细胞和可能的其它物质。收获在离心后在Ficoll-Hypaque 1077和培养基之间的界面处得到的细胞带，并用HBSS洗涤两次，每次通过离心回收细胞。在第二次离心后，将从每个胎肺的灌洗中回收的细胞团块悬浮在补充有10％的胎牛血清、丙酮酸钠(1mM；Mediatech Cellgro，Cat.25-000-C1)和非必需氨基酸(1X；Mediatech Cellgro Cat.No.25-025-C1)的RPMI-1640培养基中，并独立放置在6孔板(Sarstedt)的一个孔中进行悬浮培养。从1至6标记每个孔，以识别从六个胎儿彼此独立纯化的细胞。尽管这种尝试中，在等密度离心程序后只回收了很少的极小细胞(<100)，但在建立初始培养物后的14天内，每个孔中均观察到了明显的生长。由于从胎肺中收获的巨噬细胞祖细胞明显很小并且可能具有大于1.077的密度(因此在等密度离心的过程中通过密度培养基到达管的底部)，所以在胎儿#1的情况中，还收获了在等密度离心后得到的红细胞团块，将其置于培养物中并标记为P1。在这种情况中，尽管培养开始时的主要细胞类型由红细胞组成，但观察到少量非常小的单核细胞。在培养开始后的第16和24天，源自胎儿#4的肺灌洗的细胞的生长表现出足以进行分到6孔板的新孔中的生长。源自该培养物的细胞称为ZMAC1107-4。类似地，在培养开始后第36天，源自红细胞团块的标记为P1的孔中生长很明显，也分到两个孔中。源自该培养物的细胞称为ZMAC1107-P1。通过每簇包含2个、4个、8个、16个或更多个细胞的细胞簇的存在表明了细胞的生长。
开始ZMAC1107-4的培养后第37天，将在两个重复孔的一个中的该细胞系的培养基补加了10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(小鼠；Sigma-Aldrich产品编号M9170)。七天后，很明显，在这一早期培养阶段，外源性补充生长因子显著地辅助了ZMAC1107-4细胞的生长，然后在所有培养物的培养基中补加了5至10ng/ml的MCSF。每隔4至6天通过吸除一半体积的细胞培养液并用补充有生长因子的新鲜培养基来代替而向培养物进行补料。通过悬浮生长和松散贴于培养表面的细胞集落的形成表明了ZMAC 1107-4和ZMAC 1107-P1两系的稳健生长。
在另一项独立的尝试中，开发了进一步的组合物和方法。从伊利诺伊大学兽医研究农场的猪群获得了妊娠54天的标识为编号9093的母猪。安乐死后，将子宫从腹腔中无菌取出并转移到细胞培养实验室。此后的所有操作均在无菌条件下在生物安全操作台内进行。从子宫中无菌收获八只胎儿并将它们置于塑料皮氏培养皿中，与心脏、食道和其它膜解剖分离出它们的肺，所述肺具有与肺连接的完整气管。用HBSS彻底冲洗肺的外部，用以去除任何可见的血液和其它污染的残留组织。通过将肺置于干净无菌的皮氏培养皿中并用10ml无菌汉克平衡盐溶液(HBSS)填充气道来进行支气管肺泡灌洗，从而分别分离八只胎儿各自的肺气道中的细胞。借助于插入气管腔的10cc注射器和1英寸18g针头，将10毫升HBSS推入肺中。轻柔地推动液体通过气管，同时用钳子压迫气管以防止HBSS回流，从而使得肺明显被液体膨胀。然后，通过简单地减少对气管的压迫，将含有肺灌洗细胞的液体从肺中自行排出。在一些情况中，用剪刀的钝端将肺轻轻向下压，以帮助排出剩余的灌洗液。将在皮氏培养皿中收集的细胞悬浮液转移到无菌的15ml锥形塑料管中，并在台式临床离心机中以1500RPM离心10分钟。将从每个胎肺的灌洗中回收的细胞团块悬浮在补充有10％的胎牛血清、丙酮酸钠(1mM；Mediatech Cellgro，Cat.25-000-C1)和非必需氨基酸(1X；MediatechCellgro Cat.No.25-025-C1)的RPMI-1640培养基中，并独立放置在6孔板(Sarstedt)的一个孔中进行悬浮培养。从1至8标记每个孔，以识别八个胎儿彼此独立纯化的细胞。最初将来自每个胎肺的灌洗的约10000个细胞置于培养中。这些培养中的生长在5天时是明显的。在源自胎儿#1、3、6、7和8的培养物中明显可见大团簇的细胞。
培养开始后第12天，通过轻轻吸打收获所有8个胎肺灌洗细胞培养物中的非贴壁细胞和松散贴壁细胞，并通过使用Ficoll-Hypaque 1077的等密度离心进行纯化。这是通过以下方式完成的：将细胞悬浮液转移到无菌的15ml锥形塑料管中，将3至4ml温的Ficoll-Hypaque 1077置于其下，然后在室温下以400g离心30分钟。在离心后在Ficoll-Hypaque1077之间的界面处获得清晰可见的细胞带。收获培养基并用HBSS洗涤两次，每次通过离心回收细胞。在第二次离心后，将从每个胎肺的灌洗培养物中回收的细胞团块悬浮在3ml的补充有10％的胎牛血清、丙酮酸钠(1mM；Mediatech Cellgro，Cat.25-000-C1)和非必需氨基酸(1X；Mediatech Cellgro Cat.No.25-025-C1)的RPMI-1640培养基中，并独立放置在6孔板(Sarstedt)的一个孔中进行悬浮培养，标记为与培养物的原始标记直接相对应的1至8。五天后，向所有细胞培养物补给2cc新鲜的培养基。九天后，在源自标记为3和6的胎肺灌洗细胞培养物的培养物中，悬浮细胞和贴壁细胞的生长非常显著，其表现出显著数量的悬浮生长的巨噬细胞集落以及松散贴壁的圆形巨噬细胞。观察到许多大的球形合体细胞，其周围环绕着小巨噬细胞，从而形成呈细胞冠状的结构。培养开始后第26天，向细胞培养物补给补充有5ng/ml MCSF(小鼠；Sigma-Aldrich产品编号M9170)的新鲜培养基。五天后，在源自胎儿#3、#6和#8的培养物中观察到悬浮生长和松散贴于培养板表面上的细胞巨噬细胞集落的旺盛生长。将这些细胞系分别称为ZMAC1207-3、ZMAC1207-6和ZMAC1207-8，并在数天后通过转移到T75培养瓶中在补充有5至10ng/ml MCSF的培养基中进行扩增。
实施例3：在Pirbright研究所建立ZMAC细胞培养物并测试ASFV易感性
从液氮储存器中复活由Aptimmune Biologics，Inc.(1005N.Warson Road，Suite305，St.Louis，MO 63132)提供的一小瓶ZMAC细胞。简而言之，将细胞在37℃(即摄氏度)下快速解冻，添加到10ml温的培养基中，在330xg和4℃下离心7分钟以除去冷冻培养基，然后在T75超低贴壁(ULA)培养瓶的总共50ml的培养基和5ng/ml MCSF中进行培养。3天后，以1:2的稀释向培养物再补给新的培养基，其中补充的M-CSF在总体积(100ml)中的最终浓度为5ng/ml。每隔三至四天用新鲜的培养基(在不到7天前制备)以1:2培养物体积的稀释度进行另外的再补料，其中补充的M-CSF最终为5ng/ml。当培养物在T75 ULA培养瓶中达到约150ml时，将培养物分到新的培养瓶中，并如之前每隔三到四天进行再补料。在该程序之后，在一个月内建立了三个具有生长的ZMAC培养物的T75 ULA培养瓶。三个培养瓶中的细胞计数显示为每个培养瓶约3x106个细胞。从此时起，将部分细胞留在相同的T75 ULA培养瓶中，或扩增到几个新的T75 ULA，而后按照相同的方案进行再补料。当培养瓶中的培养物体积达到约150ml时，通过离心收集细胞，进行计数，并部分重新接种在相同的培养瓶中(接种每毫升约4x104个细胞，每个培养瓶1.2至2x106个细胞)。部分细胞用于制备新的冷冻细胞原液(在90％小牛血清和10％DMSO中为3.5至5x106个细胞/ml)或用于测试替代性的培养容器。自ZMAC培养开始以来的两个月内，可以获得八个冷冻细胞的冷冻管。其中两个成功复活，并将细胞扩增到新的培养瓶中，从而表明用于冷冻细胞的条件是适合的。
在250ml聚碳酸酯Erlenmeyer(Corning参考号43114)中以在50ml培养基和5ng/mlMCSF中约1.2x106个细胞(2.4x104个细胞/ml)开始进行的培养表明其也是用于ZMAC培养的良好容器，使用与T75 ULA类似的补料方案，其中细胞数目在13天之内增加4倍，最终培养物体积为125ml。
在培养ZMAC细胞并将培养物扩增至更大的容器后，从此时起以至少三天的间隔向ZMAC培养物进行补料，M-CSF浓度增加至10ng/ml。此外，推荐的T75ULA中的初始接种细胞浓度为6x104个/ml。按照这些新指令，通常在7至9天之内观察到T75 ULA培养物和250mlErlenmeyer中的细胞成为三倍或四倍的量。在另外的约两个月内，使用这些生长条件，本发明人可以获得额外的八个冷冻管的细胞和另外两小瓶用于生长困难后重新开始新的培养。本发明人已经获得了总共12个具有经本发明人增殖的ZMAC细胞的冷冻管。本发明人还观察到，胎牛血清(完全培养基的组分)在56度灭活超过30分钟对于ZMAC培养是有害的，导致不良的细胞生长。因此，本发明人现在使用推荐的未热灭活的血清。
在初步实验中使用ZMAC细胞以测试其对ASFV的易感性和支持病毒生长。使用具有2.2x106个ZMAC细胞/板(2.3x104个细胞/孔)和补充有M-CSF的完全培养基的标准贴壁组织培养板或ULA板(Corning 4515–96孔球形微板)，以96孔形式平行滴定不同的ASFV分离株。为了进行比较，用猪骨髓(PBM)细胞在96孔组织培养板上进行了相同的滴定，这是ASFV的经典滴定方法。如表1所示，与标准贴壁组织培养板中的ZMAC细胞相比，ULA板中的ZMAC细胞的滴度显著增加了至少一个log，这表明贴壁的ZMAC细胞丧失了一定程度的对ASFV的易感性。ULA容器中的滴度也更接近于PBM中获得的滴度，除了NHV分离株，其在ZMAC细胞中的滴度高两个log。
表1：不同ASFV分离株对ZMAC细胞和猪骨髓细胞进行的滴定(TCID50/ml)的比较
Figure BDA0002633331450000181
Figure BDA0002633331450000191
实施例4：用于扩大ZMAC细胞培养的细胞培养条件的优化
为了鉴定出ZMAC细胞系的最佳培养条件，检测了数种类型的培养基以及这些培养基组分的浓度的变化。发现了RPMI-1640的改良(由葡萄糖和谷氨酰胺浓度的增加组成)可优化ZMAC细胞的生长速率。发现最佳的是每隔四至五天通过以下方式对细胞培养物进行分离：添加最终浓度为5至20ng/mL的鼠重组巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和足够体积的新鲜培养基以实现培养基体积的1:3的稀释。在这些条件下，在分离时稀释后的细胞浓度保持为0.5至0.8x105个/ml，四至五天后细胞浓度将达到1.4至1.6x105个/ml。发现在10代后单独添加1ng/ml的猪重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)有助于维持细胞在10代后的旺盛生长，这保持了进行至少10次以上细胞传代的细胞生长活力。
ZMAC细胞具有贴壁性，如果在经过组织培养处理的表面上进行培养，则这些细胞将牢固地贴壁。但是，出于某些不确定的原因，ZMAC细胞牢固地贴于培养表面会显著减慢细胞生长速率。相比之下，如果将细胞培养在能促进其贴壁的培养容器上，则ZMAC细胞会作为松散贴壁的集落有效生长。该功效可以通过简单地使用未经过组织培养处理的容器或旨在用于悬浮培养的具有疏水表面的容器(用于悬浮培养的Sarstedt培养瓶，目录编号83.1810.502)来实现。本发明人已经发现，最佳地促进ZMAC细胞生长的组织培养容器的类型为
Figure BDA0002633331450000192
超低贴壁(ULA)细胞培养瓶。不幸地，由于制造的最大培养瓶的生长面积为75cm2，因此该容器价格昂贵，并不适于经济实用的规模扩大。尽管如此，本发明人已经开发了从ZMAC细胞冷冻等分试样(aliquot)开始启动ZMAC细胞培养的标准方案。在这种情况中，最佳地是将Corning的ULA培养瓶用于初始扩增，并且这些培养瓶中数个用于生产。然后，可以通过转移到更大的容器(例如生长面积为175cm2的Sarstedt悬浮培养瓶)中来实现培养基规模扩大。
从包含4x106个ZMAC细胞的冷冻等分试样开始的典型生产操作，包括：首先建立一个75cm2 ULA组织培养瓶(Corning)，其中将来自这种小瓶的解冻细胞在35ml体积的补充有10％胎牛血清和5ng/ml鼠MCSF的改良RPMI-1640培养基中进行培养。细胞扩增后，在16至20天内建立两个ULA 75cm2培养瓶，每个培养瓶包含总体积为150ml的细胞悬浮液。通过使用常规的300cm2组织培养瓶进一步扩增细胞培养物的体积，其允许每个培养瓶的培养物体积>300ml。然而，在这种情况中，为了使细胞贴壁最小化，将培养瓶放置在培养箱中，使培养瓶的未经过组织培养处理的一侧朝下，从而使得细胞在重力作用下沉降在培养瓶的未经过组织培养处理的内表面上。现在参考图2，在这些条件下，经过7次细胞传代后，在38天内细胞数目扩增100倍。y轴显示细胞总数x 10e6，x轴显示培养天数。随后每4天至5天以1:3的稀释度通过细胞传代进行的扩增应使得细胞数目扩增2至3倍。因此，培养方法得以改进，其允许从细胞系的工作细胞种子原液开始进行＞20次的连续细胞系传代。最近，对培养基配方的进一步改良使得单位体积培养物的细胞产率得到两倍的增加，同时伴随着细胞生长速率的相应增加。这种最近的改进不仅将降低生产成本，而且还表明在开发用于工业大规模工艺的细胞培养方法的过程中将实现对培养过程的进一步优化。
在这方面，测试了数种类型的细胞培养容器能够使ZMAC细胞有效生长的适用性。这些包括使用一次性生物反应器、细胞培养袋(例如JRH聚乙烯袋)以及体积容量为0.5至10L的较大培养容器。还探索了搅拌培养与静态培养的需求。这些研究表明细胞不需要搅拌。确切地说，显然，当允许细胞沉降并彼此紧密接触时，它们的生长最佳。这些测试表明，数种便宜类型的容器适用于ZMAC细胞的有效的培养基规模培养，这应至少允许疫苗的初始培养基规模的商业生产。本发明人具有能够实现ZMAC细胞培养的连续方法的原型培养系统，其中可以从这些已建立的培养容器中收获细胞，然后将其转移到更适合于病毒生产并与疫苗生产相兼容的其它容器中。已建立的培养容器的再补料可使得在3至4天内快速扩增ZMAC细胞群，以进行另一轮的细胞收获。当前，如果将细胞保持在最佳的培养条件下，似乎可以无限期地重复该过程。
实施例5：支持高水平的非洲猪瘟病毒复制的猪巨噬细胞系
猪中ASFV复制的主要靶细胞是单核巨噬细胞谱系，其表达分化中期到后期的典型标记物。可精确代表这些靶细胞的猪细胞系的缺乏限制了对病毒宿主相互作用的研究和减毒活疫苗株的开发。本发明人在此表示，持续生长的依赖生长因子的ZMAC-4猪巨噬细胞系容易感染八种不同的野生ASFV分离株。在ZMAC-4细胞中的复制以与原代猪骨髓细胞中相似的动力学和相似的高滴度发生。此外，本发明人表明，在ZMAC-4细胞中，ASFV减毒株OURT88/3的十二次传代并没有降低该病毒诱导抗毒性病毒攻击的保护的能力。因此，ZMAC-4细胞可替代原代细胞用于ASFV复制。
介绍
ASFV引起家猪和野猪的出血热，其可导致几乎所有感染动物死亡。该疾病是由一种大DNA病毒引起的，该病毒是非洲猪瘟病毒(Asfarviridae)家族的唯一成员，其基因组长度为170至193kbp，在分离株之间有所不同。ASFV存在于非洲东部(E.Africa)的野生动植物圈中，包括疣猪和钝缘蜱属(Ornithodoros spp)的软蜱载体，它们被持续感染，即使有任何临床体征，也是很少。在2007年ASFV被引入横贯高加索地区的佐治亚州(Georgia)之后，该疾病已传播到俄罗斯并进一步到欧洲的西部，感染了另外11个国家(OIE WAHIS https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/diseasehome)。2018年，在中国检测到首例ASFV疫情，并在2019年上半年经长距离迅速传播，抵达所有省份。进一步传播到亚洲的另外8个国家，导致全球风险增加，并扩大了疫情的经济影响。缺乏疫苗限制了控制ASFV的选择。尽管开发疫苗的努力正在加大，但是对病毒及其与宿主相互作用的了解不足阻碍了该过程。
ASFV主要在单核巨噬细胞谱系的细胞中复制，这些细胞表达分化中期到后期的典型标记物。通过操纵这些细胞的功能，病毒可以干扰并调节宿主对感染的应答。更好地了解这种相互作用将提供有关病毒免疫逃逸和发病机理的信息，从而为疫苗开发提供基础。进行这些研究的生物学相关细胞系的可用性将通过提供遗传同质细胞系来促进研究。此外，该细胞系将为生产用于ASFV的减毒活疫苗提供选择，并可替代原代巨噬细胞培养物用于诊断和病毒分离。在先建立的细胞系(包括Vero、Cos和WSL)已用于ASFV增殖，但需要病毒适应在这些细胞中的复制。这可以导致基因组修饰，这种修饰可以减少在猪巨噬细胞或猪中的复制。此外，这些已建立的细胞在如何应答感染中与巨噬细胞在许多重要方面是不同的。
ZMAC-4猪巨噬细胞系源自胎猪肺巨噬细胞。本发明人在此描述了实验，这些实验证实ASFV分离株在ZMAC-4细胞系中复制达到的水平与原代猪巨噬细胞相似，而且无需针对细胞系进行任何适应性步骤。此外，发明人表明，在ZMAC-4细胞中减毒活ASFV株OURT88/3的传代并未降低该病毒诱导猪抗毒性病毒OURT88/1攻击的100％保护的效力。这些发现表明，ZMAC-4细胞系为减毒活ASFV疫苗的研究、诊断和生产提供了合适的细胞系。
材料和方法
病毒和细胞
之前已经描述了OURT88/3和NH/P68基因I型非血细胞吸附减毒ASFV株、毒性株基因I型OURT88/1、Begin97/1、Georgia基因II型、Malawi LIL 20/1基因VIII型和中度毒性株Dominican Republic株。所使用的其它ASFV分离株可从Pirbright研究所的参考库中获得。这些病毒是从家猪的暴发中获得的，或者是从野外的蜱中分离的，并在原代猪骨髓细胞培养物中生长最多3代。
ZMAC-4细胞系源自猪胎儿的肺，由需要MCSF的存在才能生长的未转化的吞噬细胞组成。该细胞是寡克隆且稳定的，如由其在8个月的时间内成功传代75次以上而未表现出增殖能力下降的能力所证实。ZMAC-4细胞获自Aptimmune Biologics,Inc.或伊利诺伊大学。
流式细胞术
用于流式细胞术的ZMAC-4细胞悬浮液的染色包括在冰冷温度下于含有指定的mAb的PBS流(PBS，1.0％BSA，0.01％叠氮化钠)中孵育30分钟，其中每一步均通过PBS流进行一次洗涤来结束。最初，ZMAC-4细胞未经处理或分别暴露于下列识别指定的猪分子的单克隆抗体之一：CD14(biG 10/14)、CD163(2A10/11)、CD172(74-12-55)、CD203a(PM18-7)、PU.1(E.388.3)。然后，将细胞在含有与PE缀合的山羊抗小鼠Ig(Southern Biotech)、2％标准小鼠血清(Sigma)和100mg/ml小鼠IgG(Zymed Laboratories，Invitrogen)的PBS流中相继孵育。为了检测PU.1，将细胞用多聚甲醛固定并用如前所述的去污剂透化。为检测吞噬活性，将ZMAC-4细胞在2.00微米Fluoresbrite YG微球(Polysciences，Inc)存在下于培养基中在37℃孵育30分钟。作为对照，在1％叠氮化钠存在下使用相同的颗粒在冰冷的温度孵育ZMAC-4细胞。使用未暴露于微球的细胞检测该实验中的背景荧光。用LSR II流式细胞仪(BDBiosciences,San Jose,CA,USA)进行流式细胞术分析。使用FlowJo软件(Ashland,OR,USA)进行数据分析和图形表示的制备。
病毒感染和滴定
通过以下方式滴定ASFV：限定稀释猪骨髓细胞培养物，并如前所述，通过血细胞吸附测定法(HAD)或通过使用抗p30/pCP204L蛋白的单克隆抗体的免疫荧光法检测感染。如前所述，对ZMAC-4细胞中的ASFV生长进行评估。以Georgia 2007/1的感染复数(MOI)0.05进行感染，并且在不同的感染时间之后将细胞冷冻在-80℃。在对来自同一只猪的猪骨髓细胞进行平行滴定之前，将细胞进行两次冻融循环。如本文所述通过免疫荧光法获得表示为TCID50/ml(组织培养物感染剂量50％水平)的滴度，并且通过添加从肝素化猪血中收集的红细胞与接种物来获得HAD滴度。使用来自同一培养传代的细胞进行平行滴定(在三个重复孔中)。
病毒基因组检测
如前所述从EDTA中收集的全血或解剖后收集的组织中提取DNA，并且如前所述通过qPCR检测DNA。
动物实验
实验是在Pirbright研究所的SAPO4高密闭设施中进行的，并遵循1986年英国动物(科学程序)法的规定。实验中使用了来自健康状况良好的农场的8至9周大的大白猪(LargeWhite)和长白猪杂交猪(Landrace cross-bred pigs)(18至22kg)。
结果
ZMAC-4细胞的特征
现在参考图3中的A图，对ZMAC-4细胞的形态进行评估。用倒置相差显微镜使ZMAC-4细胞的活培养物成像。原始放大倍数为40倍。从形态上看，ZMAC-4细胞表现出丝状伪足和板状伪足的存在。现在参考图3中的B图，使用S型盒(type S cassette)通过Moxi Z仪器测定ZMAC-4细胞的平均细胞直径和体积。ZMAC-4细胞的平均细胞直径为15μM，平均细胞体积为1.7pL。该曲线表示对75000个细胞的分析。现在参考图3中的C图，对ZMAC-4细胞的吞噬活性进行评估。C图示出细胞的流式细胞分析结果，所述细胞未经处理(无珠粒)或者在1％叠氮化钠存在下于37℃或冰冷温度暴露于YG微球30分钟。ZMAC-4细胞的分析证实这种细胞是吞噬细胞。现在参考图3中的D图，其示出与特异于指定分子的抗体反应的原代猪肺泡巨噬细胞(上排)或ZMAC-4细胞(下排)的流式细胞术分析。ZMAC-4细胞均匀地表达猪肺泡巨噬细胞(PAM)的数种特征性表面标记物，包括CD14、CD163和CD172、AsGM1以及E-二十六(E26)家族转录因子PU.1。PU.1是一种在正常的髓样分化中起关键作用的E-二十六(E26)转化特异性家族转录因子。它在髓样细胞中最突出，并参与B细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞的发育和成熟。因此，PU.1的表达是巨噬细胞的标志。值得注意的是，ZMAC-4细胞似乎并不表达SWC9/CD203a。CD203a的缺乏可能表明ZMAC-4细胞不如原代肺泡巨噬细胞成熟。这是可以预期的，因为ZMAC-4细胞能够增殖，而原代肺泡巨噬细胞却不能。先前的结果表明，ZMAC-4细胞在对聚肌胞苷酸(polyIC)的应答中产生IFN-α，其动力学与PAM相似。因此，ZMAC-4细胞表现出PAM的许多典型特征。
ASFV在ZMAC-4细胞中复制达到的滴度与原代猪骨髓细胞相似。
为了测试ZMAC-4细胞感染ASFV野生株的易感性，将这些细胞中的感染与源自猪骨髓(PBM)的原代巨噬细胞培养物进行了比较。为了评估ASFV野生分离株的感染易感性，将来自基因I型、II型、VIII型的8种ASFV野生分离株(OURT88/3、NH/P68、Benin 1997/1、Georgia2007/1、Malawi LIL20/1、Tengani、MOZ 94/1、ZOM 2/84、Dominican Republic)的相同病毒原液在ZMAC-4和PBM细胞中一式三份进行平行滴定。表2中的结果表明，对于所有测试的分离株，ZMAC-4细胞中的滴定相比于PBM细胞中的滴定达到类似的水平。这些结果表明，对于感染，ZMAC-4细胞与原代猪巨噬细胞具有相似的易感性。
表2：在原代猪骨髓巨噬细胞和ZMAC细胞上的不同ASFV分离株的滴定
Figure BDA0002633331450000231
Figure BDA0002633331450000241
为确定与间接免疫荧光法(针对病毒早期蛋白P30-TCID50/ml)相比，在ZMAC-4细胞中通过血细胞吸附法(HAD/ml)进行滴定的有效性，在具有添加至培养基的红细胞的ZMAC-4细胞上平行滴定不同的ASFV野生分离株NH/P68、Georgia 2007/1和Benin 97/1。对于TCID50滴度，将细胞染色以用于P30早期病毒蛋白的免疫荧光检测，并在荧光显微镜下进行观察；为了确定表示为HAD50的滴度，将接种物与猪红细胞一起添加到细胞中，并在光学显微镜下筛查不同的稀释度下血细胞吸附花环的存在。接种后3天在显微镜下观察细胞，类似于先前的滴定。现在参考图4，筛查不同的接种物稀释度下血细胞吸附花环的存在，如表3中所示，获得的滴度证实使用两种滴定技术的结果相似，除了非血细胞吸附分离株NH/P68，其如预期的那样不引起血细胞吸附。该分离株在编码CD2v/EP402R的基因和C型凝集素/EP153R基因中存在中断，这解释了其非血细胞吸附表型。如图4所示，如通过免疫荧光法所估算的那样达到了高达80％的细胞感染率。
表3：通过间接免疫荧光法(TCID50)和血细胞吸附法(HAD50)的ASFV野生分离株在ZMAC细胞上的滴定
TCID50/ml HAD/ml
NH/P68 3.16x 10<sup>5</sup> 0
Georgia 2007/1 3.16x 10<sup>6</sup> 7.9x 10<sup>6</sup>
Benin 1988/1 3.16x 10<sup>7</sup> 1.83x10<sup>7</sup>
与PBM细胞相比的ZMAC-4细胞中ASFV复制的动力学
现在参考图5，在对PBM培养物和ZMAC-4培养物进行感染后，比较了ASFV子代的产量。图5中的y轴显示滴度，x轴显示感染后的小时数。将0.5ml培养基中的2x105个ZMAC细胞转移到5ml聚丙烯管(Corning 352063)中，并以0.001的MOI接种ASFV-Georgia。平行地，对每孔0.5ml培养基的24孔组织培养板中的PBM培养物也以相似的MOI进行接种。在两种细胞类型中均用相同的Georgia 2007/1病毒原液以低的MOI(0.05)进行感染，并在ZMAC-4细胞的0、24h、48h和72h以及PBM的0和72h监测病毒的生长。ZMAC-4细胞中的滴度逐渐增加并在72小时后达到PBM培养物的近似滴度(ZMAC-4中为1.47x107个/ml，PBM中为6.81x106个/ml)，证明ZMAC-4细胞对ASFV感染的高度易感性和病毒的有效产生。
现在参考图6，本发明人还评估了ZMAC-4培养物可以维持ASFV生长多长时间。图6中的y轴显示滴度，x轴显示感染后的天数。以低的MOI 0.05进行感染，并在五天的时间内用滴定法测定病毒子代产率。图6示出5天内ZMAC-4细胞中的ASF生长。接种后直至培养4天时子代滴度增加超过3个log单位(从1.48x104到6.76x107 HAD50/ml)，此时这样的滴度达到最大滴度，在第5天时略有下降(2.32x107 HAD50/ml)。因此，感染四天似乎是用ZMAC-4细胞获得最大病毒产率的最佳选择。
ASFV减毒活株OURT88/3在ZMAC-4细胞中传代不会降低在猪中对抗毒性ASFV攻击的保护性应答的诱导。
为了确定ASFV在ZMAC-4细胞中的传代是否改变猪中病毒的免疫原性，本发明人使用低的感染复数(MOI为0.1)将基因I型减毒株OURT88/3在ZMAC-4细胞中培养12代。每代回收的病毒的滴度相似。如下所述，用第12代后收获的病毒对猪进行免疫接种。
在IAH-Pirbright的SAPO4密闭室(containment)中，经肌肉内注射(IM)对从健康状况良好的农场获得的6只远系杂交猪的群组接种104 TCID50(组织培养感染剂量50％水平)的OURT88/3株。将一组(第1组)经肌肉内注射接种104 TCID50传代前的亲代OURT88/3分离株。在IAH-Pirbright的SAPO4密闭室中，将另一组(第2组)经肌肉内注射接种104 TCID50的OURT88/3分离株，该分离株已在ZMAC-4细胞中传代12代。每天监测猪的临床体征并根据发明人采用的标准进行评分(例如King K、Chapman D、Argilaguet JM、Fishbourne E、Hutet E等人，2011。Protection of European domestic pigs from virulent Africanisolates of African swine fever virus by experimental immunization.Vaccine29:4593-600)。在接种后第21天，用104 TCID50的毒性分离株OURT88/1经肌肉内攻击第1组和第2组的猪。还用毒性株OURT88/1攻击另一组(第4组)的三只未用OURT88/3免疫接种的对照猪(未处理的非免疫猪)。在用OURT88/1攻击前每周收集血液样品，在攻击后每间隔3天收集血液样品，用于通过qPCR测量病毒血症。在终止时进行解剖并收集组织样品。
现在参考图7，用ZMAC-4细胞中传代的OURT88/3免疫接种的猪(第2组)和第1组的猪经攻击后全都存活，并在被攻击后的16至18天之间进行安乐死。第1组和第2组的猪经免疫接种后的临床评分非常低。图7中的x轴显示攻击后的天数，y轴显示临床评分。现在参考图8，猪11在免疫接种后第3天的温度为40，在免疫接种后第15天的温度为40.2。没有观察到其它高于40.0℃的温度。在经攻击之后，猪7在被攻击后第3天的温度为41℃，在被攻击后第10天的温度为40.7。猪9在被攻击后第5天的温度为40。猪10在被攻击当天的温度为40.1，猪11在被攻击后第4天的温度为40.1，在被攻击后第5天的温度为40.5。直至在被攻击后第16至18天终止时，所有猪均存活。两只猪(9和11)出现皮肤肿胀或跛行，用抗生素治疗解决了这些问题。现在参考图9，对第1组和第2组猪进行的解剖检查没有发现肉眼可见的病变(即没有出血体征)，也没有ASF的典型脾脏肿大(参见图9的C和D)。
返回参考图8，与第1组和第2组猪相比，对照非免疫猪(第4组)在被攻击后第4天全都出现了高于40.5的温度，并伴有嗜睡和减少进食或无进食。此外，所有第4组猪的耳朵周围的皮肤都发红。现在参考图11，对第4组的所有猪(19、20和21)在被攻击后第5天进行安乐死。返回参考图7，第4组猪在感染后3至4天出现了典型的ASFV临床体征。返回参考图9，对第4组猪的解剖检查显示出急性ASFV的典型体征，包括数个淋巴结中出血(参见图9的A)和脾脏肿大和出血(参见图9的B)。
现在参考图10，y轴显示用ZMAC细胞中传代的OURT88/3免疫接种的猪在被毒性OURT88/1株攻击之前和之后的每毫升全血中基因组拷贝数的log 10标度(分别使用三角形、菱形、圆形、“x”和加号(“+”)标记7至12)。对照非免疫猪的水平示于其中(分别使用圆形、正方形和三角形标记C19、C20和C21)。x轴显示免疫接种后(PI)或攻击后(PC)的天数。返回参考图8，y轴显示经攻击后不同的免疫接种猪(分别使用三角形、菱形、圆形、“x”和加号(“+”)标记7至12)的直肠温度和对照非免疫猪(分别使用的圆形、正方形和三角形标记19-21)的直肠温度。
为了监测病毒的复制，如本文所述，在攻击前以每周的间隔并在攻击后以每3天的间隔收集血液样品，以通过qPCR测量病毒基因组的水平。现在参考图11，结果显示来自用ZMAC-4细胞中传代的OURT88/3免疫接种的组(第2组)的四只猪(7、8、9、10)在被攻击前血液中具有低的病毒基因组水平(每毫升为102至104之间的基因组拷贝数)。x轴表示免疫接种后或被攻击后的天数，y轴表示每毫升血液的病毒基因组拷贝数。误差棒显示4个技术重复的标准偏差。来自同一只猪的样品由实线连接。正方形表示第2组的猪，星形表示第1组的猪，三角形表示未用OURT88/3免疫接种的对照猪(第4组)。在被攻击后，4只猪具有可检测到的病毒基因组。在这些猪中，12只在被攻击后第3天具有105，所有其它阳性样品为103或更低。对来自脾脏和扁桃体的样品的分析发现，任一只经免疫接种和攻击的猪(第1组和第2组)的组织中均未检测到病毒基因组。相比之下，对照组(第4组)的猪在被攻击后第3天的血液中形成高的病毒水平(3至8x106TCID50/m)，在被攻击后第5天或第6天增至8x107至2x108TCID50/ml。对照猪(第4组)在终止时脾脏中也具有高的病毒基因组水平(每毫克5x103至2.7x104)。总之，在ZMAC-4细胞中传代的OURT88/3免疫接种的猪(第2组)均被保护免受毒性分离株OURT88/1的攻击。
讨论
在此，本发明人表明，ZMAC-4猪巨噬细胞系易受ASFV野生分离株感染，并且该病毒以与原代猪巨噬细胞中相似的动力学和相似的滴度复制。与使ASFV复制的体内靶细胞类似的猪巨噬细胞系的缺乏限制了对病毒宿主相互作用的研究，限制了减毒活疫苗的开发，并使病毒的诊断更加复杂。体内使得ASFV复制的主要靶细胞是单核细胞和巨噬细胞。在细胞培养中，表达分化中期和后期特征性标记物的那些细胞易受感染。尽管最初提出CD163是感染所需的，但随后的研究表明，不表达CD163的单核细胞也可被感染。缺少CD163的基因编辑猪完全易受感染。来自这些猪的单核细胞和巨噬细胞也易受感染，证明不需要CD163。合适的巨噬细胞系的可用性将通过提供细胞的遗传同源的来源避免与来自不同远系杂交猪的原代细胞相关的巨大变异，从而促进研究。也将促进旨在了解限制宿主细胞功能的病毒复制和病毒调节(包括逃避宿主防御)的宿主因子的研究。
重要的是，猪巨噬细胞系的可用性也可以代替对原代猪细胞的需求以进行病毒诊断和分离。本发明人表明，ZMAC-4细胞中病毒的滴定提供了与原代猪骨髓细胞相似的结果，并且用于确定病毒滴度的黄金标准血细胞吸附测定法和免疫荧光法均可用于这些细胞。因此，ZMAC-4细胞可以有效地替代原代巨噬细胞培养物用于ASFV感染。本发明人还证实，与在平行进行的研究中未经传代的OURT88/3病毒相比，或与OURT88/3以相同途径和剂量递送的其它实验相比，在ZMAC-4细胞中经过12次传代的减毒活ASFV株OURT88/3的子代并未增加在免疫接种后或被攻击后导致的临床体征或病毒血症。OURT88/3和数种其它野生ASFV株在ZMAC-4细胞中生长至高滴度，类似于在原代巨噬细胞中获得的那些滴度，而且无需适应性过程。这些结果共同证明，ZMAC-4细胞可替代原代巨噬细胞或其它细胞系用于ASFV诊断和疫苗生产。
尽管在前述附图和描述中详细地举例说明了本公开，但是这些附图和描述应被认为是示例性的而非限制性的，应理解仅示出和描述了本发明的示例性实施方案，而在本公开的精神之内的所有变化和修改均希望受到保护。

Claims (36)

1.一种用于产生非洲猪瘟(ASF)病毒子代的方法，所述方法包括:
提供能够使ASF病毒复制的分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞，其中所述细胞被培养至少5代；
将细胞暴露于ASF病毒；以及
使ASF病毒在细胞中复制；
从而产生ASF病毒子代。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞为ZMAC细胞或其衍生物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞选自ZMAC-1、ZMAC-4、具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
4.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括使细胞与生长因子组合物接触。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述生长因子组合物包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
7.一种用于制备ASF疫苗的方法，所述方法包括：
提供ASF病毒的经修饰活病毒(MLV)株；以及
使MLV株在分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞中生长，所述胎猪肺泡巨噬细胞能够使ASFMLV株复制。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞为原代细胞、细胞群、细胞系、或者其变体或衍生物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞为ZMAC细胞或其衍生物。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞选自ZMAC-1、ZMAC-4、具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
11.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括使细胞与生长因子组合物接触。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述生长因子组合物包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
13.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
14.一种用于使ASF病毒生长的方法，所述方法包括：
从猪胎肺分离胎猪肺泡巨噬细胞，包括：提供猪胎受试者，从所述受试者获得包含细胞的支气管肺泡灌洗样品，以及从所述样品中分离巨噬细胞；
培养细胞；以及
使细胞与ASF病毒接触，以使病毒复制；
从而使ASF病毒生长。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，培养包括使细胞传代至少5代、或进行至少10天的连续培养来使细胞生长、或它们的组合。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，培养包括使细胞与生长因子组合物接触。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述生长因子组合物包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述细胞获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞被培养至少10代。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞被培养至少20代。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞为细胞系。
22.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞为细胞系。
23.根据权利要求14所述的方法，其中，培养包括使细胞传代至少20代。
24.一种用于检测猪受试者中ASF病毒的存在的方法，所述方法包括：
提供能够使ASF病毒复制的分离或纯化的胎猪肺泡巨噬细胞，其中所述细胞被培养至少5代；
使细胞与样品接触；
在合适的条件下孵育细胞；以及
检测细胞中ASF病毒的存在。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述细胞为ZMAC细胞或其衍生物。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述细胞选自ZMAC-1、ZMAC-4、具有美国典型培养物保藏中心指定的ATCC专利保藏编号PTA-8764的保藏细胞、和前述任一者的衍生物。
27.根据权利要求24所述的方法，所述方法进一步包括使细胞与生长因子组合物接触。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述生长因子组合物包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
29.根据权利要求24所述的方法，其中，所述细胞获自胎龄为约30天至约90天的猪胎受试者。
30.根据权利要求24所述的方法，其中，所述样品选自血液、血清、血浆、淋巴、唾液、鼻分泌物、粪便、尿液、精液、痰、脑脊液、泪液、粘液、汗液、乳汁和组织细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述组织细胞选自胸腺、淋巴结、脾脏、骨髓和扁桃体。
32.根据权利要求24所述的方法，其中，检测包括使用血细胞吸附测定法或免疫荧光法。
33.一种疫苗，其包含在载体中的权利要求1所述的ASF病毒子代。
34.根据权利要求33所述的疫苗，其进一步包含佐剂。
35.一种在猪中诱发抗ASFV免疫应答的方法，所述方法包括向猪施用有效量的权利要求33所述的疫苗。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，施用途径选自肠胃外、口服、鼻内和粘膜施用。
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