CN111606978B

CN111606978B - 一种去除大肠杆菌重组表达猪细小病毒vp2蛋白中内毒素的方法

Info

Publication number: CN111606978B
Application number: CN202010515345.6A
Authority: CN
Inventors: 刘运超; 张改平; 王聚财; 陈玉梅; 尚延丽; 王方雨; 魏蔷; 冯华; 杨苏珍; 柴书军; 金前跃; 邓瑞广
Original assignee: Henan Zhongze Biological Engineering Co ltd; Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Zhongze Biological Engineering Co ltd; Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2040-06-09
Also published as: CN111606978A

Abstract

本发明提供一种去除大肠杆菌表达重组猪细小病毒VP2蛋白中内毒素的方法，包括猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液制备、氢氧化铝悬液制备、氢氧化铝吸附和层析法分离步骤。通过氢氧化铝吸附和复合模式层析介质分离两步，可以有效去除大肠杆菌表达系统中重组蛋白的内毒素，操作简单实用，符合规模化生产需求。采用本发明方法处理后的生物制品的VP2蛋白内毒素含量小于200EU/mL，且对VP2蛋白抗原活性无明显影响，安全性好，处理后的蛋白可在制备疫苗、药物类等生物制品中应用，解决了PPV疫苗生产中的核心技术问题。

Description

一种去除大肠杆菌重组表达猪细小病毒VP2蛋白中内毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种去除大肠杆菌表达重组猪细小病毒VP2蛋白中内毒素的方法，属于生物医药领域。

背景技术

内毒素(endotoxin)是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质，一般在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中，也可以从活细胞中直接泄漏出来。因为革兰氏阴性菌无处不在，所以内毒素几乎存在于任何地方。在疫苗生产中一定要重视和尽可能减少内毒素的污染。生产用水中内毒素的含量是导致疫苗安全性的关键因素之一。大量研究表明，疫苗生产过程中内毒素主要来源于培养液和配制用水，其在贮存过程中易受到革兰氏阴性菌的污染。生产用具、管道、泵、阀门、滤器等的清洗消毒不彻底也会造成内毒素污染。生产原料的污染，如血液制品，细胞培养基。人为操作不规范也会引起内毒素污染。而生物制品中，内毒素的污染广泛存在，比如，单克隆抗体作为生物大分子药物，生产和纯化工艺复杂，有诸多环节可能将内毒素带入，因此需要去除内毒素，保证生物制品的安全性。各国药监部门对生物产品中的内毒素含量也均有严格规定。欧洲药典规定注射剂内毒素限度不得高于5EU/(kg·h)，EU为内毒素单位，每EU内毒素约相当于100pg。随着生物制品的大量使用，对生物制品中内毒素残留限的要求越高，但是因为内毒素分子结构复杂且不均一，导致内毒素可以多种方式与溶液中的蛋白质相互作用，形成复合物，大大增加了去除的难度。并且，在去除内毒素的同时，还要尽可能减小活性成分的损失。

猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)是一种DNA病毒，主要引起猪细小病毒病，又称为猪繁殖障碍病。该病以怀孕母猪发生流产、死胎、产木乃伊为特征，特别是初产母猪发病率较高，但母猪本身无明显的症状。因此，该病难以察觉，危害极大，严重影响母猪的生产繁育。VP2蛋白是PPV的主要结构蛋白，重组VP2蛋白免疫原性强，能够刺激强的免疫应答反应，是理想的PPV疫苗靶标。大肠杆菌重组表达PPVVP2蛋白具有良好的蛋白结构和免疫原性，产量高生产成本低，操作简单，是生产猪细小病毒疫苗的理想抗原。但是大肠杆菌含有大量的内毒素，重组大肠杆菌细胞经破碎后内毒素释放到蛋白溶液中，其含量可以达到10⁶EU以上。由于内毒素含量高，采用传统方法清除较为困难，严重影响了大肠杆菌重组表达PPVVP2蛋白在生物制品领域的应用。目前，常用的去除内毒素的方法有活性炭吸附、萃取、超滤、离子交换色谱等，不同的技术方案适合不同的应用场景，但是这些方案总体存在内毒去除效果不佳、清除效率太低、成本过高等问题，是生产中的一大难题。经检索，发明专利申请《一种生物制品的内毒素去除方法》(CN 104710527A)提出一种利用羟基磷灰石去除内毒素的技术方法，由于该方法所用基质羟基磷灰石的内毒素载量有限，因此内毒素去除效率较低，适合用于动物细胞表达系统表达生物制品或者单克隆抗体等内毒素含量较低(100EU/mg以下)的样品中内毒素的去除。若用于大肠杆菌中内毒素清除需要消耗大量羟基磷灰石，成本昂贵，处理能力有限，不适合用于清除大肠杆菌来源的生物制品中的10⁶EU以上内毒素的清除。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种去除大肠杆菌表达重组猪细小病毒VP2蛋白中内毒素的方法，该方法针对大肠杆菌表达重组猪细小病毒VP2蛋白的理化特性和内毒素特征，提出一种包括氢氧化铝吸附和复合模式层析介质分离的两步法，用于清除重组PPV VP2蛋白中的内毒素，解决PPV疫苗生产中的核心技术问题。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种去除大肠杆菌重组表达猪细小病毒VP2蛋白中内毒素的方法，包括如下步骤：

(1)猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液的制备：采用大肠杆菌表达系统重组表达猪细小病毒VP2蛋白，经高速离心、硫酸铵沉淀，收集得猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液；

(2)氢氧化铝悬液的制备：将氢氧化钠和氯化铝混合，pH为6.0～6.8，在2～8℃条件下反应，得到20g/L的氢氧化铝悬液；

(3)氢氧化铝吸附：对步骤(1)所得的猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液进行预处理，随后缓慢加入步骤(2)所得的氢氧化铝悬液进行吸附，边加入边搅拌，温度为2～8℃，转速为100rpm，搅拌时间为1～3h，搅拌完成后，离心处理得去除内毒素后的蛋白溶液上清液；

重复氢氧化铝悬液吸附1次；其中每次氢氧化铝悬液的加入量均按Al₂O₃的浓度计算，当Al₂O₃在VP2蛋白抗原溶液中的浓度为0.1mg/mL时，停止加入氢氧化铝悬液；

(4)层析法分离：采用吸附层析法，将步骤(3)所得的去除内毒素后的蛋白溶液上清液进行预处理，随后以一定的流速上样到层析介质，上样前先用清洗液清洗层析柱，然后用平衡缓冲液平衡层析柱，上样时收集上样流穿溶液，上样完成后用2倍柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，收集层析柱流出液，合并流穿溶液与层析柱流出液，得到去除内毒素的猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液。

所述步骤(1)中大肠杆菌表达系统重组表达猪细小病毒VP2蛋白的方法为：构建猪细小病毒VP2蛋白重组表达菌株，将活化后的猪细小病毒VP2重组菌株接种于LB培养基，在温度37℃、转速220rpm摇床培养3～5h，待菌株培养液的吸光值OD600达到0.8～1.2，加入终浓度为0.1～0.15mM IPTG诱导重组表达的猪细小病毒VP2蛋白，在温度25℃、转速220rpm摇床中继续培养12～16h。

所述步骤(1)中猪细小病毒VP2蛋白抗原溶液的收集方法具体为：

a、以8000rpm的转速离心处理经大肠杆菌表达系统重组表达的猪细小病毒VP2蛋白溶液，收集离心后沉淀，即得到重组表达VP2蛋白大肠杆菌菌体，称量菌体湿重，加入pH值为6.3的10mM PB缓冲液重悬菌体，其中菌体湿重的质量与PB缓冲液的体积比为1:20；

b、将步骤a经PB缓冲液重悬后的大肠杆菌菌体，先用超声破碎或高压均质机破碎，再以8000rpm的转速离心处理破碎的菌体，收集离心后上清，去除破碎菌体碎片，即得到破碎菌体上清溶液；

c、向步骤b收集的破碎菌体上清溶液中加入硫酸铵，边加入边搅拌，形成40％饱和度的硫酸铵溶液，以100rpm的转速持续搅拌2h后，再以8000rpm的转速，2～8℃条件下离心30min，收集离心后沉淀；

d、向步骤c收集的沉淀中加入10mM PBS缓冲液使沉淀溶解，加入的PBS缓冲液体积与步骤(a)中的PB缓冲液的体积相同，即得猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液。

其中超声破碎的条件为：工作3s、间歇5s、功率60w、时间15min，将重悬的菌液置于冰水混合浴中，探头插入液面以下1.0～2.0cm，开始超声破碎；

高压均质机破碎的条件为：压力800bar，温度控制在5～10℃，进样速度为480mL/min，高压破碎1遍。

所述步骤(3)中猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液预处理的方法为：加入10mM PB缓冲液，调整pH为6.0～6.8，温度为2～8℃；所述离心处理的离心力为7000g～9000g，离心温度为4-8℃，离心时间为20～40min。

所述步骤(3)中猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液预处理的方法为：加入10mM PB缓冲液，调整pH为6.2～6.5，温度为2～8℃；所述离心处理的离心力为8000g，离心温度为6℃，离心时间为30min。

所述步骤(4)中去除内毒素后的蛋白溶液上清液预处理的方法为：加入含200mM氯化钠的10mM PB缓冲液，调整pH为8.0，在2～8℃下搅拌3～5h。

所述步骤(2)中的pH为6.2～6.5；所述步骤(3)中的搅拌时间为2小时。

所述步骤(4)中吸附层析法所用填料为复合模式层析介质Capto^TMCore700；所用清洗液为含有30％(体积含量)异丙醇的1mol/LNaOH；所用平衡缓冲液pH为8.0、含200mM氯化钠的10mM PB缓冲液；流速为1/10～1/20柱体积每分钟。

所述去除内毒素的猪细小病毒重组VP2蛋白在制备疫苗和药物制剂类生物制品中的应用。

本发明有益效果：

1、本发明利用氢氧化铝凝胶带正电荷的特性，在pH为6.2～6.5的条件下，可与内毒素中带负电的磷酸基团共价结合，而PB缓冲液中磷酸根和合适的pH条件，可降低或防止氢氧化铝对VP2蛋白抗原的吸附，降低VP2蛋白的损失，从而有效吸附溶液的内毒素。

2、本发明利用VP2蛋白在体外可自动组装形成病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)的特性，将氢氧化铝处理后的VP2蛋白溶液在2～8℃，pH为8.0，含有200mMNaCl的10mM PB缓冲液中搅拌4h以上，促进重组VP2蛋白组装成VLPs，组装效率可达90％以上，其粒径在20-30nm之间，具备红细胞凝集活性。

3、本发明利用复合模式层析介质Capto^TMCore700具有分离以及吸附层析的双重功能，VP2蛋白形成的病毒样颗粒在层析柱的穿流中被收集起来，同时较小的杂质以及内毒素会与微球内在配基结合，达到对VP2蛋白溶液中内毒素进一步净化的目的。与传统凝集过滤层析、离子交换层析相比，本发明中采用的层析介质具备高载量、高流速和操作简单方便等特点，显著提高生产效率，适合生物制品大规模生产使用。

4、本发明提供的氢氧化铝吸附和复合模式层析介质Capto^TMCore700分离两步法，可以有效去除大肠杆菌表达系统中重组蛋白的内毒素，方法操作简单实用，符合规模化生产的需求。采用本发明方法处理后的生物制品的VP2蛋白内毒素含量小于200EU/mL，且对VP2蛋白的抗原活性无明显影响，安全性好，具有良好的临床应用前景。

5、控制药品中内毒素含量，对疫苗和蛋白质药物的研究至关重要，含内毒素制剂注射到人和动物体内会引起发热、休克、多器官损伤甚至死亡。大肠杆菌表达系统具有产量高、成本低、操作简便等优点，但是该内毒素含量限制了该技术在疫苗和制药领域的应用，本申请提供一种高效、便捷的去除大肠杆菌重组表达PPVVP2蛋白内毒素的方法，处理后的蛋白可在制备疫苗、药物类等生物制品中应用，解决了PPV疫苗生产中的核心技术问题。

附图说明

图1猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒电镜图；

图2猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒动态光散射图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1重组PPVVP2蛋白抗原溶液的制备

(1)采用大肠杆菌表达系统重组表达PPVVP2蛋白

采用经本团队前期研究结果验证的猪细小病毒VP2蛋白氨基酸序列，经大肠杆菌密码子优化后，采用基因合成方法合成VP2蛋白编码基因，将编码基因插入PET-28a载体BamHI和Xhol酶切位点之间，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经过基因测序鉴定，成功构建猪细小病毒VP2蛋白重组表达菌株。活化后的VP2重组菌株，接种LB培养基，在温度37℃、转速220rpm摇床中培养3h，待菌株培养液的吸光值OD600达到1.0左右，加入终浓度为0.1mMIPTG诱导重组蛋白PPVVP2表达，在温度25℃、转速220rpm摇床中继续培养12h。

目前常用的杆状病毒和动物细胞表达方法，VP2蛋白的表达量在1-5mg/L，该方法产率低、成本高、周期长、培养要求条件高等缺点严重限制了其在兽用生物制品生产中的应用。采用本发明所述的大肠杆菌表达方法，在保证重组蛋白的生物活性的同时，可以大大提升蛋白的表达量，重组VP2蛋白的表达量可以达到1g/L，产量增加了2000倍以上。除此之外，大肠杆菌表达系统工艺简单、成本低廉、转化效率高、生长繁殖快、对设备和环境的要求低，可以快速实现大规模地生产目的蛋白，促进了以该系统表达的蛋白为抗原的疫苗在畜牧行业的推广应用。

(2)重组PPVVP2蛋白抗原溶液的收集

c、向步骤b收集的破碎菌体上清溶液中加入硫酸铵，边加入边搅拌，辅助溶解，形成40％饱和度的硫酸铵溶液，以100rpm的转速持续搅拌2h后，再以8000rpm的转速，2～8℃条件下离心30min，收集离心后沉淀；

其中，超声破碎的条件为：工作3s、间歇5s、功率60W、时间15min，将重悬的菌液置于冰水混合浴中，探头插入液面以下1.2cm左右，开始超声破碎；

高压均质机破碎的条件为：压力800bar，温度控制在5～17℃，进样速度为480mL/min，高压破碎1遍。

本方法采用高压破碎或者超声破碎方法处理重组表达菌体，可以小量也可以大批量处理工业级别的发酵液。首先选用高速离心去除破碎菌体碎片，随后采用硫酸铵沉淀法，使重组VP2蛋白在等电点附近沉淀，既可以对重组VP2蛋白进行粗纯化，又提升了重组VP2蛋白的回收效率。

实施例2去除大肠杆菌表达重组猪细小病毒VP2蛋白中的内毒素

(1)氢氧化铝吸附法去除重组PPVVP2蛋白抗原溶液中的内毒素

氢氧化铝：将氢氧化钠和氯化铝混合，pH为6.2～6.5，在2～8℃条件下反应，得到20g/L的氢氧化铝悬液；本实验所用氢氧化铝为商品化氢氧化铝，蛋白吸附不低于1.5mgBSA/mg氢氧化铝。

猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液预处理：加入10mM PB缓冲液，调整pH为6.2～6.5，温度为2～8℃。

氢氧化铝吸附：向转速为100rpm持续搅拌的重组PPVVP2蛋白抗原溶液中，缓慢加入氢氧化铝，边加入边搅拌，转速为100rpm，搅拌2小时，温度2～8℃，搅拌完成后，以8000g的离心力离心样品，离心温度为6℃，离心时间为30min，抽取离心后样品上清，得去除内毒素后的蛋白溶液上清液。

重复操作：重复上述氢氧化铝吸附试验1次，提升内毒素吸附效率；其中每次氢氧化铝悬液的加入量均按Al₂O₃的浓度计算，当Al₂O₃在VP2蛋白抗原溶液中的浓度为0.1mg/mL时，停止加入氢氧化铝悬液。

本申请方法针对大肠杆菌重组表达PPVVP2蛋白设计，具有针对性，通过调整氢氧化铝溶液及VP2蛋白抗原溶液的pH值，其中氢氧化铝能在pH为6.2～6.5的PB缓冲液中与带有强负电荷的内毒素高效结合。而在此PH值范围内PPVVP2蛋白带弱正电荷，能够降低VP2蛋白与氢氧化铝的结合效率，有效降低氢氧化铝对PPVVP2蛋白抗原的吸附，减少VP2蛋白的损失，增加蛋白收率，同时更有效吸附溶液中的内毒素，降低单位抗原中内毒素含量，提升内毒素清除效率。

(2)层析法分离重组PPVVP2蛋白抗原溶液中的内毒素

经氢氧化铝吸附处理后的重组PPVVP2蛋白抗原溶液预处理：加入含200mM氯化钠的10mM PB缓冲液，调整pH为pH8.0，在2～8℃下搅拌4h。

层析填料：采用GE公司的复合模式层析介质Capto^TMCore 700。

填料清洗：使用清洗液含30％(体积含量)异丙醇的1mol/LNaOH，清洗层析柱。

填料平衡：使用平衡缓冲液10mM PB+200mM NaCl、pH为8.0，平衡层析柱。

样品上样：将经过氢氧化铝吸附和样品前处理的猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液上样到层析介质Capto Core 700，流速为1/10-1/50柱体积每分钟，压力不大于0.3MP，收集上样流穿溶液。

样品收集：监测样品280nm波长处的紫外吸收峰，样品上样完成后用2倍柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，直至紫外吸收峰回到基线，收集层析柱流出液，合并流穿溶液与层析柱流出液，得到去除内毒素的猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液。

本申请方法首先利用VP2蛋白在体外可自动组装形成病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)的特性，将氢氧化铝处理后的VP2蛋白抗原溶液在2～8℃含有200mMNaCl的10mM PB，pH为8.0的溶液中搅拌4h以上，促进重组VP2蛋白组装成VLPs，组装效率可达90％以上，其粒径在20-30nm之间，具备红细胞凝集活性，如图1和图2所示。其次，利用Capto^TMCore700具有大小分离以及吸附层析的双重功能，形成的VLPs可穿流层析柱，同时分子量较小的内毒素分子会与微球内在配基结合，达到对PPVVP2蛋白溶液中内毒素进一步净化的目的。除此之外，与传统凝集过滤层析、离子交换层析相比，本发明中采用的层析介质具备高载量、高流速和操作简单方便等特点，显著地提高了生产效率，适合生物制品大规模生产使用。

实施例3重组PPV VP2蛋白抗原溶液中内毒素含量的测定

采用内毒素检测鲎试剂盒(试管定量显色基质法)，对经实施例2处理前后的重组PPV VP2蛋白抗原溶液中内毒素的含量进行检测。按内毒素检测鲎试剂盒的说明书进行检测，以下为详细说明。

配制细菌内毒素标准溶液，取细菌内毒素标准品1瓶，加入1mL细菌内毒素检查用水，置旋涡混匀器上剧烈振摇15min。将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释为10EU/mL的内毒素溶液，再稀释为1.0EU/mL的内毒素溶液。以1.0EU/mL的内毒素溶液为母液分别稀释成0.1，0.25，0.5，1.0EU/mL的浓度梯度。

对鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂等的溶解。加标示量细菌内毒素检查用水于鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂2和偶氮化试剂3中，加标示量反应终止剂于偶氮化试剂1中，显色基质溶液可在无污染的条件下于2～8℃贮存4周，偶氮化试剂溶液可于2～8℃贮存1周；最后取无热原试管，加入100μL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液或待检样品，再加入100μL鲎试剂溶液，混匀，盖上铝箔纸(试管包装铝箔)，37℃温育12min。温育结束，加入100μL显色基质溶液，混匀，37℃温育6min。温育结束，加入500μL偶氮化试剂1溶液，混匀，加入500μL偶氮化试剂2溶液，混匀加入500μL偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5min，于545nm波长处读取吸光度值。反应结束到读取吸光度值的时间不应超过5小时。根据标准品的吸光度值与内毒素含量的关系建立标准曲线，计算出待检样品的内毒素含量。

实验结果：采用本方法进行大肠杆菌重组表达蛋白中细菌内毒素的去除，可将猪细小病毒重组VP2蛋白中的内毒素含量由处理前的194500EU/mL降低到141EU/mL。检测结果见下表1。

表1重组PPVVP2蛋白抗原溶液中内毒素去除结果

编号	处理方法	内毒素含量(EU/mL)	内毒素去除率
				0	未处理样品	194500	--
1	氢氧化铝吸附1次	48236	75.2％
				2	氢氧化铝吸附2次	9406	80.5％
3	Capto<sup>TM</sup>Core700分离	141	98.5％

实施例4重组PPVVP2蛋白抗原溶液血凝效价的测定

对经实施例2处理前后的重组PPVVP2蛋白抗原溶液进行HA血凝试验，以检测在内毒素清除过程中抗原损失情况。具体方法如下：

(1)取96孔V型微量反应板，每孔25μL PBS溶液(0.01mol/L，pH 7.0～7.4)；

(2)分别向第一列各孔中加入未经实施例2处理样品、经氢氧化铝吸附1次、经氢氧化铝吸附2次、经Capto^TMCore 700分离的重组PPVVP2蛋白抗原溶液，各25uL。

(3)将上述重组PPVVP2蛋白抗原溶液与PBS溶液混匀后，随即抽出25uL加入第二列反应孔，再次混匀后加入第三孔并混匀，以此类推，直至第23孔，混匀后抽出25uL溶液，弃去。

(4)向每个反应孔再加入0.6％豚鼠红细胞悬液25μL，用微量震荡器混合均匀，置室温下静置1小时。

(5)判定结果时，以使50％红细胞凝集抗原最高稀释倍数作为判定终点。

实验结果：重组PPVVP2蛋白抗原溶液在内毒素去除前后血凝效价差异不大，表明VP2蛋白抗原损失较少，说明本发明可有效去除样品中内毒素的含量，且对VP2重组蛋白的抗原活性无明显影响，可应用于实际生产。检测结果见表2。

表2重组PPVVP2蛋白抗原溶液HA检测结果

对比例1

1、重组PPVVP2蛋白抗原溶液的制备方法，同实施例1。

2、内毒素的去除方法

除了如下参数的改变外，其余条件同实施例2。

编号1：氢氧化铝吸附蛋白溶液中内毒素时，重组PPVVP2蛋白抗原溶液的pH改为pH7.0～7.5。

编号2：Capto^TMCore700吸附层析分离时，经氢氧化铝吸附处理后的重组PPVVP2蛋白抗原溶液的pH改为pH 7.0～7.5。

3、检测分析方法，同实施例3、4。

4、实验结果

编号1：处理后，样品中内毒素含量为182EU/mL，HA血凝效价为2¹⁰。

编号2：处理后，样品中内毒素含量大于3267EU/mL。

实验结果说明，只有采用在本发明特定的条件下，才可以有效去除VP2蛋白抗原溶液中内毒素的含量，且不影响蛋白的抗原活性，改变其中一个条件，如氢氧化铝吸附条件(编号1)，和本申请相比将会增加VP2蛋白500倍的损失(2¹⁹/2¹⁰)。改变VP2蛋白组装纯化条件(编号2)，均会影响内毒素的去除效率，导致内毒素去除不彻底。

序列表

<110> 河南省农业科学院河南中泽生物工程有限公司

<120> 一种去除大肠杆菌重组表达猪细小病毒VP2蛋白中内毒素的方法

<130> 构建菌株

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 579

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 1

Met Ser Glu Asn Val Glu Gln His Asn Pro Ile Asn Ala Gly Thr Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Arg Gly Ala Gly Gly Val Gly Val Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn

35 40 45

Gln Thr Glu Phe Gln Tyr Leu Gly Glu Gly Leu Val Arg Ile Thr Ala

50 55 60

His Ala Ser Arg Leu Ile His Leu Asn Met Pro Glu His Glu Thr Tyr

65 70 75 80

Lys Arg Ile His Val Leu Asn Ser Glu Ser Gly Val Ala Gly Gln Met

85 90 95

Val Gln Asp Asp Ala His Thr Gln Met Val Thr Pro Trp Ser Leu Ile

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Ala Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Ser Asn Asn Met Thr Glu Ile Asn Leu Val Ser Phe Glu Gln Ala

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Ile Thr Glu Ser Ala Thr Ser Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Ile Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Thr Asn Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Thr Lys Pro Thr Gln Tyr

195 200 205

Arg Tyr Tyr Leu Ser Cys Ile Arg Asn Leu Asn Pro Pro Thr Tyr Thr

210 215 220

Gly Gln Ser Gln Gln Ile Thr Asp Ser Ile Gln Thr Gly Leu His Ser

225 230 235 240

Asp Ile Met Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ala Val Pro Ile His Leu Leu

245 250 255

Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ser Thr Gly Ile Tyr His Phe Asp Thr Lys

260 265 270

Pro Leu Lys Leu Thr His Ser Trp Gln Thr Asn Arg Ser Leu Gly Leu

275 280 285

Pro Pro Lys Leu Leu Thr Glu Pro Thr Thr Glu Gly Asp Gln His Pro

290 295 300

Gly Thr Leu Pro Ala Ala Asn Thr Arg Lys Gly Tyr His Gln Thr Ile

305 310 315 320

Asn Asn Ser Tyr Thr Glu Ala Thr Ala Ile Arg Pro Ala Gln Val Gly

325 330 335

Tyr Asn Thr Pro Tyr Met Asn Phe Glu Tyr Ser Asn Gly Gly Pro Phe

340 345 350

Leu Thr Pro Ile Val Pro Thr Ala Asn Thr Gln Tyr Asn Asp Asp Glu

355 360 365

Pro Asn Gly Ala Ile Arg Phe Thr Met Asp Tyr Gln His Gly His Leu

370 375 380

Thr Thr Ser Ser Gln Glu Leu Glu Arg Tyr Thr Phe Asn Pro Gln Ser

385 390 395 400

Lys Cys Gly Arg Ala Pro Lys Gln Gln Phe Asn Gln Gln Ala Pro Leu

405 410 415

Asn Leu Glu Asn Thr Asn Asn Gly Thr Leu Leu Pro Ser Asp Pro Ile

420 425 430

Gly Gly Lys Ser Asn Met His Phe Met Asn Thr Leu Asn Thr Tyr Gly

435 440 445

Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Thr Ala Pro Val Phe Pro Asn Gly Gln

450 455 460

Ile Trp Asp Lys Glu Leu Asp Thr Asp Leu Lys Pro Arg Leu His Val

465 470 475 480

Thr Ala Pro Phe Val Cys Lys Asn Asn Pro Pro Gly Gln Leu Phe Val

485 490 495

Lys Ile Ala Pro Asn Leu Thr Asp Asp Phe Asn Ala Asp Ser Pro Gln

500 505 510

Gln Pro Arg Ile Ile Thr Tyr Ser Asn Phe Trp Trp Lys Gly Thr Leu

515 520 525

Thr Phe Thr Ala Lys Met Arg Ser Ser Asn Met Trp Asn Pro Ile Gln

530 535 540

Gln His Thr Thr Thr Ala Glu Asn Ile Gly Asn Tyr Ile Pro Thr Asn

545 550 555 560

Ile Gly Gly Ile Arg Met Phe Pro Glu Tyr Ser Gln Leu Ile Pro Arg

565 570 575

Lys Leu Tyr

Claims

1.一种去除大肠杆菌重组表达猪细小病毒VP2蛋白中内毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液的制备：采用大肠杆菌表达系统重组表达猪细小病毒VP2蛋白，经高速离心、硫酸铵沉淀，收集得猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液；

（2）氢氧化铝悬液的制备：将氢氧化钠和氯化铝混合，pH为6.0~6.8，在2~8℃条件下反应，得到20g/L的氢氧化铝悬液；

（3）氢氧化铝吸附：对步骤（1）所得的猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液进行预处理，随后缓慢加入步骤（2）所得的氢氧化铝悬液进行吸附，边加入边搅拌，温度为2~8℃，转速为100rpm，搅拌时间为1～3h，搅拌完成后，离心处理得去除内毒素后的蛋白溶液上清液；

（4）层析法分离：采用吸附层析法，将步骤（3）所得的去除内毒素后的蛋白溶液上清液进行预处理，随后以一定的流速上样到层析介质，上样前先用清洗液清洗层析柱，然后用平衡缓冲液平衡层析柱，上样时收集上样流穿溶液，上样完成后用2倍柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，收集层析柱流出液，合并流穿溶液与层析柱流出液，得到去除内毒素的猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液；

所述吸附层析法所用填料为复合模式层析介质Capto™ Core700；所用清洗液为含有30% 体积含量异丙醇的1mol/L NaOH；所用平衡缓冲液pH为8.0、含200 mM氯化钠的10 mMPB缓冲液；流速为1/10~1/20柱体积每分钟。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中大肠杆菌表达系统重组表达猪细小病毒VP2蛋白的方法为：构建猪细小病毒VP2蛋白重组表达菌株，将活化后的猪细小病毒VP2重组菌株接种于LB培养基，在温度37℃、转速220rpm摇床培养3~5h，待菌株培养液的吸光值OD600达到0.8~1.2，加入终浓度为0.1~0.15 mM IPTG诱导重组表达的猪细小病毒VP2蛋白，在温度25℃、转速220rpm摇床中继续培养12~16h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中猪细小病毒VP2蛋白抗原溶液的收集方法具体为：

a、以8000 rpm的转速离心处理经大肠杆菌表达系统重组表达的猪细小病毒VP2蛋白溶液，收集离心后沉淀，即得到重组表达VP2蛋白大肠杆菌菌体，称量菌体湿重，加入pH值为6.3的10 mM PB缓冲液重悬菌体，其中菌体湿重的质量与PB缓冲液的体积比为1:20；

c、向步骤b收集的破碎菌体上清溶液中加入硫酸铵，边加入边搅拌，形成40%饱和度的硫酸铵溶液，以100 rpm的转速持续搅拌2h后，再以8000 rpm的转速，2~8℃条件下离心30min，收集离心后沉淀；

d、向步骤c收集的沉淀中加入10 mM PBS缓冲液使沉淀溶解，加入的PBS缓冲液体积与步骤(a)中的PB缓冲液的体积相同，即得猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中超声破碎的条件为：工作3s、间歇5s、功率60w、时间15min，将重悬的菌液置于冰水混合浴中，探头插入液面以下1.0~2.0cm，开始超声破碎；

高压均质机破碎的条件为：压力800bar，温度控制在5~10℃，进样速度为480mL/min，高压破碎1遍。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液预处理的方法为：加入10 mM PB缓冲液，调整pH为6.0~6.8，温度为2~8℃；所述离心处理的离心力为7000g~9000g，离心温度为4-8℃，离心时间为20~40min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中猪细小病毒重组VP2蛋白抗原溶液预处理的方法为：加入10 mM PB缓冲液，调整pH为6.2~6.5，温度为2~8℃；所述离心处理的离心力为8000g，离心温度为6℃，离心时间为30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中去除内毒素后的蛋白溶液上清液预处理的方法为：加入含200 mM氯化钠的10 mM PB缓冲液，调整pH为8.0，在2~8 ℃下搅拌3~5 h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的pH为6.2~6.5；所述步骤（3）中的搅拌时间为2小时。

9.如权利要求1所述去除内毒素的猪细小病毒重组VP2蛋白在制备药物制剂类生物制品中的应用。

10.如权利要求1所述去除内毒素的猪细小病毒重组VP2蛋白在制备疫苗中的应用。