NO174005B

NO174005B - Monoklonalt antistoff, hybridom, og reagens for immunologisk analyse av alfa-hanp

Info

Publication number: NO174005B
Application number: NO88883854A
Authority: NO
Inventors: Hiroo Imura; Kazuwa Nakao; Eiji Ishikawa; Masao Kono; Ken Inouye
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1987-09-01
Filing date: 1988-08-30
Publication date: 1993-11-22
Also published as: NO883854L; EP0306309B1; DE3885975T2; KR940009281B1; DE3885975D1; HK1003795A1; ATE97959T1; KR890005519A; DK174151B1; DK484588A; DK484588D0; EP0306309A3; CA1335082C; NO174005C; NO883854D0; EP0306309A2; ES2061664T3

Description

Oppfinnelsen vedrører et monoklonalt antistoff som gjenkjenner a-hANP, og utgjøres av det monoklonale antistoff KY-ANP-I som er fremstilt ved hjelp av hybridomet KY-ANP-I med deponeringsbetegnelsen ECACC 87082001. Oppfinnelsen vedrører også et hybridom som fremstiller det nevnte monoklonale antistoff, og er hybridomet KY-ANP-I med deponeringsbetegnelsen ECACC 87082001.

Oppfinnelsen vedrører videre et reagens for immunologisk analyse (i det følgende forkortet som EIA) av a-hANP, omfattende to typer av antistoffer, hvorav det ene gjenkjenner N-ende-siden av a-hANP og det annet gjenkjenner C-ende-siden av a-hANP, hvor et antistoff er immobilisert på en fast fase og det annet er merket med et enzym.

Tidligere teknikk

Atrialt natriuretisk polypeptid (ANP) er tilstede i granuler fremstilt av cellene i muskelen av atrium cordis og har sterkt diuretisk og natriuretisk virkning. Denne type polypeptid finnes ikke bare i mennesker, men også i rotter og benevnes hANP hhv. rANP. Hver av hANP og rANP klassifiseres videre i tre typer hhv. a, P og y. a-hANP består av 28 amino-syrerester. Dets Cys [7] og Cys [23]

er hhv. anordnet ved 7. hhv. 23. posisjon fra N-enden og danner en disulfid-binding, og sekvensen mellom dem danner en ring-struktur (Biochem. Biophys. Res. Commun.

(i det følgende forkortet som BBRC) 118, 131 - 13 9,

(1984) . a-rANP er forskjellig fra a-hANP bare med hensyn til en rest ved 12-posisjonen fra N-enden, som er Ile og Met i a-rANP og a-hANP (BBRC 117, 839 - 865, 1983). S-hANP er en antiparallell dimer av a-hANP (Japansk patent-søknad nr. 184098/1985). y-hANP består av 126 amino-syrerester med 99 - 12 6 amino-syrer ved C-enden tilsvarende a-hANP. Med hensyn til metoder for måling av ANP er allerede en radioimmunologisk analyse under anvendelse av antiserum allerede etablert (Science 228, 323 - 325, 1985; Nature 314, 264 - 266, 1985; BBRC 124, 815 - 821, 1984; BBRC 124, 663 - 668, 1984; BBRC 125, 315 - 323, 1984). Fra disse er det kjent at antiserum CR-3 gjenkjenner C-ende-fragmentet[17-28] av ANP.

Med hensyn til et monoklonalt antistoff som gjenkjenner a-hANP, er 11A - All kjent. Det nevnte antistoff oppnås ved å anvende atriopeptin II, en type av rotte ANP, som antigen, og dets epitope befinner seg mellom Cys [7] og Ser [25] og involverer disulfid-binding. Epitopen ansees således å være en del av ring-strukturen av ANP. Affi-niteten av det nevnte antistoff vedrører imidlertid ikke forskjellen mellom Met [12, human] og Ile [12, rotte], og antistoffet gjenkjenner rANP og hANP (Life Science 38, 1991 - 1997, 1986).

Ved den konvensjonelle immunologiske analyse av ANP har det vært nødvendig å ekstrahere ANP fra plasmaprøver. Det har således vært et avgjort behov for et monoklonalt antistoff med en så høy affinitet at det blir mulig å oppnå høy-sensitiv analyse uten ekstråksjon. Som et monoklonalt antistoff som gjenkjenner ANP nevnes det ovennevnte 11A - All. Dette antistoff gjenkjenner imidlertid ikke bare hANP, men også rANP. Imidlertid, som nevnt ovenfor, gjenkjenner antiserumet CR-3 for ANP C-ende-siden av ANP. Hvis man følgelig kan oppnå et antistoff som spesifikt gjenkjenner N-ende-siden av ANP vil det da være mulig å gjennomføre sandwich-type immunologiske analyser under anvendelse av disse to typer antistoff. Av denne grunn har det vært et sterkt behov for et monoklonalt antistoff, med en høy affinitet, som spesifikt gjenkjenner N-ende-siden av hANP.

Med hensyn til en immunologisk analyse for hANP er det tidligere kjent radioimmunologiske analyser under anvendelse av radioisotop (i det følgende forkortet som RIA) og enzymimmunologiske analyser under anvendelse av enzym (EIA). Med hensyn til RIA har det vært en tendens til å unngå bruken av denne pga problemene med nødvendig utstyr og hjelpemidler. Det har således vært et meget stort behov for tilveiebringelse av en meget sensitiv EIA som kan anvendes hvor som helst. Som en metode for enzym-merking har glutaraldehyd hittil vært generelt anvendt som et brodannende middel. Det anvendes imidlertid nå ikke så ofte pga problemer med polymerisasjon og dårlig utbytte. Som et brodannende middel som kan anvendes i stedet for glutaraldehyd er det mer nylig blitt kjent midler som N-hydroksysuccinimidoester av N,N'-0-fenylen-dimaleimid og N- (4-karboksycykloheksylmetyl)maleimid (J. Immunoassay 4, 209 - 327 (1983)). Det er imidlertid ikke rapportert at disse kan anvendes ved analyse av hANP og det kan således ikke sies at en meget sensitiv immunologisk analyse for hANP har vært tilgjengelig.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører et monoklonalt antistoff, som er kjennetegnet ved at det har affinitet til og gjenkjenner N-ende-halvdelen av ring-strukturen oc-hANP, idet det gjenkjenner en hvilken som helst partial del som er inneholdt i a-hANP[7-16] og innbefatter Met-[12] og utgjøres av det monoklonale antistoff KY-ANP-I som er fremstilt ved hjelp av hybridomet KY-ANP-I med deponeringsbetegnelsen ECACC 87082001.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et hybridom som er kjennetegnet ved at det fremstiller det nevnte monoklonale antistoff og som er hybridomet KY-ANP-I med deponeringsbetegnelsen ECACC 87082001.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en reagens for immunologisk analyse av a-hANP, omfattende to typer av antistoffer, hvorav det ene gjenkjenner N-ende-siden av a-hANP og det annet gjenkjenner C-ende-siden av a-hANP, hvor et antistoff er immobilisert på en fast fase og det annet er merket med et enzym, som er kjennetegnet ved at det monoklonale antistoff som gjenkjenner N-ende-siden av a-hANP er antistoffet i følge krav 1 og at antistoffet som gjenkjenner C-ende-siden av a-hANP er et tidligere kjent anti-a-hANP [17 - 28] antistoff.

Ved måling av a-hANP ved hjelp av en konvensjonell RIA-metode, har det vært nødvendig å ekstrahere a-hANP fra en plasma-prøve. Når imidlertid reagenset for immunologisk analyse av a-hANP under anvendelse av det monoklonale antistoff i samsvar med oppfinnelsen anvendes, er det mulig direkte å måle a-hANP i testprøven uten å ekstrahere a-hANP.

Videre kan denne måling gjennomføres ikke bare ved hjelp av en to-trinns metode hvori et antistoff immobilisert på en fast fase først omsettes med a-hANP og det deretter foretas en ytterligere reaksjon med et merket antistoff, men målingen kan også gjennomføres ved hjelp av en en-trinns metode hvori a-hANP og et merket antistoff samtidig omsettes med et antistoff immobilisert på en fast fase. Således kan a-hANP måles enkelt. Med tilveiebringelse av denne metode for måling av a-hANP er det blitt mulig lett og nøyaktig å diagnostisere og følge forløpet av hjertesykdommer, nyresykdommer, hypertensjon (essensiell og sekundær), ødematøse lidelser (lever-cirrhose, nefrose, katapleptisk ødem, etc.) og dehydrati-sering som følges av abnormalitet i kroppsvæske-balansen.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser kryss-reaktiviteter av a-hANP, a-rANP og

-hANP fragmenter med det monoklonale antistoff i

samsvar med oppfinnelsen. Fig. 2 illustrerer standard kurve (Q) av a-hANP og fortynningskurver (®, ^, £)

av plasma ved hjelp av EIA. Fig. 3 viser standard-kurven av a-hANP (O) og fortynnings-kurver J^, |) av plasma ved hjelp av en-trinns EIA.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen er et resultat av bestrebelser på å tilveiebringe et monoklonalt antistoff med en høy affinitet og som spesifikt gjenkjenner N-ende-siden av hANP. Som et resultat ble det oppnådd et monoklonalt antistoff som gjenkjenner N-ende-siden av ringstrukturen av a-hANP. Videre, ved å anvende dette antistoff, er det blitt etablert en meget sensitiv analysemetode for a-hANP. (1) Fremstilling av et hybridom som fremstiller et monoklonalt antistoff.

a-hANP er et polypeptid bestående av 28 aminosyre-rester, og dets molekylvekt er forholdsvis lav. Følgelig er dets evne til å indusere antistoff-produksjon (immunogenisitet) lav. Av denne grunn, for å kunne anvende det som et antigen, blir det kombinert med bovint serum-albumin eller bovint tyroglobulin. Det oppnådde konjugat emulgeres med et passende hjelpestoff som f.eks.

Freund<1>s komplette hjelpestoff, og anvendes så for immunisering av mus.

Immunosering gjennomføres ved inokkulering av den ovennevnte emulsjon intraperitonealt, subkutant eller intravenøst, flere ganger med mellomrom på noen uker. 3 til 4 døgn etter den siste immunisering tas milten ut og anvendes som antistoff-produserende celler. Samtidig, som parentale celler som fusjoneres med de antistoff-produserende celler for å danne et hybridom, fremstilles en myelom-cellestamme med en passende markør som f.eks. hypoksantin-guanin-fosforibosyl-transferase-deficiens (HGPRT") eller tymidin-kinase-deficiens (TK") og myelom-celle-stammen blir så fusjonert med de antistoff-produserende celler for å danne et hybridom.

Som et dyrkingsmedium for fremstilling av hybridomet anvendes slike media som Eagle's MEM, Dulbecco's modifiserte medium, og RPMI-1640, som generelt anvendes med tilsetning av mmtrent 15 % føtalt kalveserum (FCS) i de tilfeller dette er nødvendig.

Først fremstilles myelom som parentale celler og miltceller i forholdet 1:6,5. Som fusjoneringsmiddel anvendes generelt 50% polyetylenglykol (PEG) på grunn av en høy fusjoneringsgrad. Fusjonerte stammer selekteres ved hjelp av HAT seleksjonsmetoden. De fremstilte hybridomer underkastes screening ved hjelp av kjente metoder som membran fluorescens-antistoff-teknikk, enzym-bundet immunosorbent analyse-metode (ELISA-metode) eller immun-vev-fargemetode ved anvendelse av dyrkings-supernatanten. Derved selekteres kloner av hybridomer som fremstiller et tilsiktet immunoglobulin. For å gjøre hybridomene monoklonale anbringes normale miltceller som et ii feederi-ilag i en 96-mikrobrønnplate med 10 celler/brønn hvor hybridomer anbringes med mindre enn en celle/brønn, og voksende kloner underkastes på nytt screening. Monoklonale hybridomer oppnås ved gjentagelse av slik sub-kloning.

(2) Fremstilling av monoklonalt antistoff.

For fremstilling av det monoklonale antistoff i samsvar med oppfinnelsen blir hybridomene oppnådd i det foregående dyrket in vitro eller in vivo. Ved dyrking in vitro kan vanlige media som nevnt ovenfor anvendes med tilsetning av FCS. Etter dyrking i mediet i 3 til 5 døgn oppnås det monoklonale antistoff fra dyrkings-supernatanten. I tilfellet med in vivo dyrking blir hybridomet inokkulert i bukhulen av et pattedyr. 7 til 14 døgn etter dette samles askitesvæsken hvorfra det monoklonale antistoff oppnås. I sammenligning med in vitro dyrking frembringer in vivo dyrking en langt større mengde antistoff på effektiv måte og in vivo dyrking foretrekkes således.

Det monoklonale antistoff oppnådd på denne måte fra dyrkings-supernatant eller askitesvæske renses ved hjelp av en passende kombinasjon av kjente metoder som ammoniumsulfat-fraksjonering, DEAE-Sepharose-kolonne,

etc. F.eks. kan rensingen gjennomføres på en måte som nevnt i eksemplet.

Som det senere skal vises i eksemplet gjenkjenner det monoklonale antistoff KY-ANP-I oppnådd i samsvar med oppfinnelsen spesifikt a-hANP og viser nesten ingen affinitet med rANP. Det antas at dets epitope er N-ende-halvdelen av ringstrukturen av a-hANP, mer spesielt en del som dekker fra Cys [7] til Gly [l6]. Videre ettersom det reagerer meget svakt med rANP betraktes dets epitose å være en del inneholdende Met [l2]. Ettersom epitopen er en del som felles ikke bare for a-hANP, men også for B-hANP og y-hANP viser det nevnte antistoff også reaktivitet med B -hANP og y-hANP.

Videre viste dette antistoff en høy affinitet (Ka= 3,1 x 10^ M ^) med a-hANP. Som vist i standard-kurven av a-hANP i fig. 1 var 10% og 50% inhiberende konsentrasjoner (IC-^q og IC^q) henhv. 10 pg/rør og 100 pg/rør.

Hybridomet KY-ANP-I som fremstiller det monoklonale antistoff KY-ANP-I i samsvar med oppfinnelsen er deponert i PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, European Collection of Animals Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, England 20. august 1987, tilgjengelig under nr. 87082001 i samsvar med Budapest-konvensjonen.

(3) Konjugasjon av antistoff til bærer.

Som en fast fase for konjugering av et antistoff til en bærer kan det anvendes legemer som korn, kuler, rør

eller plater av glass eller plast, kommersielt tilgjengelige og som anvendes generelt ved immunologiske analyser som en bærer for antigen-antistoff-

reaksjon. Et antistoff som gjenkjenner N-ende-siden eller C-ende-siden av -hANP adsorberes til hvilke som helst

av disse bærere. Adsorbsjonen gjennomføres vanligvis over natten i fosfatbuffer ved pH 6 - 10, foretrukket ved omtrent nøytral reaksjon, ved romtemperatur. Bæreren hvorpå antistoffet er blitt adsorbert holdes under avkjøling i nærvær av et antiseptisk middel som f.eks. natrium-azid.

Både de monoklonale antistoffer og de polyklonale antistoffer kan adsorberes på bærere på samme måte som det foregående.

(4) Kanin anti a-hANP [ 17 - 28] serum.

Kaniner immuniseres flere ganger med a-hANP [17 - 28]-bovint thyroglobulin-konjugat fremstilt ved hjelp av karbodiimid-metoden, og 10 til 14 døgn etter den siste immunisering samles blodet hvorfra kanin anti-a-hANP [17 - 28] serum fremstilles.

(5) Fremstilling av enzym-merket antistoff.

Kanin IgG, F(ab')2 og Fab'

Antiserum fremstilt som ovenfor fraksjoneres med natrium-sulfat og føres så gjennom DEAE-cellulose-kolonne hvorved IgG oppnås. Det oppnådde IgG kuttes med pepsin for fremstilling av FCab'^, som så reduseres med 2-merkaptoetylamin til å gi anti-a-hANP [17 - 28] Fab'.

Fremstilling av Fab' fra IgG er detaljert i J. Immunoassay 4, 209 - 327 (1983) og samme prosedyrer kan anvendes

ved den foreliggende oppfinnelse.

Enzym- merking av antistoffer

Som enzym for merking av et antistoff kan anvendes alkali-fosfatase, 3-D-galaktosidase, peroksidase,

glukoseoksidase, etc. Ved oppfinnelsen anvendes foretrukket pepperrot-peroksidase. Som et brodannende middel kan anvendes N,N'-o-fenylendimaleimid, N-succinimidyl-4-(N-maleimidometyl)cykloheksanoat, N-succinimidyl-6-maleimidoheksanoat, N-succinirnidyl-3-(2-pyridylditio)propionat, 4,4<1->ditiopyridin og andre kjente midler.

Omsetningene av disse brodannende midler med enzymer

og antistoffer kan gjennomføres ved hjelp av kjente metoder avhengig av egenskapene av hvert middel.

I avhengighet av omstendighetene anvendes antistoff-fragmenter som Fab<1>, Fab og F(ab')2 som antistoff.

Som brodannende middel ved denne oppfinnelse er det ønskelig å anvende N-succinimidyl-4-(N-maleimidometyl) cykloheksanoat, eller N-succinimidyl-6-maleimidoheksanoat. Videre, uansett polyklonalt eller monoklonalt antistoff kan enzym-merkede antistoffer oppnås ved samme prosedyre. Derfor kan enzym-merkede antistoffer oppnådd ved å anvende de ovennevnte to brodannende midler representeres ved den følgende generelle formel (I):

(hvori A viser et antistoff eller dets fragment som gjenkjenner N-ende-siden eller C-ende-siden av a-hANP, B indikerer et merkings-enzym og R står for 4-metylen-cykloheksyl eller pentametylen.

Det er ønskelig at de således oppnådde enzym-merkede antistoffer renses ved affinitetskromatografering slik at det oppnås et mer høysensitivt immunologisk analyse-system. De rensede enzym-merkede antistoffer lagres på et koldt og mørkt sted med et stabiliseringsmiddel som f.eks. thimerosal eller glyserol etter å være blitt frysetørket.

Når a-hANP måles ved å anvende en immunologisk analyse-reagens fremstilt som ovenfor, anordnes kombinasjonen av antistoffer som følger: I tilfellet

av at et antistoff som gjenkjenner N-ende-siden av

-hANP immobiliseres, enzym-merkes et antistoff som gjenkjenner C-ende-siden. Ved immobilisering av et antistoff kreves generelt en forholdsvis stor mengde antistoff. For immobiliseringen er derfor et monoklonalt antistoff som lett kan oppnås i en stor mengde (f.eks. KY-ANP-I i samsvar med foreliggende oppfinnelse) egnet. Et polyklonalt antistoff fremstilt fra antiserum kan også anvendes uten ulempe. Med hensyn til antistoffet som skal enzym-merkes kan enten et monoklonalt antistoff eller et polyklonalt antistoff anvendes, betinget av at det er et antistoff som gjenkjenner stedet som er forskjellig fra det stedet som gjenkjennes av det immobiliserte antistoff. F.eks. når KY-ANP-I i samsvar med oppfinnelsen anvendes som et immobilisert antistoff kan det ovennevnte antiserum CR-3 eller antiserum F36 nevnt i eksemplet anvendes som enzym-merket antistoff. Det motsatte av denne kombinasjon kan også anvendes. Selvfølgelig kan det ved den foreliggende oppfinnelse også anvendes monoklonale antistoffer som gjenkjenner C-ende-siden av a-hANP og antisera som gjenkjenner N-ende-siden av a-hANP.

EKSEMPEL

F^Tn.qt-.i llina av hvbridom

Syntetisk a-hANP (1,5 mg) og bovint thyroglobulin (5,4 mg) ble oppløst i 2 ml destillert vann. Til denne oppløsning ble tilsatt dråpevis en oppløsning av 30 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid i 1 ml destillert vann i løpet av en periode på 10 min. ved romtemperatur, hvoretter blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 24 timer. Denne oppløsning ble dialysert 6 ganger mot 3 1 destillert vann i løpet av en periode på 3 døgn. Dialysatet ble oppdelt i fem porsjoner som ble lagret ved -20°C (Se BBRC 124, 815-821, 1984).

Til den ovennevnte oppløsning lagret i oppdelte porsjoner (inneholdende 300 ug av a-hANP) ble tilsatt destillert vann til 1,2 ml og oppløsningen ble så suspendert i 1,2 ml av Freund's komplette hjelpestoff. Av dette ble omtrent 2 ml injisert intraperitonealt og subkutant inn i 10 BALB/c hunmus (200 pl pr. dyr). Dyrene ble gitt ytterligere immunisering på samme måte 3 uker senere. Fem uker etter den ytterligere immunisering ble antistoffene i blodet målt og til 2 mus som viste den mest tydelige immunreaksjon ble det gitt ytterligere immunisering gjennom halevenen med den ovennevnte oppløsning inneholdende 50 ug a-hANP. 4 døgn etter dette ble miltcellene samlet fra de to mus for celle-fusjon.

De samlede miltceller (1.3 x 10 3 stykker) og myelom-

7

celler X63-Ag8.653 (2 x 10 stykker) ble blandet i Dulbecco<1>s medium (DMEM), og blandingen ble sentrifugert ved 1500 omdr. pr. min. i 5 min. ved 4°C. De oppnådde pellets ble smeltet ved oppvaiming ved 37°C og deretter ble 1 ml 50% PEG 4000 (PEG 1 g/DMEM 1 ml) tilsatt dråpevis i løpet av en periode på 1 min. Deretter fikk blandingen stå i 2 min. ved 37°C hvoretter oppløsningen ble fortynnet ved dråpevis tilsetning av 10 ml DMEM ved 37°C i løpet av en periode på 5 min. Denne ble også vasket ved sentrifugering ved 4°C med DMEM inneholdende 15% FCS.

De oppnådde celler ble sådd på en 96-brønns plate og dyrket i 2 uker i HAT-medium og ytterligere i 1 uke i HT-medium. Av totalt 768 brønner formerte hybridomer

seg i omtrent 30% (212/768), hvorav 4% (8/212) ble funnet å frembringe ct-hANP-antistof f er .

Cellene i brønnene som viste det høyeste antistoffinnhold ble klonet ved begrensende fortynningsmetode,

for dette ble som •i feederi-iceller tilsatt BALB/c muse-thymus-celler til brønnene med 10 stykker/brønn og hybridomer ble anbragt deri med 1 stykke/brønn og dyrket deri. Denne prosedyre ble gjennomført to ganger.

Ved slik kloning ble det selektert et klon som frembringer den største mengde antistoff på stabil måte og det ble benevnt KY-ANP-I.

Antistoff-innholdene i antiserum oppnådd fra de immuniserte mus og i supernatanten av hybridom-kulturen ble målt som følger: Antiserum av immunisert mus eller supernatant av hybridom-kulturen ble tatt som prøve. En blanding av 100 ul av den fortynnede oppløsning av den nevnte prøve, 300 ul assaybuffer (RIA buffer) og 100 ul <125>I-a-hANP (10.000 cpm) fikk reagere i 24 timer ved 4°C hvoretter oppløsningen ble blandet med 1 ml dekstranbelagt trekull og blandingen fikk reagere i 5 min. ved 4°C. Deretter ble blandingen sentrifugrert ved 3.000 omdr.

pr. min. i 30 min. ved 4°C og radioaktiviteten av supernatanten ble målt ved hjelp av en -y-teller hvorfra antistoff-innholdet i den fortynnede oppløsning av prøven ble beregnet.

Det ovennevnte <125>I-a-hANP ble fremstilt ved hjelp av kloramin-T-metoden. Ved dette ble a-hANP (1 ug) blandet

125

med Na 1(1 mCi) hvortil det ble tilsatt 10 ul kloramin-

T (5,25 mg/ml), og 10 sek. deretter ble 20 ul natrium-pyrosulfitt (4,5 mg/ml) tilsatt. Dertil ble det ytterligere tilsatt 1 ml 2% gelatin som så ble renset ved hjelp av Sep-Pak C18 (fremstilt av Waters).

Fremstilling av monoklonalt antistoff

BALB/c mus ble forhåndsbehandlet to ganger med mellomrom 1 til 2 uker ved intraperitoneal tilførsel av pristane med 0,5 ml pr. dyr hver gang. Til hver av musene ble det intraperitonealt injisert 5 x 10 stykker hybridom KY-ANP-I suspendert i 200 ul DMEM. Oppnådd ascites-væske ble renset ved hjelp av protein A-Sepharose CL-4B kolonne og ga monoklonalt antistoff KY-ANP-I.

Egenskaper av KY- ANP- I

Isotypen av dette monoklonale antistoff ble bestemt ved hjelp av Ouchterlony's metode å være IgG^. Dets affinitet ble oppnådd ved å foreta en Scatchard-avsetning basert på radiobindings-analyse og som et resultat ble det funnet Ka = 3,1 x 10*^ M

Dets epitope ble bestemt ved å måle dets kryssreaktivitet med forskjellige ANP-beslektede peptider ved hjelp av RIA og resultatet er vist i fig. 1. Ettersom det nesten ikke viser noen reaksjon med a-ANP [17-28 ] og

a-ANP [ 1 - 6 ] , antas epitopen å være inneholdt i a -ANP [7 - 16 ] . I tillegg reagerer det meget svakt med crhANP [18 - 22] ellera-rANP. Det antas derfor at

det er nødvendig at epitopen har en ringstruktur og at epitopen inneholder Met. Det ble konkludert at epitopen gjenkjent av det monoklonale antistoff i samsvar med oppfinnelsen er nær N-ende-halvdelen av ringstrukturen av a-hANP.

Reaktiviteter av KY-ANP-I med B-hANP og -y-hANP ble

også undersøkt ved hjelp av den ovennevnte metode for måling av antistoffinnhold. Som et resultat ble det funnet at KY-ANP-I gjenkjenner ikke bare a-hANP, men

også -y-hANP og videre at det reagerer med 3-hANP med 80% kryssreaktivitet.

Fremstilling av anti g- hANP \ 17 - 28] bovint thyroglobulin- serum

a-hANP [17 - 28] ble bundet til thyroglobulin ved hjelp av den kjente karbodiimid-metode (BBRC 117. 695, 1984). Til 0,5 ml av en vandig oppløsning inneholdende 3,1 mg a-hANP [17 - 28] ble tilsatt 0,7 ml av en vandig oppløsning inneholdende 19 mg bovint thyroglobulin. Dertil ble det tilsatt 1 ml av en vandig oppløsning inneholdende 40 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid-hydroklorid og blandingen ble omrørt i 2 timer under avkjøling med is. Reaksjonsoppløsningen ble dialysert tre ganger ved 4°C mot 2 1 destillert vann, hvoretter den ble frysetørket og ga 21 mg av konjugatet. Det bundne molare forhold av a-hANP [17 - 28] i forhold til bovint thyroglobulin ble oppnådd ved hjelp av aminosyre-analysemetoden og var 30.

Immunisering og blodsamling

I 0,25 ml fysiologisk saltoppløsning ble oppløst 0,25 mg av det ovennevnte a-hANP [17 - 28]bovint thyroglobulin-konjugat. Dette ble suspendert i en like stor mengde Freund's komplette hjelpestoff og oppløsningen ble subkutaht injisert i en kanin på mer enn 20 steder på ryggen. Denne prosedyre ble gjennomført seks ganger med interval på 3 uker og den 10. dag etter den første injeksjon ble kaninen tappet for blod fra karotid-arterien og ga antiserum F36.

Fremstilling av kanin IgG

Til 1 ml anti a-hANP-serum (F36) ble sakte tilsatt

0,18 g natrium-sulfat under omrøring og etter at det tilsatte material var fullstendig oppløst ble omrøring fortsatt ved 22 - 25"°C. Blandingen ble så sentrifugert ved 10.000 omdr. pr. min. i 10 min. ved 22 - 25°C. Bunnfallet ble oppløst i 1 ml natriumfosfat-buffer

(pH 6,3; 17,5 mmol/1) som så ble dialysert mot den samme buffer. Supernatanten ble ført gjennom DEAE-cellulose-kolonne som på forhånd var blitt ekvilibrert med samme buffer (pH 6,3; 17,5 mmol/1). Det våte volum av DEAE-cellulose nødvendig for å passere 10 mg protein i supernatanten er 1 ml. Den oppnådde mengde IgG var 7 mg, beregnet ved å anvende ekstingsjons-koeffisienten ved 280 nm., var 1,5 g 1 cm og molekylvekten av IgG 150.000 (Se J. Immunoassay 4, 209 - 327 (1983)).

Fremstilling av F(ab')2

10 mg kanin IgG ble dialysert ved 5°C mot 1 ml natrium-acetatbuffer (pH 4,5, 0,1 mol/l). Til den dialyserte IgG-oppløsning ble tilsatt 0,05 ml (1/20 volum) av en vandig oppløsning av natriumklorid (2 mol/l). I denne ble det oppløst pepsin (0,2 mg/10 mg IgG) avledet fra slimhinnen i svinemave. Blandingen fikk reagere i 15 til 24 timer ved 37°C. Deretter ble blandingen innstilt til pH 8 med en vandig oppløsning av natriumhydroksyd (1 mol/l), hvoretter blandingen ble tilført en kolonne av Sephadex G-150 (1,5 x 45 cm for 1,0 - 1,5 ml,

2,0 x 45 cm for 2,0 - 2,5 ml) og eluert med natrium-borat-buffer (pH 8,0; 0,1 mol/l). Mengden av F(ab')9

o-l -1 oppnådd var 6 mg beregnet ved å anvende 1,48 g 1 cm som ekstingsjons-koeffisient ved 280 nm og 92.000 som molekylvekt av Ftab'^ (Se J. Immunoassay, .4, 209 -

327 (1983)).

Fremstilling av Fab'

3 mg F(ab')2 ble oppløst i 0,45 ml natrium-fosfat-buffer (pH 6,0, 0,1 mol/l). Dertil ble tilsatt 2-merkaptoetylamin/natrium-fosfat-buffer-oppløsning (pH 6,0,

0.1 mol/l) inneholdende 5 mmol/1 EDTA idet buffer-oppløsningen ble fremstilt umiddelbart før bruk.. Deretter fikk blandingen reagere i 1,5 time ved 37°C. Deretter ble reaksjonsblandingen tilført en kolonne av Sephadex G -25 (1 x 30 cm) og eluert med natrium-fosfat-buf fer (pH 6,0, 0,1 mol/l; inneholdende 5 mmol/1 EDTA). Mengden av oppnådd Fab' var 2,5 mg beregnet ved å

anvende 1,48 g <1> 1 cm 1 som ekstingsjons-koeffisient ved 280 nm og 46.000 som molekylvekten av Ffab1^

(Se J. Immunoassay, 4, 209 - 327 (1983)).

Fremstilling av peroksidase- merket anti- g- hANPf17- 28] Fab' 2 mg pepperrot-peroksidase (5 nmol) ble oppløst i 0,3 ml natrium-fosfat-buffer (pH 7,0, 0,1 mol/l). Dertil ble tilsatt en blanding av 0,65 mg (2100 nmol) N-succinimidyl-6-maleimido-heksanoat og 0,03 ml N,N-dimetylformamid,

og blandingen fikk reagere under omrøring i 0,5 til 1 time ved 30°C. Deretter ble reaksjonsblandingen underkastet sentrifugering slik at overskudd av reagens ble fjernet som bunnfall. Supernatanten ble ført gjennom en Sephadex G25 kolonne (1,0 x 45 cm), og deretter eluert med natrium-fosfat-buffer (pH 6,0, 0,1 mol/l)

med en strømningstakt på 30 - 40 ml/time hvori volumet av hver fraksjon ble innstilt til 0,5 - 1,0 ml. En kolonne av Sephadex G-50 (Pharmacia) (1,0 x 6,4 cm,

5 ml) med et finmasket filter ved bunnen ble ekvilibrert med den ovennevnte buffer og sentrifugert i et testrør ved 100 x g i 2 min. Det ovennevnte reaksjonsprodukt (0,5 ml) ble tilført denne kolonne og ble sentrifugert på samme måte. Den oppnådde fraksjon ble konsentrert ved sentrifugering med en mikrokonsentrator (CENTRICON-30

Amicon Corp.) ved 2.000 x g ved 4°C.

I natrium-fosfat-bufferen (pH 6,0, 0,1 mol/l) ble oppløst 1,8 mg (45 nmol) maleimid-peroksidase-konjugat fremstilt på denne måte. Dertil ble tilsatt en oppløsning av omtrent 2,0 mg (43 nmol) Fab<1> i 0,2 - 0,4 ml natrium-fosfat-buffer (pH 6,0, 0,1 mol/l) inneholdende 5 mmol/1 EDTA og blandingen fikk reagere ved 4°C i

20 timer eller ved 30°C i 1 time. Den endelige konsentrasjon av maleimid-peroksidase Fab'-konjugatet i reaksjonsblandingen ble innstilt til 50 - 100 umol/1. Denne reaksjonsblanding ble ført gjennom en kolonne

(1,5 x 45 cm) av Ultrogel AcA 44 og eluert med natrium-fosfat-buffer (pH 6,5, 0,1 mol/l) ved en strømningstakt på 0,3 - 0,5 ml/min. med et volum av hver fraksjon innstilt ved omtrent 1,0 ml. På denne måte ble det oppnådd omtrent 2,5 mg av tilsiktet peroksydase-merket anti-a-hANP [l7 - 28] Fab' (se J. Immunoassay, .4,

209 - 327 (1983)).

a- hANP [ l7 - 28] - ikkespesifikt kanin IgG konjugat

En oppløsning av a-hANP[l7 - 28] (0,5 mg) i 0,2 ml natrium-fosfat-buffer (0,1 mol/l, pH 7,0) fikk reagere med 0,01 ml 105 mmol/1 N-succinimidyl-6-maleimido-heksanoat i N,N'-dimetylformamid ved 30°C i 30 min. Reaksjonsproduktet ble underkastet gel-filtrering med en kolonne av Sephadex G-10 (1,0 x 45 cm) under anvendelse av 0,1 mol/l natrium-fosfat-buffer (pH 6,0) inneholdende 5 mmol/1 EDTA. Gjennomsnittsverdien av maleimid-gruppene innført i a-hANP [l7 - 28] var 0,6/molekyl.

En oppløsning av ikke-spesifikt kanin IgG (10 mg) i

0,1 mol/l natrium-fosfat-buffer (0,6 ml, pH 7,5) fikk reagere med en oppløsning av 210 mmol/1 S-acetylmerkapto-ravsyre-anhydrid (0,03 ml) i N,N'-dimetylformamid i 30 min. ved 30°C. Til denne reaksjonsblanding ble

tilsatt 0,1 mol/l tris-hydroklorid-buffer (0,1 ml,

pH 7,0), 0,1 mol/l EDTA (0,02 ml) og 1 mol/l hydroksylamin-hydroklorid (0,1 ml, pH 7,0) og blandingen fikk reagere i 5 min. ved 30°C. Reaksjonsproduktet ble underkastet gel-filtrering med en kolonne av Sephadex G-25 (1,0 x 45 cm) under anvendelse av 0,1 mol/l natrium-fosfat-buffer (pH 6,0) inneholdende 5 mmol/1 EDTA. Gjennomsnittsverdien av tiol-gruppene innført i det ikke-spesifikke kanin IgG var 11/molekyl.

En delmengde (2,0 ml) av det ovennevnte maleimid-CC-hANP [17 - 28] fikk reagere ved 30'C i 30 min. med merkapto-succinylert ikke-spesifikt kanin IgG (2,4 mg) oppnådd i 0,1 mol/l natrium-fosfat-buffer (pH 6,0, 0,25 ml) inneholdende 5 mmol/1 EDTA. Til reaksjonsproduktet ble tilsatt 0,1 ml N-etylmaleimid 0,01 mmol/1 slik at de resterende merkapto-grupper ble blokkert. Blandingen ble så underkastet gel-filtrering med en kolonne av Sephadex G-25 (1,0 x 45 cm) under anvendelse av 0,1 mol/l natrium-fosfat-buffer (pH 7,0). Det gjennomsnittlige antall av molekyler av a-hANP [l7 - 28] som kombinert med det ikke-spesifikke kanin IgG var 8,7/molekyl, beregnet fra reduksjon av tiol-gruppene.

Rensing av pepperrot- peroksidase- merket

anti- hANP [ 17 - 28] Fab'

a-hANP [17 - 28 ]-ikke-spesifikt kanin IgG konjugat (2 mg), bovint thyroglobulin (10 mg) og muse-serum-protein (20 mg) ble hvert kombinert med brom-cyan-aktivert Sepharose 4B (1 g) . Pepperrot-peroksidase-merket anti-hANP [l7 - 28J Fab' (7,8 mg) i 0,8 ml 0,1 mol/l natrium-fosfat-buffer (pH 6,5) inneholdende 1 g/l gelatin og 50 mg/l thimerosal ble ført gjennom to kolonner, hvorav den ene er en kolonne med bovint thyroglobulin-Sepharose 4B (0,55 x 4,0 cm) og den annen

er en kolonne av museserum-protein-Sepharose 4B

(0,55 x 4,0 cm) med en strømningstakt på 0,5 ml/time, under anvendelse av 10 mmol/1 natrium-fosfat-buffer (pH 7,5) inneholdende 1 g/l gelatin og 0,1 mol/l natrium-klorid. Deretter ble ytterligere rensing foretatt med en kolonne av a-hANP ['17 - 28]-ikke-spesifikt kanin IgG-Sepharose 4B (0,35 x 2,0 cm) under anvendelse av 3,2 mmol/1 saltsyre (pH 2,5). Eluatet (1 ml) inneholdende 0,35 mg renset merket substans ble med en gang blandet med 0,1 ml av 1 mol/l natrium-fosfatbuffer (pH 7,0) og 0,01 ml 100 g/l gelatin. Mengden av merket substans var omtrent 0,35 mg, beregnet fra peroksidase-aktiviteten.

Fremstilling av monoklonalt anti- g- hANP- belagte polystyren- kuler 50 stykker polystyren-kuler (diameter 3,2 mm, fremstilt av Precision Plastic Ball Co., Chicago, USA) ble innført i 1 ml 0,1 M natrium-fosfat-buffer (pK 7,0) hvortil var tilsatt 100 fag/ml monoklonalt anti-g<->hANP-IgG^ (KY-ANP-I) og blandingen ble satt bort over natten ved romtemperatur. Deretter ble polystyren-kulene vasket med natrium-fosfat-buffer (pH 7,0) hvoretter natrium-azid ble tilsatt ved 0,1%. De således fremstilte polystyren-kuler ble oppbevart i et kjøleskap.

Samling av plasma

Blod ble samlet kl. 9.00 om morgenen fra den ante-kubitale vene fra friske menn (alder 26 - 32 år) i en liggende stilling etter fasting over natten. Blod ble på nytt samlet fra de samme personer på samme måte etter 1 times spasering med intravenøs tilførsel av 40 mg furosemid. Blodet ble tatt med avkjølte plast-sprøyter og ble overført til avkjølte silikonbelagte glassrør for engangs bruk fylt med aprotinin og EDTA. Blodet ble sentrifugert (500 x g) for separering av plasma. De endelige konsentrasjoner av aprotinin og EDTA var 1.000 kallikrein inaktivator-enheter (KIU)/ml henhv.

1 mg/ml.

Enzym- immunologisk analyse av a-hANP ved hjelp av sandwich- metoden

En monoklonalt anti-a-hANP IgG1 (KY-ANP-I)-belagt polystyren-kule ble innført i standard oppløsning av a-hANP eller i plasma (totalt volum 0,15 ml), som fikk stå i 24 timer ved 4°C. a-hANP standard-oppløsningen ble fortynnet med 10 mM natrium-fosfat-buffer (pH 7,0; inneholdende 1 mg/ml gelatin, 0,3 M natrium-klorid, 0,2 mM cystin, 1 mM EDTA, 1 mg/ml natrium-azid og 1.000 KIU/ml aprotinin) til et sluttvolum på 0,15 ml. Plasmaet (50 ul) ble blandet med 0,1 ml 10 mM natrium-fosfat-buffer (pH 7,0; inneholdende 1 mg/ml gelatin,

0,4 M natrium-klorid, 0,3 mM cystin, 1,5 mM EDTA,

1,5 mg/ml natrium-azid og 1.000 KIU/ml aprotinin).

Etter å ha fjernet væskedelen fra reaksjonsproduktet

ble polystyren-kulen vasket to ganger med 2 ml 10 mM natrium-fosfat-buffer (pH 7,0; inneholdende 0,1 M natrium-klorid). Deretter ble kulen blandet med 50 ng kanin anti-a-hANP [17 - 28 ]Fab<1->peroksidase-konjugat renset ved hjelp av affinitets-kromatografering og 0,15 ml 10 mM natrium-fosfat-buffer (pH 8,0; inneholdende 1 mg/ml gelatin, 0,2 mM cystin og 1 mM EDTA), og blandingen fikk stå i 24 timer ved 4°C. Etter fjernelse av væskedelen ble polystyren-kulen vasket to ganger på samme måte som nevnt ovenfor og ble.overført til et annet prøverør.

For å bestemme aktiviteten av den konjugerte peroksidase ble fluorescens-intensiteten målt etter at den hadde fått reagere ved 30°C i 60 min. med 3-(4-hydroksyfenyl)-propion-syre anvendt som substrat. Fluorescens-intensiteten ble målt basert på 200 ng/ml kinin/50 mM

sulfon-syre som base.

Spesifisitet

I EIA ved hjelp av denne metode var den standard fortynningskurve for a-hANP identisk med kurvene for a-hANP [4 - 28 ] , a-hANP [5 - 28 ] og a-hANP [7 - 28],

som indikerte ingen virkning av N-ende-modifikasjoner.

På den annen side reduserte utelatelse av C-ende-amino-syrer betraktelig reaktiviteten. Ingen reaksjon ble imidlertid iakttatt med ende-fragmenter: a-hANP[l7 - 28] og a-hANP[l - 6] . Kryss-reaksjonene med B-hANP og a-rANP var 4,7% henhv. 0,01% på molar basis. Disse resultater var i samsvar med spesifisiteten av de anvendte antistoffer: museklonalt IgG^ immobilisert på polystyren-kule var spesifikk for N-ende-halvdelen av ringstrukturen av a-hANP mens kanin Fab' konjugert til persoksidase var spesifikk for a-hANP[l7 - 28].

Innvirkning av plasma

Den bundne oksidase-aktivitet (ikke-spesifikk binding) målt i fravær av plasma og a-hANP var identisk med peroksidase-aktivitet målt i nærvær av plasma forhåndsbehandlet med 1 pmol monoklonal anti-a-hANP IgGj.

(KY-ANP-I). Gjenvinningene av a-hANP (10 - 200 pg/ml) tilsatt til plasma inneholdende 4,3 - 332 pg/ml ANP

var 81 - 94%. Fortynnings-kurven av plasma var parallell med standard-kurven av a-hANP oppnådd i fravær av plasma, når plasma-volumet pr. rør var innenfor området 1 - 50 ul. Således ble det iakttatt liten plasma-interferens når volumet av anvendt plasma var 50 ul eller mindre. Resultatet er vist i fig. 2.

Sensitivitet av EIA

Deteksjons-grensen av a-hANP var 30 fg (10 amol)/rør.

Når 50 pl plasma ble anvendt var det minste deteksjons-nivå for plasma a-hANP 0,6 pg/ml (0,2 fmol/ml). Denne sensitivitet av EIA var mye høyere, en til to størrelsesordner, enn for konvensjonell RIA.

Reproduserbarhet av EIA

Reproduserbarheten ved oppfinnelsen ble definert ved

5 forskjellige nivåer over området 5 - 158 pg/ml av a-hANP i plasma. Variasjons-koeffisienter for reproduserbarhet for innenfor-analysen og mellom-analysen var hhv. 3,2 - 9,4 % (n = 20) og 5,4 - 12,0 %.

Plasma g- hANP- nivåer i friske personer i basal- og blod-volum- uttatt tilstand ved hjelp av EIA, sammenlignet med tilsvarende ved RIA

Basalt plasma a-hANP-nivå bestemt ved hjelp av EIA i friske personer var 24,5 + 5,9 pg/ml. Plasma ot-hANP-nivået sank til 15,3 + 3,7 pg/ml i blod-volum-uttatt tilstand etter en times spasering med intravenøs tilførsel av furosemid (40 mg). Plasma a-hANP-nivåer bestemt samtidig ved hjelp av RIA var 28,2 +5,7 pg/ml henhv. 18,3 + 3,2 pg/ml. Følgende corelasjon ble bestemt mellom målinger av a-hANP ved hjelp av EIA (y) og RIA (x): y = 0,78 x + 1,3,

r = 0,92, n = 24.

Det er fra de ovennevnte data klart at EIA anvendt

i oppfinnelsens sammenheng er så følsom at selv i blod-volum-uttatt tilstand er det mulig å måle plasma oc-hANP-konsentrasjonen uten ekstraksjon.

Plasma a- hANP- nivåer i pasienter med hjerte- sykdom

Plasma a-hANP-nivåer målt ved hjelp av a-hANP-målings-reagenset i samsvar med oppfinnelsen i pasienter med hjertesykdommer var som vist i følgende tabell 1:

Bemerkninger: Pasientene nr. 1 - 3 hadde alvorlig hjertesvikt.

Anvendelse ved en- trinns metode i EIA

EIA kan i oppfinnelsens sammenheng også gjennomføres

ved hjelp av en en-trinns metode. Fig. 3 viser standard-kurve av a-hANP og fortynnings-kurver av plasma ved hjelp av en-trinns-metoden. Ved denne metode ble hANP, enzym-merket antistoff og antistoff-belagte polystyren-kuler alle blandet samtidig og reaksjonen fikk foregå

ved 4°C i 24 timer. Peroksidase (POD) aktivitet ble målt ved 30°C i 30 min. Andre betingelser var de samme som ved to-trinns-metoden.

Claims

1. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det har affinitet til og gjenkjenner N-ende-halvdelen av ring-strukturen a-hANP, idet det gjenkjenner en hvilken som helst partial del som er inneholdt i a-hANP[7 - 16] og innbefatter Met[12] og utgjøres av det monoklonale antistoff KY-ANP-I som er fremstilt ved hjelp av hybridomet KY-ANP-I med deponeringsbetegnelsen ECACC 87082001.

2. Monoklonalt antistoff som angitt i krav 1, karakterisert ved at det er immobilisert på en fast fase, særlig et glasskorn eller en poly-styrenkule.

3. Hybridom, karakterisert ved at det fremstiller et monoklonalt antistoff som angitt i krav 1 og er hybridomet KY-ANP-I med deponeringsbetegnelsen ECACC 87082001.

4. Reagens for immunologisk analyse av a-hANP, omfattende to typer av antistoffer, hvorav det ene gjenkjenner N-ende-siden av a-hANP og det annet gjenkjenner C-ende-siden av a-hANP, hvor et antistoff er immobilisert på en fast fase og det annet er merket med et enzym, karakterisert ved at det monoklonale antistoff som gjenkjenner N-ende-siden av a-hANP er antistoffet ifølge krav 1 og at antistoffet som gjenkjenner ei-ende-siden av a-hANP er et tidligere kjent anti-a-hANP [17 - 28] antistoff.

5. Reagens for immunologisk analyse som angitt i krav 4, karakterisert ved at antistoffet er bundet til enzymet ved hjelp av et brodannende middel.

6. Reagens for immunologisk analyse som angitt i krav 4, karakterisert ved at enzymet er peroksidase.

7. Reagens for immunologisk analyse som angitt i krav 4, karakterisert ved at det brodannende middel er N-succinimidyl-4-(N-maleimidometyl)-syk-loheksanoat eller N-succinimidyl-6-maleimidoheksanoat.

8. Reagens for immunologisk analyse som angitt i krav 4, karakterisert ved at anti-a-hANP[17 - 28] antistoffet er oppnådd fra kanin anti-a-hANP[17 -28] serum.

9. Reagens for immunologisk analyse som angitt i krav 4, karakterisert ved at den faste fase er glasskorn eller polystyren-kuler.