CN112626008B - 一种用于培养肉种子细胞短期增殖的改良培养基 - Google Patents

一种用于培养肉种子细胞短期增殖的改良培养基 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于培养肉种子细胞体外短期增殖的改良培养基，即加快培养肉目前最有潜力的种子细胞—肌肉干细胞体外短期培养的增殖速度。改良后的培养基为添加有水溶性维生素E的细胞增殖培养基，采用改良的增殖培养基细胞在体外短期培养时增殖速度显著提高，细胞数量上是正常培养基的1.2倍；采用添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基培养的细胞在分化培养基中诱导分化，能够显著提高细胞的分化能力、产生更多的肌肉蛋白。因此，改良的增殖培养基可以帮助在体外短期获得较多数量的培养肉种子细胞，对于培养肉的生产起到了极有利的作用。

Description

一种用于培养肉种子细胞短期增殖的改良培养基
技术领域
本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域，具体地，涉及一种用于培养肉种子细胞体外短期增殖的改良培养基。
背景技术
随着经济发展以及人口膨胀，传统的肉类生产方式越来越难满足人类的肉类需求，与此同时传统畜牧业面临着诸多的挑战，如造成环境污染以及动物福利问题等。因此我们需要高效、环保的新型肉类生产方式，培养肉技术的诞生在未来可以满足人类对肉类的需求。细胞培养肉是指利用细胞培养工程和组织工程等技术，在体外培养动物肌肉组织作为食用材料，它不依赖动物养殖，直接通过细胞工厂化生产肉类，根据测算，相较于传统的畜牧业，培养肉产业能减少35％到60％的能耗、少占用98％的土地和少产生80％以上的温室气体。
培养肉生产过程中其中最重要的一部分就是需要在体外获得大量具有分化成熟形成多核肌纤维能力的种子细胞，在目前的研究中，肌肉干细胞是培养肉种子细胞选择中的最具有潜力的一种细胞，肌肉干细胞经体外分离后可以在体外进行培养，定向分化形成多核肌细胞，并表达肌肉特有的肌球蛋白重链。
发明内容
本发明的目的是加快肌肉干细胞在体外短期培养过程的增殖速度，提供一种有利于肌肉干细胞体外短期培养的培养基。
本发明的第一个目的是提供一种提高肌肉干细胞体外短期培养过程中增殖能力的改良增殖培养基，所述改良增殖培养基为添加有水溶性维生素E的细胞增殖培养基。
本发明所述的“短期培养”是指，某一代细胞细胞在体外培养三天。
本发明所述的“vol％”是指体积百分比。
进一步的，所述细胞增殖培养基包括79vol％常规细胞培养基、20vol％胎牛血清、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2；
优选的，所述常规细胞培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。
优选的，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。
进一步的，所述改良增殖培养基中，水溶性维生素E浓度为50-200μmol/L；优选的，水溶性维生素E浓度为50-100μmol/L.
本发明的第二个目的是提供前述的改良增殖培养基体在提高肌肉干细胞体外短期培养过程中增殖能力和/或维持肌肉干细胞体外短期培养过程中分化潜能中的应用，具体的，采用前述改良增殖培养基对肌肉干细胞进行体外短期培养。
优选的，所述的改良生长培养基体能够提高肌肉干细胞体外短期培养过程中的增殖速度。
本发明的第三个目的是提供水溶性维生素E在在提高肌肉干细胞体外短期培养过程中增殖能力和/或维持肌肉干细胞体外短期培养过程中分化潜能中的应用，具体的，为采用添加有水溶性维生素E的细胞增殖培养基对肌肉干细胞进行体外短期培养。
优选的，所述的水溶性维生素E能够提高肌肉干细胞体外短期培养过程中的增殖速度。
进一步的，所述细胞增殖培养基包括79vol％常规细胞培养基、20vol％胎牛血清、1vol％的青霉素链霉素双抗以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2；
优选的所述常规细胞培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。
进一步的，所述水溶性维生素E在细胞增殖培养基中的浓度为50-200μmol/L，优选的，水溶性维生素E浓度为50-100μmol/L。
本发明的第四个目的是提供一种同时提高肌肉干细胞体外短期培养过程中的增殖能力和分化潜能的方法，所述方法包括以下步骤：
S1：采用前述的改良增殖培养基对肌肉干细胞进行体外扩大培养，获得肌肉干细胞；
S2：将S1得到的肌肉干细胞移入分化培养基中进行诱导分化，获得肌肉细胞。
进一步的，分化培养基为添加有水溶性维生素E的细胞分化培养基；优选的，所述分化培养基包括2vol％马血清、97vol％常规细胞培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液，100μmol/L的水溶性维生素E。
优选的，所述常规细胞培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。
优选的，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。
采用本发明的改良增殖培养基，通过水溶性维生素E的添加，在体外短期培养中加快了肌肉干细胞增殖速度，并且了维持肌肉干细胞细胞的分化潜能，并且采用本申请设计的改良增殖培养基培养的细胞在分化培养基中诱导分化，能够进一步提高细胞分化能力，增加了肌肉蛋白的产生，从而实现加快肌肉干细胞体外短期培养过程中的增殖速度、提高分化能力。
前述添加有水溶性维生素E的细胞增殖培养基在肌肉干细胞体外短期培养以及诱导分化的过程中维持干性的研究，包括以下步骤：
将猪肌肉干细胞分别接种到常规增殖培养基、添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基的细胞培养皿中，并进行3天的换液传代培养，收集细胞进行细胞计数。
将猪肌肉干细胞分别接种到含有添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基、常规增殖培养基的分化培养皿中进行增殖，增殖五天后，将添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基、常规培养基换成分化培养基诱导分化。
进一步的，所述改良增殖培养基为20vol％胎牛血清、79vol％F10培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2，以及水溶性维生素E，水溶性维生素E浓度为50-200μmol/L，优选的，水溶性维生素E浓度为50-100μmol/L。
进一步的，所述分化培养皿为预涂了10-200μg/ml基质胶的3.5cm培养皿，分化培养基为2vol％马血清、97vol％DMEM培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液、100μmol/L的水溶性维生素E。
进一步的，本发明所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量均为10000U/ml，链霉素的含量均为10mg/ml。
所述的添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基在体外短期培养肌肉干细胞，可加快在体外短期培养过程中肌肉干细胞体外增殖速度。
所述的添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基在体外短期培养的肌肉干细胞，在体外诱导分化时具有更好的分化潜能，说明采用本发明提供的添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基，能够提高肌肉干细胞分化潜力，获得更多的肌肉蛋白。
本发明技术方案所实现的有益效果为：
细胞培养肉的生产首先需要在体外获得大量具有功能的肌源性细胞、并且在体外获得的肌源性细胞在体外诱导分化的过程中需要得到更多的肌球蛋白重链，但是在正常的含有20％胎牛血清的F10培养基中肌肉干细胞增殖速度慢，因此需要开发一种加快肌肉干细胞在体外培养过程增殖速度的培养基。
本发明发现，添加有水溶性维生素E的细胞增殖培养基可以加快体外短期培养中肌肉干细胞的增殖速度，细胞扩增倍数上比正常细胞培养基培养的肌肉干细胞多扩增1.2倍以上；另外，利用添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基培养的细胞在分化培养基中诱导分化，可以增加肌肉干细胞产生的肌肉蛋白、显著提高了肌肉干细胞在体外诱导分化的能力。
采用本发明的改良增殖培养基，通过水溶性维生素E的添加，能够在体外短期培养中加快肌肉干细胞增殖速度。
进一步的，将获得的肌肉干细胞在分化培养基诱导分化，能够进一步增加细胞分化能力，增加了肌肉蛋白的产生，从而实现同时提高肌肉干细胞体外短期培养过程中的增殖能力和分化能力。
附图说明
图1为对照细胞增殖培养基、添加有不同浓度水溶性维生素E的细胞增殖培养基短期培养的肌肉干细胞的扩增倍数；
图2为常规细胞增殖培养基、添加有50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的水溶性维生素E的改良增殖培养基对表征肌肉干细胞分化潜能的干性基因“Pax7”的影响，图中“P”表示肌肉干细胞分化进程的增殖阶段，“D”表示肌肉干细胞分化进程中的分化阶段，“+”表示添加有水溶性维生素E，“-”表示不添加水溶性维生素E；
图3为添加有100μmol/L的水溶性维生素E的改良增殖培养基、常规增殖培养基培养细胞诱导分化后在终末分化时对分化标志基因MYHC-2a表达的影响，图中“P”表示肌肉干细胞分化进程的增殖阶段，“D”表示肌肉干细胞分化进程中的分化阶段，“+”表示添加有水溶性维
生素E，“-”表示不添加水溶性维生素E。
具体实施方式
下述实施例中采用的细胞培养基，为添加有水溶性维生素E的细胞增殖培养基和分化培养基，其他方面与正常肌肉干细胞体外培养方法一致。
下述实施例中采用的常规增殖培养基，配方为20vol％胎牛血清、79vol％F10培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗以及10ng/ml成纤维细胞生长因子2。
下述实施例中采用的改良增殖培养基，配方为20vol％胎牛血清、79vol％F10培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗以及10ng/ml成纤维细胞生长因子2与水溶性维生素E。
下述实施例中所述分化培养皿为预涂了10-200μg/ml基质胶的3.5cm培养皿。
下述实施例中采用的常规分化培养基，配方为2vol％马血清、97vol％DMEM培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗、100μmol/L水溶性维生素E。
青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量均为10000U/ml，链霉素的含量均为10mg/ml。
下述实施例中采用的细胞为幼猪肌肉干细胞，进一步的为贴壁细胞。
下述实施例中采用的培养条件皆为CO2培养箱中37℃培养，CO2的浓度皆为5％(v/v)。
下述实施例中采用的检测方法，除非另外说明，否则都是领域内公开的实验方法、检测方法和制备方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1猪肌肉干细胞体外短期培养增殖能力检测：
1)肌肉干细胞短期培养：本实施例分为4组，分别为常规增殖培养基对照组、水溶性维生素E浓度为50μmol/L的改良增殖培养基组实验组，水溶性维生素E浓度为100μmol/L的改良增殖培养基组实验组，水溶性维生素E浓度为200μmol/L的改良增殖培养基组实验组。将猪肌肉干细胞按1.5×105/dish接种到常规增殖培养基、改良增殖培养基的10cm培养皿中培养并两天进行换液，三天用0.25％的胰酶消化，血细胞计数板进行计数。
2)结果显示：所述的添加水溶性维生素E的改良增殖培养基短期培养的肌肉干细胞可以加快肌肉干细胞在短期增殖中的扩增速度，当水溶性维生素E浓度为50μmol/L时细胞扩增倍数为对照组的1.26倍，差异显著，当水溶性维生素E浓度为100μmol/L时细胞扩增倍数为对照组的1.22倍，差异显著，当水溶性维生素E浓度为200μmol/L时细胞扩增倍数为对照组的1.07倍，显示水溶性维生素E的浓度为50-100μmol/L时，能够有效提高干细胞扩增速度(图1)。
实施例2肌肉干细胞分化潜能检测
取实例1中常规增殖培养基对照组、水溶性维生素E浓度为50μmol/L的改良增殖培养基组实验组、水溶性维生素E浓度为100μmol/L、水溶性维生素E浓度为200μmol/L的改良增殖培养基组实验组培养的细胞，提取其中的RNA，利用q-pcr技术分别检测改良增殖培养基与常规增殖培养基培养的细胞表征分化潜能的干性基因“Pax7”的基因表达量。
结果显示：所述的添加水溶性维生素E的改良增殖培养基短期培养的肌肉干细胞可以维持其分化潜能，当水溶性维生素E浓度为50μmol/L时Pax7的表达量为对照组的1.35倍，当水溶性维生素E浓度为100μmol/L时Pax7的表达量为对照组的1.65倍，差异显著，当水溶性维生素E浓度为200μmol/L时Pax7的表达量为对照组的2.11倍，差异显著，显示水溶性维生素E的浓度为50-200μmol/L时，能够维持肌肉干细胞的分化潜能。(图2)。
实施例3肌肉干细胞分化水平检测
取实施例1中水溶性维生素E为100μmol/L的改良增殖培养基、常规增殖培养基培养得到的肌肉干细胞进行诱导分化：肌肉干细胞体外诱导分化的进程包括两个阶段，第一个阶段是肌肉干细胞的增殖阶段，细胞在含有添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基、常规增殖培养基的分化培养皿中进行增殖，增殖5天到达预分化阶段。
将利用添加有水溶性维生素E的改良增殖培养基、常规增殖培养基培养得到的预分化阶段的细胞进行诱导分化，均每两天进行一次半换液，即吸去一半分化培养基，加入一半新的分化培养基，诱导分化4-5天后结束分化，此时成为终末分化阶段，此阶段表征分化能力的基因为MYHC。
分化标志基因水平：利用q-pcr技术分别检测用改良增殖培养基和常规培养基培养的细胞诱导分化之后的终末分化时标志基因MYHC的基因表达量。
结果显示：将利用添加有水溶性维生素为E的改良增殖培养基培养的细胞在分化培养基中诱导分化，所述添加有水溶性维生素E的细胞改良增殖培养基培养的细胞诱导分化后可显著上调终末分化的MYHC的表达(图3)，可以得出结论，添加有水溶性维生素E的细胞增殖培养基可显著提高肌肉干细胞的分化能力，维持肌肉干细胞体外短期培养过程中分化潜能。
综上，本发明发现，添加有水溶性维生素E的细胞改良增殖培养基可以加快体外短期扩大培养中肌肉干细胞的增殖速度，细胞扩增倍数上比正常细胞培养基培养的肌肉干细胞多扩增1.07-1.26倍；另外，添加有水溶性维生素E的细胞改良增殖培养基培养的细胞可以在诱导肌肉干细胞分化的过程中增加肌肉干细胞产生的肌肉蛋白、显著提高了肌肉干细胞在体外诱导分化的能力。
以上公开的实例是为了说明本发明公开的实施案例，但不能理解为本发明的局限，本文列出了许多不同的抗氧化剂和分化抑制剂，在不脱离本发明范围和精神的前提下，仍有许多不同可以进一步的组合，因此本发明不只局限于公开的实施案例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (12)

1.一种用于培养肉种子细胞短期增殖的改良增殖培养基，其特征在于，所述改良增殖培养基为添加有水溶性维生素E的细胞增殖培养基；所述细胞增殖培养基包括79vol%常规细胞培养基、20vol%胎牛血清、1vol%的青霉素-链霉素双抗溶液以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2。
2.根据权利要求1所述的改良增殖培养基，其特征在于，所述常规细胞培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。
3.根据权利要求1所述的改良增殖培养基，其特征在于，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。
4.根据权利要求1所述的改良增殖培养基，其特征在于，所述改良增殖培养基中，水溶性维生素E浓度为50-200μmol/L。
5.根据权利要求4所述的改良增殖培养基，其特征在于，水溶性维生素E浓度为50-100μmol/L。
6.权利要求1所述的改良增殖培养基在提高肌肉干细胞体外短期培养过程中增殖能力和/或维持肌肉干细胞体外短期培养过程中分化潜能中的应用。
7.水溶性维生素E在提高肌肉干细胞体外短期培养过程中增殖能力和/或维持肌肉干细胞体外短期培养过程中分化潜能中的应用，其特征在于，采用添加有水溶性维生素E的细胞增殖培养基对肌肉干细胞进行体外短期培养。
8.一种同时提高肌肉干细胞体外短期培养过程中的增殖能力和分化潜能的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：采用权利要求1所述的改良增殖培养基对肌肉干细胞进行体外扩大培养，获得肌肉干细胞；
S2：将S1得到的肌肉干细胞移入到分化培养基中进行诱导分化，获得肌肉细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，分化培养基为添加有水溶性维生素E的细胞分化培养基。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述分化培养基包括2vol%马血清、97vol%常规细胞培养基、1vol%的青霉素链霉素双抗溶液、100μmol/L的水溶性维生素E。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述常规细胞培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。
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