CN108676773A - 一种延缓间充质干细胞衰老的培养液及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例提供一种延缓间充质干细胞衰老的培养液及制备方法，涉及生物医学材料技术领域，在达到提高间充质干细胞体外增殖的同时，尽可能的延缓间充质干细胞老化速率，保持干细胞具有的细胞表型及功能，提高其利用效率，满足科研及临床的应用要求。该延缓间充质干细胞衰老的培养液及制备方法包括：基础培养液和外源添加物，所述外源添加物为：葡聚糖为5~15g/L，脂类浓缩剂为0.1~0.5mL/L，氢化可的松为0.05~5μg/L，地塞米松为0.1~10μg/L，亚硒酸钠为1~5μg/L，β‑巯基乙醇为10~50μM，维生素C（VC）为10~100mg/L，维生素E（VE）为10~50μg/L，转铁蛋白为1~20 mg/L，胰岛素5~50μg/L，生长激素（GH）为10~50μg/L，谷胱甘肽10~50μg/mL，非必需氨基酸为1%。

Description

一种延缓间充质干细胞衰老的培养液及制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种延缓间充质干细胞衰老的培养液及制备方法。
背景技术
间充质干细胞( Mesenchymal Stem Cells，MSCs )是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可以向成骨、软骨、脂肪、神经及心肌细胞等方向增殖分化。基于该类细胞广泛的可塑性，在众多的动物疾病模型和临床试验中进行了广泛的应用研究。
目前，研究者已经从动物及人体多种组织分离并获取了间充质干细胞，如：骨髓（BMSCs）、脂肪（ADSCs）、脐带（UC-MSCs）、脐血（UB-MSCs）、牙髓、羊膜、胎盘以及滑膜等。不同组织来源的间充质干细胞，虽然在形态上存在一定差异，但均具有一定的体外增殖能力和定向分化能力。国际细胞治疗协会(Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee ofthe International Society for Cellular Therapy)认为人类的MSCs可贴壁性生长；并高表达CD73、CD90、CD105，而应低表达或不表达CD14、CD45、CD11b、CD34、CD79、CD19。此外，在特定的诱导液培养下，MSCs必须具有向骨、脂肪和软骨分化的能力。因此 对间充质干细胞的鉴定主要采用流式细胞仪检测细胞表面标志和成脂、成骨和成软骨的诱导分化来确定它们是否为间充质干细胞。
间充质干细胞不但具有可塑性，也可以产生或分泌大量的生物活性因子，并含有丰富的生物活性物质，这些生物活性因子或物质可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。因此，利用干细胞分泌产生的生物活性因子或干细胞内的生物活性物质激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。
目前，美国、澳大利亚、新西兰、韩国等国家已对间充质干细胞治疗技术进行临床研究并获准上市，为干细胞临床应用广泛开展奠定重要基础。全世界细胞治疗产业，正呈现繁荣的发展景象。2015年1月，美国再生医学产业联盟发布的年度报告表示，全球专业从事细胞治疗研发的企业已达340家，在研的临床研究也已达到650项。
然而，将间充质干细胞应用于疾病防治与保健美容领域需要大量的种子细胞，但间充质干细胞的获取均需获得人体组织，且存在培养成功率低、体外培养容易老化等缺点，造成细胞增殖减缓、分化能力下降和生理功能丧失。 因此，需要提供一种增殖效率高、安全性好、能够减缓间充质干细胞老化速率的培养基，以期实现体外条件下，分化潜能的维持和大量种子细胞的获取，满足科研及临床需要。
发明内容
本发明实施例提供了一种延缓间充质干细胞衰老的培养液及制备方法，在达到提高间充质干细胞体外增殖的同时，尽可能的延缓间充质干细胞老化速率，保持干细胞具有的细胞表型及功能，提高其利用效率，满足科研及临床的应用要求。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明实施例提供一种延缓间充质干细胞衰老的培养液，所述延缓间充质干细胞衰老的培养液包括基础培养液和外源添加物，
所述外源添加物为：葡聚糖为5~15g/L，脂类浓缩剂为0.1~0.5mL/L，氢化可的松为0.05~5μg/L，地塞米松为0.1~10μg/L，亚硒酸钠为1~5μg/L，β-巯基乙醇为10~50μM，维生素C（VC）为10~100mg/L，维生素E（VE）为10~50μg/L，转铁蛋白为1~20 mg/L，胰岛素5~50μg/L，生长激素（GH）为10~50μg/L，谷胱甘肽10~50μg/mL，非必需氨基酸为1%。
进一步地，所述延缓间充质干细胞衰老的培养液还包括细胞生长因子添加成分，
所述细胞生长因子添加成分为：碱性成纤维生长因子（bFGF）为1~25μg/L，表皮生长因子（EGF）为0.5~10μg/L，转化生长因子（TGF-β）为1~10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为1~10μg/L，干细胞生长因子（SCF）为1~10μg/L。
优选的，所述细胞生长因子添加成分为：碱性成纤维生长因子（bFGF-2）为1~10μg/L，表皮生长因子（EGF）为1~5μg/L，转化生长因子（TGF-β）为5~10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为1~3μg/L，干细胞生长因子（SCF）为2~5μg/L。
进一步地，所述基础培养液为DMEM培养液或α-MEM培养液。
本发明实施例还提供一种延缓间充质干细胞衰老的培养液的制备方法，所述延缓间充质干细胞衰老的培养液的制备方法包括：
采用超纯水配制基础培养液；
在基础培养液中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入脂类浓缩剂，氢化可的松，地塞米松，亚硒酸钠为，β-巯基乙醇，维生素C（VC），维生素E（VE），转铁蛋白为，胰岛素，生长激素（GH），谷胱甘肽，非必需氨基酸，调pH7.2，定容后用滤膜过滤除菌，4℃保存。
进一步地，所述在基础培养液中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入脂类浓缩剂，氢化可的松，地塞米松，亚硒酸钠为，β-巯基乙醇，维生素C（VC），维生素E（VE），转铁蛋白为，胰岛素，生长激素（GH），谷胱甘肽，非必需氨基酸后，且在调pH7.2前，所述方法还包括：
在所述基础培养液中加入碱性成纤维生长因子（bFGF），表皮生长因子（EGF），转化生长因子（TGF-β），血小板衍生生长因子（PDGF），干细胞生长因子（SCF）。
进一步地，所述方法还包括：
1）将消化后获得的原代细胞用PBS溶液清洗干净，离心后用本培养液重悬，按2×104～5×104个/cm2的细胞密度接种培养；
2）培养2～5天后换液，之后每2~3天换液一次；
3）待细胞生长汇合至70％~85%时，可进行传代。
进一步地，所述方法还包括：
1）胰酶消化原代软骨细胞，将消化后获得的细胞用PBS溶液清洗，离心后用无血清培养液重悬细胞，按1×104～5×104个/cm2的细胞密度接种培养；
2）每2~3天换液一次，待细胞生长汇合至75~85％时，进行传代。
本发明提供的延缓间充质干细胞衰老的培养液具备以下有益效果：
本发明所制备的间充质干细胞培养液，能够维持该细胞在体外条件下正常生长扩增能力和功能维持，促进干细胞功能的发挥，延长其传代次数，可实现大量种子细胞的获取。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
实施例1
本发明实施例提供一种延缓间充质干细胞衰老的培养液，所述延缓间充质干细胞衰老的培养液包括基础培养液和外源添加物，
所述外源添加物为：葡聚糖为5~15g/L，脂类浓缩剂为0.1~0.5mL/L，氢化可的松为0.05~5μg/L，地塞米松为0.1~10μg/L，亚硒酸钠为1~5μg/L，β-巯基乙醇为10~50μM，维生素C（VC）为10~100mg/L，维生素E（VE）为10~50μg/L，转铁蛋白为1~20 mg/L，胰岛素5~50μg/L，生长激素（GH）为10~50μg/L，谷胱甘肽10~50μg/mL，非必需氨基酸为1%。
进一步地，所述延缓间充质干细胞衰老的培养液还包括细胞生长因子添加成分，
所述细胞生长因子添加成分为：碱性成纤维生长因子（bFGF）为1~25μg/L，表皮生长因子（EGF）为0.5~10μg/L，转化生长因子（TGF-β）为1~10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为1~10μg/L，干细胞生长因子（SCF）为1~10μg/L。
为了提高体外条件下间充质干细胞的扩增能力、并维持其细胞功能，减缓细胞老化速率，优选的，所述细胞生长因子添加成分为：碱性成纤维生长因子（bFGF-2）为1~10μg/L，表皮生长因子（EGF）为1~5μg/L，转化生长因子（TGF-β）为5~10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为1~3μg/L，干细胞生长因子（SCF）为2~5μg/L。
进一步地，所述基础培养液为DMEM培养液或α-MEM培养液。
本发明所制备的间充质干细胞培养液，能够维持该细胞在体外条件下正常生长扩增能力和功能维持，促进干细胞功能的发挥，延长其传代次数，可实现大量种子细胞的获取。
实施例2
本发明实施例还提供一种延缓间充质干细胞衰老的培养液的制备方法，所述延缓间充质干细胞衰老的培养液的制备方法包括：
采用超纯水配制基础培养液；
在基础培养液中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入脂类浓缩剂，氢化可的松，地塞米松，亚硒酸钠为，β-巯基乙醇，维生素C（VC），维生素E（VE），转铁蛋白为，胰岛素，生长激素（GH），谷胱甘肽，非必需氨基酸，碱性成纤维生长因子（bFGF），表皮生长因子（EGF），转化生长因子（TGF-β），血小板衍生生长因子（PDGF），干细胞生长因子（SCF），调pH7.2，定容后用滤膜过滤除菌，4℃保存。
进一步地，采用本发明间充质干细胞培养液培养原代细胞按以下操作：
1）将消化后获得的原代细胞用PBS溶液清洗干净，离心后用本培养液重悬，按2×104～5×104个/cm2的细胞密度接种培养；
2）培养2～5天后换液，之后每2~3天换液一次；
3）待细胞生长汇合至70％~85%时，可进行传代。
进一步地，采用本发明培养液进行间充质干细胞细胞传代培养以下操作：
1）胰酶消化原代软骨细胞，将消化后获得的细胞用PBS溶液清洗，离心后用无血清培养液重悬细胞，按1×104～5×104个/cm2的细胞密度接种培养；
2）每2~3天换液一次，待细胞生长汇合至75~85％时，进行传代。
由于本发明实施例提供的培养液中不使用血清，能避免使用血清造成的潜在隐患，并减缓干细胞衰老速率，提高其利用率，维持间充质干细胞的特性，实现该类细胞在疾病治疗和健康美容领域的广泛和有效利用。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种延缓间充质干细胞衰老的培养液，其特征在于，所述培养液包括基础培养液和外源添加物，
所述外源添加物为：葡聚糖为5~15g/L，脂类浓缩剂为0.1~0.5mL/L，氢化可的松为0.05~5μg/L，地塞米松为0.1~10μg/L，亚硒酸钠为1~5μg/L，β-巯基乙醇为10~50μM，维生素C（VC）为10~100mg/L，维生素E（VE）为10~50μg/L，转铁蛋白为1~20 mg/L，胰岛素5~50μg/L，生长激素（GH）为10~50μg/L，谷胱甘肽10~50μg/mL，非必需氨基酸为1%。
2.根据权利要求1所述的延缓间充质干细胞衰老的培养液，其特征在于，所述延缓间充质干细胞衰老的培养液还包括细胞生长因子添加成分，
所述细胞生长因子添加成分为：碱性成纤维生长因子（bFGF）为1~25μg/L，表皮生长因子（EGF）为0.5~10μg/L，转化生长因子（TGF-β）为1~10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为1~10μg/L，干细胞生长因子（SCF）为1~10μg/L。
3.根据权利要求2所述的延缓间充质干细胞衰老的培养液，其特征在于，所述细胞生长因子添加成分为：碱性成纤维生长因子（bFGF-2）为1~10μg/L，表皮生长因子（EGF）为1~5μg/L，转化生长因子（TGF-β）为5~10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为1~3μg/L，干细胞生长因子（SCF）为2~5μg/L。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的延缓间充质干细胞衰老的培养液，其特征在于，所述基础培养液为DMEM培养液或α-MEM培养液。
5.一种延缓间充质干细胞衰老的培养液的制备方法，其特征在于，所述延缓间充质干细胞衰老的培养液的制备方法包括：
采用超纯水配制基础培养液；
在基础培养液中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入脂类浓缩剂，氢化可的松，地塞米松，亚硒酸钠为，β-巯基乙醇，维生素C（VC），维生素E（VE），转铁蛋白为，胰岛素，生长激素（GH），谷胱甘肽，非必需氨基酸，调pH7.2，定容后用滤膜过滤除菌，4℃保存。
6.根据权利要求5所述的延缓间充质干细胞衰老的培养液的制备方法，其特征在于，所述在基础培养液中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入脂类浓缩剂，氢化可的松，地塞米松，亚硒酸钠为，β-巯基乙醇，维生素C（VC），维生素E（VE），转铁蛋白为，胰岛素，生长激素（GH），谷胱甘肽，非必需氨基酸后，且在调pH7.2前，所述方法还包括：
在所述基础培养液中加入碱性成纤维生长因子（bFGF），表皮生长因子（EGF），转化生长因子（TGF-β），血小板衍生生长因子（PDGF），干细胞生长因子（SCF）。
7.根据权利要求5或6所述的延缓间充质干细胞衰老的培养液的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
1）将消化后获得的原代细胞用PBS溶液清洗干净，离心后用本培养液重悬，按2×104～5×104个/cm2的细胞密度接种培养；
2）培养2～5天后换液，之后每2~3天换液一次；
3）待细胞生长汇合至70％~85%时，可进行传代。
8.根据权利要求5或6所述的延缓间充质干细胞衰老的培养液的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
1）胰酶消化原代软骨细胞，将消化后获得的细胞用PBS溶液清洗，离心后用无血清培养液重悬细胞，按1×104～5×104个/cm2的细胞密度接种培养；
2）每2~3天换液一次，待细胞生长汇合至75~85％时，进行传代。
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