JP5830945B2 - Ｆｃレセプターの精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＦｃレセプターを精製する方法に関する。

Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。

Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は１０^−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるサブクラスのうち、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３と強く結合し、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４との結合は弱いことが知られている。

ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナル配列、１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、２９０番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から３７４番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。またＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子工学的手法により、大腸菌（特許文献１）または動物細胞を利用した発現が報告されている。

近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィー担体の捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。しかしながら、前記目的でＦｃγＲＩを利用するには、ＦｃγＲＩを高純度に精製することが重要である。

特開２００８−２４５５８０号公報

Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１ Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５ Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５ Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９

遺伝子工学的手法を用いてタンパク質を生産させる場合、通常、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することにより宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで当該タンパク質を発現し生産する。培養液中には、培養する際の栄養源（アミノ酸類、糖類、微量金属類など）や、宿主自身が生産する副生成物といった様々な夾雑物が存在する。そのため、前記形質転換体により形質転換体外へ当該タンパク質が発現される場合は、培養液を遠心分離するなどにより培養上清を得た後、前記夾雑物を除去する精製を行なう必要がある。一方、前記形質転換体により形質転換体内に当該タンパク質が発現される場合は、培養液を遠心分離するなどにより培養細胞を得た後、機械的せん断、浸透圧ショック、酵素処理、薬剤処理などにより培養細胞を破砕する必要がある。なお、前記破砕操作により、細胞内の全ての内容物が破砕液中に放出するため、形質転換体外へ発現する場合よりも複雑な精製方法が必要となる場合がある。

通常、培養液から目的とするタンパク質を精製分離するには、硫安分画や限外ろ過による大まかな分離を行なった後、モードの異なる２種類以上のクロマトグラフィーを組み合わせて行なわれる。クロマトグラフィーによる精製分離は、電荷、親水性／疎水性の差、タンパク質分子の大きさなどにより目的タンパク質を精製分離する。なお、各クロマトグラフィーにおける溶媒の種類や吸着／洗浄／溶出方法は、適宜検討の上行なわれる。クロマトグラフィーによる精製分離の中でも、疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィー（疎水クロマトグラフィー）は、試料溶液中に高濃度の塩類が添加されている場合であっても希釈や透析による塩濃度を下げる操作が不要であり、低い塩濃度の緩衝液で目的タンパク質の溶出が行なえるなどの利点があるため、初期段階の精製に用いる手段として好ましい。一方、タンパク質の電荷の違いを利用して精製分離を行なうイオン交換クロマトグラフィーは、交換容量が大きく低い塩濃度の緩衝液で開始できること、疎水クロマトグラフィーの次の段階の精製で使用しやすいこと、宿主が大腸菌の場合それに由来する多くの夾雑タンパクが酸性であり塩基性タンパクを分離しやすいことなどから、中間または最終段階の精製に用いる手段として好ましい。

Ｆｃレセプターの精製に関しては、以前本出願人が、疎水クロマトグラフィーを用いたヒトＦｃγＲＩの精製について検討を行なっており、疎水クロマトグラフィー用担体に吸着したヒトＦｃγＲＩを１０％（ｗ／ｖ）以上のグリセロールを含む緩衝液で溶出させることでヒトＦｃγＲＩの高純度かつ高効率な精製を実現している（特願２００９−２８７７７４号）。しかしながら、疎水クロマトグラフィーを用いて精製したＦｃレセプターの更なる高純度化を目的として、当該Ｆｃレセプターを含む溶液をイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製を試みたところ、導入したＦｃレセプターの多くが、イオン交換クロマトグラフィー用担体に吸着せずそのまま素通りする現象が生じ、結果としてＦｃレセプターの回収率が低下する問題が発生した。

そこで本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、Ｆｃレセプターを高回収率かつ高純度に精製する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィー用担体を用いてＦｃレセプターを精製する際、前記担体にＦｃレセプターを吸着させる際用いる緩衝液、および吸着させるＦｃレセプターを溶出させる際用いる緩衝液、の組成および濃度について鋭意検討した結果、本発明を見出した。

すなわち本発明は、以下の態様を包含する：
第一の態様は、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にＦｃレセプターを含む溶液を添加して、前記担体にＦｃレセプターを吸着させ、
前記担体に吸着したＦｃレセプターを溶出液を用いて溶出させる、
Ｆｃレセプターの精製方法であって、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するＦｃレセプターを含む溶液および溶出液が尿素を含んでいる、前記精製方法である。

第二の態様は、
Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から疎水クロマトグラフィー用担体を用いて精製することで、Ｆｃレセプターを含む溶液を調製し、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にＦｃレセプターを含む溶液を添加して、前記担体にＦｃレセプターを吸着させ、
前記担体に吸着したＦｃレセプターを溶出液を用いて溶出させる、
Ｆｃレセプターの精製方法であって、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するＦｃレセプターを含む溶液および溶出液が尿素を含んでいる、前記精製方法である。

第三の態様は、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するＦｃレセプターを含む溶液および溶出液に含まれる尿素の濃度がそれぞれ１ｍｏｌ／Ｌ以上である、前記第一または第二の態様に記載の精製方法である。

第四の態様は、前記第一から第三のいずれかの態様に記載の精製方法で得られた、Ｆｃレセプターである。

以下に、本発明について詳細に説明する。

陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にＦｃレセプターを含む溶液を添加して前記担体にＦｃレセプターを吸着させ、前記担体に吸着したＦｃレセプターを溶出液を用いて溶出させる、Ｆｃレセプターの精製方法において、通常の緩衝液成分からなるＦｃレセプターを含む溶液を前記担体に添加してＦｃレセプターを吸着させようとしても、添加したＦｃレセプターの多くが吸着せずに素通りし、結果としてＦｃレセプターの回収率が著しく低くなる問題があった。そこで、Ｆｃレセプターを含む溶液および溶出液に、尿素や塩酸グアニジンといったタンパク質変性剤を添加して、Ｆｃレセプターの回収率および精製度を評価した結果、尿素が添加剤として好ましいことを見出した。さらに添加する尿素量について検討した結果、終濃度１ｍｏｌ／Ｌ以上となるように尿素を添加すると好ましく、終濃度１ｍｏｌ／Ｌから２ｍｏｌ／Ｌとなるように尿素を添加すると回収率および精製度がさらに向上することを見出した（後述の実施例および比較例参照）。

本発明において、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加する、Ｆｃレセプターを含む溶液としては、Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液（後述する粗精製Ｆｃレセプター溶液を含む）でもよいし、前記培養液（後述する粗精製Ｆｃレセプター溶液を含む）を陽イオン交換クロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーを用いて精製して得られた溶液でもよいが、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体の特徴を考慮すると、後者の溶液のほうが好ましい。ここでいう、陽イオン交換クロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィー等があげられるが、Ｆｃレセプターの工業的生産に適している点で、疎水クロマトグラフィーが特に好ましい。

本発明において、Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換する宿主とは、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞に代表される動物細胞、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。

前記宿主の培養液から、クロマトグラフィー用担体に添加するための粗精製Ｆｃレセプター溶液を得るには、宿主細胞外にＦｃレセプターを発現するときは培養液を遠心分離することで得ることができる。一方、宿主細胞内にＦｃレセプターを発現するときは培養液を遠心分離して得られる培養細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後遠心分離により破砕残渣を除去することで得ることができる。

本発明において、精製に用いる陽イオン交換クロマトグラフィー用担体は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基、スルホン酸基といった陽イオン交換基を担体に導入したものであれば特に限定はなく、具体例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ−６５０Ｍ（以上、東ソー社製）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）があげられる。なお、前記陽イオン交換クロマトグラフィー用担体を用いて、本発明の精製方法を実施する際は、前記担体へのＦｃレセプターを含む溶液（アプライ液）の添加量や、前記担体のタンパク吸着性能等によって決定した量の担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、前記陽イオン交換クロマトグラフィー用担体は、アプライ液を添加する前に、あらかじめ、尿素を含む適切な緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、リン酸塩緩衝液等）により平衡化するとよい。

本発明の精製方法では、前述した緩衝液であらかじめ平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に、Ｆｃレセプターを含む溶液（アプライ液）を添加して、前記担体にＦｃレセプターを吸着させ、前記担体に吸着したＦｃレセプターを溶出液を用いて溶出させるが、溶出させる前に平衡化に用いた緩衝液で洗浄すると、前記担体に吸着しないタンパク質を溶出操作前に除去できる点で好ましい、
本発明の精製方法において、溶出液で溶出した画分中のＦｃレセプターを定量するには、従来から知られている安定かつ効率的に定量できる方法の中から適宜選択すればよいが、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）による分析方法が好ましい。

本発明の精製方法により得られたＦｃレセプターは、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド（分離剤）など様々な用途に用いることができる。使用の際の形態や純度はその用途により異なり、本発明の精製方法により得られたＦｃレセプターをそのまま用いてもよいし、さらに高度に精製したものを用いてもよいし、またその中間の純度の精製度合いのものを用いてもよい。

本発明は、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にＦｃレセプターを含む溶液を添加して前記担体にＦｃレセプターを吸着させ、前記担体に吸着したＦｃレセプターを溶出液を用いて溶出させる、Ｆｃレセプターの精製方法であって、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するＦｃレセプターを含む溶液および溶出液が尿素を含んでいることを特徴としている。本発明の精製方法により、高純度かつ高い回収率でＦｃレセプターを精製することができる。また、本発明の精製方法は前記担体に導入するＦｃレセプターを含む溶液量（アプライ量）に係わらず適用可能な方法であるため、Ｆｃレセプターの分析目的に適用できることはもちろん、工業的なＦｃレセプター生産の一工程にも適用することができる。

本発明の精製方法で得られたＦｃレセプターは、そのまま、またはさらなる精製により、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド（分離剤）など様々な用途に用いることができる。

ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図。

以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１
（１）ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を２ＹＴ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ）に植菌し、ＯＤ_{６６０ｎｍ}＝３になるまで３０℃で培養した。
（２）１５℃に冷却後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を終濃度０．０５ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、さらに一晩培養した。
（３）培養液より菌体を回収後、抽出液（０．６％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０２％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ、０．３ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、０．００１％ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０））に菌体を懸濁し、撹拌することで菌体内からタンパク質を抽出し、遠心分離により無細胞抽出液を調製した。
（４）１ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｃ（東ソー株式会社製）ゲルをオープンカラムに充填し、５ｍＬの緩衝液Ａ（６％硫酸アンモニウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０））にてゲルを平衡化した。
（５）（３）で調製したヒトＦｃγＲＩを含む無細胞抽出液に、硫酸アンモニウムを終濃度６％となるよう添加したアプライ液１０ｍＬをゲルに添加し、１０ｍＬの緩衝液Ａにより洗浄後、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０）５ｍＬによりヒトＦｃγＲＩを溶出することで、ヒトＦｃγＲＩ粗精製溶液を得た。
（６）（５）のヒトＦｃγＲＩ粗精製溶液を２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で透析後、尿素を終濃度２ｍｏｌ／Ｌとなるよう添加し、これをアプライ液とした。
（７）１ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー株式会社製）ゲルをオープンカラムに充填し、５ｍＬの緩衝液Ａ（２ｍｏｌ／Ｌ尿素を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ ６．０））にてゲルを平衡化した。
（８）（６）で調製したアプライ液５ｍＬを導入し、１０ｍＬの緩衝液Ａにより洗浄後、２ｍｏｌ／Ｌ尿素および１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）５ｍＬによりヒトＦｃγＲＩを溶出した。溶出したヒトＦｃγＲＩの回収率を算出した結果、５５％であった。また、粗精製溶液中におけるヒトＦｃγＲＩの全タンパクに対する割合（比活性）は４．５倍へと向上した。

実施例２
実施例１（６）における２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で透析したヒトＦｃγＲＩ粗精製溶液に添加する尿素の量を終濃度１ｍｏｌ／Ｌとし、実施例１（８）におけるヒトＦｃγＲＩを溶出させる緩衝液の組成を１ｍｏｌ／Ｌ尿素および１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）とした他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、ヒトＦｃγＲＩの回収率は５０％であり、粗精製溶液中におけるヒトＦｃγＲＩの全タンパクに対する割合（比活性）は３．２倍へと向上した。

比較例１
実施例１（６）における２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で透析したヒトＦｃγＲＩ粗精製溶液に尿素は添加せず、実施例１（８）におけるヒトＦｃγＲＩを溶出させる緩衝液の組成を１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）とした他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、ヒトＦｃγＲＩの回収率は３１％であり、粗精製溶液中におけるヒトＦｃγＲＩの全タンパクに対する割合（比活性）は３．０倍となった。

比較例２
実施例１（６）における２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で透析したヒトＦｃγＲＩ粗精製溶液に塩酸グアニジンを終濃度１ｍｏｌ／Ｌとなるよう添加し、実施例１（８）におけるヒトＦｃγＲＩを溶出させる緩衝液の組成を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジンおよび１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）とした他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、ヒトＦｃγＲＩの回収率は２１％であり、粗精製溶液中におけるヒトＦｃγＲＩの全タンパクに対する割合（比活性）は１．５倍となった。

実施例１および２ならびに比較例１および２の結果を表１にまとめた。なお表１において、回収向上率は比較例１におけるヒトＦｃγＲＩ回収率を１００％としたときの値である。表１からわかるように、ヒトＦｃγＲＩを含む溶液を陽イオン交換クロマトグラフィー用担体を用いて精製する際、ヒトＦｃγＲＩを含む溶液および前記担体に吸着したヒトＦｃγＲＩの溶出液に尿素を含んでいると、ヒトＦｃγＲＩの回収率および精製度が向上することがわかる。一方、尿素と同様にタンパク質変性剤として用いられる塩酸グアニジンを添加するとヒトＦｃγＲＩの回収率は逆に低下した。

Claims (2)

1. 陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にＦｃレセプターを含む溶液を添加して、前記担体にＦｃレセプターを吸着させ、
   前記担体に吸着したＦｃレセプターを溶出液を用いて溶出させる、
   Ｆｃレセプターの精製方法であって、
   陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するＦｃレセプターを含む溶液および溶出液が１ｍｏｌ／Ｌ以上２ｍｏｌ／Ｌ以下の尿素を含んでおり、
   Ｆｃレセプターを含む溶液がＦｃレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された大腸菌の培養液から得られる無細胞抽出液である、前記精製方法。
2. Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から得られる無細胞抽出液を、疎水クロマトグラフィー用担体を用いて精製することで、Ｆｃレセプターを含む溶液を調製し、
   陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にＦｃレセプターを含む溶液を添加して、前記担体にＦｃレセプターを吸着させ、
   前記担体に吸着したＦｃレセプターを溶出液を用いて溶出させる、
   Ｆｃレセプターの精製方法であって、
   宿主が大腸菌であり、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するＦｃレセプターを含む溶液および溶出液が１ｍｏｌ／Ｌ以上２ｍｏｌ／Ｌ以下の尿素を含んでいる、前記精製方法。

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