CN113249391A - 一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种编码rPD蛋白的分离的核酸、其制备方法和用途，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，利用所述分离的核酸表达rPD蛋白的表达量高。通过本发明制造的rPD蛋白具有耗时短、低成本、纯度高、收率高、工艺稳定性强等特点，在rPD蛋白制备的领域具有极为广阔的应用前景。

Description

一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及利用基因工程技术生产重组蛋白药物，具体涉及流感嗜血杆菌D蛋白的可溶性高表达和纯化方法，属于基因工程技术和医药技术领域。
背景技术
流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae，Hi)可引起人类多种传染性疾病，最常见和最严重的是脑膜炎，其次是肺炎。根据其主要的毒力因子——荚膜的有无，可将其分为两大类有荚膜型和无荚膜型。有荚膜型有a、b、c、d、e、f六个荚膜型别，无荚膜型别为不可分型(Nontypeable haemophilus influenzae,NTHi)。
六种荚膜型别中，b型致病力最强，是引起小儿严重细菌感染的主要致病菌，其感染对象主要是5岁以下婴幼儿，占所有Hi侵袭性感染的95％。在将Hib荚膜多糖结合疫苗纳入儿童免疫计划后，侵入性Hib感染率发生了显著的下降。近年来，有研究报道，NTHi逐渐替代荚膜型成为临床优势感染菌株，这些菌株经常是造成儿童急性中耳炎(AOM)的原因。
Protein D(PD)是一种相对分子量为42KDa的表面脂蛋白，存在于所有的Hi和NTHi中，基因序列具有高度的保守性。天然PD由364个氨基酸编码，其中1-18位氨基酸为信号肽序列，19-364位氨基酸为成熟肽序列。PD作为外膜脂蛋白是通过脂肪酸与PD成熟肽的首位半胱氨酸通过脂酰化作用而连接，缺乏半胱氨酸的PD突变体不能得到酰化而被分泌到胞内。作为Hi的一种特征性毒力决定因子，PD在Hi引起呼吸道感染过程中起重要作用，是极具潜力的疫苗候选蛋白。
早在2009年，非酰化NTHi PD就作为10价疫苗(PHiD-CV,SynflorixTM)的载体蛋白在欧洲上市，具有较好的安全性和有效性，对肺炎链球菌引起的中耳炎和NTHi引起的急性中耳炎起到了有效预防。表明PD作为一种新型的载体蛋白，在今后的疫苗应用中具有广阔前景。
美国专利US9,107,872简略描述了PD的构建表达及纯化，其采用的是传统的PL和PR温敏表达系统，在升温诱导的过程中会刺激宿主菌的水解酶的表达，影响重组蛋白的稳定性，且在放大生产中升温过程耗时长，难以做到产业化放大。
关于PD蛋白的重组表达研究相对较少，现有的文献均采用从细菌基因组上扩增pd基因的方法，尹梦梦在氨苄抗性的大肠杆菌中实现了PD蛋白的可溶性表达，破碎上清中PD蛋白占全菌体蛋白的44％(尹梦梦.b型流感嗜血杆菌多糖制备工艺及其D蛋白原核可溶性表达研究[D].北京协和医学院,2013.)。杜倩成功构建了pET30a-PD表达株，以包涵体形式表达，PD表达量占全菌体蛋白40％(杜倩.b型流感嗜血杆菌D蛋白的克隆,表达,纯化及作为结合疫苗载体的初步研究[D].暨南大学,2011.)。
实现高效可溶且无标签表达的菌种是理想的工业菌种，目前尚未见有关重组Protein D(rPD)蛋白高效可溶表达及相关生产工艺的报道。
发明内容
为了解决上述问题，实现低成本、高收率、高纯度、易放大的rPD蛋白制备方法，本发明提供了一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途。本发明通过对大肠杆菌的密码子优化并进行化学合成，优化不仅仅是简单的将密码子向大肠杆菌偏好高的方向进行替换，而是通过部分替换并进行化学合成，最终获得高效可溶性表达、无标签的rPD表达株。经纯化后获得的高纯度、低内毒素rPD可用于载体蛋白或疫苗组分使用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种编码rPD蛋白的分离的核酸，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供一种表达载体，所述表达载体包含如技术方案之一所述的分离的核酸。
在一具体实施例中，所述表达载体为pET27b或pET30a。优选地，所述载体为pET30a。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：提供一种表达菌株，所述表达菌株包含如技术方案之一所述的分离的核酸，或如技术方案之二所述的表达载体。
在一具体实施例中，所述表达菌株的宿主菌为大肠杆菌。优选地，所述菌株为BL21(DE3)。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之四为：提供一种rPD蛋白的发酵工艺，培养如技术方案之三所述的表达菌株，获得发酵液；所述发酵工艺的发酵温度例如为32～37℃，所述发酵液的A600nm值例如为10左右时，添加诱导剂；诱导剂为IPTG，诱导温度例如为16～28℃，诱导时长例如为4h～12h。优选地，所述诱导温度为28℃，所述IPTG的终浓度为0.05～0.5mmol/L。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之五为：提供一种rPD蛋白的粗处理方法，所述粗处理方法包含利用精氨酸对如技术方案之四所述的发酵工艺获得的发酵液进行高渗处理，以获得rPD蛋白溶液。优选地，所述高渗处理使用精氨酸进行，且随后进行低渗处理。更优选地，所述粗处理方法包括以下步骤：
(1)将所述发酵液进行超滤浓缩，收集菌体浓缩液；
(2)在所述菌体浓缩液中加入精氨酸，室温搅拌例如3h，形成高渗处理液；
(3)将所述高渗处理液按照1:10体积比例与低渗液混合，室温静置例如静置过夜或静置12小时以上，获得混合液；
(4)将所述混合液进行澄清，收集澄清流穿液；
(5)将所述澄清流穿液进行浓缩，收集浓缩截留液；
(6)将所述浓缩截留液使用置换液进行置换，优选置换3～4次，获得浓缩置换液。
进一步更优选地，使用0.45μm、10Kda～30Kda的膜包进行超滤浓缩和/或澄清，和/或，所述高渗处理液中精氨酸的终浓度为0.5mol/L；和/或，所述菌体浓缩液中菌体浓度为0.3g菌体/mL；和/或，所述低渗液为50mmol/L Tris-HCl、pH8.0、含1mmol/L EDTA；和/或，所述置换液为50mmol/L PBS缓冲液、pH6.5、含1mmol/L EDTA。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之六为：提供一种rPD蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)将如技术方案之五所述的粗处理方法得到的浓缩置换液上样于经平衡后的阴离子交换柱，冲洗、流穿后收集上样流穿液和冲洗流穿液，所述阴离子交换柱的填料例如为DEAE Sepharose FF；优选所述平衡使用3倍柱体积的平衡液，和/或，所述冲洗使用3倍柱体积的冲洗液；和/或，
(2)将所述上样流穿液和冲洗流穿液合并上样于经平衡后的阳离子交换柱，冲洗、流穿后使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，所述阳离子交换柱的填料例如为SPSepharose FF；优选所述平衡使用3倍柱体积的平衡液，和/或，所述冲洗使用3倍柱体积的冲洗液，和/或，所述洗脱使用3倍柱体积的洗脱缓冲液。
较佳地，所述阴离子交换柱的平衡液和冲洗液均为50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA；和/或，所述阳离子交换柱的平衡液和冲洗液均为50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA；和/或，所述洗脱缓冲液为50mmol/LPBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA和0.1～0.2mol/L NaCl，优选0.14mol/L NaCl。
在一具体实施例中，还包括以下步骤：
(3)用(NH4)2SO4将所述的洗脱液中(NH4)2SO4浓度调节至1mol/L，平衡后将所述的洗脱液上样疏水层析柱，收集上样流穿液和冲洗流穿液，所述疏水层析柱的填料例如为Phenyl Bestarose HP。
较佳地，所述平衡使用3倍柱体积的平衡液，和/或，所述冲洗使用3倍柱体积的冲洗液。
更佳地，所述疏水层析柱的平衡液和冲洗液均为50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/LEDTA和1mol/L(NH4)2SO4。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之七为：提供一种如技术方案之一所述的分离的核酸、技术方案之二所述的表达载体、技术方案之三所述的表达菌株在制备疫苗中的用途。
优选地，所述用途包括预防流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎、呼吸道感染、中耳炎例如急性中耳炎。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明通过密码子优化及低温诱导使得rPD蛋白大量可溶性表达，30L发酵罐规模下，可溶性rPD产量可达36.78mg rPD/g菌体；两步法纯化工艺极大限度提升了目标蛋白的回收率，精蛋白收率可达73.37％，SDS-PAGE电泳和毛细管电泳纯度均达98％以上，内毒素含量低于0.1EU/μg；这意味本发明在放大生产过程中具有极佳的应用前景。
经生物信息学分析，rPD蛋白理论分子量为39.9KDa，酸性氨基酸残基总数为50，碱性氨基酸残基总数为45，理论等电点为6.19，亲水性平均总值为-1.299，消光系数为1.53。
附图说明
图1为密码子优化前后rPD蛋白核苷酸序列对比图。
图2为pET30a-rPD载体构建示意图。
图3为rPD表达株摇瓶诱导表达验证SDS-PAGE电泳图谱。
图4为rPD蛋白DEAE柱层析和SP柱层析层析图谱。
图5为rPD精蛋白精确分子量测定图谱。
图6为rPD精蛋白SDS-PAGE电泳纯度分析图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
密码子优化前后rPD蛋白核苷酸序列对比图如图1所示。
编码rPD蛋白的核苷酸序列为：
AGCAGTCATAGCAGCAATATGGCCAATACCCAGATGAAATCAGATAAGATTATCATTGCACACCGTGGTGCAAGCGGTTATCTGCCGGAACATACCCTGGAAAGTAAAGCACTGGCCTTTGCCCAGCAGGCCGATTATCTGGAACAGGATCTGGCCATGACCAAAGATGGCCGTCTGGTGGTTATTCATGATCATTTCCTGGATGGCCTGACCGATGTTGCCAAGAAATTTCCGCATCGCCATCGCAAAGATGGTCGTTATTATGTGATTGATTTCACCCTGAAAGAAATTCAGAGTCTGGAAATGACCGAGAATTTCGAAACCAAAGATGGTAAACAGGCACAGGTTTATCCGAATCGTTTCCCGCTGTGGAAATCACATTTCCGCATTCATACCTTTGAAGATGAAATTGAATTCATCCAGGGTCTGGAGAAATCTACCGGCAAGAAAGTTGGTATCTATCCGGAAATTAAGGCACCTTGGTTTCATCATCAGAATGGTAAAGATATTGCCGCAGAAACCCTGAAAGTGCTGAAGAAATATGGCTATGATAAGAAGACTGATATGGTTTATCTGCAGACCTTTGATTTCAATGAACTGAAACGCATTAAGACCGAACTGCTGCCGCAGATGGGCATGGATCTGAAACTGGTTCAGCTGATTGCATATACCGATTGGAAAGAAACCCAGGAGAAAGATCCGAAAGGTTATTGGGTTAATTATAATTACGACTGGATGTTTAAGCCGGGTGCAATGGCCGAAGTTGTGAAATATGCAGATGGTGTGGGTCCGGGTTGGTATATGCTGGTTAATAAGGAAGAAAGCAAACCGGATAATATTGTGTATACACCTCTGGTGAAAGAACTGGCACAGTATAATGTGGAAGTGCATCCGTATACCGTTCGCAAAGATGCACTGCCGGAATTCTTTACCGATGTGAATCAGATGTATGATGCCCTGCTGAATAAGAGCGGTGCAACCGGTGTGTTTACCGATTTCCCGGATACCGGTGTTGAATTTCTGAAAGGCATTAAG(SEQ ID NO:1)
含有rPD蛋白的表达载体中目标蛋白的氨基酸序列为：
SSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETKDGKQAQVYPNRFPLWKSHFRIHTFEDEIEFIQGLEKSTGKKVGIYPEIKAPWFHHQNGKDIAAETLKVLKKYGYDKKTDMVYLQTFDFNELKRIKTELLPQMGMDLKLVQLIAYTDWKETQEKDPKGYWVNYNYDWMFKPGAMAEVVKYADGVGPGWYMLVNKEESKPDNIVYTPLVKELAQYNVEVHPYTVRKDALPEFFTDVNQMYDALLNKSGATGVFTDFPDTGVEFLKGIK(SEQ ID NO:2)
实施例1rPD表达株构建
根据GenBank NO.M37487.1公布的流感嗜血杆菌PD蛋白序列，对其全长364个氨基酸进行生物信息学分析，剔除信号肽和成熟肽中的第一个氨基酸(半胱氨酸)，获得20-364位氨基酸对应的核苷酸序列，并在两端分别加入NdeI和XhoI酶切位点，进行全片段化学合成；
将合成好的核苷酸序列优化后核苷酸序列连接至T载体，并转化至DH5α感受态细胞，将测序正确的菌液用试剂盒提取质粒，再将质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，再次提取质粒，测序正确后保种，-80℃储存(载体构建示意图见图2)。
实施例2rPD表达株表达量及表达方式鉴定
将甘油菌用接种环三线法接种至固体LB(含30μg/ml Kana)培养基中，37℃倒置过夜培养；
挑取平板中长势较好的单克隆菌落至LB(含30μg/ml Kana)液体培养基中(15mL)，32℃，140rpm过夜培养；
将过夜培养的菌液按1:100接种比例接种至400mL新鲜液体LB(含30μg/ml，Kana)培养基中，37℃，220rpm培养至A600nm＝0.6-0.8，约3h；加入IPTG，使得IPTG终浓度为0.1mmol/L，28℃，220rpm开始诱导，诱导前及诱导后每2小时取样一次，测定A600nm；
将诱导4h的样品进行均质机破碎，900bar破碎3次；取破碎后样品10000rpm离心15min，收集上清和沉淀；
对诱导前样品、诱导后样品、破碎样品进行还原SDS-PAGE电泳分析；样品按照相应的A600nm值用0.9％NaCl复溶至5A600nm/管；
本发明发现37℃诱导条件下，基本均为包涵体表达；32℃诱导条件下，仅部分可溶性表达。而本实施例中的28℃诱导表达，实现了完全可溶性表达。如图3所示，图3的a为28℃诱导条件下表达分析，其中，M为Marker；lane1为诱导前样品；lane2为诱导2h样品；lane3为诱导4h样品；lane4和lane5为诱导4h样品破碎上清；lane6和lane7为诱导4h样品破碎沉淀。图3的b为37℃诱导条件下表达分析，其中，M为Marker；lane1为诱导前样品；lane3、4、5和7为诱导3h样品；lane8为诱导3h破碎上清；lane9为诱导3h样品破碎沉淀。结果显示，图3的a中诱导4h样品破碎液上清中rPD占上清液总菌体蛋白的48.47％；图3的b中诱导3h样品破碎上清液中rPD占上清液中菌体蛋白的24.53％；表明pET30a-rPD表达株在28℃诱导条件下实现了可溶性高表达。
实施例3 30L发酵罐规模下的rPD蛋白发酵
取一支冻存的甘油菌，取0.5mL接种到装有1L培养基的三角瓶中进行培养；每瓶加入1mL 30mg/mL硫酸卡那霉素。摇床设定温度32℃，转速为140rpm，摇育过夜，A600nm达到1～3之间；
10L基础培养基(终体积20L)，待温度达到设定温度35±0.5℃，在火焰保护无菌状态下，开始接种。接种前加入20mL 30mg/mL硫酸卡那霉素(终浓度30μg/mL)，以及无机盐溶液(K2HPO4、MgSO4)，种子液接种比例为1:2.5。发酵工艺参数为：pH7.0；100～600rpm；300～400L/H；罐压0.05MPa；溶氧≥30％；
过程中加入消泡剂消除泡沫，当A600nm达到1以上，开始进行分批补料，每小时补料一次，分阶段进行，在对数期完成补料；每小时测A600nm，染色镜检；
A600nm值达到10左右时，开始降温至28℃，然后开始降温诱导；
加入已过滤除菌的诱导剂IPTG，至终浓度为0.1mmol/L，诱导4小时发酵结束；
诱导结束，停止发酵，放料收获发酵液。
实施例4精氨酸提取法粗处理提取可溶性rPD蛋白
收获发酵液20L，使用0.45μm膜包将发酵液浓缩至一定体积后收集，再加入一定体积纯水洗膜后收集，重复2次，使得菌体浓缩液的菌体浓度约为0.3g菌体/mL，最终收集菌体约736.8g。
取上述菌体浓缩液560ml(即168g菌体)进行高渗，即向菌体浓缩液中边搅拌边加入精氨酸粉末，使其终浓度为0.5mol/L，在室温条件下，搅拌作用3h。
使用50mmol/L，Tris-HCl，pH8.0，含1mmol/L EDTA低渗液10倍体积稀释高渗处理液，在室温条件下，静置不少于12h。
使用0.45μm膜包对混合液进行膜过滤处理，收集澄清流穿液。
使用10kDa膜包对澄清流穿液进行浓缩处理，当浓缩至一定体积后，使用置换液(50mmol/L PBS缓冲液，pH6.5，含1mmol/L EDTA)对浓缩截留液进行4次缓冲液置换处理，当最后一次缓冲液置换结束后，对样品进行收集，收集后加入一定体积的缓冲液对膜包进行润洗，重复4次，收集浓缩置换液。
如表1所示，对发酵样品和粗处理样品进行表达分析，20L发酵液共收获菌体约1020.60g，诱导4h发酵液中rPD含量约为36.47g，即发酵液中rPD产量为49.5mg/g菌体。经菌体浓缩、高渗、低渗、澄清、浓缩及置换等粗处理后，可溶性rPD产量为36.78mg/g菌体，粗处理过程rPD回收率为74.30％。
表1发酵样品和粗处理样品表达量分析
Figure BDA0003058516140000101
注：表1中rPD含量由SDS-PAGE电泳图谱分析得出。
实施例5两步法纯化工艺纯化rPD蛋白
50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA的平衡液(冲洗液的配方与此相同)对DEAESepharose FF(BXK50/30，CV＝376mL)层析柱平衡3CV，粗处理获得的粗样上样DEAESepharose FF层析柱，冲洗液冲洗流穿3CV，收集上样流穿液和冲洗流穿液。
50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA的平衡液(冲洗液的配方与此相同)对SPSepharose FF(BXK50/30，CV＝428mL)层析柱平衡3CV，将DEAE上样流穿液和冲洗流穿液的合并液上样SP Sepharose FF(BXK50/30，CV＝428mL)层析柱，再用冲洗液冲洗3CV，用50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA和0.14mol/L NaCl的洗脱缓冲液洗脱3CV，收集洗脱液(层析图谱见图4，图4的a为DEAE柱层析，图4的b为SP柱层析，图4的c为HIC柱层析)。
如表1所示，经DEAE和SP两步纯化后，SP洗脱液纯度达98.94％，总回收率达73.37％，内毒素含量小于检测限，表明两步法纯化工艺即可获得高收率、高纯度和低内毒素含量的rPD蛋白。
实施例6三步法纯化工艺纯化rPD蛋白
50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA平衡液(冲洗液的配方与此相同)对DEAESepharose FF(BXK50/30，CV＝376mL)层析柱平衡3CV，粗处理获得的粗样上样DEAESepharose FF层析柱，冲洗液冲洗流穿3CV，收集上样流穿液和冲洗流穿液。
50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA平衡液(冲洗液的配方与此相同)对SPSepharose FF(BXK50/30，CV＝428ml)层析柱平衡3CV，将DEAE上样流穿液和冲洗流穿液的合并液上样SP Sepharose FF(BXK50/30，CV＝428mL)层析柱，再用冲洗液冲洗3CV，用50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA和0.14mol/L NaCl的洗脱缓冲液洗脱3CV，收集洗脱液。
用2mol/L(NH4)2SO4溶液将SP洗脱液中(NH4)2SO4浓度调节至1mol/L。
50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA和1mol/L(NH4)2SO4平衡液(冲洗液的配方与此相同)对Phenyl Bestaeose HP(BXK50/30，CV＝465mL)层析柱平衡3CV，将上述调节好的洗脱液上样于Phenyl Bestaeose HP(BXK50/30，CV＝465mL)层析柱，用冲洗液冲洗3CV，收集上样流穿液和冲洗流穿液(层析图谱见图4，图4的a为DEAE柱层析，图4的b为SP柱层析，图4的c为HIC柱层析)。
如表2所示，经DEAE、SP和HIC三步纯化后，HIC洗脱液纯度达99.54％，总回收率为40.51％，内毒素含量小于检测限。与两步法纯化工艺相比，纯度与内毒素含量指标基本一致，但总回收率约为两步法纯化工艺的一半，因此，优选两步法纯化工艺。
表2两步法和三步法纯化工艺指标参数比较
Figure BDA0003058516140000111
注：上表纯度数据为SDS-PAGE电泳图谱经软件分析所得；rPD含量数据由Lowrry法蛋白定量实验所得；内毒素含量由动态浊度法测定所得。
实施例7rPD精蛋白的精确分子量、纯度及内毒素含量检测
7.1rPD精蛋白的精确分子量测定
精蛋白样品采用超高效液相色谱系统U3000(Thermofisher公司)进行分离，流动相A为0.1％FA水溶液，流动相B为0.1％FA的乙腈溶液。色谱柱为C4(Thermo MAbPacTMRP，2.1mmX50mm，4μm)。流速为：0.3mL/min，柱温70℃。液相梯度如下：
Figure BDA0003058516140000121
用高分辨质谱仪Q Exactive Plus(Thermofisher公司)对其进行精确分子量测定，分析时长：15min；检测方式：正离子；扫描范围：900-3000m/z；分辨率：17500。原始数据由Biopharmafinder 1.0软件处理；实验类型：Manual RespectTM；质量容差:20ppm；干扰抑制:95％置信度。
如图5所示，图5的a为质谱原始图谱，图5的b为去卷积后相对平均分子量图。结果显示，rPD精蛋白精确分子量为39.965KDa，与理论分子量基本一致。
7.2SDS-PAGE法纯度测定
精蛋白经Lowrry法测定浓度后，准确将10μg rPD精蛋白分别进行还原和非还原SDS-PAGE电泳(分离胶浓度为12％)，80v电泳30分钟，120v电泳约1h，直至溴酚蓝条带到达分离胶底部时停止电泳；将凝胶剥离，加入考马斯亮蓝染色液染色2h，弃染色液，再加入脱色液脱色，期间每2h更换脱色液；待脱色至背景为透明时，停止脱色；使用凝胶成像仪进行SDS-PAGE图谱分析。
结果如图6所示，还原电泳条件下(lane1、lane2、lane3)，rPD精蛋白纯度为98.36％；非还原电泳条件下(lane5、lane6、lane7)，rPD精蛋白纯度为98.01％。
7.3动态浊度法内毒素含量测定
配制4组细菌内毒素工作标准品溶液，标准品溶液内毒素含量分别为10EU/mL、2.5EU/mL、0.625EU/mL和0.156EU/mL，每一浓度制备3份平行，同时设立阴性对照。将样品用细菌内毒素检测用水稀释至细菌内毒素浓度在0.156-10EU/mL之间，制备2份平行供试品溶液，供试品稀释倍数应不超过最大有效稀释倍数。设立阳性加标溶液，利用鲎试剂对样品进行检测，绘制标准曲线。标准曲线相关系数绝对值应≥0.980，加标回收率应在50％-200％之间，阴性对照内毒素含量应小于检测限，样品检测数据才有效。
经内毒素含量检测发现，DEAE流穿液中内毒素含量为423.3EU/μg rPD，SP洗脱液中内毒素含量小于检测限，表明两步法纯化能有效去除内毒素。
序列表
<110> 江苏坤力生物制药有限责任公司
<120> 一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途
<130> P21013284C
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1035
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码rPD蛋白的核苷酸序列
<400> 1
agcagtcata gcagcaatat ggccaatacc cagatgaaat cagataagat tatcattgca 60
caccgtggtg caagcggtta tctgccggaa cataccctgg aaagtaaagc actggccttt 120
gcccagcagg ccgattatct ggaacaggat ctggccatga ccaaagatgg ccgtctggtg 180
gttattcatg atcatttcct ggatggcctg accgatgttg ccaagaaatt tccgcatcgc 240
catcgcaaag atggtcgtta ttatgtgatt gatttcaccc tgaaagaaat tcagagtctg 300
gaaatgaccg agaatttcga aaccaaagat ggtaaacagg cacaggttta tccgaatcgt 360
ttcccgctgt ggaaatcaca tttccgcatt catacctttg aagatgaaat tgaattcatc 420
cagggtctgg agaaatctac cggcaagaaa gttggtatct atccggaaat taaggcacct 480
tggtttcatc atcagaatgg taaagatatt gccgcagaaa ccctgaaagt gctgaagaaa 540
tatggctatg ataagaagac tgatatggtt tatctgcaga cctttgattt caatgaactg 600
aaacgcatta agaccgaact gctgccgcag atgggcatgg atctgaaact ggttcagctg 660
attgcatata ccgattggaa agaaacccag gagaaagatc cgaaaggtta ttgggttaat 720
tataattacg actggatgtt taagccgggt gcaatggccg aagttgtgaa atatgcagat 780
ggtgtgggtc cgggttggta tatgctggtt aataaggaag aaagcaaacc ggataatatt 840
gtgtatacac ctctggtgaa agaactggca cagtataatg tggaagtgca tccgtatacc 900
gttcgcaaag atgcactgcc ggaattcttt accgatgtga atcagatgta tgatgccctg 960
ctgaataaga gcggtgcaac cggtgtgttt accgatttcc cggataccgg tgttgaattt 1020
ctgaaaggca ttaag 1035
<210> 2
<211> 345
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 含有rPD蛋白的表达载体中目标蛋白的氨基酸序列
<400> 2
Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp Lys
1 5 10 15
Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His Thr
20 25 30
Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp Tyr Leu Glu
35 40 45
Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His Asp
50 55 60
His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His Arg
65 70 75 80
His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys Glu
85 90 95
Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys Asp Gly Lys
100 105 110
Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys Ser His Phe
115 120 125
Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu Glu
130 135 140
Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala Pro
145 150 155 160
Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu Thr Leu Lys
165 170 175
Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met Val Tyr Leu
180 185 190
Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr Glu Leu Leu
195 200 205
Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile Ala Tyr Thr
210 215 220
Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr Trp Val Asn
225 230 235 240
Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala Glu Val Val
245 250 255
Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu Val Asn Lys
260 265 270
Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu Val Lys Glu
275 280 285
Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val Arg Lys Asp
290 295 300
Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr Asp Ala Leu
305 310 315 320
Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe Pro Asp Thr
325 330 335
Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys
340 345

Claims (10)

1.一种编码rPD蛋白的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQID No:1所示。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求1所述的分离的核酸。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET27b或pET30a；优选地，所述载体为pET30a。
4.一种表达菌株，其特征在于，所述表达菌株包含如权利要求1所述的分离的核酸，或如权利要求2或3所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的表达菌株，其特征在于，所述表达菌株的宿主菌为大肠杆菌；优选地，所述菌株为BL21(DE3)。
6.一种rPD蛋白的发酵工艺，其特征在于，培养如权利要求4或5所述的表达菌株，获得发酵液；所述发酵工艺的发酵温度例如为32～37℃，所述发酵液的A600nm值例如为10左右时，添加诱导剂；诱导剂为IPTG，诱导温度例如为16～28℃，诱导时长例如为4h～12h；优选地，所述诱导温度为28℃，所述IPTG的终浓度为0.05～0.5mmol/L。
7.一种rPD蛋白的粗处理方法，其特征在于，所述粗处理方法包含利用精氨酸对如权利要求6所述的发酵工艺获得的发酵液进行高渗处理，以获得rPD蛋白溶液；优选地，所述高渗处理使用精氨酸进行，且随后进行低渗处理；更优选地，所述粗处理方法包括以下步骤：
(1)将所述发酵液进行超滤浓缩，收集菌体浓缩液；
(2)在所述菌体浓缩液中加入精氨酸，室温搅拌例如3h，形成高渗处理液；
(3)将所述高渗处理液按照1:10体积比例与低渗液混合，室温静置例如静置过夜或静置12小时以上，获得混合液；
(4)将所述混合液进行澄清，收集澄清流穿液；
(5)将所述澄清流穿液进行浓缩，收集浓缩截留液；
(6)将所述浓缩截留液使用置换液进行置换，优选置换3～4次，获得浓缩置换液；
进一步更优选地，使用0.45μm、10Kda～30Kda的膜包进行超滤浓缩和/或澄清，和/或，所述高渗处理液中精氨酸的终浓度为0.5mol/L；和/或，所述菌体浓缩液中菌体浓度为0.3g菌体/mL；和/或，所述低渗液为50mmol/L Tris-HCl、pH8.0、含1mmol/L EDTA；和/或，所述置换液为50mmol/L PBS缓冲液、pH6.5、含1mmol/L EDTA。
8.一种rPD蛋白的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)将如权利要求7所述的粗处理方法得到的浓缩置换液上样于经平衡后的阴离子交换柱，冲洗、流穿后收集上样流穿液和冲洗流穿液，所述阴离子交换柱的填料例如为DEAESepharose FF；优选所述平衡使用3倍柱体积的平衡液，和/或，所述冲洗使用3倍柱体积的冲洗液；和/或，
(2)将所述上样流穿液和冲洗流穿液合并上样于经平衡后的阳离子交换柱，冲洗、流穿后使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，所述阳离子交换柱的填料例如为SP SepharoseFF；优选所述平衡使用3倍柱体积的平衡液，和/或，所述冲洗使用3倍柱体积的冲洗液，和/或，所述洗脱使用3倍柱体积的洗脱缓冲液；
较佳地，所述阴离子交换柱的平衡液和冲洗液均为50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/LEDTA；和/或，所述阳离子交换柱的平衡液和冲洗液均为50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/LEDTA；和/或，所述洗脱缓冲液为50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/L EDTA和0.1～0.2mol/LNaCl，优选0.14mol/L NaCl。
9.如权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，还包括以下步骤：
(3)用(NH4)2SO4将所述的洗脱液中(NH4)2SO4浓度调节至1mol/L，平衡后将所述的洗脱液上样疏水层析柱，收集上样流穿液和冲洗流穿液，所述疏水层析柱的填料例如为PhenylBestarose HP；
较佳地，所述平衡使用3倍柱体积的平衡液，和/或，所述冲洗使用3倍柱体积的冲洗液；
更佳地，所述疏水层析柱的平衡液和冲洗液均为50mmol/L PBS，pH6.5，含1mmol/LEDTA和1mol/L(NH4)2SO4。
10.如权利要求1所述的分离的核酸、权利要求2或3所述的表达载体、权利要求4或5所述的表达菌株在制备疫苗中的用途；
优选地，所述用途包括预防流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎、呼吸道感染、中耳炎例如急性中耳炎。
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