DE69735942T2

DE69735942T2 - Neuartige inhibitoren der aktivität des wachstumsfaktors für gefäss-endothelzellen (vegf), ihre verwendungen und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69735942T2
Application number: DE69735942T
Authority: DE
Inventors: Lynn Terri Foster City DAVIS-SMYTH; Hsifei Helen Daly City CHEN; Leonard San Francisco PRESTA; Napoleone San Francisco FERRARA
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-05-07
Filing date: 1997-05-06
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2017-05-07
Also published as: ES2267143T3; DE69735942D1; US20090010933A1; DK0907733T3; US5952199A; WO1997044453A1; AU3060497A; US20130178418A1; US20110301337A1; AU717112B2; EP1666499A2; US20030092604A1; EP0907733B1; US7771721B2; US8268313B2; US20110213130A1; NZ332779A; US20110300577A1; CA2804657A1; US20110301338A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige chimäre VEGF-Rezeptorproteine, umfassend Aminosäuresequenzen, die von Vaskulärendothelwachstumsfaktor-(VEGF-)Rezeptoren flt-1, KDR und dem murinen Homolog des Human-KDR-Rezeptors, FLK-1, herrühren, worin sich die chimären VEGF-Rezeptorproteine an VEGF binden und dessen proliferative und angiogene Endothelzellen-Aktivität antagonisieren. Die Erfindung betrifft außerdem Nucleinsäuren und Expressionsvektoren, die für diese chimären VEGF-Rezeptorproteine kodieren, solche Expressionsvektoren umfassende Wirtszellen, solche Proteine umfassende, pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen, Verfahren zur Herstellung solcher Proteine und Verfahren unter Verwendung derartiger Proteine zur Behandlung von mit unerwünschter Vaskularisierung assoziierten Leiden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die zwei zellulären Hauptkomponenten des Säugetier-Gefäßsystems sind die Endothel- und Glattmuskelzellen. Endothelzellen bilden die Auskleidung der Innenfläche aller Blutgefäße im Säugetier und stellen eine nichtthrombogene Grenzfläche zwischen Blut und Gewebe dar. Daher ist die Proliferation von Endothelzellen eine wichtige Komponente für die Entwicklung neuer Kapillaren und Blutgefäße, was wiederum ein notwendiger Prozess für das Wachstum und/oder die Regeneration von Säugetiergewebe ist.
Ein Protein, das erwiesenermaßen eine äußerst wichtige Rolle bei der Förderung der Proliferation und Angiogenese von Endothelzellen spielt, ist der Vaskulärendothel wachstumsfaktor (VEGF). VEGF ist ein sich an Heparin bindender Endothelzellen-Wachstumsfaktor, der ursprünglich aus Medium identifiziert und gereinigt wurde, das mit Follikel- oder Follikulostellar-(FS-)Zellen aus der Rinderhypophyse konditioniert war. Ferrara und Henzel, Biochem. Biophys. Res. Comm 161, 851–858 (1989). VEGF ist ein Dimer mit einem scheinbaren Molekülmasse von etwa 46 kDa, wobei jede Untereinheit eine scheinbare Molekülmasse von etwa 23 kDa aufweist. Human-VEGF wird in einer Vielzahl von Geweben in mehreren Homodimer-Formen exprimiert (121, 165, 189 und 206 Aminosäuren pro Monomer), wobei jede Form das Ergebnis alternativen Spleißens eines einzelnen RNA-Transkripts ist. VEGF₁₂₁ ist ein lösliches Mitogen, das Heparin nicht bindet, während längere Formen von VEGF Heparin mit zunehmend höherer Affinität binden.
Biochemische Analysen zeigten, dass VEGF eine starke mitogene Spezifität für vaskuläre Endothelzellen besitzt. Beispielsweise förderten Medien, die durch mit Human-VEGF-cDNA transfizierten Zellen konditioniert waren, die Proliferation von Kapillarendothelzellen, während dies bei durch Vergleichszellen konditioniertem Medium nicht der Fall war. Leung et al., Science 246, 1306 (1989). Somit weiß man, dass VEGF die Proliferation und Angiogenese vaskulärer Endothelzellen fördert, wobei es sich hierbei um ein Verfahren handelt, das die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehendem Endothel umfasst. Als solches könnte sich VEGF für die therapeutische Behandlung zahlreicher Leiden eignen, bei denen eine wachstumsfördernde Aktivität auf die vaskulären Endothelzellen von Bedeutung ist, z.B. im Fall von Ulzera, vaskulären Läsionen und Myokardinfarkt.
Während allerdings die vaskuläre Endothelproliferation unter gewissen Umständen wünschenswert ist, sind die vaskuläre Endothelproliferation und -angiogenese auch wichtige Komponenten in einer Vielzahl von Krankheiten und Störungen; Beispiele dafür sind Tumorwachstum und Metastasen, Rheumatoidarthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, altersbedingte Mauklardegeneration, Hämangiome, Immunabstoßung von transplantiertem Kornealgewebe und anderer Gewebe sowie chronische Entzündung. Natür lich möchte man bei Patienten, die an diesen Störungen leiden, die Endothelproliferationsaktivität des VEGF-Proteins hemmen oder zumindest substanziell reduzieren.
Im spezifischen Fall von Tumorzellenwachstum scheint die Angiogenese für den Übergang von Hyperplasie zu Neoplasie und für die Versorgung des wachsenden festen Tumors mit Nahrung von grundsätzlicher Bedeutung zu sein. Folkman et al., Nature 339, 58 (1989). Die Angiogense ermöglicht es den Tumoren auch, mit dem Gefäßbett des Wirts in Kontakt zu stehen – dies eröffnet eine Möglichkeit der Metastasenbildung von Tumorzellen. Hinweise auf die Rolle der Angiogenese in der Tumormetastase finden sich z.B. in Studien, die eine Korrelation zwischen der Anzahl und der Dichte von Mikrogefäßen in histologischen Sektionen von invasivem Human-Brustkarzinom und der tatsächlichen Gegenwart entfernter Metastasen aufzeigen. Weidner et al., New Engl. J. Med. 324, 1 (1991). Somit ist ein möglicher Mechanismus zur effektiven Behandlung neoplastischer Tumoren die Hemmung oder substanzielle Reduktion der proliferativen und angiogenen Endothelaktivität des VEGF-Proteins.
Die proliferative Endothelaktivität von VEGF wird erwiesenermaßen durch zwei hochaffine Tyrosin-Kinase-Rezeptoren, flt-1 und KDR, mediiert, die nur auf der Oberfläche vaskulärer Endothelzellen existieren. DeVries et al., Science 225, 989–991 (1992), und Terman et al., Oncogene 6, 1677–1683 (1991). Sowohl der flt-1- als auch der KDR-Tyrosin-Kinase-Rezeptor besitzen sieben Immunglobulin-ähnliche (Ig-ähnliche) Domänen, die die extrazellulären Liganden-Bindungsregionen der Rezeptoren bilden, eine Transmembrandomäne, die dazu dient, den Rezeptor auf der Oberfläche von Zellen zu verankern, in denen er exprimiert wird, und eine intrazelluläre katalytische Tyrosin-Kinase-Domäne, die durch ein „Kinase-Insert" unterbrochen ist. Während der KDR-Rezeptor nur das VEGF-Protein mit hoher Affinität bindet, bindet der flt-1-Rezeptor auch Plazenta-Wachstumsfaktor (PLGF), ein Molekül mit signifikanter Strukturhomologie mit VEGF. Eine zusätzliche Rezeptor-Tyrosin-Kinase mit sieben Ig-ähnlichen Domänen in der extrazellulären Liganden-Bindungsregion ist FLT4, die kein Rezeptor für VEGF oder PLGF ist, sondern sich an einen anderen Li ganden, VH1.4.5, bindet. Der VH1.4.5-Ligand wurde in der Literatur als VEGF-verwandtes Protein (VRP) oder VEGF-C bezeichnet.
Gen-Knockout-Studien aus jüngster Zeit zeigten, dass sowohl der flt-1- als auch der KDR-Rezeptor für die normale Entwicklung des Säugetier-Vaskulärsystems essenziell ist, obwohl ihre jeweilige Rolle bei der Endothelzellen-Proliferation und -Differenzierung unterschiedlich zu sein scheint. Die endothele proliferative und angiogene Aktivität des VEGF-Proteins wird durch Bindung an die extrazelluläre Liganden-Bindungsregion des flt-1- und KDR-Rezeptors auf der Oberfläche vaskulärer Endothelzellen mediiert.
Die WO 95/33050 offenbart eine modifizierte, lösliche Form des FLT-Polypeptids, das sich an VEGF binden kann und daher eine hemmende Wirkung darauf ausübt, wobei das Polypeptid fünf oder weniger komplette Ig-ähnliche Domänen aufweist, sowie das Polypeptid umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen und zahlreiche Verwendungszwecke dafür.
Angesichts der Rolle von VEGF in der vaskulären Endothelproliferation und -Angiogenese und der Rolle, die diese Prozesse in unterschiedlichen Krankheiten und Störungen spielen können, ist es wünschenswert, über die Möglichkeit zu verfügen, eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten von VEGF zu reduzieren oder zu hemmen. Als solches basiert die vorliegende Erfindung auf Forschungen zur Identifikation einer oder mehrerer Ig-ähnlicher Domänen der extrazellulären Liganden-Bindungsregion des flt-1- und des KDR-Rezeptors, die die Bindung an das VEGF-Protein und das Insertieren oder Fusionieren dieser Domäne(n) in Aminosäuresequenzen aus einem anderen Protein mediieren, um ein „chimäres VEGF-Rezeptorprotein" zu produzieren. Die chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung binden sich an endogenen VEGF und inaktivieren diesen, wodurch eine Möglichkeit gegeben ist, endogene VEGF-Aktivität zu reduzieren oder zu inhibieren, was wiederum die Proliferation und Angiogenese von Endothelzellen reduziert oder inhibiert. Somit ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neuartige chimäre VEGF-Rezeptorproteine bereitzustellen, die Aminosäuresequenzen aus der extrazellulären Liganden-Bindungs region der flt-1- und KDR-Rezeptoren umfassen, worin die chimären VEGF-Rezeptorproteine zur Bindung und Hemmung der VEGF-Aktivität fähig sind.
Weitere Ziele der Erfindung sind die Bereitstellung von Nucleinsäuren, die für chimäre VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung kodieren, replizierbarer Expressionsvektoren, die zur Expression solcher chimärer Proteine fähig sind, Wirtszellen, die mit diesen Expressionsvektoren transfiziert sind, pharmazeutischer Zusammensetzungen, die die chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung umfassen, Verfahren zur Herstellung derartiger chimärer Proteine und Verfahren zur Verwendung dieser chimären Proteine für die therapeutische Behandlung eines dieser Behandlung bedürfenden Patienten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die weiter oben allgemein definierten Ziele der Erfindung werden durch Vorsehen der in den Ansprüchen definierten chimären VEGF-Rezeptorproteine erreicht, die zur Bindung an VEGF und zur Ausübung einer hemmenden Wirkung darauf fähig sind, worin das chimäre VEGF-Rezeptorprotein Ig-ähnliche Domänen 1, 2 und 3 des flt-1- und/oder des KDR-Rezeptors (oder den Mäuse-Homolog des KDR-Rezeptors, FLK-1) oder funktionelle Äquivalente davon umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung flt-1- oder KDR-Rezeptor-Aminosäuresequenzen, die nur den Ig-ähnlichen Domänen 1, 2 und 3 der extrazellulären Liganden-Bindungsregion davon entsprechen, wobei jede Ig-ähnliche Domäne aus demselben VEGF-Rezeptor stammt.
In anderen Ausführungsformen umfassen die chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung Ig-ähnliche Domänen 1, 2 und 3 der extrazellulären Liganden-Bindungsregion des flt-1- oder KDR-Rezeptors zusätzlich zu einer oder mehreren der verblie benen vier Ig-ähnlichen Domänen. Vorzugsweise stammen die verwendeten Ig-ähnlichen Domänen aus dem gleichen Rezeptor, doch eine Kombination von Ig-ähnlichen Domänen aus dem flt-1- und aus dem KDR-Rezeptor kommt ebenfalls in Frage.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfassen die chimären VEGF-Rezeptorproteine die extrazelluläre Liganden-Bindungsregion des FLT4-Rezeptors, worin zumindest die Ig-ähnliche Domäne 2 des FLT4-Rezeptors mit der Ig-ähnlichen Domäne 2 des flt-1- oder des KDR-Rezeptors ersetzt ist. Vorzugsweise ist nur die Ig-ähnliche Domäne 2 des FLT4-Rezeptors durch die entsprechende Ig-ähnliche Domäne aus dem flt-1- oder dem KDR-Rezeptor ersetzt, doch es können auch andere Domänen in ähnlicher Weise ersetzt sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Nucleinsäuresequenzen, die für die hierin beschriebenen chimären VEGF-Rezeptorproteine sowie funktionelle Äquivalente davon kodieren. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig, dass derartige Nucleinsäuren infolge der Degeneration des genetischen Codes variieren können, wobei derartige Nucleinsäurevarianten ebenfalls vom Schutzbereich der Erfindung erfasst sind.
In zusätzlichen Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung replizierbare Expressionsvektoren, die für die verschiedenen oben erläuterten chimären VEGF-Rezeptorproteine kodieren, mit diesen Expressionsvektoren transfizierte Wirtszellen sowie Zusammensetzungen, die die oben beschriebenen chimären VEGF-Rezeptorproteine umfassen, die mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten vermischt sind.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung die in den Ansprüchen definierten Verfahren zur Herstellung der weiter oben beschriebenen chimären VEGF-Rezeptorproteine durch Einsetzen eines für das erwünschte chimäre Protein kodierenden Expressionsvektors in ein geeignetes Expressionssystem und Herbeiführen der Expression des Proteins.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der chimären VEGF-Rezeptorproteine als Mittel zur Behandlung von Zuständen, die mit ungenügender Vaskularisation assoziiert sind, worin die Hemmung von Vaskularisation und Angiogenese wünschenswert ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. DEFINITIONEN
Der Ausdruck „chimäres VEGF-Rezeptorprotein" bezieht sich auf ein Rezeptormolekül mit Aminosäuresequenzen, die aus zumindest zwei unterschiedlichen Proteinen stammen, von denen zumindest eine der fit-1- oder der KDR-Rezeptor ist, wobei das Rezeptormolekül zur Bindung an VEGF und zur Hemmung seiner Aktivität fähig ist. Vorzugsweise bestehen die chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung aus Aminosäuresequenzen aus nur zwei unterschiedlichen VEGF-Rezeptormolekülen, doch Aminosäuresequenzen, die Ig-ähnliche Domänen aus der extrazellulären Liganden-Bindungsregion des flt-1- und/oder KDR-Rezeptors umfassen, können mit Aminosäuresequenzen aus anderen nicht-verwandten Proteinen verbunden sein, z.B. Immunglobulinsequenzen. Andere Aminosäuresequenzen, mit denen Ig-ähnliche Domänen kombiniert sind, sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig.
Der Ausdruck „KDR-Rezeptor" bezieht sich hierin nicht nur auf den KDR-Rezeptor, sondern auch auf das murine Homolog des Human-KDR-Rezeptors mit der Bezeichnung FLK-1.
„Immungobulin-ähnliche Domäne" oder „Ig-ähnliche Domäne" bezieht sich auf jede der sieben unabhängigen und voneinander unterschiedlichen Domänen, die man in der extrazellulären Liganden-Bindungsregion der flt-1-, KDR- und FLT4-Rezeptoren vorfindet. Ig-ähnliche Domänen werden im Allgemeinen durch eine Zahl gekenn zeichnet. Der Ausdruck „Ig-ähnliche Domäne" umfasst hierin nicht nur die komplette Wildtypdomäne, sondern auch Insertions-, Deletions- und Substitutionsvarianten davon, die im Wesentlichen die funktionellen Eigenschaften der intakten Domäne beibehalten. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig, dass zahlreiche Varianten der Ig-ähnlichen Domänen der flt-1- und KDR-Rezeptoren erhalten werden können, die im Wesentlichen die gleichen funktionellen Eigenschaften wie die Wildtypdomäne beibehalten.
„Löslich" in Zusammenhang mit den chimären VEGF-Rezeptorproteinen der Erfindung bezieht sich auf chimäre VEGF-Rezeptorproteine, die nicht mittels einer Transmembrandomäne an der Zelloberfläche fixiert sind. Lösliche Formen der chimären VEGF-Bindungsproteine der Erfindung sind zwar zur Bindung an und Inaktivierung von VEGF fähig, sie umfassen aber keine Transmembrandomäne und werden daher im Allgemeinen nicht mit der Zellmembran von Zellen assoziiert, in denen das Molekül exprimiert wird. Eine lösliche Form des Rezeptors übt durch Bindung an VEGF eine hemmende Wirkung auf die biologische Aktivität des VEGF-Proteins aus, wodurch es daran gehindert wird, sich an seine natürlichen Rezeptoren auf der Oberfläche von Zielzellen zu binden.
„Membran-gebunden" bedeutet hierin in Zusammenhang mit den chimären VEGF-Rezeptorproteinen der Erfindung chimäre VEGF-Rezeptorproteine, die mittels einer Transmembrandomäne an der Oberfläche von Zellen fixiert sind, in denen sie exprimiert werden.
„Funktionelle Äquivalente" bedeuten hierin in Zusammenhang mit den Ig-ähnlichen Domänen der extrazellulären Liganden-Bindungsregionen der flt-1-, KDR- oder FLT4-Rezeptoren, dass die Ig-ähnliche(n) Domäne(n) zumindest eine bestimmte Modifikation, z.B. eine Deletion, Addition und/oder Substitution, darin aufweist bzw. aufweisen, doch im Wesentlichen die gleichen funktionellen Eigenschaften wie die Ig-ähnlichen Wildtypdomäne(n) beibehält bzw. beibehalten. In Zusammenhang mit Ig-ähnlichen Domänen 1, 2 und 3 des flt-1- und/oder KDR-Rezeptors bezieht sich der Ausdruck „funktionelle Äquivalente" auf den Umfang so vieler derartiger Domä nen, dass zumindest substanzielle Bindung an VEGF gegeben ist, d.h. eine partielle Sequenz jeder der Domänen, die Bindungswirkung aufweist.
„Hemmwirkung" bedeutet hierin in Zusammenhang mit der Aktivität eines chimären VEGF-Rezeptorproteins der Erfindung, dass sich das chimäre VEGF-Rezeptorprotein an VEGF bindet und dessen Aktivität substanziell hemmt. Im Allgemeinen ist das Ergebnis dieser Hemmwirkung eine Abnahme der Vaskularisation und/oder Angiogenese, die infolge des VEGF-Proteins eintritt.
„Unerwünschte Vaskularisierung" bezieht sich hierin auf die Endothelproliferation und/oder -Angiogenese, die mit einer unerwünschten Krankheit oder Störung assoziiert ist und die – sofern sie reduziert oder eliminiert ist – zu einer Reduktion oder Eliminierung der unerwünschten Eigenschaften der Krankheit oder Störung führen würde. Beispielsweise ist die Vaskularisation und/oder Angiogenese, die mit Tumorbildung und -metastase sowie zahlreichen Retinopathien assoziiert ist, unerwünscht.
„Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle – ungeachtet dessen, ob Kodierungssequenzen exprimiert werden. Es sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, z.B. CaPO₄ und Elektroporation. Erfolgreiche Transfektion erkennt man im Allgemeinen daran, wenn Hinweise auf die Aktivität bzw. Funktion dieses Vektors in der Wirtszelle zu finden sind.
„Transformation" ist hierin die Einführung von DNA in einen Organismus, so dass die DNA replizierbar ist – entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. Je nach der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Anwendung von für solche Zellen geeigneten Standardtechniken. Calciumbehandlung mit Calciumchlorid – siehe Cohen, S. N. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972) und Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 154 (1970) – wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die substanzielle Zellwandschranken enthalten. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände ist das Calciumphosphat-Fällungsverfahren von Graham, F. und van der Eb, A., Virology 52, 456–457 (1978) vor zuziehen. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystem-Transformationen wurden von Axel in US-Patent 4.399.216 vom 16. August 1983 beschrieben. Transformationen in Hefe erfolgen typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen, P. et al., J. Bact. 130, 946 (1977) und Hsiao, C. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979). Allerdings kommen auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen in Frage, z.B. Kerninjektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion.
„Ortsgerichtete Mutagenese" ist eine Standardtechnik auf dem Gebiet der Erfindung und erfolgt unter Einsatz eines synthetischen Oligonucleotidprimers, der gegenüber einer zu mutagenisierenden Einzelstrang-Phagen-DNA komplementär ist – mit Ausnahme begrenzter Fehlübereinstimmung, die die erwünschte Mutation darstellt. Zusammenfassend gesagt wird das synthetische Oligonucleotid als Primer verwendet, um die Synthese eines Strangs zu lenken, der zum Phagen komplementär ist, und die resultierende doppelsträngige DNA in ein Phagen-unterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Top-Agar ausplattiert, was die Plaquebildung aus einzelnen Phagen-enthaltenden Zellen ermöglicht. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques den Phagen mit der mutierten Form als Einzelstrang; 50% besitzen die Originalsequenz. Die Plaques werden mit Kinase-behandeltem synthetischem Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die Hybridisierung einer exakten Übereinstimmung ermöglicht, bei der aber die Fehlübereinstimmungen mit dem ursprünglichen Strand ausreichen, um Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann ausgewählt und kultiviert und die DNA dann gewonnen.
„Operabel verbunden" bezieht sich auf eine Verknüpfung, die die Durchführung der normalen Funktion der Komponenten ermöglicht. Somit bedeutet eine Kodierungssequenz, die mit Steuersequenzen „operabel verbunden" ist, dass es sich um eine Konfiguration handelt, in der die Kodierungssequenz unter der Steuerung dieser Sequenzen exprimiert werden kann und in der die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend und – im Fall eines Sekretionsleaders – zusammenhängend und in einer Lesephase angeordnet sind. Beispielsweise ist DNA für eine Vorsequenz oder einen Sekretionsleader operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn es als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer bzw. Verstärker ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn die Transkription der Sequenz dadurch beeinflusst wird; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation vereinfacht wird. Die Verbindung erfolgt durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen. Wenn es keine derartige Stellen gibt, werden synthetische Oligonucleotid-Adaptoren oder -Linker in Einklang mit auf dem Gebiet der Erfindung üblichen Verfahren verwendet.
„Steuersequenzen" beziehen sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel verbundenen Kodierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Steuersequenzen, die sich z.B. für Prokaryoten eignen, enthalten einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomen-Bindungsstelle und möglicherweise andere, bislang wenig erforschte Sequenzen. Es ist bekannt, dass eukaryotische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Verstärker verwenden.
„Expressionssystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine erwünschte Kodierungssequenz und Steuersequenzen in operabler Verbindung enthalten, so dass mit diesen Sequenzen transformierte Wirte die kodierten Proteine produzieren können. Zur Durchführung der Transformation kann das Expressionssystem auf einem Vektor enthalten sein; die relevante DNA kann dann aber auch in das Wirtschromosom integriert sein.
Die hierin verwendeten Ausdrücke „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" werden austauschbar gebraucht und umfassen allesamt auch die Nachkommenschaft. Somit umfasst der Ausdruck „Transformanten" oder „transformierte Zellen" die jeweils daraus stammenden primären Zellen und Kulturen – ungeachtet der Anzahl an Transfers. Es ist ferner zu beachten, dass die gesamte Nachkommenschaft bezüglich des DNA-Gehalts möglicherweise nicht identisch ist, was auf zufällige oder beabsichtigte Mutationen zurückzuführen ist. Mutierte Nachkommen, die die gleiche Funktionalität aufweisen wie jene, die sich durch Screening in der ursprünglich transformierten Zelle ermittelt wurde, sind ebenfalls inkludiert. Wenn präzise Bezeichnungen beabsichtigt sind, ergeben sich diese aus dem Kontext.
„Plasmide" sind durch ein klein geschriebenes p gekennzeichnet, vor und/oder nach dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen. Die hierin verwendeten Ausgangsplasmide sind im Handel erhältlich und uneingeschränkt für die Öffentlichkeit zugänglich, oder sie können aus solchen verfügbaren Plasmiden gemäß publizierter Verfahren konstruiert werden. Außerdem sind andere äquivalente Plasmide auf dem Gebiet bekannt und für Fachleute offenkundig.
„Verdau" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Positionen in der DNA wirkt. Solche Enzyme werden als Restriktionsenzyme und die Stellen, für die jedes davon spezifisch ist, als Restriktionsstellen bezeichnet. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und es werden die Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Anforderungen der Enzym-Lieferanten eingehalten. Restriktionsenzyme werden üblicherweise durch Abkürzungen bezeichnet, die aus einem Großbuchstaben und danach aus anderen Buchstaben, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich erhalten wurde, sowie aus einer das jeweilige Enzym kennzeichnenden Zahl bestehen. Im Allgemeinen wird etwa 1 mg Plasmid- oder DNA-Fragment mit etwa 1–2 Enzymeinheiten in etwa 20 ml Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für konkrete Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Es erfolgt üblicherweise einstündige Inkubation bei 37°C, doch dies kann je nach Anweisungen des Lieferanten variieren. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die gespaltene Nucleinsäure mittels Fällung mit Ethanol aus der wässrigen Fraktion gewonnen. An den Verdau mit einem Restriktionsenzym schließt sich gelegentlich Hydrolyse der endständigen 5'-Phosphate mit bakterieller alkalischer Phosphatase an, um die „Zirkularisierung" bzw. Bildung einer geschlossenen Schleife der zwei restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments zu verhindern, da dies die Insertion eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle verhindern würde. Sofern nicht anders angegeben, schließt sich an den Verdau von Plasmiden keine endständige 5'-Dephosphorylierung an. Verfahren und Reagenzien für die Dephosphorylierung sind herkömmlich (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), S. 133–134).
„Gewinnung" oder „Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsverdau bedeutet die Trennung des Verdaus auf Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, Identifikation des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität gegenüber jener von Marker-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, Entfernung des das erwünschte Fragment enthaltenden Gelabschnitts und Trennung des Gels von DNA. Dieses Verfahren ist auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Siehe z.B. R. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103–6114 (1981) und D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).
„Ligation" bezieht sich auf das Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al. 1982, siehe oben, S. 146). Sofern nicht anders angegeben, kann die Ligation mit bekannten Puffern und unter bekannten Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 mg etwa äquimolekularer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
„Präparation" von DNA aus Transformanten bedeutet hierin die Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikrobenkultur. Sofern nicht anders angegeben, kann das Alkali/SDS-Verfahren von Maniatis et al. 1982, siehe oben, S. 90, zur Anwendung kommen.
„Oligonucleotide" sind kurze, einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide, die durch bekannte Verfahren chemisch synthetisiert werden (z.B. mittels Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramiditchemie unter Anwendung von Festphasentechniken, wie sie etwa in der EP-A-266.032 vom 4. Mai 1988 beschrieben sind, oder mittels Desoxynucleosid-H-Phosphat-Zwischenprodukten, wie sie von Froehler et al., Nucl. Acids. Res. 14, 5399–5407 (1986), beschrieben sind). Sie werden anschließend auf Polyacrylamidgelen gereinigt.
B. ALLGEMEINE METHODOLOGIE
1. Aminosäuresequenz-Varianten
Es ist zu beachten, dass zahlreiche Aminosäuresubstitutionen in der Ig-ähnlichen Domäne bzw. den Ig-ähnlichen Domänen der chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung möglich sind, ohne vom Schutzumfang der Erfindung in Bezug auf die Fähigkeit der chimären Proteine, sich an VEGF zu binden und dessen Aktivität zu hemmen, abzuweichen. Somit können Punktmutationen und andere umfangreichere Variationen in der bzw. den Ig-ählichen Domäne(n) der chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung erfolgen, um interessante Eigenschaften zu verleihen, die die Fähigkeit der chimären Proteine, VEGF zu binden bzw. dessen Aktivität zu hemmen, nicht substanziell beeinflussen. Diese Varianten können durch Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren gebildet werden.
a. Kovalente Modifikationen
Kovalente Modifikationen können mit verschiedenen Aminosäureresten der Ig-ähnlichen Domäne(n) im chimären VEGF-Rezeptorprotein durchgeführt werden, wodurch dieser bzw. diesen Ig-ähnlichen Domäne(n) neuartige Eigenschaften verliehen werden, ohne dass dabei die Fähigkeit verloren geht, sich an VEGF zu binden und diesen zu inaktivieren.
Beispielsweise werden Cysteinylreste am häufigsten mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen) wie etwa Chloressigsäure oder Chloracetamid umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol zu derivatisieren.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5–7,0 derivatisiert, da dieses Mittel für die Histidylseitenkette relativ spezifisch ist. p-Bromphenacylbromid kommt ebenfalls in Frage; die Reaktion erfolgt vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0.
Lysinyl und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Mittel führt zu einer Umkehr der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Mittel für die Derivatisierung von α-Amino enthaltenden Resten sind Imidoester, wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren konventionellen Reagenzien modifziert, z.B. mit Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Reaktion aufgrund des hohen pK₈ der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen stattfindet. Außerdem können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie der Arginin-ε-Aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten an sich wurde umfassend untersucht, wobei man sich besonders der Einführung spezifischer Marker in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan widmete. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²⁵I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung im Radioimmuntest zu bilden, wobei das oben beschriebene Chloramin-T-Verfahren dafür geeignet ist.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R') wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid selektiv modifiziert. Außer dem werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt.
Die Derivatisierung mit bifunktionalen Mitteln dient zur Vernetzung des chimären VEGF-Rezeptorproteins mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zum Reinigen des VEGF-Proteins aus komplexen Gemischen. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel sind z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester wie etwa Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester wie etwa Disuccinimidylester, z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimdylproprionat), sowie bifunktionale Maleimide wie z.B. Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie etwa Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die zur Bildung von Vernetzungen in der Gegenwart von Licht fähig sind. Alternativ dazu werden wasserunlösliche Matrizen wie z.B. Cyanogenbromid-aktivierte Kohlehydrae und die reaktiven Substrate, die in US-Patenten 3.969.287, 4.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537 und 4.330.440 beschrieben sind, für die Proteinimmobilisierung verwendet.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter leicht sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste sind im Schutzbereich der Erfindung enthalten.
Andere Modifikationen sind die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 [1983]), die Acetylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppe.
b. DNA-Mutationen
Aminosäuresequenzvarianten der in den chimären VEGF-Rezeptorproteinen der Erfindung vorhandenen Ig-ähnlichen Domäne(n) können ebenfalls gebildet werden, indem Mutationen in der für das chimäre Protein kodierenden DNA geschaffen werden. Solche Varianten sind z.B. Deletionen aus oder Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Aminosäuresequenz der Ig-ähnlichen Domäne(n). Jede beliebige Kombination von Deletionen, Insertionen und Substitutionen ist denkbar, um zum Endkonstrukt zu gelangen, sofern dieses die erwünschte Aktivität aufweist. Natürlich dürfen Mutationen, die in der für die Variante kodierenden DNA stattfinden, die Sequenz nicht aus dem Leserahmen entfernen und erzeugen vorzugsweise auch keine komplementären Regionen, die eine sekundäre mRNA-Struktur bilden könnten (siehe EP 75.444A ).
Auf der genetischen Ebene werden Varianten der in den chimären VEGF-Rezeptorproteinen der Erfindung vorhandenen Ig-ähnlichen Domäne(n) üblicherweise durch ortsgerichtete Mutagenese von Nucleotiden in der DNA hergestellt, die für die Ig-ähnliche(n) Domäne(n) kodiert, wodurch für die Variante kodierende DNA produziert wird; anschließend wird die DNA in rekombinanter Zellkultur exprimiert. Die Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative Fähigkeit zur Bindung an den VEGF-Liganden auf wie das unmodifizierte chimäre Protein.
Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenz-Variation in der bzw. den Ig-ähnlichen Domäne(n) des chimären VEGF-Rezeptorproteins vorbestimmt ist, muss die Mutation an sich nicht vorbestimmt sein. Beispielsweise kann zur Optimierung der Leistungsfähigkeit einer Mutation an einer bestimmten Stelle Zufallsmutagenese im Zielcodon oder in der Zielregion stattfinden, und es können die exprimierten chimären Proteinvarianten auf die optimale Kombination erwünschter Eigenschaften gescreent werden, z.B. auf die Fähigkeit, sich spezifisch an den VEGF-Liganden zu binden, auf in-vivo-Halbwertszeit u.dgl. Techniken zur Erzeugung von Substitutions mutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA mit bekannter Sequenz sind allgemeiner Wissensstand, z.B. die ortsspezifische Mutagenese.
Die Bildung von Varianten in der bzw. den Ig-ähnlichen Domäne(n) des erfindungsgemäßen chimären VEGF-Rezeptorproteins erfolgt vorzugsweise durch ortsspezifische Mutagenese von DNA, die für ein zuvor hergestelltes chimäres Protein kodiert. Die ortsspezifische Mutagense erlaubt die Produktion von Ig-ähnlichen Domänenvarianten durch Verwendung spezifischer Oligonucleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der erwünschten Mutation kodieren, sowie einer ausreichenden Anzahl benachbarter Nucleotide, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen und dadurch eine stabile Duplex auf beiden Seiten der gerade überquerten Deletionsverbindungsstelle zu schaffen. Typischerweise ist ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nucleotiden vorzuziehen, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindungsstelle der Sequenz modifiziert werden. Im Allgemeinen ist das Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, wie man dies anhand von Publikationen wie z.B. von Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), erkennt.
Es ist zu beachten, dass die Technik der ortsspezifischen Mutagenese typischerweise einen Phagenvektor verwendet, der sowohl in einzel- als auch in doppelsträngiger Form vorliegt. Typische für die ortsgerichtete Mutagenese geeignete Vektoren sind M13-Phagen; siehe Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1981). Diese Phagen sind im Handel erhältlich, und ihre Verwendung ist Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung hinlänglich bekannt. Alternativ dazu kann man auf Plasmidvektoren zurückgreifen, die einen einzelsträngigen Page-Replikationsursprung enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 [1987]), um einzelsträngige DNA zu erhalten.
Im Allgemeinen findet die ortsgerichtete Mutagenese hierin statt, indem zunächst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird, der in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die für das relevante VEGF-Rezeptorprotein kodiert. Es wird ein die erwünschte mutierte Sequenz tragender Oligonucleotidprimer gebildet, wobei dies im Allgemei nen synthetisch erfolgt, z.B. mittels des Verfahrens von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978). Dieser Primer wird dann mit dem die einzelsträngige chimäre Proteinsequenz enthaltenden Vektor anneliert und DNA-polymerisierenden Enzymen wie z.B. E. coli-Polymerase-I-Klenow-Fragment ausgesetzt, um die Synthese des die Mutation tragenden Strangs abzuschließen. Somit bildet sich ein Heteroduplex, in dem ein Strang für die ursprüngliche nicht-mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die erwünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplexvektor dient dann dazu, geeignete Zellen wie z.B. JM101-Zellen zu transformieren, und es werden Klone ausgewählt, die rekombinante Vektoren enthalten, die die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Nach der Auswahl eines solchen Klons kann die für die chimäre VEGF-Rezeptorproteinvariante kodierende mutierte DNA entfernt und in einen geeigneten Vektor für die Proteinproduktion eingesetzt werden – im Allgemeinen handelt es sich hierbei um einen Expressionsvektor jener Art, die man für die Transformation eines zweckmäßigen Wirts verwenden kann.
c. Mutationstypen
Aminosäuresequenz-Deletionen reichen im Allgemeinen von etwa 1 bis 15 Resten, noch bevorzugter von 1 bis 7 Resten, und sind typischerweise zusammenhängend.
Aminosäuresequenz-Insertionen enthalten Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen von einem Rest bis zu Polypeptiden im Wesentlichen unbeschränkter Länge sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Intrasequenzinsertionen (d.h. Insertionen innerhalb der Ig-ähnlichen Domänsequenzen) können im Allgemeinen etwa 1 bis 10 Reste, noch bevorzugter 1 bis 5 Reste, umfassen. Ein Beispiel für eine terminate Insertion enthält eine Fusion einer Signalsequenz (heterolog oder homolog zur Wirtszelle) mit dem N-Terminus des chimären VEGF-Rezeptorproteins, um die Sekretion des chimären Proteins aus rekombinanten Wirten zu vereinfachen.

Die dritte Gruppe von Mutationen, die man in der bzw. den Ig-ähnlichen Domäne(n) im chimären VEGF-Rezeptorprotein vorsehen kann, besteht aus jenen, in denen zumindest ein – und vorzugsweise nur ein – Aminosäurerest in der bzw. den Ig-ähnlichen Domäne(n) entfernt und ein anderer Rest an seiner Stelle insertiert wurde. Solche Substitutionen erfolgen vorzugsweise in Einklang mit nachstehender Tabelle 1, wenn es erwünscht ist, die Eigenschaften der Ig-ähnlichen Domäne(n) geringfügig zu modulieren. Tabelle 1

Ursprünglicher Rest	Beispiele für Substitutionen
Ala (A)	gly; ser
Arg (R)	lys
Asn (N)	gln; his
Asp (D)	glu
Cys (C)	ser
Gln (Q)	asn
Glu (E)	asp
Gly (G)	ala; pro
His (H)	asn; gln
Ile (I)	leu; val
Leu (L)	ile; val
Lys (K)	arg; gln; glu
Met (M)	leu; tyr; ile
Phe (F)	met; leu; tyr
Ser (S)	thr
Thr (T)	ser
Trp (W)	tyr
Tyr (Y)	trp; Phe
Val (V)	ile; leu

Substanzielle Veränderungen der Funktion oder immunologischen Identität werden durch die Wahl von Substitutionen erreicht, die weniger konservativ sind als jene aus Tabelle 1, d.h. durch Auswahl von Resten, die sich hinsichtlich ihres Einflusses auf die folgenden Faktoren signifikanter voneinander unterscheiden: (a) Beibehaltung der Struktur des Polypeptidrückgrats im Bereich der Substitution, z.B. als Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) Beibehaltung der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) Beibehaltung des Großteils der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die größten Veränderungen der Eigenschaften der Ig-ähnlichen Domänen bewirken, sind jene, in denen (a) Glycin und/oder Prolin (P) durch eine andere Aminosäure substituiert bzw. deletiert oder insertiert ist/sind; (b) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert ist; (c) ein Cysteinrest für (oder durch) einen beliebigen anderen Rest substituiert ist; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen Rest mit elektronegativer Ladung, z.B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert ist; (e) ein Rest mit elektronegativer Seitenkette für (oder durch) einen Rest mit elektropositiver Ladung substituiert ist; oder (f) ein Rest mit umfangreicher Seitenkette, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) einen ohne derartige Seitenkette, z.B. Glycin, substituiert ist.
Man kann nicht davon ausgehen, dass die meisten Deletionen und Insertionen – und insbesondere Substitutionen – radikale Veränderungen der Eigenschaften der Ig-ähnlichen Domäne(n) des chimären VEGF-Rezeptorproteins bewirken. Wenn es allerdings schwierig ist, die genaue Auswirkung der Substitution, Deletion oder Insertion im Vorhinein zu eruieren, kann dies durch routinemäßige Screeningtests erfolgen, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Beispielsweise wird eine Ig-ähnliche Domänvariante typischerweise durch ortsspezifische Mutagenese der für das intakte chimäre VEGF-Rezeptorprotein kodierenden Nucleinsäure, Expression der Nucleinsäurevariante in rekombinanter Zellkultur, Reinigung der chimären VEGF-Rezeptorproteinvariante aus der Zellkultur und Detektieren der Fähigkeit der chimären VEGF-Rezeptorproteinvariante, sich spezifisch an einen VEGF-Liganden zu binden, hergestellt. Bindungstests, die man routine mäßig durchführen kann, um zu ermitteln, ob eine bzw. mehrere Modifikation(en) in einer bzw. mehreren Domäne(n) die Fähigkeit des chimären VEGF-Rezeptorproteins beeinflusst bzw. beeinflussen, sich an VEGF zu binden und dessen Aktivität zu hemmen, sind in den nachfolgenden Beispielen und auch im Artikel von Park et al., J. Biol. Chem. 269, 25646–25654 (1994), beschrieben.
Somit kann die Aktivität einer chimären VEGF-Rezeptorproteinvariante in einem geeigneten Screeningtest auf die erwünschten Eigenschaften gescreent werden. Beispielsweise kann eine Veränderung der Fähigkeit, sich spezifisch an einen VEGF-Liganden zu binden, durch einen kompetitiven VEGF-Bindungstest gemessen werden. Modifikationen solcher Proteineigenschaften wie z.B. Redox- oder Thermostabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit für proteolytischen Abbau oder Neigung zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren werden durch Verfahren untersucht, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind.
2. Rekombinante Expression
Die chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung werden durch jede beliebige Technik hergestellt, z.B. mittels allgemein bekannter Rekombinationsverfahren. Der Ausdruck „isolierte DNA" bezieht sich hierin auf chemisch synthetisierte DNA, cDNA, chromosomale oder extrachromosomale DNA mit oder ohne die 3'- und/oder 5'-Flankierungsregionen. Vorzugsweise wird das erwünschte chimäre VEGF-Rezeptorprotein der Erfindung durch Synthese in rekombinanter Zellkultur gebildet.
Für eine derartige Synthese ist es zunächst notwendig, Nucleinsäure zu gewinnen, die für ein chimäres VEGF-Rezeptorprotein der Erfindung kodiert. Für einen flt-1- oder KDR-Rezeptor kodierende DNA kann aus vaskulären Endothelzellen folgendermaßen erhalten werden: (a) Bilden einer cDNA-Bibliothek aus diesen Zellen; (b) Durchführen einer Hybridisierungsanalyse mit markierter DNA, die für den flt-1- oder KDR-Rezeptor oder Fragmente davon (mit einer Länge von bis zu oder mehr als 100 Basenpaaren) kodiert, um Klone in der Bibliothek zu detektieren, die homologe Sequenzen enthalten; und (c) Analysieren der Konge durch Restriktionsenzymanalyse und Nucleinsäuresequenzieren, um Klone voller Länge zu identifizieren. Wenn keine Klone voller Länge in einer cDNA-Bibliothek vorhanden sind, können geeignete Fragmente aus den verschiedenen Klonen gewonnen werden, indem die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz-Information verwendet wird, die für die flt-1- und KDR-Rezeptoren bekannt und an den Klonen gemeinsamen Restriktionsstellen ligiert ist, um ein für die flt-1- oder KDR-Domäne kodierendes Klon voller Länge zusammenzusetzen. Alternativ dazu können genomische Bibliotheken die erwünschte DNA liefern.
Sobald diese DNA identifiziert und aus der Bibliothek isoliert wurde, kann sie in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden, der mit zweckmäßigen Steuersequenzen verbunden ist. Sobald sie in einen geeigneten Vektor kloniert ist, kann die DNA – wie oben beschrieben – in unterschiedlicher Weise verändert werden, um funktionell äquivalente Varianten zu bilden. Außerdem kann DNA, die für verschiedene Domänen kodiert, z.B. die intrazelluläre, Transmembran- und/oder verschiedene Ig-ähnliche Domänen, deletiert und/oder durch DNA ersetzt werden, die für entsprechende Domänen aus anderen Rezeptoren kodiert. DNA, die für nicht verwandte Aminosäuresequenzen kodiert, z.B. den F_c-Abschnitt eines Immunglobulinmoleküls, kann auch mit DNA fusioniert sein, die für einen Teil oder die Gesamtheit des VEGF-Rezeptors kodiert, wodurch ein chimäres VEGF-Rezeptormolekül entsteht.
In einem Beispiel für ein rekombinantes Expressionssystem wird eine chimäres VEGF-Rezeptorprotein enthaltende Ig-ähnliche Domäne in Säugetierzellen durch Transformation mit einem Expressionsvektor exprimiert, der für das chimäre VEGF-Rezeptorprotein kodierende DNA umfasst. Es ist vorzuziehen, Wirtszellen zu transformieren, die zu einer solchen Verarbeitung fähig sind, um das chimäre Protein im Kulturmedium oder Periplasma der Wirtszelle zu erhalten, d.h. ein sekretiertes Molekül zu gewinnen.
a. Nützliche Wirtszellen und Vektoren
Die hierin geoffenbarten Vektoren und Verfahren eignen sich zur Verwendung in Wirtszellen in einer Vielzahl prokaryotischer und eukaryotischer Organismen.
Im Allgemeinen sind natürlich Prokaryoten für die anfängliche Klonierung von DNA-Sequenzen und die Konstruktion der hierin geeigneten Vektoren vorzuziehen. Beispielsweise ist E. coli K12-Stamm MM 294 (ATCC Nr. 31.446) besonders nützlich. Andere in Frage kommende Mikrobenstämme sind E. coli-Stämme wie z.B. E. coli B und E. coli X1776 (ATCC Nr. 31.537). Diese Beispiele sind natürlich lediglich veranschaulichend und nicht einschränkend.
Prokaryoten sind ebenfalls für die Expression geeignet. Die oben erwähnten Stämme sowie E. coli-Stämme W3110 (F-, Lambda-, prototroph, ATCC Nr. 27.325), K5772 (ATCC Nr. 53.635) und SR101, Bazillen wie z.B. Bacillus subtilis und andere Enterobakterien wie z.B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans sowie diverse Pseudomonasspezies kommen auch in Frage.
Im Allgemeinen werden in Zusammenhang mit diesen Wirten Plasmidvektoren verwendet, die Replicon- und Steuersequenzen enthalten, die aus Spezies stammen, die mit der Wirtszelle verträglich sind. Der Vektor trägt üblicherweise eine Repliconstelle sowie Markierungssequenzen, die für phenotypische Selektion in transformierten Zellen sorgen können. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322, einem Plasmid aus einer E. coli-Spezies, transformiert (siehe z.B. Bolivar et al., Gene 2, 95 [1977]). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit ein praktikables Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen bereit. Das pBR322-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide oder Phagen, müssen auch Promotoren enthalten (oder modifiziert sein, sie zu enthalten), die vom mikrobiellen Organismus zur Expression seiner eigenen Proteine genutzt werden können.
Promotoren, die bei der DNA-Rekombinationskonstruktion am häufigsten verwendet werden, sind die β-Lactamase- (Penicillinase-) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 375, 615 [1978]; Itakura et al., Science 198, 1056 [1977]; Goeddel et al., Nature 281, 544 [1977]) und ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 [1980]; EP-A-036.776). Während dies die am häufigsten verwendeten Beispiele sind, wurden auch andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet und Details über ihre Nucleotidsequenzen veröffentlicht, so dass Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sie funktionell mit Plasmidvektoren ligieren können (siehe z.B. Siebenlist et al., Cell 20, 269 [1980]).
Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben wie z.B. Hefekulturen verwendet werden. Saccaromyces cerevisiae bzw. Backhefe ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl auch einige andere Stämme auf dem Markt erhältlich sind. Für die Expression in Saccharomyces verwendet man üblicherweise z.B. das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7, 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10, 157 [1980]). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für eine Stammmutante von Hefe ohne die Fähigkeit des Wachstums in Tryptophan aufweist, z.B. ATCC Nr. 44.076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 [1977]). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Eigenschaft des Hefe-Wirtszellengenoms bietet dann eine wirkungsvolle Umgebung für das Detektieren von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 [1968]; Holland et al., Biochemistry 17, 4900 [1978]), z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Beim Konstruieren geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen auch in den Expressionsvektor 3' von der Sequenz ligiert, die exprimiert werden soll, um Polyadenylierung der mRNA und Termination zu bewirken. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription aufweisen, sind die Promotorregion für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, Säure-Phosphatase, mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziierte Abbauenzyme und die oben erwähnte Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwendung verantwortlich sind. Jeder Plasmidvektor kommt in Frage, der Hefe-verträglichen Promotor, Replikationsursprung und Terminationssequenzen enthält.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können als Wirte auch Kulturen von Zellen aus mehrzelligen Organismen verwendet werden. Im Prinzip kommt jede solche Zellkultur in Frage, ob sie nun aus Wirbeltier- oder einer Wirbellosenkultur stammt. Das Hauptinteresse gilt jedoch den Wirbeltierzellen, wobei die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) in den letzten Jahren zu einem Routineverfahrne wurde (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hg., [1973]). Beispiele für solche nützliche Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, chinesische Hamstereierstock-(CHO-)Zelllinien sowie W138-, BHK-, COS-7-, 293- und MDCK-Zelllinien. Expressionsvektoren für derartige Zellen enthalten üblicherweise (falls erforderlich) einen Replikationsursprung, einen Promotor vor dem zu exprimierenden Gen sowie allfällige notwendige Ribosomen-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminatorsequenzen.
Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Steuerfunktionen auf den Expressionsvektoren oft von viralem Material bereitgestellt. Beispielsweise stammen die am häufigsten verwendeten Promotoren aus Polyoma, Adenovirus 2 und vor allem aus Affenvirus 40 (SV40). Die frühen und späten Promotoren von SV40-Virus sind besonders zweckmäßig, da beide leicht aus dem Virus als Fragment gewonnen werden, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273, 113 [1978]). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, sofern die etwa 250 bp große Sequenz vorhanden ist, die sich von der HindIII-Stelle bis hin zur BglI-Stelle im viralen Replikationsursprung erstreckt. Außerdem ist es möglich und oft wünschenswert, Promotor- oder Steuersequenzen zu ver wenden, die normalerweise mit der erwünschten Gensequenz assoziiert sind, sofern solche Steuersequenzen mit den Wirtszellsystemen verträglich sind.
Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors solcherart, dass ein exogener Ursprung enthalten ist, z.B. aus SV40 oder einer anderen viralen Quelle wie etwa Polyoma, Adeno, VSV oder BPV, oder durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt sein. Wenn der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert ist, reicht Letzteres oft aus.
Zufrieden stellende Proteinmengen werden durch Zellkulturen produziert; Weiterentwicklungen unter Verwendung einer sekundären Kodierungssequenz dienen jedoch dazu, die hergestellten Mengen noch zu vergrößern. Eine sekundäre Kodierungssequenz umfasst Dihydrofolat-Reductase (DHFR), die durch einen extern gesteuerten Parameter wie z.B. Methotrexat (MTX) beeinflusst wird, wodurch die Expressionssteuerung durch Steuerung der Methotrexat-Konzentration ermöglicht wird.
Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszelle für die Transfektion mit den Vektoren der Erfindung, die sowohl für chimäres Protein als auch für DHFR-Protein kodierende DNA-Sequenzen umfassen, ist es zweckmäßig, den Wirt je nach Art des verwendeten DHFR-Proteins auszuwählen. Wenn Wildtyp-DHFR-Protein verwendet wird, ist es vorzuziehen, eine Wirtszelle mit DHFR-Defizienz auszuwählen, wodurch die Verwendung der DHFR-Kodierungssequenz als Marker für die erfolgreiche Transfektion in selektivem Medium ermöglicht wird, das kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin aufweist. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die CHO-Zelllinie ohne DHFR-Aktivität, die gemäß dem Verfahren von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4216 (1980) hergestellt und vermehrt wurde.
Wenn hingegen DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaffinität für MTX als Steuersequenz verwendet wird, ist es nicht notwendig, DHFR-defiziente Zellen zu verwenden. Da die DHFR-Mutante gegenüber MTX resistent ist, können MTX enthaltende Medien als Selektionsmittel verwendet werden, sofern die Wirtszellen selbst MTX-sensitiv sind. Die meisten eukaryotischen Zellen, die zur Absorption von MTX fähig sind, scheinen MTX-sensitiv zu sein. Eine derartige zweckmäßige Zelllinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 (ATCC Nr. CCL 61).
b. Typische zweckmäßige Methodologie
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die die erwünschten Kodierungs- und Steuersequenzen enthalten, sieht die Anwendung herkömmlicher Ligationstechniken vor. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und religiert – dies erfolgt in der zur Herstellung der Plasmide jeweils erforderlichen Form.
Wenn man stumpfe Enden benötigt, kann das Präparat 15 Minuten bei 15°C mit 10 Einheiten Polymerase I (Klenow) behandelt, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt werden.
Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente kann unter Verwendung von 6%igem Polyacrylamidgel durchgeführt werden, wie dies von Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8,4057 (1980) beschrieben wurde.
Damit die Analyse die korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden bestätigt, dienen die Ligationsgemische typischerweise dazu, E. coli K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31.446) oder andere geeignete E. coli-Stämme zu transformieren; falls dies angezeigt ist, werden erfolgreiche Transformanten durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt. Plasmide aus den Transformanten werden durch Restriktionskartierung und/oder DNA-Sequenzieren gemäß dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981) oder gemäß dem Verfahren von Maxam et al., Methods of Enzymology 65, 499 (1980) produziert und analysiert.
Nach der Einführung der DNA in den Säugetierzellwirt und der Auswahl in Medium hinsichtlich stabiler Transfektanten erfolgt die Amplifikation von für DHFR-Protein kodierenden Sequenzen, indem Wirtszellkulturen in Gegenwart von etwa 20.000– 500.000 nM Konzentrationen MTX, einem kompetitiven Inhibitor der DHFR-Aktivität, gezüchtet werden. Der wirksame Konzentrationsbereich hängt natürlich sehr von der Art des DHFR-Gens und den Wirteigenschaften ab. Klarerweise können allgemein definierte Unter- und Obergrenzen nicht festgelegt werden. Geeignete Konzentrationen anderer Folsäureanaloge oder anderer DHFR-hemmender Verbindungen kommen ebenfalls in Frage. MTX selbst ist jedoch praktisch, leicht erhältlich und wirkungsvoll.
Andere zweckmäßige Techniken werden in den Beispielen erläutert.
c. VEGF-Rezeptor-Immunglobulinchimären (Immunadhäsine)
Immunglobuline und bestimmte Varianten davon sind bekannt und wurden möglicherweise schon in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Siehe z.B. US-Patent 4.745.055; EP 256.654 ; Faulkner et al., Nature 298, 286 (1982); EP 120.694 ; EP 125.023 ; Morrison, J. Immunol. 123, 793 (1979); Kohler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41, 2073 (1981); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 2, 239 (1984); Morrison, Science 229, 1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81, 6851; EP 255.694 ; EP 266.663 ; und WO 88/03559. Es sind auch neu zusammengesetzte Immunglobulinketten bekannt. Siehe z.B. US-Patent 4.444.878; WO 88/03565; und EP 68.763 sowie die dort angegebenen Literaturhinweise.
Chimären aus einer Proteinrezeptorsequenz, die mit einer geeigneten Immunglobulin-Konstantdomänensequenz (Immunadhäsinen) verbunden ist, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die in der Literatur beschriebenen Immunadhäsine sind z.B. Fusionen des T-Zellenrezeptors (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. [USA] 84, 2936–2940 [1987]), CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 [1989]), L-Selectin (Homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 [1990]), CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 [1990]), CD28 und B7 (Linseley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 [1991]), CTLA-4 (Linsley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 [1991]), CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 [1991]), TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. .Acad. Sci. [USA] 88, 10535–10539 [1991]) und IgE-Rezeptor-α (Ridgway et al., J. Cell. Biol. 115, abstr. 1448 [1991]).
Die einfachste Immunadhäsin-Konstruktion kombinierte die Bindungsregion(en) eines „Adhäsin"-Proteins mit den Fc-Regionen einer Immunglobulin-Schwerkette. Üblicherweise werden bei der Herstellung der erfindungsgemäßen chimären VEGF-Rezeptoren mit Immunglobulinsequenzen Nucleinsäuren, die für die Ig-ähnlichen Domänen des bzw. der VEGF-Rezeptors bzw. VEGF-Rezeptoren kodieren, C-terminal mit der Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz kodiert, doch es sind auch N-terminale Fusionen möglich.
Typischerweise behält in derartigen Fusionen das kodierte chimäre Polypeptid zumindest funktionell aktive Hinge-Region, CH2- und CH3-Domänen der Konstantregion einer Immunglobulin-Schwerkette bei. Fusionen erfolgen auch mit dem C-Terminus des Fc-Porions einer Konstantdomäne oder unmittelbar N-terminal mit CH1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette.
Die genauer Stelle der Fusion ist nicht entscheidend; es sind bestimmte Stellen allgemein bekannt und können ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindungseigenschaften der VEGF-Rezeptor/Immunglobulin-Chimäre zu optimieren.
In einigen Ausführungsformen können die VEGF-Rezeptor/Ig-Chimären der Erfindung als Monomere, Hetero- oder Homomultimere und vor allem als Dimere und Trimere zusammengesetzt sein, wie dies im Wesentlichen in WO 91/08298 veranschaulicht ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die VEGF-Rezeptor-Ig-ähnlichen Domänen von Interesse mit dem N-Terminus der Fc-Domäne von Immunglobulin G₁ (IgG1) fusioniert. Es ist möglich, die gesamte Schwerketten-Konstantregion mit den VEGF-Rezeptor-Ig-ähnlichen Domänen von Interesse zu fusionieren. Doch bevor zugter verwendet man in einer Fusion eine Sequenz, die in der Hinge-Region knapp stromauf von der Papain-Spaltungsstelle beginnt, die Fc chemisch definiert, oder analoge Stellen anderer Immunglobuline. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Ig-ähnlichen Domänen des VEGF-Rezeptors von Interesse mit (a) der Hinge-Region sowie CH2- und CH3-Domänen oder mit (b) CH1-, der Hinge-Region, CH2- und CH3-Domänen einer IgG-1-, IgG-2- oder IgG-3-Schwerkette fusioniert. Die genaue Fusionsstelle ist wiederum nicht entscheidend, wobei die optimale Stelle durch Routineversuche ermittelt werden kann.
In einigen Ausführungsformen sind die Ig-ähnlichen VEGF-Rezeptor/Immunglobulin-Chimären der Erfindung als Multimere, vor allem als Homodimere oder Homotetramere, zusammengesetzt. Im allgemeinen besitzen diese zusammengesetzten Immunglobuline bekannte Struktureinheiten. Eine vierkettige Grundstruktureinheit ist die Form, in der IgG, IgD und IgE existieren. Eine vierkettige Einheit wiederholt sich in den höhermolekularen Immunglobulinen; IgM besteht im Allgemeinen als Pentamer von vier Grundeinheiten, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin und gelegentlich IgG-Globulin können auch in Form von Multimeren in Serum vorliegen.
Ig-ähnliche Domäensequenzen aus den VEGF-Rezeptoren können auch zwischen Immunglobulin-Schwer- und Leichtkettensequenzen insertiert sein, so dass ein Immunglobulin erhalten wird, das eine chimäre Schwerkette umfasst. In dieser Ausführungsform sind die VEGF-Rezeptor-Ig-ähnlichen Sequenzen mit dem 3'-Ende einer Immunglobulin-Schwerkette in jedem Immunglobulin fusioniert – entweder zwischen der Hinge-Region und der CH2-Domäne oder zwischen der CH2- und der CH3-Domäne. Ähnliche Konstrukte wurden auch von Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991) beschrieben.
Obwohl die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in den Immunadhäsinen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine Immunglobulin-Leichtkette entweder mit einem Fusionspolypeptid aus VEGF-Rezeptor-Ig-ähnlichen Domänen und Immunglobulin-Schwerkette kovalent assoziiert oder direkt mit den VEGF-Re zeptor-Ig-ähnlichen Domänen fusioniert sein. Im ersteren Fall wird für eine Immunglobulin-Leichtkette kodierende DNA typischerweise mit dem chimären Protein aus VEGF-Rezeptor-Ig-ähnlichen Domänen und Immunglobulin-Schwerkette co-exprimiert. Nach der Sekretion ist das Hybrid aus Leicht- und Schwerkette kovalent assoziiert, um eine Immunglobulin-ähnliche Struktur zu bilden, die zwei über Disulfid verbundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Verfahren zur Herstellung solcher Strukturen sind z.B. in US-Patent 4.816.567 vom 28. März 1989 geoffenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Ig-Sequenzen, die bei der Konstruktion der Immunadhäsine der Erfindung zur Anwendung kommen, aus einer IgG-Immunglobulin-Schwerkettendomäne. Für Human-Immunadhäsine ist die Verwendung von Human-IgG1- und IgG3-Immunglobulinsequenzen vorzuziehen. Ein Hauptvorteil der Verwendung von IgG1 besteht darin, dass IgG1-Immunadhäsine wirkungsvoll auf immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Es sollten allerdings andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften in Betracht gezogen werden, wenn der Ig-Fusionspartner für eine bestimmte Immunadhäsinkonstruktion ausgewählt wird. Beispielsweise ist die IgG3-Hinge-Region länger und flexibler und kann daher größere „Adhäsin"-Domänen aufnehmen, die bei Fusion mit IgG1 möglicherweise nicht richtig gefaltet sind oder funktionieren. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist die Valenz; IgG-Immunadhäsine sind zweiwertige Homodimere, während Ig-Subtypen wie z.B. IgA und IgM zu dimeren bzw. pentameren Strukturen der Ig-Homodimer-Grundeinheit führen können. Für Chimären aus VEGF-Rezeptor-Ig-ähnlichen Domänen und Immunglobulin, die für in vivo-Anwendungen gedacht sind, sind auch die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen der Fc-Region von Bedeutung. Obwohl IgG1, IgG2 und IgG3 alle In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen aufweisen, unterscheidet sich ihre relative Wirksamkeit bei der Aktivierung des Komplementsystems. Außerdem besitzen verschiedene Immunglobuline eine variierende Anzahl an allotypischen Isotypen.
Die allgemeinen Verfahren zur Konstruktion und Expression von Immunadhäsinen sind die gleichen wie jene, die weiter oben in Zusammenhang mit nativen oder va riierten Ig-ähnlichen Domänen der verschiedenen VEGF-Rezeptoren erläutert wurden. Chimäre Immunadhäsine der Erfindung werden am besten konstruiert, indem die für die VEGF-Rezeptor-Ig-ähnliche(n) Domäne(n) von Interesse kodierende cDNA-Sequenz innerhalb des Rahmens mit einer Ig-cDNA-Sequenz fusioniert wird. Allerdings kommt auch eine Fusion mit genomischen Ig-Fragmenten in Frage, wie dies z.B. in Gascoigne, s.o., erklärt ist. Diese Art der Fusion erfordert die Gegenwart von regulatorischen Ig-Sequenzen für die Expression. Für IgG-Schwerketten-Konstantregionen kodierende cDNA können auf der Grundlage veröffentlichter Sequenzen von cDNA-Bibliotheken aus Milz- oder peripheren Blutlymphozyten mittels Hybridisierungs- oder Polymerase-Kettenreaktions-(PCR-)Techniken isoliert werden. Die cDNA, die für das „Adhäsin" aus der/den VEGF-Rezeptor-Ig-ähnlichen Domäne(n) kodieren, und die Ig-Teile der Chimäre werden tandemweise in einen Plasmidvektor insertiert, der die effiziente Expression in den ausgewhälten Wirtszellen lenkt. Die exakte Verbindungsstelle kann gebildet werden, indem die zusätzlichen Sequenzen zwischen den konstruierten Verbindungscodons mittels Oligonucleotid-gelenkter Deletionsmutagenese entfernt werden (Zoller und Smith, Nucl. Adics Res. 10, 6478 [1982]). Es können synthetische Oligonucleotide verwendet werden, in denen jede Hälfte zur Sequenz auf beiden Seiten der erwünschten Verbindungsstelle komplementär ist. Alternativ dazu eignen sich PCR-Techniken, um die zwei Teile des Moleküls innerhalb des Rahmens mit einem zweckmäßigen Vektor zu verknüpfen.
Die chimären Immunadhäsine der Erfindung können unter Anwendung verschiedener, allgemein bekannter Verfahren gereinigt werden, z.B. mit Affinitätschromatographie auf Protein A oder G, thiophiler Gelchromatographie (Hutchens et al., Anal. Biochem. 159, 21–226 [1986]) und Chromatographie mit immobilisiertem Metallchelat (Al-Mashikhi et al., J. Dairy Sci. 71, 1756–1763 [1988]).
d. Therapeutische Verwendung und Formulierungen
Für therapeutische Anwendungen werden die chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung an ein Säugetier, vorzugsweise einen Menschen, in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsform verabreicht, z.B. mittels intravenöser Verabreichung an einen Menschen in Form von Bolus oder mittels Dauerinfusion über einen Zeitraum, durch intramuskuläre, intraperitoneale, intrazerebrospinale, subkutane, intraarterielle, intrasynoviale, intrathekale, orale und topische Verabreichung sowie durch Inhalation. Die chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung können auch intratumoral, peritumoral, intraläsional und periläsional verabreicht werden, um lokale sowie systemische Wirkungen zu entfalten. Man kann davon ausgehen, dass die intraperitoneale Darreichung besonders nützlich ist, z.B. bei der Behandlung von Eierstocktumoren.
Solche Dosierungsformen umfassen pharmazeutisch annehmbare Träger, die inhärent nicht-toxisch und nicht-therapeutisch sind. Beispiele für solche Träger sind Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine wie etwa Humanserumalbumin, Puffersubstanzen wie etwa Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Glycerid-Teilgemische gesättigter pflanzlicher Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte wie etwa Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Silicamaterial, Magnesiumtrisilicat, Polyvinylpyrrolidon, Substanzen auf Cellulose-Basis und Polyethylenglykol. Träger für topische oder Gel-basierte Formen des chimären Proteins sind Polysaccharide wie etwa Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglykol und Holzwachsalkohole. Für alle Verabreichungen kommen konventionelle Depotformen in Frage. Dazu zählen z.B. Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposome, Pflaster, Inhalationsformen, Nasensprays, sublinguale Tabletten sowie Retardpräparate. Beispiele für Retardzusammensetzungen finden sich in US-Patent 3.773.919; EP 58.481A ; US-Patent 3.887.699; EP 158.277A ; in der kanadischen Patentanmeldung 1.176.565; U. Sidman et al., Biopolymers 22, 547 (1983); und R. Langer et al., Chem. Tech. 12, 98 (1982). Das chimäre Protein ist in solchen Vehikeln üblicherweise in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml fomuliert.
Gegebenenfalls können andere Ingredienzien den pharmazeutischen Formulierungen der chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung zugesetzt sein; Beispiele dafür sind Antioxidanzien wie etwa Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten) wie etwa Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie etwa Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie etwa Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie etwa Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate wie etwa Cellulose oder ihre Derivate, Glucose, Mannode oder Dextrine; Chelatbildner wie etwa EDTA; und Zuckeralkohole wie etwa Mannit oder Sorbit.
Die für die therapeutische Verabreichung vorgesehene chimäre VEGF-Rezeptorprotein-Formulierung muss steril sein. Sterilität wird mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen (z.B. 0,2 μm-Membranen) problemlos erreicht. Das chimäre VEGF-Rezeptorprotein wird üblicherweise in lyophilisierter Form oder als wässrige Lösung gelagert, wenn es gegenüber thermischer und oxidativer Denaturierung hochstabil ist. Der pH-Wert der Präparate aus chimärem VEGF-Rezeptorprotein reichen typischerweise von etwa 6 bis 8, obwohl unter bestimmten Umständen auch höhere oder niedrigere pH-Werte in Frage kommen.
Hinsichtlich der Prävention oder Behandlung von Krankheiten hängt die geeignete Dosierung des chimären VEGF-Rezeptorproteins von folgenden Faktoren ab: von der Art der zu behandelnden Krankheit; vom Schweregrad und dem Verlauf der Krankheit; davon, ob die chimären VEGF-Rezeptorproteine prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden; von der zuvor durchgeführten Therapie; von der Anamnese des Patienten und seiner Reaktion auf das chimäre VEGF-Rezeptorprotein; und schließlich vom Ermessen des behandelnden Arztes. Das chimäre VEGF-Rezeptorprotein wird günstigerweise einmal oder im Laufe einer Behandlungsreihe an den Patienten verabreicht. Die „therapeutisch wirksame Menge" eines chimären VEGF-Rezeptorproteins ist hierin eine Menge, die den behandelten Zustand verhindern, lindern oder heilen kann, insbesondere eine Menge, die ausreicht, die Proliferation von vaskulärem Endothel in vivo zu reduzieren oder zu inhibieren.
Die chimären VEGF-Rezeptorproteine der Erfindung eignen sich zur Behandlung verschiedener neoplastischer und nicht-neoplastischer Krankheiten und Störungen. Neoplasmen und verwandte Zustände, die sich für die Behandlung eignen, sind Brust-, Lungen-, Speiseröhren, Magen-, Darm-, Rektal, Leber-, Eierstock- und Zervikalkarzinom, Endometrium, Thekome, Arrhenoblastome, endometriale Hyperplasie, Endometriose, Fibrosarkome, Choriozarkinom, Kopf- und Halskarzinom, Nasopharynxkarzinom, Larynxkarzinom, Hepatoblastom, Karposi-Sarkom, Melanom, Hautkarzinome, Hämangiom, kavernöses Hämangiom, Hämangioblastom, Pankreaskarzinom, Retinoblastom, Astrozytom, Glioblastom, Schwannom, Oligodendogliom, Medullobastom, Neuroblastome, Rhabdomyosarkom, osteogenes Sarkom, Leiomyosarkome, Harntraktkarzinome, Thyreoideakarzinome, Wilms-Tumor, Nierenzellenkarzinom, Prostatakarzinom, mit Phakomatosen assoziierte, abnormale vaskuläre Proliferation, Ödem (z.B. mit Hirntumoren assoziiert), und Meigs-Syndrom.
Nichtneoplastische Zustände, die sich zur Behandlung eignen, sind Rheumatoidarthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetische und andere Rtinopathien, retrolentrale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, altersbedingte Makulardegeneration, Thyroideahyperplasien (z.B. Basedow-Krankheit), korneale und andere Gewebetransplantation, chronische Entzündung, Lungenentzündung, nephrotisches Syndrom, Präklampsie, Aszites, Perikarderguss (z.B. mit Perikarditis assoziiert) und Pleuraerguss.
Die folgenden Beispiele sollen lediglich die beste derzeit bekannte Durchführungsart der Erfindung veranschaulichen, wobei die Erfindung keinesfalls auf die Details dieser Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1: Konstruktion und Analyse der extrazellulären flt-1-Domänen/IgG₁F_c-Chimäre (flt-1-/IgG) und Deletionskonstrukte davon
Ein Expressionskonstrukt, bestehend aus der extrazellulären nativen flt-1-Liganden-Bindungsregion, mit sieben Ig-ähnlichen Domänen, fusioniert mit dem F_c-Abschnitt von Human-IgG₁, wurde im Wesentlichen nach dem Verfahren von Park et al., J. Biol. Chem. 269, 25646–25654 (1994), konstruiert. Die extrazelluläre Liganden-Bindungsregion des flt-1-Rezeptors wurde durch PCR unter Einsatz von Pfu-Polymerase kloniert. Humanplazenta-cDNA diente als Templat. Primer umfassten die gesamte extrazelluläre Liganden-Bindungsregion der cDNA, die für die extrazelluläre flt-1-Liganden-Bindungsregion kodierte, einschließlich der Signalpeptide. Shibuya et al., Oncogene 5, 519–524 (1990) und deVries et al., Science 255, 989–991 (1992). Die cDNA für die extrazelluläre Liganden-Bindungsregion wurde in zwei Stücken kloniert, um das Sequenzieren zu vereinfachen. Zwei Primer-Sätze (nachstehend angeführt) wurden verwendet und die resultierende Bande (mit einer Größe von etwa 1 kb) mit den geeigneten Enzymen digeriert und in pBluescript II oder pSL301 subkloniert. Die produzierte cDNA kodierte für die ersten 758 Aminosäuren des flt-1-Rezeptors. Extrazelluläre flt-1-Liganden-Bindungsregion-cDNA voller Länge wurde durch Ligieren der zwei flt-1-PCR-Klone an einer singulären natürlichen Mun I-Restriktionsstelle gebildet.
flt-1-Primer-Satz Nr. 1:
flt-1-Primer-Satz Nr. 2:
Diese Primer änderten die Aminosäure 757 der extrazellulären flt-1-Liganden-Bindungsregion zu Phenylalanin und führten am 3'-Ende davon eine Bst BI-Stelle ein. Eine Bst BI-Mutation, die alle Linkersequenzen eliminierte, wurde am 5'-Ende von CH₂CH₃, einem IgGγ1-Schwerketten-cDNA-Klon, eingeführt. Capton et al., Nature 337, 525–531 (1989). Die extrazellulären flt-1-Liganden-Bindungsregionsequenzen wurden dann mit den Kodierungsssequenzen für Aminosäuren 216–443 dieses IgGγ1-Schwerkettenklons mittels der singulären Bst BI-Stelle am 3'-Ende der Kodierungsregion für die extrazelluläre flt-1-Liganden-Bindungsregion fusioniert. Dieses Konstrukt wurde dann zwecks Expression in CEN4-Zellen in das Plasmid pHEBO23 subkloniert, wie dies von Park et al., Mol. Biol. Cell. 4, 1317–1326 (1993) beschrieben ist. Die Authentizität des Klons wurde durch DNA-Sequenzieren verifiziert. Dies führte zur erfolgreichen Konstruktion der Chimäre „flt-1/IgG", worin die native extrazelluläre Liganden-Bindungsregion des flt-1-Rezeptors mit dem F_c-Abschnitt des Human-IgG fusioniert ist.
Die Aminosäuresequenzen der extrazellulären Liganden-Bindungsregion der flt-1-, KDR- und FLT4-Rezeptoren wurden dann unter Anwendung des Sequenz-Analyseprogramms „align" ausgerichtet und die Grenzen von jeder der sieben Ig-ähnlichen Domänen in den extrazellulären Liganden-Bindungsregionen der flt-1-, KDR- und FLT3-Rezeptoren durch strukturelle und Sequenzüberlegungen bestimmt.
Sobald die Grenzen der sieben Ig-ähnlichen Domänen in den extrazellulären Liganden-Bindungsregionen der flt-1-, KDR- und FLT4-Rezeptoren definiert waren, wurde das oben gebildete flt-1/IgG-Konstrukt als Templat verwendet, um systematisch jede der sieben individuellen Ig-ähnlichen Domänen der extrazellulären flt-1-Liganden-Bindungsregion zu deletieren, indem die bereits von Urfer et al., EMBO J. 14, 2795–2805 (1995), beschriebene „Loop-out"-Mutagenesetechnik angewendet wurde. Siehe auch Kunkle, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 488–492 (1985). Durch Anwendung von Oligonucleotid-gerichteter Mutagenese wurden Oligonucleotide konstruiert, um eine einzelne Ig-ähnliche Domäne aus dem flt-1/IgG-Konstrukt einem „Loop-out" zu unterziehen, während auch singuläre Restriktionsstellen an den Grenzen jeder der sieben Ig-ähnlichen Domänen geschaffen wurden, die zum Insertieren anderer Ig-ähnlicher Domänen aus anderen extrazellulären VEGF-Rezeptor-Liganden-Bindungsregionen dienten; dies erfolgte deshalb, um andere chimäre VEGF-Rezeptormoleküle zu bilden (siehe unten).
Diese Versuche führten zu sieben zusätzlichen flt-1-/IgG-Konstrukten, von denen in jedem eine der sieben unterschiedlichen Ig-ähnlichen Domänen deletiert war.
Um die Ig-ähnliche flt-1-Domäne-1-Deletion zu schaffen wurde das Oligonucleotid 5'-AAAATTAAAAGATCCAGATCTGACTATCTATATATTTATTAGTGATACCGGTAGACCTTTT-3' verwendet, um die Aminosäuren 36–123 einem „Loop-out" zu unterziehen und eine Bgl II-Stelle und eine Age I-Stelle am 5'- bzw. am 3'-Ende der Domäne-1-Deletion vorzusehen.
Das zur Bildung der Ig-ähnlichen flt-1-Domäne-2-Deletion verwendete Oligonucleotid war 5'-GAAGGAAACAGAAGGCGCCATCTATATATTTATTCGAGGTACCAATACAATCATAG-3', wodurch die Aminosäuren S129 bis H223 wirkungsvoll entfernt wurden. Die Schaffung von Kas I- und Kpn I-Restriktionsstellen bewirkte die Aminosäureänderungen S122 zu G bzw. Q225 zu G.
Die Deletion des dritten Ig-ähnlichen Domäne entfernte die Aminosäuren N227 bis S325 unter Verwendung des Oligonucleotids 5'-CAAACTATCTCACACATAGATCTACCGTGCATATATATGATACCGGTTTCATCACTGTGAAAC-3'. Die Aminosäuren Q225, K331 und A332 wurden in S, T bzw. G umgeändert, um für die Insertion von Bgl II- und Age I-Restriktionsstellen zu sorgen.
Das Oligonucleotid 5'-GTTAACACCTCAGTGCACGTGTATGATGTCAATGTGAAACCCCAGATCTACGAAAAGGCCGTGTC-3' wurde für den „Loop-out" von Aminosäuren K331 bis I423 (Ig-ähnliche flt-1-Domäne-4-Deltion) verwendet. Die Aminosäureänderung aufgrund der Erzeugung einer Bbr PI-Restriktionsstelle war von I328 zu V. Die Bildung einer Bgl II-Restriktionsstelle am 3'-Ende der Ig-ähnlichen Domäne 4 veränderte keine Aminosäure.
Das Deletieren der Ig-ähnlichen Domäne-5-Aminosäuren K427 bis S549 wurde unter Einsatz des Oligonucleotids 5'-AAACCTCACTGCCACGCTAGCTGTCAATGTGTTTTATATCACAGATCTGCCAAATGGGTTTCAT-3' erzielt. Die Schaffung einer Nhe I-Restriktionsstelle am 5'-Ende mutierte I423 zu A; Aminosäure V555 wurde während der Insertion der Bgl II-Stelle am 3'-Ende durch L substituiert.
Um die Ig-ähnliche Domäne-6-Deletionsmutante zu erzeugen, exzidierte das Oligonucleotid 5'-GTGGGAAGAAACATAAGCTTTGTATACATTACAATCAGATCTCAGGAAGCACCATAC-3' die Aminosäuren T553 bis E652. Die Erzeugung der Bst 11071I-Stelle am 5'-Ende veränderte die Aminosäuren Y551 und I552 zu V bzw. Y; die Aminosäure D657 wurde während der Bildung der Bgl II-Restriktionsstelle am 3'-Ende durch S substituiert.
Die letzte zu deletierende Ig-ähnliche flt-1-Domäne, Domäne 7, entfernte Aminosäuren Q658 bis Y745, während die Restriktionsstelle Bsi WI und Kpn I 5' bzw. 3' hinzugefügt wurden. Das Oligonucleotid, 5'-CCAGAAGAAAGAAATTACCGTACGAGATCTCACTGTTCAAGGTACCTCGGACAAGTCTAAT-3', bewirkte eine Aminosäuresubstitution an I655 zu V.
Nach der Konstruktion des flt-1-/IgG-Konstrukts und den Ig-ähnlichen Domänendeletions-Konstrukten auf der Basis von flt-1/IgG wurden die Konstrukte unabhängig voneinander zu E. coli-Stamm XL-1 Blue unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken transformiert. Nach der Transformation der Konstrukte zu E. coli-Stamm XL-1 Blue wurden Kolonien mittels Restriktionsdigerieren hinsichtlich der Gegenwart der neu geschaffenen Restriktionsstelle getestet und anschließend die gesamte Kodierungsregion jedes Konstrukts unter Verwendung des Sequenase Version 2.0-Sets (US Biochemical Corp.) sequenziert. Doppelstrang-DNA für jeden ausgewählten Klon wurde unter Verwendung des QUIAGEN DNA-Reinigungs-Sets (Quiagen Inc.) hergestellt und für die Transfektion in CEN4-Zellen verwendet.
Plasmid-DNA, die für das native flt-1/IgG-Protein oder die flt-1/IgG-Domänendeletionen kodiert, wurde mittels Calciumphosphat-Fällung in CEN4-Zellen eingesetzt (Current Protocols in Molecular Biology). CEN4-Zellen sind ein Derivat der Humanembryonen-Nieren-293-Zelllinie, die das Epstein-Barr-Virus-Nuclearantigen-1 exprimiert, das für die episomale Replikation des pHEB023-Vektors erforderlich ist, auf dem das flt-1/gG-Konstrukt basiert. Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88, 10870–10874 (1991). 10 μg Plasmid-DNA wurden für die Transfektion einer einzelnen, 80% konfluenten 10 ml-Zellkulturschale verwendet. 48 Stunden nach der Transfektion wurde das die löslichen chimären VEGF-Rezeptoren enthaltende Medium gesammelt und die Konzentration des produzierten Proteins durch ELISA-Tests bestimmt, deren Ziel es war, den F_c-Abschnitt des chimären Proteins zu detektieren.
Beispiel 2: Bindungstests zur Detektion von Bindung an den VEGF-Liganden
Bindungstests mit den in obigem Beispiel 1 erhaltenen löslichen chimären VEGF-Rezeptoren wurden im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Park et al., J. Biol. Chem. 269, 25646–25654 (1994) durchgeführt. Genauer gesagt wurden die Bindungstests in 96-Napf-„Breakaway"-Immunabsorbens-Testplatten (Nunc) durchgeführt, die über Nacht bei 4°C mit 2 μg/ml affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-Human-F_c-IgG (Organon-Teknika) in 50 mM Na₂CO₃, pH 9,6, beschichtet wurden. Die Platten wurden 1 h lang mit 10% Rinderfötenserum in PBS blockiert (Puffer B). Nach der Entfernung des Blockierpuffers wurden 100 μl eines Bindungsgemisches jedem Napf zugesetzt. Die Bindungsgemische bestanden aus einer bestimmten Menge eines chimären flt-1/IgG-Proteins, ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ (< 9000 cpm/Napf), plus oder minus 50 ng unmarkiertem VEGF-Kompetitor falls angezeigt, wobei alle innerhalb von Puffer B vorhanden waren, um ein Endvolumen von 100 μl zu ergeben; die Gemische wurden gebildet und über Nacht bei 4°C äquilibriert. VEGF₁₆₅ wurde durch das Chloramin T-Verfahren von Keyt et al., J. Biol. Chem. 271, 5638–5656 (1996), iodiert. Die spezifische Aktivität des iodierten VEGF betrug 5,69 × 10⁷ cpm/μg. Die Inkubation in den beschichteten Näpfen erfolgte über einen Zeitraum von 4 h bei Raumtemperatur, gefolgt von vier Waschungen mit Puffer B. Die Bindung wurde durch Zählen einzelner Näpfe in einem Gammazähler ermittelt. Daten wurden mittels eines 4-Parameter-Kurvenanpassungs-Programms zur Anpassung nichtlinearer Kurven analysiert (Kalidagraph, Abelbeck Software).
Es wurden Ergebnisse der Bindungstests unter Verwendung der intakten flg-1/IgG-Proteinchimäre und der sieben Ig-ähnlichen flt-1/IgG-Deltions-Proteinchimären erhalten. Von allen untersuchten Proteinchimären war nur die Proteinchimäre ohne die Ig- ähnliche Domäne 2 nicht in der Lage, VEGF-Liganden spezifisch zu binden. Alle anderen analysierten sechs flt-1/IgG-Deletionschimären behielten die Fähigkeit bei, den VEGF-Liganden spezifisch zu binden. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass die Ig-ähnliche Domäne 2 der extrazellulären flt-1-Liganden-Bindungsregion für die spezifische Bindung an den VEGF-Liganden notwendig ist.
Diese Ergebnisse führen zum Klonieren, Exprimieren und Untersuchen verschiedener anderer chimärer flt-1/IgG-Deletionskonstrukte. Spezifische Ig-ähnliche/IgG-Konstrukte wurden durch Amplifizieren der erwünschten spezifischen Ig-ähnlichen Domänen unter Verwendung von PCR-Primern mit Restriktionsstellen (Cla I und Bst I 5' bzw. 3'), die die rahmeninternen Stellen bieten, um das Klonieren in das 5'-Ende des IgG1-Schwerketten-cDNA-Plasmids vorzunehmen, gebildet (siehe Capon et al., Nature 337, 525–531 [1989]). Dies führte zur Schaffung eines flt-1/IgG-Deletionskonstrukts nur mit den Ig-ähnlichen Domänen 1 und 2 der extrazellulären flt-1-Liganden-Bindungsregion, fusioniert mit dem F_c von IgG [flt(1,2)]. Für die Konstruktion von flt(1,2) wurden Aminsoäuren M1 bis Q224 unter Einsatz der Oligonucleotide 5'-CAGGTCAATCATCGATGGTCAGCTACTGGGACACC-3' (Flt.sp.Cla I) und 5'-GGTCAACTATTTCGAATTGTCGATGTGTGAGATAG-3' (Flt.2C.Bst BI) amplifiziert.
Andere flt-1/IgG-Deletionschimären wurden in ähnlicher Weise gebildet und enthielten die Kombination von nur der Ig-ähnlichen Domäne 2[flt(2)], nur der Ig-ähnlichen Domänen 2 und 3[flt(2,3)] und nur der Ig-ähnlichen Domänen 1, 2 und 3[flt(1,2,3)]. Die gleichen zwei Oligonucleotide zur Bildung von flt(1,2) wurden auch zur Bildung von flt(2) aus einem Konstrukt ohne die Ig-ähnliche Domäne 1 verwendet. Flt(2,3) wurde erzeugt, indem ein Konstrukt ohne die Ig-ähnliche Domäne 1 mit dem Flt.sp. Cla I-Oligonucleotid und einem weiteren Oligonucleotid, 5'-GGTCAACTATTTCGAATATATGCACTGAGGTGTTAAC-3' (Flt.3C.Bst BI), das die Kodierungssequenz bis I328 enthält, amplifziert wurde. Das Amplifizieren von flt-1/IgG-ähnlichen Domänen 1 bis 3 erfolgte unter Verwendung von Primern Flt.sp.Cla I und Flt.3C.Bst BI auf einem Konstrukt mit allen drei Ig-ähnlichen Domänen. Die gesamte Domänen-IgG-Kodierungssequenz wurde dann an den Cla I- und Not I-Stellen in pHEBO23 subkloniert.
Alle diese flt-1/IgG-Konstruktchimären wurden kloniert, exprimiert und auf ihre Fähigkeit getestet, sich spezifisch an VEGF zu binden; dies fand wie in obigen Beispielen 1 und 2 statt. Wie bei den anderen flt-1/IgG-Konstrukten wurden alle diese flt-1/IgG-Deletionskonstrukte sequenziert, in CEN4-Zellen transfiziert und das exprimierte Protein durch F_c-ELISA quantifiziert. Es wurden Ergebnisse der VEGF-Bindungstests mit den flt-1/IgG-Domänen-Deletionschimären erhalten.
Die Ergebnisse zeigen auf, dass die Ig-ähnliche flt-1-Domäne 2 selbst nicht ausreicht, um die Bindung des VEGF-Liganden zu ermöglichen. Die Ig-ähnliche Domäne 1 in Kombination mit Domäne 2 reichte auch nicht aus, um die Bindung des VEGF-Liganden zu ermöglichen. Man konnte eine kleine Menge an VEGF-Bindung detektieren, wenn die Ig-ähnlichen Domänen 2 und 2 in Kombination vorhanden waren, doch das Ausmaß und die Affinität dieser Bindung muss weiter analysiert werden. Im Gegensatz dazu war die Fähigkeit zur Bindung an den VEGF-Liganden vollständig wiederhergestellt, wenn die Ig-ähnlichen Domänen 1, 2 und 3 alle in Kombination vorhanden waren. Diese Ergebnisse belegen daher, dass die Kombination von Ig-ähnlichen flt-1-Domänen 1, 2 und 3 für die VEGF-Bindung ausreicht.
Als nächstes wurden immer größere Mengen von unmarkiertem VEGF-Liganden dazu verwendet, die ¹²⁵I-VEGF₁₆₅-Bindung an 1 ng immunreaktive flt-1/IgG oder flt(1,2,3) zu titrieren. Die Bindungstests fanden im Wesentlichen wie oben statt. Es wurden Testergebnisse erhalten. Unter Verwendung der logistischen 4-P-Kurvenanpassung [(m1 – m4)/(1 + (m0/m3)^–m2)] + m4 entspricht der Wert von m3 der Konzentration, die zu 50% Hemmung führt (IC₅₀). Dies tritt am Wendepunkt der Kurve ein. IC₅₀ für die intakte flt-1/IgG-Proteinchimäre und die flt(1,2,2)-Deletionschimäre ist bei 1,89 ng/ml bzw. 1,34 ng/ml ähnlich. Somit verhält sich die flt(1,2,3)-Deletionschimäre in Bezug auf die Bindung an den VEGF-Liganden in ähnlicher Weise wie die intakte flt-1/IgG-Proteinchimäre.
Beispiel 3: Bindungstests zum Detektieren von Bindung an den VEGF-Liganden durch „Swap"-Chimären
Es wurden die Grenzen jeder der sieben Ig-ähnlichen Domänen in den extrazellulären Liganden-Bindungsregionen der flt-1-, KDR- und FLT4-Rezeptoren ermittelt. Auf der Grundlage dieser Information wurden verschiedene „Swap"-Chimären gebildet, wobei eine oder mehrere der Ig-ähnlichen Domänen aus dem flt-1/IgG-Konstrukt mit den gleichen Ig-ähnlichen Domänen aus dem KDR- oder FLT4-Rezeptor ersetzt waren. Um diese „Swap"-Chimären zu konstruieren, wurde das erwünschte Domänenfragment aus dem KDR- oder dem FLT4-Rezeptor unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die die gleichen flankierenden Restriktionsstellen innerhalb des Rahmens enthielten, wie sie während der Konstruktion des oben beschriebenen intakten flt-1/IgG-Konstrukts gebildet wurden. Die Spaltung des intakten flt-1/IgG-Konstrukts und des PCR-Fragments (erhalten durch die Amplifikation von KDR- oder FLT4-Rezeptor-DNA mit den Restriktionsenzymen und anschließende Ligation der resultierenden Fragmente) lieferte Konstrukte, die für die erwünschten „Swap"-Chimären kodieren. Alle produzierten Konstruktchimären wurden sequenziert, um ihre Authentizität zu bestätigen.
In einem Versuch wurde die Ig-ähnliche Domäne 2 des KDR- oder des FLT4-Rezeptors mit der Ig-ähnlichen Domäne 2 des flt-1/IgG-Konstrukts „geswappt", um „Swap"-Chimären mit Ig-ähnlichen flt-1-Domänen 1 und 3–7 in Kombination mit Ig-ähnlicher Domäne 2 aus KDR (flt.K2) oder FLT4 (fltF4.2) zu bilden. Wie oben wurden beide „Swap"-Konstrukte sequenziert, bevor die Transfektion und Expression in CEN4-Zellen erfolgte und die durch die CEN4-Zellen erzeugten „Swap"-Chimären einem F_c-ELISA unterzogen wurden. Die Proteinchimären wurden anschließend wie oben auf ihre Fähigkeit untersucht, sich spezifisch an ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ zu binden. Es wurden dabei Versuchsergebnisse erhalten.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Ersetzen der Ig-ähnlichen flt-1-Domäne 2 mit der Ig-ähnlichen Domäne 2 des KDR-Rezeptors die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an den VEGF-Liganden wiederherstellt, während die Gegenwart von Ig-ähnlicher FLT4-Domäne 2 die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an den VEGF-Liganden nicht wiederherstellt. Da es bekannt ist, dass sich nativer FLT4-Rezeptor nicht an den VEGF-Liganden bindet und da der KDR-Rezeptor mit diesem Liganden in Wechselwirkung tritt, belegen diese Ergebnisse, dass Ig-ähnliche Domäne 2 die für die VEGF-Bindung hauptverantwortliche Domäne ist. Wie erwartet, band sich die native flt-1/IgG-Chimäre spezifisch an den VEGF-Liganden, während sich die flt-1/IgG-Chimäre ohne Ig-ähnliche Domäne 2 nicht spezifisch an den VEGF-Liganden band.
Als nächstes wurden Versuche durchgeführt, die ermitteln sollen, ob die Spezifität der Bindung an den VEGF-Liganden an der Ig-ähnlichen Domäne 2 des flt-1- und des KDR-Rezeptors liegt. Es ist allgemein bekannt, dass Plazenta-Wachstumsfaktor (PLGF) zur Bindung an die extrazelluläre Liganden-Bindungsregion des flt-1-Rezeptors fähig ist, sich aber nicht an die extrazellulären Liganden-Bindungsregionen des KDR- oder des FLT4-Rezeptors bindet. Somit kann die Bindung von PLGF mit der Bindung des VEGF-Liganden an den flt-1-Rezeptor konkurrieren.
Auf der Grundlage dieser Information erfolgte eine Kompetition gegen VEGF-Bindung unter Verwendung einer Reihe von „Swap"-Mutanten, die aus der flt-1/IgG-Proteinchimäre bestanden, worin zahlreiche der Ig-ähnlichen Domänen davon mit den gleichen Ig-ähnlichen Domänen aus dem KDR-Rezeptor ersetzt waren. Genauer gesagt waren die „Swap"-Chimären wie oben konstruiert – die Ig-ähnliche Domäne 1, 2, 3, 5 oder 7 der flt-1/IgG-Chimäre war durch die entsprechende Ig-ähnliche Domäne aus dem KDR-Rezeptor ersetzt. Kompetitions-Bindungstests wurden wie oben durchgeführt, wobei die Kompetitoren aus 50 ng unmarkiertem VEGF oder 50 ng unmarkiertem PLGF bestanden. Es wurden Ergebnisse dieser Kompetitions-Bindungstests erhalten.
Die Ergebnisse belegen, dass nur beim Ersetzen der Ig-ähnlichen Domäne 2 des flt-1-Rezeptors mit der Ig-ähnlichen Domäne 2 des KDR-Rezeptors die VEGF-Wechselwirkung mehr dem Wildtyp-KDR als dem Wildtyp-flt-1 entspricht. Jede der konstruierten anderen „Swap"-Chimären verhielt sich ähnlich wie der Wildtyp-flt-1-Re zeptor. Wenn die Ig-ähnliche Domäne 2 der flt-1/IgG-Proteinchimäre durch die Ig-ähnliche Domäne 2 des FLT4-Rezeptors ersetzt war, wies die resultierende Proteinchimäre die Bindungsspezifität des intakten FLT4-Rezeptors auf (Daten nicht dargestellt). Diese Ergebnisse belegen daher, dass die Ig-ähnliche Domäne 2 des flt-1- und des KDR-Rezeptors die Hauptdeterminante der Ligandenspezifität ist.
Als nächstes wurde ein Expressionskonstrukt verwendet, das für den gesamten Human-FLT4-Rezeptor kodiert, einschließlich der extrazellulären Domäne, der Transmembranregion und der intrazellulären Tyrosin-Kinase-Domäne (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93, 1988–1992 [1996]), um verschiedene andere chimäre Rezeptoren zu schaffen. Das für den gesamten FLT4-Rezeptor kodierende Konstrukt wurde dann Oligo-gerichteter Mutagenese (s.o.) ausgesetzt, um rahmeninterne Restriktionsstellen am Anfang der Ig-ähnlichen Domäne 1 der extrazellulären FLT4-Liganden-Bindungsregion (Afl II), am Ende von Domäne 1/Anfang von Domäne 2 (Nhe I), am Ende von Domäne 2/Anfang von Domäne 3 (Bsi WI) und am Ende von Domäne 3 (Mlu I) zu schaffen. Die folgenden Kombinationen von Ig-ähnlichen flt-1-Domänen wurden dann – im Wesentlichen wie oben – unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die die gleichen rahmeninternen Restriktionsstellen besaßen: Domäne 2 alleine und Domänen 1–3 alleine. Das Klonieren der flt-1-PCR-Produkte in das mutagenisierte FLT4-Kodierungskonstrukt führte zu den flt-1/FLT4-Rezeptor-Konstruktchimären. Genauer gesagt wurden Konstrukte gebildet, die die gesamten FLT4-Rezeptorsequenzen aufwiesen, außer das die Ig-ähnlichen FLT4-Domänen 1–3 mit den Ig-ähnlichen Domänen 1–3 des flt-1-Rezeptors ersetzt waren (Konstrukt flt-1(1,2,2)/FLT4) oder dass die Ig-ähnliche FLT4-Domäne 2 mit der Ig-ähnlichen Domäne 2 des flt-1-Rezeptors ersetzt war (Konstrukt flt-1(2)/FLT4). Bei flt-1(1,2,3)/FLT4 war die für Aminosäuren N33 bis E324 kodierende FLT4-Sequenz durch die für S35 bis S325 kodierenden fit-1-Sequenzen ersetzt. Die Bildung der Klonierungsstellen führte zu einer Änderung von I325 von FLT4 zu R. Bei flt-1(2)/FLT4 war die für S128 bis I224 kodierende FLT4-Sequenz durch die für I124 bis R224 kodierende flt-1-Sequenz ersetzt. Dies verändert die FLT4-Aminosäuren N33 und I326 ebenfalls zu S bzw. R und fügte T36 hinzu. Das Sequenzieren bestätigte die Authentizität dieser Chimären.
Nach der Herstellung dieser Expressionskonstrukte wurden 293-Zellen mittels DEAE-Dextran mit den Konstrukten transfiziert und transient exprimierende Zellen hinsichtlich ihrer Fähigkeit analysiert, sich an den VEGF-Liganden zu binden. Um die Bindung des VEGF-Liganden zu detektieren, wurde ein Sättigungs-Bindungstest auf transient exprimierenden 293-Zellen durchgeführt, die intakten FLT4-Rezeptor, die flt-1-Domäne-2/FLT4-Rezeptorchimäre, die flt-1-Domänen-1-3/FLT4-Rezeptorchimäre oder den intakten flt-1-Rezeptor exprimieren. Genauer gesagt wurden 2,5 × 10⁵ Zellen mit immer größeren Mengen an ¹²⁵I-VEGF (spezifische Aktivität von 56,9 × 10⁶ cpm/μg) in einem Endvolumen von 0,2 ml Puffer C (50/50 Medium mit 0,1% BSA und 25 mM HEPES, pH 7,3) 4 h lang bei 4°C unter leichtem Rühren inkubiert. Das Zellgemisch wurde dann auf ein 0,75 ml-Kissen aus 30% Saccharose schichtenweise aufgetragen, 10 min lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und das Pellet gewonnen und in einem Gammazähler gezählt. Da 293-Zeilen etwas fit-1-ähnliche VEGF-Bindung aufweisen, wurden auch nicht-transfizierte Zellen verwendet und die Hintergrund-Counts von den für die transfizierten Zellen erhaltenen Counts subtrahiert. Die Menge der hinzugefügten Counts und der erhaltenen gebundenen Counts wurde dann einer Scatchard-Analyse unterzogen.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten, dass die den intakten FLT4-Rezeptor exprimierenden Zellen wie erwartet den VEGF-Liganden nicht spezifisch banden. Allerdings stellte man fest, dass Zellen, die die flt-1-Domäne-2-/FLT4-Rezeptorchimäre oder die flt-1-Domänen-1-3/FLT4-Rezeptorchimäre exprimieren, spezifische und enge Bindung an den VEGF-Liganden aufwiesen. Die Kd-Werte für die flt-1-Domäne-2/FLT4-Rezeptorchimäre bzw. die flt-1-Domänen1-3/FLT4-Rezeptorchimäre sind etwa 10,2 pM +/– 1,1 pM bzw. 10,4 pM +/– 3,4 pM. Diese Werte kommen an den Bereich heran, der für den intakten flt-1-Rezeptor voller Länge angegeben wurde.
Es erfolgten ferner Versuche, um die Menge an Tyrosin-Phosphorylierung in 293-Zellen zu messen, die diese Rezeptorchimären 60–72 Stunden nach der Transfektion transient exprimieren. Tyrosin-Phosphorylierungs-Tests wurden im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Park et al., J. Biol. Chem. 269, 25646–25654 (1994) durchgeführt. Es wurde den transient exprimierenden 293-Zellen 16–18 h vor der Stimulation in einem bestimmten Faktor Serum entzogen. Zellen wurden mit FLT4-Liganden (VH1.4.5; VEGF-C/CRP) mit einer Konzentration von 400 ng/ml, 50 ng/ml VEGF oder 0,5 nM PLGT 15 min lang bei 37°C stimuliert. Nach der Entfernung des Stimulationsmediums wurden die Zellen zwei Mal mit eiskalter PBS gewaschen und dann in 1 ml Lysepuffer lysiert. Das Lysat wurde von Zellbruchstücken geklärt, und die Rezeptoren wurden unter Verwendung von JTL.1, einem polyklonalen Antkörper gegen die extrazelluläre Domäne des FLT4-Rezeptors, immungefällt (siehe Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93, 1988–1992 [1996]). Die Immunfällungen wurden dann Western-Gel/Blot-Analyse unter Einsatz des monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers 4G10 (UBI, Lake Placid, NY, USA) unterzogen. Immunreaktive Banden wurden mit einem ABC-Set gemäß den Anweisungen des Herstellers (Vector Laboratories) sichtbar gemacht.
Um stabile Zelllinien zu bilden, wurde jedes der chimären Konstrukte mit einem Plasmid co-transfiziert, das das Neomycinresistenz-Gen enthielt; dies erfolgte mittels Calciumphosphat-Fällung in NIH 3T3-Zellen. In Gegenwart von G418 proliferierende Klone wurden auf ihre Fähigkeit zur Bindung an VEGF gescreent. Klone, die entweder die flt-1(1,2,3)/FLT4- oder die flt-1(2)/FLT4-Chimäre exprimierten, wurden in einem Zellbindungstest analysiert, um den Kd-Wert für VEGF zu bestimmen, indem eine Spurenmenge von ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ (etwa 5.000 cpm/ml Endvolumen) mit steigenden Mengen von kaltem VEGF₁₆₅ titriert wurde. Zunächst wurden die anhaftenden Zellen mit kaltem Bindungspuffer C gewaschen (DMEM/F12-Medium mit 0,2% BSA und 25 mM HEPES, pH 7,4), und dann wurden ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ und der kalte Kompetitor, jeweils in 0,5 ml Puffer C, gleichzeitig zugesetzt. Die Zellen wurden 4 h lang bei 4°C aufbewahrt. Nach dem Absaugen des Bindungspuffers wurden die Zellen mit kalter PBS und dann zwei Mal mit kalter PBS mit 2 M NaCl gewaschen. Schließlich wurden die Zellen mit 0,25 M NaOH lysiert und das gesamte Lysat in einem Gammazähler gezählt. Die Ergebnisse wurden analysiert und die Kd-Werte berechnet, wobei dies in Einklang mit dem Scatchard-Analyseprogramm New Ligand (Genentech, Inc.) erfolgte.
NIH 3T3-Zellen, die entweder die flt-1(1,2,2)/FLT4- oder die flt-1(2)/FLT4-Rezeptorchimäre stabil exprimieren, wurden im 12-Napf-Format mit 50,000 Zellen/Napf in Glucose-armes DMEM-Medium aufplattiert, das 10% FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco BRL), 2 mM Glutamin, 2,5 μg/ml Fungizone (Gibro BRL) und 200 μg/ml G418 (Gibco BRL) enthielt. Nach 18–24 h Serumentzug in Medium mit 0,5 FBS wurden Wachstumsfaktoren oder 10% FBS zugesetzt. Die Konzentration des zugegebenen VEGF₁₆₅ reichte von 5 pg/ml bis zu 300 ng/ml; die PIGF₁₅₂-Konzentrationen lagen zwischen 5,12 ng/ml und 3,2 μg/ml; die Konzentration von VEGF-C betrug 40 ng/ml und 4 μg/ml. Nach 12–16 h Stimulation bei 37°C wurde [³H]Thymidin (1 mCi/ml; 5 Ci/mMol) in einer Endkonzentration von 1 μCi/ml zugesetzt und die Inkubation 4 h lang bei 37°C fortgesetzt. An die Entfernung des Mediums und mehrere PBS-Waschgänge schloss sich TCA-Fällung. Nach der Entfernung von TCA wurden die Zellen mit 0,2 N NaOH, 1% SDS, lysiert, in Szintillationsfläschchen gefüllt und mit 2 M Na₂OAc, pH 4,0, neutralisiert. Die Proben wurden unter Verwendung des Titriumkanals gezählt.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass VEGF die Tyrosin-Phosphorylierung in Zellen, die den intakten FLT4-Rezeptor transient exprimieren, nicht stimulierte, dass aber signifikante Tyrosin-Phosphorylierung in Zellen beobachtet wurde, die die flt-1(2)/FLT4-Rezeptorchimäre oder die flt-1(1,2,3)/FLT4-Rezeptorchimäre transient exprimieren. Somit belegen diese Versuche, dass die flt-1(2)/FLT4-Rezeptorchimäre und die flt-1(1,2,3)/FLT4-Rezeptorchimäre zur Bindung an und spezifischen Reaktion auf VEGF fähig sind. Außerdem zeigten diese Klone eine signifikante Reaktion auf VEGF im Thymidin-Inkorporationstest.
Abschließende Bemerkungen
Die obige Beschreibung erläutert spezifische Verfahren, die sich zur Durchführung der vorliegenden Erfindung eignen. Nach dieser ausführlichen Darlegung solcher spezifischer Verfahren ist es für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung möglich, alternative zuverlässige Techniken zu entwickeln, mit deren Hilfe die gleichen Ergebnisse erzielt werden können wie im Lichte der vorliegenden Erfindung. Somit sind zwar die obigen Ausführungen äußerst detailliert, doch sie sollten keinesfalls so ausgelegt werden, dass sie den Schutzumfang der Erfindung einschränken. Dieser Schutzumfang der Erfindung ist lediglich durch die gesetzmäßige Auslegung der beiliegenden Ansprüche definiert.

Claims

Chimäres VEGF-Rezeptorprotein, das zur Bindung an einen VEGF fähig ist und so eine Hemmwirkung auf ihn ausübt, umfassend: eine Ig-ähnliche Domäne 1 vom flt-1-Rezeptor oder KDR-Rezeptor; eine Ig-ähnliche Domäne 2 vom flt-1-Rezeptor oder KDR-Rezeptor; und eine Ig-ähnliche Domäne 3 vom flt-1-Rezeptor oder KDR-Rezeptor, worin das chimäre VEGF-Rezeptorprotein entweder (a) keine Ig-ähnliche Domänen 4–7, aber Ig-ähnliche Domänen 1–3 vom gleichen VEGF-Rezeptor aufweist oder (b) zumindest eine Ig-ähnliche Domäne vom flt-1-Rezeptor und zumindest eine Ig-ähnliche Domäne vom KDR-Rezeptor aufweist und worin der Begriff Ig-ähnliche Domäne vom flt-1- oder KDR-Rezeptor die gesamte Wildtypdomäne und funktionelle Äquivalente davon umfasst.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 1, worin die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 1, 2 und 3 alle vom flt-1-Rezeptor stammen.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 1, worin die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 1, 2 und 3 alle vom KDR-Rezeptor stammen.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 1, worin die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 1 und 3 vom flt-1-Rezeptor stammen und die Immunglobulin-ähnliche Domäne 2 vom KDR-Rezeptor stammt.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 1, worin die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 1 und 3 vom KDR-Rezeptor stammen und die Immunglobulin-ähnliche Domäne 2 vom flt-1-Rezeptor stammt.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 1, worin die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 1 und 2 vom flt-1-Rezeptor stammen und die Immunglobulin-ähnliche Domäne 3 vom KDR-Rezeptor stammt.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 1, worin die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 1 und 2 vom KDR-Rezeptor stammen und die Immunglobulin-ähnliche Domäne 3 vom flt-1-Rezeptor stammt.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 1, worin die Immunglobulin-ähnliche Domäne 1 vom flt-1-Rezeptor stammt und die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 2 und 3 vom KDR-Rezeptor stammen.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 1, worin die Immunglobulin-ähnliche Domäne 1 vom KDR-Rezeptor stammt und die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 2 und 3 vom flt-1-Rezeptor stammen.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 1, 2 und 3 an den F_c-Abschnitt eines menschlichen IgG-Immunglobulins fusioniert sind.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das löslich ist.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein, das zur Bindung an einen VEGF fähig ist und so eine Hemmwirkung auf ihn ausübt, wobei das chimäre VEGF-Rezeptorprotein die extrazelluläre Domäne des FLT4-Rezeptors umfasst, worin die Immunglobulin-ähnliche Domäne 2 des FLT4-Rezeptors durch die Immunglobulin-ähnliche Domäne 2 des flt-1- oder KDR-Rezeptors oder eines funktionellen Äquivalents davon ersetzt ist und worin eine oder mehrere Immunglobulin-ähnliche Domänen des FLT4-Rezeptors gegebenenfalls durch die entsprechende Immunglobulin-ähnliche Domäne des flt-1- oder KDR-Rezeptors oder eines funktionellen Äquivalents davon ersetzt sind.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 12, das die Immunglobulin-ähnliche Domäne 2 des flt-1-Rezeptors und die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 1 und 3 bis 7 des FLT4-Rezeptors aufweist.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 12, das die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 1 bis 3 des flt-1-Rezeptors und die Immunglobulin-ähnlichen Domänen 4 bis 7 des FLT4-Rezeptors aufweist.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach einem der Ansprüche 12 bis 14, das löslich ist.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach einem der Ansprüche 12 bis 14, das membrangebunden ist.
Nucleinsäure, die für ein chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 kodiert.
Replizierbarer Expressionsvektor, der zur Expression des chimären VEGF-Rezeptorproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 16 in einer Transformantenwirtszelle fähig ist.
Wirtszellen, die mit dem replizierbaren Expressionsvektor nach Anspruch 18 transformiert sind, worin die Wirtszellen keinen Menschen darstellen.
Wirtszellen nach Anspruch 19, die CEN4-Zellen sind.
Zusammensetzung aus Elementen, die ein chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 umfassen, das mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt ist.
Verfahren zur Herstellung eines chimären VEGF-Rezeptorproteins, die Schritte der Einführung des Expressionsvektors nach Anspruch 18 in ein geeignetes Expressionssystem und der Durchführung der Expression des chimären VEGF-Rezeptorproteins umfassend, worin das Expressionssystem kein Mensch ist.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 23 zur Verwendung bei der Behandlung eines Leidens in Zusammenhang mit ungewünschter Vaskularisation in einem Säugetier.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 24, worin das Leiden in Zusammenhang mit ungewünschter Vaskularisation die Entstehung eines Tumors umfasst.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 25, worin der Tumor bösartig ist.
Chimäres VEGF-Rezeptorprotein nach Anspruch 23 zur Verwendung bei der Hemmung von VEGF-Aktivität in einem Säugetier.
Verwendung eines chimären VEGF-Rezeptorproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Leidens in Zusammenhang mit ungewünschter Vaskularisation in einem Säugetier.
Verwendung nach Anspruch 28, worin das Leiden in Zusammenhang mit ungewünschter Vaskularisation die Entstehung eines Tumors umfasst.
Verwendung nach Anspruch 29, worin der Tumor bösartig ist.
Verwendung eines chimären VEGF-Rezeptorproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von VEGF-Aktivität.