ES2239338T3 - Genes regulados y sus usos. - Google Patents
Genes regulados y sus usos.Info
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Abstract
UNA MOLECULA DE NUCLEOTIDO QUE CODIFICA UNA PROTEINA CODIFICADA POR UN GEN REGULADO POR FOS O UN FRAGMENTO DE ESTE, DONDE LA DICHA PROTEINA O SU FRAGMENTO ESTA CODIFICADA POR CUALQUIERA DE LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE SE MUESTRAN EN LA FIGURA 1 O 2 O UN FRAGMENTO DE ELLOS, INCLUYENDO VARIANTES ALELICAS Y ESPECIES VARIANTES DE LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS.
Description
Genes regulados y sus usos.
La presente invención se refiere a las secuencias
de nucleótidos de los genes regulados por Fos, a las proteínas
codificadas por las secuencias, a usos de las secuencias y proteínas
codificadas, y a animales transgénicos que comprenden una o más de
las secuencias.
El factor de transcripción AP-1
está implicado en una serie de procesos celulares, incluyendo la
proliferación celular, diferenciación y función neuronal (véase
Angel and Karin, 1991).
Se considera que AP-1 ejerce su
efecto por unión a una secuencia de reconocimiento de ADN, conocida
como el elemento de AP-1, encontrada en las regiones
promotora y potenciadora de los genes. El elemento de
AP-1 tiene la secuencia de consenso en TGA G/C
TCA.
Se ha encontrado una serie de genes que contienen
elementos de AP-1 en sus regiones reguladoras,
incluyendo c-Jun (Angel y col., 1988),
MCP-1 (Rolling y col., 1988), estromalisina (Kerr y
col., 1988), colagenasa de tipo I (Schonthal y col., 1988) e
interleuquina II (Farrar y col., 1989).
AP-1 está compuesta de complejos
diméricos formados entre las proteínas Jun (c Jun,
Jun-B y Jun D) y Fos (c-Fos, Fos B,
Fra-1 y Fra2). Se ha encontrado que el componente
Fos de AP-1 es el componente limitante de la
actividad de AP-1 en células cicladoras (véase
Kovary and Bravo, 1991).
c-Fos es un protooncogén nuclear
que se ha implicado en una serie de sucesos celulares importantes,
incluyendo la proliferación celular (Holt y col., 1986; Riabowol y
col., 1988), diferenciación (Distel y col., 1987; Lord y col., 1993)
y tumorigénesis (Curren y col., 1983; Miller y col., 1984; Ruther y
col., 1989).
c-Fos codifica una proteína de 62
kDa que forma heterodímeros con c-Jun, formando un
factor de transcripción AP-1 que se une al ADN en un
elemento de AP-1 y estimula la transcripción.
Los productos génicos de Fos también pueden
reprimir la expresión génica. Sassone y col. (1988) mostraron que
c-Fos inhibe su propio promotor y Gius y col. (1990)
y Hay y col. (1989) mostraron que c-Fos inhibe los
genes de respuesta temprana Egr-1 y
c-myc.
También se ha mostrado que los factores
AP-1 inhiben la expresión del MHC de clase I y genes
PEPCK (véase Gurney y col., 1992 y Howcroft y col., 1993).
Por lo tanto, se puede observar que los genes
regulados por Fos son extremadamente importantes para la expresión
correcta de los genes que conducen a cambios en el fenotipo celular.
La importancia de los genes Fos se demostró claramente generando
ratones deficientes en c-Fos (véase Hu y col.,
1994). Los ratones deficientes en c-Fos eran
viables, pero presentaban una variedad de defectos del desarrollo
específicos del tejido, incluyendo osteoporosis, gametogénesis
retardada y linfofenia y anomalías del comportamiento.
Los ratones deficientes en c-Fos
se usaron para generar líneas celulares de fibroblastos, y se
encontró que la expresión de dos genes era anormalmente baja. Los
dos genes eran el de la estromalisina y la colagenasa de tipo I.
Previamente se identificó que ambos genes tenían sitios
AP-1 en sus secuencias reguladoras (véase Kerr y
col., 1988, y Schonthal y col., 1988).
La estromalisina y colagenasa de tipo I se han
implicado en el desarrollo tisular embrionario (Brenner y col.,
1989), remodelación de tejido dañado (Hasty y col., 1990; Woessner
and Gunja, 1991) y en el avance tumoral y de metástasis (Liotta and
Stetler, 1990).
Superti-Furga y col., (1991),
mostraron que la actividad de c-Fos se puede
controlar hormonalmente mediante fusión de la proteína
c-Fos de ratón al dominio de unión del ligando del
receptor humano de estrógeno. Se encontró que la proteína de fusión
estimulaba la transcripción dependiente de AP-1 de
una forma estrictamente dependiente de la hormona. Usando la
proteína de fusión, se encontró un gen regulado por
AP-1, Fit-1. Se encontró que
Fit-1 codificaba una proteína secretada o unida a
membrana dependiendo del patrón de ayuste.
La presente invención se refiere a secuencias de
nucleótidos que codifican dos nuevos genes regulados por Fos.
La presente invención proporciona una molécula de
nucleótidos que codifica una proteína codificada por un gen regulado
por Fos o uno de sus fragmentos, en el que dicha proteína o su
fragmento es codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada en
la Figura 1 ó 2, o uno de sus fragmentos, incluyendo variantes
alélicas y variantes de especie de las secuencias de
nucleótidos.
La expresión "molécula de nucleótidos" usada
en esta memoria, se refiere a nucleótidos de cualquier longitud,
sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. La expresión abarca
tanto moléculas de doble como de una cadena. También incluye tipos
conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcadores que son
conocidos en la técnica, metilación, "grupos terminales",
sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un
análogo, modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo,
aquellas con enlaces no cargados (p. ej., fosfonatos de metilo,
fosfotriésteres, fosfamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces
cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que
contienen restos colgantes, tales como proteínas (incluyendo
nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal,
poli-L-lisina, etc.), las que
contienen intercaladores (p. e., acridina, psoralén, etc.), las que
contienen queladores (p. ej., metales, metales radiactivos, boro,
metales oxidantes, etc.), las que contienen alquilantes y las que
contienen enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos anómeros
alfa, etc.).
La molécula de nucleótidos de la presente
invención puede codificar la proteína de un gen regulado por Fos o
uno de sus fragmentos.
El término "fragmento" usado en relación con
las proteínas se refiere a fragmentos que tienen suficiente longitud
para ser únicos para la proteína actualmente reivindicada (p. ej.,
10, 15, 20 ó 25 aminoácidos consecutivos de longitud).
Preferiblemente, los fragmentos de proteína son capaces de provocar
al menos parte de una actividad de la proteína completa. Los
fragmentos particularmente preferidos comprenden una región
conservada de un gen que se ha encontrado que es homólogo con una
serie de otros genes. Se considera que dichas regiones conservadas
tienen una función específica.
Las secuencias de nucleótidos mostradas en las
Figuras 1 y 2, como la mayoría de las secuencias de nucleótidos
naturales, tendrán una serie de formas distintas, tales como
variantes alélicas y variantes de especie. Dichas variantes y
cualesquiera otras formas naturales de las secuencias de nucleótidos
de la presente invención también se considera que forman parte de la
presente invención. Dichas variantes deben tener una homología de
secuencia de al menos 60%, preferiblemente 80%, y más
preferiblemente 90%, con las secuencias mostradas en la figura 1 ó 2
o sus fragmentos.
La presente invención también se refiere a la
molécula de nucleótidos de la presente invención, en la que se
altera la proteína o uno de sus fragmentos codificada por la
secuencia mostrada en la Figura 1 ó 2 o uno de sus fragmentos.
Las proteínas alteradas preferidas o sus
fragmentos, son aquellas que todavía retienen su actividad y
preferiblemente tienen una homología de al menos 80%, más
preferiblemente 90% y más preferiblemente 95% con la proteína o uno
de sus fragmentos, codificada por la secuencia mostrada en la Figura
1 ó 2, o uno de sus fragmentos. Preferiblemente dichas proteínas
alteradas o sus fragmentos difieren sólo en 1 a 10 aminoácidos. Se
prefiere además que los cambios de aminoácidos sean
conservativos.
Los cambios conservativos son los que sustituyen
un aminoácido por otro de la familia de aminoácidos que está
relacionada por sus cadenas laterales. Por ejemplo, es razonable
esperar que una sustitución aislada de una leucina por una
isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por
una serina, o una sustitución conservativa similar de un aminoácido
por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrán un efecto
importante en la actividad biológica de la proteína.
Sin embargo, a veces es conveniente alterar los
aminoácidos con el fin de alterar la actividad biológica de la
proteína. Por ejemplo, pueden ser particularmente útiles las
mutaciones que suprimen o potencian una o más de las funciones de la
proteína. Dichas mutaciones generalmente se pueden hacer alterando
cualesquiera secuencias conservadas de la proteína. Las mutaciones
que aumentan el número de aminoácidos que pueden formar enlaces
disulfuro con otros aminoácidos en la proteína son particularmente
preferidos con el fin de aumentar la estabilidad de la proteína.
También se pueden hacer las mutaciones que disminuyen el número de
aminoácidos que pueden formar enlaces disulfuro con otros
aminoácidos en la proteína si se desea disminuir la estabilidad de
la proteína. Se prefiere que dichas proteínas alteradas o sus
fragmentos tengan una homología de al menos 80%, más preferiblemente
90% y más preferiblemente 95% con la proteína o uno de sus
fragmentos, codificada por la secuencia mostrada en la Figura 1 ó 2
o uno de sus fragmentos. Preferiblemente dichas proteínas alteradas
o sus fragmentos difieren sólo en 1 a 10 aminoácidos.
La molécula de nucleótidos de la presente
invención se puede obtener por métodos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, las secuencias se pueden obtener por clonación genómica o
clonación de ADNc de líneas celulares adecuadas o de ADN o ADNc
obtenido directamente de los tejidos de un organismo, tal como un
ratón. Entre las líneas celulares adecuadas se incluyen cualesquiera
líneas celulares de fibroblastos tales como la línea celular 3T3,
descrita por Hu y col. (1994). Los clones positivos se pueden cribar
usando sondas adecuadas para la molécula de nucleótidos deseada.
También se puede usar la clonación por PCR. Las sondas y cebadores
se pueden generar fácilmente puesto que en esta memoria se dan las
secuencias que codifican la proteína o uno de sus fragmentos,
codificada por la molécula de nucleótidos de la presente
invención.
Se pueden usar numerosas técnicas patrón
conocidas en el campo de la biología molecular para preparar las
moléculas de nucleótidos deseadas o las sondas y cebadores para
identificar los clones positivos. Las moléculas de nucleótidos
sondas o cebadores se pueden sintetizar completamente usando métodos
de síntesis de oligonucleótidos patrón, tales como el método de la
fosfaramidita.
Se pueden usar numerosas técnicas para alterar la
secuencia de ADN obtenida por los procedimientos de síntesis o
clonación, y dichas técnicas son conocidas por los expertos en la
técnica. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de mutagénesis
dirigida, mutagénesis dirigida por oligonucleótido y PCR, para
alterar la secuencia de ADN. Dichas técnicas son conocidos por los
expertos en la técnica y están descritas en la amplia bibliografía
conocida por los expertos en la técnica, por ejemplo, Sambrook y
col., (1989).
La presente invención proporciona además la
proteína codificada por la molécula de nucleótidos de la presente
invención.
Preferiblemente, la proteína codificada por la
molécula de nucleótidos de la presente invención tiene la secuencia
de aminoácidos mostrada en la Figura 1 ó 2, o uno de sus
fragmentos.
El término "proteína" tal como se usa en
esta invención, se refiere a un polímero de aminoácidos y no se
refiere a una longitud específica del producto; por lo tanto dentro
del término proteína están incluidos péptidos, oligopéptidos y
proteínas. El término además no se refiere o excluye modificaciones
después de expresión de la proteína, por ejemplo, glicosilaciones,
acetilaciones y fosforilaciones. En la definición se incluyen
proteínas que contienen uno o más análogos de un aminoácido
(incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales), proteínas con
uniones sustituidas, así como otras modificaciones conocidas en la
técnica, tanto naturales como sintetizadas.
La proteína de la presente invención se puede
obtener de células que producen naturalmente la proteína tales como
células de fibroblasto usando técnicas de purificación patrón. Sin
embargo, se prefiere usar una célula hospedante y sistema de vector
adecuados para la expresión de la molécula de nucleótidos de la
presente invención. La molécula de nucleótidos de la presente
invención se puede expresar en una variedad de sistemas de expresión
diferentes, por ejemplo, los usados con células de mamíferos,
baculovirus, bacterias y microorganismos eucariotas tales como
levaduras.
Todos los sistemas de expresión antes mencionados
son conocidos en la técnica y la expresión de secuencias de
nucleótidos ahora es una técnica patrón conocida por los expertos en
la técnica.
Preferiblemente, se usan sistemas de expresión de
célula hospedante eucariota, p. ej., de mamífero. En particular, las
células hospedantes de mamífero adecuadas incluyen células de ovario
de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster
pequeño (BKC), células de origen hepático tales como células HepG2,
y mieloma o líneas celulares de hibridoma.
La presente invención proporciona además un
vector para expresar la molécula de nucleótidos de la presente
invención, que comprende un promotor y una molécula de nucleótidos
de la presente invención.
Un promotor de mamífero puede ser cualquier
secuencia de ADN que se puede unir a la
ARN-polimerasa de mamífero y puede iniciar la
transcripción corriente abajo de una secuencia codificante en el
ARNm. Los promotores particularmente útiles son los derivados de
genes víricos de mamíferos, tales como el promotor temprano de SV40,
promotor tardío principal de adenovirus y el promotor del virus
herpes simplex. Adicionalmente, también se pueden usar secuencias de
genes no víricos como promotores, tales como del gen de
metalotioneína murina.
La molécula de nucleótidos de la presente
invención puede ser expresada intracelularmente en células de
mamífero. Se puede unir una secuencia promotora directamente con la
molécula de nucleótidos de la presente invención, en cuyo caso el
primer aminoácido en el extremo N de la proteína codificada será una
metionina codificada por el codón de inicio ATG.
Alternativamente, la proteína codificada por la
molécula de nucleótidos de la presente invención puede ser segregada
de la célula por la unión de una secuencia de nucleótidos que
codifica una secuencia líder, a la molécula de nucleótidos de la
presente invención. La proteína de fusión codificada comprenderá un
fragmento de la secuencia líder y la proteína codificada por la
molécula de nucleótidos de la presente invención. La secuencia líder
conducirá a la secreción de la proteína de fusión fuera de la
célula. Preferiblemente, hay sitios de procesamiento entre la
secuencia líder y la proteína codificada por la molécula de
nucleótidos de la presente invención que permiten que la secuencia
líder sea escindida enzimática o químicamente. Un ejemplo de dicha
secuencia líder es la secuencia líder triparite de adenovirus.
El vector de la presente invención
preferiblemente es un vector de ácido nucleico que comprende ADN. El
vector puede ser de configuración lineal o circular, y se puede
adaptar para la existencia episomal o integrada en la célula
hospedante, como se expone en la extensa bibliografía conocida por
los expertos en la técnica. Los vectores se pueden suministrar a
células usando sistemas de suministro vírico o no vírico. La
elección del sistema de suministro determinará si la molécula de ADN
se va a incorporar en el genoma de la célula o permanecerá
episomal.
El vector de la presente invención puede
comprender además elementos de control tales como señales de
poliadenilación, señales de terminación de la transcripción,
potenciadores, regiones de control de locus (LCR).
La presente invención proporciona además una
célula hospedante transformada con el vector de la presente
invención.
La transformación se refiere a la inserción de un
polinucleótido exógeno en una célula hospedante, sin tener en cuenta
el método usado para la inserción, por ejemplo, captación directa,
transducción, apareamiento-f o electroporación. El
polinucleótido exógeno se puede mantener como un vector no integrado
(episoma), o se puede integrar en el genoma del hospedante.
Preferiblemente, la célula hospedante es una
célula eucariota, más preferiblemente una célula de mamífero, tal
como células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células
de riñón de hámster pequeño (BKH), células de origen hepático tales
como células HepG2, y líneas celulares de mieloma o hibridoma.
La presente invención proporciona además un
método para producir la proteína codificada por la molécula de
nucleótidos de la presente invención, que comprende transfectar una
célula hospedante con el vector de la presente invención, cultivar
la célula hospedante transfectada en condiciones adecuadas con el
fin de conducir a la expresión de la molécula de ADN y a la
producción de la proteína deseada. Después, la proteína se puede
recoger de las células transfectadas o del medio de crecimiento
celular dependiendo de si la proteína es secretada, usando técnicas
patrón.
La presente invención proporciona además la
molécula de nucleótidos de la presente invención para usar en
terapia.
La presente invención proporciona además el uso
de la molécula de nucleótidos de la presente invención en la
fabricación de una composición para el tratamiento de trastornos del
desarrollo.
La presente invención proporciona además el uso
de la molécula de nucleótidos de la presente invención en el
tratamiento de trastornos del desarrollo.
Se sabe que los genes regulados por Fos están
implicados en el desarrollo y en la diferenciación celular. De
acuerdo con esto, el descubrimiento de genes regulados por Fos tiene
consecuencias en el control del desarrollo y diferenciación
celular.
Se ha encontrado que las secuencias de
nucleótidos mostradas en la Figura 1 y Figura 2 tienen una secuencia
similar a los genes de una familia de factores de crecimiento
caracterizada por la identificación de la familia del factor de
crecimiento de plaquetas (PDGF). La secuencia más claramente
relacionada es la del factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF). VEGF forma un homodímero que es un factor de crecimiento
activo en la angiogénesis y crecimiento celular endotelial (véase
Keck y col., 1989 y Leung y col., 1989). VEGF también se ha usado
para estimular la angiogénesis y producir así un efecto terapéutico
(véase Takeshita y col., 1994).
La proteína codificada por la secuencia de la
Figura 1 es una proteína de ratón, y la proteína codificada por la
secuencia de la Figura 2 es el homólogo humano de la proteína de
ratón codificada por la secuencia dada en la Figura 1. Ambas
proteínas se denominan en lo sucesivo factor de crecimiento inducido
por c-Fos (FIGF).
Por lo tanto, se puede ver que el uso de la
molécula de nucleótidos de la presente invención en terapia es una
aplicación importante de las secuencias de los genes regulados por
Fos de la presente invención.
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
Figura 1 y Figura 2 tienen interés particular en trastornos de
pulmón, ya que se ha encontrado que las secuencias de nucleótidos
son expresadas principalmente en los pulmones. Entre los trastornos
pulmonares particulares que se pueden tratar usando la molécula de
nucleótidos que codifica la proteína o sus fragmentos que son
codificados por la secuencia mostrada en la Figura 1 o Figura 2, se
incluyen la neumonía y neumoconiosis. La molécula de nucleótidos
también se puede usar después de neumonoectomía con el fin de ayudar
al pulmón a que vuelva a crecer.
La secuencia de nucleótidos de la Figura 2 se ha
cartografiado del cromosoma humano Xp22, cerca del sitio que
cartografía la patología displasia espondiloepifisaria (SEDL). El
mapa genético de esta región es descrito por Ferrero y col. (1995),
y el mapa de la enfermedad SEDL es descrito por Heuertz y col.
(1993). Por lo tanto, SEDL se puede tratar usando la molécula de
nucleótidos que codifica la proteína o sus fragmentos, que son
codificados por la secuencia dada en la Figura 1 o en la Figura
2.
Como se ha discutido previamente, se ha
encontrado que los genes regulados por Fos están implicados en el
avance tumoral y metástasis. Por inhibición de los genes regulados
por Fos se puede inhibir o suprimir el crecimiento tumoral.
Previamente, Kim y col., (1983), suprimieron el
crecimiento tumoral mediante inyección de anticuerpos monoclonales
específicos para VEGF. Como se ha expuesto previamente, VEGF tiene
una secuencia de nucleótidos similar a las secuencias de nucleótidos
mostradas en la Figura 1 y Figura 2.
De acuerdo con esto, por inhibición de la
expresión, traducción in vivo, etc. de las moléculas de
nucleótidos salvajes de la presente invención, se puede inhibir o
suprimir el crecimiento tumoral.
Las acciones de los genes regulados por Fos
correspondientes a las moléculas de nucleótidos de la presente
invención se pueden inhibir por una serie de técnicas.
Un objetivo adicional de la presente invención es
el uso de la proteína de la presente invención para identificar el
receptor o receptores de la proteína o de un complejo de proteína
que comprende la proteína.
Los expertos en la técnica conocen métodos para
identificar receptores, y se han descrito ampliamente en la
bibliografía. Sin embargo, básicamente hay tres modos principales de
identificar receptores:
i. Ensayar todos los receptores conocidos que se
unen a moléculas similares. Esto es particularmente útil para la
proteína codificada por las secuencias de ADN mostradas en la Figura
1 y Figura 2, como se ha encontrado que VEGF tiene una secuencia
similar.
ii. Llevar a cabo una etapa de purificación de
unión. Por ejemplo, la proteína de la presente invención o un
complejo de proteína que comprende la proteína de la presente
invención, se puede inmovilizar en un soporte sólido, y después se
pasan numerosas posibles moléculas receptoras, especialmente
proteínas de membrana, sobre el soporte sólido. Schusted y col.,
(1995), describen procedimientos de purificación de la unión.
iii. Por cribado de bibliotecas de expresión con
el fin de encontrar células que carecen del receptor o receptores, y
después usar el método de clonación de receptor descrito por Seed y
Aruffo, (1987).
Los expertos en la técnica también conocen otros
métodos y se pueden usar con el fin de encontrar el receptor o
receptores.
Para identificar el receptor o receptores se
podrán diseñar fármacos que bloqueen o potencien la actividad del
receptor o receptores y produzcan moléculas de anticuerpo que
bloqueen el receptor o receptores. Una vez que se conoce la
secuencia de ADN del receptor o receptores, se pueden diseñar una
serie de terapias génicas para corregir los errores en el receptor o
receptores, o para bloquear la expresión del receptor o
receptores.
La presente invención proporciona además el uso
de la proteína de la presente invención en un ensayo para
identificar antagonistas o agonistas de la proteína que se pueden
usar como fármacos en el tratamiento del cáncer y trastornos del
desarrollo, respectivamente. Los ensayos para identificar dichos
potenciales fármacos se usan con frecuencia y son conocidos por los
expertos en la técnica. Un ejemplo de dicho ensayo es descrito
claramente por Tsunoda y col., (1994).
La presente invención proporciona además el uso
de la molécula de nucleótidos, molécula de nucleótidos antisentido,
proteína o molécula de anticuerpo de la presente invención, o
cualquiera de sus combinaciones, para diagnosticar un estado
patológico o una predisposición a una enfermedad.
La molécula de nucleótidos o molécula de
nucleótidos antisentido de la presente invención se puede usar para
determinar la presencia del gen correspondiente a la molécula de
nucleótidos, o para determinar la cantidad de ARN transcrito del
gen.
La proteína de la presente invención se puede
usar en un ensayo para determinar la cantidad de proteína codificada
por el gen correspondiente a la molécula de nucleótidos de la
presente invención.
Determinando la presencia del gen correspondiente
a la molécula de nucleótidos de la presente invención o el ARN
transcrito o la proteína codificada por el gen, se puede
diagnosticar un estado patológico o una predisposición a una
enfermedad causada por la presencia del gen o la sobreexpresión del
gen.
La presente invención proporciona además el uso
de la molécula de nucleótidos de la presente invención para generar
un animal transgénico. En particular, la invención proporciona el
uso de dichas moléculas de nucleótidos para generar animales
transgénicos no humanos, especialmente ratones transgénicos.
Se pueden generar animales transgénicos que son
adecuados como modelos para la investigación. Por ejemplo, se pueden
usar animales transgénicos que sobreexpresan la molécula de
nucleótidos de la presente invención, con el fin de determinar que
efectos tendrá la sobreexpresión. Alternativamente, se pueden
generar animales transgénicos en los que la molécula de nucleótidos
salvaje de la presente invención "no se expresa". Entonces se
puede investigar el efecto de "no expresar" la molécula de
nucleótidos.
Los expertos en la técnica conocen métodos para
generar dichos animales transgénicos y se pueden llevar a cabo
fácilmente puesto que las moléculas de nucleótidos que se van a
sobreexpresar o "no se van a expresar" se describen en esta
memoria.
Los animales transgénicos de la presente
invención posteriormente también se pueden reproducir con ratones
que sobreexpresan Fos o con ratones que no expresan Fos, con el fin
de determinar los efectos del control de Fos alterado.
La presente invención también proporciona una
molécula de nucleótidos que comprende todo o parte de la secuencia
mostrada en una cualquiera de las Figuras 1 ó 2.
La molécula de nucleótidos que comprende toda o
parte de la secuencia mostrada en una cualquiera de las Figuras 1 ó
2, puede codificar una proteína o puede ser no codificante.
Preferiblemente, la molécula de nucleótidos codifica adicionalmente
las secuencias de control del gen Fos correspondientes a la
secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las Figuras 1
ó 2. Además se prefiere que la molécula de nucleótidos codifique una
secuencia que confiera a un gen regulación por Fos. Es
particularmente preferido que la molécula de nucleótidos comprenda
la secuencia TGACTCA.
La presente invención ahora se ilustra en los
ejemplos adjuntos con referencia a las siguientes figuras.
Figura
1
Secuencia de ADN del gen F0401regulado por Fos,
que muestra la secuencia de proteína codificada y las regiones
homólogas a VEGF (subrayadas).
Figura
2
Secuencia de ADN del gen regulado por Fos HF175
(homólogo humano de F0401), que muestra la proteína codificada.
Figura
3
Alineamiento de la proteína codificada por FIGF
con el dominio conservado de la familia de factores de crecimiento
de PDGF/VEGF. Los puntos indican restos de cisteína que son
característicos de estos factores de creci-
miento.
miento.
Figura
4
(A) Ensayo de inmunoprecipitación de la proteína
FIGF. Se marcaron metabólicamente células COS-7
transfectadas sólo con el vector (-) o con un vector que contenía la
secuencia que codifica FIGF controlada por un promotor de CMV (+),
durante 1 hora con [^{32}S]-metionina y
[^{35}S]-cisteína, cada uno con una concentración
de 100 \muCi/ml. Después de 1 hora o 22 horas de seguimiento, el
medio condicionado y los lisatos celulares se inmunoprecipitaron por
separado con anticuerpos policlonales anti-FIGF. [La
proteína FIGF se expresó en E. coli controlado por el
promotor T5. El fragmento de ADNc, de la región codificante de FIGF,
se generó por PCR a partir del resto de metionina en la posición +40
y se clonó en el vector pQE-31 (Qiagen) para obtener
una proteína de fusión con un marcador de histidina
N-terminal. La proteína se expresó en bacterias TG1
(pREP+) por inducción durante 4 horas a 37ºC en presencia de
isopropil-b-D-tiogalactopiranósido
2 mM. La proteína recombinante se localizó exclusivamente en cuerpos
de inclusión, y se purificó en una columna de
Ni-NTA-Resina, en condiciones
desnaturalizantes de acuerdo con los protocolos del fabricante
(Qiagen). Los anticuerpos se aumentaron inyectando a conejos 200
\mug de FIGF recombinante en forma de proteína desnaturalizada en
adyuvante completo de Freund. El suero se preparó después de 4
inyecciones en adyuvante incompleto de Freund a intervalos de 3
semanas]. Los inmunocomplejos se recogieron mediante perlas de
proteína A-Sefarosa (Pharmacia) y se separaron en
SDS-PAGE al 12% en presencia de
b-mercaptoetanol al 3%. Las flechas indican las
bandas específicas presentes sólo en las células transfectadas con
FIGF.
(B) Actividad mitógena medida como incorporación
de [^{3}H]-timidina en fibroblastos
c-fos (-/-). Las células se incubaron con medio
condicionado de células COS-7 transfectadas con el
vector de expresión de FIGF o sólo con el vector. Un día después de
la transfección, las células se dividieron y se mantuvieron en suero
al 2%. Los medios condicionados se recogieron 120 horas después.
(C) Actividad mitógena media como incorporación
de [^{3}H]-timidina en fibroblastos
c-fos (-/-). Las células se incubaron con medio
condicionado de clones estables c-fos (-/-),
concretamente FH-10.2, FH-10.5,
FH-9.3, FH-9.6,
FH-10.9 y células c-fos (-/-)
(prueba), que expresan constitutivamente FIGF exógeno controlado por
el promotor de CMV. Los medios condicionados se recogieron de las
células cultivadas durante 48 horas en suero al 0,5%.
(D) Actividad mitógena medida como incorporación
de [^{3}H]-timidina en fibroblastos
c-fos (-/-). Las células se incubaron con FIGF
recombinante parcialmente renaturalizado. En las mismas condiciones,
la incubación con PDGF-BB (Sigma), usado como
testigo positivo, induce aproximadamente una incorporación de
timidina 30% mayor, mientras que VEGF (Sigma) no induce la
incorporación de timidina por encima del valor de fondo. Los datos
mostrados son la media de seis experimentos llevados a cabo con dos
preparaciones de FIGF diferentes.
(E) Actividad mitógena medida como incorporación
de [^{3}H]-timidina en fibroblastos de embrión de
ratón. Las células se cultivaron con FIGF recombinante parcialmente
renaturalizado. Las células MEF se obtuvieron de embriones de
13-15 días de ratones B6D2F1. Los embriones se
sacrificaron, se aclararon y se tripsinizaron durante 30 min a 37ºC.
Las células MEF se hicieron crecer 24 horas en medio que contenía
suero al 0,5% antes de añadir los factores de crecimiento. En las
mismas condiciones, la incubación con PDGF-BB
(Sigma), usado como un testigo positivo, induce una incorporación de
timidina aproximadamente 30% mayor, mientras que VEGF (sigma) no
induce incorporación por encima del valor de fondo. Los datos
mostrados son la media de seis experimentos llevados a cabo con dos
preparaciones de FIGF diferentes. En cada experimento se restaron
los valores de fondo.
Figura
5
(A) Expresión de FIGF en células cultivadas.
Análisis de transferencia Northern de ARN total obtenido de:
fibroblastos c-fos (-/-) (calles
1-3); una línea celular estable, obtenida de células
c-fos (-/-), que expresan c-fos
exógeno (calles 4-6), fibroblastos
c-fos (+/+) (calles 7-9). Se extrajo
ARN celular por el método del tiocianato de guanidina después de
incubar las células durante 48 horas en suero al 0,5% (tiempo 0). La
concentración de suero se aumentó al 10% y se recogió el ARN total a
las 2 ó 4 horas según se indica. Las calles 10 y 11 muestran la
expresión de FIGF en fibroblastos c-fos (-/-)
transfectados transitoriamente sólo con el vector (prueba) o que
contienen c-fos controlado por el promotor
constitutivo FBJ-LTR (c-fos). Los
ARN de las células transitoriamente transfectadas se recogieron 30
horas después de cultivar las células en medio que contenía suero al
0,5%. Cada calle se cargó con 10 \mug de ARN celular total.
(B) Expresión de PDGF o VEGF. Se extrajeron los
ARN celulares totales de células c-fos (-/-) (calles
1-3) o de una línea celular estable, obtenida de
células c-fos (-/-), que expresaban
c-fos exógeno (calles 4-6), como se
indica en el panel A.
Se usó
gliceraldehído-fosfato-deshidrogenasa
(GAP-DH) como testigo para la carga de ARN.
Figura
6
Análisis Northern de ARN poli-A+
extraído de diferentes tejidos de ratón.
Figura
7
(A) Morfología de células deficientes en
c-fos. Las células se transfectaron establemente
sólo con el vector.
(B) Morfología de un clon celular obtenido de
células deficientes en c-fos, establemente
transfectadas con el vector de expresión que contiene FIGF
controlado por el promotor de CMV.
(C) Morfología de células establemente
transfectadas con un vector de expresión que contenía el ADNc de
FIGF en la orientación antisentido controlado por el promotor de
CMV.
(D) Morfología de células establemente
transfectadas con el vector de expresión que contiene
c-fos controlado por el promotor de
FBJ-LTR.
(E) Un clon celular obtenido de las mismas
células que en D (que expresan c-fos
constitutivamente) transfectadas con un vector de expresión FIGF
controlado por el promotor de CMV.
(F) Un clon celular obtenido de las mismas
células que en D (que expresan c-fos
constitutivamente) transfectadas con un vector de expresión que
contiene el ADNc de FIGF en la orientación antisentido, controlado
por el promotor de CMV.
(G) Fibroblastos c-fos (-/-)
cultivados durante 120 horas en medio que contenía suero al
0,5%.
(H) Células como en G pero tratadas durante 120
horas con FIGF recombinante parcialmente renaturalizado. Se
analizaron diez clones independientes obtenidos de 3 transfecciones
independientes. Todos mostraron cambios morfológicos similares a los
observados en la figura.
Se generaron fibroblastos de ratón, células
salvajes respecto a la expresión de c-Fos (+/+) y
líneas celulares 3T3 deficientes en c-Fos (-/-) y
línea celular establemente transfectada que expresaba
constitutivamente c-Fos, como se ha descrito (Hu, y
col., 1994). Todas las líneas celulares se hicieron crecer a 37ºC
con CO_{2} al 5% en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)
complementado con suero ternero fetal al 10% (FCS), glutamina y
penicilina-estreptomicina. Las células se cultivaron
hasta que alcanzaron aproximadamente 70% de confluencia, se
subalimentaron con suero durante 48 horas en DMEM que contenía FCS
al 0,5%, y se estimularon con DMEM que contenía FCS al 10% durante
0, 2 y 4 horas antes de aislar el ARN. El ARN total se aisló usando
el método del isotiocianato de guanidina. Se llevó a cabo la
presentación diferencial del ARNm como describen Laing y col., y
modificada por Bauer y col. (Bauer y col., 1993). Brevemente, del
ARN extraído se separó la contaminación de ADN cromosómico de
50 \mug de ARN total aislado por tratamiento con DNasa I. Se usaron 0,2 \mug de ARN, extraído a las 2 ó 4 horas después de inducción con suero, para la transcripción inversa en un volumen de reacción de 40 \mul usando cebadores dT_{12}mN y transcriptasa inversa 300 U MMLV (Promega Corp., Madison, WI) con un tiempo de incubación de 60 min a 37ºC. La mezcla de PCR para la amplificación del ADNc contenía cebador dT_{12}mN, uno de los 20 cebadores desoxinucleótidos decámeros con secuencia arbitraria (Kit A - Operon Biotechnology Inc., Alameda, CA), ^{33}P-dATP (Amersham International plc, Bucking-hamshire, Inglaterra) y polimerasa Taq 1U (Promega Corp.). Las muestras se sometieron a 40 ciclos de amplificación usando un termociclador PTC-100 (MJ Research Inc., Watertown, MA). Los parámetros de los ciclos eran los siguientes: 94ºC durante 30 segundos, 42ºC durante 90 segundos, 72ºC durante 30 segundos y un periodo de expansión adicional a 72ºC durante 10 minutos. Se ajustaron 2 \mul de mezcla de la PCR con glicerol al 5% y se cargaron en un gel de poliacrilamida al 6% sin urea (Bauer y col., 1993). Las bandas de ADNc expresado de forma diferencial, se recuperaron del gel y se volvieron a amplificar. Las sondas de ADNc reamplificadas se hicieron correr en un gel de agarosa al 1,5%, se purificaron y clonaron en el vector pGEM-T usando el sistema de clonación TA (Promega Corp.). Los clones positivos se seleccionaron usando el fenotipo azul-blanco.
50 \mug de ARN total aislado por tratamiento con DNasa I. Se usaron 0,2 \mug de ARN, extraído a las 2 ó 4 horas después de inducción con suero, para la transcripción inversa en un volumen de reacción de 40 \mul usando cebadores dT_{12}mN y transcriptasa inversa 300 U MMLV (Promega Corp., Madison, WI) con un tiempo de incubación de 60 min a 37ºC. La mezcla de PCR para la amplificación del ADNc contenía cebador dT_{12}mN, uno de los 20 cebadores desoxinucleótidos decámeros con secuencia arbitraria (Kit A - Operon Biotechnology Inc., Alameda, CA), ^{33}P-dATP (Amersham International plc, Bucking-hamshire, Inglaterra) y polimerasa Taq 1U (Promega Corp.). Las muestras se sometieron a 40 ciclos de amplificación usando un termociclador PTC-100 (MJ Research Inc., Watertown, MA). Los parámetros de los ciclos eran los siguientes: 94ºC durante 30 segundos, 42ºC durante 90 segundos, 72ºC durante 30 segundos y un periodo de expansión adicional a 72ºC durante 10 minutos. Se ajustaron 2 \mul de mezcla de la PCR con glicerol al 5% y se cargaron en un gel de poliacrilamida al 6% sin urea (Bauer y col., 1993). Las bandas de ADNc expresado de forma diferencial, se recuperaron del gel y se volvieron a amplificar. Las sondas de ADNc reamplificadas se hicieron correr en un gel de agarosa al 1,5%, se purificaron y clonaron en el vector pGEM-T usando el sistema de clonación TA (Promega Corp.). Los clones positivos se seleccionaron usando el fenotipo azul-blanco.
Típicamente de una banda se podían obtener de 1 a
3 clones diferentes, que se usaron para la caracterización sucesiva
por análisis de transferencia Northern. Los fragmentos de ADNc se
marcaron con ^{32}P-dCTP usando un kit de marcaje
de cebador aleatorio (Amersham International plc.). Se cribaron las
señales de hibridación y se cuantificaron con PhosphorImager usando
el software Image Quant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). La
secuenciación del ADN plasmídico de las sondas de ADNc clonadas con
el cebador T7 o SP6, se llevó a cabo manualmente usando el kit
Sequenase V 2.0 (US Biochemical Inc., Cleveland, Ohio). Brevemente,
el ARN extraído de las células se sometió a amplificación usando
cebadores aleatorios, y se identificaron las bandas de un tipo
celular por comparación y se aislaron. Los fragmentos obtenidos se
ensayaron en la transferencia Northern con ARN de líneas celulares
para confirmar que los ARNm correspondientes están regulados
positivamente en células que expresan Fos. Después se generó una
biblioteca de ADNc propia en vectores lambda ZAP a partir de líneas
celulares de fibroblastos de ratón para obtener los clones de
longitud completa usando un kit de síntesis y clonación de ADNc
(Stratagene). El cribado se llevó a cabo de acuerdo con el
fabricante. Los clones positivos primero se analizaron mediante mapa
de restricción, y los más largos se sometieron a secuencia de
ADN.
La secuencia de F0401 se muestra en la Figura 1 y
la secuencia de HF175 se muestra en la Figura 2: un análisis
búsqueda sencillo en los bancos de datos NIH y EMBL puso de
manifiesto que F0401 y el homólogo humano FIGF son genes nuevos, y
sus secuencias son similares a los genes de una familia de factores
de crecimiento caracterizados por la identidad de la familia del
factor de crecimiento de plaquetas (PDGF). El patrón de consenso de
la familia es:
C-V-x(3)-R-C-x-G-C-C-N.
Los miembros de esta familia forman dímeros con enlaces disulfuro y
son mitógenos potentes. La secuencia más parecida a F0401 y HF175 es
la del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que forma un
homodímero y es un factor de crecimiento activo en la angiogénesis y
el crecimiento celular endotelial (Keck y col., 1989; Leung y col.,
1989). Puesto que VEGF es un factor de crecimiento su sobreexpresión
puede dar como resultado angiogénesis tumoral (Plate y col., 1993).
Informes recientes indican el posible uso terapéutico basado en la
inhibición de VEGF en tumores (Kim y col., 1993), y en el
tratamiento con VEGF para estimular la angiogénesis (Takeshita y
col., 1994).
Los siguientes experimentos se llevaron a cabo
usando F0401.
La secuencia de proteína predicha para FIGF tiene
una secuencia hidrófoba en el extremo N que puede codificar un
péptido señal. Esta región del extremo N larga no muestra una
homología significativa con proteínas conocidas. Sin embargo, hay un
dominio cargado positivamente en esta región que puede permitir la
unión de la proteína a la membrana celular o a la matriz
extracelular.
Para verificar si FIGF es una proteína segregada,
se transfectaron células COS-7 con un vector de
expresión que contenía el ADNc de FIGF controlado por el promotor
del gen temprano inmediato del citomegalovirus (CMV). Los
anticuerpos policlonales, contra FIGF recombinante (como se ha
descrito previamente), inmunoprecipitaron una banda específica que
se observa tanto en los lisatos celulares como en los medios
condicionados de las células COS-7 transfectadas con
FIGF (Fig. 4A). Después de 1 hora de marcaje seguido de 1 hora de
seguimiento, estaba presente principalmente una banda específica en
el lisato celular, mientras que después de un seguimiento más largo
de 4 horas, la proteína se acumulaba en el líquido sobrenadante
celular. En condiciones no desnaturalizantes, FIGF se agregó en una
forma multímera. La adición de b-mercaptoetanol dio
como resultado una desnaturalización parcial de la proteína que
migró mayoritariamente como una banda de 66 kDa y sólo se pudo
encontrar una fracción minoritaria de la proteína como un monómero
de los 33 kDa de masa molecular esperado (Fig. 4A). Estos resultados
muestran que FIGF es una proteína secretada y puede formar dímeros.
La dimerización de FIGF se podía predecir puesto que el dominio
central de FIGF es altamente conservado y contiene los restos de
cisteína implicados en la dimerización tanto de PDGF como de VEGF.
Además se investigó si el medio condicionado de las células que
producían FIGF podía promover el crecimiento celular in
vitro, ensayado como la incorporación de
[^{3}H]-timidina (Vaziri y col., (1995)). El medio
condicionado se obtuvo de células COS-7
transfectadas transitoriamente o de clones estables, derivados de
fibroblastos c-fos (-/-), que expresaban FIGF
controlado por el promotor de CMV. La actividad mitógena del medio
que contenía FIGF se ensayó en fibroblastos c-fos
(-/-). El medio condicionado tanto de COS-7
transfectadas (Fig. 4B) como de clones de fibroblastos estables que
sobreexpresan FIGF (Fig. 4C), induce la síntesis de ADN en
fibroblastos c-fos (-/-). Como en las células de
mamífero la expresión de FIGF podía inducir la activación de otros
factores de crecimiento, que a su vez serían responsables de la
incorporación de [^{3}H]-timidina medida, se
ensayó la actividad mitógena de una proteína FIGF recombinante
expresada en E. coli (como se ha descrito previamente). Con
el fin de obtener una proteína recombinante biológicamente activa,
la proteína FIGF de E. coli purificada se renaturalizó
parcialmente en presencia de una mezcla de glutatión reducido y
oxidado. La proteína recombinante purificada se ajustó a 0,4 mg/ml y
se redujo completamente en presencia de urea 8 M,
b-mercaptoetanol al 2%, durante 1 hora a 370ºC. La
proteína reducida se dializó contra una solución que contenía
Tris-Cl 50 mM pH 8,0, urea 1 M, glutatión reducido 5
mM y glutatión oxidado 0,5 mM durante 2 días, y contra una solución
que contenía Tris-Cl 20 mM pH 7,5, NaCl 0,7 M
durante 1 día, como describen Hoppe y col., Biochemistry, 28,
págs. 2956-2960 (1989); Hoppe y col. Eur. J.
Biochem., 187, págs. 207-214 (1990). El FIGF
parcialmente replegado inducía la síntesis de ADN en
fibroblastos
c-fos (-/-) de una forma dependiente de la dosis (Fig. 4D). Como se esperaba, las células c-fos (-/-) también son sensibles a PDGF-BB, mientras que el tratamiento con VEGF no inducía incorporación de [^{3}H]-timidina en estas células. La actividad mayor de síntesis de ADN se obtuvo con 2 \mug de FIGF purificado. La actividad específica aparentemente baja observada de FIGF recombinante, probablemente se debe a la baja eficacia del replegado correcto de FIGF, puesto que FIGF contiene 29 restos de cisteína de 358 aminoácidos. También se ensayó la actividad mitógena de FIGF recombinante en fibroblastos de embrión de ratón (MEF). FIGF inducía la síntesis de ADN en fibroblastos de embrión de ratón de una forma dependiente de la dosis (Fig. 4E). Se aisló el ADNc de FIGF por cribado diferencial de ARN de células que diferían sólo en la expresión de c-fos. El análisis de la expresión del gen de FIGF por transferencia Northern pone de manifiesto que el mensajero de FIGF apenas se puede detectar en fibroblastos c-fos (-/-), mientras que su expresión es alta en fibroblastos c-fos (+/+) salvajes (Fig. 5A, compárense las calles 1-3 con las calles 7-9). La expresión de FIGF se restablece completamente en clones estables, derivados de células c-fos (-/-), que expresan c-fos exógeno controlado por el promotor constitutivo de FBJ-LTR (Hu y col., (1994)) (Fig. 5A, compárense las calles 1-3 con las calles 4-6). La transfección transitoria de c-fos exógeno da como resultado la inducción de FIGF en células c-fos (-/-), aunque debido al menor número de células transfectadas, la inducción observada es menos pronunciada (Fig. 5A, calles 10 y 11). Por lo tanto, la expresión de FIGF depende de c-fos. Además, FIGF no es inducido por el homólogo de levadura AP-1 constitutivo GCN4. En células de mamífero GCN4 puede activar la mayoría de los genes diana de AP-1, pero no es oncogénico. En fibroblastos salvajes c-Fos es la proteína Fos mayoritaria asociada con c-Jun o Jun B en la primera hora después de la inducción con suero. Después c-Fos ya no es detectable y se sustituye por FraJ1 y FraJ2 en el complejo de AP-1. En células que expresan c-fos, FIGF es altamente expresado cuando las células se mantienen en condiciones de suero bajo y disminuye a niveles indetectables en 6 horas después de la inducción con suero (Fig. 5A). Este patrón de expresión de FIGF se puede observar tanto en células salvajes como en células que expresan constitutivamente c-fos (Fig. 5A). Por lo tanto, se observa una discrepancia entre el máximo esperado de expresión de c-fos y la aparición de FIGF, cuyo mensajero se acumula en la fase inactiva. El patrón de regulación de FIGF sugiere que además de la expresión de c-fos, son necesarios controles de regulación adicionales para su activación. Aunque FIGF pertenece a la familia de factores de crecimiento de PDGF/VEGF, su expresión se parece más a la expresión de genes específicos de parada de crecimiento (gas). Es interesante que, uno de ellos, gas6, actúa como un factor de crecimiento. Tanto el factor de crecimiento PDGF como VEGF están implicados en la formación de tumor (Kim y col., (1993)). Además, PDGF es el principal mitógeno del suero que induce la activación de la transcripción de c-fos. Con el fin de comparar el patrón de expresión de este factor de crecimiento con respecto a FIGF, se midieron los niveles de los mensajeros de PDGF y VEGF en fibroblastos que diferían en la expresión de c-fos. Como se puede observar en la Fig. 5B, la regulación de los mensajeros tanto de PDGF como de VEGF es distinta de la FIGF. Estos factores de crecimiento son inducidos rápidamente después de la inducción con suero y su expresión es independiente de la de c-fos. El avance del tumor se caracteriza por cambios morfológicos del tumor que conducen a que las células mutadas pierdan su adhesión a los vecinos originales y escapen del tejido de origen. Se ha implicado a c-fos en el avance del tumor y su sobreexpresión induce una morfología celular transformada en fibroblastos y células epiteliales. Puesto que FIGF es un factor de crecimiento dependiente de c-fos, se analizó si su sobreexpresión podía inducir la transformación morfológica de los fibroblastos. Como se puede observar en la Fig. 7, la expresión constitutiva de FIGF en los fibroblastos induce un fenotipo transformado. Los clones estables derivados de células c-fos (-/-), que expresan FIGF constitutivamente, adquieren una morfología con forma de huso, se hacen más refractivos y se desprenden de la placa (Fig. 7, B frente a A). Por el contrario, los clones estables que expresan el mensajero de FIGF antisentido adquieren una fenotipo plano menos refringente (Fig. 7C) que es más parecido al fenotipo de células c-fos (-/-) mantenidas en condiciones de poco suero (Fig. 7G). La sobreexpresión de c-fos altera la morfología de la célula c-fos (-/-) de la misma forma que la observada con la sobreexpresión de FIGF, aunque el fenotipo es menos pronunciado (Fig. 7D). La sobreexpresión tanto de c-fos como de FIGF conduce a un fenotipo extremo en los fibroblastos: las células se hacen más largas, desorganizadas y pierden contacto (Fig. 7E). La expresión del mensajero antisentido de FIGF en células que expresan constitutivamente c-fos induce una inversión del fenotipo transformado (Fig. 7F). Por lo tanto, las células que expresan c-fos pero que carecen de FIGF pierden la mayor parte del fenotipo transformado, sugiriendo que la morfología observada en las células que expresan c-fos constitutivamente se debe a FIGF. También se obtienen alteraciones morfológicas similares por el tratamiento de células con FIGF recombinante purificado. Los fibroblastos c-fos (-/-), mantenidos en medio que contiene suero al 0,5% durante 120 horas, dejan de crecer, se vuelven grandes y planos y menos refringentes (Fig. 7G). El tratamiento de células con FIGF recombinante induce el fenotipo refringente, alargado y no adherente (Fig. 7H).
c-fos (-/-) de una forma dependiente de la dosis (Fig. 4D). Como se esperaba, las células c-fos (-/-) también son sensibles a PDGF-BB, mientras que el tratamiento con VEGF no inducía incorporación de [^{3}H]-timidina en estas células. La actividad mayor de síntesis de ADN se obtuvo con 2 \mug de FIGF purificado. La actividad específica aparentemente baja observada de FIGF recombinante, probablemente se debe a la baja eficacia del replegado correcto de FIGF, puesto que FIGF contiene 29 restos de cisteína de 358 aminoácidos. También se ensayó la actividad mitógena de FIGF recombinante en fibroblastos de embrión de ratón (MEF). FIGF inducía la síntesis de ADN en fibroblastos de embrión de ratón de una forma dependiente de la dosis (Fig. 4E). Se aisló el ADNc de FIGF por cribado diferencial de ARN de células que diferían sólo en la expresión de c-fos. El análisis de la expresión del gen de FIGF por transferencia Northern pone de manifiesto que el mensajero de FIGF apenas se puede detectar en fibroblastos c-fos (-/-), mientras que su expresión es alta en fibroblastos c-fos (+/+) salvajes (Fig. 5A, compárense las calles 1-3 con las calles 7-9). La expresión de FIGF se restablece completamente en clones estables, derivados de células c-fos (-/-), que expresan c-fos exógeno controlado por el promotor constitutivo de FBJ-LTR (Hu y col., (1994)) (Fig. 5A, compárense las calles 1-3 con las calles 4-6). La transfección transitoria de c-fos exógeno da como resultado la inducción de FIGF en células c-fos (-/-), aunque debido al menor número de células transfectadas, la inducción observada es menos pronunciada (Fig. 5A, calles 10 y 11). Por lo tanto, la expresión de FIGF depende de c-fos. Además, FIGF no es inducido por el homólogo de levadura AP-1 constitutivo GCN4. En células de mamífero GCN4 puede activar la mayoría de los genes diana de AP-1, pero no es oncogénico. En fibroblastos salvajes c-Fos es la proteína Fos mayoritaria asociada con c-Jun o Jun B en la primera hora después de la inducción con suero. Después c-Fos ya no es detectable y se sustituye por FraJ1 y FraJ2 en el complejo de AP-1. En células que expresan c-fos, FIGF es altamente expresado cuando las células se mantienen en condiciones de suero bajo y disminuye a niveles indetectables en 6 horas después de la inducción con suero (Fig. 5A). Este patrón de expresión de FIGF se puede observar tanto en células salvajes como en células que expresan constitutivamente c-fos (Fig. 5A). Por lo tanto, se observa una discrepancia entre el máximo esperado de expresión de c-fos y la aparición de FIGF, cuyo mensajero se acumula en la fase inactiva. El patrón de regulación de FIGF sugiere que además de la expresión de c-fos, son necesarios controles de regulación adicionales para su activación. Aunque FIGF pertenece a la familia de factores de crecimiento de PDGF/VEGF, su expresión se parece más a la expresión de genes específicos de parada de crecimiento (gas). Es interesante que, uno de ellos, gas6, actúa como un factor de crecimiento. Tanto el factor de crecimiento PDGF como VEGF están implicados en la formación de tumor (Kim y col., (1993)). Además, PDGF es el principal mitógeno del suero que induce la activación de la transcripción de c-fos. Con el fin de comparar el patrón de expresión de este factor de crecimiento con respecto a FIGF, se midieron los niveles de los mensajeros de PDGF y VEGF en fibroblastos que diferían en la expresión de c-fos. Como se puede observar en la Fig. 5B, la regulación de los mensajeros tanto de PDGF como de VEGF es distinta de la FIGF. Estos factores de crecimiento son inducidos rápidamente después de la inducción con suero y su expresión es independiente de la de c-fos. El avance del tumor se caracteriza por cambios morfológicos del tumor que conducen a que las células mutadas pierdan su adhesión a los vecinos originales y escapen del tejido de origen. Se ha implicado a c-fos en el avance del tumor y su sobreexpresión induce una morfología celular transformada en fibroblastos y células epiteliales. Puesto que FIGF es un factor de crecimiento dependiente de c-fos, se analizó si su sobreexpresión podía inducir la transformación morfológica de los fibroblastos. Como se puede observar en la Fig. 7, la expresión constitutiva de FIGF en los fibroblastos induce un fenotipo transformado. Los clones estables derivados de células c-fos (-/-), que expresan FIGF constitutivamente, adquieren una morfología con forma de huso, se hacen más refractivos y se desprenden de la placa (Fig. 7, B frente a A). Por el contrario, los clones estables que expresan el mensajero de FIGF antisentido adquieren una fenotipo plano menos refringente (Fig. 7C) que es más parecido al fenotipo de células c-fos (-/-) mantenidas en condiciones de poco suero (Fig. 7G). La sobreexpresión de c-fos altera la morfología de la célula c-fos (-/-) de la misma forma que la observada con la sobreexpresión de FIGF, aunque el fenotipo es menos pronunciado (Fig. 7D). La sobreexpresión tanto de c-fos como de FIGF conduce a un fenotipo extremo en los fibroblastos: las células se hacen más largas, desorganizadas y pierden contacto (Fig. 7E). La expresión del mensajero antisentido de FIGF en células que expresan constitutivamente c-fos induce una inversión del fenotipo transformado (Fig. 7F). Por lo tanto, las células que expresan c-fos pero que carecen de FIGF pierden la mayor parte del fenotipo transformado, sugiriendo que la morfología observada en las células que expresan c-fos constitutivamente se debe a FIGF. También se obtienen alteraciones morfológicas similares por el tratamiento de células con FIGF recombinante purificado. Los fibroblastos c-fos (-/-), mantenidos en medio que contiene suero al 0,5% durante 120 horas, dejan de crecer, se vuelven grandes y planos y menos refringentes (Fig. 7G). El tratamiento de células con FIGF recombinante induce el fenotipo refringente, alargado y no adherente (Fig. 7H).
Los tumores obtenidos de células deficientes en
c-fos no pueden experimentar avance maligno incluso
aunque lleven el v-H-Ras activado.
Por lo tanto, la expresión de c-fos es esencial para
la activación de los genes diana responsables del fenotipo maligno.
FIGF es un factor de crecimiento autocrino dependiente de
c-fos que puede inducir acceso a la división
celular, y cuando es sobreexpresado, un fenotipo transformado en
fibroblastos. Los datos sugieren que el papel de
c-fos en la activación del fenotipo maligno se debe
a la activación de FIGF.
Experimentos adicionales sobre FIGF usando una
sonda específica para FIGF en el análisis Northern de ARN derivado
de tejidos de ratón, muestran que el gen de FIGF sólo es expresado
en células que expresan Fos y pobremente en células que carecen del
oncogén Fos (Figura 5). La transferencia de ARN usada en el ensayo
Northern se obtuvo de Clontec. El análisis de su expresión en
tejidos de ratón muestra que FIGF es expresado principalmente en el
pulmón (Figura 6) y ya está presente el día 7 de vida del embrión de
ratón (no se muestra).
Por lo tanto FIGF es una molécula relacionada con
el factor de crecimiento VEGF, regulado positivamente por el oncogén
Fos. Podría estar implicado en tumores y en el desarrollo.
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43.
EP-A-0125023
Claims (13)
1. Una molécula de nucleótidos que tiene al menos
80% de homología con la secuencia de nucleótidos expuesta entre el
nucleótido 283 y el nucleótido 1356 de la Figura 1, codificando
dicha molécula de nucleótidos una proteína con actividad mitógena, o
un fragmento de dicha molécula de nucleótidos, cuyo fragmento
codifica una proteína con actividad mitógena.
2. Una molécula de nucleótidos que tiene al
menos 80% de homología con la secuencia de nucleótidos expuesta
entre el nucleótido 242 y el nucleótido 1303 de la Figura 2,
codificando dicha molécula de nucleótidos una proteína con actividad
mitógena, o un fragmento de dicha molécula de nucleótidos, cuyo
fragmento codifica una proteína con actividad mitógena.
3. La proteína codificada por la molécula de
nucleótidos o el fragmento de dicha molécula de nucleótidos de la
reivindicación 1 o reivindicación 2.
4. Un vector para expresar la molécula de
nucleótidos de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que comprende
un promotor y dicha molécula de nucleótidos.
5. Una célula hospedante transformada con el
vector de la reivindicación 4.
6. La célula hospedante de la reivindicación 5
que es una célula de ovario de hámster chino.
7. Un método para producir la proteína de la
reivindicación 3, que comprende cultivar la célula hospedante de la
reivindicación 5 o reivindicación 6 en condiciones que conducen a la
producción de la proteína, y recoger la proteína.
8. La molécula de nucleótidos de la
reivindicación 1 o reivindicación 2, para usar en la terapia.
9. El uso de la molécula de nucleótidos de la
reivindicación 1 o reivindicación 2, en la fabricación de una
composición para tratar trastornos del desarrollo.
10. El uso de la proteína de la reivindicación
3, para identificar el receptor de dicha proteína.
11. El uso de la proteína de la reivindicación
3, en un ensayo para identificar antagonistas o agonistas de dicha
proteína.
12. El uso de la molécula de nucleótidos de la
reivindicación 1 o reivindicación 2, la proteína de la
reivindicación 3 en el diagnóstico in vitro de un estado
patológico o una predisposición a una enfermedad.
13. El uso de la secuencia de nucleótidos de la
reivindicación 1 o reivindicación 2, para generar un animal
transgénico no humano.
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