CN107949638A - 新型人血清白蛋白突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可与生理活性蛋白质连接而提高该蛋白质的血中稳定性的人血清白蛋白突变体以及与其连接而成的蛋白质。该连接而成的蛋白质是一种人血清白蛋白突变体以及与其连接而成的生理活性蛋白质，该人血清白蛋白突变体包含序列编号3所示的氨基酸序列或者相对于该序列编号3所示的氨基酸序列有10个以下的氨基酸残基缺失和/或有10个以下的氨基酸残基被置换的氨基酸序列，该氨基酸序列中，序列编号3所示的氨基酸序列的N末端第318个天冬酰胺残基和第320个苏氨酸残基保持着在这2个残基间经由脯氨酸以外的单个氨基酸残基(X)通过肽键连接的状态。

Description

新型人血清白蛋白突变体
技术领域
本发明涉及通过与具有生理活性的蛋白质连接、可提高该蛋白质的血中稳定性的新型人血清白蛋白突变体，以及由该人血清白蛋白突变体与具有生理活性的蛋白质连接而成的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(HSA突变体连接蛋白质)、例如人血清白蛋白突变体连接人生长激素。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)的成熟型是由585个氨基酸构成的蛋白质。HSA是血浆蛋白质中量最多的成分，血浆中的半衰期长达14～20天。HSA参与血浆的渗透压的调节，并且具有与血中的阳离子、脂肪酸、激素类、胆红素及其它内源性物质以及药剂等外源性物质结合来对它们进行搬运的功能。一般来说，与HSA结合的物质难以被脏器摄入，能在血中更长时间地循环。
已知人血清白蛋白(HSA)存在多种天然的变异体。人血清白蛋白Redhill是其中之一(非专利文献1、2)。人血清白蛋白Redhill与由585个氨基酸构成的上述普通人血清白蛋白的氨基酸序列相比，在其N末端侧第320个氨基酸残基不是丙氨酸而是苏氨酸、且其N末端上增加了一个精氨酸残基这一点上有所不同，由586个氨基酸构成。通过上述丙氨酸向苏氨酸的转变，白蛋白Redhill的氨基酸序列中产生以Asn-Tyr-Thr表示的序列，该序列中的Asn(天冬酰胺)残基被N-连接糖基化。因此，白蛋白Redhill与上述普通人血清白蛋白相比，观察到的分子量要大2.5kDa左右。
有人报道了通过使酶等蛋白质与HSA融合来增加该蛋白质在血浆中的稳定性的方法(非专利文献3、专利文献1、2)。HSA与酶等的融合蛋白质如下所述制备：将在框内结合有编码HSA的基因和编码酶等蛋白质的基因的DNA整合在表达载体中，制备导入有该表达载体的转化细胞，对该细胞进行培养，藉此在培养基中或细胞内以重组蛋白质的形式制备HSA与酶等的融合蛋白质。
作为与人血清白蛋白(HSA)融合而增加了血浆中的稳定性的蛋白质的例子，有HSA与G-CSF的融合蛋白质(专利文献1、3)、HSA与α干扰素的融合蛋白质(专利文献4)、HSA与GLP-1的融合蛋白质(专利文献5)、HSA与胰岛素的融合蛋白质(专利文献6)、HSA与红细胞生成素的融合蛋白质(专利文献7)、HSA与生长激素的融合蛋白质(专利文献4、5及8～11)等。
人生长激素(hGH)是在下丘脑的控制下由垂体前叶分泌的蛋白质。hGH除了显示出软骨形成促进、蛋白质同化促进等生长促进活性外，还显示出身体组成及脂质代谢改善作用。hGH的分泌少的儿童与健康儿童相比，会发生呈现低身高的生长激素缺乏性侏儒症。
含有使用导入有hGH基因的大肠杆菌以重组蛋白质的形式制备的分子量约22KD的hGH作为有效成分的制剂(hGH制剂)，作为生长激素缺乏性侏儒症、特纳综合征中的侏儒症、不伴有骺线闭合的SGA(小于胎龄(Small-for-Gestational Age))性侏儒症、由慢性肾功能衰竭引起的侏儒症、普拉德-威利综合征中的侏儒症、软骨营养障碍中的侏儒症的治疗剂广泛地应用于临床。hGH制剂给药至皮下或肌肉内，在血中循环，通过其生长促进活性而起到促进患者的生长的效果。此外，hGH制剂也作为成人生长激素缺乏症的治疗剂广泛地应用于临床。在成人生长激素缺乏症的患者中观察到脂质代谢异常等各种异常，而通过hGH制剂的给药，患者的脂质代谢正常化等，患者的QOL得到改善。作为针对生长激素缺乏性侏儒症、成人生长激素缺乏症等的hGH制剂，例如有Growject(注册商标)。
基于临床上的需求，进行了增加血浆中的hGH稳定性的尝试。hGH在血浆中的半衰期少于20分钟，给药至患者的hGH迅速地从血中消失。因此，为了让hGH的药效在患者中实质上发挥出来，需要对患者进行每周3次的hGH的肌肉内给药，或者对患者每天进行hGH的皮下给药。这样频繁的给药成为患者的负担。因此，如果能通过增加hGH在血浆中的稳定性、延长半衰期来减少对患者的hGH给药次数，则可减轻患者的负担，是优选的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特表平7-503368号公报
专利文献2：日本专利特开平3－178998号公报
专利文献3：日本专利特表平7-503844号公报
专利文献4：日本专利特表2003-530838号公报
专利文献5：日本专利特表2005-514060号公报
专利文献6：日本专利特表2010-500031号公报
专利文献7：日本专利特开2011-015690号公报
专利文献8：日本专利特表2000-502901号公报
专利文献9：日本专利特表2008-518615号公报
专利文献10：日本专利特表2013-501036号公报
专利文献11：日本专利特表2013-518038号公报
非专利文献
非专利文献1：Brand S.等,Clin Chim Acta.136,197-202(1984)
非专利文献2：Brennan SO.等,Proc Natl Acad Sci USA.87,26-30(1990)
非专利文献3：Poznansky MJ.等,FEBS Letter.239,18-22(1988)
发明内容
发明所要解决的技术问题
在上述背景下，本发明的一个目的是提供可通过与所要的生理活性蛋白质(本说明书中也称为蛋白质(A))结合来提高该生理活性蛋白质的血中稳定性的新型人血清白蛋白突变体。本发明的另一个目的是提供包含所要的蛋白质(例如生长激素)和与之连接的该人血清白蛋白突变体的人血清白蛋白突变体连接蛋白质。本发明的又一个目的是提供通过使所要的蛋白质与该人血清白蛋白突变体连接来提高该蛋白质的血中稳定性的方法。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人在针对上述目的的研究中进行了反复探讨，结果发现，使与由585个氨基酸构成的普通人血清白蛋白相比、其N末端第320个氨基酸残基的精氨酸被苏氨酸置换的氨基酸序列构成的突变体(人血清白蛋白突变体)与人生长激素(hGH)连接，将所得的化合物(人血清白蛋白突变体连接hGH)给药至机体时，与原本的人生长激素相比显示出显著更高的血中稳定性，并继续进行进一步探讨而完成了本发明。即，本发明提供以下的技术方案。
1.一种人血清白蛋白突变体，其包含相对于序列编号3所示的氨基酸序列有10个以下的氨基酸残基缺失和/或有10个以下的氨基酸残基被置换的氨基酸序列，该氨基酸序列中，序列编号3所示的氨基酸序列的N末端第318个天冬酰胺残基和第320个苏氨酸残基保持着在这2个残基间经由脯氨酸以外的单个氨基酸残基(X)通过肽键连接的状态。
2.如上述1所述的人血清白蛋白突变体，其中，该氨基酸残基(X)为酪氨酸。
3.如上述2所述的人血清白蛋白突变体，其由序列编号3所示的氨基酸序列构成。
4.一种人血清白蛋白突变体，其中，相对于上述1～3中任一项所述的人血清白蛋白突变体的氨基酸序列，除了序列编号3所示的氨基酸序列的N末端第318个～第320个所对应的位置的序列部分以外，增加了10个以下的氨基酸残基，并且与序列编号2所示的氨基酸序列不同。
5.一种人血清白蛋白突变体，其中，相对于上述1～3中任一项所述的人血清白蛋白突变体的氨基酸序列，在N末端或C末端增加了10个以下的氨基酸残基，并且与序列编号2所示的氨基酸序列不同。
6.一种人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含上述1～5中任一项所述的人血清白蛋白突变体的氨基酸序列，所述第二多肽链包含与所述第一多肽链连接的其它蛋白质(A)的氨基酸序列。
7.如上述6所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，
(a)该第一多肽链的N末端与该第二多肽链的C末端、或者
(b)该第一多肽链的C末端与该第二多肽链的N末端
经由肽键连接。
8.如上述7所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质，其中，该经由肽键的连接包括与接头形成的肽键。
9.如上述8所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该接头由1～50个氨基酸残基构成。
10.如上述8所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该接头由1～6个氨基酸残基构成。
11.如上述8所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质，其中，该接头选自Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、序列编号4、序列编号5和序列编号6所示的氨基酸序列。
12.如上述8所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该接头以氨基酸序列Gly-Ser表示。
13.如上述6～12中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该蛋白质(A)在给药至机体时显示出生理活性。
14.如上述6～13中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该蛋白质(A)选自α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白质、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、硫酸乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、包括CLN1～10的溶酶体酶、PD-1配体、骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素、催乳素、胃动素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促黑色素细胞激素(MSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、甲状旁腺激素(PTH)、血小板生成素、干细胞因子(SCF)、瘦素、血管加压素、催产素、降钙素、胰高血糖素、胃泌素、促胰液素、促胰酶素、胆囊收缩素、血管紧张素、血管他丁、内皮他丁、人胎盘催乳素(HPL)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、脑啡肽、内啡肽、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、白细胞介素2、胸腺生成素、胸腺刺激素、胸腺体液因子(THF)、血清胸腺因子(FTS)、胸腺素、胸腺因子X、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、尿激酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、强啡肽、铃蟾肽、神经降压素、雨蛙肽、缓激肽、天冬酰胺酶、激肽释放酶、P物质、神经生长因子(NGF)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3、神经营养因子4/5、神经营养因子6、神经调节蛋白1、激活素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、超氧化物歧化酶(SOD)、盐酸溶菌酶、多粘菌素B、粘菌素、短杆菌肽、杆菌肽、抑胃肽(GIP)、血管活性肠肽(VIP)、血小板衍生生长因子(PDGF)、生长激素释放因子(GRF)、表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素、生长激素抑制素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、20K生长激素、22K生长激素、以及它们的盐或突变体。
15.如上述6～12中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该蛋白质(A)是22K生长激素。
16.如上述6～12中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该蛋白质(A)是20K生长激素。
17.如上述15所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其由序列编号11所示的氨基酸序列构成。
18.如上述16所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其由序列编号12所示的氨基酸序列构成。
19.一种药物，其含有上述6～18中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)作为有效成分。
20.如上述19所述的药物，其是选自生长激素缺乏性侏儒症、特纳综合征中的侏儒症、由慢性肾功能衰竭引起的侏儒症、普拉德-威利综合征中的侏儒症、软骨营养障碍中的侏儒症、及SGA性侏儒症(所有这些均不伴有骺线闭合)、以及成人生长激素缺乏症、由AIDS引起的疲劳、及由厌食症引起的疲劳的疾病的治疗剂。
21.一种DNA，其包含编码上述1～5中任一项所述的人血清白蛋白突变体的基因。
22.一种DNA，其包含编码上述6～18中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)的基因。
23.一种表达载体，其包含上述21或22所述的DNA而成。
24.一种哺乳类细胞，其用上述23所述的载体进行了转化。
25.一种人血清白蛋白突变体或人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其通过将上述24所述的哺乳类细胞在无血清培养基中培养而得。
发明的效果
通过本发明，可提高欲作为医药品给药至动物(包括人)的具有生理活性的所要的生理活性蛋白质的血中稳定性。因此，可提高这些生理活性蛋白质的药效，也可实现其药效的持续时间的延长。此外，藉此也可减少这些生理活性蛋白质的给药量和给药频度，可提高患者的QOL，并且也有助于防止由以往的频繁的给药引发的感染和医疗事故。
附图说明
图1是表示pE-neo载体的构建方法的流程图。
图2是表示pE-hygr载体的构建方法的流程图。
图3-1是表示pE-IRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图3-2是表示pE-IRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图3-3是表示pE-IRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图3-4是表示pE-IRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图3-5是表示pE-IRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图3-6是表示pE-IRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图3-7是表示pE-IRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图3-8是表示pE-IRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图3-9是表示pE-IRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图4是表示pE-mIRES-GS-puro的构建方法的流程图。
图5是表示使用BaF3/hGHR细胞的HSA-hGH融合蛋白质的细胞增殖活性的测定结果的图。纵轴表示490nm的吸光度，横轴表示各标本的浓度(nM)。竖线表示标准偏差。
图6是表示使用食蟹猴的HSA-hGH融合蛋白质的药物动力学分析的结果的图。纵轴表示食蟹猴血浆中的HSA-hGH融合蛋白质的浓度(ng/mL)，横轴表示HSA-hGH融合蛋白质的给药后的经过时间(小时)。图中的竖线表示标准偏差。
图7是表示使用食蟹猴的HSA-hGH融合蛋白质的药效分析的结果的图。纵轴表示将HSA-hGH融合蛋白质的给药前的浓度设为100％时的、食蟹猴血浆中的IGF-1的浓度(％)，横轴表示HSA-hGH融合蛋白质的给药后的经过时间(天)。图中的竖线表示标准偏差。
具体实施方式
本说明书中，单独言及“人血清白蛋白”或“HSA”时，除了序列编号1所示的由585个氨基酸残基构成的普通野生型人血清白蛋白外，只要具有与血中的内源性物质以及药剂等外源性物质结合来对它们进行搬运的功能等作为普通野生型人血清白蛋白的功能，则也包括HSA突变体，不作特意区分，该HSA突变体相当于相对于序列编号1所示的氨基酸序列有1个或多个氨基酸残基发生了置换、缺失和/或增加(本说明书中，氨基酸残基的“增加”是指在序列的末端或内部追加残基)的氨基酸序列。将氨基酸残基用其它氨基酸残基置换的情况下，置换的氨基酸残基的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。使氨基酸残基缺失的情况下，缺失的氨基酸残基的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。例如，序列编号1所示的氨基酸序列的N末端或C末端的氨基酸残基缺失的、由584个氨基酸残基构成的突变体也包括在人血清白蛋白的范畴内。此外，这些氨基酸残基的置换和缺失也可以组合。还可以在普通野生型HSA或其突变体的氨基酸序列中或者该氨基酸序列的N末端侧或C末端侧增加1个或多个氨基酸残基(“增加”是指在序列的末端或内部追加残基)。此时，增加的氨基酸残基的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。
作为组合引入了氨基酸的置换、缺失和增加这3种突变中的至少2种突变的HSA的突变体，优选具有相对于序列编号1所示的氨基酸序列进行了0～10个氨基酸残基的缺失、0～10个氨基酸残基到其它氨基酸残基的置换、以及0～10个氨基酸残基的增加的氨基酸序列的突变体。更优选地，相对于序列编号1所示的氨基酸序列，这些缺失、置换和/或增加的氨基酸残基的个数分别优选为5个以下，更优选为3个以下。
本发明中，“人血清白蛋白Redhill”(HSA-Redhill)的用语是指由序列编号2所示的586个氨基酸残基构成的、人血清白蛋白的变异体。人血清白蛋白Redhill相当于相对于序列编号1所示的由585个氨基酸构成的野生型人血清白蛋白的氨基酸序列、N末端第320个氨基酸残基不是丙氨酸而是苏氨酸、且N末端上增加了一个精氨酸残基的氨基酸序列。通过该丙氨酸到苏氨酸的置换，白蛋白Redhill的氨基酸序列中产生以Asn-Tyr-Thr表示的序列部分，该序列部分中的Asn(天冬酰胺)残基被N-连接糖基化。因此，白蛋白Redhill与普通野生型白蛋白(序列编号1)相比，观察到的分子量要大2.5kDa左右。
本发明中，“人血清白蛋白突变体”(HSA突变体)的用语是指相对于普通野生型HSA(序列编号1)的上述突变体，但序列编号2所示的变异体(HSA-Redhill)除外。本发明中优选的HSA突变体除了序列编号3所示的突变体外，只要具有与血中的内源性物质以及药剂等外源性物质结合来对它们进行搬运的功能等作为普通野生型人血清白蛋白的功能，则也包括具有相对于序列编号3所示的氨基酸序列有1个或多个氨基酸残基发生了到其它氨基酸残基的置换、缺失或增加的氨基酸序列的突变体，该氨基酸序列中，序列编号3所示的氨基酸序列的N末端第318个天冬酰胺残基和第320个苏氨酸残基保持着在这2个残基间经由脯氨酸以外的单个氨基酸残基(X)通过肽键连接的状态。将该氨基酸序列中的氨基酸残基用其它氨基酸残基置换的情况下，置换的氨基酸残基的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。使氨基酸残基缺失的情况下，缺失的氨基酸残基的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。例如，也可以是序列编号3所示的氨基酸序列的N末端或C末端的氨基酸残基缺失的、由584个氨基酸残基构成的突变体。此外，这些氨基酸残基的置换和缺失也可以组合。还可以在这些突变体的氨基酸序列中或者该氨基酸序列的N末端侧或C末端侧增加1个或多个氨基酸残基。即，可以相对于序列编号3所示的氨基酸序列组合引入氨基酸的置换、缺失和增加这3种突变中的至少2种突变，进行0～10个氨基酸残基的缺失、0～10个氨基酸残基到其它氨基酸残基的置换、以及0～10个氨基酸残基的增加。但是，序列编号3所示的氨基酸序列的N末端第318～320个氨基酸残基必须是天冬酰胺-X-苏氨酸(“X”是脯氨酸以外的氨基酸残基)，优选是天冬酰胺-酪氨酸-苏氨酸。
本发明的各种HSA突变体与普通野生型HSA比较时的各突变的位置及其形式(缺失、置换、增加)可通过两种HSA的氨基酸序列的比对容易地确认。
下述实施例中制备的人血清白蛋白突变体(本发明的HSA突变体的典型的一例)相对于由585个氨基酸构成的野生型人血清白蛋白的氨基酸序列(序列编号1)，仅在N末端第320个氨基酸残基不是丙氨酸而是苏氨酸这一点上有所不同(序列编号3)。通过该不同，可在该HSA突变体(记作“HSA(A320T)”)的氨基酸序列中产生以Asn-Tyr-Thr表示的序列部分，该序列部分中的Asn(天冬酰胺)残基被N-连接糖基化。
本发明的HSA突变体可通过制备整合有编码本发明的HSA突变体的DNA的表达载体，用该表达载体转化宿主细胞，对该细胞进行培养，从而以重组蛋白质的形式制备。
本发明中，作为人血清白蛋白突变体的连接对象的具有生理活性的蛋白质(本说明书中也称为“蛋白质(A)”)是指血清白蛋白(无论是否是突变体)以外的具有生理活性的蛋白质。此外，这里的“生理活性”是指作用于基体而带来某些特定的生理变化的能力，例如包括各种酶(例如溶酶体酶群)、肽激素(蛋白质激素)、神经递质、生长因子、信号传导因子等参与各种生理调节(促进、抑制)的蛋白质。
本说明书中，“人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)”或“HSA突变体连接蛋白质(A)”的用语是指连接有本发明的HSA突变体的蛋白质(A)，其是具有两者的各氨基酸序列的多肽彼此连接而得的化合物。这里，这些多肽的“连接”不仅包括一方的N末端与另一方的C末端之间直接通过肽键连接的情况，也包括两条多肽经由接头间接地结合的情况。
这里，“接头”是位于上述2条多肽之间、通过共价键将两者连接的结构部分，不来源于本发明的HSA突变体和作为其连接对象的蛋白质(A)的任一者的末端。接头可以是与两条多肽通过肽键结合的单个氨基酸残基或由2个以上的氨基酸残基构成的肽链部分(肽接头)，本说明书中将该由1个以上的氨基酸残基构成的接头一并称为“肽接头”。本发明中，接头也可以是肽接头以外的作为2价基团将HSA突变体与蛋白质(A)之间通过共价键连接的接头部分，本说明书中将其称为“非肽接头”。此外，本说明书中，言及HSA突变体与蛋白质(A)“经由肽键”连接时，包括两者直接通过肽键连接的情况和两者通过与肽接头的结合而连接的情况。另外，本说明书中，HSA突变体与蛋白质(A)直接或经由肽接头结合的情况下，该化合物、即“HSA突变体连接蛋白质(A)”也称为“HSA突变体融合蛋白质(A)”。
本发明的HSA突变体与蛋白质(A)经由肽接头连接时，该接头优选由1～50个、更优选由1～17个、进一步优选由1～10个、更进一步优选由1～6个氨基酸残基构成，例如由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个或25～29个氨基酸构成，还例如仅由1个氨基酸残基、或由2个、3个、5个、6个或20个氨基酸残基构成。只要通过肽接头连接的HSA突变体部分能保持作为HSA的功能且蛋白质(A)部分也能在生理条件下发挥出蛋白质(A)的生理活性，则构成肽接头的氨基酸残基或氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成。作为肽接头的优选例子，可例举由Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列编号4)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列编号5)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列编号6)构成的肽接头，以及包含这些氨基酸序列的肽接头。具有这些氨基酸序列中的任意一种连续2～10次或2～5次的序列的肽接头也可以适合用作肽接头，此外，具有这些氨基酸序列中的任意两种以上组合起来连续1～10次或2～5次的序列的肽接头也可以适合用作肽接头。作为这些氨基酸序列的任意两种以上组合而成的肽接头的优选者，可例举包含在氨基酸序列Gly-Ser之后有连续3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列编号5)的共计20个氨基酸序列的肽接头。
作为将2种不同的多肽连接的方法，例如常规的是在编码一方的多肽的基因的下游在框内结合编码另一方的多肽的基因，制备整合有所得DNA的表达载体，用该表达载体转化宿主细胞，对该细胞进行培养，从而以重组融合蛋白质的形式进行表达的方法，可以在本发明中采用。
通过让转化细胞表达重组体来产生HSA突变体融合蛋白质(A)的情况下，可获得包含蛋白质(A)的氨基酸序列的多肽连接在包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的N末端或C末端中的任一处的形式的融合蛋白质。
使包含蛋白质(A)的氨基酸序列的多肽连接在包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的N末端侧的情况下，在编码包含蛋白质(A)的氨基酸序列的多肽的基因的下游在框内连接编码包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的基因，使用整合有所得DNA的表达载体。使2条多肽经由肽接头间接地连接的情况下，在编码2条多肽的基因之间在框内插入编码该接头的DNA序列。
使包含蛋白质(A)的氨基酸序列的多肽连接在包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的C末端侧的情况下，在编码包含蛋白质(A)的氨基酸序列的多肽的基因的上游在框内连接编码包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的基因，使用整合有所得DNA的表达载体。使2条多肽经由肽接头间接地连接的情况下，在编码2条多肽的基因之间在框内插入编码该接头的DNA序列。
为了让宿主细胞产生HSA突变体或HSA突变体融合蛋白质(A)，向宿主细胞内导入整合有编码它们之中的任一者的DNA的表达载体。可以用于该目的的宿主细胞只要能通过导入这种表达载体而表达本发明的HSA突变体或HSA突变体融合蛋白质(A)即可，无特别限定，可以是哺乳动物细胞、酵母、植物细胞、昆虫细胞等真核生物细胞、大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞中的任一种，特别优选哺乳动物细胞。但是，以经糖链修饰的蛋白质(A)的形式进行表达的情况下，宿主细胞选自哺乳动物细胞、酵母、植物细胞、昆虫细胞等真核生物细胞。通过在真核生物细胞中进行HSA突变体融合蛋白质(A)的表达，通过普通野生型HSA的第320个氨基酸残基变成苏氨酸而产生的以Asn-Tyr-Thr表示的序列部分的Asn残基或以Asn-X-Thr(“X”是脯氨酸以外的氨基酸残基)表示的序列中的Asn残基被N-连接糖基化。
使用哺乳动物细胞作为宿主细胞的情况下，对该哺乳动物细胞的种类没有特别限定，优选来源于人、小鼠、中国仓鼠的细胞，特别优选来源于中国仓鼠卵巢细胞的CHO细胞或来源于小鼠骨髓瘤的NS/0细胞。此时，用于整合并表达编码本发明的HSA突变体或HSA突变体融合蛋白质(A)的DNA片段的表达载体只要在导入哺乳动物细胞内时能进行该基因的表达即可，可以无特别限定地使用。整合在表达载体中的该基因配置于能在哺乳动物细胞内调节基因的转录频度的DNA序列(基因表达调控位点)的下游。作为本发明中可以使用的基因表达调控位点，可例举例如来源于巨细胞病毒的启动子、SV40早期启动子、人延伸因子-1α(EF-1α)启动子、人泛素C启动子等。
导入有这种表达载体的哺乳动物细胞可表达整合在表达载体中的蛋白质，但其表达量根据各种不同的细胞而不同，不是一律相同的。因此，为了高效地生产本发明的HSA突变体或HSA突变体融合蛋白质(A)，需要进行从导入有表达载体的哺乳动物细胞中筛选这些蛋白质的表达水平高的细胞的步骤。为了进行该筛选步骤，在表达载体中整合起到筛选标记物作用的基因。
作为筛选标记物，最常用的是分解嘌呤霉素、新霉素等药剂的酶(耐药性标记物)。哺乳动物细胞通常在一定浓度以上的这些药剂的存在下死亡。但是，导入有整合了耐药性标记物基因的表达载体的哺乳动物细胞可通过表达出的耐药性标记物来分解上述药剂，使其无毒化或减毒化，因此在上述药剂的存在下也能够生存。如果将整合有耐药性标记物作为筛选标记物的表达载体导入哺乳动物细胞，在含有与该耐药性标记物相对应的药剂的筛选培养基中，一边逐渐提高该药剂的浓度一边持续进行培养，则可获得在更高浓度药剂的存在下也能够增殖的细胞。由此筛选出的细胞中，不仅是耐药性标记物，一般来说整合在表达载体中的编码目标蛋白质的基因的表达量也增加，其结果是，该蛋白质的表达水平高的细胞被筛选出来。
此外，作为筛选标记物，也可使用谷氨酰胺合成酶(GS)。谷氨酰胺合成酶是由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。如果将哺乳动物细胞在含有谷氨酰胺合成酶的抑制剂、例如甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)且不含谷氨酰胺的筛选培养基中培养，则细胞通常会死亡。但是，如果将整合有谷氨酰胺合成酶作为筛选标记物的表达载体导入哺乳动物细胞，则该细胞中的谷氨酰胺合成酶的表达水平升高，因此在更高浓度MSX的存在下也能够增殖。此时，如果一边逐渐提高MSX的浓度一边持续进行培养，则可获得在更高浓度MSX的存在下也能够增殖的细胞。由此筛选出的细胞中，不仅是谷氨酰胺合成酶，一般来说整合在表达载体中的编码目标蛋白质的基因的表达量也增加，其结果是，该蛋白质的表达水平高的细胞被筛选出来。
此外，作为筛选标记物，也可使用二氢叶酸还原酶(DHFR)。使用DHFR作为筛选标记物的情况下，将导入有表达载体的哺乳动物细胞在含有甲氨蝶呤、氨基蝶呤等DHFR抑制剂的筛选培养基中培养。如果一边逐渐提高DHFR抑制剂的浓度一边持续进行培养，则可获得在更高浓度DHFR抑制剂的存在下也能够增殖的细胞。由此筛选出的细胞中，不仅是DHFR，一般来说整合在表达载体中的编码目标蛋白质的基因的表达量也增加，其结果是，该蛋白质的表达水平高的细胞被筛选出来。
已知在编码目标蛋白质的基因的下游侧经由内部核糖体进入位点(IRES：internal ribosome entry site)配置有谷氨酰胺合成酶作为筛选标记物的表达载体(国际专利公报WO2012/063799、WO2013/161958)。这些文献中记载的表达载体特别适合用于本发明的HSA突变体或HSA突变体融合蛋白质(A)的制备。
例如，本发明的HSA突变体或HSA突变体融合蛋白质(A)的制备中可以适合使用一种用于表达目标蛋白质的表达载体，该表达载体包含第一基因表达调控位点以及位于其下游的编码该蛋白质的基因、位于更下游的内部核糖体进入位点、及位于再更下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且在上述第一基因表达调控位点或与之不同的另一个第二基因表达调控位点的下游还包含二氢叶酸还原酶基因或耐药性基因。该表达载体中，作为第一基因表达调控位点或第二基因表达调控位点，优选使用来源于巨细胞病毒的启动子、SV40早期启动子、人延伸因子-1α启动子(hEF-1α启动子)、人泛素C启动子，特别优选hEF-1α启动子。
此外，作为内部核糖体进入位点，优选使用来源于选自微小核糖核酸病毒科的病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒、牛肠道病毒、泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒、柯萨奇B病毒的病毒的基因组或者选自人免疫球蛋白重链结合蛋白基因、果蝇触角足基因、果蝇超双胸基因的基因的5’非翻译区的内部核糖体进入位点，特别优选来源于小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体进入位点。使用来源于小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体进入位点的情况下，除了野生型以外，也可以适合使用野生型的内部核糖体进入位点中所包含的多个起始密码子中的一部分被破坏了的内部核糖体进入位点。此外，该表达载体中，适合使用的耐药性基因优选为嘌呤霉素或新霉素抗性基因，更优选为嘌呤霉素抗性基因。
此外，本发明的HSA突变体或HSA突变体融合蛋白质(A)的制备中例如可以适合使用一种用于表达目标蛋白质的表达载体，该表达载体包含人延伸因子-1α启动子、位于其下游的编码该蛋白质的基因、位于更下游的来源于小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体进入位点、及位于再更下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且还包含在其它基因表达调控位点及位于其下游的二氢叶酸还原酶基因，其中，该内部核糖体进入位点是野生型的内部核糖体进入位点中所包含的多个起始密码子中的一部分被破坏了的内部核糖体进入位点。作为这种表达载体，可例举WO2013/161958中记载的表达载体。
此外，本发明的HSA突变体或HSA突变体融合蛋白质(A)的制备中例如可以适合使用一种用于表达目标蛋白质的表达载体，该表达载体包含人延伸因子-1α启动子、位于其下游的编码该蛋白质的基因、位于更下游的来源于小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体进入位点、及位于再更下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且还包含在其它基因表达调控位点及位于其下游的耐药性基因，其中，该内部核糖体进入位点是野生型的内部核糖体进入位点中所包含的多个起始密码子中的一部分被破坏了的内部核糖体进入位点。作为这种表达载体，可例举WO2012/063799中记载的pE-mIRES-GS-puro及WO2013/161958中记载的pE-mIRES-GS-mNeo。
在来源于野生型的小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体进入位点的3’末端存在着3个起始密码子(ATG)，包含这3个起始密码子的序列部分以序列编号7(5'-ATGataatATGgccacaaccATG-3'：起始密码子ATG以大写字母表示)表示。作为该序列部分中的起始密码子中的一部分被破坏了的内部核糖体进入位点，例如有序列编号8(5'-atgataagcttgccacaaccatg-3')所示者，上述pE-mIRES-GS-puro及pE-mIRES-GS-mNeo是具有包含序列编号8所示的序列的IRES的表达载体。
本发明中，将导入有整合了编码本发明的HSA突变体或HSA突变体连接蛋白质(A)的DNA片段的表达载体的哺乳动物细胞在筛选培养基中进行筛选培养，以筛选出这些蛋白质的表达水平高的细胞。
筛选培养中，使用DHFR作为筛选标记物的情况下，使筛选培养基中所含的DHFR抑制剂的浓度逐步升高。DHFR抑制剂是甲氨蝶呤的情况下，其最大浓度优选为0.25～5μM，更优选为0.5～1.5μM，进一步优选为约1.0μM。
使用GS作为筛选标记物的情况下，使筛选培养基中所含的GS抑制剂的浓度逐步升高。GS抑制剂是MSX的情况下，其最大浓度优选为100～1000μM，更优选为200～500μM，进一步优选为约300μM。此时，通常使用不含谷氨酰胺的培养基作为筛选培养基。
使用分解嘌呤霉素的酶作为筛选标记物的情况下，筛选培养基中所含的嘌呤霉素的最大浓度优选为3～30μg/mL，更优选为5～20μg/mL，进一步优选为约10μg/mL。
使用分解新霉素的酶作为筛选标记物的情况下，筛选培养基中所含的G418的最大浓度优选为0.1mg～2mg/mL，更优选为0.5～1.5mg/mL，进一步优选为约1mg/mL。
此外，作为用于哺乳动物细胞培养的培养基，筛选培养中所用的培养基、用于生产下述重组蛋白质的培养基(重组蛋白质生产用培养基)均可，只要是能培养哺乳动物细胞并使其增殖的培养基就可以无特别限定地使用，优选使用无血清培养基。HSA具有吸附血清中所含的成分的性质，所以使用含血清培养基来生产HSA的情况下，会获得吸附了血清中的杂质的HSA，因此需要在后续工序中除去该杂质。
本发明的HSA突变体或HSA突变体融合蛋白质(A)特别是指将表达这些蛋白质的细胞在无血清培养基中培养而得的蛋白质。通过使用无血清培养基，可减少HSA上的杂质的吸附量，因此可简化后续的纯化工序。
通过筛选培养而筛选出的重组蛋白质的表达水平高的细胞用于重组蛋白质的生产(重组蛋白质产生细胞)。重组蛋白质的生产通过将重组蛋白质产生细胞在重组蛋白质生产用培养基中培养来进行。该培养称为生产培养。
本发明中，作为用作重组蛋白质生产用培养基的无血清培养基，例如优选使用含有3～700mg/L的氨基酸、0.001～50mg/L的维生素类、0.3～10g/L的单糖类、0.1～10000mg/L的无机盐、0.001～0.1mg/L的微量元素、0.1～50mg/L的核苷、0.001～10mg/L的脂肪酸、0.01～1mg/L的生物素、0.1～20μg/L的氢化可的松、0.1～20mg/L的胰岛素、0.1～10mg/L的维生素B12、0.01～1mg/L的腐胺、10～500mg/L的丙酮酸钠、及水溶性铁化合物的培养基。根据需要，也可以在培养基中添加胸苷、次黄嘌呤、惯用的pH指示剂及抗生素等。
作为用作重组蛋白质生产用培养基的无血清培养基，也可以使用DMEM/F12培养基(DMEM和F12的混合培养基)作为基础培养基，这些各培养基是本领域技术人员公知的。作为无血清培养基，还可以使用包含碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、胰岛素、亚硒酸钠、二氨基丁烷、氢化可的松、硫酸亚铁、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸及聚乙烯醇的DMEM(HG)HAM改良型(R5)培养基。还可以使用市售的无血清培养基、例如CD OptiCHOTM培养基、CHO-S-SFMII培养基或CD CHO培养基(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific社)，原生命科技公司(ライフテクノロジーズ社))、IS cho-VTM培养基(欧文科技公司(IrvineScientific社))、EX-CELLTM302培养基或EX-CELLTM325-PF培养基(SAFC生物科技公司(SAFCBiosciences社))等作为基础培养基。
为了得到HSA突变体连接蛋白质(A)，也可以分别制备两种蛋白质，将各多肽用非肽接头或肽接头连接的方法。作为非肽接头的例子，可采用聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳质类及透明质酸、或者它们的衍生物或它们的组合。另一方面，肽接头是由通过肽键结合的1～50个氨基酸构成的肽链或其衍生物，其N末端和C末端分别与本发明的HSA突变体或所要的蛋白质中的任一者形成肽键，从而将本发明的HSA突变体和所要的蛋白质连接。
使用PEG作为非肽接头将本发明的HSA突变体与蛋白质(A)连接而成的蛋白质在特别记载时，称为HSA突变体PEG连接蛋白质(A)。HSA突变体PEG连接蛋白质(A)可通过如下方式制备：使HSA突变体与PEG结合(PEG化HSA突变体)，使其与蛋白质(A)结合；或者先使蛋白质(A)与PEG结合(PEG化生理活性蛋白质(A))，使其与HSA突变体结合。为了使PEG与HSA突变体或蛋白质(A)结合，可使用经碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯或醛等官能团修饰的PEG。这些导入PEG的官能团主要通过与本发明的HSA突变体及蛋白质(A)的氨基反应来使本发明的HSA突变体及蛋白质(A)共价结合。此时所用的PEG的分子量及形状无特别限定，其平均分子量(MW)优选为MW＝500～60000，更优选为MW＝500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的PEG可以适合作为非肽接头使用。
例如，PEG化HSA突变体可通过如下方式获得：将本发明的HSA突变体和具有醛基作为官能团的聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)按照HSA/(ALD-PEG-ALD)的摩尔比为11、12.5、15、110、120等的条件混合，向其中添加NaCNBH3等还原剂使其反应。接着，使上述PEG化HSA突变体在NaCNBH3等还原剂的存在下与蛋白质(A)反应，从而得到HSA突变体PEG连接蛋白质。反之，通过先使蛋白质(A)与ALD-PEG-ALD结合而制成PEG化蛋白质(A)、使其与本发明的HSA突变体结合，也能得到本发明的HSA突变体PEG连接蛋白质(A)。
与本发明的HSA突变体连接的蛋白质(A)优选在给药至机体时显示出生理活性的蛋白质，可根据需要选择。作为这样的蛋白质，可例举α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白质、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、硫酸乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、包括CLN1～10的溶酶体酶、PD-1配体、骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素、催乳素、胃动素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促黑色素细胞激素(MSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、甲状旁腺激素(PTH)、血小板生成素、干细胞因子(SCF)、瘦素、血管加压素、催产素、降钙素、胰高血糖素、胃泌素、促胰液素、促胰酶素、胆囊收缩素、血管紧张素、血管他丁、内皮他丁、人胎盘催乳素(HPL)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、脑啡肽、内啡肽、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、白细胞介素2、胸腺生成素、胸腺刺激素、胸腺体液因子(THF)、血清胸腺因子(FTS)、胸腺素、胸腺因子X、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、尿激酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、强啡肽、铃蟾肽、神经降压素、雨蛙肽、缓激肽、天冬酰胺酶、激肽释放酶、P物质、神经生长因子(NGF)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3、神经营养因子4/5、神经营养因子6、神经调节蛋白1、激活素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、超氧化物歧化酶(SOD)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、盐酸溶菌酶、多粘菌素B、粘菌素、短杆菌肽、杆菌肽、抑胃肽(GIP)、血管活性肠肽(VIP)、血小板衍生生长因子(PDGF)、生长激素释放因子(GRF)、表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素、生长激素抑制素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、20K生长激素、22K生长激素、以及它们的盐或突变体，但不限定于此。
本发明中，与HSA突变体连接的蛋白质(A)对其来源物种没有特别限定，但优选来源于哺乳动物的蛋白质，更优选来源于人、非洲绿猴等灵长类、小鼠、大鼠、中国仓鼠等啮齿类、兔、犬的蛋白质，特别优选来源于人的蛋白质。
本发明中，蛋白质(A)不限于野生型。即，也可以是相对于野生型的氨基酸序列有1个或多个氨基酸发生了置换、缺失和/或增加的突变体，该突变体除了保持蛋白质(A)原本的生理活性外，也与野生型的蛋白质(A)拮抗而起作用(这会对内源性的蛋白质(A)的作用造成影响)。可以发生置换、缺失和/或增加的氨基酸的个数对各种突变类型而言优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。这些氨基酸的置换、缺失和/或增加可以组合发生。
本发明的HSA突变体连接蛋白质(A)与未连接HSA突变体的原本的蛋白质(A)相比，血中的稳定性提高，半衰期延长。虽然会根据给药途径和给药量而有所变动，但通过皮下注射给药至食蟹猴时的血中半衰期(t1/2β)达到大约5小时以上，在血中极为稳定。例如，关于本发明的HSA突变体连接人生长激素的血中半衰期(t1/2β)，以0.5～10mg/kg的用量对雄性食蟹猴进行单次皮下给药时，血中半衰期(t1/2β)为5～40小时。
本发明的HSA突变体连接蛋白质(A)在给药至机体时，由于蛋白质(A)部分所显示出的活性，因此可以用作药物。这里，“机体”是指包括人在内的哺乳类、特别优选人的机体。
本发明的HSA突变体连接蛋白质(A)在血中的稳定性提高，因此即使是以往在血中不稳定、给药后迅速分解、无法发挥足够的药效的蛋白质(A)，通过使其与本发明的HSA突变体连接，也可使其在血中稳定化而发挥其生理活性，开创出作为药物的开发道路。
此外，即使是以往可以用作药物的蛋白质(A)，通过使其与本发明的HSA突变体连接，也可进一步提高血中的稳定性，以长期保持着活性的状态留在血中，因此可减少蛋白质(A)的给药频度或给药量。例如，需要每天给药的药物通过与本发明的HSA突变体连接，其给药频度可以是例如每隔3～30天进行给药。此外，该药物的给药量以摩尔比计可减少至例如1/3～1/100。
含有本发明的HSA突变体连接蛋白质(A)作为有效成分的药物可作为注射剂在静脉内、肌肉内、腹腔内或皮下给药。药物的给药途径根据其剂型、适应症等适当选择。这些注射剂能够以冷冻干燥制剂或水性液剂的形式提供。制成水性液剂时，可以制成填充于管瓶(vial)的形态，也能以预先填充于注射器的预灌装型制剂的形式提供。冷冻干燥制剂的情况下，在使用前溶解于水性介质将其复原后使用。
作为与本发明的HSA突变体连接的蛋白质(A)之一，可例举人生长激素。人生长激素主要有分子量不同的两种，即22K人生长激素和20K人生长激素。22K生长激素是具有序列编号9所示的氨基酸序列、由191个氨基酸构成的蛋白质。通常，言及“人生长激素(或hGH)”时，是指该22K生长激素，但在本说明书中，单独言及“人生长激素(或hGH)”时，包括22K人生长激素和20K人生长激素两者。
本说明书中，单独言及“22K人生长激素(或22KhGH)”时，除了具有序列编号9所示的氨基酸序列的野生型22KhGH外，也包括相对于该野生型22KhGH有1个或多个氨基酸发生了置换、缺失和/或增加、且具有生长促进活性的22KhGH突变体。可以发生置换、缺失和/或增加的氨基酸的个数对各种突变类型而言优选为1～8个，更优选为1～4个，进一步优选为1～2个。
野生型20K人生长激素相当于构成野生型22K生长激素(序列编号9)的191个氨基酸中、从N末端数起第32个～第46个的15个氨基酸缺失了的产物，其氨基酸序列由176个氨基酸构成(序列编号10)，是具有生长促进活性的蛋白质。但是，本说明书中，单独言及“20K人生长激素(或20KhGH)”时，除了序列编号10所示的野生型20KhGH外，也包括相对于该序列有1个或多个氨基酸发生了置换、缺失和/或增加、且具有生长促进活性的20KhGH突变体。可以发生置换、缺失和/或增加的氨基酸的个数对各种突变类型而言优选为1～8个，更优选为1～4个，进一步优选为1～2个。
含有使用导入有hGH基因的大肠杆菌以重组蛋白质的形式制备的分子量约22KD的hGH作为有效成分的制剂(hGH制剂)，作为生长激素缺乏性侏儒症、特纳综合征中的侏儒症、不伴有骺线闭合的SGA性侏儒症、由慢性肾功能衰竭引起的侏儒症、普拉德-威利综合征中的侏儒症、及软骨营养障碍中的侏儒症的治疗剂广泛地应用于临床。hGH制剂通过给药至皮下或肌肉内，成分hGH在血中循环，通过其生长促进活性而发挥促进患者的生长的效果。此外，hGH制剂也作为成人生长激素缺乏症的治疗剂广泛地应用于临床。在成人生长激素缺乏症的患者中观察到脂质代谢异常，而通过hGH制剂的给药，患者的脂质代谢等正常化，患者的QOL得到改善。生长激素也作为由AIDS引起的疲劳的治疗剂应用于临床。作为生长激素缺乏性侏儒症、成人生长激素缺乏症等的hGH制剂，例如有Growject(注册商标)。
本发明中，采用人生长激素作为人血清白蛋白突变体(mHSA)的连接对象蛋白质(A)者称为“人血清白蛋白突变体连接人生长激素”或“mHSA连接hGH”等，经由肽键连接的情况下，也特别称为“人血清白蛋白突变体融合人生长激素”、“mHSA融合hGH”等。
作为将包含本发明的HSA突变体的氨基酸序列的多肽与包含hGH的氨基酸序列的多肽连接的具体方法，例如常规的是在编码一方的多肽的基因的下游在框内结合编码另一方的多肽的基因，制备整合有所得DNA片段的表达载体，用该表达载体转化宿主细胞，对该细胞进行培养，从而以重组蛋白质的形式进行表达的方法，可以在本发明中采用。
通过让转化细胞以重组蛋白质的形式进行表达的方法来制备mHSA连接hGH时，包含hGH的氨基酸序列的多肽直接或经由接头间接地连接在包含本发明的HSA突变体的氨基酸序列的多肽的N末端侧或C末端侧中的任一处。
使包含hGH的氨基酸序列的多肽连接在包含本发明的HSA突变体的氨基酸序列的多肽的N末端侧的情况下，在编码包含hGH的氨基酸序列的多肽的基因的下游在框内结合编码包含本发明的HSA突变体的氨基酸序列的多肽的基因，使用整合有所得DNA片段的表达载体。使2条多肽经由肽接头间接地连接的情况下，在编码2条多肽的基因之间在框内配置编码该接头的DNA序列。
使包含hGH的氨基酸序列的多肽连接在包含本发明的HSA突变体的氨基酸序列的多肽的C末端侧的情况下，在编码包含hGH的氨基酸序列的多肽的基因的上游在框内结合编码包含本发明的HSA突变体的氨基酸序列的多肽的基因，使用整合有所得DNA片段的表达载体。使2条多肽经由肽接头间接地连接的情况下，在编码2条多肽的基因之间在框内配置编码该接头的DNA序列。
除此之外，作为将包含本发明的HSA突变体的氨基酸序列的多肽与包含hGH的氨基酸序列的多肽连接的方法，例如有以重组蛋白质的形式分别制备2条多肽、接着使这2条多肽经由非肽接头或肽接头连接的方法。作为非肽接头的例子，可采用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳质类及透明质酸、或者它们的衍生物或它们的组合。另一方面，肽接头是由通过肽键结合的1～50个氨基酸构成的肽链或其衍生物，其N末端和C末端分别与本发明的HSA突变体或所要的蛋白质中的任一者形成肽键，从而将本发明的HSA突变体和所要的蛋白质连接。
使用PEG作为非肽接头将HSA突变体与蛋白质(A)连接而成的蛋白质在明确记载接头时，称为HSA突变体PEG连接蛋白质(A)。即，选择hGH作为蛋白质(A)的情况下，称为HSA突变体PEG连接hGH。HSA突变体PEG连接hGH可通过如下方式制备：先使HSA突变体与PEG结合(PEG化HSA突变体)，使其与hGH结合；或者先使hGH与PEG结合(PEG化hGH)，使其与HSA突变体结合。为了使PEG与本发明的HSA突变体或hGH结合，可使用经碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯或醛等官能团修饰的PEG。这些导入PEG的官能团主要通过与本发明的HSA突变体及hGH分子的氨基反应来使本发明的HSA突变体及hGH共价结合。此时所用的PEG的分子量及形状无特别限定，其平均分子量(MW)优选为MW＝500～60000，更优选为MW＝500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的PEG可以适合作为非肽接头使用。
例如，PEG化HSA突变体可通过如下方式获得：将本发明的HSA突变体和具有醛基作为官能团的聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)按照HSA/(ALD-PEG-ALD)的摩尔比为11、12.5、15、110、120等的条件混合，向其中添加NaCNBH3等还原剂使其反应。接着，使上述PEG化HSA突变体在NaCNBH3等还原剂的存在下与hGH反应，从而得到HSA突变体PEG连接hGH。反之，通过先使hGH与ALD-PEG-ALD结合而制成PEG化hGH、使其与HSA突变体结合，也能得到本发明的HSA突变体PEG连接hGH。
本发明中，作为mHSA连接(融合)hGH的优选的一例，可例举将具有序列编号9所示的氨基酸序列的22K人生长激素的C末端不经由接头、而是通过肽键连接在具有序列编号3所示的氨基酸序列的HSA(A320T)的N末端而成的、具有序列编号11所示的氨基酸序列的mHSA连接hGH。本发明中，将由HSA(A320T)和22KhGH依次连接而成的产物称为“22K人生长激素-mHSA”或“22KhGH-mHSA”。同样地，将22K人生长激素的N末端不经由接头、而是通过肽键结合在HSA(A320T)的C末端而成的产物称为“mHSA-22K人生长激素”或“mHSA-22KhGH”。
此外，将具有序列编号10所示的氨基酸序列的20K人生长激素的C末端不经由接头、而是通过肽键连接在具有序列编号3所示的氨基酸序列的人血清白蛋白(A320T)的N末端而成的、具有序列编号12所示的氨基酸序列的mHSA连接hGH称为“20K人生长激素-mHSA”或“20KhGH-mHSA”。同样地，将20K人生长激素的N末端不经由接头、而是通过肽键连接在人血清白蛋白(A320T)的C末端而成的产物称为“mHSA-20K人生长激素”或“mHSA-20KhGH”。
本发明的HSA突变体连接人生长激素的特征是，通过皮下注射给药至食蟹猴时的血中半衰期(t1/2β)达到大约10小时以上，在血中极为稳定。虽然会根据给药量而有所变动，但例如以4mg/kg的用量对雄性食蟹猴进行单次皮下给药时，mHSA-22KhGH及22KhGH-mHSA的血中半衰期(t1/2β)为20～35小时。
本发明的HSA突变体连接人生长激素可作为药物使用。通过使人生长激素和HSA突变体的机体内功能产生协同作用，也可以作为药物使用。
本发明的HSA突变体连接人生长激素在血中极为稳定。因此，通过本发明，可使人生长激素在血中稳定化，以长时间保持着活性的状态留在血中，可减少作为药物使用时的人生长激素的给药频度或给药量。例如，需要每天给药的药物通过与本发明的HSA突变体连接，其给药频度可以是例如每隔3～30天进行给药。此外，该药物的给药量以摩尔比计可减少至1/3～1/100。
本发明的HSA突变体连接人生长激素可作为以生长激素缺乏性侏儒症、特纳综合征中的侏儒症、由慢性肾功能衰竭引起的侏儒症、普拉德-威利综合征中的侏儒症、软骨营养障碍中的侏儒症、SGA性侏儒症(所有这些均不伴有骺线闭合)、成人生长激素缺乏症、由AIDS引起的疲劳、及由厌食症引起的疲劳作为对象疾病的药物使用，但不限定于此，可以作为通过使生长激素所具有的软骨形成促进、蛋白质同化促进等生长促进活性、身体组成及脂质代谢改善作用等生理活性长期作用就能改善症状的疾病的治疗剂使用。
将mHSA-22KhGH给予不伴有骺线闭合的生长激素缺乏性侏儒症的患者时，每1次的优选给药量为0.01～0.7mg/Kg体重。将mHSA-22KhGH给予不伴有骺线闭合的特纳综合征中的侏儒症的患者时，每1次的优选给药量为0.015～1.4mg/Kg体重。将mHSA-22KhGH给予不伴有骺线闭合的由慢性肾功能衰竭引起的侏儒症的患者时，每1次的优选给药量为0.01～1.4mg/Kg体重。将mHSA-22KhGH给予不伴有骺线闭合的普拉德-威利综合征中的侏儒症的患者时，每1次的优选给药量为0.012～0.98mg/Kg体重。将mHSA-22KhGH给予不伴有骺线闭合的软骨营养障碍中的侏儒症的患者时，每1次的优选给药量为0.015～1.4mg/Kg体重。将mHSA-22KhGH给予不伴有骺线闭合的SGA性侏儒症的患者时，每1次的优选给药量为0.012～1.9mg/Kg体重。将mHSA-22KhGH给予成人生长激素缺乏症的患者时，每1次的优选给药量为0.001～0.34mg/Kg体重。将mHSA-22KhGH给予由AIDS引起疲劳的患者时，每1次的优选给药量为0.005～0.4mg/Kg体重。但是，给药量应当根据患者的检查结果等适当改变。此外，这些疾病的优选的mHSA-22KhGH给药间隔为每隔7～30天1次，应当根据患者的检查结果等适当改变为每隔7～14天、每隔10～20天或每隔14～21天1次。此外，给药方法优选为皮下注射、肌肉内注射或静脉注射，更优选为皮下注射或肌肉内注射。
含有本发明的HSA突变体连接蛋白质作为有效成分的药物可作为注射剂在静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下或脑室内给药。这些注射剂能够以冷冻干燥制剂或水性液剂的形式提供。制成水性液剂时，可以制成填充于管瓶(vial)的形态，也能以预先填充于注射器的预灌装型制剂的形式提供。冷冻干燥制剂的情况下，在使用前溶解于水性介质将其复原后使用。
实施例
以下，参照实施例来对本发明进行更详细的说明，但并不表示本发明受到实施例的限定。
〔实施例1〕pE-mIRES-GS-puro的构建
将pEF/myc/nuc载体(英杰公司(インビトロジェン社))用限制酶(KpnI及NcoI)消化，切出包含EF-1α启动子及其第一内含子的DNA片段，将该DNA片段用T4DNA聚合酶进行平滑末端化处理。另外，将pCI-neo(英杰公司)用限制酶(BglII及EcoRI)消化，将包含CMV的增强子/启动子及内含子的区域切除后，用T4DNA聚合酶进行平滑末端化处理。在其中插入上述包含EF-1α启动子及其第一内含子的区域(平滑末端化处理后的产物)，构建成pE-neo载体(图1)。
将pE-neo载体用限制酶(SfiI及BstXI)消化，将包含新霉素抗性基因的约1kbp的区域切除(图2)。以pcDNA3.1/Hygro(+)(英杰公司)为模板，使用引物Hyg-Sfi5'(序列编号13)及引物Hyg-BstX3'(序列编号14)，通过PCR扩增潮霉素基因(图2)。将扩增的潮霉素基因用限制酶(SfiI及BstXI)消化，插入到上述pE-neo载体中，构建成pE-hygr载体(图2)。
将表达载体pPGKIH(Miyahara M.等,J.Biol.Chem.275,613-618(2000))用限制酶(XhoI及BamHI)消化，切出由包含来源于小鼠脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)、潮霉素抗性基因(Hygr基因)及小鼠磷酸甘油酸激酶(mPGK)的多聚腺苷酸化区域(mPGKpA)的碱基序列IRES-Hygr-mPGKpA(序列编号15：从5’末端起，由第1～6个碱基构成的区域为“XhoI位点”，由第120～715个碱基以及后续的第716～718个碱基(atg)构成的区域为“包含来源于小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体进入位点的碱基序列”，由包含该第716～718个碱基(atg)的第716～1741个碱基构成的区域为“编码潮霉素抗性基因的碱基序列”，由第1747～2210个碱基构成的区域为“包含小鼠磷酸甘油酸激酶(mPGK)的多聚腺苷酸化区域的碱基序列”，由3’末端的6个碱基(第2211～2216个碱基)构成的区域为“BamHI位点”)构成的DNA片段(另外，Hygr基因所对应的氨基酸序列以序列编号16表示)。将该DNA片段插入pBluescript SK(-)(Stratagene公司)的XhoI位点和BamHI位点之间，将其记作pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)(图3-1)。
以pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)为模板，使用引物IRES5'(序列编号17)及引物IRES3'(序列编号18)，通过PCR扩增包含EMCV的IRES的一部分的DNA片段。将该DNA片段用限制酶(XhoI及HindIII)消化，插入pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)的XhoI位点和HindIII位点之间，将其记作pBSK(NotI-IRES-Hygr-mPGKpA)(图3-2)。将pBSK(NotI-IRES-Hygr-mPGKpA)用限制酶(NotI及BamHI)消化，插入pE-hygr载体的NotI位点和BamHI位点之间，将其记作质粒pE-IRES-Hygr(图3-3)。
以表达载体pPGKIH为模板，使用引物mPGKP5'(序列编号19)及引物mPGKP3'(序列编号20)，通过PCR扩增由包含mPGK的启动子区域(mPGKp)的碱基序列(序列编号21：从5’末端起，第4～9个碱基为“BglII位点”，由后续的第10～516个碱基构成的区域为“包含小鼠磷酸甘油酸激酶基因的启动子区域的碱基序列”，由后续的第524～529个碱基构成的区域为“EcoRI位点”)构成的DNA片段。将该DNA片段用限制酶(BglII及EcoRI)消化，插入pCI-neo(普洛麦格公司(プロメガ社))的BglII位点和EcoRI位点之间，将其记作pPGK-neo(图3-4)。将pE-IRES-Hygr用限制酶(NotI及BamHI)消化，切出DNA片段(IRES-Hygr)，插入pPGK-neo的NotI位点和BamHI位点之间，将其记作pPGK-IRES-Hygr(图3-5)。
由CHO-K1细胞制备cDNA，以该cDNA为模板，使用引物GS5'(序列编号22)及引物GS3'(序列编号23)，通过PCR扩增包含GS基因的DNA片段。将该DNA片段用限制酶(BalI及BamHI)消化，插入pPGK-IRES-Hygr的BalI位点和BamHI位点之间，将其记作pPGK-IRES-GS-ΔpolyA(图3-6)。
以pCAGIPuro(Miyahara m.等,J.Biol.Chem.275,613-618(2000))为模板，使用引物puro5'(序列编号24)及引物puro3'(序列编号25)，通过PCR扩增由包含嘌呤霉素抗性基因(puro基因)的碱基序列(序列编号26：从5’末端起，由第2～7个碱基构成的区域为“AflII位点”，由后续的第8～607个碱基构成的区域为“编码嘌呤霉素抗性基因(puro基因)的碱基序列”，由紧接着的第608～619个碱基构成的区域为“BstXI位点”)构成的DNA片段(另外，puro基因所对应的氨基酸序列以序列编号27表示)。将该DNA片段用限制酶(AflII及BstXI)消化，插入表达载体pE-neo的AflII位点和BstXI位点之间，将其记作pE-puro(图3-7)。
以pE-puro为模板，使用引物SV40polyA5'(序列编号28)及引物SV40polyA3'(序列编号29)，通过PCR扩增包含SV40晚期多聚腺苷酸化区域的DNA片段。将该DNA片段用限制酶(NotI及HpaI)消化，插入表达载体pE-puro的NotI位点和HpaI位点之间，将其记作pE-puro(XhoI)(图3-8)。将pPGK-IRES-GS-ΔpolyA用限制酶(NotI及XhoI)消化，切出包含IRES-GS区域的DNA片段，将该DNA片段插入表达载体pE-puro(XhoI)的NotI位点和XhoI位点之间，将其记作pE-IRES-GS-puro(图3-9)。
以表达载体pE-IRES-GS-puro为模板，使用引物mIRES-GS5'(序列编号30)及引物mIRES-GS3'(序列编号31)，通过PCR扩增从EMCV的IRES起到GS为止的区域，对在EMCV的IRES的5’侧起的第2个起始密码子(atg)上加入突变而将其破坏的DNA片段进行扩增。以表达载体pE-IRES-GS-puro为模板，使用该DNA片段和上述引物IRES5'，通过PCR扩增包含从IRES起到GS为止的上述区域的DNA片段。将该DNA片段用限制酶(NotI及PstI)消化，将切出的DNA片段插入表达载体pE-IRES-GS-puro的NotI位点和PstI位点之间，制成哺乳动物细胞用的表达载体pE-mIRES-GS-puro(图4)。
〔实施例2〕HSA-22KhGH表达用载体的构建
使野生型HSA(序列编号1)的C末端与22KhGH的N末端融合而成的融合蛋白质HSA-22KhGH的氨基酸序列以序列编号32表示。该氨基酸序列中，第1～585个氨基酸残基相当于野生型成熟HSA的氨基酸序列(序列编号1)，第586～776个氨基酸残基相当于22KhGH的氨基酸序列。以化学方式合成具有序列编号33所示的碱基序列的DNA，该碱基序列包含编码HSA-22KhGH的基因(HSA-22KhGH基因)。该序列中，第11～82个碱基编码HSA的前导肽，第83～1837个碱基编码成熟型HSA，第1838～2410个碱基编码成熟型hGH。将该DNA用限制酶(MluI及NotI)消化，整合在实施例1中制备的pE-mIRES-GS-puro的MluI位点和NotI位点之间，从而构建成HSA-22KhGH表达用载体pE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH)。
〔实施例3〕mHSA-22KhGH表达用载体的构建
使HSA(A320T)(序列编号3)的C末端与22KhGH的N末端融合而成的、具有序列编号34所示的氨基酸序列的融合蛋白质记作mHSA-22KhGH。序列编号34所示的氨基酸序列中，第1～585个氨基酸残基相当于mHSA的氨基酸序列，第586～776个氨基酸残基相当于22KhGH的氨基酸序列。以实施例2中制备的pE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH)为模板，使用引物YA082(序列编号35)及引物YA083(序列编号36)，通过PCR扩增包含编码mHSA-22KhGH的基因的DNA片段。将该DNA片段自退火，构建成mHSA-22KhGH表达用载体pE-mIRES-GS-puro(mHSA-22KhGH)。
〔实施例4〕22KhGH-HSA表达用载体的构建
使22KhGH的C末端与野生型HSA(序列编号1)的N末端融合而成的、具有序列编号37所示的氨基酸序列的融合蛋白质记作22KhGH-HSA。序列编号37所示的氨基酸序列中，第1～191个氨基酸残基相当于22KhGH的氨基酸序列，第192～776个氨基酸残基相当于HSA的氨基酸序列。以化学方式合成具有序列编号38所示的碱基序列的DNA，该碱基序列包含编码22KhGH-HSA的基因(22KhGH-HSA基因)。该序列中，第11～88个碱基编码hGH的前导肽，第89～661个碱基编码成熟型hGH，第662～2416个碱基编码成熟型HSA。将该DNA用限制酶(MluI及NotI)消化，整合在实施例1中制备的pE-mIRES-GS-puro的MluI位点和NotI位点之间，从而构建成HSA-22KhGH表达用载体pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)。
〔实施例5〕22KhGH-mHSA表达用载体的构建
使22KhGH的C末端与HSA(A320T)(序列编号3)的N末端融合而成的、具有序列编号39所示的氨基酸序列的融合蛋白质记作22KhGH-mHSA。以实施例4中制备的pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)为模板，使用引物YA082(序列编号35)及引物YA083(序列编号36)，通过PCR扩增包含编码22KhGH-mHSA的基因的DNA片段。将该DNA片段自退火，构建成22KhGH-mHSA表达用载体pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)。
〔实施例6〕融合蛋白质表达细胞的制备
如下所述制备用于表达HSA-22KhGH、mHSA-22KhGH、22KhGH-HSA及22KhGH-mHSA的各融合蛋白质的细胞。使用Gene Pulser Xcell电穿孔系统(伯乐公司(Bio Rad社))，将实施例2～5中制备的HSA-22KhGH表达用载体pE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH)、mHSA-22KhGH表达用载体pE-mIRES-GS-puro(mHSA-22KhGH)、22KhGH-HSA表达用载体pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)及22KhGH-mHSA表达用载体pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)分别导入来源于中国仓鼠的卵巢的CHO-K1细胞。将导入有各表达载体的细胞用含有甲硫氨酸亚砜亚胺(西格玛公司(SIGMA社))及嘌呤霉素(西格玛公司)的CD OptiCHOTM培养基(赛默飞世尔科技公司)进行筛选培养，分别建立HSA-22KhGH表达细胞、mHSA-22KhGH表达细胞、22KhGH-HSA表达细胞及22KhGH-mHSA表达细胞。筛选培养时，使甲硫氨酸亚砜亚胺及嘌呤霉素的浓度逐步升高，最终使甲硫氨酸亚砜亚胺的浓度达到300μM、嘌呤霉素的浓度达到10μg/mL，从而使显示出更高的耐药性的细胞选择性地增殖。
将由此得到的HSA-22KhGH表达用细胞、mHSA-22KhGH表达用细胞、22KhGH-HSA及22KhGH-mHSA表达用细胞统称为HSA-hGH融合蛋白质表达细胞，将通过培养这些细胞而得的HSA与hGH的融合蛋白质统称为HSA-hGH融合蛋白质。
〔实施例7〕融合蛋白质表达细胞的培养
如下所述进行HSA-22KhGH表达细胞、mHSA-22KhGH表达细胞、22KhGH-HSA表达细胞及22KhGH-mHSA表达细胞的培养。在CD OptiCHOTM培养基(赛默飞世尔科技公司)中分别以300μM及10μg/mL的浓度添加甲硫氨酸亚砜亚胺和嘌呤霉素，配制成细胞培养用培养基。将实施例6中制备的各表达细胞分别以2×105个/mL的细胞密度添加至5mL的细胞培养用培养基中，在5％CO2的存在下于37℃培养。每隔5天，以2×105个/mL的细胞密度将细胞转移至新的培养用培养基，进行传代培养。
〔实施例8〕HSA-hGH融合蛋白质的纯化
如下所述进行HSA-22KhGH、mHSA-22KhGH、22KhGH-HSA及22KhGH-mHSA的纯化。将实施例7中传代培养的各表达细胞分别以2×105个/mL的密度悬浮于细胞培养用培养基中，以使总量达到240mL。将该细胞悬浮液加入8块直径15cm的培养皿中，每块培养皿为30mL，在5％CO2的存在下于37℃培养5天。培养结束后，回收培养基，用膜滤器(孔径0.22μm，密理博公司(Millipore社))过滤，制成培养上清。接着，在各培养上清中加入1M HEPES(pH8.0)，将pH调整至7.0～7.2。
在聚丙烯制的柱(Poly-PrepTM柱，伯乐公司)中填充5mL的结合有抗人生长激素抗体的树脂(Capture SelectTM抗hGH树脂，赛默飞世尔科技公司)，用柱体积的5倍容量的含有500mM NaCl的10mM HEPES缓冲液(pH7.5)使树脂平衡化。接着，将调整好pH的上述培养上清以约2.5mL/分钟的流速上柱，使HSA-hGH融合蛋白质分别吸附于树脂。接着，以相同的流速用柱体积的5倍容量的含有500mM NaCl的10mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗柱。接着，用柱体积的5倍容量的含有100mM NaCl的0.1M甘氨酸缓冲液(pH3.0)将HSA-hGH融合蛋白质分别从树脂上洗脱。回收含有HSA-hGH融合蛋白质的洗脱组分，立即添加7％(v/v)的1M HEPES缓冲液(pH8.0)。使用PierceTM BCA蛋白质试验试剂盒(赛默飞世尔科技公司)，以BSA作为标准物质来测定洗脱组分中所含的HSA-hGH融合蛋白质的浓度。
〔实施例9〕BaF3/hGHR细胞的制备
如下所述制备通过将人GH受体(hGHR)基因导入小鼠BaF3细胞而获得了GH依赖性增殖能力的BaF3/hGHR细胞。以具有序列编号40所示的碱基序列的hGHR ECD人工合成基因(编码hGHR的胞外结构域(Extra Cellular Domain)的hGHR基因的5’侧片段)为模板，使用引物YA034(序列编号41)及引物YA035(序列编号42)进行PCR。将所得PCR产物供至琼脂糖电泳，用QIAEX II(凯杰公司(QIAGEN社))纯化。将该DNA片段记作大引物。以来源于人肺的cDNA为模板，使用引物K708(序列编号43)及引物K709(序列编号44)进行PCR，扩增包含hGHR基因全长的DNA片段。将所得PCR产物供至琼脂糖电泳，用QIAEX II纯化。接着，以纯化好的包含hGHR基因全长的DNA片段为模板，使用上述大引物及引物K709(序列编号44)进行PCR，扩增包含编码在5’侧具有hGHR ECD人工合成基因序列的全长hGHR的基因的、具有序列编号45所示的碱基序列的DNA片段。将该DNA片段用限制酶(MluI及NotI)消化，整合在逆转录病毒载体pMX-II(Ono Y.,Oncogene.19.3050-8(2000))的MluI和NotI之间，将其记作hGHR表达用逆转录病毒载体(hGHR/pMX-II)。
使6×106个293细胞(大日本制药株式会社(大日本製薬社))悬浮于10mL的含10％FBS的DMEM培养基中，将其添加至细胞培养用10cm皿中，在5％CO2的存在下于37℃培养24小时。另外，这里所用的293细胞是用腺病毒的E1基因进行了转化的人胚胎肾细胞。
在500μL的Opti-MEMITM培养基(赛默飞世尔科技公司)中加入15μL的X-tremeGENE9 DNA转染试剂(罗氏公司(Roche社))并混合，向其中进一步加入5μg的逆转录病毒包装载体pCL-Eco(艾美捷公司(IMGENEX社))和5μg的hGHR/pMX-II并混合。将该混合液在室温下静置15分钟后，添加至上述的培养了293细胞24小时的10cm皿中。接着，将细胞在5％CO2的存在下于37℃培养24小时后，将培养基以3000rpm离心5分钟，回收上清。将回收的上清记作hGHR表达逆转录病毒液。
将WEHI-3细胞(理化学研究所)在含10％FBS的RPMI1640培养基中培养后，将培养基以3000rpm离心5分钟，回收上清。在2mL的hGHR表达逆转录病毒液中加入500μL的WEHI-3细胞的培养上清和2.5mL的含10％FBS的RPMI1640培养基并混合。将该混合液添加至2×106个IL-3依赖性细胞株BaF3细胞(理化学研究所)，使细胞悬浮。将该细胞悬浮液转移至75cm2培养瓶中，将细胞在5％CO2的存在下于37℃培养8小时，进一步加入500μL的WEHI-3细胞的培养上清和2.5mL的含10％FBS的RPMI1640培养基，培养16小时。培养结束后，将细胞离心回收，用PBS洗涤3次。向回收的细胞添加5mL的含100ng/mL的22KhGH且含10％FBS的RPMI1640培养基，使细胞悬浮，接着，将该细胞悬浮液转移至培养瓶中，在5％CO2的存在下于37℃培养，得到通过hGHR基因的表达而获得了hGH依赖性增殖能力的BaF3细胞。将该细胞记作BaF3/hGHR细胞。
〔实施例10〕使用BaF3/hGHR细胞的细胞增殖活性的测定
使用通过实施例9中记载的方法制备的BaF3/hGHR细胞，评价HSA-hGH融合蛋白质的细胞增殖活性。
将处于对数增殖期的BaF3/hGHR细胞用PBS洗涤3次后，用含1％马血清的15mL的RPMI1640培养基稀释至1×106个/mL，在5％CO2的存在下于37℃培养16小时。培养后，将细胞以同一培养基稀释至3×105个/mL，播种于96孔培养板的各孔中，每孔为100μL。使用含0.1％BSA的PBS将实施例8中纯化好的HSA-hGH融合蛋白质(HSA-22KhGH、mHSA-22KhGH、22KhGH-HSA及22KhGH-mHSA)稀释，分别调整为7个级别的浓度(90.3nM、18.1nM、3.6nM、0.72nM、0.14nM、0.029nM及0.0058nM)的稀释液。
将由此制备的标本稀释液添加至播种有BaF3/hGHR细胞的96孔培养板的各孔中，每孔为20μL，用培养板震荡器混合后，将细胞在5％CO2的存在下于37℃培养22小时。培养后，在各孔中加入用于测定活细胞数的比色定量分析用试剂CellTiter 96TM水性一液型细胞增殖试验(Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)试液(普洛麦格公司)并混合，每孔为24μL，进一步培养3小时。接着，用酶标仪测定各孔的490nm处的吸光度。以490nm处的吸光度为纵轴，以各标本的摩尔浓度(nM)为横轴，将测定值绘制成图。490nm处的吸光度表示活细胞数的相对值，所以将测定值绘制成图而得的曲线表示标本的浓度与细胞的增殖量的相关关系，将相对于用该曲线求得的细胞的增殖量的最大值、细胞的增殖量为50％时的标本的浓度作为EC50求出。另外，对任何标本均进行了3次测定。
〔实施例11〕使用食蟹猴的药物动力学及药效分析
将实施例8中纯化好的HSA-hGH融合蛋白质(HSA-22KhGH、mHSA-22KhGH。22KhGH-HSA及22KhGH-mHSA)分别以4.0mg/kg的用量对雄性食蟹猴进行单次皮下给药。另外，HSA-22KhGH的给药用3只食蟹猴进行，mHSA-22KhGH、22KhGH-HSA及22KhGH-mHSA的给药分别用1只食蟹猴进行。
为了用于药物动力学分析，在给药15分钟后、1、4、8、12、24、48、72、120、168及216小时后采集动物的外周血。将血液采集至加入有EDTA二钾的采血管，冰冷后，进行离心分离(1700×g、5分钟、4℃)以分离血浆。通过实施例12中详述的方法测定制备的血浆中所含的HSA-hGH融合蛋白质的浓度，以HSA-hGH融合蛋白质的浓度为纵轴、以给药后的时间为横轴绘图，从而求出Cmax、AUC0-216h、AUC0-inf及t1/2β，进行药物动力学分析。
此外，以IGF-1分泌促进为指标，如下所述分析HSA-hGH融合蛋白质的药效。在HSA-hGH融合蛋白质给药前、给药6、12小时后、1、2、3、4、5、6、7、8及9天后采集外周血，通过上述方法由外周血制备血浆。通过实施例13中详述的方法测定血浆中所含的IGF-1的浓度，以IGF-1的浓度为纵轴、以给药后的时间为横轴绘图，从而进行药效分析。此外，还准备了1只食蟹猴作为对照，以0.3mg/kg的用量对其进行连续7天的22KhGH(Growject(注册商标))皮下给药，同样地测定血浆中的IGF-1的浓度。
〔实施例12〕血浆中的HSA-hGH融合蛋白质的定量
通过本领域技术人员公知的方法，将用HSA或hGH免疫的小鼠的脾细胞分别与骨髓瘤细胞融合，对所得的杂交瘤细胞进行培养，得到小鼠抗HSA单克隆抗体及小鼠抗hGH抗体。将小鼠抗hGH单克隆抗体用0.1M NaHCO3溶液(pH9)透析后，用NanoDropTM(赛默科技公司(Thermo Scientific社))测定溶液中的抗体浓度。接着，将以5mg/mL的浓度溶解于DMSO的EZ-LinkTM NHS-LC-生物素(赛默飞世尔科技公司)以每1mg的抗体对应60μg的NHS-LC-生物素的比例添加至抗体溶液中，在室温下反应2小时后，将反应溶液用PBS透析，得到生物素化小鼠抗hGH单克隆抗体。下述定量法中，使用小鼠抗HSA单克隆抗体作为一次抗体，使用生物素化小鼠抗hGH单克隆抗体作为二次抗体。
使用Sector Imager 6000(MSD公司(Meso Scale Diagnostics社))，通过电化学发光(ECL)免疫测定法测定血浆中的HSA-hGH融合蛋白质的浓度。ECL免疫测定法是在板上对用钌络合物SULFO-TAG标记的二次抗体施加电化学刺激、用CCD照相机检测因SULFO-TAG的电解氧化·还原而产生的波长620nm的发光、从而对标本进行定量的方法。
按照Sector Imager 6000的使用说明书，大致如下所述进行测定。将小鼠抗HSA单克隆抗体添加至高结合力板(High Bind Plate)(MSD公司)上，静置1小时，将抗HSA抗体(一次抗体)固定在板上。接着，将溶于PBS的Superblock封闭缓冲液(Superblock Blockingbuffer in PBS)(赛默飞世尔科技公司)添加至板上，振荡1小时，将板封闭。将板用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤后，添加标本，振荡1小时。将板用PBST洗涤后，添加生物素化小鼠抗hGH单克隆抗体(二次抗体)，振荡1小时。将板用PBST洗涤后，添加SULFO-Tag-链霉亲和素(MSD公司)，振荡1小时。将板用PBST洗涤后，添加读数缓冲液T(Read buffer T)(MSD公司)，用Sector Imager 6000(MSD公司)测定波长620nm的发光。同样地在同一块板上对已知浓度的HSA-hGH进行定量，求出标准曲线，将标本的测定值内插至其中，求得血浆中的HSA-hGH融合蛋白质的浓度。
〔实施例13〕血浆中的IGF-1的定量
使用人IGF-I Quantikine ELISA试剂盒(R&D系统公司(R&D systems))，通过ELISA法进行血浆中所含的IGF-1的定量。
〔实施例14〕结果及探讨
(1)使用BaF3/hGHR细胞的细胞增殖活性的测定
图5是以490nm处的吸光度为纵轴、以各标本的摩尔浓度(nM)为横轴、将测定值绘制成图而得的、表示使用BaF3/hGHR细胞的细胞增殖活性的测定结果的图。由该图求得的各标本的EC50的结果示于表1。
[表1]
表1.各标本的EC50值(使用BaF3/hGHR细胞的细胞增殖活性的测定值)
HSA-22KhGH mHSA-22KhGH 22KhGH-HSA 22KhGH-mHSA
EC50(nM) 1.38×10-1 1.53×10-1 8.78×10-1 1.20
由表1可见，在人血清白蛋白的C末端侧连接22KhGH而成的HSA-22KhGH和mHSA-22KhGH的EC50分别为1.38×10-1nM和1.53×10-1nM，两者具有几乎同等的细胞增殖活性。此外，关于在人血清白蛋白的N末端侧连接22KhGH而成的22KhGH-HSA和22KhGH-mHSA，它们的EC50分别为8.78×10-1nM和1.20nM，表示它们也具有彼此几乎同等的细胞增殖活性。
另一方面，如果将HSA-22KhGH与22KhGH-HSA的EC50进行比较，则22KhGH-HSA的EC50为HSA-22KhGH的EC50的约6.4倍，此外，如果将mHSA-22KhGH与22KhGH-mHSA的EC50进行比较，则22KhGH-mHSA的EC50为mHSA-22KhGH的EC50的约7.8倍。
这些结果表示，将22KhGH与人血清白蛋白连接成融合蛋白质的情况下，至少在体外，与将22KhGH连接在人血清白蛋白的N末端侧相比，连接在C末端侧时，可获得22KhGH所具有的细胞增殖活性更高的融合蛋白质。因此，上述结果也提示，将22KhGH与人血清白蛋白连接成生长激素缺乏性侏儒症等的治疗剂的情况下，优选使22KhGH结合在人血清白蛋白的C末端侧。
(2)使用食蟹猴的药物动力学分析
图6是表示以食蟹猴血清中的HSA-hGH融合蛋白质(HSA-22KhGH、mHSA-22KhGH、22KhGH-HSA及22KhGH-mHSA)的浓度为纵轴、以HSA-hGH融合蛋白质的给药后的经过时间为横轴绘制而成的、HSA-hGH融合蛋白质的药物动力学分析的结果的图。由该图求得的各标本的Cmax、AUC0-216h、AUC0-inf及t1/2β的结果示于表2。
[表2]
表2.各标本的药物动力学分析值
由表2可见，关于AUC，在人血清白蛋白的C末端侧连接22KhGH而成的HSA-22KhGH和mHSA-22KhGH的AUC0-inf分别显示出752±55μg·小时/mL、737μg·小时/mL的值。与之相对，在人血清白蛋白的N末端侧连接22KhGH而成的22KhGH-HSA和22KhGH-mHSA的AUC0-inf分别为2220μg·小时/mL和3260μg·小时/mL，这就表明，在人血清白蛋白的N末端侧连接22KhGH时，与在人血清白蛋白的C末端侧连接22KhGH时相比，在血中稳定得多。此外，在人血清白蛋白的C末端侧连接22KhGH而成的HSA-22KhGH和mHSA-22KhGH彼此显示出同等的AUC0-inf值，但与在人血清白蛋白的N末端侧连接22KhGH而成的22KhGH-HSA和22KhGH-mHSA相比，22KhGH-mHSA的AUC0-inf显示出22KhGH-HSA的约1.47倍的高值，这表示22KhGH-mHSA在血中特别稳定。
这些结果表示，超乎想象地，在人血清白蛋白的C末端连接人生长激素的N末端的情况下、以及反过来在人生长激素的C末端连接人血清白蛋白的N末端的情况下，这些融合蛋白质的血中稳定性相差巨大，后者的情况下可达到高得多的稳定性。除此之外，这些结果也表示，在人生长激素的C末端侧连接HSA(A320T)的N末端侧的情况下，人生长激素的血中稳定性特别显著地提高，即，HSA(A320T)具有显著地提高连接在其N末端侧的蛋白质的血中稳定性的能力。即，总的来说，这些结果表示，作为让欲作为医药品给药至人或其它动物的生长激素等各种蛋白质在给药后在血中稳定化的技术方案，有效的是将这些蛋白质与HSA(A320T)连接，特别有效的是将这些蛋白质的C末端与HSA(A320T)的N末端通过例如肽键连接。
(3)使用食蟹猴的药效分析
图7是表示HSA融合22KhGH的药物动力学分析的结果的图，纵轴表示血浆中的IGF-1的浓度，横轴表示HSA-22KhGH融合蛋白质的给药后的经过时间。已知IGF-1是由生长激素诱导分泌的具有骨生长促进作用等的活性的多肽，hGH的一部分生理活性经由IGF-1来发挥。
由图7可见，给予在人血清白蛋白的C末端侧连接22KhGH而成的HSA-22KhGH或mHSA-22KhGH的动物中，血浆中IGF-1浓度在给予HSA-22KhGH的动物中在给药后第3天显示出最大值，为给药前的约1.5倍，在给予mHSA-22KhGH的动物中在给药后第2天显示出最大值，为给药前的约2倍。但是，任何情况下，血浆中IGF-1浓度随后都下降，在给药后第5天以后达到与作为对照的22KhGH几乎同等的值。另外，在图7中在22KhGH的给药后未确认到血浆中IGF-1浓度的显著的升高，认为其原因在于，22KhGH的血中半衰期短到约20分钟，在采集血液时IGF-1浓度就已经几乎恢复到给药前的值。此外，给予22KhGH的动物的血浆中IGF-1浓度从第2天开始升高，随后在直到测定最终日即第9天为止的过程中都显示出比给药前的值更高的值，认为其原因在于，由于连续7天都只进行22KhGH的给药，因此22KhGH的效果以累积的方式表现了出来。
另一方面，给予在人血清白蛋白的N末端侧连接22KhGH而成的HSA-22KhGH或mHSA-22KhGH的动物的血浆中IGF-1浓度，在给予22KhGH-HSA的动物中在给药后第7天显示出最大值，为给药前的约2.0倍，在给予22KhGH-mHSA的动物中在给药后第7天显示出最大值，为给药前的约2.0倍。此外，任何情况下，与作为对照的22KhGH相比，在给药后第9天，血浆中的IGF-1的浓度也都维持着高值。还有，如果将HSA-22KhGH与mHSA-22KhGH进行比较，则有直到给药后第3天为止HSA-22KhGH的IGF-1浓度更高的倾向，但在给药后第5天以后，mHSA-22KhGH的IGF-1浓度一直都更高，这就表示，mHSA-22KhGH与HSA-22KhGH相比，能更长期地将血中的IGF-1浓度维持在高值。
这些结果表示，通过将生长激素连接在HSA(A320T)的N末端侧，可显著地延长生长激素的药效，因此，作为与现有的生长激素制剂(Growject(注册商标)等)相比能更长时间地维持药效的持续型生长激素，可以适合使用将生长激素的C末端侧连接在HSA(A320T)的N末端侧而成的22KhGH-mHSA。还有，这些结果表示，通过将欲作为医药品等给药至动物的生理活性蛋白质连接在HSA(A320T)的N末端侧，可在血浆中显著地维持这些生理活性蛋白质的活性，并且还表示，作为制造能长时间地维持药效的持续型医药品的技术方案，有效的是将生理活性蛋白质与HSA(A320T)连接，特别有效的是将生理活性蛋白质的C末端与HSA(A320T)的N末端通过肽键结合。
给予22KhGH-mHSA的动物中，在给药后第9天，血浆中IGF-1浓度仍维持着非常高的值，由此可以合理地预测，将22KhGH-mHSA给予生长激素缺乏性侏儒症、成人生长激素缺乏症等的患者的情况下，即使给药间隔为7天～14天，其药效也能够充分地发挥。表3中例举了将22KhGH-mHSA给予生长激素缺乏性侏儒症、成人生长激素缺乏症等的患者时的用法、用量。表3所示的给药量、给药间隔应根据临床症状及IGF-1浓度等的检查结果适当增减。此外，优选将22KhGH-mHSA以肌肉内注射或皮下注射的形式给予患者。
[表3]
表3.22KhGH-mHSA的适应症及用法用量例
〔制剂实施例1〕水性注射剂
磷酸氢二钠七水合物···········1.33mg
磷酸二氢钠···············1.57mg
聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇·····3mg
苄醇··················13.5mg
D-甘露糖醇···············52.5mg
22KhGH-mHSA··············1mg
以上述成分比例将各成分溶解于注射用水，将pH调整至6.0～6.4，将液量调整至1.5mL，制成水性注射剂。
〔制剂实施例2〕水性注射剂
L-组氨酸················1mg
苯酚··················4.5mg
聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇·····4.5mg
D-甘露糖················60mg
22KhGH-mHSA··············1mg
以上述成分比例将各成分溶解于注射用水，将pH调整至6.0～6.4，将液量调整至1.5mL，制成水性注射剂。
〔制剂实施例3〕冷冻干燥剂
磷酸氢二钠七水合物···········2.475mg
磷酸二氢钠···············0.394mg
氯化钠·················1.125mg
氨基乙酸················11.25mg
D-甘露糖醇···············22.5mg
22KhGH-mHSA··············1mg
在使用时，将由上述成分构成的冷冻干燥剂溶解于含有9.7mg苄醇的1mL注射用水。
产业上的利用可能性
通过本发明，可提高欲作为医药品给药至动物的所要的蛋白质的血中稳定性，因此可提供能减少作为医药品给药时的该所要的蛋白质的给药量的新型医药品。
符号的说明
1 LacZ启动子
2 mPGK启动子
3 包含序列编号7所示的碱基序列的野生型小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点的部分序列
3a 包含序列编号8所示的碱基序列的突变型小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点的部分序列
4 mPGK的多聚腺苷酸化区域(mPGKpA)
5 包含EF-1p及第一内含子的碱基序列
6 SV40晚期多聚腺苷酸化区域
7 包含SV40早期启动子的区域
8 合成多聚腺苷酸化区域
9 包含巨细胞病毒启动子的区域
10 谷氨酰胺合成酶基因
序列表备注信息
序列编号3：人血清白蛋白突变体(A320T)
序列编号4：接头例
序列编号5：接头例
序列编号6：接头例
序列编号8：来源于突变型小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点的部分序列，合成
序列编号11：22KhGH-mHSA，成熟型
序列编号12：20KhGH-mHSA，成熟型
序列编号13：引物Hyg-Sfi5’，合成
序列编号14：引物Hyg-BstX3’，合成
序列编号15：IRES-Hygr-mPGKpA，合成
序列编号16：潮霉素抗性基因所对应的氨基酸序列
序列编号17：引物IRES5’，合成
序列编号18：引物IRES3’，合成
序列编号19：引物mPGKP5’，合成
序列编号20：引物mPGKP3’，合成
序列编号21：mPGKp，合成
序列编号22：引物GS5’，合成
序列编号23：引物GS3’，合成
序列编号24：引物puro5’，合成
序列编号25：引物puro3’，合成
序列编号26：包含嘌呤霉素抗性基因的序列
序列编号27：嘌呤霉素抗性基因所对应的氨基酸序列
序列编号28：引物SV40polyA5’，合成
序列编号29：引物SV40polyA3’，合成
序列编号30：引物mIRES-GS5’，合成
序列编号31：引物mIRES-GS3’，合成
序列编号32：HSA-22KhGH，成熟型
序列编号33：包含HSA-22KhGH基因的序列，合成
序列编号34：mHSA-22KhGH，成熟型
序列编号35：引物YA082，合成序列
序列编号36：引物YA083，合成序列
序列编号37：22KhGH-HSA，成熟型
序列编号38：包含22KhGH-HSA基因的序列，合成
序列编号39：22KhGH-mHSA
序列编号40：编码hGHR ECD的人工合成基因的序列
序列编号41：引物YA034，合成
序列编号42：引物YA035，合成
序列编号43：引物K708，合成
序列编号44：引物K709，合成
序列编号45：编码hGHR的人工合成基因的碱基序列，合成
序列表
<110> JCR制药股份有限公司（JCR Pharmaceuticals Co., Ltd.）
<120> 新型人血清白蛋白突变体
<130> GP187-PCT
<150> JP2015-177093
<151> 2015-09-08
<160> 45
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 2
<211> 586
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu
20 25 30
Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr
35 40 45
Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp
50 55 60
Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr
65 70 75 80
Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu
85 90 95
Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn
100 105 110
Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe
115 120 125
His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala
130 135 140
Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys
145 150 155 160
Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala
165 170 175
Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala
180 185 190
Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly
195 200 205
Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe
210 215 220
Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr
225 230 235 240
Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp
245 250 255
Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile
260 265 270
Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser
275 280 285
His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro
290 295 300
Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr
305 310 315 320
Thr Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala
325 330 335
Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys
340 345 350
Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His
355 360 365
Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu
370 375 380
Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly
385 390 395 400
Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val
405 410 415
Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly
420 425 430
Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro
435 440 445
Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu
450 455 460
His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu
465 470 475 480
Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu
485 490 495
Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala
500 505 510
Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr
515 520 525
Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln
530 535 540
Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys
545 550 555 560
Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu
565 570 575
Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 3
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人血清白蛋白突变体 (A320T)
<400> 3
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头例
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头例
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头例
<400> 6
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 小鼠脑心肌炎病毒
<400> 7
atgataatat ggccacaacc atg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于突变型小鼠脑心肌炎病毒的IRES的部分序列
<400> 8
atgataagct tgccacaacc atg 23
<210> 9
<211> 191
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 10
<211> 176
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn
20 25 30
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
35 40 45
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
50 55 60
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
65 70 75 80
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
85 90 95
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
100 105 110
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
115 120 125
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
130 135 140
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
145 150 155 160
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
165 170 175
<210> 11
<211> 776
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 22KhGH-mHSA
<400> 11
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Asp
180 185 190
Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
195 200 205
Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln
210 215 220
Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe
225 230 235 240
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
245 250 255
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg
260 265 270
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
275 280 285
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro
290 295 300
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp
305 310 315 320
Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
325 330 335
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr
340 345 350
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
355 360 365
Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser
370 375 380
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg
385 390 395 400
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys
405 410 415
Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
420 425 430
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
435 440 445
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser
450 455 460
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
465 470 475 480
Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu
485 490 495
Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr Glu
500 505 510
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
515 520 525
His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr
530 535 540
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
545 550 555 560
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
565 570 575
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr
580 585 590
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
595 600 605
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
610 615 620
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
625 630 635 640
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu
645 650 655
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
660 665 670
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
675 680 685
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
690 695 700
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
705 710 715 720
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
725 730 735
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
740 745 750
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
755 760 765
Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
770 775
<210> 12
<211> 761
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20KhGH-mHSA
<400> 12
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn
20 25 30
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
35 40 45
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
50 55 60
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
65 70 75 80
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
85 90 95
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
100 105 110
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115 120 125
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
130 135 140
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
145 150 155 160
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
165 170 175
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
180 185 190
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
195 200 205
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
210 215 220
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
225 230 235 240
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
245 250 255
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
260 265 270
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
275 280 285
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
290 295 300
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
305 310 315 320
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
325 330 335
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
340 345 350
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
355 360 365
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
370 375 380
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
385 390 395 400
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
405 410 415
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
420 425 430
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
435 440 445
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
450 455 460
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
465 470 475 480
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr
485 490 495
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
500 505 510
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
515 520 525
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
530 535 540
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
545 550 555 560
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
565 570 575
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
580 585 590
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
595 600 605
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
610 615 620
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
625 630 635 640
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
645 650 655
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
660 665 670
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
675 680 685
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
690 695 700
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
705 710 715 720
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
725 730 735
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
740 745 750
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
755 760
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Hyg-Sfi5', 合成
<400> 13
gaggccgcct cggcctctga 20
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Hyg-BstX3', 合成
<400> 14
aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29
<210> 15
<211> 2216
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRES-Hygr-mPGKpA, 合成
<400> 15
ctcgaggaat tcactccttc aggtgcaggc ttgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg 60
ccaactggct cacaaatacc actgagatcg acggtatcga taagcttgat atcgaattcc 120
gccccccccc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 180
ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 240
agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 300
gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 360
tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac 420
aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc 480
cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 540
ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 600
cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg 660
aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aatatggcca caaccatgaa 720
aaagcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt tcgacagcgt 780
ctccgacctg atgcagctct cggagggcga agaatctcgt gctttcagct tcgatgtagg 840
agggcgtgga tatgtcctgc gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgtta 900
tgttcatcgg cactttgcat cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg acattgggga 960
attcagcgag agcctgacct attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca cgttgcaaga 1020
cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct gcagccggtc gcggaggcca tggatgcgat 1080
cgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca ttcggaccgc aaggaatcgg 1140
tcaatacact acgtggcgtg atttcatatg cgcgattgct gatccccatg tgtatcactg 1200
gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg caggctctcg atgagctgat 1260
gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtccg gcacctcgtg cacgcggatt tcggctccaa 1320
caatgtcctg acggacaatg gccgcataac agcggtcatt gactggagcg aggcgatgtt 1380
cggggattcc caatacgagg tcgccaacat cttcttctgg aggccgtggt tggcttgtat 1440
ggagcagcag acgcgctact tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat cgccgcggct 1500
ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg ttgacggcaa 1560
tttcgatgat gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca atcgtccgat ccggagccgg 1620
gactgtcggg cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc gtctggaccg atggctgtgt 1680
agaagtactc gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact cgtccgaggg caaaggaata 1740
gtcgagaaat tgatgatcta ttaagcaata aagacgtcca ctaaaatgga agtttttcct 1800
gtcatacttt gttaagaagg gtgagaacag agtacctaca ttttgaatgg aaggattgga 1860
gctacggggg tgggggtggg gtgggattag ataaatgcct gctctttact gaaggctctt 1920
tactattgct ttatgataat gtttcatagt tggatatcat aatttaaaca agcaaaacca 1980
aattaagggc cagctcattc ctccactcac gatctataga tccactagct tggcgtaatc 2040
atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 2100
agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 2160
tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatcc 2216
<210> 16
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 潮霉素抗性基因所对应的氨基酸序列
<400> 16
Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile
1 5 10 15
Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu
20 25 30
Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val His
50 55 60
Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile
65 70 75 80
Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln
85 90 95
Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu
100 105 110
Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser
115 120 125
Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr
130 135 140
Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr
145 150 155 160
His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln
165 170 175
Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg
180 185 190
His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn
195 200 205
Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp
210 215 220
Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala
225 230 235 240
Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu
245 250 255
Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp
260 265 270
Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp
275 280 285
Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val
290 295 300
Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly
305 310 315 320
Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg
325 330 335
Pro Arg Ala Lys Glu
340
<210> 17
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物IRES5', 合成
<400> 17
caactcgagc ggccgccccc cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt act 53
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物IRES3', 合成
<400> 18
caagaagctt ccagaggaac tg 22
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物mPGKP5', 合成
<400> 19
gcgagatctt accgggtagg ggaggcgctt 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物mPGKP3', 合成
<400> 20
gaggaattcg atgatcggtc gaaaggcccg 30
<210> 21
<211> 532
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mPGKp, 合成
<400> 21
gcgagatctt accgggtagg ggaggcgctt ttcccaaggc agtctggagc atgcgcttta 60
gcagccccgc tgggcacttg gcgctacaca agtggcctct ggcctcgcac acattccaca 120
tccaccggta ggcgccaacc ggctccgttc tttggtggcc ccttcgcgcc accttctact 180
cctcccctag tcaggaagtt cccccccgcc ccgcagctcg cgtcgtgcag gacgtgacaa 240
atggaagtag cacgtctcac tagtctcgtg cagatggaca gcaccgctga gcaatggaag 300
cgggtaggcc tttggggcag cggccaatag cagctttgct ccttcgcttt ctgggctcag 360
aggctgggaa ggggtgggtc cgggggcggg ctcaggggcg ggctcagggg cggggcgggc 420
gcccgaaggt cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg 480
ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt tcgaccgatc atcgaattcc tc 532
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GS5', 合成
<400> 22
aatatggcca caaccatggc gacctcagca agttcc 36
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GS3', 合成
<400> 23
ggaggatccc tcgagttagt ttttgtattg gaagggct 38
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物puro5', 合成
<400> 24
gcttaagatg accgagtaca agcccacg 28
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物puro3', 合成
<400> 25
cccatcgtga tggtcaggca ccgggcttgc 30
<210> 26
<211> 620
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含嘌呤霉素抗性基因的序列, 合成
<400> 26
gcttaagatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc acccgcgacg acgtccccag 60
ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc gccacgcgcc acaccgtcga 120
tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa ctcttcctca cgcgcgtcgg 180
gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc gcggtggcgg tctggaccac 240
gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt 300
gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc ctcctggcgc cgcaccggcc 360
caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg cccgaccacc agggcaaggg 420
tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc 480
cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt 540
caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg 600
tgcctgacca tcacgatggg 620
<210> 27
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嘌呤霉素抗性基因所对应的氨基酸序列
<400> 27
Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val
1 5 10 15
Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala
20 25 30
Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu
35 40 45
Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val
50 55 60
Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu
65 70 75 80
Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala
85 90 95
Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu
100 105 110
Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val
115 120 125
Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val
130 135 140
Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu
145 150 155 160
Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe
165 170 175
Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys
180 185 190
Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala
195
<210> 28
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SV40polyA5', 合成
<400> 28
caacaagcgg ccgccctcga gttcccttta gtgagggtta atgc 44
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SV40polyA3', 合成
<400> 29
cccctgaacc tgaaacataa aatg 24
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物mIRES-GS5', 合成
<400> 30
acacgatgat aagcttgcca caacc 25
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物mIRES-GS3', 合成
<400> 31
ctccacgata tccctgccat a 21
<210> 32
<211> 776
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSA-22KhGH, 成熟型
<400> 32
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser
580 585 590
Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu
595 600 605
Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu
610 615 620
Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser
625 630 635 640
Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser
645 650 655
Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu
660 665 670
Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr
675 680 685
Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu
690 695 700
Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr
705 710 715 720
Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His
725 730 735
Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg
740 745 750
Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg
755 760 765
Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
770 775
<210> 33
<211> 2421
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含HSA-22KhGH基因的序列, 合成
<400> 33
acgcgtcacc atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta 60
ttccaggggt gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga 120
tttgggagaa gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca 180
gtgtccattt gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg 240
tgttgctgat gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa 300
attatgcaca gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa 360
acaagaacct gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc 420
ccgattggtg agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac 480
atttttgaaa aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga 540
actccttttc tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga 600
taaagctgcc tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc 660
tgccaaacag agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc 720
atgggcagta gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa 780
gttagtgaca gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg 840
tgctgatgac agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag 900
taaactgaag gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt 960
ggaaaatgat gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa 1020
ggatgtttgc aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga 1080
atatgcaaga aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata 1140
tgaaaccact ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt 1200
gttcgatgaa tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga 1260
gctttttgag cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa 1320
gaaagtaccc caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt 1380
gggcagcaaa tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct 1440
atccgtggtc ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt 1500
caccaaatgc tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt 1560
cgatgaaaca tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat 1620
atgcacactt tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt 1680
gaaacacaag cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc 1740
ttttgtagag aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa 1800
aaaacttgtt gctgcaagtc aagctgcctt aggcttattc ccaaccattc ccttatccag 1860
gctttttgac aacgctatgc tccgcgccca tcgtctgcac cagctggcct ttgacaccta 1920
ccaggagttt gaagaagcct atatcccaaa ggaacagaag tattcattcc tgcagaaccc 1980
ccagacctcc ctctgtttct cagagtctat tccgacaccc tccaacaggg aggaaacaca 2040
acagaaatcc aacctagagc tgctccgcat ctccctgctg ctcatccagt cgtggctgga 2100
gcccgtgcag ttcctcagga gtgtcttcgc caacagcctg gtgtacggcg cctctgacag 2160
caacgtctat gacctcctaa aggacctaga ggaaggcatc caaacgctga tggggaggct 2220
ggaagatggc agcccccgga ctgggcagat cttcaagcag acctacagca agttcgacac 2280
aaactcacac aacgatgacg cactactcaa gaactacggg ctgctctact gcttcaggaa 2340
ggacatggac aaggtcgaga cattcctgcg catcgtgcag tgccgctctg tggagggcag 2400
ctgtggcttc taagcggccg c 2421
<210> 34
<211> 776
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mHSA-22KhGH
<400> 34
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser
580 585 590
Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu
595 600 605
Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu
610 615 620
Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser
625 630 635 640
Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser
645 650 655
Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu
660 665 670
Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr
675 680 685
Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu
690 695 700
Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr
705 710 715 720
Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His
725 730 735
Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg
740 745 750
Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg
755 760 765
Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
770 775
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YA082, 合成
<400> 35
aactatactg aggcaaagga tgtcttc 27
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YA083, 合成
<400> 36
tgcctcagta tagtttttgc aaacatc 27
<210> 37
<211> 776
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 22KhGH-HSA, 成熟型
<400> 37
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Asp
180 185 190
Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
195 200 205
Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln
210 215 220
Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe
225 230 235 240
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
245 250 255
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg
260 265 270
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
275 280 285
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro
290 295 300
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp
305 310 315 320
Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
325 330 335
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr
340 345 350
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
355 360 365
Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser
370 375 380
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg
385 390 395 400
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys
405 410 415
Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
420 425 430
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
435 440 445
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser
450 455 460
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
465 470 475 480
Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu
485 490 495
Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu
500 505 510
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
515 520 525
His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr
530 535 540
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
545 550 555 560
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
565 570 575
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr
580 585 590
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
595 600 605
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
610 615 620
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
625 630 635 640
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu
645 650 655
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
660 665 670
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
675 680 685
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
690 695 700
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
705 710 715 720
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
725 730 735
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
740 745 750
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
755 760 765
Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
770 775
<210> 38
<211> 2427
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含22KhGH-HSA基因的序列, 合成
<400> 38
acgcgtcacc atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg 60
cctgccctgg cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga 120
caacgctatg ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt 180
tgaagaagcc tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc 240
cctctgtttc tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc 300
caacctagag ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca 360
gttcctcagg agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta 420
tgacctccta aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg 480
cagcccccgg actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca 540
caacgatgac gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga 600
caaggtcgag acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt 660
cgatgcacac aagagtgagg ttgctcatcg gtttaaagat ttgggagaag aaaatttcaa 720
agccttggtg ttgattgcct ttgctcagta tcttcagcag tgtccatttg aagatcatgt 780
aaaattagtg aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt gttgctgatg agtcagctga 840
aaattgtgac aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa ttatgcacag ttgcaactct 900
tcgtgaaacc tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa caagaacctg agagaaatga 960
atgcttcttg caacacaaag atgacaaccc aaacctcccc cgattggtga gaccagaggt 1020
tgatgtgatg tgcactgctt ttcatgacaa tgaagagaca tttttgaaaa aatacttata 1080
tgaaattgcc agaagacatc cttactttta tgccccggaa ctccttttct ttgctaaaag 1140
gtataaagct gcttttacag aatgttgcca agctgctgat aaagctgcct gcctgttgcc 1200
aaagctcgat gaacttcggg atgaagggaa ggcttcgtct gccaaacaga gactcaagtg 1260
tgccagtctc caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca tgggcagtag ctcgcctgag 1320
ccagagattt cccaaagctg agtttgcaga agtttccaag ttagtgacag atcttaccaa 1380
agtccacacg gaatgctgcc atggagatct gcttgaatgt gctgatgaca gggcggacct 1440
tgccaagtat atctgtgaaa atcaagattc gatctccagt aaactgaagg aatgctgtga 1500
aaaacctctg ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg gaaaatgatg agatgcctgc 1560
tgacttgcct tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag gatgtttgca aaaactatgc 1620
tgaggcaaag gatgtcttcc tgggcatgtt tttgtatgaa tatgcaagaa ggcatcctga 1680
ttactctgtc gtgctgctgc tgagacttgc caagacatat gaaaccactc tagagaagtg 1740
ctgtgccgct gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg ttcgatgaat ttaaacctct 1800
tgtggaagag cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag ctttttgagc agcttggaga 1860
gtacaaattc cagaatgcgc tattagttcg ttacaccaag aaagtacccc aagtgtcaac 1920
tccaactctt gtagaggtct caagaaacct aggaaaagtg ggcagcaaat gttgtaaaca 1980
tcctgaagca aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta tccgtggtcc tgaaccagtt 2040
atgtgtgttg catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc accaaatgct gcacagaatc 2100
cttggtgaac aggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc gatgaaacat acgttcccaa 2160
agagtttaat gctgaaacat tcaccttcca tgcagatata tgcacacttt ctgagaagga 2220
gagacaaatc aagaaacaaa ctgcacttgt tgagctcgtg aaacacaagc ccaaggcaac 2280
aaaagagcaa ctgaaagctg ttatggatga tttcgcagct tttgtagaga agtgctgcaa 2340
ggctgacgat aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa aaacttgttg ctgcaagtca 2400
agctgcctta ggcttataag cggccgc 2427
<210> 39
<211> 776
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 22KhGH-mHSA, 成熟型
<400> 39
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Asp
180 185 190
Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
195 200 205
Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln
210 215 220
Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe
225 230 235 240
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
245 250 255
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg
260 265 270
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
275 280 285
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro
290 295 300
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp
305 310 315 320
Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
325 330 335
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr
340 345 350
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
355 360 365
Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser
370 375 380
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg
385 390 395 400
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys
405 410 415
Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
420 425 430
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
435 440 445
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser
450 455 460
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
465 470 475 480
Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu
485 490 495
Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr Glu
500 505 510
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
515 520 525
His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr
530 535 540
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
545 550 555 560
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
565 570 575
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr
580 585 590
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
595 600 605
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
610 615 620
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
625 630 635 640
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu
645 650 655
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
660 665 670
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
675 680 685
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
690 695 700
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
705 710 715 720
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
725 730 735
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
740 745 750
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
755 760 765
Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
770 775
<210> 40
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码合成hGHR ECD基因的序列
<400> 40
atggacctgt ggcagctcct cctgaccctc gctctggctg gctcctccga tgccttctcc 60
ggctccgagg ccaccgctgc tatcctgagc agggctccct ggtccctgca gagcgtcaac 120
cctggcctga agaccaactc ctccaaagag cccaagttca caaagtgcag gtcccccgag 180
agggagacct tctcctgtca ttggaccgac gaggtgcacc acggcaccaa gaacctgggc 240
cccatccagc tcttctacac caggaggaac acccaagagt ggacacagga gtggaaggag 300
tgccccgatt acgtgtccgc cggcgagaac agctgctact tcaactcctc cttcacatcc 360
atctggattc cttattgcat caaactgacc tccaacggcg gcacagtgga tgagaagtgc 420
ttcagcgtcg acgagatcgt gcagcccgat ccccccatcg ctctgaactg gaccctgctg 480
aatgtgtccc tgaccggcat ccacgccgat attcaggtga ggtgggaggc tcccaggaac 540
gctgacatcc agaagggctg gatggtcctg gagtacgagc tgcagtacaa ggaggtcaac 600
gagaccaagt ggaaaatgat ggaccctatc ctgacaacat ccgtccctgt gtacagcctg 660
aaggtggaca aagagtacga ggtgagggtg aggagcaaac agcggaatag cggcaactac 720
ggagaattct ccgaggtgct gtatgtgacc ctgccccaga tgtcccagtt cacctgtgaa 780
gaggactttt ac 792
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YA034, 合成
<400> 41
ccgacgcgtc gccaccatgg acctgtggca gctcctcctg ac 42
<210> 42
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YA035, 合成
<400> 42
cactgttagc ccgaatattc cgaagatgat aattaggagc catgggaagt aaaagtcctc 60
ttcacag 67
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物K708, 合成
<400> 43
ccggtcgacc gccaccatgg atctctggca gctgctgttg acc 43
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物K709, 合成
<400> 44
tttggcggcc gcctaaggca tgattttgtt cagttggtc 39
<210> 45
<211> 1917
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码合成hGHR基因的序列
<400> 45
atggacctgt ggcagctcct cctgaccctc gctctggctg gctcctccga tgccttctcc 60
ggctccgagg ccaccgctgc tatcctgagc agggctccct ggtccctgca gagcgtcaac 120
cctggcctga agaccaactc ctccaaagag cccaagttca caaagtgcag gtcccccgag 180
agggagacct tctcctgtca ttggaccgac gaggtgcacc acggcaccaa gaacctgggc 240
cccatccagc tcttctacac caggaggaac acccaagagt ggacacagga gtggaaggag 300
tgccccgatt acgtgtccgc cggcgagaac agctgctact tcaactcctc cttcacatcc 360
atctggattc cttattgcat caaactgacc tccaacggcg gcacagtgga tgagaagtgc 420
ttcagcgtcg acgagatcgt gcagcccgat ccccccatcg ctctgaactg gaccctgctg 480
aatgtgtccc tgaccggcat ccacgccgat attcaggtga ggtgggaggc tcccaggaac 540
gctgacatcc agaagggctg gatggtcctg gagtacgagc tgcagtacaa ggaggtcaac 600
gagaccaagt ggaaaatgat ggaccctatc ctgacaacat ccgtccctgt gtacagcctg 660
aaggtggaca aagagtacga ggtgagggtg aggagcaaac agcggaatag cggcaactac 720
ggagaattct ccgaggtgct gtatgtgacc ctgccccaga tgtcccagtt cacctgtgaa 780
gaggactttt acttcccatg gctcctaatt atcatcttcg gaatattcgg gctaacagtg 840
atgctatttg tattcttatt ttctaaacag caaaggatta aaatgctgat tctgccccca 900
gttccagttc caaagattaa aggaatcgat ccagatctcc tcaaggaagg aaaattagag 960
gaggtgaaca caatcttagc cattcatgat agctataaac ccgaattcca cagtgatgac 1020
tcttgggttg aatttattga gctagatatt gatgagccag atgaaaagac tgaggaatca 1080
gacacagaca gacttctaag cagtgaccat gagaaatcac atagtaacct aggggtgaag 1140
gatggcgact ctggacgtac cagctgttgt gaacctgaca ttctggagac tgatttcaat 1200
gccaatgaca tacatgaggg tacctcagag gttgctcagc cacagaggtt aaaaggggaa 1260
gcagatctct tatgccttga ccagaagaat caaaataact caccttatca tgatgcttgc 1320
cctgctactc agcagcccag tgttatccaa gcagagaaaa acaaaccaca accacttcct 1380
actgaaggag ctgagtcaac tcaccaagct gcccatattc agctaagcaa tccaagttca 1440
ctgtcaaaca tcgactttta tgcccaggtg agcgacatta caccagcagg tagtgtggtc 1500
ctttccccgg gccaaaagaa taaggcaggg atgtcccaat gtgacatgca cccggaaatg 1560
gtctcactct gccaagaaaa cttccttatg gacaatgcct acttctgtga ggcagatgcc 1620
aaaaagtgca tccctgtggc tcctcacatc aaggttgaat cacacataca gccaagctta 1680
aaccaagagg acatttacat caccacagaa agccttacca ctgctgctgg gaggcctggg 1740
acaggagaac atgttccagg ttctgagatg cctgtcccag actatacctc cattcatata 1800
gtacagtccc cacagggcct catactcaat gcgactgcct tgcccttgcc tgacaaagag 1860
tttctctcat catgtggcta tgtgagcaca gaccaactga acaaaatcat gccttag 1917

Claims (25)

1.一种人血清白蛋白突变体，其包含相对于序列编号3所示的氨基酸序列有10个以下的氨基酸残基缺失和/或有10个以下的氨基酸残基被置换的氨基酸序列，该氨基酸序列中，序列编号3所示的氨基酸序列的N末端第318个天冬酰胺残基和第320个苏氨酸残基保持着在这2个残基间经由脯氨酸以外的单个氨基酸残基(X)通过肽键连接的状态。
2.如权利要求1所述的人血清白蛋白突变体，其中，该氨基酸残基(X)为酪氨酸。
3.如权利要求2所述的人血清白蛋白突变体，其由序列编号3所示的氨基酸序列构成。
4.一种人血清白蛋白突变体，其中，相对于权利要求1～3中任一项所述的人血清白蛋白突变体的氨基酸序列，除了序列编号3所示的氨基酸序列的N末端第318个～第320个所对应的位置的序列部分以外，增加了10个以下的氨基酸残基，并且与序列编号2所示的氨基酸序列不同。
5.一种人血清白蛋白突变体，其中，相对于权利要求1～3中任一项所述的人血清白蛋白突变体的氨基酸序列，在N末端或C末端增加了10个以下的氨基酸残基，并且与序列编号2所示的氨基酸序列不同。
6.一种人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含权利要求1～5中任一项所述的人血清白蛋白突变体的氨基酸序列，所述第二多肽链包含与所述第一多肽链连接的其它蛋白质(A)的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，
(a)该第一多肽链的N末端与该第二多肽链的C末端、或者
(b)该第一多肽链的C末端与该第二多肽链的N末端
经由肽键连接。
8.如权利要求7所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质，其中，该经由肽键的连接包括与接头形成的肽键。
9.如权利要求8所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该接头由1～50个氨基酸残基构成。
10.如权利要求8所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该接头由1～6个氨基酸残基构成。
11.如权利要求8所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质，其中，该接头选自Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、序列编号4、序列编号5和序列编号6所示的氨基酸序列。
12.如权利要求8所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该接头以氨基酸序列Gly-Ser表示。
13.如权利要求6～12中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该蛋白质(A)在给药至机体时显示出生理活性。
14.如权利要求6～13中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该蛋白质(A)选自α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白质、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、硫酸乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、包括CLN1～10的溶酶体酶、PD-1配体、骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素、催乳素、胃动素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促黑色素细胞激素(MSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、甲状旁腺激素(PTH)、血小板生成素、干细胞因子(SCF)、瘦素、血管加压素、催产素、降钙素、胰高血糖素、胃泌素、促胰液素、促胰酶素、胆囊收缩素、血管紧张素、血管他丁、内皮他丁、人胎盘催乳素(HPL)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、脑啡肽、内啡肽、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、白细胞介素2、胸腺生成素、胸腺刺激素、胸腺体液因子(THF)、血清胸腺因子(FTS)、胸腺素、胸腺因子X、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、尿激酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、强啡肽、铃蟾肽、神经降压素、雨蛙肽、缓激肽、天冬酰胺酶、激肽释放酶、P物质、神经生长因子(NGF)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3、神经营养因子4/5、神经营养因子6、神经调节蛋白1、激活素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、超氧化物歧化酶(SOD)、盐酸溶菌酶、多粘菌素B、粘菌素、短杆菌肽、杆菌肽、抑胃肽(GIP)、血管活性肠肽(VIP)、血小板衍生生长因子(PDGF)、生长激素释放因子(GRF)、表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素、生长激素抑制素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、20K生长激素、22K生长激素、以及它们的盐或突变体。
15.如权利要求6～12中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该蛋白质(A)是22K生长激素。
16.如权利要求6～12中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其中，该蛋白质(A)是20K生长激素。
17.如权利要求15所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其由序列编号11所示的氨基酸序列构成。
18.如权利要求16所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其由序列编号12所示的氨基酸序列构成。
19.一种药物，其含有权利要求6～18中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)作为有效成分。
20.如权利要求19所述的药物，其是选自不伴有骺线闭合的生长激素缺乏性侏儒症、特纳综合征中的侏儒症、由慢性肾功能衰竭引起的侏儒症、普拉德-威利综合征中的侏儒症、软骨营养障碍中的侏儒症、及SGA性侏儒症，以及成人生长激素缺乏症、由AIDS引起的疲劳、及由厌食症引起的疲劳的疾病的治疗剂。
21.一种DNA，其包含编码权利要求1～5中任一项所述的人血清白蛋白突变体的基因。
22.一种DNA，其包含编码权利要求6～18中任一项所述的人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)的基因。
23.一种表达载体，其包含权利要求21或22所述的DNA而成。
24.一种哺乳类细胞，其用权利要求23所述的载体进行了转化。
25.一种人血清白蛋白突变体或人血清白蛋白突变体连接蛋白质(A)，其通过将权利要求24所述的哺乳类细胞在无血清培养基中培养而得。
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