CN109734816A

CN109734816A - 一种基因重组人促皮质素与白蛋白的融合蛋白及表达方法

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Publication number: CN109734816A
Application number: CN201910186462.XA
Authority: CN
Inventors: 王大勇; 黄永林; 武新丽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2019-05-10

Abstract

人促皮质素又称促肾上腺皮质激素（ACTH），目前是临床治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯一特效药。人血清白蛋白（ALB）在体内具有稳定其它蛋白质的作用。本发明通过基因工程技术，优化设计并构建基因重组ACTH与ALB的融合蛋白表达质粒，并在BL21‑DE3菌株中表达。ACTH与ALB通过组织型纤溶酶原激活剂的底物识别序列（tPAst）相连接起，tPAst在体内可以被组织型纤溶酶原激活剂识别并水解，从而可以逐渐释放出游离的ACTH与ALB。

Description

一种基因重组人促皮质素与白蛋白的融合蛋白及表达方法

技术领域

本发明属于基因工程制药，涉及一种利用微生物表达的基因重组融合蛋白及其DNA和蛋白质序列，以及该融合蛋白的表达方法。

背景技术

促皮质素(Corticotropin)也称促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropichormone，ACTH)，是由垂体的前叶、下丘脑、肾上腺髓质、肠道和胎盘等组织分泌的一种39个氨基酸的多肽类激素，具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢，调节心脑血管功能、提高抵抗力，调控糖皮质激素(GC)的合成与分泌，神经损伤恢复与再生，抗炎，免疫抑制，抗毒素，抗休克等作用。ACTH是临床治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯一特效药，该病发病率0.5％～1％，6～33％的婴儿惊厥症患儿在3岁前死亡，70～90％患儿智力发育缓慢，30％发展为自闭症。ACTH也用于红斑狼疮、多发性硬化病急性恶化、肾病综合征、全身性皮肌炎和结节病的治疗；还用于银屑病关节炎、风湿性关节炎、强直性脊柱炎以及严重眼部过敏和炎症等的辅助治疗。目前医药市场上流通的注射用人促肾上腺皮质激素(简称促皮质素，ACTH)主要有两个来源：一是在动物脏器中提取，生产成本高并且有传播动物病毒和支原体的潜在风险。二是由人工合成具有生物活性的ACTH前24肽，其工艺复杂、成本高、产量小、半衰期较短,并且化学合成的方法不易控制其产物旋光性。ACTH在血液中容易被蛋白酶降解，血浆半衰期很短。本发明从工程菌中表达制备基因重组ACTH融合蛋白，生产成本低，基本不会传播动物病毒和支原体。

人血清白蛋白(ALB)是人体血液中含量最多的蛋白质，含有585个氨基酸，具有结合其它化合物、维持血液渗透压、抗凝血、清除自由基、增强人免疫力和抵抗力等作用，其在体内的半衰期较长，约为19天。ALB制剂在临床上广泛用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综合症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂等。人血清白蛋白可以保护与其结合的蛋白质不被血浆中的各种蛋白酶降解，从而延长蛋白质在血浆中的半衰期。

组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是血液中的一种蛋白酶，它可以特异性识别底物蛋白质当中的酶切识别位点序列“CPGRVVGG”(简称为tPAst)，并在该位点处将底物蛋白质切割成两段。在本发明表达的融合蛋白中，以tPAst连接ACTH与ALB，形成融合蛋白结构ACTH-tPAst-ALB，当融合蛋白被注射入血液后，血液中tPA的作用下，ACTH-tPAst-ALB融合蛋白会逐渐释放出游离的ACTH及ALB蛋白。

构建的表达ACTH与ALB的融合蛋白的表达质粒在本专利中称为ACTH-tPAst-ALB-pET21a。其中tPAst为如上所述组织型纤溶酶原激活剂底物序列(氨基酸序列为CPGRVVGG)。

发明内容

1.发明的目的

利用工程菌表达及制备一种基因重组融合蛋白(ACTH-tPAst-ALB)的方法，ACTH与ALB通过tPAst氨基酸序列相连，tPAst在血液中可以被蛋白酶tPA识别并切割成两段。

2.发明的技术方案

一、使用设计的引物以及重叠PCR技术将编码ACTH、tPAst和ALB的核苷酸序列相连，构建两端带有内切酶位点(BamHI和SalI)的cDNA架构：BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI。

二、双酶切BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI以及空白载体pET21a，产生互补的粘性末端。

三、用T4连接酶将切出粘性末端的BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI以及pET21a空白质粒连接，构建出表达ACTH-tPAst-ALB(图1)的pET21a表达质粒。

四、将构建好的质粒转入大肠杆菌工程菌株BL21-DE3中，筛选高表达菌株，诱导表达。

五、破碎菌体，收集包涵体并洗涤。在破碎和溶解包涵体，得到富含ACTH-tPAst-ALB的溶液。

3.发明的有益效果

本发明可以获得具有ACTH和ALB双重功效的融合蛋白ACTH-tPAst-ALB，融合蛋白ALB-tPAst-ACTH在人体血液中能够被tPA识别。tPA可以将含有tPAst氨基酸序列(CPGRVVGG)的融合蛋白质切成两段，从而逐步释放出游离的ACTH和ALB。发挥类似缓释长效制剂的作用，同时可以增强ACTH的作用。

附图说明

图1.ACTH-tPAst-ALB-pET21a表达质粒图谱，ACTH-tPAst-ALB逆时针转录。

图2.BamHI-ACTH-tPAst的PCR扩增产物结果图。

图3.tPAst-ALB-SalI的PCR扩增产物结果图。

图4.ACTH-tPAst-ALB-pET21a表达质粒的BamHI及SalI双酶切验证结果。M：分子量标记；泳道1：ACTH-tPAst-ALB-pET21a表达质粒的BamHI及SalI双酶切电泳结果图；小片段为ACTH-tPAst-ALB，大片段为pET21a载体骨架片段；泳道2：pET21a空白质粒。

图5.ACTH-tPAst-ALB基因序列1-638nt正向测序图，其中1-3nt为起始密码子ATG，4-120nt编码ACTH，121-144nt编码tPAst。

图6.ACTH-tPAst-ALB基因序列639-1276nt正向测序图。

图7.ACTH-tPAst-ALB基因序列1277-1587nt正向测序图。

图8.ACTH-tPAst-ALB基因序列1588-1908nt反向测序图，最后9个碱基为三联终止密码子TAATAATAA。

图9.在BL21-DE3工程菌中表达的ACTH-tPAst-ALB蛋白质电泳结果。表达的蛋白质分别经SDS-PAGE(12％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，用考马斯亮蓝R-250原位染色，用BIO-RAD ChemiDocTM XRS+凝胶成像系统检测蛋白质条带。M：分子量标记；泳道1：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株未诱导表达，泳道2：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株诱导表达后菌体裂解液，泳道3：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株诱导表达后收集到的包涵体的裂解液。箭头所指为ACTH-tPAst-ALB融合蛋白。

图10.原核诱导表达的ACTH-tPAst-ALB的Western blot检测结果。ACTH-tPAst-ALB经SDS-PAGE(12％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，转印到硝酸纤维素膜，一抗为鼠抗人ACTH抗体，二抗为Alexa488荧光标记羊抗鼠抗体，用Typhoon FLA 9500(GEHealhcare)检测蛋白条带荧光强度。M：分子量标记。泳道1：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株未诱导表达，泳道2：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株诱导表达后菌体裂解液，泳道3：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株诱导表达后收集到的包涵体的裂解液。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式表达基因重组ACTH-tPAst-ALB融合蛋白，按以下步骤进行：

一、根据原核表达体系中的密码子偏好性优化设计ACTH cDNA序列并合成，使其能够在大肠杆菌表达菌株BL21-DE3中高效表达，选用pET21a作为原核表达载体，以BamHI和SalI作为酶切位点，插入融合蛋白的CDs序列。

引物设计，设计带有保护碱基(CGC)、酶切位点和起始密码子(ATG)的上游引物：BamHI-ACTH Primer F；带有tPAst核苷酸序列的下游引物ACTH-tPAst Primer R。设计带有设计带有tPAst核苷酸序列的ALB上游引物：tPAst-ALB Primer F；设计带有保护碱基(ACGC)、SalI酶切位点和三联终止密码子(TAATAATAA)的下游酶切位点：ALB-SalI PrimerR。

重叠PCR，首先，用引物BamHI-ACTH Primer F和引物ACTH-tPAst Primer R及模板ACTH扩增BamHI-ACTH-tPAst(图2)，胶回收目的产物。第二，用引物tPAst-ALB Primer F和引物ALB-SalI Primer R及模板ALB扩增tPAst-ALB-SalI(图3)，胶回收目的产物。第三，用引物BamHI-ACTH Primer F和引物ALB-SalI Primer R及模板BamHI-ACTH-tPAst和tPAst-ALB-SalI扩增带有酶切位点的目的融合蛋白基因BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI。

二、用BamHI和SalI内切酶分别酶切BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI以及空白质粒载体pET21a。

三、用T4DNA连接酶连接上述切割后的BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI片段和pET21a空白载体，构建ACTH-tPAst-ALB-pET21a完整表达质粒(图1)。双酶切鉴定结果见图4。构建好的上述表达质粒测序结果见图5、图6、图7和图8。

四、通过在42℃水浴加热45秒钟分别将ACTH-tPAst-ALB-pET21a表达质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3中，加热后迅速冰浴冷却2min，加入500μL无抗培养基，37℃恢复菌体1小时，取50μL涂布含有氨苄青霉素的LB培养板，37℃倒置培养16h。分别挑选培养板上的单一克隆，转移到50mL(体积可倍率放大)液体LB培养基的锥形瓶中，培养基中加有氨苄青霉素，37℃摇菌至OD 600为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG于180rpm 37℃表达5h。

五、将上述工程菌收集在离心管中，以12,000rpm，4℃离心15min，弃去上清。加入非变性裂解液(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH 8.0)柔和洗涤菌体。再以12,000rpm，4℃离心15min，收集沉淀。反复洗涤3次。每克湿重加入8mL非变性裂解液，用旋转混合仪分散菌体。将菌液置于冰上，用超声波破碎仪破碎菌体，破碎功率为400W，破碎3s停5s，共破碎200次。于12,000rpm，4℃离心20min，收集包涵体沉淀，取少量样品加入上样缓冲液，经12％Tris-Glycine聚丙烯酰胺电泳后，用考马斯亮蓝R-250原位染色，用BIO-RADChemiDocTM XRS+凝胶成像系统检测蛋白质条带(图9)。

六、原核诱导表达的ACTH-tPAst-ALB经SDS-PAGE(12％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，Western blot检测结果如图10所示。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是不采用pET21a质粒，而是用pET30a作为表达载体。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是不采用pET30a或pET21a质粒，而是用其它表达质粒载体。

具体实施方式四：本实施方式所采用的实验方法与具体实施方式一相同，但具体实施方式一的步骤四中的转化后的菌体扩增体积按照50mL的倍数加以放大，后续步骤中的试剂用量也相应增加。

序列表

<110> 王大勇

<120> 一种基因重组人促肾上腺皮质激素与人血清白蛋白的融合蛋白及其表达方法

<130> 2019-03-08

<141> 2019-03-08

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1908

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcttact ctatggaaca cttccgttgg ggtaaaccgg ttggtaaaaa acgtcgtccg 60

gttaaagttt acccgaacgg tgctgaagac gaatctgctg aagctttccc gctggaattc 120

tgcccgggtc gtgttgttgg tggtgatgca cacaagagtg aggttgctca tcggtttaaa 180

gatttgggag aagaaaattt caaagctttg gtgttgattg cctttgctca gtatcttcag 240

cagtgtccat ttgaagatca tgtaaaatta gtgaatgaag taactgaatt tgcaaaaaca 300

tgtgttgctg atgagtcagc tgaaaattgt gacaaatcac ttcataccct ttttggagac 360

aaattatgca cagttgcaac tcttcgtgaa acctatggtg aaatggctga ctgctgtgca 420

aaacaagaac ctgagagaaa tgaatgcttc ttgcaacaca aagatgacaa cccaaacctc 480

ccccgattgg tgagaccaga ggttgatgtg atgtgcactg cttttcatga caatgaagag 540

acatttttga aaaaatactt atatgaaatt gccagaagac atccttactt ttatgccccg 600

gaactccttt tctttgctaa aaggtataaa gctgctttta cagaatgttg ccaagctgct 660

gataaagctg cctgcctgtt gccaaagctc gatgaacttc gggatgaagg gaaggcttcg 720

tctgccaaac agagactcaa gtgtgccagt ctccaaaaat ttggagaaag agctttcaaa 780

gcatgggcag tagctcgcct gagccagaga tttcccaaag ctgagtttgc agaagtttcc 840

aagttagtga cagatcttac caaagtccac acggaatgct gccatggaga tctgcttgaa 900

tgtgctgatg acagggcgga ccttgccaag tatatctgtg aaaatcaaga ttcgatctcc 960

agtaaactga aggaatgctg tgaaaaacct ctgttggaaa aatcccactg cattgccgaa 1020

gtggaaaatg atgagatgcc tgctgacttg ccttcattag ctgctgattt tgttgaaagt 1080

aaggatgttt gcaaaaacta tgctgaggca aaggatgtct tcctgggcat gtttttgtat 1140

gaatatgcaa gaaggcatcc tgattactct gtcgtgctgc tgctgagact tgccaagaca 1200

tatgaaacca ctctagagaa gtgctgtgcc gctgcagatc ctcatgaatg ctatgccaaa 1260

gtgttcgatg aatttaaacc tcttgtggaa gagcctcaga atttaatcaa acaaaattgt 1320

gagctttttg agcagcttgg agagtacaaa ttccagaatg cgctattagt tcgttacacc 1380

aagaaagtac cccaagtgtc aactccaact cttgtagagg tctcaagaaa cctaggaaaa 1440

gtgggcagca aatgttgtaa acatcctgaa gcaaaaagaa tgccctgtgc agaagactat 1500

ctatccgtgg tcctgaacca gttatgtgtg ttgcatgaga aaacgccagt aagtgacaga 1560

gtcaccaaat gctgcacaga atccttggtg aacaggcgac catgcttttc agctctggaa 1620

gtcgatgaaa catacgttcc caaagagttt aatgctgaaa cattcacctt ccatgcagat 1680

atatgcacac tttctgagaa ggagagacaa atcaagaaac aaactgcact tgttgagctc 1740

gtgaaacaca agcccaaggc aacaaaagag caactgaaag ctgttatgga tgatttcgca 1800

gcttttgtag agaagtgctg caaggctgac gataaggaga cctgctttgc cgaggagggt 1860

aaaaaacttg ttgctgcaag tcaagctgcc ttaggcttat aataataa 1908

<210> 2

<211> 633

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys

1 5 10 15

Lys Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser

20 25 30

Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly

35 40 45

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

50 55 60

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

85 90 95

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

100 105 110

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

115 120 125

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

130 135 140

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

145 150 155 160

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

165 170 175

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

180 185 190

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

195 200 205

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

210 215 220

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

225 230 235 240

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

245 250 255

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

260 265 270

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

275 280 285

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

290 295 300

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

305 310 315 320

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

325 330 335

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

340 345 350

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

355 360 365

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

370 375 380

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

385 390 395 400

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

405 410 415

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

420 425 430

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

435 440 445

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

450 455 460

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

465 470 475 480

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

485 490 495

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

500 505 510

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

515 520 525

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

530 535 540

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

545 550 555 560

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

565 570 575

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

580 585 590

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

595 600 605

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

610 615 620

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

625 630

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcca tgtcttactc tatggaa 27

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgacccgggc agaattccag cgggaaagct t 31

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagctttccc gctggaattc tgcccgggtc gtgttgttgg tggtgatgca cacaagagt 59

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgcgtcgac ttattattat aagcctaagg cagct 35

Claims

1.人促皮质素(ACTH)与人血清白蛋白(ALB)的融合蛋白，其特征在于一条多肽链中同时包含ACTH氨基酸序列和ALB氨基酸序列。

2.权利要求1所描述的ACTH与ALB融合蛋白中的ACTH与ALB通过组织型纤溶酶原激活剂所识别并降解的底物氨基酸序列(tPAst)相连接，tPAst的特征为包含氨基酸序列CPGRVVGG的全部序列或部分序列。

3.权利要求1所描述的ACTH与ALB的融合蛋白的经过优化的核苷酸序列，如本专利序列表所示。

4.权利要求1所述描的ACTH与ALB的融合蛋白的氨基酸序列，如本专利需列表所示。

5.本专利所描述的用于表达ACTH与ALB融合蛋白的基因工程方法的全部或部分。