EA010059B1 - Flp-опосредованная рекомбинация - Google Patents
Flp-опосредованная рекомбинация Download PDFInfo
- Publication number
- EA010059B1 EA010059B1 EA200600772A EA200600772A EA010059B1 EA 010059 B1 EA010059 B1 EA 010059B1 EA 200600772 A EA200600772 A EA 200600772A EA 200600772 A EA200600772 A EA 200600772A EA 010059 B1 EA010059 B1 EA 010059B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- host cell
- recombination
- polynucleotide
- cell
- sequence
- Prior art date
Links
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title claims description 102
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title claims description 102
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 133
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 133
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 133
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 85
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 85
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 76
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 23
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 11
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 7
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 claims description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 16
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 abstract description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 179
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 34
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 24
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 7
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 101150054177 Acot8 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 101000836268 Homo sapiens U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000018170 Lymphotoxin beta Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010091221 Lymphotoxin beta Receptor Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100027244 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229940041984 dextran 1 Drugs 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- XUSNPFGLKGCWGN-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(3-aminopropyl)piperazin-1-yl]propan-1-amine Chemical compound NCCCN1CCN(CCCN)CC1 XUSNPFGLKGCWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 101100500421 Chlamydomonas reinhardtii DHC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004998 Chloroplast DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 206010017553 Furuncle Diseases 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010054017 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100039622 Granulocyte colony-stimulating factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004556 Interleukin-15 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017535 Interleukin-15 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004554 Interleukin-17 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017525 Interleukin-17 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004557 Interleukin-18 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017537 Interleukin-18 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102000003959 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100264226 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) XRN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100528938 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ker1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 208000001449 Viral Hemorrhagic Septicemia Diseases 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N chlorotrianisene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)=C(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=C(OC)C=C1 BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000409 cytocidal Toxicity 0.000 description 1
- 230000000445 cytocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 208000003512 furunculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000017776 integrin beta chain Human genes 0.000 description 1
- 108060004057 integrin beta chain Proteins 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000005709 nerve cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- QUAMTGJKVDWJEQ-UHFFFAOYSA-N octabenzone Chemical compound OC1=CC(OCCCCCCCC)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 QUAMTGJKVDWJEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007692 polyacrylamide-agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000019710 soybean protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000002179 total cell area Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- -1 ΡΑΝΤΈ8 Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Описываются композиции и способы, применяемые для гомологичной рекомбинации и стабильной интеграции полинуклеотида в клетку-хозяина. Раскрываемые композиции и способы обеспечивают быстрый и эффективный способ осуществления стабильной интеграции экзогенного полинуклеотида в клетку-хозяина и отбора таких трансформированных клеток.
Description
Настоящее изобретение относится к рекомбинантной кассете, включающей участок промотора/энхансера; интересующий полинуклеотид, домен полиА-сигнала; домен рекомбинантного РК.Т; и полинуклеотид 4Ыг, где указанный участок промотора/энхансера, интересующий полинуклеотид и домен полиА-сигнала связаны операбельно.
Настоящее изобретение также относится к вектору рекомбинации, включающему кассету рекомбинации, в состав которой входит участок промотора/энхансера; интересующий полинуклеотид; домен полиА-сигнала; домен рекомбинантного РК.Т; и полинуклеотид 4Ыг, где указанный участок промотора/энхансера, интересующий полинуклеотид и домен полиА-сигнала связаны операбельно. В одном варианте указанный вектор включает последовательность, приведенную в 8ЕО ГО N0: 1 или 2. В еще одном варианте рекомбинантный вектор также включает второй участок промотора/энхансера, второй интересующий полинуклеотид и второй домен полиА-сигнала, где второй участок промотора/энхансера, второй интересующий полинуклеотид и второй полиА-сигнал связаны операбельно.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей одну или несколько копий стабильно интегрированной кассеты рекомбинации по настоящему изобретению. В одном варианте указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии и/или бессывороточной среде.
Настоящее изобретение также относится к системе рекомбинации. Система рекомбинаций включает плазмиду экспрессии, содержащую один или несколько доменов рекомбинантной РК.Т, и клеткухозяина, содержащую один или несколько сайтов РК.Т. В одном варианте клетка-хозяин представляет собой СНО клетку, которая включает, например, клетку СНО-ОС44. В некоторых вариантах клеткахозяин адаптирована для роста в суспензии и/или в бессывороточной среде.
Настоящее изобретение также относится к набору, включающему вектор и/или кассету рекомбинации по настоящему изобретению и клетку-хозяина, включающую сайт РК.Т.
Детали одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения приведены в прилагаемых фигурах и в описании настоящего патента. Другие особенности, объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже описания фигур и из прилагаемой формулы изобретения.
Описание фигур
На фиг. 1 показан сайт РЬР рекомбинантной мишени (РК.Т) и способ введения в геном клетокхозяев СН0. Вектор экспрессии, содержащий интересующий полинуклеотид, может быть трансфицирован (стабильно интегрирован) в геном посредством рекомбинации ДНК с участием РЬР-рекомбиназы в сайте РК.Т.
На фиг. 2 показана генная карта рекомбинантного вектора по настоящему изобретению (соответствует 8Е0 ГО N0: 1)
На фиг. 3 показана генная карта рекомбинантного вектора по настоящему изобретению (соответствует 8Е0 ГО N0: 2), включающего вектор, который имеет два сайта для введения вставок (например, сайты множественного клонирования, начинающиеся в положениях 1309 и 6370).
На фиг. 4 показана карта плазмиды рРК.Т1ас2ео, которую используют для получения клеточной линии СНО-ЭС44 Р1р-1п.
На фиг. 5 показана карта плазмиды рРК.Т1ас2ео, на которой указан зонд, используемый для идентификации наличия РК.Т в трансфицированных хозяйских клетках.
На фиг. 6 показана репрезентативная фотография 17 из >100 клеточных линий, исследованных с помощью саузерн-блоттинга. Каждая полоса содержит 10 мкг геномной ДНК из трансфицированной клеточной линии. Как следует из разного размера полос, большое число потенциальных линий клетокхозяев содержит последовательность РК.Т в состоянии интегрированности в СНО-ОС44 по различным сайтам. Кроме того, на полосе 11 можно видеть, в качестве примера, факт множественности сайтов интеграции РК.Т, что следует из множественности полосок.
- 1 010059
На фиг. 7 показаны возможные варианты, которые также использовались для подтверждения того, что кассета РК.Т представлена в виде единственной копии. Полоса 1 включает 1 нг рРКТ71ас2ео, который выполняет функцию позитивного контроля. Показаны результаты 9 из 35 взятых в качестве возможных вариантов клеточных линий. Каждая полоса содержит 10 мкг геномной ДНК из трансфицированной клеточной линии. Видны только единичные полосы, что подтверждает наличие единственной интеграции. Кроме того, различные размеры полос поддерживают тот факт, что имеются различные места локализации сайтов РК.Т. Полосы, соответствующие гибридизации, очень слабые, что является следствием наличия лишь одной копии последовательности РК.Т, присутствующей в геноме СН0-ЭС44.
На фиг. 8А и 8В показана нуклеотидная последовательность 8Εβ ΙΌ N0: 1.
На фиг. 9А и 9В показана нуклеотидная последовательность 8Εβ ΙΌ N0: 2.
Подробное описание
Настоящее изобретение относится к кассетам рекомбинации и к векторам рекомбинации, которые используются для гомологичной рекомбинации и стабильной интеграции желательного полинуклеотида (например, интересующего полинуклеотида) в клетке-хозяине. Настоящее изобретение относится к полинуклеотидной конструкции, которая включает последовательности, гомологичные эндогенной нуклеотидной последовательности хромосомы, что открывает возможность осуществления гомологичной рекомбинации в сайте хромосомной ДНК клетки-хозяина, где указанный полинуклеотид кодирует селектируемый маркер и сайт клонирования, и может также включать регуляторные элементы. Способы, системы и композиции по настоящему изобретению представляют собой мощный инструмент для создания определенных количеств белка с минимальными затратами на получение стабильной клеточной линии.
В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему кассету рекомбинации, в которую входит регуляторный участок транскрипции цитомегаловирусов (СМУ), вставочная последовательность варьирующей длины (например, из интрона А от СМУ), интересующий полинуклеотид, рекомбинантный домен и домен сигнала полиаденилирования. Настоящее изобретение также относится к способам и векторам экспрессии, позволяющим осуществить продукцию и восстановление гетерологичных полинуклеотидов из клеток-хозяев.
В другом аспекте рекомбинантная кассета по настоящему изобретению включает оперативно связанные (ί) крупный очень ранний участок промотора/энхансера СМУ (ΙΕ1) и вставочную последовательность варьирующей длины (например, производное интрона А), (ίί) интересующий полинуклеотид, (ίίί) домен первого сигнала полиаденилирования (например, ВНС или 11СН полиА), (ίν) рекомбинантный домен (например, сайт РК.Т), (ν) селектируемый маркер (например, бМг) и (νί) второй сигнал полиаденилирования (например, полиА из 8У40 Ε). Термины оперативно связанный, связанный операбельно относится к такому близкому расположению, при котором компоненты находятся в связи, позволяющей им функционировать нужным образом (например, в функциональной связи). Таким образом, например, промотор/энхансер, оперативно связанные с интересующим полинуклеотидом, ассоциированны с последним таким образом, что достигается экспрессия интересующего полинуклеотида в условиях, которые совместимы с активацией экспрессии данным промотором/энхансером.
В одном варианте настоящего изобретения кассета рекомбинации включает последовательность, указанную в 8Εβ ΙΌ N0: 1, простирающуюся от примерно нуклеотида 1 до примерно нуклеотида 2704 (например, от 1 до 2700, до 2701, до 2702, до 2703, до 2705, до 2706, до 2707 или до 2708). Другой пример относится к кассете рекомбинации, которая включает последовательность от примерно нуклеотида 1 до 2635 (например, от 1 до 2633, до 2634, до 2636 или 2637) в 8Εβ ΙΌ N0: 2. Кассета рекомбинации, показанная на участке от 1 до 2704 или от 1 до 2635 в 8Εβ ΙΌ N0: 1 или 2, соответственно, включает множество отдельных доменов, таких как участок промотора/энхансера СМУ ΙΕ1, имеющий последовательность, указанную далее, от примерно х1 до примерно х2 в 8Εβ ΙΌ N0: 1 или 2, где х1 обозначает нуклеотид от положения 1 до положения 70 и х2 обозначает нуклеотид от положения 770 до положения 780 (например, от примерно положения 63 до примерно положения 776 в 8Εβ ΙΌ N0: 1 или 2). Другой домен в кассете рекомбинации включает вставочную последовательность варьирующей длины (УЫУ8), содержащую сайт донора сплайсинга и сайт акцептора сплайсинга. УЫУ8 может содержать по меньшей мере 50 п.н. в длину (например, по меньшей мере 100, 150, 200 или 250 п.н.) и может включать доноры и акцепторы сплайсинга из любого известного источника (см., например, Уагаш е1 а1., Аппи Вех Вюрйук Вюшо1 81гис1 27:407-45 (1998) и Кошпд, Ειπ. 1 Вюсйеш 219:25-42 (1994)). Подходящий вставочный домен может включать полностью весь интрон А из генома СМУ любого штамма или может включать более мелкий фрагмент, содержащий 5'-последовательность, в которую входит сайт донора сплайсинга, лигированный с 3'-последовательностью, содержащей сайт акцептора сплайсинга. Например, УЫУ8 включает нуклеотиды от примерно х3 до примерно х4 из 8Εβ ΙΌ N0: 1, где х3 обозначает нуклеотид в положении 770-780 и х4 обозначает нуклеотид в положении 1300-1310 (например, 776-1304 в 8Εβ ΙΌ N0: 1). В другом примере УЫУ8 включает нуклеотиды от примерно х3 до примерно х4 в 8Εβ ΙΌ N0: 2, где х3 обозначает нуклеотид в положении 770-780 и х4 обозначает нуклеотид в положении 1300-1310 (например, 776-1309 в 8Εβ ΙΌ N0: 2). Вставочная последовательность, идущая за промотором/энхансером СМУ ΙΕ1, может варьировать по размеру и включать до 317 нуклеотидов из числа присутствующих в 8Ε0 ΙΌ N0: 1 или 2. Сайт множественного клонирования может присутствовать после
- 2 010059 (т.е. по ходу считывания информации) участка УЫУ8 (например, на участке нуклеотидов 1310-1418 в 8ЕО ΙΌ N0: 1, который включает сайты ΝΗ3Ι, ВатН1, ΚρηΙ, ЕсоРф Рте1, РкН, ЕсоРУ. ΝοΐΙ, ХйоЕ Ара1 и Рте1; на участке нуклеотидов 1309-1332 в 8ЕО ΙΌ N0: 2. который включает сайты ЕсоРУ, ΝοίΙ, Χ1οΙ). В кассете рекомбинации могут быть созданы с использованием известных в данной области методик другие или дополнительные сайты рестрикции. Например, на фиг. 3 показаны два множественных сайта клонирования (см., например, сайты клонирования, начинающиеся на участке примерно 1309 и 6370), которые способствуют множественному клонированию родственных или неродственных полинуклеотидов. Данный вектор, включающий двойные кассеты, как показано на фиг. 3, также содержит терминатор между двумя кассетами.
Кроме того, любой специалист в данной области понимает, что можно заменять, добавлять или делетировать один или несколько нуклеотидов на концах конкретных доменов, без изменения функциональности домена, и/или кассеты, и/или вектора в целом. Например, вариация от 1 до 10 нуклеотидов на любом конце любого из идентифицированных в описании доменов будет, по всей вероятности, включать функциональный домен для предполагаемой цели использования данного домена, кассеты и/или вектора по настоящему изобретению.
Кассета рекомбинации также включает домен полиА-сигнала. Домен полиА-сигнала может быть получен из источников, взятых от человека (например, человеческого гормона роста (йОН полиА)), или от быка (например, бычьего гормона роста (ВОН полиА)), или других источников животного происхождения. Домен полиА-сигнала может быть получен из гена йОН, который может варьировать по своей 3'иТР последовательности, например, от одной аллели к другой. Одна аллель гена йОНу описана в ОепВапк, Νο. доступа Κ00470 (8Е0 ГО N0: 3). Пример домена полиА-сигнала для ВОН включает указанную ниже последовательность, которая содержит участок от примерно 1143 до примерно 1668 нуклеотидов в 8Е0 ГО N0: 1 и участок от примерно 1375 до примерно 1600 нуклеотидов в 8Е0 ГО N0: 2. Неприродные варианты доменов полиА-сигнала могут быть получены путем мутагенеза, включая методики, разработанные применительно к полинуклеотидам, клеткам или организмам. Вариант домена полиА-сигнала из гена ЮН включает домен полиА-сигнала, который представляет собой вариации домена полиА-сигнала для йОН дикого типа, в которых все еще сохраняется способность воспринимать сигнал терминации транскрипции и/или стабилизации мРНК. Например, домен сигнала полиаденилирования может включать последовательность домена сигнала полиаденилирования для йОНу. Рассматривается любой домен полиА-сигнала, который включает непрерывную нуклеотидную последовательность с длиной по меньшей мере 100 нукл. (например, по меньшей мере 200, 300, 400, 500 или 600 нукл.), включая канонический сайт ААТААА, из гена йОНу.
Дополнительно, настоящее изобретение относится к последовательностям, которые включают вариации относительно предшествующих последовательностей до 8% (например, имеющие 92% идентичности с последовательностью 8Е0 ГО N0: 3 или ее заданным доменом). Например, в настоящее изобретение включен полинуклеотид, обладающий 95% идентичностью к нуклеотидам 1-2704 в 8Е0 ГО N0: 1 или 1-2635 в 8Е0 ГО N0: 2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему кассету рекомбинации. В контексте настоящего описания термин вектор обозначает молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), способную к автономной репликации при введении в клетку-реципиент (например, в бактериальную клетку или клетку млекопитающего, такую как клетка СН0). Примерами векторов являются плазмиды и вирусы. Способ экспрессии на основе вектора экспрессии хорошо известен и включает использование клеточных ферментов и способы создания продуктов экспрессии на основе интересующих полинуклеотидов. Векторы экспрессии представляют собой векторы, которые способны вовлекаться в экспрессию клонированного полинуклеотида в клетке-хозяине, который может быть того же самого или иного типа относительно клетки, используемой для репликации или размножения вектора. Многие векторы экспрессии млекопитающих могут множиться в обычных бактериях (клеткахреципиентах), но экспрессия интересующего полинуклеотида осуществляется в клетках млекопитающих (клетках-хозяевах), но не в бактериях.
Векторы по настоящему изобретению включают вектор клонирования для получения интересующего полинуклеотида; регуляторные элементы транскрипции (например, участки промотора/энхансера СМУ ΙΕ1), достаточные для осуществления транскрипции полинуклеотида, встроенного в сайт клонирования в клетке-хозяине; элементы трансляции, достаточные для осуществления трансляции транскрипта РНК указанного полинуклеотида в клетке-хозяине и (при желании) элементы репликации, необходимые для осуществления репликации указанного вектора в клетке-хозяине или другой клетке-реципиенте, использованной для размножения вектора. Векторы по настоящему изобретению способны вовлекаться в такую экспрессию временно или стабильно в клетках-хозяевах (например, за счет гомологичной рекомбинации в геноме клетки-хозяина).
В конкретном варианте вектор по настоящему изобретению включает (1) последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 1 или 2; (2) последовательность, которая является комплементарной к последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 1 или 2; (3) последовательность, которая по меньшей мере на 80% (или по меньшей мере на 90, 95, 98 или 99%) идентична 8Е0 ГО N0: 1 или 2 или их комплементам; или
- 3 010059 (4) последовательность, включающую 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 2, на участке примерно от 1 до 2704 или 2635 нуклеотида, соответственно, и включающую также интересующий полинуклеотид и/или селектируемый маркер.
Вектор по настоящему изобретению включает 8Е0 ГО N0: 1 или 2, или один или несколько следующих доменов, если они содержат сайт для ЕВТ. Например, в векторе присутствует участок промотора/энхансера СМУ ΙΕ1, имеющий последовательность, показанную от примерно х1 до примерно х2 в 8Е0 ГО N0: 1, где х1 обозначает нуклеотид в положении от 1 до 70, и х2 обозначает нуклеотид в положении от 770 до 780 (т.е. примерно от 1 до 776 в 8Е0 ГО N0: 1). В другом аспекте изобретения в векторе присутствует участок промотора/энхансера СМУ ΙΕ1, имеющий последовательность, показанную от примерно х1 до примерно х2 в 8Е0 ГО N0: 2, где х1 обозначает нуклеотид от 1 до 60 и х2 обозначает нуклеотид от 770 до 780 (т.е. примерно от 1 до 776 в 8Е0 ГО N0: 1). Другой домен вектора экспрессии по настоящему изобретению включает вставочную последовательность варьирующей длины (УЫУ8), содержащую сайт донора сплайсинга и сайт акцептора сплайсинга. Например, УЫУ8 включает нуклеотиды от примерно х3 до примерно х4 в 8Е0 ГО N0: 1, где х3 обозначает нуклеотид от 770 до 780 и х4 обозначает нуклеотид от 1300 до 1310 нуклеотидов (например, 776-1304 в 8Е0 ГО N0: 1). В другом примере УЫУ8 включает нуклеотиды от примерно х3 до примерно х4 в 8Е0 ГО N0: 2, где х3 обозначает нуклеотид от 770 до 780 и х4 обозначает нуклеотид от 1300 до 1310 (например, 776-1309 в 8Е0 ГО N0: 2). Сайт множественного клонирования может присутствовать после (т.е. по ходу считывания информации) участка УЪ1У8 (участок нуклеотидов 1310-1418 в 8Е0 ГО N0: 1 включает сайты N431. ВатН1, ΚρηΙ, ЕсоВ1, Рте1, РяП. ЕсоВУ, N011, ΧΙιοΙ, Ара1 и Рте1; участок нуклеотидов 1309-1332 в 8Е0 ГО N0: 2 включает сайты ЕсоВУ, N011, ΧΙιοΙ). В векторе экспрессии могут быть созданы разные или дополнительные сайты рестрикции с использованием методик, известных специалистам в данной области. Вектор экспрессии также включает домен полиА-сигнала.
Домен полиА-сигнала может быть получен из источников человеческого происхождения (например, из человеческого гормона роста (ЙСН полиА)), или от быка (например, бычьего гормона роста (ВОН полиА)), или других источников животного происхождения. Домен полиА-сигнала может быть получен из гена ЙСН, который может варьировать по своей 3'-иТВ последовательности, например, от одной аллели к другой. Одна аллель гена НСНу описана в ОепВапк, № доступа Κ00470 (8Е0 ГО N0: 3). Пример домена полиА-сигнала для ВОН включает последовательность, содержащую участок от 1143 до 1668 нуклеотида в 8Е0 ГО N0: 1 и участок от 1375 до 1600 нуклеотида в 8Е0 ГО N0: 2. В векторе по настоящему изобретению может также присутствовать один или несколько селектируемых маркеров.
Кассеты и векторы рекомбинации по настоящему изобретению имеют явное преимущество в сравнении с кассетами и векторами рекомбинации, известными в настоящее время. Например, кассеты и векторы по настоящему изобретению позволяют осуществлять стабильную интеграцию интересующего полинуклеотида в клетку-хозяина, включающую один или несколько сайтов для ЕВТ, с использованием селектируемого маркера бЫг, который является ауксотрофным по своей природе и позволяет осуществлять простую и эффективную селекцию трансформированных клеток-хозяев. Отбор успешно трансфицированных клеточных линий обычно основан на использовании интегрированного селектируемого маркера, который придает устойчивость к цитотоксическим средствам (например, резистентность к антибиотикам). Неауксотрофные селектируемые маркеры придают устойчивость к веществам, которые в норме способны уничтожить организм (например, клетку). Когда такое цитотоксическое вещество вводят в организм, выживают только те варианты, в которых содержится данный селектируемый маркер. Таким образом, в случае типичных селектируемых маркеров, требуется, чтобы было добавлено экзогенное вещество для отбора клеток, которые являются устойчивыми. При этом должны добавляться соответствующие концентрации цитотоксического вещества, что требует дополнительных усилий со стороны технического специалиста или исследователя. Например, если добавляется слишком много цитотоксического вещества, то организм, который включает данный селектируемый маркер, может быть уничтожен за счет снижения эффективности трансфекции/трансформации с соответствующими последствиями такого процесса. Тогда как настоящее изобретение, наоборот, относится к ситуации, при которой селектируемый маркер не добавляют, но сами клетки имеют селектируемый маркер (например, бЫг), и в этой связи, способны расти в определенной среде без специфических добавок, что необходимо для организмов, не содержащих селектируемый маркер для роста.
Дигидрофолятредуктаза (ДГФР) представляет собой НАДФ-зависимый фермент (ЕС 1.5.1.3), который катализирует синтез тетрагидрофолята, метаболита, необходимого для синтеза дТМФ, глицина и пуринов. В отсутствие полинуклеотида, кодирующего ПНЕВ, клетка должна расти на среде, содержащей дТМФ, глицин и/или пурины. В том случае, когда селектируемый маркер ПНЕВ присутствует в клетке, экзогенные пурины могут быть удалены, и те клетки, которые содержат маркер ПНЕВ, продолжают расти и пролиферировать, тогда как и клетки без ПНЕВ погибают. Соответственно, настоящее изобретение позволяет тратить меньшие усилий на отбор организмов (например, клеток), которые были трансфицированы/трансформированы.
Система ЕЬР по настоящему изобретению позволяет осуществлять стабильную интеграцию и экспрессию интересующего полинуклеотида в любой желательной клетке-хозяине млекопитающего в кон
- 4 010059 кретном положении генома. Клеточная линия клеток-хозяев ЕЬР устанавливается путем трансфекции единичного целевого домена рекомбинации ЕЬР (ЕКТ) в геном выбранной линии клеток-хозяев; при этом создается вариант линии клеток-хозяев, которую затем используют для последующих ЕЬР трансфекций/рекомбинаций. Как только получают такую линию клеток-хозяев, в геном клетки-хозяина можно осуществить стабильное интегрирование любого интересующего полинуклеотида путем рекомбинации ДНК с участием ЕЬР-рекомбиназы в сайте ЕКТ (см. фиг. 1). Интересующий полинуклеотид может эффективно обмениваться с геномом хозяина, причем всегда в идентичных положении и ориентации. Поскольку все трансфицированные клетки содержат интересующий полинуклеотид, интегрированный в одно и то же положение генома, выделения клональных клеточных линий не требуется, поскольку все трансфицированные клетки генетически одинаковы.
Настоящее изобретение также относится к линии клеток-хозяев, которую получают путем трансфекции клеток яичника китайского хомяка (СНО)-ОС44 сайтом мишени рекомбинации (например, сайтом рекомбинации ЕКТ). Такая клеточная линия СНО-ЭС44 не содержит функционального гена дигидрофолятредуктазы (бМг) и в этой связи требуется добавление экзогенного глицина, пуринов и тимидина (пиримидина) для роста. Такая клеточная линия должна поддерживаться в культуральной среде с добавлением нуклеозидов. При трансфекции кассетой/вектором рекомбинации по настоящему изобретению, которые содержат функциональный ген бМг, селекцию проводят при культивировании клеток в среде, не содержащей пуринов и тимидина. При восстановлении такой линии клеток-хозяев могут быть очень быстро получены стабильные клеточные линии, экспрессирующие интересующий(ие) полинуклеотид(ы).
Настоящее изобретение также относится к системе рекомбинации, включающей кассету и/или вектор рекомбинации по настоящему изобретению и клетку-хозяина, включающую сайт ЕКТ. В одном аспекте настоящего изобретении клетка-хозяин представляет собой клетку СНО или клетку, полученную из СНО, которая включает сайт ЕКТ, рекомбинантно встроенный в геном клетки-хозяина. Данная система (например, СНО клетка или полученная из СНО клетка и кассета/вектор рекомбинации) представляет собой мощный инструмент для получения от 10 до 40 мг/л рекомбинантного белка в клетке-хозяине СНО менее чем за 6 недель (например, со значением 1СА 15х107 (клеточных дней)/мл в ходе 10-дневного роста в биореакторе). Кроме того, требуется минимальная работа для установления таких стабильных клеточных линий.
Способы и композиции по настоящему изобретению позволяют легко осуществлять интеграцию интересующего полинуклеотида в заданном сайте-мишени эндогенного полинуклеотида в клеткехозяине. Сайт-мишень эндогенного полинуклеотида может относиться к природному полинуклеотиду (например, к полинуклеотиду, который имеется в геноме клетки-хозяина и не был встроен по рекомбинантной методике), или он может представлять собой полинуклеотид, который был ранее сконструирован и введен в организм хозяина для облегчения селекции, экспрессии или рекомбинации в организме хозяина. В контексте настоящего описания термины заданная мишень эндогенного полинуклеотида и заданная мишень относятся к полинуклеотидным последовательностям, содержащимся в клеткемишени. Такая заданная мишень включает, например, хромосомные последовательности (например, структурные гены, интронные последовательности, 5'- или 3'-некодирующие последовательности, регуляторные последовательности, включающие промоторы и энхансеры, рекомбинаторные горячие точки, повторы, интегрированные последовательности провируса, шпилечные последовательности, палиндромы) и эписомные или внехромосомные последовательности (например, реплицирующиеся плазмиды или интермедиаты вирусной или паразитарной репликации), которые включают последовательности хлоропластной и митохондриальной ДНК. Термины заданный или заранее отобранный означают, что последовательность-мишень может быть выбрана на основе предсказанной последовательности и не ограничивается определенными сайтами, распознаваемыми некоторыми сайт-специфичными рекомбиназами (например, ЕЬР-рекомбиназой или СКТ-рекомбиназой). В некоторых вариантах заданная эндогенная полинуклеотидная мишень отличается от природного терминального полинуклеотида (например, экзогенный полинуклеотид, паразитарная, микоплазменная или вирусная последовательность). Экзогенный полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, который был перенесен (например, с помощью рекомбинантных методик молекулярной биологии) в клетку-хозяина. Например, экзогенные полинуклеотиды, которые были перенесены путем микроинъекции или трансфекции в клетку, являются экзогенными полинуклеотидами. Термин природный в контексте настоящего описания применительно к объекту означает, что данный объект может быть обнаружен в природе. Например, полинуклеотид, который присутствует в организме (включая вирус), может быть выделен из природного источника, который не был модифицирован человеком и является природным.
Рекомбинантный домен в кассете/векторе рекомбинации по настоящему изобретению направляет кассету/вектор в специфическое положение на хромосоме внутри генома организма-хозяина благодаря гомологии, которая существует между доменом рекомбинации и соответствующей заданной мишенью эндогенного полинуклеотида, и вводит желательную генетическую модификацию посредством способа, известного под названием гомологичная рекомбинация.
Термины гомологичный или гомология относятся к двум или более последовательностям нуклеиновых кислот, которые являются идентичными или достаточно близкими (например, идентичными на
- 5 010059
97% или более) и которые способны гибридизироваться друг с другом или подвергаться межмолекулярному обмену. Процент идентичности последовательностей вычисляют, исключая небольшие делеции или добавки, которые составляют менее 25% относительно эталонной последовательности. Эталонная последовательность может представлять собой подмножество более крупных последовательностей, таких как часть гена, или фланкирующая последовательность, или повторяющаяся часть хромосомы. Однако эталонная последовательность включает по меньшей мере 12-18 нуклеотидов в длину, по меньшей мере примерно 30 нуклеотидов в длину и может составлять по меньшей мере примерно 50-100 нуклеотидов в длину. В целом, эффективность рекомбинации повышается по мере увеличения длины и/или процента гомологии между доменом рекомбинации и заданной мишенью эндогенного полинуклеотида.
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более молекул нуклеиновой кислоты относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые одинаковы или имеют заданный процент одинаковых нуклеотидов, при сравнении и выравнивании с целью выявления максимального соответствия в данном окне сравнения, при измерении с использованием алгоритма сравнения или при ручном сопоставлении и визуальном осмотре. Данное определение также относится к комплементу последовательности (например, к комплементу последовательности, указанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, или ее фрагменту, включающему кассету рекомбинации). Например, кассета рекомбинации и ее фрагменты включают такие варианты с показателями идентичности на уровне нуклеотидной последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 95%, примерно на 97%, примерно на 98% или примерно на 99% идентичны заданной части в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 (например, нуклеотидам 1-719, 1-1254 и т.п., в последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 1). Таким образом, если последовательность имеет требуемую идентичность на уровне последовательности к полной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 или ее домену, то она может функционировать как кассета или домен рекомбинации по настоящему изобретению, соответственно.
Для сравнения на уровне последовательности обычно используют одну последовательность, которая выполняет функцию эталонной последовательности и с которой проводят сравнение исследуемой последовательности. В случае использования алгоритма для сравнения последовательностей, в компьютер вводят информацию об исследуемой и эталонной последовательностях, разрабатывают координаты подпоследовательности, при необходимости, и определяют программные параметры алгоритма последовательности. Могут быть использованы заданные по умолчанию параметры программы или могут быть разработаны альтернативные параметры. Далее алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности на уровне последовательности данной(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности, на основании разработанных или заданных по умолчанию параметров программы. Термин окно сравнения в контексте настоящего описания означает соотнесение с сегментом любого из множества соприкасающихся положений, выбранных из группы, состоящей из 25-600, обычно примерно 50-200, чаще примерно 100-150 положений, по которым может проводиться сравнение данной последовательности с эталонной последовательностью по одному и тому же набору соприкасающихся положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения известны в данной области. Известны также разные алгоритмы, которые включают, например, алгоритм локальной гомологии Смита и Ватермана (8шйй & \Уа1сгтап, Λάν. Αρρί. Ма1б. 2:482 (1981)), алгоритм сопоставления по гомологии (№еб1етаи & ХУипксй. 1. Мо1. ΒίοΙ. 48:443 (1970)), поиск сходства по методу Пирсона и Липмана (Реагкои & Ыртаи, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 85:2444 (1988)), а также различные компьютеризированные варианты данных алгоритмов (САР, РШЕИР, ВЕ8ТР1Т, РА8ТА и ТРА8ТА в программном обеспечении ХУксопчп Сеиебск 8оП\саге Раскаде, Сеиебск Сотри1ег Сгоир, 575 8с1еисе Эг., Маб1кои, XVI) или с помощью ручного выравнивания и визуального осмотра.
Для целей определения процента идентичности на уровне последовательности по данному изобретению (например, существенного сходства или идентичности) используют алгоритм ВЬА8Т, который описан Альтшулем (А11ксйи1, 1. Мо1. Вю1. 215:403-410, 1990). Программное обеспечение для проведения анализа в рамках ВЬА8Т доступно для общественного пользования через Национальный Центр Биотехнологической Информации (на \\'еЬ-странице Национального Центра Биотехнологической Информации Щабоиа1 Сеи1ег £ог Вю1есйио1оду 1и£огтабои) исЬ^.и1т.и^Ь.дον/). Данный алгоритм включает вначале идентификацию пар последовательностей с высоким баллом (Н8Р) путем идентификации коротких слов длиной V в запрашиваемой последовательности, которые либо полностью соответствуют, либо удовлетворяют некоторым положительным пороговым значениям в баллах пороговому значению Т при сопоставлении со словом той же длины в базе данных последовательностей. Параметр Т означает пороговую величину, используемую для оценки порогового значения соседства слов. Указанная исходная величина степени соседства слов действует как затравка для первоначальных поисков с целью нахождения более длинных Н8Р, содержащих их. Указанные высокие значения по соседству слова затем расширяют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, настолько, насколько может быть повышено кумулятивное сопоставление по баллам. Кумулятивные баллы вычисляют с использованием, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров М (присваиваемые баллы для случая пары спаривающихся остатков; всегда >0) и N (штрафные очки, присваиваемые в случае неспаривающихся остатков, всегда <0).
- 6 010059
Расширение попаданий при соответствии слов в каждом направлении обрывается в том случае, когда кумулятивный балльный показатель, определяемый при выравнивании, падает на значение X от его максимально достижимого значения; кумулятивный показатель баллов опускается до 0 или ниже из-за накопления одного или более результатов сопоставления в виде остатков с негативным показателем; или при достижении конца любой последовательности. Параметры Л, Т или X в алгоритме ВБА8Т определяют чувствительность и скорость сопоставления и включают следующие параметры для проведения сравнительного анализа нуклеотидов: длина слова (Л) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=4. В случае аминокислотных последовательностей программа ВБА8ТР использует значение длины слова (Л) 3, параметр ожидания (Е) 10 и балльную матрицу ВЕ08ИМ62 (см., например, НешкоГГ, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 89:10915, 1989).
Алгоритм ВЬА8Т также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Кагйп, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 90:5873-5787, 1993). Одним из критериев сходства последовательностей, оцениваемых в рамках алгоритма ВЬА8Т, является наименьшая сумма вероятностей (Р(№)), которая дает указание на вероятность спаривания между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями, осуществляемыми случайным образом. Нуклеиновая кислота считается сходной с эталонной последовательностью, если наименьшая сумма вероятностей меньше чем 0,1. Например, она может быть меньше чем примерно 0,01 или меньше чем примерно 0,001.
В настоящее изобретение также включаются полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с полинуклеотидной последовательностью, показанной в виде 8ЕО ΙΌ N0: 1 или 2, или их доменом. Фраза селективно (или специфически) гибридизуется с относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы с конкретным эталонным полинуклеотидом в строгих условиях гибридизации. Фраза строгие условия гибридизации относится к условиям, при которых зонд преимущественно гибридизуется с подпоследовательностью-мишенью в сложной смеси нуклеиновых кислот, но не с другими последовательностями. Строгие условия зависят от последовательности и различаются в разных случаях, например, зависят от длины зонда. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при высоких температурах. Обширный обзор по вопросу гибридизации нуклеиновых кислот приведен в соответствующем руководстве (Туккеп, Тес11пк|иек ίη Вюсйетщйу апб Мо1еси1аг Вю1оду-НуЬпб1/а1юп νίΐΗ №ис1ек РгоЬек, 0уегу1е\\' оГ рг1пс1р1ек оГ НуЬг1б1ха(1оп апб 1Не к1га1еду оГ пис1ек ас1бк аккаук (1993)). В основном, строгие условия выбираются так, чтобы они были на 5-10°С ниже, чем температура точки плавления (Тт) для конкретной последовательности при заданных значениях ионной силы и рН. Тт представляет собой температуру (в определенных условиях ионной силы, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных к мишени, гибридизуется с целевой последовательностью в равновесном соотношении (поскольку целевые последовательности присутствуют в избытке, при Тт 50% зондов находятся в равновесном состоянии). Строгие условия будут такими, при которых концентрация соли составляет менее чем примерно 1,0 М ионов натрия, в типичном случае примерно от 0,01 до 1,0 М концентрации ионов натрия (или других солей) при рН 7,0-8,3 и при температуре, которая по меньшей мере составляет 30°С для коротких зондов (например, длиной примерно 10-50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, при температуре 60°С для длинных зондов (например, крупнее, чем примерно 50 нуклеотидов). Строгие условия могут быть достигнуты при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для проведения селективной или специфической гибридизации позитивный сигнал (т.е. идентификация нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению) превышает примерно в 2 раза фоновый уровень гибридизации. Для целей настоящего изобретения понятие умеренно строгих условий гибридизации означает, что гибридизация проводится при температуре примерно 42°С в растворе для гибридизации, содержащем 25 мМ КР04 (рН 7,4), 5Х 88С, 5Х раствор Денхарта, 50 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, 50% формамида, 10% сульфата декстрана и 1-15 нг/мл зонда, а промывку осуществляют при температуре 50°С промывным раствором, содержащим 2Х 88С и 0,1% додецилсульфата натрия. Условия гибридизации высокой строгости означают, что гибридизацию проводят при температуре 42°С в растворе для гибридизации, содержащем 25 мМ КР04 (рН 7,4), 5Х 88С, 5Х раствор Денхарта, 50 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, 50% формамида, 10% сульфата декстрана и 1-15 нг/мл зонда, а промывку осуществляют при температуре 65°С промывным раствором, содержащим 0,2Х 88С и 0,1% додецилсульфата натрия.
Способы и композиции по настоящему изобретению находят применение при модификации клеткихозяина посредством введения в нее, делеции или замещения эндогенного полинуклеотида путем гомологичной рекомбинации с использованием кассеты/вектора по настоящему изобретению.
Кассета/вектор рекомбинации по настоящему изобретению может включать селектируемый маркер. Термин маркер или селектируемый маркер обозначает маркер, используемые для селекции, который позволяет выделять редко трансфицируемые клетки, экспрессирующие маркер, из множества обработанных клеток в популяции. Конкретные примеры селектируемых маркеров включают такие маркеры, которые кодируют белки, придающие резистентность к цитостатическим или цитоцидным лекарственным препаратам, таким как белок ПНЕВ, который придает резистентность к метотрексату (Л1д1ег е! а1., Ргос. №аЙ. Асаб. 8сг И8А 77:3567, (1980); О'Наге е! а1., Ргос. №а!1. Асаб.. 8сг И8А 78:1527, (1981)); белок ОРЕ,
- 7 010059 который придает резистентность к микофенольной кислоте (МиШдап & Вегд, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 78:2072 (1981)); маркер резистентности к неомицину, который придает резистентность к аминогликозиду 6-418 (Со1Ьегге-6агарт е! а1., 1. Мо1. ΒίοΙ. 150:1 (1981)); белок Нудго, который придает устойчивость к гигромицину (8ал1егге е! а1., 6епе 30:147 (1984)); и маркер резистентности к зеоцину (2еост™) (коммерчески доступный от компании 1пуйгодеп). Дополнительно, тимидинкиназа из вируса простого герпеса (^1§1ег е!. а1., Се11 11:223 (1977)), фосфорибозилтрансфераза гипоксантингуанина (8хуЬа15ка & ЗхуЬаРкк Ргос. №И1. Асаб. 8ск И8А 48:2026 (1961)) и аденинфосфорибозилтрансфераза (Ьо^у е! а1., Се11 22:817 (1980)) могут использоваться на !к-, йдрй- или арй-клетках, соответственно. Другие селектируемые маркеры включают №-ацетилтрансферазу пуромицина или аденозиндезаминазу.
Особое преимущество дает маркер бЫг. ΌΗΡΚ. представляет собой фермент, который требуется для синтеза пиримидинов. Клетки, в которых отсутствует функциональный ΌΗΡΚ или которые не экспрессируют ΌΗΡΚ, нуждаются в пиримидинах для роста. Клетка-хозяин, которая является бЫг-, может быть трансфицирована вектором бЫг, что приводит к восстановлению ее способности синтезировать пиримидины. При удалении среды, содержащей экзогенные пиримидины, выживают только те клетки, которые включают экзогенно введенный ген бЫг. И наоборот, при использовании маркеров, которые позволяют проводить селекцию на основе способности клеток расти в присутствии цитотоксических средств, вести отбор труднее всего. Например, в том случае, когда клетку трансфицируют геном резистентности, добавляют различные концентрации цитотоксических средств для отбора клеток, которые включают ген резистентности. В некоторых случаях может быть добавлено или слишком много цитотоксического средства или недостаточно, и в этих случаях селекция будет неэффективной и/или ненадежной.
Последовательности 8ЕО ΙΌ №О: 1 и 2 включают ген дигидрофолятредуктазы (бЫг) (например, включают последовательность с участком от примерно 2007 нуклеотида до примерно 2567 нуклеотида в 8ЕО ΙΌ №О: 1; и с участком от примерно 1939 нуклеотида до примерно 2499 нуклеотида в 8ЕО ΙΌ №О: 2). Кассета/вектор рекомбинации по настоящему изобретению может включать дополнительные элементы промотора/энхансера и регуляторные участки (например домены полиаденилирования). Такие дополнительные регуляторные элементы и домены полиаденилирования могут фланкировать (например, могут непосредственно примыкать к 5'- и З'-концам) селектируемый маркер интересующего полинуклеотида. Ген бЫг в таких векторах фланкирован участком полиаденилирования из 8У40 (например, представляет собой участок от примерно 2568 нуклеотида до примерно 2704 нуклеотидов и от примерно 2500 нуклеотида до примерно 2635 нуклеотида в 8ЕО ΙΌ №О: 2, соответственно).
Кассета и/или вектор рекомбинации по настоящему изобретению включает рекомбинантный домен, состоящий по меньшей мере примерно из 10-100 нуклеотидов, в типичном случае по меньшей мере примерно 20-100 нуклеотидов в длину, но может быть длиннее (например, составляет в длину по меньшей мере примерно 250-500 нуклеотидов или примерно 500-2000 нуклеотидов в длину или больше). Длина рекомбинантного домена может частично определяться наличием гомологии с заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью. Соответственно, длина гомологии может быть отобрана по усмотрения практикующего специалиста на основе состава последовательности и сложности заданной(ых) последовательности(ей) эндогенного полинуклеотида-мишени и имеющегося в данной области соответствующего руководства. Рекомбинантный домен включает по меньшей мере одну последовательность, которая, по существу, соответствует или, по существу, является комплементарной к заданному эндогенному полинуклеотиду (например, последовательности ДНК полинуклеотида, расположенного в целевой клеткехозяине, такой как хромосомный, митохондриальный, хлоропластный, вирусный, эписомный или микоплазменный полинуклеотид). Такие нуклеотидные последовательности рекомбинантного домена служат в качестве матриц для гомологичного спаривания с заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью. При нацеливании интересующего полинуклеотида в составе вектора на геном клетки-хозяина участки гомологии обычно располагаются непосредственно или в окрестности 5'- или 3'-конца(ов) интересующего полинуклеотида (Веппйет е! а1., (1992) Мо1ес. Се11. Вю1. 12:360, указанная работа включена в настоящее описание в качестве ссылки). Не связывая себя приверженностью к какой-либо теории, следует отметить, что добавление рекомбиназ позволяет осуществлять более эффективное нацеливание с использованием нуклеотидной последовательности рекомбинантного домена, имеющей короткие (например, примерно 10-1000 пар нуклеотидов в длину) сегменты гомологии. В соответствии с настоящим изобретением рекомбинантный домен расположен в сайте ΡΚΤ.
В типичном случае рекомбинантный домен включает последовательность, которая имеет высокую степень гомологии с заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью, и обычно идентичен. В типичном случае нуклеотидная последовательность рекомбинантного домена по настоящему изобретению составляет примерно от 10 до 35 нуклеотидов в длину, но может достигать примерно 20-100 нуклеотидов в длину или примерно 100-500 нуклеотидов в длину, хотя степень гомологии последовательностей между рекомбинантным доменом и заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью будет определять оптимальную и минимальную длину (например, 6-С обогащенные последовательности обычно термодинамически более стабильны и в основном требуют более коротких рекомбинантных доменов). В этой связи, и длина рекомбинантного домена, и степень гомологии на уровне последовательности определяются относительно конкретной заданной последовательности.
- 8 010059
Кассету рекомбинации по настоящему изобретению и/или вектор по настоящему изобретению вводят в клетку-хозяина, содержащую заданный эндогенный полинуклеотид-мишень, в основном с использованием по меньшей мере одного белка рекомбиназы (например, рекомбиназы Е1р). В некоторых случаях кассету или вектор рекомбинации инкубируют с Р1р или другой рекомбиназой до введения в клеткухозяина, так чтобы белок(ки) рекомбиназы мог/могли быть погружен(ы) в кассету рекомбинации или вектор рекомбинации.
Рекомбиназы представляют собой белки, которые при включении в интересующий полинуклеотид, содержащий домен рекомбинации, приводят к измеряемому повышению частоты рекомбинации и/или частоты локализации между интересующим полинуклеотидом и заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения может быть достигнуто повышение частоты рекомбинации от 10 до 1000 раз.
Рекомбиназа относится к семейству КесА-подобных белков рекомбинации, которые имеют, по существу, все или большую часть одних и тех же функций, в частности: (1) способность белка рекомбиназы соответствующим образом связываться и располагать интересующий полинуклеотид, включающий домен рекомбинации, на гомологичной мишени и (и) способность комплексов белок рекомбиназы/полинуклеотид-мишень эффективно находить и связываться с комплементарными эндогенными последовательностями. Лучше всего среди них охарактеризован гесА белок из Е. сой. Дополнительно к белку Е. сой дикого типа было идентифицировано множество мутантных гесА-подобных белков (например, гесА803; см. Маб1га.)и е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ст И8А 85(18):6592 (1988); Маблащ е! а1., Вюсйет. 31:10529 (1992); Багету е! а1., 1. Вю1. Сйет. 267:20648 (1992)). Кроме того, многие организмы имеют гесА-подобную рекомбиназу с активностью по переносу цепей (например, Бищка\\'а е! а1., Ыис1. Ас1б. Кек. 13:7473 (1985); Шей е! а1., Се11 44:885 (1986); Шей е! а1., 1. Вю1. Сйет. 264:5089 (1989); Е1зйе1 е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ст И8А 85:3683 (1988); Сакки!о е! а1., Мо1. Сей. Сеие!. 208:10 (1987); Саиеа е! а1., Мо1. Се11 Вю1. 7:3124 (1987); Мооге е! а1., 1. Вю1. Сйет. 19:11108 (1990); Кеепе е! а1., Ыис1. Аабк Кек. 12:3057 (1984); К1те1с, Со1б кргтд Нагйог 8утр. 48:675 (1984); К1тею, Се11 44:545 (1986); Ко1обпег е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сБ И8А 84:5560 (1987); 8л§шо е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сБ И8А 85:3683 (1985); На1йгоок е! а1., 1. Вю1. Сйет. 264:21403 (1989); Е1кеп е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8сБ И8А 85:7481 (1988); МсСаййу е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сБ И8А 85:5854 (1988); Бо^епйаир! е! а1., 1. Вю1. Сйет. 264:20568 (1989), которые включены в настоящее описание в качестве ссылок). Примеры таких белков рекомбиназы включают, без ограничения: гесА, гесА803, υνκΧ и другие мутанты гесА, а также гесА-подобные рекомбиназы (Коса, А. I. Сгй. Кеу. Вюсйет. Мо1ес. Вю1. 25:415 (1990)), кер1 (Ко1обпег е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ст И8А 84:5560 (1987); Т18йко££ е! а1., Мо1ес. Се11 Вю1. 11:2593 (1991)), Ки\С (Пипбегба1е е! а1., ХПиге 354:506 (1991)), Ό8Τ2, КЕМ1, ΧΡΝ1 (Пукк!га е! а1., Мо1ес. Се11. Вю1. 11:2583 (1991)), 8ТР.а1рйа./П8Т1 (С1агк е! а1., Мо1ес. Се11. Вю1. 11:2576 (1991), НРР-1 (Мооге е! а1., Ргос. Шб. Асаб. 8ст И8А 88:9067 (1991)); и другие целевые рекомбиназы (В1кйор е! а1., Се11 69:439 (1992); 8Ыпойага е! а1., Се11 69:457 (1992), которые включены в настоящее описание в качестве ссылок). КесА может быть также очищен из Е. сой, таких штаммов Е. сой, как 1С12772 и 1С15369 (которые доступны коммерчески). Данные штаммы содержат последовательности, кодирующие гесА, на плазмидном векторе с очень высоким репликативным потенциалом, присутствующем в виде большого числа копий в клетке. Белок гесА803 представляет собой высокоактивный мутант гесА дикого типа. Описано несколько примеров белков рекомбиназы, например, из Пгокорйба, дрожжей, растений, организма человека и клеток млекопитающих, отличных от человека, биологические свойства которых аналогичны гесА (например, гесА-подобная рекомбиназа), такие как Каб51 из клеток млекопитающих и дрожжей и Рк-гес из гипертермофильных архебактерий Ругососсиккр (см., Какй1б е! а1., М.1с1е1с Ас1б Кек. 25(4):719 (1997), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). Рекомбиназа фактически может представлять собой комплекс белков. В определение рекомбиназы включаются также части или фрагменты рекомбиназ, которые сохраняют биологическую активность рекомбиназы, а также варианты или мутанты рекомбиназ дикого типа, которые сохраняют биологическую активность, такие как мутант Е. сой гесА803 с повышенной рекомбиназной активностью.
КесА образует гомологичные связи между гомологичными последовательностями и включается в качестве посредника в процесс поиска гомологии между экзогенной полинуклеотидной цепью (например, интересующим полинуклеотидом, включающим домен рекомбинации) и эндогенной полинуклеотидной цепью (например, заданной полинуклеотидной мишенью), с образованием относительно стабильных гетеродуплексов на участках с высокой степенью гомологии. Соответственно, рекомбиназы могут направлять гомологичную реакцию рекомбинации между цепями, которые являются в существенной мере, но не полностью гомологичными. Таким образом, кассета/вектор рекомбинации могут использоваться для введения нуклеотидных замещений, вставок и делеций в эндогенную последовательность ДНК и, таким образом, соответствующих аминокислотных замещений, вставок и делеций в белках, экспрессированных на основе эндогенной последовательности ДНК.
В одном варианте в качестве рекомбиназы используют гесА или габ51. Например, гесА белок получают в типичном случае из бактериальных штаммов, которые осуществляют суперпродукцию гесА белка из Е. сой дикого типа или мутантного белка гесА803. Альтернативно, гесА белок может быть приобретен, например, у компании Рйагтаста (Рткса1а^ау, Ν.Ι.).
- 9 010059
ЕЬР-рекомбиназа представляет собой белок, который катализирует сайт-специфическую реакцию рекомбинации. ЕЬР был клонирован и экспрессирован в Ε.οοίί (см., например, Сох, Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А 80:4223-4227, 1983) и затем был очищен почти до гомогенного состояния (см., например, МеуегЬеоп е1 а1., Ыис1. Ас1йк Век. 15:6469-6488, 1987). ЕЬР-рекомбиназа коммерчески доступна или может быть получена специалистами в данной области из источников, относящихся, например, к роду 8ассйаготусек.
Сайт ЕВТ был идентифицирован как участок, включающий два повтора из 13 пар нуклеотидов, разделенных спейсером из 8 нуклеотидных пар: например, это может быть последовательность, включающая 5'-СААСТТССТАТТСТСТАСАААСТАТАССААСТТС-3' (8ΕΟ ГО N0: 1 на участке от 1966 до 1999 нуклеотида и 8ЕЦ ГО N0: 2 на участке от 1882 до участка 1937; обозначенная курсивом последовательность относится к спейсеру). Нуклеотиды, входящие в состав спейсерного участка, могут быть замещены другим сочетанием нуклеотидов, так что два повтора по 13 пар нуклеотидов разделяются по меньшей мере 8 нуклеотидами. Фактически, нуклеотидная последовательность спейсера не является решающим фактором, хотя для специалистов понятно, что в некоторых приложениях желательно, чтобы спейсер был ассиметричным, тогда как для других приложений может использоваться палиндромный спейсер. В основном, спейсеры, присутствующие в домене рекомбинации и в сайте ЕВТ, присутствующем в клеткехозяине, идентичны друг другу. Домен рекомбинации по настоящему изобретению и сайт ЕВТ в клеткехозяине могут включать последовательность, соответствующую участку от 1966 до 1999 нуклеотида в 8ЕЦ ГО N0: 1 и участку от 1898 до 1931 нуклеотида в 8ЕЦ ГО N0: 2.
Процессы, опосредованные участием рекомбиназы, описаны также в указанных ниже публикациях: №0 00/63365, ν0 99/60108, \\Ό 00/56872, \\Ό 99/37755, патенты США № 5948653, 6074853, 5763240, 5929043 и 5989879, которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок. Следует понимать, что в композиции и способы по настоящему изобретению включают использование рекомбиназ, соответствующих тем, которые были описаны здесь, а также других рекомбиназ, известных специалистам в данной области.
Как указывалось выше, кассета и вектор рекомбинации включают регуляторные элементы. В одном аспекте настоящего изобретения указанные промоторные и необязательно энхансерные элементы могут быть получены из любого штамма цитомегаловируса, такого как описано здесь, или соответствующего тем штаммам, которые приведены в цитированных публикациях, таких как патент США № 5658795, описание которого приведено в настоящей работе в качестве ссылки. Например, в кассетах рекомбинации по настоящему изобретению применимы подходящие участки очень раннего промотора СМУ, которые могут быть получены из вектора экспрессии β-галактозидазы, функционирующего под действием промотора СМУ, СМУв (МасСгедог е1 а1., №с1. Ас1йк Век. 17:2365 (1989)).
Кассета рекомбинации может быть использована в виде голой конструкции нуклеиновой кислоты. Альтернативно, кассета рекомбинации может быть введена в виде части вектора на основе нуклеиновой кислоты (например, вектора рекомбинации, такого как было описано выше). Такие векторы включают плазмиды и вирусные векторы.
Термин интересующий полинуклеотид относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые способны транскрибироваться. Молекула может иметь смысловую или антисмысловую ориентацию относительно промотора. Антисмысловые конструкции могут использоваться для ингибирования экспрессии гена в клетке, в соответствии с известными методиками. Интересующий полинуклеотид может включать гетерологичный полинуклеотид. Г етерологичный полинуклеотид в типичном случае получают из чужеродного организма, относительно регуляторного элемента, с которым он оперативно связан в кассете или векторе рекомбинации, или может быть получен из того же самого источника, и в этом случае, он будет модифицирован относительно исходной формы. В этой связи, гетерологичный полинуклеотид, оперативно связанный с промотором, происходит из источника, отличного от того источника, из которого был получен промотор или, если он был получен из того же самого источника, то содержит модификацию относительно своей первоначальной формы. Модификация гетерологичного полинуклеотида может происходить, например, путем обработки ДНК рестриктазой с образованием фрагмента ДНК, который способен к оперативному связыванию с промотором, что приводит к модификации полинуклеотида относительно его исходной формы. Может быть использован также сайт-направленный мутагенез для модификации гетерологичного полинуклеотида. Гетерологичные полинуклеотиды могут также включать маркерные гены (например, кодирующие β-галактозидазу или зеленый флуоресцентный белок) или гены, продукты которых регулируют экспрессию других генов. Таким образом, полинуклеотиды, которые служат в качестве матриц для мРНК, тРНК и рРНК включаются в данное определение. Гетерологичный ген может быть любым аллельным вариантом гена дикого типа или может представлять собой мутантный ген. мРНК необязательно включает некоторые или все из 5'- и/или 3'-транскрибированных, но не транслированных фланкирующих природных участков или, в ином случае, ассоциированных с транслированной кодирующей последовательностью.
Интересующий полинуклеотид может также необязательно включать ассоциированные управляющие элементы транскрипции, которые в норме ассоциируются с транскрибированными молекулами, на
- 10 010059 пример, со стоп-сигналами транскрипции, доменами полиаденилирования и энхансерными элементами, функционирующими по направлению считывания информации. Интересующий полинуклеотид может кодировать терапевтический продукт или служить в качестве матрицы для него, который может представлять, например, пептид, полипептид, белок или рибонуклеиновую кислоту. Интересующий полинуклеотид в типичном случае представляет собой последовательность ДНК (такую как кДНК или геномная ДНК), кодирующую полипептидный продукт, такой как ферменты (например, β-галактозидазу); гормоны; цитокины; интерлейкины; интерфероны; ΤΝΓ; факторы роста (например, ЮЕ-1); молекулы растворимого рецептора (например, молекулы растворимого рецептора ΤΝΕ); нейротрансмиттеры или их предшественники, тропные факторы, такие как ΒΌΝΕ, ΟΝΤΕ, ΝΟΕ, ЮЕ, ОМЕ, аЕСЕ, ЬЕСЕ, ΝΤ3 и ΝΤ5; аполипопротеины, такие как ΑροΑΙ и ΑροΑίν; дистрофин или минидистрофин; белки, подавляющие развитие опухоли, такие как р53, ВЬ, Вар1 Α, ЭСС и к-геу; факторы, участвующие в коагуляции, такие как факторы VII, VIII и IX; или, альтернативно, полностью или частично природные или искусственные иммуноглобулины (например, ЕаЬ и 8сЕу. или легкая или тяжелая цепь, клонированного ЦС).
Интересующий полинуклеотид может также включать матрицу для создания антисмысловых молекул, транскрипция которых в целевой клетке позволяет осуществлять экспрессию или транскрипцию гена, или транскрипцию клеточных мРНК, подлежащих контролю. Такие молекулы могут быть, например, транскрибированы в целевой клетке в РНК, комплементарную клеточным мРНК, и могут, таким образом, блокировать их трансляцию в белок, в соответствии с известными в данной области методиками. В частности, антисмысловые молекулы могут использоваться для блокирования трансляции воспалительных или катаболических цитокинов при лечении артрита и разрежении ткани, вызванной такими цитокинами.
Интересующий полинуклеотид может в типичном случае включать полинуклеотид, применимый для диагностических или терапевтических целей. Данный полинуклеотид может быть получен в биореакторах ίη νίΐτο с использованием различных клеток-хозяев (например, клеток СО8 или клеток СНО, или их производных), содержащих кассету рекомбинации по настоящему изобретению.
Терапевтическое использование в настоящем контексте означает использование, которое может привести к ослаблению проявлений заболевания или расстройства, излечению от заболевания или расстройства и/или снижению тяжести заболевания или расстройства. Диагностическое использование включает использование молекул, способных выявлять или давать информацию относительно причины или связи молекулы с болезненным процессом, определять наличие или отсутствие заболевания или расстройства. Диагностический агент не вносит непосредственно вклада в облегчение заболевания или расстройства.
Интересующий полинуклеотид может также кодировать генный полипептид, применяемый в качестве вакцины. Полинуклеотиды, которые кодируют антигенные белки, получают из патогенных организмов, таких как, например, бактерия или вирус. Например, антигенные полинуклеотиды включают антигенные детерминанты, присутствующие в полипептиде из патогенного организма. Соответственно, могут быть получены вакцины для применения в случае таких организмов, которые вызывают, например, вирусную геморрагическую септицемию, болезнь почек бактериальной природы, вибриоз и фурункулез.
В контексте настоящего изобретения термин выделенный применительно к молекуле или композиции, таким как, например, вектор или кассета рекомбинации по настоящему изобретению или интересующий полинуклеотид, означает, что молекула или композиция была отделена по меньшей мере от одного другого соединения, такого как белок, ДНК, РНК или другие контаминанты, с которыми она ассоциирована ίη νίνο, или находится в природном состоянии. Таким образом, интересующий полинуклеотид считается выделенным, если он был отделен от любого другого компонента, с которым он ассоциирован в естественном состоянии. Выделенная композиция может быть, по существу, чистой. Выделенная композиция может быть в гомогенном состоянии. Они может быть высушена, лиофилизирована или иметь вид водного раствора. Степень чистоты и гомогенности может быть определена, например, с использованием методов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), электрофорез в агарозном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).
В контексте настоящего описания термин рекомбинантный относится к полинуклеотиду, синтезированному или полученному иным образом ίη νίΐτο (например, к рекомбинантному полинуклеотиду), к способам использования рекомбинантных полинуклеотидов для получения продуктов в клетках или других биологических системах, или к полипептиду (рекомбинантному белку), кодируемому рекомбинантным полинуклеотидом.
Рекомбинантные полинуклеотиды включают молекулы нуклеиновой кислоты из разных источников, лигированные с образованием рекомбинантной кассеты или вектора для экспрессии, например, белка слияния или продуктов, получаемых путем индуцибельной или конститутивной экспрессии с образованием полипептида (например, на основе рекомбинантной кассеты или вектора по настоящему изобретению, оперативно связанных с гетерологичным полинуклеотидом, таким как последовательность, кодирующая полипептид).
В типичной системе экспрессии продукция полипептида на основе гетерологичного полинуклеоти
- 11 010059 да либо не регулируется, либо регулируется путем модуляции транскрипции за счет оперативно связанного промотора транскрипции, расположенного против хода считывания информации в полинуклеотиде, который кодирует гетерологичный полипептид. Однако для того, чтобы обеспечить соответствующую терминацию транскрипции и стабильность мРНК, регуляция должна происходить соответствующим образом по ходу считывания информации. В одном аспекте настоящего изобретения домен сигнала полиаденилирования (полиА) расположен по ходу считывания информации (3') в интересующем полинуклеотиде, присутствующем в кассете или векторе рекомбинации по настоящему изобретению. В одном аспекте используют домен полиА-сигнала из ΙιΟΗν. который включает последовательность, полученную из генетической последовательности гормона роста человека. Последовательность домена сигнала полиаденилирования из ΙιΟΗν обеспечивает эффективную терминацию транскрипции и более высокую стабильность получаемой мРНК в эукариотических клетках. Домен сигнала полиаденилирования из ΙιΟΗν обеспечивает явное преимущество в сравнении с кассетами или векторами рекомбинации, известными на достигнутом уровне техники, включающими элементы, которые могут использовать промотор/энхансер из СМУ.
Элементы трансляции также могут присутствовать и предназначены для взаимодействия со специализированными последовательностями (такими как сайты связывания рибосом и кодоны инициации), которые необходимы для осуществления трансляции транскриптов РНК в белок. Элементы трансляции могут также включать консенсусные последовательности, лидерные последовательности, сплайсингсигналы и другие, которые облегчают или усиливают трансляцию или повышают стабильность экспрессированного продукта. Векторы по настоящему изобретению могут содержать вспомогательные участки транскрипции, такие как интроны, сигналы полиаденилирования, сигналы трансляции Шайна-Дальгарно (Ыипе/ОаЦагпо) и консенсусные последовательности Козака (8Ыие с1 а1., Ргос. №111. Асай, δοί. (И8А) 71:1342-1346 (1974); Когак, Се11 44:283-292 (1986)).
Термин элементы репликации относится к специализированным последовательностям (таким как ориджин репликации), которые необходимы для репликации вектора в клетке-реципиенте. В целом, такие векторы содержат по меньшей мере один ориджин репликации, достаточный для осуществления автономной стабильной репликации вектора в клетке-реципиенте.
В другом варианте настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим указанные выше конструкции (например, кассету или вектор рекомбинации по настоящему изобретению). Кассета рекомбинации по настоящему изобретению может использоваться для рекомбинантной модификации клетки-хозяина путем трансфекции клетки-хозяина или трансформации клетки-хозяина для экспрессии желательного интересующего полинуклеотида. В контексте настоящего описания термин рекомбинантно модифицированный означает введение кассеты или вектора рекомбинации по настоящему изобретению в живую клетку или систему экспрессии. Обычно кассета рекомбинации, включающая интересующий полинуклеотид, присутствует в векторе (например, в плазмиде). Система экспрессии включает живую клетку-хозяина, в которую введен интересующий полинуклеотид, продукт которого экспрессируется, как описано здесь.
Клетки-хозяева представляют собой клетки, в которых может быть размножена кассета рекомбинации (включающая вектор, содержащий кассету рекомбинации), и могут быть экспрессированы полинуклеотиды, кодирующие продукты. Клетка-хозяин также включает любое потомство такой клетки-хозяина или ее производных. Следует понимать, что все потомство может быть не полностью идентично родительской клетке, поскольку в процессе репликации могут происходить мутации. Однако такое потомство включается в понятие термина клетка-хозяин. Клетки-хозяева, которые применимы в контексте настоящего изобретения, включают бактериальные клетки (например, Е. сой), грибные клетки (например, клетки дрожжей), растительные клетки и клетки животных. Так, например, клетки-хозяева могут включать клетку высшего эукариота, такую как клетка млекопитающего, или клетку низшего эукариота, такую как дрожжевая клетка, или клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Введение конструкции в клетку-хозяина может быть осуществлено путем трансфекции с использованием фосфата кальция, путем трансфекции с использованием ДЭАЭ-декстрана или путем электропорации (Паук, Ь., П1Ьиег, М., Вайеу, Ь., Вакю Ме1йойк ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1986)). В качестве репрезентативных примеров соответствующих клеток-хозяев можно указать следующие: клетки грибов, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как клетки ЭгокорИйа 82 и 8ройор1ега 8£9; клетки животных, такие как клетки СНО, СО8 или меланомы (Вотек); растительные клетки и т.п. Выбор соответствующего хозяина может осуществить любой специалист со средним уровнем в данной области, на основе приведенного здесь описания.
Клетки-хозяева, применимые в рамках настоящего изобретения, включают эукариотические клеткихозяева (например, клетки млекопитающих). В одном аспекте настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, представляющим собой продуцирующие клетки млекопитающих, адаптированные для роста в клеточной культуре. Примеры таких клеток, обычно используемых в данной области, включают СНО, УЕКО, ВНК, НеЬа, СУ1 (включая Сок; Сок-7), МОСК, 293, 3Т3, С127, клеточную линию миеломных клеток (в особенности мышиных), клетки РС12 и \У138. Широко используются клетки яичника китайского хомяка (СНО) для получения некоторых сложных рекомбинантных белков, например, цитоки
- 12 010059 нов, факторов свертывания крови и антител (Вгаке1 е! а1., Βίοοά 88:2004-2012 (1996); КаиГтап е! а1., 1. Вю1. Сйет., 263:6352-6362 (1988); МсКшиоп е! а1., 1. Μοί. Εηάοοτίηοί 6:231-239 (1991); \\οοιΙ е! а1., 1. 1ттипо1 145:3011-3016 (1990)). Линии мутантных клеток, дефицитных по дигидрофолятредуктазе (ОНЕК) (иг1аиЬ е! а1., Ргас. №111. Асаб. 8с1. И8А 77:4216-4220 (1980)), представляют собой линии клеток СНО, выбираемых в связи с возможностью проводить эффективную селекцию по маркеру ΌΟΡΡ и приемлемостью данной системы генной экспрессии для амплификации, что позволяет достигать высокого уровня экспрессии рекомбинантного белка в таких клетках (КаиГтап е! а1., Ме!й Εηζутο1 185:527-566 (1990)). Кроме того, данными клетками можно легко манипулировать, используя их в виде адгезионных или суспензионных культур, которые обладают относительно высокой генетической стабильностью. Клетки СНО и экспрессируемые в них рекомбинантные белки были тщательно изучены и разрешены контрольными органами для использования в производстве клинических продуктов. Кроме того, как следует полагать, могут также использоваться клетки-хозяева, получаемые на основе любой из указанных выше клеточных линий, которые имеют желательный фенотип. Например, такие клеточные линии включают клетки СНО (например, клеточную линию ΌΟ44), которые в процессе селективного культивирования дают желательный фенотип (например, при культивировании с использованием методов позитивной и/или негативной селекции). В одном аспекте клетки СНО адаптированы для роста в бессывороточной среде и могут быть также, или независимо от этого, адаптированы для роста в суспензии (см., например, 8ίικκοΐΌ е! а1., Βίο^Ηηο1. Вюепдт. 52:518-528 (1996); и На1бапкаг е! а1., Βίο^Ηηο1. Ргод. 15:336-346 (1999)). Суспензия адаптированных клеток легче поддается манипуляциям и позволяет достигать более высокой плотности культуры. Клетки, адаптированные к бессывороточной среде, обеспечивают преимущества, связанные с легкостью очистки рекомбинантного белка из культурального супернатанта этих клеток.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к системе экспрессии ш νίίτο для продукции агента, кодируемого интересующим полинуклеотидом. Как показано в настоящем описании, интересующий полинуклеотид может кодировать полипептид, обладающий фармацевтической, медицинской, питательной и/или промышленной ценностью. Например, интересующий полинуклеотид может кодировать лекарственное вещество полипептидной природы. В типичном случае такой полипептид экспрессируется как внеклеточный продукт. Например, полипептиды, которые могут быть получены с использованием кассеты и/или вектора рекомбинации по настоящему изобретению, включают, без ограничения, лиганд Е1!3, лиганд СЭ40, эритропоэтин, тромбопоэтин, кальцитонин, лиганд Рак, лиганд для рецептора активатора ΝΡ-каппа В (КАЛКЕ), ΤΝΡ-связанный лиганд, индуцирующий апоптоз (ТКА1Ь), ОКК/Тек, лимфопоэтин, полученный из стромальных клеток вилочковой железы, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов, фактор роста тучных клеток, фактор роста стволовых клеток, эпидермальный фактор роста, ΡΑΝΤΈ8, гормон роста, инсулин, инсулинотропин, инсулиноподобные факторы роста, паратиреоидный гормон, интерфероны (например, интерферон-бета), факторы роста нервных клеток, глюкагон, интерлейкины 1-18, колониестимулирующие факторы, лимфотоксин-β, фактор некроза опухолевых клеток, факторы, ингибирующие лейкоз, онкостатин-М, различные лиганды для молекул клеточной поверхности Е1к и Нек (такие как лиганды для ерй-связанных киназ или БЕКК8), и легкие или тяжелые цепи антитела.
Рецепторы (или их растворимые фрагменты) для любого из указанных ниже белков могут быть экспрессированы с использованием методов и композиций по настоящему изобретению, которые включают обе формы рецептора фактора некроза опухолевых клеток (обозначенных как р55 и р75), рецепторы интерлейкина-1 (типа 1 и 2), рецепторы интерлейкина-4, рецепторы интерлейкина-15, рецепторы интерлейкина-17, рецепторы интерлейкина-18, рецептор гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, рецептор гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, рецепторы фактора, ингибирующего онкостатин-М и лейкоз, рецептор активатора ΝΡ-каппа, (ΡΑΝΕ), рецептор ТКА1Б, рецептор ВАРР, рецептор лимфотоксина-бета, рецептор ΤΟΡβ типа I и II и рецепторы, которые включают фатальные домены, такие как Рак или рецептор индукции апоптоза (А1К).
Другие белки, которые могут быть экспрессированы с использованием кассеты и/или векторов рекомбинации по настоящему изобретению, включают кластер антигенов дифференциации (называемых как СО белки), например, описанные в литературе (Беи^суЮ Турищ VI (Ргосеебтдк οΓ !йе УН11 1п!егпа!юпа1 \νοΓ1<κ1ιορ апб С'опГегепсе; К^кЫтο!ο, К1ки!аш е! а1., ебк., РдЬе. 1арап, 1996)), или СО молекулы, описанные в других работах. Примеры таких молекул включают СЭ27, СЭ30, СЭ39, С.П40 и их лиганды (лиганд СЭ27, лиганд СЭ30 и лиганд СЭ40). Некоторых их этих молекул являются представителями семейства ΤΝΡ рецепторов, которые включают 41ВВ и ОХ40; указанные лиганды часто относятся к семейству ΤΝΡ (как и лиганд 41ВВ и лиганд ОХ40); соответственно, члены семейства ΤΝΡ и ΤΝΡΚ могут быть также экспрессированы согласно настоящему изобретению.
Полипептиды, которые обладают ферментативной активностью, могут быть также экспрессированы согласно настоящему изобретению. Примеры таких полипептидов включают представителей семейства металлопротеиназы-дезинтегрина, различные киназы, глюкоцереброзидазу, супероксиддисмутазу, тканевой активатор плазминогена, фактор VIII, фактор IX, аполипопротеин Е, аполипопротеин АЛ, гло
- 13 010059 бины, антагонист 1Ь-2, альфа-1 антитрипсин, ΤΝΡ-альфа превращающий фермент (ТАСЕ) и различные другие ферменты. Лиганды для белков, обладающих ферментативной активностью, могут быть также экспрессированы с использованием кассет и векторов по настоящему изобретению.
Композиции и способы по настоящему изобретению также могут использоваться для экспрессии других типов рекомбинантных белков и полипептидов, включающих молекулы иммуноглобулина или их части и химерных антител (например, антител, имеющих константный участок человеческой молекулы, соединенный со связывающим участком мышиного антигена) или их фрагменты. Известны различные методики, с помощью которых можно манипулировать ДНК, кодирующими молекулы иммуноглобулина, получая ДНК, кодирующие рекомбинантные белки, такие как одноцепочечные антитела, антитела с повышенной аффинностью или другие полипептиды антительной природы (см., например, Еатск е! а1., Вю!есйпо1оду 7:934-938 (1989); Веюйтапп е! а1., №1Шге 332:323-327 (1988); ВоЬейк е! а1., №1иге 328:731734 (1987); Уегйоеуеп е! а1., 8с1епсе 239:1534-1536 (1988); Сйаибйагу е! а1., Хпиге 339:394-397 (1989)). Клонированные гуманизированные антитела включают антитела, которые специфически связываются с бета-рецептором лимфотоксина и интегринами, такими как УЪА-1, УЪА-4 и ανβ6. Такие антитела могут быть агонистами или антагонистами.
Различные белки слияния могут быть также экспрессированы с использованием способов и композиций по настоящему изобретению. Примеры таких белков слияния включают белки, экспрессируемые в виде слияния с частью молекулы иммуноглобулина, белки, экспрессируемые в виде белков слияния с зиппер-фрагментом, и новые полифункциональные белки, такие как белок слияния цитокина и фактора роста (см., например, СМ-С8Е и 1Ь-3, МОЕ и 1Ь-3). В \УО 93/08207 и \УО 96/40918 описано получение различных растворимых олигомерных форм молекулы, обозначаемой как СЭ40Е, включающей иммуноглобулиновый гибридный белок и зиппер-белок слияния, соответственно. Методики, приведенные в данных документах, применимы также и к другим белкам.
После экспрессии интересующего полинуклеотида продукт экспрессии (например, белок или полипептид) может быть очищен с использованием известных в данной области стандартных методик. Например, в том случае, когда интересующий полинуклеотид кодирует полипептид слияния, включающий метку, полезную для очистки, данный полипептид может быть очищен с использованием антител, которые специфически связываются с данной меткой. В одном аспекте олигонуклеотид, кодирующий молекулу метки, лигируют по 5'- или 3'-концу интересующего полинуклеотида, кодирующего желательный полипептид; олигонуклеотид может кодировать полиНЬ (такой как йехаНЬ) или другую метку, такую как ЕЬАС, НА (гемагглютинин вируса гриппа) или тус, для которых существуют коммерчески доступные антитела. Указанную метку обычно сливают с полипептидом при экспрессии полипептида, и она может служить в качестве полезного инструмента для аффинной очистки желательного полипептида при его выделении из клетки-хозяина. Аффинная очистка может быть осуществлена, например, путем колоночной хроматографии с использованием антител против метки в качестве аффинной матрицы. Необязательно метка может быть впоследствии удалена от очищенного полипептида с помощью различных способов, таких как протеолитическое расщепление.
Кассета и векторы рекомбинации по настоящему изобретению могут использоваться для достижения стабильного переноса интересующего полинуклеотида в клетку-хозяина. Стабильный перенос означает, что интересующий полинуклеотид непрерывно поддерживается в организме хозяина.
Векторы, содержащие интересующий полинуклеотид, могут быть перенесены в клетку-хозяина с использованием известных методик, выбор которых определяется типом клетки-хозяина. Например, обычно используют микроинъекцию в целевые клетки, хотя также могут быть применимы обработка фосфатом кальция, электропорация, использование липофектина, биолистиков или других способов трансфекции, основанных на вирусах. Другие способы, используемые для трансформации клеток млекопитающих, включают использование полибрена (Ро1уЬгепе), метод слияния протопластов и другие (см., в основном, работу 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 26 еб., 1989, Со16 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Рге§8, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору. Данный набор включает кассету и/или вектор рекомбинации по настоящему изобретению. Набор также включает клетку-хозяина, содержащую сайт мишени (например, сайт ЕВТ). Такие клетки-хозяева обычно представляют в виде одного или нескольких укупоренных контейнеров (например, в пакете, ампуле, тубе или микротитрационном планшете), которые могут включать в ряде вариантов питательные среды. Обычно набор включает описание свойств данного организма-хозяина (например, его генотип) и/или инструкции по способу проведения трансформации. В некоторых вариантах набор включает один или несколько полинуклеотидов, включающих кассету и/или вектор рекомбинации по настоящему изобретению, и может также включать ферменты (например, Е1р-рекомбиназу) в отдельных контейнерах.
Примеры.
Получение кассеты/вектора рекомбинации.
Плазмиду рЕВТ/1ас2ео (1птйгодеп 1пс., каталожный #У6015-20; см. фиг. 4) линеаризуют рестрикционной эндонуклеазой 8ар1 (1 единица эндонуклеазы 8ар1 на 1 мкг плазмиды) и расщепляют при температуре 37°С в течение примерно 16 ч. Используемые для трансфекции организмы представляют собой де
- 14 010059 фицитную по дигидрофолятредуктазе (ϋΗΕΚ) линию клеток яичника китайского хомячка ЭС44 (иДаиЬ с1 а1., Се11 33, 405-412, (1983)). Для каждой трансфекции используют приблизительно 2х106 жизнеспособных клеток СНО-ОСг44. Клетки-хозяева подвергают электропорации при 280 В, 960 мкФ с использованием 500 иг линеаризованной плазмиды ρΕΡΤ/ΙηοΖοο для трансфекции.
Варианты успешной трансфекции отбирают на средах, содержащих 200 мкг/мл антибиотика зеоцина (Ζεοοίη™) Цпуйгодеи 1ис., каталожный #К250-01). Колонии, успешно растущие на селективных средах, отбирают в 24-ячеечные планшеты для культивирования клеток. Указанные изоляты размножают в 6-ячеечных культуральных планшетах до достижения плотности, достаточной для переноса трансфицированных клеток в колбы Т225. Из трансфицированных клеток (5х 106 клеток) выделяют геномную ДНК.
Геномную ДНК из более чем 100 клеточных линий исследуют методом саузерн-блоттинга для подтвсрждсния того, что имеется всего одна копия последовательности ЕКТ. Последовательность зонда охватывает всю последовательность ЕКТ и 5'-конец гена слияния бета-галактозидазы (см. фиг. 5). Из >100 клеточных линий, подвергнутых скринингу, были отобраны только 35 клеточных линий, содержащих единственный сайт интеграции ЕКТ, для определения уровня экспрессии белка (см. фиг. 6 и 7).
Клонирование репортерных генов.
Кассету/вектор рекомбинации по настоящему изобретению, включающую СМУ ΙΕ1, фрагмент интрона А и домен полиА-сигнала, сравнивают с коммерчески доступным вектором рекомбинации.
Секретируемую щелочную фосфатазу (8ЕАР) используют в качестве модели секретируемых белков для определения уровня экспрессии с использованием СНО-ОС44 Е1р-1и в качестве линии клеток-хозяев. Последовательность, кодирующую 8ЕАР, получают из плазмиды экспрессии р8ЕАР2 (С1ои1ес11, Ра1о А11о, СА) путем амплификации в полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР). 5'-праймер получают на основе сайта ΚρηΙ, и 3'-праймер создают с использованием сайта Вд1П.
5'-праймер:
ТТТТ00ТАССАТ0СТЗСТССТССТЗ (старт-кодон обозначен жирным шрифтом) (8ЕЦ ГО ΝΟ: 4)
ΚρηΙ
3'-праймер:
ТТТТАСАТСТСАТСТСТССТССААСССССС (тРрминируютпий кодон обозначен жирным шрифтом) (8ЕЦ ГО ΝΟ: 5)
ВдШ
ПЦР проводят следующим образом: 3 мкг плазмиды ρδΕΑΡ (С1ои1ес11, Ра1о АИо, СА); 1 мкМ каждого из 5-' и З'-праймеров (см. выше): 0,25 мМ дНТФ (Ртошеда, МасШоп, XVI): 2 единицы полимеразы Уеи1® (Νε\ν Епд1апс1 Вю1аЬ§, Вс\ сг1у. МА); IX буфер для полимеразной реакции Уеи1® (Νε\ν Епд1апс1 Вю1аЬ§, Вс\ сг1у. МА). ПЦР проводят в 100 мкл реакционной смеси. ПЦР проводят в течение 30 циклов: при 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 45 с и при 75°С в течение 2 мин и затем при 75°С в течение 10 мин и выдерживают при температуре 4°С. Получают продукт ПЦР длиной примерно 1,6 кбайт, соответствующий участку, кодирующему 8ЕАР. Продукт ПЦР выделяют из смеси и очищают для ПЦР с использованием набора для очистки Χνίζηπΐ® РСК (Ртошеда, МабБоп. XVI) и разбавляют с1Н20. Продукт ПЦР расщепляют вначале эндонуклеазой ΚρηΙ (Νε\ν Епд1апс1 ΒίοΙηΕδ. Вс\ сг1у. МА) и затем ВдШ (Νε\ν Епд1апс1 Вю1аЬ§, Вс\ сг1у. МА).
иг плазмиды рЕЕТ/с111Гг-1. которая была ранее расщеплена ΚρηΙ и ВатН1, лигируют с расщепленным 8ЕАР продуктом ПЦР. Секвенируют участок, кодирующий 8ЕАР, и точки сочленения. Как и ожидалось, результаты соответствуют гипотетической последовательности. Плазмида была обозначена как рЕРТ/8ЕАР.
Трансфекцию репортерного гена 8ЕАР в хозяйскую клеточную линию Е1р-1и проводят путем электропорации. 10 мкг рЕРТ/8ЕАР объединяют с 90 мкг рОС44 (1пуйгодеи, СагкЬаб, СА), как плазмиды, экспрессирующей Е1р-рекомбиназу. ДНК осаждают этанолом, промывают в 70% этаноле и высушивают. Для трансфекции используют 2х106 жизнеспособных клеток из клеточной линии. Клетки и ДНК объединяют асептически в 800 мкл стерильного НеВ8 (20 мМ НЕРЕ8 рН 7,05, 137 мМ №1С1. 5 мМ КС1, 0,7 мМ №2НРО4. 6 мМ декстрозы) и переносят в кювету с длиной 0,4 см (ВюРасЕ Нсгси1с5. СА). Электропорацию проводят с использование устройства СепеРиНег® (ВюКаб, Нсгси1с5. СА), установленном на режим работы при 0,28 кВ и 950 мкФ. После импульсной электропорации клетки инкубируют в кювете в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Затем их переносят в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл альфа МЕМ и нуклеозиды (С1Ьсо, СаййегеЬигд, МО) с 10% диализованной фетальной сыворотки теленка (дФСТ) (Нус1оие, Бодаи, ЦТ) и осаждают при центрифугировании в режиме 1000 об/мин в течение 5 мин. Ресуспендированный осадок высевают в 6-ячеечные планшеты на среду альфа-МЕМ без нуклеозидов с добавкой 10% дФСТ и инкубируют при 36°С в присутствии 5% СО2 в увлажненном инкубаторе в течение примерно 2 недель, с получением колоний.
Стабильные трансфицированные варианты анализируют в виде изолятов. Изоляты получают путем отбора колоний из вариантов, полученных после трансфекции. Отбор проводят аспирацией непосредственно колонии с использованием Р1ре1таи™ Р200, установленного на 50 мкл. Аспирированные колонии переносят вначале на 24-ячеечный планшет. Как только в ячейке достигается >50% слияния,
-15 010059 среды заменяют на химически чистые среды РгоСНО4 (СашЬгех, ^а1кег5\'П1е, ΜΏ), содержащие 4 мМ Ьглютамина (СашЬгех, ^а1кег5\'Ше, ΜΏ), после чего клетки переносят в 6-ячеечные планшеты. Удельную продуктивность оценивают в 6-ячеечных планшетах в точке слияния или близко к ней.
Удельную продуктивность оценивают в тесте 8ЕАР при замене среды свежей средой с проведением отбора образцов среды и подсчета числа клеток, выросших через 4 дня. Титр продукта нормализуют относительно количества клеток по истечении 4 дней и продуктивность выражают в виде активности 8ЕАР на клетку.
Кондиционированную среду анализируют с использованием репортерной системы Стеа! ЕзсЛРе™ 8ЕЛР Керог1ег 8уз1еш 3 (С1оп1есЬ, Ра1о ΑΙΐο, СА). В указанном тесте используют флуоресцентный субстрат для выявления активности 8ЕАР в кондиционированной среде. Набор используют в 96-ячеечном формате, в соответствии с инструкциями производителя. Все стандарты и образцы разбавляют прилагаемой свежей средой, а не буфером для разведения. Вместо одного измерения через 60 мин, измерения проводят через 10 мин и через 40 мин, и на основе полученных данных выражают активность 8ЕАР в относительных единицах флуоресценции в минуту (КРИ/мин). Используют эмиссионный фильтр в сочетании с прибором для анализа планшетов Су1ойиог II™ (Рег8ер1Ае Вюзу81ешз, Ргашшдкаш, ΜΑ), который устанавливают на работу при длине волны 460 нм вместо рекомендованной длины 449 нм.
Значение КРИ/мин нормализуют по стандартной кривой относительно стандарта, прилагаемого к набору. Поскольку прилагаемый стандарт не охарактеризован количественно, все значения являются относительными. Указанные относительные значения нормализуют применительно к числу клеток и времени инкубации, получая значения относительной удельной продуктивности (активность 8ЕАР на клетку в расчете на один день).
Экспрессия 8ЕАР в хозяйских клетках А1 Р1р-1п СНО-ОИ44
| Клеточная линия | День 0: исходная плотность клеток в клеточной линии (клетки/мл) | День 4: итоговая плотность клеток в клеточной линии (клетки/мл) | Общая площадь клеток (клетка*день/мл) | кгимин | Нормализованная активность 8ЕАР/клетка/день (*1Е6) |
| 1 | 2,0Е+05 | 6,2Е+05 | 1.5Е+06 | 0,75 | 0,5 |
| 2 | 2,0Е+05 | 6,ЗЕ+05 | 1,5Е+06 | 0,71 | 0,5 |
| 3 | 2,0Е+05 | 5,ЗЕ+05 | 1,4Е+06 | 0,75 | 0,6 |
| 4 | 2,0Е+05 | 8,ЗЕ+05 | 1,8Е+06 | 0,75 | 0,4 |
| 5 | 2.0Е+05 | 7.5Е+05 | 1.7Е+06 | 0,71 | 0,4 |
| 6 | 2.0Е+05 | 7.8Е+05 | 1,7Е+06 | 0,74 | 0,4 |
| 7 | 2,0Е+05 | 1.5Е+06 | 2,5Е+06 | 0,74 | 0,3 |
| 8 | 2,0Е+05 | 5,6Е+05 | 1,4Е+06 | 0,75 | 0,5 |
| 9 | 2,0Е+05 | 4,8Е+05 | 1,ЗЕ+06 | 0,72 | 0,6 |
| 10 | 2,0Е+05 | 4,7Е+05 | 1,ЗЕ+06 | 0,75 | 0,6 |
| 11 | 2,0Е+05 | 5,ЗЕ+05 | 1,4Е+06 | 0,74 | 0,5 |
| 12 | 2,0Е+05 | 3,8Е+05 | Ι,ΙΕ+06 | 0,73 | 0,7 |
| 13 | 2.0Е+05 | 7.6Е+05 | 1.7Е+06 | 0,74 | 0,4 |
| 14 | 2,0Е+05 | 5,2Е+05 | 1,ЗЕ+06 | 0,74 | 0,6 |
| 15 | 2,0Е+05 | 5,4Е+05 | 1.4Е+06 | 0,72 | 0,5 |
| 16 | 2,0Е+05 | 4,9Е+05 | 1,ЗЕ+06 | 0,74 | 0,6 |
| 17 | 2,0Е+05 | 5.0Е+05 | 1.3Е+06 | 0,73 | 0,6 |
| 18 | 2,0Е+05 | 1,4Е+06 | 2,4Е+06 | 0,75 | 0,3 |
| 19 | 2,0Е+05 | 5,2Е+05 | 1,ЗЕ+06 | 0,76 | 0,6 |
| 20 | 2.0Е+05 | 6,6Е+05 | 1.5Е+06 | 0,75 | 0,5 |
Среднее значение показателя КРИ/мин = 0,74±0,01
Среднее значение активности 8ЕАР/клетку/день*1Е6 = 0,5±0,1
В данном описании было приведено множество вариантов осуществления настоящего изобретения. Тем не менее, следует понимать, что возможны различные модификации, без отхода от принципов и объема настоящего изобретения. Соответственно, возможны другие варианты его осуществления, определяемые объемом притязаний прилагаемой формулы изобретения.
Claims (30)
1. Кассета рекомбинации, включающая участок промотора/энхансера; интересующий полинуклеотид; домен полиА-сигнала; домен ЕРТ рекомбинации и полинуклеотид ййГг, где указанный участок промотора/энхансера, интересующий полинуклеотид и домен полиА-сигнала связаны операбельно.
2. Кассета рекомбинации по п.1, отличающаяся тем, что указанный участок промотора/энхансера включает очень ранний участок 1 из СМУ (йСМУ ΙΕ1).
3. Кассета рекомбинации по п.2, отличающаяся тем, что указанный участок промотора/энхансера йСМУ ΙΕ1 включает последовательность, соответствующую участку от примерно х1 до примерно х2 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 или 2, где х1 обозначает нуклеотид, локализованный от положения 1 до положения 70, и х2 обозначает нуклеотид, локализованный от положения 770 до положения 780.
4. Кассета рекомбинации по п.1, дополнительно включающая вставочную последовательность варьирующей длины (УЫУ8), которая включает сайт донора сплайсинга и сайт акцептора сплайсинга.
5. Кассета рекомбинации по п.4, отличающаяся тем, что УЫУЗ включает интрон А из гена йСМУ ΙΕ1.
6. Кассета рекомбинации по п.4, отличающаяся тем, что УЫУ8 включает интрон А из гена йСМУ ΙΕ1, который имеет делецию между сайтом донора сплайсинга и сайтом акцептора сплайсинга.
7. Кассета рекомбинации по п.6, отличающаяся тем, что УЫУЗ включает последовательность от примерно хз до примерно х4 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, где х3 обозначает нуклеотид на участке 770-780 и х4 обозначает нуклеотид на участке 1300-1310 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1; или от примерно х5 до примерно х в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, где х5 обозначает нуклеотид на участке 770-780 и хе обозначает нуклеотид на участке 1300-1310 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.
8. Кассета рекомбинации по п.1, отличающаяся тем, что указанный интересующий полинуклеотид кодирует терапевтический агент.
9. Кассета рекомбинации по п.1, отличающаяся тем, что указанный домен полиА-сигнала включает по меньшей мере 100 соприкасающихся нуклеотидов в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3.
10. Кассета рекомбинации по п.9, отличающаяся тем, что указанный домен полиА-сигнала включает 8ЕО ΙΌ N0: 3.
11. Вектор рекомбинации, включающий кассету рекомбинации по п.1.
12. Вектор рекомбинации по п.11, дополнительно включающий второй участок промотора/энхансера; второй интересующий полинуклеотид и второй домен полиА-сигнала, где второй участок промотора/энхансера, второй интересующий полинуклеотид и второй домен полиА-сигнала связаны операбельно.
13. Вектор рекомбинации по п.12, дополнительно включающий вставочный домен между вторым участком промотора/энхансера и вторым интересующим полинуклеотидом.
14. Клетка-хозяин, включающая вектор рекомбинации по п.11.
15. Клетка-хозяин по п.14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии.
16. Клетка-хозяин по п.14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
17. Клетка-хозяин по п.15, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
18. Клетка-хозяин, включающая кассету рекомбинации по п.1.
19. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии.
20. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
21. Клетка-хозяин по п.19, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
22. Система рекомбинации, включающая кассету рекомбинации по п.1 и клетку-хозяина, включающую сайт ЕРТ.
23. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку СН0.
24. Система рекомбинации по п.23, отличающаяся тем, что указанная клетка СН0 представляет собой клетку СН0-ЭО44.
25. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии.
- 17 010059
26. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
27. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин получена из клетки СНО-ЭС44.
28. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой бЫг-.
29. Набор, включающий вектор по п.11 и клетку-хозяина, включающую сайт ЕКГ.
30. Набор по п.29, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку ιΙΙιίϊ СНО, геном которой включает сайт Ι'ΚΤ.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51161003P | 2003-10-14 | 2003-10-14 | |
| PCT/US2004/033868 WO2005038020A1 (en) | 2003-10-14 | 2004-10-14 | Flp-mediated recombination |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200600772A1 EA200600772A1 (ru) | 2006-10-27 |
| EA010059B1 true EA010059B1 (ru) | 2008-06-30 |
Family
ID=34465252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200600772A EA010059B1 (ru) | 2003-10-14 | 2004-10-14 | Flp-опосредованная рекомбинация |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070134795A1 (ru) |
| EP (1) | EP1687418A4 (ru) |
| JP (1) | JP2007508037A (ru) |
| KR (1) | KR20060109906A (ru) |
| CN (1) | CN1894402A (ru) |
| AU (1) | AU2004282558A1 (ru) |
| BR (1) | BRPI0415446A (ru) |
| CA (1) | CA2542791A1 (ru) |
| EA (1) | EA010059B1 (ru) |
| GE (1) | GEP20094618B (ru) |
| IL (1) | IL174892A0 (ru) |
| IS (1) | IS8417A (ru) |
| MX (1) | MXPA06004121A (ru) |
| NO (1) | NO20062177L (ru) |
| RS (1) | RS20060266A (ru) |
| WO (1) | WO2005038020A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200602984B (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104818253B (zh) * | 2015-03-24 | 2018-03-09 | 成都贝爱特生物科技有限公司 | 靶向定点整合cho细胞系的改造及其用途 |
| CN108441478A (zh) * | 2017-02-16 | 2018-08-24 | 成都贝爱特生物科技有限公司 | 一种接受外源基因定点整合的基因工程细胞系 |
| EP3583205A1 (en) * | 2017-02-17 | 2019-12-25 | Lonza Ltd | Mammalian cells for producing adeno-associated viruses |
| US20200299721A1 (en) * | 2017-10-11 | 2020-09-24 | Celltrion Inc. | Expression Cassette for Production of High-Expression and High-Functionality Target Protein and Use Thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030119104A1 (en) * | 2001-05-30 | 2003-06-26 | Edward Perkins | Chromosome-based platforms |
| WO2004029284A2 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Protein Design Labs, Inc. | Efficient generation of stable expression cell lines through the use of scorable homeostatic reporter genes |
| US6828093B1 (en) * | 1997-02-28 | 2004-12-07 | Baylor College Of Medicine | Rapid subcloning using site-specific recombination |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030215913A1 (en) * | 2000-07-19 | 2003-11-20 | Enrique Alvarez | Nucleic acids, vectors, host cells, polypeptides, and uses thereof |
| ES2261489T3 (es) * | 2000-10-13 | 2006-11-16 | Chiron Corporation | Fragmentos de intron a de citomegalovirus. |
| WO2004074439A2 (en) * | 2003-02-14 | 2004-09-02 | Biogen Idec Ma Inc. | An expression cassette and vector for transient or stable expression of exogenous molecules |
-
2004
- 2004-10-14 EA EA200600772A patent/EA010059B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-10-14 AU AU2004282558A patent/AU2004282558A1/en not_active Abandoned
- 2004-10-14 MX MXPA06004121A patent/MXPA06004121A/es not_active Application Discontinuation
- 2004-10-14 EP EP04795078A patent/EP1687418A4/en not_active Withdrawn
- 2004-10-14 GE GEAP20049391A patent/GEP20094618B/en unknown
- 2004-10-14 KR KR1020067009340A patent/KR20060109906A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-10-14 JP JP2006535642A patent/JP2007508037A/ja not_active Withdrawn
- 2004-10-14 BR BRPI0415446-0A patent/BRPI0415446A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-10-14 WO PCT/US2004/033868 patent/WO2005038020A1/en active Application Filing
- 2004-10-14 US US10/575,696 patent/US20070134795A1/en not_active Abandoned
- 2004-10-14 CA CA002542791A patent/CA2542791A1/en not_active Abandoned
- 2004-10-14 RS YUP-2006/0266A patent/RS20060266A/sr unknown
- 2004-10-14 CN CNA2004800371519A patent/CN1894402A/zh active Pending
-
2006
- 2006-04-10 IL IL174892A patent/IL174892A0/en unknown
- 2006-04-12 ZA ZA200602984A patent/ZA200602984B/xx unknown
- 2006-04-12 IS IS8417A patent/IS8417A/is unknown
- 2006-05-15 NO NO20062177A patent/NO20062177L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6828093B1 (en) * | 1997-02-28 | 2004-12-07 | Baylor College Of Medicine | Rapid subcloning using site-specific recombination |
| US20030119104A1 (en) * | 2001-05-30 | 2003-06-26 | Edward Perkins | Chromosome-based platforms |
| WO2004029284A2 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Protein Design Labs, Inc. | Efficient generation of stable expression cell lines through the use of scorable homeostatic reporter genes |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHAPMAN. B.S. Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 1991, Vol. 19, No. 14, pages 3979-3986, especially Figure 3, Discussion. * |
| DEROUAZI, M. et al. Serum-free large-scale transient transfection of CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. August 2004, Vol. 87, No. 4, pages 537-545. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IS8417A (is) | 2006-04-12 |
| ZA200602984B (en) | 2007-09-26 |
| CA2542791A1 (en) | 2005-04-28 |
| EA200600772A1 (ru) | 2006-10-27 |
| BRPI0415446A (pt) | 2006-12-05 |
| IL174892A0 (en) | 2006-08-20 |
| KR20060109906A (ko) | 2006-10-23 |
| WO2005038020A1 (en) | 2005-04-28 |
| CN1894402A (zh) | 2007-01-10 |
| NO20062177L (no) | 2006-07-11 |
| US20070134795A1 (en) | 2007-06-14 |
| GEP20094618B (en) | 2009-02-25 |
| MXPA06004121A (es) | 2006-07-05 |
| JP2007508037A (ja) | 2007-04-05 |
| EP1687418A4 (en) | 2007-07-18 |
| RS20060266A (en) | 2008-09-29 |
| AU2004282558A1 (en) | 2005-04-28 |
| EP1687418A1 (en) | 2006-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100233781B1 (ko) | 동종 재조합을 이용하는 단백질 제조방법 | |
| JP2010213718A (ja) | 外来性分子の一過性の発現もしくは安定な発現のための発現カセットおよび発現ベクター | |
| JP4525863B1 (ja) | 高生産性細胞の樹立のための発現ベクター及び高生産性細胞 | |
| JP2006517802A5 (ru) | ||
| EP0724639B1 (en) | Methods for selection of recombinant host cells expressing high levels of a desired protein | |
| CN112159801B (zh) | SlugCas9-HF蛋白、含有SlugCas9-HF蛋白的基因编辑系统及应用 | |
| KR20170132784A (ko) | 글로빈 유전자 클러스터의 조절 요소를 포함하는 진핵생물 발현 벡터 | |
| JPH05503015A (ja) | 哺乳類発現ベクター | |
| EA011619B1 (ru) | Экспрессионный вектор и способ продуцирования высоких уровней белков | |
| US20170037428A1 (en) | Method for Gene Amplification | |
| EA010059B1 (ru) | Flp-опосредованная рекомбинация | |
| EP0247145B1 (en) | Multiply-amplifiable vectors for high level expression of exogenous dna | |
| RU2488633C1 (ru) | ЭКСПРЕССИОННЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ВЫСОКОЧАСТОТНОЙ ИНТЕГРАЦИИ И УСИЛЕННОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ЭКСПРЕССИОННОЙ КАССЕТЫ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, БИЦИСТРОННАЯ мРНК, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ ЛИНИЙ ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО ВЕКТОРА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ | |
| AU606049B2 (en) | Inducible heat shock and amplification system | |
| JP4547643B1 (ja) | クローニングに最適化された発現ベクター | |
| US5686263A (en) | Method for enhancing gene expression | |
| EP1263985B1 (en) | Methods for amplifying genetic material and uses thereof | |
| WO2021155607A1 (zh) | 经改造的胞嘧啶碱基编辑器及其应用 | |
| JP2012055303A (ja) | 遺伝子増幅を含む高生産性細胞の樹立のための発現ベクター | |
| Schafer et al. | Somatic cell hybrid approaches to genome | |
| US20050064547A1 (en) | Vectors and transfected cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |