CN105754928A - 一种对虾胚胎细胞的分离与培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明建立一种有效的对虾胚胎细胞解离与培养技术，并将其应用于对虾胚胎细胞建系研究。本发明优化了对虾胚胎的无菌消毒处理技术，可直接从对虾育苗厂收集虾卵，运回实验室后处理，尤其是碘伏的处理浓度的优化，既保证有效控制微生物和原生动物的污染，又最大程度降低碘伏对胚胎的毒性；优化了对虾完全培养基的配方，为对虾胚胎细胞的贴壁和生长提供了更合适的营养条件，贴壁更快，生长更好，同时简化了培养基的配方，降低了培养基的成本；采用由适当孔径不锈钢滤网制作的胚胎细胞收集器，捣碎对虾胚胎的方法，可在短时间内获得大量活的胚胎细胞和细胞团，操作简便快速，仅用数秒，不易污染，效果远超已报道的其它解离方法。

Description

一种对虾胚胎细胞的分离与培养方法

技术领域

本发明属于动物细胞、组织培养技术领域，具体涉及一种对虾胚胎细胞的无菌分离与体外培养方法。

背景技术

对虾病毒病的频繁爆发已给对虾养殖业带来了沉重打击，成为制约对虾养殖业可持续发展的瓶颈问题。对虾永生化细胞系的建立可为对虾病毒的分离纯化、研究其致病机理、生产高效的抗病毒疫苗或药物等提供有效的研究手段和载体。虽然国内外专家学者在对虾细胞建系上进行了大量的探索和努力，但由于对虾成体组织来源的体外培养细胞不分裂，难以被转化，其永生化细胞系一直未能成功建立。而早期胚胎由于具有活跃增殖能力和多分化潜能，是对虾细胞建系的良好组织来源。但是，对虾受精卵为均黄卵，完全卵裂，其早期胚胎细胞的分离与培养困难，且极易污染，因而有关对虾胚胎细胞培养方面的研究报道很少。最早于1996年，童裳亮等、Toullec等和Frerichs分别报道了中国对虾、印度对虾和罗氏沼虾的胚胎细胞培养结果。童裳亮等在中国对虾胚胎细胞培养上的尝试因微生物和原生动物的严重污染而失败。Toullec等以印度对虾16-细胞期胚胎为材料，采用M199培养基和药物处理去除受精膜的解离方法，成功得到贴壁生长的原代培养胚胎细胞，但细胞单层只维持了2周。Frerichs以罗氏沼虾7-13天胚胎为材料，采用M199培养基和研磨法，也成功得到贴壁生长的原代培养胚胎细胞，但未形成连续性单层，并且机械法传代后，细胞不再贴壁。6年后，樊廷俊等(2002)采用添加了生长因子(bFGF和IGF-II)的MPS培养基和研磨法，培养得到了中国对虾胚胎细胞连续性单层，但未见后续建系成功的报道，其结果也没有被他人重复出来。7年后，余黎明等(2009)探索了中国明对虾囊胚和原肠胚细胞的解离和培养方法，发现解剖法适用于分离囊胚细胞，血球计数板压片法适于分离原肠胚细胞，所培养的胚胎细胞单层可体外维持1-5周，但未见明显增殖。解剖法和压片法操作起来效率很低，极易污染，而研磨法、过筛法和过针法均不能得到足够多的活细胞。可见，今后要实现对虾胚胎细胞的体外长期培养，以至建系成功，亟需建立有效的对虾胚胎细胞的解离与培养方法以及无菌操作技术。

发明内容

本发明的目的是建立一种有效的对虾胚胎细胞解离与培养技术，并将其应用于对虾胚胎细胞建系研究。

本发明首先提供一种对虾早期胚胎的清洗方法，具体步骤如下：用吸管收集对虾胚胎至离心管中，无菌海水洗涤5-6次，弃除死亡胚胎和杂质颗粒；将胚胎转移到70目不锈钢滤网中，淘洗数次后，流水连续冲洗1-2h，然后用10％碘伏处理5-10分钟，去除细菌和真菌等微生物的污染；75％酒精短暂漂洗20-30秒，去除碘伏；然后依次用添加有2000IU/mL青霉素和链霉素的无菌海水和PBS充分漂洗，去除酒精；最后暂存于对虾基础培养基中。

上述无菌海水的制备方法：天然海水依次经过16-20层纱布和0.22μm滤膜过滤后，高压蒸汽灭菌20分钟。

上述PBS溶液的配制方法：分别称取8.0gNaCl，0.2gKCl，3.0gNa₂HPO₄·12H₂O和0.2g的KH₂PO₄溶于1L纯水中，溶解，用3MNaOH调节pH值至7.2～7.4，121℃高压灭菌20分钟，分装后4℃保存备用。

上述对虾基础培养基的制备方法：在1升超纯水中溶解20.55gL-15培养基、5gNaCl、2g葡萄糖、1gNaHCO₃、0.01g牛磺酸、0.01g脯氨酸、1.0×10⁵IU青霉素钠和100mg硫酸链霉素,调节pH值至7.2-7.4，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。

本发明还涉及一种不锈钢滤网捣碎法分离对虾胚胎细胞的方法。具体步骤：将保存的对虾胚胎转移到已灭菌的研钵内，弃除多余培养基；用已灭菌的胚胎细胞收集器(专利号：201420430124.9)的弧形不锈钢滤网挤压对虾胚胎来捣碎受精膜，使胚胎细胞游离出来；取新鲜的对虾基础培养基，冲洗不锈钢滤网，收集所有胚胎细胞和细胞团，用对虾基础培养基，沉降法洗涤1-2次，至澄清透明，最后用对虾完全培养基悬浮胚胎细胞和细胞团，接种至培养瓶或培养板中。

上述对虾完全培养基的配制方法：每升上述对虾基础培养基中，添加8％胎牛血清、20μg碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和20μg表皮生长因子(EGF)，pH7.2-7.4。用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。

本发明还涉及一种对虾胚胎细胞的培养方法，具体步骤：将对虾胚胎细胞悬液接种到培养瓶或培养板中，于28℃，3％CO₂培养箱中静置培养。每天观察细胞贴壁生长情况，根据培养基颜色变化，每2天更换1/2培养基。

本发明还涉及一种对虾胚胎细胞的传代方法，具体步骤：用4℃PBS洗涤细胞单层，然后用非哺乳动物来源的消化酶HyQTase消化至细胞脱壁，然后加入对虾完全培养基重悬细胞，离心洗涤1次，接种传代。

本发明的优点在于：优化和建立了对虾胚胎的无菌消毒处理技术，可直接从对虾育苗厂收集虾卵，运回实验室后处理，尤其是碘伏的处理浓度的优化，既保证有效控制微生物和原生动物的污染，又最大程度降低碘伏对胚胎的毒性，实现100％无菌成功率；优化了对虾完全培养基的配方，为对虾胚胎细胞的贴壁和生长提供了更合适的营养条件，贴壁更快，生长更好，同时简化了培养基的配方，降低了培养基的成本；采用由适当孔径不锈钢滤网制作的胚胎细胞收集器，捣碎对虾胚胎的方法，可在短时间内获得大量活的胚胎细胞和细胞团，操作简便快速，仅用数秒，不易污染，效果远超已报道的其它解离方法。

附图说明

图1:对虾胚胎冲洗装置示意图。

图2：四种对虾胚胎细胞分离方法示意图。A：不锈钢滤网捣碎法；B：细胞筛过滤法；C：研磨棒捣碎法；D：匀浆法。1：研钵；2：60-70目不锈钢滤网；3：200目尼龙细胞筛；4：50mL离心管；5：20mL注射器软塞；6：1.5mL离心管；7：研磨棒；8：组织研磨器。

图3四种物理方法解离日本囊对虾早期胚胎细胞后0-48h的培养结果。A：对虾肢芽期胚胎；B和B1：匀浆法；C、C1和C2：研磨棒捣碎法；D、D1和D2：200目筛过滤法；E、E1和E2：不锈钢滤网捣碎法。

图4不锈钢滤网破碎法分离得到的日本囊对虾胚胎细胞接种后3-48h的培养结果。A：原代培养3h、B：原代培养24h；C：原代培养36h；D：原代培养48h。

图5日本囊对虾胚胎细胞于对照培养基中的培养结果。该对照培养基中添加有10％对虾肌肉提取液和15％胎牛血清。A：原代培养3h、B：原代培养24h。

图6日本囊对虾早期胚胎细胞体外培养3-20天的结果。A：原代培养3d、B：原代培养5d；C：原代培养7d；D：原代培养10d；E：原代培养15d；F：原代培养20d。

图7对虾原代培养胚胎细胞的分化。A：成纤维样细胞(F)的分化；B：上皮样细胞(E)的分化；C：神经样细胞(N)的分化；D：心肌细胞(M)的分化。

图8日本囊对虾胚胎细胞的传代培养结果。A：传代前原代培养胚胎细胞；B：4℃PBS和HyQTase消化法传代后贴壁生长的胚胎细胞。

具体实施方式

为更好地解释本发明，以日本囊对虾的胚胎细胞分离与培养为例，进一步阐释本发明的主要内容：

实施例1日本囊对虾早期胚胎的清洗和消毒处理技术。

具体步骤如下：

(1)灭菌海水的制备：新鲜的天然海水依次经过16-20层纱布和0.22μm滤膜过滤后，高压蒸汽灭菌20分钟，冷却后备用。

(2)对虾早期胚胎的取材：从对虾育苗场收集产卵后6-8h的肢芽期胚胎，海水温度28-30℃，装入塑料袋中，充氧，扎紧袋口，置于泡沫箱中，运回实验室。

(3)对虾胚胎的收集：静置几分钟，待虾卵沉降到底部后，用塑料吸管将对虾胚胎收集到50mL离心管中，灭菌海水冲洗5-6次，在冲洗过程中将悬浮死亡的胚胎及杂质颗粒吸出。

(4)对虾胚胎的洗涤：将胚胎转移到底部为70目不锈钢滤网中，对胚胎进行淘洗3-5次，然后流水反复冲洗1-2h，去掉藻类、浮游动物和原生动物等的污染，冲洗过程中确保每枚胚胎完全重悬在灭菌海水中。胚胎冲洗装置如附图1所示。

(5)对虾胚胎的消毒处理：流水冲洗完毕，于超净工作台中，将对虾胚胎转移到10％碘伏消毒液中消毒处理5-10分钟，去除细菌和真菌等微生物的污染，期间不断用无菌吸管反复吹吸胚胎，以确保每枚胚胎完全浸没在消毒液中。随后将胚胎完全浸入75％酒精中短暂漂洗20-30秒，去除碘伏，然后依次用2000IU/mL双抗(青霉素和链霉素)的无菌海水和PBS充分漂洗，去除酒精；最后暂存于对虾基础培养基中。

该法可有效控制微生物、藻类、原生动物和浮游动物等的污染，可实现100％无菌成功率，而且对虾胚胎可以很好地耐受碘伏和酒精的处理，保持活性。

上述对虾基础培养基的制备方法：1升超纯水中溶解20.55gL-15培养基、5gNaCl、2g葡萄糖、1gNaHCO₃、0.01g牛磺酸、0.01g脯氨酸、1.0×10⁵IU青霉素钠和100mg硫酸链霉素,调节pH值至7.2-7.4，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。

上述PBS溶液的配制方法：分别称取8.0gNaCl，0.2gKCl，3.0gNa₂HPO₄·12H₂O和0.2g的KH₂PO₄溶于1L纯水中，溶解，用3MNaOH调节pH值至7.2～7.4，121℃高压灭菌20分钟，分装后4℃保存备用。

实施例2日本囊对虾胚胎细胞的最佳解离方法的筛选。

对虾的胚胎外层有受精膜举起形成的卵壳，以保护胚胎免受外界环境的伤害。要想获得分散的早期胚胎细胞，就要破碎其外层弹性坚韧的卵壳。由于对虾受精卵为均黄卵，完全卵裂，其早期胚胎细胞的分离与培养困难。本发明比较了4种物理解离方法的分离与培养效果，如附图2-3所示，发现不锈钢滤网捣碎法的分离效果最好，可得到大量活的完整的胚胎细胞和细胞团。

(1)不锈钢滤网捣碎法：将无菌处理过的对虾胚胎转移到已灭菌的研钵内，弃除多余培养基；手持已灭菌的胚胎细胞收集器(专利号：201420430124.9)，该工具的前端为一外凸弧形不锈钢滤网，网孔直径稍小于虾卵直径，垂直挤压对虾胚胎多次，捣碎卵壳，使胚胎细胞游离出来；取对虾基础培养基，冲洗不锈钢滤网的内外壁，收集所有胚胎细胞和细胞团，用对虾基础培养基，沉降法洗涤1-2次，至澄清透明，最后用对虾完全培养基悬浮胚胎细胞和细胞团，接种至培养瓶或培养板中静置培养。

(2)细胞筛过滤法：用无菌注射器软塞挤压平铺于200目细胞筛上的胚胎，用完全培养基冲洗细胞筛，使胚胎细胞从筛孔中滤过，收集滤过的细胞悬液接种到培养瓶或培养板中静置培养。

(3)研磨棒捣碎法：用研磨棒的粗头挤压1.5mL离心管底部的胚胎，捣碎至无完整胚胎颗粒。用对虾完全培养基重悬后，接种至培养瓶或培养板中静置培养。。

(4)匀浆法：将无菌处理过的对虾胚胎转移到1.5mL离心管底，组织匀浆器2000rpm匀浆3min，至无完整胚胎颗粒即停止匀浆。将组织匀浆液转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液，将沉淀重悬于对虾完全培养基中，接种至培养瓶或培养板中静置培养。

上述对虾完全培养基的配制方法：每升上述对虾基础培养基中，添加8％胎牛血清、20μg碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和20μg表皮生长EGF，pH7.2-7.4。用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。与专利：“一种对虾细胞培养基”(专利号：ZL201310162351.8)相比，本发明所涉及的对虾完全培养基的配方中，不添加任何对虾肌肉提取液，降低胎牛血清的添加量为8％，而不是15％。

胚胎细胞的解离结果如图3所示，只有不锈钢滤网捣碎法可获得大量的单个细胞和细胞团，细胞状态好，贴壁率和成活率高，可形成细胞单层，寿命长，体外可存活23天左右。而细胞筛过滤法可获得单个细胞，但不能获得细胞团，分离得到的单个细胞数量有限且贴壁能力变差，不能形成细胞单层。研磨棒捣碎法可分离得到单个细胞和细胞团，但细胞状态差，不能形成细胞单层。组织匀浆法则不能获得活的细胞。

实施例3日本囊对虾胚胎细胞的培养方法。

具体步骤：将对虾胚胎细胞悬液接种到培养瓶或培养板中，于28℃，3％CO₂培养箱中静置培养。每天观察细胞贴壁生长情况，根据培养基颜色变化，每2天更换1/2培养基。

如附图4所示，不锈钢滤网捣碎法分离得到的胚胎细胞和细胞团自接种后2-3小时即可贴壁生长，细胞变得细长并铺展开，明显观察到大量卵黄颗粒的存在，细胞表现出明显的生长趋势。48小时后相邻大的细胞团中贴壁生长的细胞间相互接触，达到半汇聚状态，此时卵黄颗粒量明显减少。

本发明所提供的对虾完全培养基对是否添加对虾肌肉提取液以及胎牛血清的添加量进行了优化，发现不添加对虾肌肉提取液，同时降低胎牛血清的添加量(8％)，更有利于对虾胚胎细胞和细胞团的贴壁与生长。附图5中所用的对照培养基为专利：“一种对虾细胞培养基”(专利号：ZL201310162351.8)所涉及的对虾完全培养基。从附图4中可见，接种后2-3h，胚胎细胞和细胞团都已贴壁生长。而附图5中，接种后2-3h，仅有单个的胚胎细胞贴壁，细胞团尚未贴壁，仍然悬浮。而且24h后，附图5中细胞迁出的数量也明显比附图4中的少。可见，本发明所提供的对虾完全培养基更利于对虾胚胎细胞的贴壁和生长，同时简化了培养基的配方，降低了培养基的成本。

如附图6所示，在细胞培养第3天开始出现具有节律收缩功能的细胞，且节律性的收缩可持续一周左右，之后细胞便维持静止状态直至细胞凋亡。待胚胎细胞培养至第5天时可达到70％-80％的汇聚状态，但是增殖不明显。当细胞培养至第20天时，细胞贴壁能力较早期培养的细胞显著降低，部分细胞颜色加深并呈现空泡化，细胞数量明显减少，组织碎片和黑色点状物增多，随后细胞凋亡。

如附图7所示，日本囊对虾早期胚胎细胞可在体外连续培养20天以上，但接种后第3天可观察到细胞分化现象。主要有3种类型分化细胞：成纤维样细胞、上皮样细胞和神经样细胞。其中，部分成纤维样细胞在接种后的第3天开始具有节律性收缩功能，这种节律性的收缩可持续一周左右，之后细胞便恢复到静止状态，直至细胞凋亡。

实施例4日本囊对虾胚胎细胞的传代培养技术。

具体步骤：

(1)日本囊对虾早期胚胎细胞培养至第5天，当细胞长成单层(细胞汇合度为70％-80％)时，向25-cm²细胞培养瓶中加入1mL4℃PBS孵育30sec左右吸出。

(2)加入1mLHyQTase消化液消化4min，显微镜下观察直至80％左右的细胞收缩变圆时终止消化。立即向细胞培养瓶中加入4mL对虾细胞培养基，反复吹打几次，收集细胞悬液，1300rpm，离心5min，用新鲜对虾完全培养基重悬细胞，接种到新的细胞培养瓶中。

(3)将细胞培养瓶置于28℃，3％CO₂培养箱中进行培养。

如附图8所示，用冷PBS结合非哺乳动物来源的消化酶HyQTase进行传代时，得到较好的传代效果。HyQTase原液作用于单层细胞5分钟，可将大约90％以上的细胞从细胞培养瓶中消化下来，接种到新瓶后细胞能贴壁生长。

Claims (9)

1.一种对虾胚胎的清洗方法，其特征在于，所述的方法是用吸管收集对虾胚胎至离心管中，无菌海水洗涤5-6次，再将胚胎转移到70目不锈钢滤网中，淘洗数次后，流水连续冲洗1-2h，然后用10％碘伏处理5-10分钟，再用75％酒精漂洗20-30秒去除碘伏；然后依次用添加有2000IU/mL青霉素和链霉素的无菌海水和PBS漂洗去除酒精；最后暂存于对虾基础培养基中。

2.如权利要求1所述的清洗方法，其特征在于，所述的无菌海水是将天然海水依次经过16-20层纱布和0.22μm滤膜过滤后，高压蒸汽灭菌制成的。

3.如权利要求1所述的清洗方法，其特征在于，所述的PBS溶液的配制方法如下：分别称取8.0gNaCl，0.2gKCl，3.0gNa₂HPO₄·12H₂O和0.2g的KH₂PO₄溶于1L纯水中，溶解，用3MNaOH调节pH值至7.2～7.4，121℃高压灭菌20分钟，分装后4℃保存备用。

4.如权利要求1所述的清洗方法，其特征在于，所述的对虾基础培养基的制备方法如下：在1升超纯水中溶解20.55gL-15培养基、5gNaCl、2g葡萄糖、1gNaHCO₃、0.01g牛磺酸、0.01g脯氨酸、1.0×10⁵IU青霉素钠和100mg硫酸链霉素,调节pH值至7.2-7.4，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。

5.一种分离对虾胚胎细胞的方法，其特征在于，所述的方法是将权利要求1所述的清洗方法保存的对虾胚胎转移到已灭菌的研钵内，弃除多余培养基；用已灭菌的胚胎细胞收集器的弧形不锈钢滤网挤压对虾胚胎来捣碎受精膜，使胚胎细胞游离出来；然后取新鲜的对虾基础培养基，冲洗不锈钢滤网，收集所有胚胎细胞和细胞团，再用对虾基础培养基，沉降法洗涤1-2次，至澄清透明，最后用对虾完全培养基悬浮胚胎细胞和细胞团，接种至培养瓶或培养板中。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的对虾基础培养基的制备方法如下：在1升超纯水中溶解20.55gL-15培养基、5gNaCl、2g葡萄糖、1gNaHCO₃、0.01g牛磺酸、0.01g脯氨酸、1.0×10⁵IU青霉素钠和100mg硫酸链霉素,调节pH值至7.2-7.4，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的对虾完全培养基的配制方法如下：每升上述对虾基础培养基中，添加8％胎牛血清、20μg碱性成纤维细胞生长因子和20μg表皮生长因子，pH7.2-7.4；用0.22μm微孔滤膜过滤除菌完成制备。

8.一种对虾胚胎细胞的培养方法，其特征在于，所述的培养方法是将权利要求5所述方法分离的对虾胚胎细胞悬液接种到培养瓶或培养板中，于28℃，3％CO₂培养箱中静置培养；每2天更换一半体积的培养基。

9.一种对虾胚胎细胞的传代方法，其特征在于，所述的传代方法是用4℃的PBS洗涤细胞单层，然后用非哺乳动物来源的消化酶HyQTase消化至细胞脱壁，然后加入对虾完全培养基重悬细胞，离心洗涤1次，接种传代。