CN1296478C - 细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

一种在醇酸(alcanoic acid)存在的情况下培养细胞的方法，可用于提高蛋白的产量。

Description

细胞培养基
细胞培养基
本发明主要涉及动物细胞培养领域。本发明设计了一种培养动物细胞的方法，用于生产治疗性蛋白或其他用途的蛋白，本发明还设计了一种独特的细胞培养基。
已知丁酸钠或其他丁酸盐能够提高蛋白在动物细胞培养中的产量，比如在EP-239292A中所描述的。这种效果可以从天然分泌的蛋白中观察到，如从杂交瘤或重组细胞系中获得抗体。丁酸盐加入细胞培养基的浓度最好高至5mM。丁酸的效果是比较特殊的，这已经被许多关于将丁酸加入到培养基的科学文献所验证；相比而言丙酸盐或戊酸盐在浓度约1mM时相当的低效。
然而，使用丁酸盐作为细胞培养添加剂具有局限和缺点。以0.1-10mM的浓度范围添加丁酸盐时，需要仔细地称量，以免因剂量过高引起中毒以及抑制细胞生长。即使小量的浓度增加也可引起剧烈的生长速率负作用。对于每一种细胞系和重组克隆，必需仔细选择最佳量的丁酸盐，并且在大规模生物反应器培养过程中进行调节控制。比如在EP-239292A中，对于杂交瘤细胞来说，从0.1-1mM的浓度范围是适宜的，而其他细胞系在丁酸盐浓度1mM以下时可具有好的耐药性。已知杂交瘤细胞对于反作用比其他细胞系更加敏感，所述反作用如氧气或营养供应不足，或化合物毒性影响；并且一旦接收到这种负面刺激因素，它们更易于且不可逆转地起始程序性细胞死亡。可见，在用于细胞培养提高产率时，丁酸盐具有一定的两面性作用。
Kim等(Biotechnology and Bioengineer 71，2001，184-193；bcl-2的超表达抑制CHO细胞中丁酸钠-诱导的凋亡，引起人源化抗体产量的提高)使用bcl-2重组细胞系计算了丁酸钠在5mM时的细胞毒性作用，其结果测量出提高的蛋白产物。然而，该方法需要大量的细胞系工程技术来构建重组体，包括重组体bcl-2和产物蛋白。因此一种更简单的用于计算丁酸盐培养基添加剂的负作用的方法将更加便利。
US 5378 612描述了一种增效的提高蛋白产量的方法，在已经包含1mM丁酸钠的CHO细胞培养基中加入锂盐(10mM)或脂多糖(LPS，1μg/ml)。对于两种不同的锂盐，产量的影响为1.3倍，而LPS显示的产量提高约在丁酸盐对照的4倍。令人感兴趣的是，在该试验系统中，10mM的乙酸钠与对照相比完全没有有益作用。
Kooistra等(Biochem.J.1987；在培养的人内皮细胞中丁酸盐刺激组织-型血纤维蛋白溶酶原-活化剂的合成，244：605-612)在包含血清的内皮细胞培养中，试验了不同化合物的潜在的对tPA产物的表达-提高作用，它们中间有一些醇酸(alcanoicacids)包括5mM的乙酸盐。具有这种效果的只有丙酸盐、戊酸盐、以及作用显著的丁酸盐，乙酸盐与对照相比没有太大的不同。
本发明的一个目的是避开现有技术的缺点，设计出另一种在动物细胞培养中提高产物蛋白产量的方法。
在本发明中，通过在细胞培养基中加入乙酸盐进行动物细胞培养的方法来实现此目的。本发明的另一个目的是提供与独立权利要求1、6、10、11和12相应的包含乙酸盐的细胞培养基。
本发明的可能的体现方式显示在如下的图示和表格中：
图1显示了在流加式摇瓶培养中，乙酸钾和乙酸钠对于NSO产率的影响。
图2显示了不包含或包含10mM乙酸钠的流加式生物反应器发酵的NSO生长图。
图3显示了在根据图2进行的发酵过程中，10mM乙酸钠对于NSO产率的影响。
图4对比了在接种体培养物(in inoc)中加入乙酸钠对NSO的影响以及进一步加入乙酸的时间选择(在接种时或在中期-指数期，即at feed)。所有的值以与对照相比的百分数差异来表示。
图5和图6显示了在定制的高密度生长培养基中含有7.5mM乙酸时，重组NSO细胞的生长和抗体产率。
图7和图8显示了在NSO细胞培养中补加乙酸钠的剂量-反应曲线。
图9-11显示了在NSO细胞培养基中补加n-丁酸钠的比较数据。
图12-14显示了在VPM 8杂交瘤细胞培养中补加乙酸钠的剂量-反应曲线。
图15-17显示了在VPM 8杂交瘤细胞培养中补加n-丁酸钠的比较数据。
在本发明中，设计了一种生产产物蛋白的方法，其中产物蛋白从一种存在于细胞培养基中的哺乳动物细胞中表达出来，并且至少在细胞培养过程中的某个时间段中被表达。也就是说，产物蛋白既可以是由细胞结构性表达的，也可以是在某些时间点上被某种细胞刺激物诱导表达的。优选的，产物蛋白是被结构性表达的。本发明的方法进一步包含以下步骤：
a)制备用于哺乳动物细胞的细胞培养基，
b)进一步加入乙酸、乙酸盐或生物学活化的乙酸酯，至终浓度为1-20mM，优选3-15mM，更优选5-12mM，最优选6-9.5mM，所述的添加可以在起始细胞培养之前直接加入到培养基中，或可以在细胞培养过程中加入到培养基中，
c)进一步在所述的培养基中培养哺乳动物细胞，伴随着产物蛋白的表达，
d)最后从细胞培养基中收获所述蛋白质。
在一个进一步优选的体现方式中，乙酸或其盐或其生物学活化的酯的浓度在6-20mM，更优选6-12mM，最优选6-9.5mM，如结合前面所述的优选浓度范围所推断出的一样。
本发明的产物是被尽可能高量表达和收获的产物蛋白，它可以是任何有意义的蛋白，例如：治疗性蛋白如白细胞介素、酶、多聚蛋白或多聚蛋白的亚基如抗体或其片断。重组产物基因可包括一个信号序列，编码可使被表达的多肽从原生产细胞中分泌出来的序列部分。产物蛋白可以是一种从转基因启动子表达的重组蛋白，或者可从天然活性基因位点表达，所述天然活性基因位点例如存在于通过常规细胞融合技术获得的杂交瘤细胞中的免疫球蛋白基因位点。产物收集以及用于纯化从培养基中所获蛋白的下游加工技术是本领域熟知的，是常规的方式。最初，如离心、超滤和/或离子交换层析等技术经常被应用，因为它们可用于高量生产。
本发明的乙酸盐可以是任何一种盐，如碱金属或碱土金属或其他任何可用的金属乙酸盐。由于培养基通常经过缓冲处理，尽管优选的是加入一种盐，但加入乙酸或乙酸酐也是可以的。同样，也可使用易于分离的乙酸盐或酯的复合物盐，其在培养过程中因为高的水解率或细胞胞外酶活性的影响，从培养基中原位释放出乙酸盐。特别是在应用胞外酶活性时，可称其为“生物学可活化的”酯。碱和碱土金属的乙酸盐是本发明优选的体现方式。更优选的，所述的盐是一种碱金属盐，并且所述碱金属不是锂；最优选的，它是乙酸钠。乙酸钠特别优选的浓度范围为6-9.5mM，用在细胞生长培养基中，而并非维持培养基；并且在细胞培养开始时或开始之前，使用乙酸钠处理细胞，如下面将要描述的。
优选的，本发明的细胞培养基是无丁酸盐的。丁酸盐易于降低生长速率和诱导凋亡；它的浓度需要仔细地称量。然而，在本发明中，其可方便地被乙酸盐代替，乙酸盐对生长速率几乎没有影响或具有非常温和的影响。目前还未发现乙酸盐可诱导凋亡。
在本发明中，乙酸盐或其等价物既可以在起始细胞培养前直接加入到新鲜的培养基中，也可以在细胞培养过程中添加至培养基，特别是在指数期加入到生长培养基中。在补料添加的情况下，应该考虑乙酸盐影响作用的延迟性，即出现可观察到的产物蛋白产量提高效果的滞后期。通常，仅使用乙酸盐的补料添加是低效的。在本发明中，特别优选在细胞培养之前，以前述的量将乙酸盐直接加入到细胞培养基中，特别是细胞生长培养基中，可选择性地进一步根据浓度补加乙酸盐。最优选的，乙酸盐仅仅在培养起始之前直接加入到培养基，以前述的量加入，特别是以6-9mM的量以乙酸钠的形式加入，并且在细胞培养过程中不再通过补料补充，优选的，在合适的培养基(如高细胞密度生长培养基)中培养生长的过程中不再补充。
在本发明中，“在起始细胞培养之前加入培养基”是指在约接种阶段加入前述量的乙酸盐或其等价物，其包括可见的细胞生长开始前的最初滞后-期；或在培养基的接种之前以前述量的乙酸盐或其等价物处理细胞。同时，“在接种之前”是指预-培养的接种体自身生长在一种包含前述量的乙酸盐培养基添加剂的培养基中。也可同时结合两个方面。在一种特别优选的体现方式中，只有接种体培养是用前述量的乙酸盐处理的，而用于大-规模生产培养的细胞培养生长培养基中是没有＞1mM范围的乙酸盐的。
合适的细胞或细胞系可以是任何哺乳动物细胞系。合适的细胞系可以是比如：SV-40永生化猴肾细胞(COS-7细胞)、犬肾细胞(MDCK)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、幼仓鼠肾细胞(BHK)如ATCC CCL10、人肝细胞(Hep G2)、淋巴细胞(Jurkat T-细胞系)、杂交瘤细胞(如SP2/0-Ag14，Shulman等，1977)、或骨髓瘤细胞(如NSO细胞)。应理解，并非所有这些细胞对于在细胞培养基中加入乙酸盐都具有同样好的反应。并且，对于一种给定的细胞类型或细胞系，以前述的浓度范围加入的乙酸盐产生的影响也可能不是线性的或恒定的。根据细胞系的不同，其可显示一种独特的最佳浓度，在该浓度上乙酸盐引起的产量提高是最大的，而当改变乙酸盐的浓度使之升高或降低时，产量下降；最佳浓度在不同细胞类型中具有相当大的不同，其需要通过单剂量反应实验来建立。
合适的用于哺乳动物的培养基和培养方法是本技术领域所熟知的，比如在US5633162中所描述的。用于实验室摇瓶或低密度细胞培养的、并且适合特异细胞类型的标准细胞培养基的例子如：Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(Morre，G.，The Journal of the American Medical Association，199，p.519f.1967)，L-15培养基(Leibovitz，A.等，Amer.J.of Hygiene，78，1p.173ff，1963)，Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)，Eagle极限必需培养基(MEM)，Ham F12培养基(Ham，R.等，Proc.Natl.Acad.Sc.53，p288ff.1965)、或缺少白蛋白、转铁蛋白和卵磷脂的Iscove改进的DMEM(Iscoves等，J.Exp.Med.1，p.923 ff.，1978)。已知这种培养基可以添加胎牛血清(FBS，也称为FCS)，其可提供一种天然来源的过量的激素和生长因子。脊椎动物和哺乳动物细胞的细胞培养已经分别形成了常规的方式，被详细描述在如R.Ian Fresney，“动物细胞培养”的手册中，第四版，Wiley-Liss/N.Y.，2000。
优选的，本发明的细胞培养基是允许和支持动物细胞生长的培养基。生长应理解为至少在细胞培养的某个阶段中，存活细胞的密度增加。在本发明中，这种“生长培养基”的定义应理解为按照本技术领域的常规含意，与“维持培养基”相对的培养基。维持培养基是维持细胞存活的细胞培养基，其不促进细胞的生长。这种维持培养基一般不包含生长所必需的因子如转铁蛋白、胰岛素、白蛋白以及类似物。
所述的培养基的体现方式是包含前述量的乙酸盐或其等价物的哺乳动物细胞培养基，特别应用于培养或加入到适于淋巴细胞培养的培养基中，所述淋巴细胞如杂交瘤和骨髓瘤细胞。术语杂交瘤不仅包括经细胞融合产生的抗体分泌细胞，包括所谓的quadromas等；还包括B-淋巴细胞，以及通过与永生化试剂如具有细胞周期活性的重组基因产物、病毒(如Eppstein-Barr-病毒)或任何化学永生化试剂进行永生化获得的抗体分泌细胞。在这里，“杂交瘤”还包括了非-分泌杂交瘤如SP2/0-Ag14(Shulman等，1977)。因此，在本发明中，从杂交瘤中获得的产物蛋白未必是与同源基因产物相关的，如从亲本细胞获得的抗体，其也可以是一种重组体产物蛋白。
优选的，所述细胞是“骨髓”细胞，最优选的是骨髓瘤NSO细胞系(如细胞系ECACCNo.85110505及其衍生物，免费获自欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，应用微生物和研究中心(Centre for Applied Microbiology & Research)，Salisbury，WiltshireSP4 0JG，英国)。“骨髓”细胞是肿瘤细胞系，NSO是其中之一。尽管通过常规的技术路线获得并被错误地作为“骨髓”细胞(Barnes等，Cytotechnology 32：109-123，2000)，NSO细胞实际上是浆细胞肿瘤，并且与B-淋巴细胞系一起作为杂交瘤。结果，相应的细胞类型是同样特别优选的体现方式。已发现“骨髓瘤”NSO细胞可潜在地升高产物的产量，尤其当应用于重组抗体的产物时。大多标准NSO细胞系是胆固醇-依赖的，通常胆固醇是培养基中必不可少的组分。在本发明中，淋巴细胞包括可通过许多技术从抗体-分泌细胞生成的杂交瘤细胞，如与合适的肿瘤细胞系进行细胞融合，包括与非-分泌杂交瘤细胞系融合，其生成所谓的triomas，或与一种转化试剂或病毒以及任何其他淋巴细胞系永生化。然而，在另一优选方式中，本发明的哺乳动物细胞或细胞系不是杂交瘤细胞系，而是一种非-杂交瘤细胞系，其更优选非-杂交瘤、重组细胞系，最优选如前所述的重组体“骨髓瘤”细胞系。
在一种进一步优选的体现方式中，细胞系是NS0细胞系，其能够表达重组谷氨酰胺合成酶(GS)。NSO细胞在与谷氨酰胺合成酶(GS)表达系统(Bebbington等，1992，“从使用谷氨酰胺合成酶基因作为扩增选择标记的骨髓瘤细胞中高-水平表达重组抗体”，Bio/Technology 10：169-175；Cockett等，1990，“使用谷氨酰胺合成酶基因扩增在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高水平表达金属蛋白酶组织抑制剂”，Bio/Technology 8：662-667)共同使用时具有特别的优点。优选的，将产物蛋白基因序列和GS基因序列置于单一的GS质粒载体上，用于生成转染的NSO细胞系，所述基因可以从不同或相同的启动子开始表达，使用如内部核糖体进入位点。GS-系统是仅有的两种特别重要的用于治疗性蛋白生产的系统之一。与二氢叶酸还原酶(DHFR)系统相比，GS系统，特别是用于与NSO骨髓瘤细胞结合的GS系统，在进行过程中具有巨大的时间优势，由于可从起始转染中构建高产率细胞系，因此省却了大量为达到基因扩增目的而进行的增加选择剂浓度的循环选择(Brown等，1992，“使用谷氨酰胺合成酶(GS)系统的重组抗体生产的进展”，Cytotechnology 9：231-236)。NSO细胞是表型上缺乏谷氨酰胺-合成酶的。因此衍生自鼠肿瘤细胞系(Galfre，G.和Milstein，C.，Methods in Enzymol.73，3-75，1981)的NSO细胞是频繁被选择用于在工业规模上与GS系统结合的细胞系。
优选的，本发明的细胞培养基是无胎牛血清(FCS或FBS)的，因此称其为“无血清的”。无血清培养基中的细胞通常需要胰岛素和转铁蛋白来获得最佳生长。转铁蛋白可至少部分被非-肽螯合剂、或高产铁载体如描述于WO94/02592的环庚三烯酚酮、或增加水平的无机铁来源的可特别结合抗氧化剂如维生素C的物质所替代。大多细胞系需要一种或多种合成生长因子(包含重组多肽)，包括如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素类似生长因子I和II(IGFI、IGFII)等。所必需的其他类型的因子可包括：前列腺素、转运和结合蛋白(如血浆铜蓝蛋白、高和低密度脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA))、激素(包括类固醇激素)、以及脂肪酸。多肽因子试验最好以逐步方式进行，在那些已知可产生生长刺激的因子存在下测试新的多肽因子。所述生长因子是合成的或重组的。目前已有多种在动物细胞培养中熟知的方法，以下将要描述其中一种具有代表性的方法。起始步骤是在细胞从添加血清的培养基中转移后3-6天内，使之达到细胞存活和/或慢速生长状态。在大多数细胞类型中，这至少是接种体密度部分相关的。一旦找到最佳的激素/生长因子/多肽添加方式，存活所需的接种体密度将降低。
在一个更优选的体现方式中，本发明的细胞培养基是无蛋白的，更优选无蛋白生长培养基，也就是说，其不存在胎血清，也不存在个体蛋白生长因子添加剂或其他蛋白，如重组转铁蛋白或用于脂结合和转运的血清白蛋白。最优选的，它是如前所述的无蛋白培养基，但其中加入了重组或纯化的白蛋白或其序列变异体或片断。然而应注意，对于NSO细胞，其通常需要胆固醇作为培养基添加剂，目前已有关于胆固醇-非依赖亚类的品种的报导，其能够被连续地培养和生长，用于蛋白生产(LonzaBiologics，UK)。本发明的无蛋白培养基特别优选与骨髓瘤细胞系如NSO协同使用。
进一步优选的，本发明的方法的可能的体现方式以及以下特殊的细胞培养基是动物细胞高-密度发酵或高-密度生长发酵的，如在一种工业流加式生物反应器如气举式或灌流式生物反应器中，上面或下面的存活细胞密度为105细胞/ml，优选106细胞/ml。因此，必需使用一种高-密度生长培养基。这种高-密度生长培养基通常可以补充加入营养成分如所有氨基酸、能量来源如前述范围的葡萄糖、无机盐、维生素、微量元素(定义为无机化合物，通常以微摩尔级范围的终浓度存在)、缓冲液、四种核苷或其对应的核苷酸、抗氧化剂如谷胱甘肽(还原性的)、维生素C，以及其他组分如重要的膜脂质(如胆固醇、或卵磷脂、或脂质前体如胆碱或肌醇)。一种高-密度培养基可富含大多数或全部的这些化合物，但是无机盐除外，其是调节同渗容摩使培养基等渗压的基础。与RPMI1640相比，包含比前述标准培养基更高量的(加强的)无机盐的方式如EP-435911A或GB-2251249中所述。GB-2251249提供了合适的高密度生长培养基的例子。在本发明中，这种高-密度细胞培养基包含前述量的乙酸盐，优选不存在丁酸盐。更优选的，本发明的高-密度培养基均衡地加强了除了色氨酸以外的多数氨基酸，含有超过75mg/l的氨基酸。更优选的，在加入常规需求的氨基酸的同时，谷氨酸和天门冬氨酸的加入量超过1g/l，最优选超过2g/l。很明显，后面指出的更优选方式不适用于转染了谷氨酰胺合成酶(GS)质粒的重组细胞系，尤其是在GS基因序列发生扩增循环以后。在那些细胞中，过量外源谷氨酸的参与将导致氨的产生，这是必需避免的。
在本发明中，高-密度细胞培养所定义的动物细胞数量为：瞬时的存活细胞密度至少或超过105细胞/ml，优选至少或超过106细胞/ml，该细胞群已经在细胞培养基上、以恒定的或增进的培养量、从单细胞或低存活细胞密度接种体进行了连续生长。
在一种进一步优选的体现方式中，本发明的细胞培养是流加式培养，其中一种或多种其他氨基酸(优选至少包含谷氨酸)被补加到细胞培养基中，如GB-2251249中所描述的，以维持其在培养基中的浓度，并且通过分别补料与葡萄糖的浓度控制相区分。更优选的，谷氨酸和选择性的一种或多种其他氨基酸(理想状态为包含谷氨酸)与一种或多种能量来源如葡萄糖相结合对细胞培养基进行补料，如EP-229809A所描述的。谷氨酸可至少部分地被天门冬氨酸替代(关于天门冬氨酸替代谷氨酸的内容可参考Kurano，N.等，1990，J.Bioltechnology 15，113-128)。补料通常起始于培养开始后的25-60小时；例如，当细胞达到约106细胞/ml的密度时，起始补料是有用的。在补料中通常可存在的氨基酸剂量为每升培养基体积每种氨基酸的总添加量在10-300mg范围内；特别是甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，它们与其他氨基酸相比，通常以较高的量补料，至少在150-200mg/l培养基体积。除了用于GS细胞系以外，调节谷氨酸和/或天门冬氨酸的补料总量在0.5g/l-3g/l培养基体积是有利的，优选的补料总量为1-2g/l培养基体积。所述的补料可以以灌注的方式被加入，或以连续灌流的方式补料，优选的补料方式是连续灌流到生物反应器中。其在流加式培养过程中不需要对生物反应器中的pH值进行仔细调节，通过加入碱或缓冲液，在接近给定细胞系的生理学pH值的最佳状态下进行培养。当使用葡萄糖作为能量来源时，葡萄糖的补料通常通过保持葡萄糖在培养基中的浓度为1-10g/l来调节，优选3-6g/l培养基。除了包含氨基酸，补料优选包含低量的胆碱，含量在5-20mg/l培养基的范围内。
包含乙酸盐添加剂的相应的细胞培养基适合于如NSO细胞的培养，由这种细胞培养基、淋巴和/或NSO细胞、以及适用于制备这种培养基的培养基浓缩物所构成的细胞培养是本发明的进一步的目的。前面所描述的内容同样可应用于本发明的这些体现方式中。
实验
如没有特殊说明，抗体产率或效价通过蛋白A-HPLC来确定。
实验1
GS-NSO细胞系6A1(100)3，短期的、分泌重组鼠/人嵌合IgG cB72.3(Bebbington，1992，见前)的6A1被用于以下所有的实验设计中。细胞培养可以通过摇瓶培养进行，也可以在10升标准气举式生物反应器中以流加方式进行，基本如所描述的(Bebbington，1992)。如前所述补料主要在高-密度培养基中加入氨基酸和碳水化合物，并且发酵。补料量为接种后量的4％。当存活细胞密度超过14×105细胞/ml时，以0.2ml/Lh的速率开始补料。温度控制在36.5℃；对于气举方式，空气饱和度为15％。pH值控制在pH7.00。以2×105存活细胞/ml接种。培养基是无血清和无必需蛋白的生长培养基ProCH04-CDM(Bio Whittaker)，其中补充了50mM硫胺甲硫氨酸(MSX)。细胞经过了在培养基中的预适应。观察到蛋白产量的提高达到了98％(对照为470mg/l，与之相比，含10mM乙酸盐时的细胞生长为768mg/l)。没有发现乙酸盐对生长的抑制作用，其略微地降低生长速率但不降低最大存活细胞密度。可以肯定，它延长了发酵的平稳期。
累积时间(105细胞/h ml)通过细胞生长曲线来计算，基本上如Renard等(1988，Biotechnology Letters 10，91-96)所描述的。
图1显示了在流加式摇瓶培养中，乙酸钾和乙酸钠对产率的影响作用。乙酸钠或乙酸钾都在中期-指数生长期被加入到摇瓶培养中，分别加至如图1表格中所列的终浓度。通过台酚蓝方法每天对培养物计数，通过蛋白A分馏和HPLC分析对样品进行产物分析。10mM乙酸钠显示比10mM或15mM乙酸钾更佳的效果。在所有的处理方法中CCT都是相似的(包括对照)。结果发现单细胞产率(qp)提高了。
图2显示了在不包含或包含10mM乙酸钠的情况下，流加式生物反应器发酵中的生长图。测试了在对照以及添加10mM乙酸钠两种培养方式下的存活细胞浓度(通过台酚蓝排除标准计数测定来确定)。在第4天开始补料。如图1所示，在生长期没有加入乙酸盐，但是一旦加入接种细胞，其立刻被加入到细胞培养产物培养基中。可以发现，乙酸盐对产率的提高作用是高度可再生的(图3)。在可达到最大细胞密度的条件下，没有观察到明显的生长抑制发生。尽管多次发现加入乙酸盐会产生某些影响，但生长速率没有实质上的降低。所有培养中CCT保持基本相似。值得注意地，乙酸盐增进了稳定生长期的持续时间或稳定性；在存活细胞密度到达峰值后，乙酸盐的存在可使存活细胞密度的下降趋缓。已知在稳定期的抗体产量远远高于指数生长期。
在本实验的另一方面，在对如前所述的对照和乙酸盐处理的培养基进行补料时，还加入了LiCl，加入至终浓度大约为1-10mM(数据未显示)。经验证锂盐的加入没有以任何方式改变乙酸盐的作用。显然，其在乙酸盐补给培养中没有产生如n-丁酸盐补给培养所报导的增效作用。
图4比较了在接种体培养物中(in inoc)、或在接种到产物培养基时(at inoc)、或在中期-指数生长期补料补给时(at feed)、或在流加式摇瓶培养中结合培养时，乙酸钠的加入所产生的影响作用。所有的值以与对照相比的百分数差异来表示。根据乙酸盐的加入量，可以观察到清晰的剂量依赖性。在接种体培养中或在接种时加入乙酸盐，意味着将添加了乙酸盐的培养基应用于生产培养，考虑到增加的产量以及最大化的单细胞产率，这是最有效的方式。
实验2
实验2的操作基本如前述的实验1/图2所描述，不同之处是这里使用7.5mM乙酸钠以及一种独特的高-密度培养基，其类似于EP-435911A中所述的脂类补给的高-密度培养基，但其使用更低的乙醇胺、无硫代甘油、并通过传感器-控制的自动添加系统保持色氨酸浓度恒定在19mM。使用这种培养基时，考虑到抗体的产量和过程的稳健性，7.5mM的乙酸盐对于细胞系是最佳的。图5显示了7.5mM乙酸盐的CCT图，再次证明乙酸盐的应用在不降低生长速率或存活细胞密度的情况下提高了抗体产量。与实验1形成对比，本实验在乙酸盐存在下可以达到与无乙酸盐存在的对照相同的最大存活细胞密度，对稳定生长期的持续时间不存在任何反面影响。类似的，产物浓度根据控制及时间稳定地提高(图6)。不同于其他产率增加试剂如丁酸盐，乙酸钠的加入仅导致微小的细胞生长参数(细胞生长速率和累积细胞时间)降低，因此乙酸钠的加入大大地提高了产物抗体的浓度。
实验3
该实验是一种剂量-反应研究，对于NS0细胞系6A1，加入不同量的乙酸钠，剂量范围高至20mM，本实验的操作基本如实验1/图2所描述的，图7显示了乙酸盐加入剂量依赖的CCT，图8显示了乙酸盐加入剂量依赖的单细胞特定产率(qp)。
比较实施例：实验4
在NSO-6A1细胞中，细胞培养基中丁酸盐的加入没有提高抗体的产率；当剂量＞1mM时，其对细胞产生强烈的毒性，并且存活细胞的密度迅速下降。在允许的范围内，根本没有可见的产率提高，即使在单细胞水平上也没有。本实验的操作基本如实验1/图2所述，不同之处是加入了如图所示量的丁酸盐而并非乙酸盐。在中期-指数生长期丁酸盐的后续加入也没有提高产率。图9-11显示了丁酸盐的加入对CCT的影响、在收获时的抗体的效价以及单细胞特定产率(qp)。
实验5
在杂交瘤细胞系VPM 8(ECACC No.93113024，European Collection of CellCulture，见上)中进行乙酸钠的剂量反应研究，操作基本如实验3中所描述的，不同之处是VPM 8生长在商品化的无蛋白培养基CD-Hybridoma(Invitrogen/U.K.)上，并且其中没有MSX的加入，因其不是GS细胞系。VPM 8是一种鼠杂交瘤，通过传统的方式与非-分泌骨髓瘤细胞融合，分泌鼠IgG1抗体。图12-14显示了乙酸盐的加入对CCT的影响、在收获时的抗体的效价以及单细胞特定产率(qp)。值得注意的，与丁酸相比，杂交瘤VPM 8对乙酸盐的耐药性表现出特别大的mM范围，这与丁酸(实验6)相反，并且还显示出比非-乙酸处理的对照更高的产率。根据已知的现有技术，后者在基于丁酸盐处理的同种细胞上是没有发现的。
比较实施例：实验6
图15-17分别显示了n-丁酸处理对于VPM 8杂交瘤细胞的CCT影响、收获的抗体的效价以及单细胞特定产率(qp)。本实验的操作基本如实验5所描述的，不同之处是加入如图所示量的n-丁酸盐替代乙酸盐。由于丁酸对该细胞系的异常毒性作用，基本上不可能出现加入丁酸而不降低生长速率和存活细胞密度的情况。因此丁酸的加入对于提高抗体效价是无效的。

Claims (19)

1.生产产物蛋白的方法，其中，所述蛋白质至少在细胞培养的一个时间段中
由淋巴细胞在细胞培养物中表达，包含以下步骤：
a)制备无蛋白的细胞培养生长培养基，
b)再加入乙酸、乙酸盐或乙酸酯，至终浓度为3-20mM，所述加入乙酸、乙酸盐或乙酸酯是在细胞培养之前或起始细胞培养之时直接加入到培养基中，或是在细胞培养过程中将之补料到培养基中，
c)在所述培养基中进一步培养所述细胞，伴随着产物蛋白的表达，
d)最后从细胞培养物中收获所述蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，步骤c)中的培养是令细胞生长的培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，乙酸或其盐只在起始细胞培养之前或起始细胞培养之时直接加入到培养基中。
4.如上述任一权利要求所述的方法，乙酸、乙酸盐或乙酸酯的终浓度为3-15mM。
5.如权利要求4所述的方法，乙酸、乙酸盐或乙酸酯的终浓度为6-9.5mM。
6.如权利要求5所述的方法，所述培养基不含丁酸或其盐。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是哺乳动物淋巴细胞。
8.如权利要求7所述的方法，所述细胞是NSO细胞。
9.如权利要求5的方法，其特征在于，所述细胞是表达谷氨酰胺合成酶的重组NSO细胞。
10.用于淋巴细胞培养的无蛋白细胞生长培养基，其特征在于，所述培养基包含乙酸、乙酸盐或生物学可活化的乙酸酯，浓度为3-20mM。
11.如权利要求10所述的细胞生长培养基，所述培养基不包含丁酸及其盐。
12.如权利要求10或11所述的细胞生长培养基，其中乙酸、乙酸盐或生物学可活化的乙酸酯的浓度为6-9.5mM。
13.如权利要求10所述的细胞生长培养基，所述的淋巴细胞是哺乳动物淋巴细胞。
14.如权利要求13所述的细胞培养基，其特征在于，所述培养基是高密度细胞培养基。
15.如权利要求10所述的细胞培养基，其特征在于，所述培养基是适合无蛋白NSO细胞培养的无血清无蛋白细胞培养基。
16.一种用于制备如权利要求10所述培养基的培养基浓缩物，其是固体的或液体的。
17.权利要求10所述的细胞培养基用于哺乳动物淋巴细胞培养的用途。
18.细胞培养物，包含处于权利要求10所述培养基中的哺乳动物淋巴细胞。
19.如权利要求18所述的细胞培养物，所述淋巴细胞是NSO细胞。
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