JPH025862A - 分泌可能な遺伝子発現インディケーター遺伝子産物 - Google Patents

分泌可能な遺伝子発現インディケーター遺伝子産物

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JPH025862A
JPH025862A JP1031252A JP3125289A JPH025862A JP H025862 A JPH025862 A JP H025862A JP 1031252 A JP1031252 A JP 1031252A JP 3125289 A JP3125289 A JP 3125289A JP H025862 A JPH025862 A JP H025862A
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JP
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cells
gene
dna
alkaline phosphatase
pbc12
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JP1031252A
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Joel Peter Berger
ジョエル　ピーター　ベルガー
Bryan Richard Cullen
ブライアン　リチャード　カレン
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、分泌可能な形態のアルカリ性ホスファターゼ
をコードするインデイケータ−（ｉｎｄｉｃａ　ｔｅｒ
）またはレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子、該遺
伝子を含む発現ベクター、該ベクターで形質転換された
細胞、遺伝子発現が検出されるべき遺伝子系および分泌
された酵素を検出するための方法に関するものである。
真核性分子生物学における現在の研究の大部分の分野は
、転写およびボスト−転写のレベルにおける遺伝子発現
のレベルを制御する因子類の解明にある。遺伝子発現の
この定量的な測定を容易にしていた一つのアプローチは
、いわゆる“インデイケータ−”または“レポーター”
遺伝子の使用である。これらの遺伝子は、定量的に分析
され得る酵素または蛋白質をコードする。興味有るプロ
モーター、エンハンサ−、ターミネータ−または非コー
ド配列に対するこれらの融合、それに続く真核性細胞中
への構築の導入は、次いで遺伝子発現のレベルでその融
合した配列の効果の間接的測定を許容する。
Ｅ、ｃｏｌｉ　　β−ガラクトシダーゼ（Ａｎ　らのＭ
ｏｌ。
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　２．１６２８−１６３２（１９
Ｂ２）　）　、キサンチン−グアニンホスフォリボシル
転移酵素（ｃｈｕらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、１３．２９２１−２９３０（１９８５）　）　、
ガラクトキナーゼ［Ｓｃｈｊｍｐｅｒｌ　ｉらのＰｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９．２５７−２６０１９８２）　）
　、インターロイキン−２［Ｃｕ１ｌｅｎ、Ｃｅ１１４
６．９７３−９８２（１９８６）　）およびチミジンキ
ナーゼ［５ｅａｒｌｅらのＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
。
５．１４８０４４８９（１９８５）　）を含み、多くの
遺伝子はインジケーター遺伝子として使用されてきてい
る。
しかしながら、これらの遺伝子のすべては欠点を有して
いる。例えば内因性の酵素活性のレベルが高かったり、
または該遺伝子の使用に基づく分析が、その実施に当っ
て大変煩雑であったりすることがある。
最も広く使用されているインデイケータ−遺伝子ハ、Ｅ
、ｃｏｌｉ酵素、クロラムフェニコールアセチル転移酵
素（ｃＡＴ）である〔、ＧｏｒｍａｎらのＭｏ１．Ｃｅ
１ｌ。
Ｂｉｏｌ、　２．１０４４−１０５１　（１９８２）　
）　、この酵素の主要な利点は、真核性細胞において同
等の酵素活性の欠損にあり、そのための背景的問題が存
在しない。
主な欠点は、この酵素を使用する分析において、その実
施がかなり煩雑となることである。通常、細胞の溶解、
それに続く培養および抽出工程、更に、薄層クロマトグ
ラフィの工程を必要とする。
更に、この分析方法は、放射能の使用を必要として、ま
た定量的に実施するにはかなりの費用がかかる。
アルカリ性ホスファターゼは、非常に簡単にすばやく、
また安価な比色分析によって測定できるので診断実験室
において頻繁に分析される。アルカリ性ホスファターゼ
は、通常、真核性細胞の発現からは分泌されない。従っ
て、インデイケータ−遺伝子としてのアルカリ性ホスフ
ァターゼの使用は、ＣＡＴに対して正確であるので細胞
の溶解を必要とする。
インデイケータ−遺伝子が使用される遺伝学的発現系は
、組換えＤＮＡ技術の使用を介して作られる。現在の組
換えＤＮＡ手段の適用に当っては、特異的ＤＮＡ配列が
適切なりＮＡベヒクルまたはベクター中に挿入され、宿
主細胞中に複製しうる組換えＤＮＡ分子を形成する。プ
ラスミドと称される環状二本鎖ＤＮＡ分子は、ベクター
として頻繁に使用され、該組換えＤＮＡ形態の調製は、
特異的塩基配列部位においてＤＮＡを開裂しうる制限エ
ンドヌクレアーゼ酵素の使用を伴う。挿入されるべき外
来ＤＮＡの分節およびプラスミドにおいて、制限酵素に
よって一度切断が行なわれると、２つのＤＮＡ分子は、
リガーゼとして知られている酵素によって共有結合的に
結合され得る。該組換えＤＮＡ分子の調製のための一般
的方法は、Ｃｏｈｅｎらの米国特許第４，２３７，２２
４号、Ｃｏｆｆ１ｎｓらの米国特許第４，３０４．８６
３号およびＭａｎ、（ａｔｉｓ　らのＭｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ、　１９８２、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。そ
れらは多くの技術の情況を説明しているので、これらの
参考文献を参照して以下に示す。
−変調製された組換えＤＮＡ分子は、多くの条件が適合
する場合にのみ、挿入された遺伝子配列によって特定さ
れた生成物を調製するために使用することができる。組
換え分子が宿主細胞に適合し、従ってその中で自律的複
製を可能にする要件が主要となる。多くの最近の研究に
おいては、それが広い範囲の組換えプラスミドと適合す
るので宿主微生物としてＥ、ｃｏｌｉを使用している。
使用されるベクター／宿主細胞系により、その組換えＤ
ＮＡ分子は、形質転換、形質導入またはトランスフェク
ションによって宿主中に導入される。
宿主細胞中の組換えプラスミドの存在の・検出は、例え
ば抗生物質耐性の様なプラスミドマーカー活性の使用を
介して都合良く達成され得る。従って、アンピシリン減
成酵素の生成をコードするプラスミドを有する宿主は、
アンピシリンを含む培地中で宿主を生育させることによ
り、非変性細胞から選択することができる。
更に、選択された制限エンドヌクレアーゼがプラスミド
を切断し、更に外来遺伝子配列が挿入される部位におい
てプラスミドが第二の抗生物質減成活性をコードする抗
生物質耐性マーカーを利用することができる。次に正確
な組換えプラスミドを含む宿主細胞は、第一の抗生物質
に対して耐性であるが第二の抗生物質としては感受性で
あることによって特徴づけられる。
宿主細胞中への組換えプラスミドの単なる挿入および修
飾された宿主の単離は、有意量の所望の遺伝子産物が生
産されるということを実質的に保証するものではない。
これが生じるためには、外来遺伝子がプロモーターと称
されるＤＮＡ転写用のプラスミドにおけるシグナル領域
に対して適切な関係において融合されていなければなら
ない。
別法として、宿主によって認識される限りにおいて、該
外来ＤＮＡは、それ自体のプロモーターを持っていても
良い。その起源がいかなるものであろうとも、プロモー
ターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を支配し、またそれ
ゆえメツセンジャーＲＮ　Ａ　（ｍＲＮＡ）の転写を“
促進”するＤＮＡ配列である。
多量のｍＲＮＡを提供することができる強力な促進があ
れば、所望の遺伝子産物の最終生産は、ｍ　ＲＮ　Ａか
ら蛋白質への翻訳の効率に左右される。
これは順次、ｍＲＮＡに対するリボゾーム結合の効率お
よび宿主細胞内におけるｍＲＮＡの安定性に依存する。
真核性細胞においては、翻訳の効率を支配する要因は、
あまり理解されていないが、翻訳を開始するＡＵＧコド
ンを囲む好ましい核酸の配列を含んでいるように思われ
る［Ｋｏｚａｋ、　Ｃｅ１１４４．２８３−２９２（１
９８６）　］。原核性および真核性細胞の両者において
あまり理解されていないｍＲＮＡの安定性に影響を与え
る要因もまた得ることができる蛋白質生産の量に対して
臨界的である。
現在までの組換えＤＮＡ分野における仕事の大部分は、
例えばＥ、ｃｏｌｉ等の細菌発現系の使用に集中してい
る。とはいえ、細菌細胞の使用は多くの好ましくない局
面を持っている。例えばＥ、ｃｏｌｉ中に生産される多
くの蛍白質およびポリペプチドは、ペリブラスマの空間
中に蓄積する。従って、これらの遺伝子産物の回収には
、これら細胞の粉砕が必要であり、その方法は、所望の
産物がきわめて多数の他のＥ、ｃｏｌｉ細胞成分から精
製されなければならないので、非能率的であり、また重
大な精製問題を引き起す。また細菌は、多くの興味有る
遺伝子産物の合成を完結しまたは多くの真核性蛋白質の
適切な形態および生物学的活性に必須である特異的ジス
ルフィド結合を形成するために必要とされ°るグリコジ
ル化を行なうことができない。
細菌発現系におけるこれらの欠陥を克服するために、遺
伝子技術者らの注目は、所望のポリペプチドおよび蛋白
質を作るためのみならず、また遺伝子発現の制御をも研
究するために、真核性宿主細胞の組換えＤＮＡへの使用
に益々むけられている。酵母および哺乳動物の細胞のよ
うな細胞類は、培地中に所望の遺伝子産物を分泌するこ
とができ、また必須のグリコジル化工程をも行なうこと
ができる。それでもなお、組換えＤＮＡのクローニング
および発現のための哺乳動物の細胞の使用は、解決しな
ければならない多くの技術的障害がある。
例えば細菌中で非常に有用であると立証されている内因
性のプラスミドは、高等な真核性細胞によって複製され
ない。その結果、他のアプローチを取らざるを得ない。
一つのアプローチは、Ｅ、ｃｏｌｉ　と同様に容易に生
育されかつ操作され得る低級な真核性酵母、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ、（ａｅを使用する
ことであった。酵母クローニング系が利用でき、また該
システムの使用によって、ヒトインターフェロン遺伝子
の酵母中における能率的な発現が達成されている（Ｈｉ
　ｔｚｅｍａｎらのＮａｔｕｒｅ　２９３．７１７−７
２２（１９８１）　）。
しかしながらインターフェロン遺伝子は、イントロンを
含まず、また酵母細胞は、イントロン、すなわちウサギ
β−グロビンを含む少なくとも一種の不均質な哺乳動物
の遺伝子を正しく転写しないということが見出されてい
る（ＢｅｇｇｓらのＮａ　ｔｕｒｅ２８３．８３５−８
４０　（１９８０）　）。
他のアプローチにおいては、外来遺伝子が直接取込み手
段によって哺乳動物の細胞中に挿入されている。これは
、クローン遺伝子のリン酸カルシウム共沈によって完成
されており、この方法によれば細胞の約１−２％が一般
に誘発されＤＮＡを取り込む。しかしながら、該低い水
準の取り込みは、極めて低い水準の所望の遺伝子産物の
発現を生ずるにすぎない。哺乳動物の細胞が、チミジン
キナーゼ（ｔｋ）遺伝子（ｔｋ−細胞）が欠如している
ことが分った場合には、共形質転換によってより良い結
果を得ることができる。選択的ＨＡＴ　（ヒボキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン）培地中では成育するこ
とができないｔｋ−細胞は、リン酸カルシウム共沈を介
してｔｋ遺伝子を含む外因性のＤＮＡ　（例えば単純ヘ
ルペスウィルスＤＮＡ）を取り込むことによってこの欠
如した酵素活性を取りもどすことができる。ｔｋＤＮＡ
に共有的に連結され、またはこれと単に混合された他の
ＤＮＡは、また細胞によって取り込まれ、しばしば共発
現される〔ＳｃａｎｏｇｏｓらのＧｅｎｅ　１４．１−
１０　（１９８１）参照〕。
第三のアプローチにおいては、ウィルスゲノムが、哺乳
動物の細胞中に他の遺伝子を導入するためのベクターと
して使用されており、シミアンウィルス４０　（ＳＶ４
０）、乳頭腫ウィルスおよびアデノウィルスゲノムに基
づく系が記述されている〔参考のためにＡｃａｄｅｍｉ
ｃ　ＰｒｅｓｓＳＮｅｗ　Ｙｏｒｋ［集のＧｅｎｅｔｉ
ｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｖｏｌ、　３、Ｒ，Ｗｉ
ｌｌ、（ａｍｓｏｎ、　ｐｐ、８３−１４１（１９Ｂ２
）中のＲ，Ｗ、Ｊ、ＲＬｇｂｙのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　ｏｆ　Ｃ１ｏｎｅｄＧｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｕｋａｒｙ
ｏｔｉｃ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓ
ｙｓｔｅｍｓＤｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｖｉｒａｌ　
Ｒｅｐｌｉｃｏｕｓ参照〕。しかしこれらの系は、限ら
れた宿主細胞の範囲の欠点を被る。更にこれらの系にお
けるウィルスの複製は、宿主細胞の死をもたらす。レト
ロウィルスＤＮＡ制御因子の使用は、これらウィルスベ
クター系の多くの欠点を回避する。
Ｇｏｒｍａｎら（Ｐｒｏｃ、Ｎａ目、八ｃａｄ、ｓｃｉ
、Ｕ、ｓ、Ａ、　７９．６７７７−６７８１（１９８２
）　）は、例えばラウス肉腫ウイルスロングターミナル
レピート　（ＬＴＲ）は、ＤＮＡ−介在トランスフェク
ションによってＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維
芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細
胞およびマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む種々の細胞中
に導入しうる強いプロモーターであることを示している
。
本発明は、新規な分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスフ
ァターゼ類、これらの分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホ
スファターゼ類をコードするインデイケータ−遺伝子Ｄ
ＮＡ配列、発現制御配列に有効に結合されたインジケー
ター遺伝子からなる組換え発現ベクター、該発現ベクタ
ーを含む哺乳動物の細胞類、および遺伝子発現系におけ
る該ＤＮＡ配列の使用のための方法を提供するものであ
る。
更に詳しくは、本発明は、天然型のヒト胎盤アルカリ性
ホスファターゼと比べてカルボキシル末端（ｃ−末端）
において１１〜２５のアミノ酸残基が削除された分泌可
能なヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼを提供するもの
である。該削除の効果は、本発明の発現ベクターを含む
哺乳動物の細胞の膜を介して酵素の通過を許容すること
にある。好ましい実施態様においては、２４のＣ−末端
アミノ酸残基が、天然型のヒト胎盤アルカリ性ホスファ
ターゼと比べて削除されている。
本発明のインデイケータ−遺伝子は、分泌可能な酵素類
が遺伝子を発現する細胞の培地中に出現し、すばやくま
た正確に検出されることができ、また簡単な比色分析に
より測定され得るので、以前に記載されているインデイ
ケータ−遺伝子よりも優れている。その結果として、他
のインデイケータ−遺伝子の発現産物を検出するために
一般的に要求される細胞の粉砕および面倒な生物学的検
定が回避される。
本発明は更に、 （ａ）　　天然型のヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ
と比べてＣ−末端において１１〜２５のアミノ酸残基が
削除された分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスファター
ゼをコードするＤＮＡ配列を含む哺乳動物細胞の培養物
を供給し、 （ｂ）　　該哺乳動物の細胞の培養物を遺伝子発現に影
響をおよぼす因子に接触させて、ＤＮＡ配列の変化した
発現および培地中の変化した量の分泌可能なヒト胎盤ア
ルカリ性ホスファターゼの出現を生じさせ、 （ｃ）　　培地中の分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホス
ファターゼの変化した量を測定することを特徴とする遺
伝子発現に影響を与える因子の検出方法を提供するもの
である。
例証的実施態様においては、分泌可能なヒト胎盤アルカ
リ性ホスファターゼを発現する哺乳動物の細胞は、好ま
しい発現ベクターｐＢｃ１２／ＲＳＶ／５ＥＡＰまたは
ｐＢｃ１２／ＨＩＶ／５ＥＡＰによって感染されている
ＳＶ４０ウィルスゲノム欠損源（ｃＯ３細胞）によって
形質転換されたアフリカ緑サル腎臓細胞系である。
ＣＯ３細胞は、それらのゲノム中にＳＶ４０ラージＴ抗
原を含む（ＧｌｕｚｍａｎのＣｅ１ｌ　２３．１７５−
１８２（１９８１）　）。
後者のベクターの発現は、ベクター中において旧Ｖ−１
ロングターミナルレピート（ＬＴＲ）　プロモーターと
相互に作用しあい分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスフ
ァターゼ遺伝子の発現を大きく強化するヒト免疫不全ウ
ィルス−Ｉ（旧Ｖ−ｒ）のトランス−作用遺伝子産物（
ｔａ　ｔ）により影響される。該強化された遺伝子発現
は、酵素基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを
使用し、培地の簡単な比色分析によって容易に検出され
る。
本発明の分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ
の生産は、分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスファター
ゼをコードするＤＮＡ配列からなる組換えベクターを含
む哺乳動物の細胞を培養し、培養物から分泌可能なヒト
胎盤アルカリ性ホスファターゼを単離することによって
達成することができる。
本発明は、分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスファター
ゼが“５ＥＡＰ”と略称されている本発明の以下の記述
、実施例および以下の図面を参照することによ、ってよ
り容易に理解することができる。
第１図は、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡ
’Ｐ）遺伝子および遺伝子を変異させるために使用した
オリゴデオキシヌクレオチドの塩基１５１゜１５３９の
ヌクレオチド配列を与えるものである。
５個の変異された塩基は、下線で示す；第２図は、ＣＡ
ＴおよびＩＬ−２インデイケータ−遺伝子と５ＥＡＰイ
ンデイケータ−遺伝子の使用とを比較するために使用し
た種々のｐＢｃ１２／Ｉ（ＩＶ発現ベクターの図式的表
示である。個々のρＢＣｌ２／ＨＩＶの構築は、ｐＸＦ
３、ｐＢＩ？３２２の誘導体欠損毒性配列中に挿入され
たＳＶ４０源複製を含むｐＸＦ３１０ｒｉに基づいてい
る（　Ｈａｎａｈａｎ、　Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ１．１６
６．５５７−５８０（１９８３）　；Ｃｕ１ｌｅｎ、前
出文献〕。ベクターｐＢｃ１２／ＨＩＶはまた完全なＨ
ＩＶ−Ｉ　ＬＴＩ？″［３’およびトランス活性化応答
領域（ｃｕｌｌｅｎ、前出文献）を含む７２８ｂｐ　Ｉ
ＩＴＶ−Ｉ　ＬＴＲ断片をも含む。ゲノム・ラット・プ
レプロインスリン■遺伝子（ＬｏｍｅｄｉｃｏらのＣｅ
１１１８、δ４５−５５８（１９７９）　）から誘導さ
れた３′非−コード領域は、ポリアデニル化部位および
３′イントロン領域を提供する。インデイケータ−遺伝
子カセットが、示された様に独特のベクター１１ｉｎｄ
ＩＩとＢａｍ旧部位との間に挿入されていた。内部Ｂａ
ｍＨＩ部位を含む５ＥＡＰの場合、３′部位はＸｈｏｌ
に変化された。ｐＢｃ１２／ＲＳＶヘクターは、）ＩＩ
Ｖ−Ｉ　ＬＴＲニＲ３Ｖ　ＬＴＩ？を代えたほかは同一
である。網目状の陰影をつけた領域は、インデイケータ
−遺伝子カセット中に存在する非コード領域を示す。
第３図は、時間の関数として４５０ｎｍにおける吸光度
の変化を示す感染されたＣＯＳ細胞の媒体がらの５ＥＡ
Ｐ活性の比色分析の図表表示である。検定は、それぞれ
感染されたプレートからの２０ＩＩｄｌの培地全量のう
ちｌＯμｌ　（パネルＡ）および１００ｕｆ（パネルＢ
）を用いて行なった。図は、プラスミドｐＢｃ１２／Ｈ
ＩＶ／ＣＡＴ（ｔａｔ＋）　、対照（ぬりつぶされてい
ない円）；　ｐＢｃ１２／ＨＩＶ／５ＥＡＰ（ｔａｔ−
）（ぬりつぶされていない四角）；　ｐＢｃ１２／ＨＩ
Ｖ／５ＥＡＰ（ｔａｔｌ（ぬりつぶされり四角）および
ｐＢｃ１２／ＲＳＶ／５ＥＡＰ　（閉じられた三角）プ
レートで感染されたＣＯ３細胞を用いて得られた結果を
示す。
第４図は、（１８ｐ）−メチオニンを用いてパルス−標
識した感染されたＣＯＳ細胞の懸濁液の溶解物からの５
ＥＡＰの免疫沈澱物の非連続性５ＯＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動分析の結果を示す。図は、プラスミド
ｐＢｃ１２／ＨＩＶ／ＣＡＴ（ｔａｔ＋）　（レーン１
）、ｐＢｃ１２／ＨＩＶ／５ＥＡＰ（ｔａｔ−）　（レ
−７２）およびｐＢｃ１２／ＩＩＩＶ／５ＥＡＰ　（ｔ
ａ　Ｈ）　（レーン３）により感染されたＣＯＳ細胞を
用いて得られた結果を示す。レーンＭは、ＩＣ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。
ＭＯ）を用いて標識した蛋白質分子量マーカーを含んで
いた。レーン１−３における試料系列は、ウサギ抗−ヒ
ト胎盤アルカリ性ホスファターゼ抗体およびＳ、ａｕｒ
ｅｕｓ蛋白質Ａを使用する免疫沈澱によって単離され、
そのゲルは、オートラジオグラフィーによって展開され
たものである。
本発明の５ＥＡＰ類は、それらが天然型のヒト胎盤アル
カリ性ホスファターゼと比べて１１〜２５のＣ末端アミ
ノ酸残基が削除されているため、それらが生産される哺
乳動物の細胞の膜を通過するヒト胎盤アルカリ性ホスフ
ァターゼの分泌可能な形態となる。天然型の酵素中にお
けるこれらの削除されたアミノ酸残基の存在は、酵素を
ホスファチジルイノシトール−グリカン部分を介してプ
ラズマ膜の外側の片に付着させる。ヒト胎盤アルカリ性
ホスファターゼｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列およ
びそれらから予測されるアミノ酸配列は、ＫａｍらのＰ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ　８２
．８７１５−８７１９　（１９８５）中に開示されてい
る。
本発明はまた、アミノ酸置換を含むがアルカリ性ホスフ
ァターゼ活性および分泌能を保有する分泌可能なヒト胎
盤アルカリ性ホスファターゼの機能的均等物ならびに遺
伝子発現活性を測定するのに使用することができる他の
アルカリ性ホスファターゼおよびその均等物を包含する
。生物学的活性を本質的に変更しない蛋白質およびポＩ
Ｊペプチド中のアミノ酸置換は、この分野で公知であり
、例えばＨ，ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ，Ｌ、Ｈｉｌｌに
よる“ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｍｓ　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９）中、特
に第１４頁の第６図中に述べられている。もっとも頻繁
に観察されるアミノ酸置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ
／ｌｉｅ、　　Ａｓｐ／Ｇｌｕ、　　Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、
　　Ａｌａ／Ｇｌｙ、　Ａｌａ／Ｔｈｒ、　　　Ｓｅｒ
／八ｓｎへ　　　八ｌａ／Ｖａｌ、　　Ｓｅｒ／Ｇｌｙ
、、　　Ｔｙｒ／Ｐｈｅ。
Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、、Ａｓｐ／Ａｓｎ、
　　Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、　　Ｌｅｕ／ｌ／ａｌ、　　Ａｌ
ａ／Ｇｌｕ、　　Ａｓｐ／Ｇｌｙおよびこれらの逆であ
る。
天然型のヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼをコードす
る遺伝子の完全なりＮＡ配列は公知であるので本発明の
５ＥＡＰＩをコードするＤＮＡ配列は、この分野におい
て公知の標準的方法、好ましくは固相法を使用すること
によって化学的に合成することができる。別法としては
、ゲノムＤＮＡが、天然型の酵素源として役立つ。好ま
しくは天然型の遺伝子は、以丁詳細に述べる様に、鋳型
として酵素を活発に生産する細胞からのｍＲＮＡを使用
してｃＤＮＡとして調製される。次に、好ましくはＭｏ
ｒｉｎａｇａらのＢｉｏ／Ｔｅｈｎｏｌｏｇｙ　２．６
３６−６３９　（１９８４）のプライマー−支配部位−
特異的変異方法（ｐｒｉｍｅｒｄｉｒｅｃｔｅｄ　５ｉ
ｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に
よって好ましいヌクレオチド残基の削除が行なわれる。
該変異のために必要とされる合成ヌクレオチドは、Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉ　およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ　らのＪ、
’Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。
１０３．３１８５−３１９１　（１９８１）のホスホラ
ミダイト固形担体方法（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔ
ｅ　５ｏｌｉｄ　５ｕｐｐｏｒｔ　ｍｅｔｈｏｄ）によ
って調製することができる。
その原料にかかわらず、Ｓ　Ｅ　Ａ　Ｐ　類をコードす
るＤＮＡは、細菌中にクローン化され、これらのクロー
ンは、この分野においてよく知られている方法によって
同定することができる。例えば形質転換体は、使用した
ヘクターの存在によって抗生物質耐性に基づいて選択す
ることができ、または相補Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｃＤＮＡ）プ
ローブは、ハイブリッド化技術を使用することによって
ＤＮＡを有するクローンを検出するのに使用されかつ標
識化されたＤＮＡ用に調製することができる。次いでＤ
ＮＡは適当な制限酵素または酵素類を使用して切除する
ことができる。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１株は好まし
い宿主細菌細胞である。
適当な発現ベクター中への切除したＤＮＡの挿入は、５
ＥＡＰＲをコードするＤＮＡおよびベクターが同一の制
限酵素または酵素類によって切断されている場合、容易
に達成することができる。その理由は、その方法によっ
て相補ＤＮＡ末端が調製されるからである。これらが達
成されない場合には、切断末端の単鎖ＤＮＡが平滑末端
を得るために消化しもどすことがあり、または適当なり
ＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのフレ
ナラ断片を用いて単鎖の末端に充填することによっても
同様の結果が達成され得る。この様な方法においては、
平滑末端が切断されたベクターへの平滑末端結合は、酵
素、例えばＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて行なうことが
できる。
発現ベクター中へのＤＮＡの挿入に当っては、また望ま
れる部位のいずれもが、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配
列（リンカ−）を結合することによって調製され得る。
該リンカ−は、制限部位認識配列を含む特異的オリゴヌ
クレオチド配列から成っていてもよい。開裂されたベク
ターおよび修飾されたＤＮＡはまた、Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８．３−２４　（１９７
９）中にＭｏｒｒｏｗによって述べられている様なホモ
ボリメリフク　テーリングによって修飾され得る。
本発明に使用することができる哺乳動物の細胞中で使用
するのに好ましい発現ベクターには、ｐＢｃ１２ＭＩ、
　ｐＢｃＬ２ＢＩＸｐＳＶ２ｄｈＦｒ、　ｐ９１０２３
（Ｂ）、ｐｃＤＶｌ、ｐＲ５Ｖｃａｔ、　ｐＧＡ２９１
、ｐＧＡ２９３、ｐＧＡ２９６、ｐＢＣ１２／１（ＩＶ
／ＩＬ−２およびｐＧＡ３００が包含されるが、これら
に制限されるものではない。ベクターｐＢｃ１２１１１
およびｐＢｃ１２／ｆｌｌＶ／ＩＬ−２が好ましい。該
ベクターは、好ましくはトランスフェクションによって
適当な哺乳動物の宿主細胞中に導入される。
使用することができる哺乳動物の宿主細胞は、例えばヒ
トｔｉｅｌａ、、［９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウス
ＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、ＣＶＩアフリカ緑サ
ル腎臓細胞、うすらロＣ１−３細胞、チャイニーズハム
スター卵巣（ｃＨＯ）細胞、マウスＬ細胞およびＣＯＳ
細胞系を含む。ＣＯＳ細胞系は、以下の様に本発明の例
示的実施態様において使用される。
本発明の５ＥＡＰインデイケータ−遺伝子は、遺伝子の
上流のどんな発現ベクター制御因子の活性をも検出する
のに使用することができる。例えばこれらの遺伝子は、
レセプターまたは活性化物質の作用に敏怒な調節系上の
これら物質である配列特異的結合蛋白質の効果を研究す
るために使用され得る。これらの蛋白質は、カスケード
系の一部分であり；　　ｔａｔ蛋白質が該蛋白質である
かに思われる。更に該遺伝子は、相互に作用し合い、ま
た該物質の活性に影響を及ぼす他の分子の効果を検出す
るのに使用することができる。ここで使用した用語“遺
伝子発現に影響を与える因子”は、遺伝子発現に対する
それらの作用の純効果が陽性または陰性のどちらからで
あろうと全べてのこれら物質を包含するものである。
本発明の例証的実施態様においては、遺伝子発現に影響
を与える因子は、ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｍ　　ロン
グターミナルレピート（ＬＴＲ）　プロモーターの制御
下に遺伝子の発現を大幅に増強するのに役立つｔａｔ惑
染感染蛋白質である。適当な発現ベクター中において、
ＩＩＩＶ　ＬＴＲプロモーターの下流に位置する本発明
のインデイケータ−遺伝子を使用することによって、プ
ロモーターおよび／またはｔａｔ遺伝子産物またはその
生産の作用に関して、薬剤、環境因子および他の遺伝子
産物の効果を監視することが可能である。該系は、　ｔ
ａｔ蛋白質の生産またはプロモーターの機能によって妨
害されうる薬剤のスクリーニングに使用することができ
、そのためＡＩＤＳの治療のための治療上のアプローチ
を提供する。熟練した技術者らは、本発明のインデイケ
ータ−遺伝子ＤＮＡ配列を有利に使用することができる
多くの系を直ちに認識するであろう。
本発明のＳ　Ｅ　Ａ　Ｐ　類が生産細胞の培地中に直接
分泌されるので、培養物の一部を分析のために簡単に取
り上げることができる。アルカリホスファターゼ検定の
いずれの方法も使用され得る。ＭｃＣｏｍｂおよびＢｏ
ｗｅｒｓのＣｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、１８．９７−１０４　
（１９７２）は、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフ
ェートを使用して活性を測定するための最適な緩衝条件
を開示している。例えば使用することができる他の基質
は、Ｍｉｓｋａ　らのＪ、Ｃ１ｔｎ、Ｃｈｅｍ、Ｃｌ１
ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２５．２３−３０　（１９８７）
に記載されているＤ−ルシフェリン０−ホスフェートで
ある。
好ましくは、検定培地は、Ｌ−ホモアルギニン巾約１０
ｍＭとされ、検定前に約６５°Ｃで約５分間予備加熱さ
れる。この処理の効果は、哺乳動物の宿主細胞中に存在
するどんな内因性のホスファターゼ活性をも阻止するこ
とである。
夫隻桝 以下の実施例は、限定的なものではないが、分泌可能な
アルカリ性ホスファターゼをコードする遺伝子がどのよ
うに構築され、かつ発現されるか、およびこの遺伝子を
インデイケータ−遺伝子として使用することが、代表的
な遺伝子発現系における他のインデイケータ−遺伝子に
対していかに優れているかを示している。以下の一般的
方法をこれらの実施例において使用した。
別に特定しない限り、固体混合物中の固体、液体中の液
体および液体中の固体の後に与えた百分率は、それぞれ
Ｗ／Ｗ　、　Ｖ／ＶおよびＷ／Ｖに基づくものである。
飽和した一夜培養物からのプラスミドＤＮＡの小規模な
単離は、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙのＮｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３−１５２３　
（１９７９）の手法に従って行なった。この手法におい
ては、分析を目的として細菌培養物から少量のＤＮＡを
単離することができる。特記しない限り、より大量のプ
ラスミドＤＮＡは、Ｃｌｅｗｅｌｌ　　らのＪ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、１１０．１１３５−１１４６（１９７２
）により記載されているようにして８周製された。
プラスミドＤＮＡの開裂により得られた特定の制限酵素
断片を、１％ＧＴＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙＧｒａｄｅ−遺伝子技術グレード）アガロース（
Ｓｅａｐｌａｑｕｅ。
ＦＭＣＩｎｃ社、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍａｉｎｅ）中
での調製用電気泳動により単離した。５　Ｘ　７．５　
ｃｍのゲルをトリスホウ酸塩緩衝溶液中で５０ｍＭにて
１−２時間作動させ（Ｍａｎ、（ａｔｉｓ　らの前出文
献、４５４頁）、次いで該ＤＮＡを視覚化するためにｌ
μｇ７ｍｌのヨウ化エチジウムにより染色した。適切な
ゲルの選択を行い、５００μｌのトリス−ホウ酸塩緩衝
溶液を入れた透析バック中に収容した。該ＤＮＡを該ト
リスホウ酸塩緩衝溶液中に電気的に溶出させ、フェノー
ルにより２回、クロロホルムにより３回抽出し、次いで
１０μｇのｔＲＮＡ担体（酵母、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ％、ＭＤ）の存在下にエタノールによ
り一２０°Ｃにて沈澱させた。
該制限酵素類、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレナラ断片
）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４　ＤＮ八へリメラー
ゼ）は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社、
Ｂｅｖｅｒｌｙ。
ＭＡの製品であり、これらの酵素類の使用にあたっての
方法および条件は、製造者のプロトコールに依った。
制限エンドヌクレアーゼ類について、活性の単位は、消
化を３７°Ｃで行なった場合に、全反応容積０．０５ｄ
中で６０分間に１．０μｇＤＮＡの完全消化物を生成す
るために必要とする酵素量として定義する。これらのす
べての酵素用として使用した緩衝溶液（制限酵素緩衝溶
液）は、１００ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのトリス−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７，５）、５ｍＭのＭｇＣ１，および１ｍＭ
の２−メルカプトエタノールからなっていた。
Ｔ４　ＤＮＡ連結は、６０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ
７，５）、１０ｍＭのＭｇＣｈ　、１０ｍＭのジチオス
レイトールおよび０．１ｍＭのＡＴＰを含む連結緩衝溶
液中で、４°Ｃにて１６時間行なった。Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ活性の単位は、２０μ２の培養混合物中、０．１２
μＭ　（３００μｇ／ｍ）の５’　Ｄ　Ｎ　Ａ末端濃度
において、１６°Ｃにて３０分間に５０％のラムダＤＮ
Ａの旧ｎｄＩ［断片の連結を与えるに必要な量として定
義する。
単鎖Ｄ　Ｎ　Ａ末端のフレナラ平滑末端化は、ｄＧＴＰ
、ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰをそれぞれ１ｍ
Ｍ含有するように調整した制限酵素緩衝溶液中で行なっ
た。活性の単位は、１０ナノモルのデオキシリボヌクレ
オチドを３７°Ｃにて３０分間で酸不溶性の形態に転換
する量として定義する。
使用した培地は、ニューヨーク、グランドアイランドの
Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、社（ＧＩＢＣＯ）のイスコブスモディファイドダル
ベッコス　ミデイアム（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆ
ｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤ
Ｍ））およびルリアブロス（ＬＢ）を包含し、５ｇのバ
クトーイースト抽出物、１０ｇのバクトートリプトファ
ン（共に旧ＦＣＯ社製品）およびＬｏｇのＮａＣｌを１
！あたりに含有し、ｐＨ７，５に調整されている。示さ
れているように、抗菌剤アンピシリンを５０ｇｇ／ｍｆ
ｌの最終濃度となるように添加した。
エシェリヒアコリ菌株は、形質転換のために塩化カルシ
ウム法により調製した（Ｍａｎ、（ａｔｉｓらの前出文
献、２５４頁）。該細胞類は、ＤａｇｅｒｔおよびＥｈ
ｒｌｉｃｈの方法により形質転換された（Ｇｅｎｅ　６
　＋２３−２８　（１９７９）　）。
５０ｍＭのＣａＣ１，，２０％グリコール中に懸濁した
適合細胞の試料２００μｆｆｉを、１０ｍＭのＣａＣ１
ｚ中に５０から１１０００ｎの範囲のＤＮＡを含む試料
１００μ！と合わせた。該混合物を氷上に３０分間保ち
、次いで４２°Ｃにて２分間加温した。１雁のＬＢを加
え、該混合物を３７°Ｃにて１時間熟成させた。該細胞
を、アンピシリンを有する３７°ＣのＬＢ寒天プレート
上に塗布し、形質転換体の選択のために３７°Ｃにて１
６時間培養した。
ＣＯＳ細胞を、Ｂｕｔｎｉｃｋら（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、　５．３００９−３０１６（１９８５）　）
により記載された方法を用いて感染させた。１０ｃｍの
組織培養皿に、１０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）　、１％
のフンジゾーン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（アンピシリン
ＢのＧｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙの商品名）および５０ｇｇ／ｍｌのゲン
タマイシンを添加したＩＭＤＭ　ＬＯｍｌ中における３
Ｘ１０６個のＣＯＳ細胞を接種し、５％ＣＯ□の３７°
Ｃ加湿培養器中で一夜培養した。該細胞を３７°Ｃのリ
ン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）により一回洗浄し、Ｌｍｇ
／ｍｌのＤＥＡＥ−デクストラン（Ｐｈａｒｍａｃ、（
ａ）　と感染すべきＤＮＡとを含む３７°ＣのＰＢＳ２
ｄを該細胞に加えた。次いで、該ＣＯＳ細胞を培養し、
３０分間にわたって５分間隔で緩和な振とうを行なった
。
この培養後、１０％のＦＣＳ、２％のフンジゾーン、５
０ｇｇｏｄのゲンタマイシンおよび１００μ門のクロロ
キン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）を含有する２０ｍ１の
Ｉｌ’ｌＥＭ　（イスコブスモディファイドイーグルス
メディアム（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅ
ａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ））を冬服に添加した。更
に２＋Ａ時間培養した後、該培地を２．５分間、１０％
のＦＣＳ、１％のフンジゾーン、５０ｇｇ／ｍｆｌのゲ
ンタマイシンおよび１０％のジメチルスルホキシドを有
する新鮮なＩＭＥＭｉ音地に置き換えた。
この培地を、次いで１０％のＦＣＳ、　　１％のフンジ
ゾーンおよび５０ｇｇ／ｍ１．のゲンタマイシンを含有
するＩＭ叶に置き換え、該培養物を３７°Ｃにて７２時
間培養し、次いで該細胞および培地を以下のように分析
した。
Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１は、八ＴＣＣから受託番号
ＡＴＣＣ５３３３８のもとに自由に入手することができ
る。また、この菌株は、Ｃａ５ａｄａｂａｎらの（Ｊ、
Ｍｏ１．Ｂ＋ｏｌ。
１３８．１７９−２０７（１９８０）　）にも記載され
ている。
該ＣＯＳ細胞株は、ＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ　１６
５１のもとに自由に入手することができる。また、この
細胞株は、Ｇｌｕｚｍａｎらの［Ｃｅ１ｌ　２３．１７
５−１８２　（１９８１）］にも記載されている。
プライマー規制の部位支配変異生成を、Ｍｏｒｉｎａｇ
ａらの前出文献に記載された方法に従って行なった。変
異生成工程を実施するために用いた合成オリゴヌクレオ
チドについては、ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕ　
ｔｈｅｒｓの前出文献のホスホラミダイト固体担持法に
よって調製した。
コロニーハイブリッド形成は、Ｍａｎ、（ａｔｉｓらの
前出文献３１２頁に記載の方法を使用して行なった。
Ｍａｎ、（ａｔｉｓらの前出文献３９６頁の方法による
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてのｒ−（”Ｐ　）　
−ＡＴＰによる５′末端標識の後、プライマー規制の変
異生成に用いたものと同じオリゴヌクレオチドをハイブ
リッド形成のためのプローブとして使用した。
ＰＬＡＰ遺伝子を位置付けるために使用したより大きい
ＤＮＡプローブの標識は、ランダムプライミングキット
（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、）を用いて製造者の指示に従い行
なった。
５ＥＡＰの酵素活性は、基質としてリン酸ｐ−ニトロフ
ェニルを使用してＭｃＣｏｍｂらの前出文献に記載され
ているようにして測定した。培養混合物は、Ｌ−ホモア
ルギニンについて１０ｍＭとして作成し、エンドジ−ナ
スホスファターゼ活性を阻止するために、測定に先立っ
て３７°Ｃにて１０分間加温した。
アルカリ性ホスファターゼ活性の１ユニツトは、３７°
Ｃにて１分間に加水分解される１μｍｏｌの基質に対応
している。
ＣＯＳ細胞の１０ｃｍプレート１枚を準備し、前述のよ
うにして感染させた。感染から６０時間たって、培地の
一部を１．５　ｄのエッペンドルフ試験管中に移した。
該培地を、４°Ｃにて２分間、最高速度で遠心分離にか
けることにより澄明化させた。該澄明化された培地を、
別のエッペンドルフ試験管に移し、６５°Ｃにて５分間
加熱した。該培地を、２５°Ｃにて２分間最高速度で遠
心分離した。該培地を新らしいエッペンドルフ試験管に
移し、４°Ｃに保った。該培地試料を２つの方法により
測定した。
第１の測定においては、１０μｌの培地、８０μ２のア
ルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）測定緩衝液（１，０Ｍ
　ジェタノールアミン−ＨＣｌ、　　ｐＨ９，８，０，
５ｍＭ　ｈｇｃ＋□、２０　ｇ　Ｍ　Ｚｎ５Ｏ４）およ
び１０μｆの１００ｍＭ　Ｌホモアルギニンを９６穴の
平底細胞培養プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ）中で３７°Ｃ
にて１０分間前培養を行なった。
次いであらかじめ３７°Ｃに加温したＡＰ測定緩衝液中
の６０ｍＭリン酸ｐ−ニトロフェニル２０μ２を上記混
合物に添加した。該反応混合物の００４゜５をアルチッ
ク（Ａｒｔｅｋ）の自動垂直ビームプレート読取り装置
（ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ）中で測定した。
第２の測定においては、１００μ２の培地、２００μｌ
の１．３　Ｘ　Ａ　Ｐ測定緩衝液および３０μρの１０
０ｍＭ　Ｌ−ホモアルギニンを３７°Ｃにて前培養した
。あらかじめ３７°Ｃに加温した１、３ＸＡＰ測定緩衝
液中の１７４ｍＭ　リン酸ｐ−ニトロフェニル２０μｌ
を添加し、上記と同様にして酵素反応を引続き行なった
。
加熱工程および測定混合物中へのし一ホモアルギニンの
封入を、内因性ホスファターゼ活性阻止のために行なっ
た。
実施例１ 約５００，０００の独立した組換えプラークからなるλ
ｇｔｌｏライブラリーを、ここに参考として加える）Ｉ
ｕｙｎｈ　らのＤ　Ｎ　ＡＣＩｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ。
１９８５年、Ｇｌｏｖｅｒｉ集、ｒＲＬ、アーリントン
、バージニア、第１巻、４９−７８頁の方法に従って構
築した。使用した該ｃＤＮＡは、ニュージャージーモン
トクレアーのＭｏｕｎｔａｉｎｓｉｄｅ　Ｈｏ５ｐｉｔ
ａｌから入手した単一期の胎盤から単離した胎盤ポリア
デニル化ｍＲＮＡから誘導した。該ｃＤＮＡを、インビ
トロにてここに参考として加えるＧｕｂｌｅｒ　らのＧ
ｅｎｅ２５．２６３−２６９頁（１９８３）の方法によ
り調製し、該ライブラリー構築のために約１０ｎｇを使
用した。
スクリーニングは、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ
（ＰＬＡＰ）の公表された配列の６００−６２４および
１４９５−１５２１のヌクレオチド領域を含む２つのオ
リゴデオキシリボヌクレオチドを使用して塩化テトラメ
チルアンモニウム法〔ｗｏｏｄらのＰｒｏｃ、ＮａＬＩ
。
＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８２．１５８５−１５８８
　（１９８５）　）により行なった。１種類のＰＬＡＰ
の対立遺伝子変異のヌクレオチド配列は、Ｋａｍらの前
出文献により開示されている。
４つの独立したクローンが得られ、それらのうち２つが
ＰＬＡＰの全長挿入物を含んでいた。ＰＬＡＰ２．４と
命名した該挿入物のひとつの７５％を、ＢＲＬゲル配列
決定系を使用してＳａｎｇｅｒらのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ
。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６
７　（１９７７）の方法により配列決定を行なった。こ
の挿入物は、ＭｉｌｌａｎのＪ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、２６１．３１１２−３１１５（１９８６）に報告され
ている対立遺伝子変異と同等であることが判明した。
実施例２ 挿入物ＰＬＡＰ　２．４をそのクローンからＥｃｏＲＩ
を用いて切取り、次いでフレナラＤＮＡポリメラーゼＩ
を用い、平滑末端化した。該結果物は、ヒＩ−ＰＬＡＰ
の全翻訳領域と０．７キロ塩基（ｋｂ）の３′−非翻訳
領域とを含む平滑末端化された２、３ｋｂのｃＤＮＡ断
片であった（ＢｅｒｇｅｒらのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ　８４．６９５−６９８（１９８７）　）。
プラスミドｐＢｃ１２／ＰＬＡＰを構築するために、該
２．３ｋｂ断片をＢｅｒｇｅｒらのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、ｓｃｉ　、ＬＩＳＡ８４．４８８５−４８
８９（１９８７）　）に記載されているようにプラスミ
ドｐＢｃ１２ＢＩに挿入した。プラスミドｐＢＣ１２Ｂ
Ｉは、真核性発現ベクターであって、細菌の複製のオリ
ジン、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性、ａ
ｍｐＲ）、サルウィルス４０の複製のオリジン、ロウス
サルコーマウイルス（Ｒｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍν１ｒｕ
ｓ）の長期反復性の転写制御領域および染色体性のラッ
トプレプロインスリン遺伝子を含んでいる。後者は、イ
ントロンおよび効率的なポリアデニル化のシグナルとし
て寄与する。
該発現ベクターｐＢｃ１２ＢＩは、［Ｃｕ１ｌｅｎのＭ
ｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５２．６
８４−７０４（１９８７）　］に記載があり、入手可能
な出発材料ベクターｐＢｃ１２旧とは、該ρＢＣＩ２Ｍ
Ｉに存在するロウスサルコーマウイルスの長期反復から
切取った７４塩基対のＢｓｔＮＩからＨ４ｎｄ［［まで
の断片を欠損する点においてのみ異なっている。この配
列の欠損または存在は、このプロモータまたはベクター
の有用性に何ら影響がない。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＲＰＩ中の
プラスミドｐＢｃ１２ＭＩ　は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ
ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにブタ
ペスト条約のちとに１９８８年２月４日に寄託され、受
託番号ＡＴＣＣ６７６１７が付与されている。
プラスミドｐＢｃ１２／ＰＬＡＰは、本発明の最終例証
となる発現ベクターを、数工程をもって構築するために
使用した。第１には、該発現ベクターｐＢｃ１２／ＰＬ
ＡＰのある部分を除去した。第２には、ＰＬＡＰ遺伝子
を、該酵素の分泌された形態をコードするように変異さ
せた。最後に、変異させた遺伝子を両末端において適切
に調製された発現ベクターに容易に挿入することができ
るように変化させた。
実施例３ ＰＬＡＰΔ４８９は、天然型酵素の２４個のカルボキシ
ル末端アミノ酸残基が欠除したヒト胎盤アルカリ性ホス
ファターゼである。この変異種は、前述した部位特異性
変位生成法により、天然型ＰＬＡＰ遺伝子中、アミノ酸
残基４８９の後に停止コドンを位置づけることによって
製造された。
ＰＬＡＰ遺伝子の部位特異性変異生成を行なう前に、プ
ラスミドｐＢｃ１２／ＰＬＡＰのクロロヌクレオチド断
片が、Ｋｐｎ　Ｉを用いた制限エンドヌクレアーゼ処理
により除去された。５μｇのｐＢｃ１２／ＰＬＡＰ　Ｄ
　Ｎ　Ａは、４８単位の酵素と共に３７°Ｃにて３時間
熟成された。
次いで該反応混合物は、０．９％アガロースゲル中にて
操作され、そして該切断されたベクターは、前述のよう
にして単離された。１５０ｎｇのこのベクターは、Ｔ４
　ＤＮＡリガーゼと共に４°Ｃにて１６時間熟成され、
該反応混合物は、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１細胞を形
質転換するために使用された。
形質転換体は、アンピシリン耐性によって選択された。
プラスミドＤＮＡは、数種のコロニーの微小溶菌（ｍｉ
ｎｉ−１ｙｓａｔｅｓ）を行ない、Ｋｐｎｌ切断の分析
、引き続き１％アガロースゲルを通して電気泳動を行な
うことによって得られた。大規模なプラスミド調製は、
クロロヌクレオチドのＫｐｎｌ断片を欠除したベクター
を含む細胞から行なわれた。該プラスミドは、ｐＢｃ１
２／ＰＬＡＰΔＫＰＮと命名された。
ｐＢｃ１２／ＰＬＡＰΔＫＰＮの部位支配変異生成を行
なうために、２９量体デオキシオリゴヌクレオチドプラ
イマーが、前述のようにホスホラミダイト固体担持法に
より調製された。この２９量体プライマーの配列および
ＤＮＡの変異生成されるべき領域の配列が第１図中に示
されている。該２９量体プラスミドは、Ｄ　Ｎ　Ａ　鎖
の一方の変異されるべき領域のそれぞれの側の塩基に対
して相補的な１２デオキシヌクレオチドを含有していた
。天然型遺伝子の該２９量体プライマーに含まれた５つ
の非相補的ヌクレオチド△、の変異（第１図中に下線に
より示した）は、アミノ酸残基４８９をコードするヌク
レオチドの後の停止コドンおよび新しい１ｌｐａ１部位
を生成したベクター中に創製した。
２０ピコモルの２０ｆｆｉ体プライマーは、１０単位の
ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて、７０ｍＭ　　）リス−１
１ｃＩ、ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇＣｌ２．５ｍＭジチ
オスレイトールおよび１００ｍＭ　ＡＴＰを含む緩衝溶
液中で、１５°Ｃにて２時間熟成することによりリン酸
化された。活性の１単位は、１ナノモルの酸不溶性３２
Ｐの３７°Ｃ１３０分間での生成を触媒する酵素量とし
て定義される。
変異生成処理を行なうために、２０μｇのｐＢｃ１２／
ＰＬＡＰΔＫＰＮが、３６単位のＢｓ５ＨＩＩおよび８
４単位のＫｐｎＩと共に２５１１１Ｍ　）リス−１１Ｃ
１、ｐＨ７，８，１０ｍＭ　ＭｇＣ１，，１００μｇ／
ｍｌウシ血清アルブミンおよび２ｍＭβ−メルカプトエ
タノールを含む緩衝液中で、３７°Ｃにて２４時間熟成
された。“ギャップ）　（ｇａｐｐｅｄ）ベクタ”と呼
ばれる生成された最大のベクター断片は、１％調製用ア
ガロースゲル中で単離された。２０μｇのｐＢｃ１２／
ＰＬＡＰΔＫＰＮは、２０単位のＰｖｕ　Ｉを用いて３
７°Ｃにて１６時間熟成することより線形化され、フェ
ノール／クロロホルムにより抽出され、エタノール中で
沈澱され、水中に取出された。
１１００ｎの同量の線形化およびギャップ生成プラスミ
ド類は、１０μ２の水中の２０倍モル過剰のリン酸化オ
リゴヌクレオチドと混合され、２μ２の１０×クレナウ
緩衝液（ＬＭ　ＮａＣ１，６５ｍＭ　　）リス−〇ＣＩ
（ｐＨ７，４）、４５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚおよび１０ｍＭ
　２−メルカプトエタノール］が添加された。該混合物
は、５．３０．３０および５分間の連続時間において、
それぞれ１００°Ｃ１室温、４°Ｃおよび０°Ｃにて処
理され、その後、該試料は、２ｕｆの１０ｍＭ　ＡＴＰ
、　ｄＣＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰおよびＴＴＰ各
２．５ｍＭの混合物４ｐｌ、０．５　ｕ　ｌのフレナラ
ポリメラーゼＩ　（２，５単位の活性）および１μ２の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（０，８単位の活性）を添加するこ
とにより２０μ！の体積とした。
該混合物は、１５°Ｃにて１６時間熟成され、次いでＥ
、ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１を形質転換するために直接使
用された。形質転換体は、アンピシリンを有するＬＢア
ガロースゲル平板上にて選択され、該平板からのコロニ
ーはニトロセルロースフィルター上に移され、変異生成
処理において使用した２９量体プライマーと同等の配列
の存在について、γ−［：１２ｐｌＡＴＰにより標識さ
れた合成オリゴヌクレオチドキナーゼをプローブとして
選別された。
更に陽性のコロニーは、ＢｉｒｍｂｏｉｍおよびＤｏｌ
ｙの前出文献の方法により期待されるＨｐａ　Ｉ制限部
位の存在について選別された。この処理により得られた
コロニーは、混合されたものであるため（Ｍｏｒｉｎａ
ｇａらの前出文献）、陽性のＤＮＡ試料は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉＭＣ１０６１の再形質転換のために使用され、得られ
たコロニーは、ＨｐａＩ制限部位について再選別された
。
こうして同定された陽性のコロニーは、ｐＢｃ１２／Ｐ
ＬＡＰΔ４８９と命名され、５個の変異されたヌクレオ
チド以外はｐＢｃ１２／ＰＬＡＰΔＫＰＮと同等であっ
た。
実施例４ 最終発現ベクターの調製は、（１）修飾されたヒトアル
カリ性ホスファターゼ遺伝子を挿入可能なベクターの調
製、（２）移動可能なヒトアルカリ性ホスファターゼ遺
伝子断片を得るためのヒトアルカリ性ホスファターゼ遺
伝子の修飾、および（３）この断片のＦＨＭ製されたベ
クターへの挿入を連続的に行なう工程によって実施され
た。
これらの構築に使用したプラスミドの一方は、前記した
ｐＢｃ１２ＢＩであった。他方は、ｐＢｃ１２／１ｌＩ
Ｖ／ＩＬ−２（ｃｕ１１ｅｎのＣｅ１１４６．９７３−
９８２（１９８６）　）であった。プラスミドρＢＣｌ
２／ＩＩＩＶ／■Ｌ−２は、入手可能なベクターｐＢｃ
１２／Ｒ３Ｖ／ＩＬ−２からＮｃｏｌおよび旧ｎｄＩ［
Ｉを用いた切断により、ロウスサルコーマウイルスの長
期反復を切取ることによって調製された。続いて、ヒト
免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）長期反復（ＬＴＲ）のＸｈ
ｏ　Ｉから旧ｎｄＩ［ＩまでのＤＮＡ断片が、標準的技
術を用いて挿入された。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＲＰＩ中のプラ
スミドｐＢｃ１２／ＨＩＶ／ＩＬ−２は、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
にブタペスト条約のもとに１９８８年２月４日に寄託さ
れており、受託番号ＡＴＣＣ６７６１８が付与されてい
る。
本発明の最終例証となる発現ベクターを構築するために
、５μｇのプラスミドｐＢｃ１２ＢＩまたはｐＢＣ１２
／ＩＩＩＶ／ＩＬ−２Ｄ　Ｎ　Ａは、２０単位のＢａｍ
ＨＩにより５０μｌの制限酵素緩衝液中で３７°Ｃにて
２時間処理された。次いで、該反応混合物は、５単位の
酵素を用いた２５°Ｃでの２０分間のフレナラ断片処理
により平滑末端化され、その後、該反応は、フェノ−ル
抽出およびエタノール沈澱により停止された。
次いで、１μｇの平滑末端化ｐＢｃ１２ＢＩまたはｐＢ
Ｃ１２／ＨＩＶ／ＩＬ−２Ｄ　Ｎ　Ａは、１０ｕＥ（Ｄ
連結酵素緩衝溶液中で０．２μｇのリン酸化ＸｈｏＩリ
ンカ−ＤＮＡ　（ｄ（ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ）；Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）および１単位のＴ４
　ＤＮＡリガーゼと共に１５°Ｃにて１５時間熟成され
た。
該反応は、エタノール沈澱により停止され、該連結反応
により生成されたＸｈｏ　Ｉリンカ−の連鎖体は、６０
単位のＸｈｏｌを用いた１００μｌの制限酵素緩衝液中
での３７°Ｃ１３時間の処理により除去された。
追加のエタノール沈澱工程の後、ｐＢｃ１２ＢＩまたは
ｐＢＣ１２／ＨＩＶ／ＩＬ−２Ｄ　Ｎ　Ａは、自己連結
のためニ２０μ！の連結緩衝溶液中で１単位のＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼの存在下に１５°Ｃにて１５時間熟成され
た。次いで、該連結反応混合物は、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＣ
１０６１の形質転換のために直接使用され、そして形質
転換体は、アンピシリンを有するＬＢ寒天上で選択され
た。
アンピシリン耐性コロニーから得られたＤＮＡは、Ｘｈ
ｏＩによる制限エンドヌクレアーゼ切断とそれに続＜ｌ
Ｏμｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１％アガロースゲ
ルでの電気泳動により生成するＤＮＡ断片の分析により
選別された。
出発ベクターｐＢｃ１２ＢＩまたはｐＢｃ１２／）ＩＩ
Ｖ／ＩＬ−２から誘導され、ＸｈｏＩ部位を得たプラス
ミド類が、かくして調製され、同定された。これらのプ
ラスミドは、それぞれプラスミドｐＢｃ１２ＢＩ（＋Ｘ
）およびプラスミドｐＢｃ１２／ＨＴＶ／ＩＬ−２（＋
Ｘ）　と命名された。
次いで、プラスミドρＢＣＩ２ＢＩ（＋Ｘ）およびρＢ
Ｃｌ２／ＨＩＶ＃Ｌ−２（＋Ｘ）は、Ｂｉｒｎｂｏｊｍ
およびＤｏｌｙらの前出文献の溶菌処理により、より大
量に調製された。
クローニングベクターの最終的調製は、５μｇのｐＢｃ
１２ＢＩ（＋Ｘ）またはｐＢｃ１２／ＩＩＩＶ／ＩＬ−
２（＋Ｘ）　Ｄ　Ｎ　Ａを２０単位の旧ｎｄｌｌｌおよ
び２０単位のＸｈｏＩにより切断し、１％アガロースゲ
ルを通しての電気泳動の後に３．９　ｋｂ　ｐＢｃ１２
ＢＩ（＋Ｘ）または４．４ｋｂ　ｐＢｃ１２／旧Ｖ／Ｉ
Ｌ２　（＋Ｘ）ベクター断片を単離することにより行な
われた。
修飾されたヒトアルカリ性ホスファターゼ遺伝子を受け
とるために用いたベクターが、かくして調製され、該修
飾遺伝子は、プラスミドｐＨｃ１２／ＰＬ静Δ４８９を
使用して調製された。ベクターｐＢｃ１２ＢＩ（＋Ｘ）
およびｐＢｃ１２／ＨＩＶ／ＩＬ−２（＋Ｘ）中にり０
−７化するための移動可能なヒトアルカリ性ホスファタ
ーゼ遺伝子断片のために、固有の制限部位がｐＢｃ１２
／ＰＬＡＰΔ４８９の該ヒトアルカリ性ホスファターゼ
遺伝子の５′末端および３′末端に造られた。
５μｇのプラスミドｐＢｃ１２／ＰＬＡＰΔ４８９ＤＮ
Ａは、２０単位のＡｐａＩと共に５０μ！の制限酵素緩
衝溶液中で３７゛Ｃにて２時間処理された。エタノール
沈澱後に、該ＤＮＡは、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ１単
位により３７°Ｃにて５分間平滑末端化され、次いで該
反応はフェノール処理および再度エタノール沈澱により
停止された。
次いでｌＩＩｇの平滑末端化ｐＢｃ１２／ＰＬＡＰΔ４
８９ＤＮＡは、０．２μｇの旧ｎｄＩ［［リンカ−ＤＮ
Ａ　（リン酸化５’−ＧＡＡＧＣＴＴＣ−３’）および
１単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼと共に連結酵素緩衝溶液
１０ｐｒ中で１５°Ｃにて１５時間熟成された。エタノ
ール沈澱により該連結反応を停止した後、ｐＢｃ１２／
ＰＬＡＰΔ４８９に連結した過剰の旧ｎｄＴＩＩリンカ
−ＤＮＡは、６０単位のｔｌｉｎｄＩ［Ｉを用い１００
μ！の制限酵素緩衝溶液中で３７°Ｃにて３時間処理す
ることにより除去された。
エタノール沈澱後、修飾されたｐＢｃ１２／ＰＬＡＰΔ
４８９ＤＮＡは、２０μ！の連結酵素緩衝溶液中で１単
位のＴ４　ＤＮＡリガーゼにより１５゛Ｃにて１５時間
で自己連結された。該連結反応混合物は、Ｅ、ｃｏｌｉ
株ＭＣ１０６１の形質転換に直接使用され、形質転換体
は、アンピシリン含有ＬＢ寒天中で選択された。アンピ
シリン耐性コロニーの該プラスミドＤＮＡは、Ｈｉｎｄ
Ｉ［ＩおよびＡｐａ　Ｉによる制限エンドヌクレアーゼ
切断と引続く１％アガロース中でのゲル電気泳動により
選別された。Ａｐａ　１部位を失ない、かつｌ１ｉｎｄ
■部位を獲得したひとつのプラスミドがかくして同定さ
れ、プラスミドｐＢｃ１２／ＰＬＡＰΔ４８９（＋Ｈ）
　　と命名された。このプラスミドの大規模な調製は、
前述したと同様にして行なわれた。
５μｇのプラスミドＩ）ＢＣ１２／ＰＬＡＰΔ４８９（
＋ｌｌ）　　Ｄ　ＮＡは、上記と同様に２０単位のＫｐ
ｎ　Ｉにより処理され、次いでＴ４　ＤＮＡポリメラー
ゼにより平滑末端化された。１μｇのこのＤＮＡに対し
、０．２μｇのＸｈｏＩリンカ−ＤＮＡが上記と同様に
して連結された。該連結混合物によるＥ、ｃｏｌｉ株Ｍ
Ｃ１０６１の形質転換ならびに制限エンドヌクレアーゼ
ＸｈｏＩおよびＫｐｎｌによるアンピシリン耐性コロニ
ーの該プラスミドＤＮＡの選別の後に、Ｋｐｎ　Ｔ部位
を失ない、かつＸｈｏ１部位を獲得したひとつのプラス
ミドが同定され、ｐＢｃ１２／ＰＬＡＰ（＋Ｈ，Ｘ）と
命名された。
これらの操作後、該ヒトアルカリ性ホスファターゼ遺伝
子は、プラスミＦｐＢＣ１２／ＰＬＡＰＡ４８９（＋Ｈ
，Ｘ）中において、特異的な旧ｎｄｌｌｌおよびＸｈｏ
Ｉ制限部位を側部に有していた。ｐＢｃ１２／ＰＬＡＰ
Δ４８９（＋Ｈ，Ｘ）の大規模なプラスミド調製は、上
記と同様にして行なわれた。
ヒトアルカリ性ホスファターゼ遺伝子断片の最終的調製
は、５μｇのｐＢｃ１２／ＰＬＡＰΔ４８９（＋Ｈ，Ｘ
）を各２０単位の旧ｎｄＩ［ＩおよびＸｈｏＩにより切
断することにより行なわれた。１％アガロースゲルを通
しての電気泳動の後に１．９　ｋｂのヒトアルカリ性ホ
スファターゼ遺伝子断片が単離された。この遺伝子断片
は、上記ベクター類中に以下のようにして挿入された。
１１００ｎのｐＢｃ１２ＢＩ（＋Ｘ）またはｐＢｃ１２
／ＨＩＶ／ＩＬ２（＋Ｘ）の調製されたベクター断片は
、５００ｎｇのヒトアルカリ性ホスファターゼ遺伝子断
片と２０μｌの連結緩衝溶液中で混合され、１単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼと共に１５°Ｃにて１５時間熟成され
た。
次いで、連結されたＤＮＡは、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＣ１０
６１の形質転換に使用され、形質転換体がアンピシリン
を有するＬＢ寒天プレート上で選択された。耐性コロニ
ーの該プラスミドＤＮＡは、旧ｎｄｎ［およびＸｈｏｌ
による制限エンドヌクレアーゼ消化と引続く１％アガロ
ースゲル電気泳動により選別された。
かくして調製された適切に修飾をうけたヒト胎盤アルカ
リ性ホスファターゼ遺伝子を含む２つのプラスミドが同
定され、ｐＢｃ１２／Ｒ５Ｖ／５ＥＡＰおよびｐＢＣ１
２／Ｉ（ＩＶ／５ＥＡＰと命名された（第２図）。
実施例５ ＳＥＡＰイン−゛−−゛　　　　と　のイン−゛との　
　に番る　− ＲＳＶ　ＬＴＲまたは旧Ｖ　ＬＴＲプロモーターの制御
下にある５ＥＡＰ遺伝子を含む上記プラスミド類の有用
性を示すために、ＣＡＴおよびヒトＩＬ−２インデイケ
ータ−遺伝子を含有する類似の構築物を作成した。
Ｒ５Ｖ／ＬＴＲプロモーターの制御下にあるヒトＩＬ−
２遺伝子を含むプラスミドｐＢｃ１２／Ｒ５Ｖ／ＩＬ２
は、ここに参考と２して含めるＣｕ１ｌｅｎの英国特許
出願発行番号ＧＢ２１９０３８２Ａに記載されているよ
うに、ベクターｐＢｃ１２旧から構築された。プラスミ
ドｐＢｃ１２ＭＩは、これに含まれているＬＴＲ断片が
３′方向に１４ｂｐ付加的に延長されていることを除き
ｐＢｃ１２ＢＩと同等である。プラスミドｐＢｃ１２Ｍ
Ｉ　は、＾ｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから自由に入手することができ、
その受託番号はＡＴＣＣ６７１０９である。
ｐＢｃ１２／Ｒ５Ｖ／ＩＬ２　（７）構築は、Ｌ　ｕｇ
　（７）ｐＢｃ１２ＭＩ　ＤＮＡを、２０単位のＢａｍ
１ｌＩ　と共に１０００ｆの制限酵素緩衝溶液中で３７
°Ｃにて１時間処理することにより行なわれた。次いで
、該反応混合物は、４単位の酵素を用いたフレナラ断片
処理を１５°Ｃで２時間行なうことにより平滑末端化さ
れ、その後に、該反応は、６５°Ｃにて５分間加熱する
ことにより停止された。次いで２μｌの該混合物は、連
結緩衝溶液により１　：　１０に希釈され、かつ該混合
物は、氷上にて冷却された。１単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼが添加され、そして該反応混合物は、４°Ｃにて１６
時間熟成された。
次いで、該連結反応混合物は、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＧＭ１１
９（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎから受託番号ＡＴＣＣ５３３３９の
もとに自由に人手できる）の形質転換に直接使用され、
形質転換体は、アンピシリンを含むＬＢ寒天中で選択さ
れた。かくして得られたアンピシリン耐性コロニーから
のＤＮＡは、ＢａｍＨＩおよびＣｌａｌを用いた制限エ
ンドヌクレアーゼ切断と、これに続＜１０μｇ／ｄの臭
化エチジウムを含む１％アガロースゲル中での電気泳動
により生成されたＤＮＡ断片の分析によって選別された
。
ＢａｍｌｌＩ部位を失ない、その場所にＣｌａｌ部位を
得た１つのプラスミドがかくして同定され、プラスミド
ｐＢｃ１２ｃＩ　と命名された。
次いで、プラスミドｐＢｃ１２ｃＩは、Ｃ１ｅｗｅｌｌ
　らの前出文献の界面活性剤溶閑法により大量に調製さ
れた。クローニングベクターの最終的調製は、１ｕｇの
ｐＢｃ１２ｃＩ　ＤＮＡを２０単位のＣ１ａＩにより切
断し、該消化生成物をフレナラ断片ＤＮＡポリメラーゼ
■により平滑末端化することにより行なわれた。
３１ｂｐの５′非翻訳配列および３０９ｂｐの３′非翻
訳配列を側方に有するヒトＩＬ−２の４５９ｂｐコ一ド
領域全体（Ｔａｎ　ｉｇｕｃｈ　ｉらのＮａｔｕｒｅ　
３０２．３０５−３１０（１９８３）　）のｃＤＮＡ複
製物を含むプラスミドｐｌＬ−２−２ｂが、ｐＢｃ１２
／Ｒ３Ｖ／ＩＬ２　（７）ためノＩＬ−２遺伝子の供給
源として使用された。このＩＬ−２ｃＤＮＡ複製物のプ
ラスミドｐｌＬ−２−２ｂ中へのクローニングは、Ｓｍ
ｉ　ｔｈ　らＯ′（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、［ＩＳＡ　８２．８４０４−８４０８　（１９８
５）］により記述されている。
１０μｇのｐｌＬ−２−２ｂは、各２０単位のＲｓａｌ
およびＢａｍ旧により、１００μｌの制限酵素緩衝溶液
中で３７°Ｃにて１時間で切断された。Ｒｓａｌは、該
ＩＬ−２ｃ　Ｄ　ＮＡ挿入物を、該ＩＬ−２開始コドン
より３′側ｔｂｐの単一部位で切断する。次いで該反応
混合物は、フレナラ断片ＤＮＡポリメラーゼ■により処
理され、１％低溶融アガロースゲル中での調製用電気泳
動にかけられた。所望の７６０ｂｐ　ＲｓａＩ／Ｂａｍ
旧ＩＬ−２ｃＤＮＡ断片が同定され、該ゲルから抽出さ
れた１００　ｕ　ｇの調製されたベクターｐＢｃ１２ｃ
Ｉ　は、２単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを含む３０μｌ
の連結緩衝溶液中で１１００ｎのＲｓａＩ／ＢａｍＨＩ
　ＩＬ−２断片と混合サレ、４°Ｃにて一夜熟成された
。該連結ＤＮＡは、次いでＥ、ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１
の形質転換に使用され、形質転換体はアンピシリンを有
するＬＢアガロースプレート上で選択された。
２００ｎｇの単離されたＩＬ−２断片は、アマジャムニ
ックトランスレーションキットを製造者の指示に従って
使用しｒｚｐ標識標識クックトランスレイテッドプロー
ブ成するために使用された。プレートからのコロニーは
、ニトロセルロースフィルタ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　
ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　Ｉｎｃ、）上に移され、次い
で、標識プローブを用い、Ｍａｎ、（ａｔｉｓらの前出
文献３２４頁の方法に従ってＩＬ−２挿入物の存在につ
いて選別された。ハイブリッド形成陽性のコロニーが取
出され、ＤＮＡ少量調製が旧ｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌ
ｌｙの方法〔前出文献〕により行なわれた。
これらの調製物は、旧ｎｄＩ［および５ｔｕｌにより切
断され、ゲル電気泳動により正しい構築物を暗示する特
徴的な６９０ｂｐ断片の存在について選別された。
該構築物は、ｐＢｃｌｏと命名された。
より大量のｐＢｃｌｏ　ＤＮＡが調製され、１０μｇが
２０単位の旧ｎｄＩ［［および１６単位の５ｊｕｌによ
り制限酵素緩衝溶液中で３７°Ｃにて１時間で切断され
た。得られた６９０ｂｐのＩＬ−２ＤＮＡ断片は、調製
用アガロースゲル電気泳動により単離された。
１ｕｇのプラスミドｐＢｃ１２Ｍｃ　ＤＮＡは、Ｂａｍ
１ｌＩにより切断され、次いでフレナラＤＮＡポリメラ
ーゼにより処理された。６５°Ｃでの熟成の後に、該Ｄ
ＮＡは、旧ｎｄｌ［［により切断され、水性フェノール
−クロロホルム（分配）により抽出され、生写の７．５
Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容のエタノールの添加によ
り沈澱され、引続き一７０°Ｃにて熟成された。該沈澱
したｐＢｃ１２ＭＩ　ＤＮＡは、遠心分離により回収さ
れ、エタノールにより洗浄され、水中に再懸濁された。
１１００ｎの調製されたｐＢｃ１２ＭＩベクターは、前
述のようにして、２００ｎｇの単離されたＩＬ−２Ｈｉ
ｎｄ　ｍ／５ｔｕＩ断片と３０μ２の連結緩衝溶液中で
連結された。該連結混合物は、Ｅ、ｃｏｌｔ株ＭＣ１０
６１の形質転換に使用され、そして形質転換体は、アン
ピシリンを有するＬＢアガロースプレート上で選択され
た。各コロニーは、前述と同様に６９０ｂｐ　ｌｌ１ｎ
ｄｌＩ［／ＢａｍＨＩ断片の存在について選別され、こ
の基準に合う構築物は、ｐＢｃ１２／Ｒ３Ｖ／ＩＬ−２
と命名さレタ。
ＨＩＶ　ＬＴＲプロモーターの制御下にあるヒトＩＬ−
２をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＢｃ１２
／ＨＩＶ＃Ｌ−２は、上述と同様にして調製された。
１？ＳＶ　ＬＴＩ？プロモーターの制御下にあるＣＡＴ
遺伝子を含有するプラスミドｐＢｃ１２／Ｒ３Ｖ／ＣＡ
Ｔは、ｐＢＣ１２／Ｒ３Ｖ／ＩＬ−２中のＩＬ−２の旧
ｎｄＩ［［がらＢａｍＨＩまでの断片を、Ｇｏｒｍａｎ
らの（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　２．１ｏ４４１
０５１　（１９８２）　）に記載された旧ｎｄＩＩＩが
らＢａｍ１ｌｌまでのＣＡＴをコードする断片に置換す
ることにより調製された。同様にして、ｐＢｃ１２／Ｈ
ＩＶ／ＣＡＴは、ｐＢＣ１２／ＨＩＶ／ＩＬ−２から構
築された（第２図参照）。
核種々のインデイケータ−遺伝子の比較のために、旧Ｖ
　ＬＴＲプロモーターの制御下にある遺伝子を、旧Ｖ　
ＬＴＲ特異性遺伝子発現のレベルの大きい上昇に寄与す
るｔａｔ遺伝子産物の存在および不存在下の両方にて試
験する必要があった。この遺伝子産物を発現するプラス
ミドｐＢｃ１２／ＣＭＶ／　ｔ２は、かくしてｔａｔ蛋
白の供給源として構築された。
プラスミドｐＢｃ１２／ＣＭＶ／１２は、Ｃｕ１ｌｅｎ
の（ｃｅｌ１４６．９７３−９８２（１９８６）　）に
記載されているようにして構築された。
３ｇ５ｃＡｐ遺伝子産物の発現を証明するために、ＣＯ
Ｓ細胞は、プラスミドｐＢｃ１２／ＨＩＶ／５ＥＡＰお
よびｐＢｃ１２／Ｒ３Ｖ／５ＥＡＰを用い、ｔａｔ蛋白
の供給源としての共に感染されるプラスミドｐＢｃ１２
／ＣＭＶ／１２と共にまたは無しで前述のようにして感
染された［Ｃｕ１ｌｅｎのＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　１５２．６８４−７０４（１９８４）
　；Ｃｕ１ｌｅｎのＣｅ１ｌ　４６．９７３−９８２（
１９８６）参照〕。細胞由来の培地の分別物は、次いで
前述のように酵素活性について分析された。同様な方法
で調製され、分析されたプラスミドｐＢｃ１２／ＨＩＶ
／ＣＡＴを有するＣＯＳ細胞からの培地は、標準として
分析された。
分別物は、培養中、０、ｌ、５．１０．１５．２０．４
０および６０分後に取られ、４０５ｎｍにて測定され、
その結果が第３図に示されている。
第３図は、パネルＡにおいて、プラスミドｐＢＣ１２／
ＲＳＶ／５ＥＡＰを保有する細胞由来の培地の１０μｌ
の分別物が、全時間に亘りリン酸ｐ−ニトロフェニルの
強い加水分解を生じたことを示している（閉じられた三
角形）。プラスミドｐＢＣ１２／ＩＩＩＶ／５ＥＡＰを
保有する細胞由来の培地もまた高い活性であったが、ｔ
ａｔ遺伝子産物が培養物中に存在する場合のみであった
（ぬりつぶされた四角形）。ｔａｔ蛋白が培養物中に存
在しない場合には、有意なアルカリ性ホスファターゼ活
性は培地中に存在しなかった（ぬりつぶされていない四
角形）。同様に、プラスミドｐＢｃ１２／ＨＩＶ／ＣＡ
Ｔにより感染した細胞の培地は、ｔａｔ蛋白が存在して
も有意な活性がなく（ぬりつぶされていない円）　　、
５ＥＡＰ分析の特異性および該分析条件下でのＣＯＳ細
胞中に有意な遺伝子内アルカリ性ホスファターゼ活性の
不在が示された。
パネルＢは、１００μ２の培地の分別物が測定のために
取られたため、より高い活性レベルを示している。しか
しながら、該データは、やはり５ＥＡＰ遺伝子分析の特
異性および感度を示している。わずかに少量のアルカリ
性ホスファターゼ活性がｔａｔ蛋白の不在下に見られた
。
他のインデイケータ−遺伝子類に対する！ＶＡＰ遺伝子
の使用の優位性を示すために、５ＥＡＰ活性が上述と同
様にして測定された。プラスミドｐＢｃ１２／ＨＩＶ／
ＩＬ−２またはｐＢｃ１２／ＲＳＶ／ＩＬ−２ニより感
染されたＣＯＳ培養物の培地のＩＬ−２活性は、Ｇ１１
ｌｉｓらのＪ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２０．２０２７−２０３２（１９７
Ｂ）の方法により測定された。プラスミドｐＢｃ１２／
ＩＩＩＶ／ＣＡＴまたはｐＢｃ１２／ＲＳＶ／ＣＡＴに
より感染されたＣＯＳ細胞中の活性は、３周期の凍結お
よび溶解による細胞の溶解の後にＧｏｒｍａｎらのＭｏ
１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ１２．１０４４−１０５１（１９
８２）の方法により測定した。ＨＩＶプロモーターの制
御下にあるすべてのインデイケータ−遺伝子は、ｔａｔ
遺伝子産物と共に、または無しで上述のようにして試験
された。結果は第１表に示されている。
５ＥＡＰ”　　　　　ＩＬ−２’　　　　ＣＡＴｃａ　
　５ＥＡＰ活性は、細胞培地ｍ１あたりのアルカリ性ホ
スファターゼ活性のミリ単位で与えられている。
ｂＩＬ−２活性は、細胞培地ｍ１あたりの単位で与えら
れている。
ｃ　　ＣＡＴ活性は、細胞抽出物の１　：　、１００希
釈物を使用して、３７°Ｃにて３０分間でのクロラムフ
エニコールのアセチル化型への転換百分率で与えられて
いる。
第１表のデータは、試験した３種のインデイケータ−遺
伝子がすべて背景レベルよりはるかに上の高活性レベル
を生じることを示している。ＨＩＶＬＴＲプロモーター
の制御下にある遺伝子の発現は、予想どおり、ｔａｔ遺
伝子産物の存在に強く依存していた。刺激を受けない（
−ｔａｔ）培養に対する刺激を受けた（＋ｔａｔ）培養
における活性の比に基づくと、該５ＥＡＰ遺伝子は、Ｉ
Ｌ−２およびＣＡＴ遺伝子と同程度に演じｉ　５ＥＡＰ
、ＩＬ−２およびＣＡＴについてのこれらの比は、それ
ぞれ１１８．６４および６０であった。
しかしながら、分析の容易さに基づくと、該Ｓ’ＥＡＰ
遺伝子は顕著に優れていた。
通常使用されているＣＡＴインデイケータ−遺伝子と比
較すると、該５ＥＡＰ遺伝子の使用は、より少ない測定
工程とより少量の試薬を必要とする。該５ＥＡＰ遺伝子
の他の優位点を第２表中にまとめた。
芽−」Ｌ−表 ＩＬ−２遺伝子の産物もまたＣＯＳ細胞培養物中に分泌
されるが、ＩＬ−２検出のために必要な測定は、困難か
つはるかに不正確な細胞培養生物検定である。
実施例６ ３％Ｓ−パルス　　５ＥＡＰの 第１表に示したｔａｔ蛋白が伴う場合および伴わない場
合の感染後７２時間での５ＥＡＰ活性の定常状態におけ
る増加が、増加した５ＥＡＰ蛋白の生成割合を反映する
ものであるか、または存在する酵素分子の活性レベルも
しくは酵素のターンオーバーの影響であるのかを決定す
るために、以下の実験を実施した。
３５ｍｍの培養プレートは、３　Ｘｌ０５ＣＯ３細胞が
接種され、前述と同様にしてプラスミドｐＢｃ１２／Ｈ
ＩＶ／ＣＡＴまたはプラスミドｐＢｃ１２／ＨＩＶ／５
ＥＡＰにより２　ｍｌのイスコブスモディファイドダル
ベッコス　ミディアル（ＩＭＤＭ）中にて感染された。
感染後６０時間において、組織培養培地が吸引除去され
、１滅のメチオニン非含有ＭＥＭ培地（ＧＩＢＧＯ）に
より置換された。該細胞は、３７°Ｃにて１時間前培養
された。
該培地は、吸引除去され、２００μＣｉの３ＳＳ−メチ
オニン（八ｍｅｒｓｈａｍ　８００Ｃｉ／　ｇ　ｍｏｌ
）を含有するメチオニン非含有ＭＥＭ培地で置換され、
３７°Ｃにて１５分間培養された。該パルス標識は、上
述のようにｔａｔの存在下および不在下に行なわれた。
該培地は除去され、該細胞は、１ｍｌの室温の放射免疫
沈澱分析（ＲＩＰ八）緩衝溶液（０，１％ＳＯ５，１％
トライトンＸ−１００，１％コール酸ナトリウム、０．
１５Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＩＭ　　Ｉ−リス−１１ＣＩ
、ｐＨ７，４）の添加により採取され、５分間回転させ
つつ培養された。
次いで該単層がかき取られ、得られた懸濁物は１、５７
１１ｉ！のエッペンドルフ試験管に移され、これは微量
遠心機により４°Ｃにて１５分間最高速度で遠心分離さ
れ、該溶解物を澄明化した。
該澄明化された溶解物は、別のエッペンドルフ試験管に
移され、１μｌの抗原−親和性精製ウサギ抗−ヒト胎盤
アルカリ性ホスファターゼ抗体（ＤＡＫＯ，５ａｎｔａ
　Ｂａｒｂａｒａ、　ＣＡ）　と共に４°Ｃにて１６時
間培養された。２００μ！のスタフィロコッカスアウレ
ウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）
蛋白質Ａ（Ｓｔａｐｈ八、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌ
ａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）の２：１懸濁物が添加され、
該混合物は４　”Ｃにて２０分間培養された。該スタッ
フＡ（Ｓｔａｐｈ　Ａ）は、微量遠心機中で１５秒間遠
心分離することによりペレット化された。
該上澄み液は、除かれ、廃棄された。
該ベレットは、ｌｄのＲＩＰＡ緩衝溶液中にうすにより
再？Ａ濁された。該ペレットは、この方法により更に２
回洗浄された。２０μｌの２×溶解緩衝溶液（０，２２
５Ｍ　　）リス−〇ＣＩ、　　ｐＨ６，８，４％ＳＯＳ
、２０％グルセロール、１０％β−メルカプトエタノー
ル、０．２％ブロモフェノールブルー）が、最終スタッ
フＡペレットに添加された。該免疫複合体は、ｉｏｏ’
ｃにて２分間加熱することにより解離された。
スタッフＡは、遠心分離によりペレット化され、標識物
質は、Ｌａｅｍｍ　Ｉ　ｉのＮａｔｕｒｅ　２２７．６
８０−６８５　（１９７０）に記載されているように９
％の分離ゲルを含む非連続的５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル中の電気泳動により分析された。該ゲルは、ケイ
光分析法のために調製され、前フラッシュを受けたＸ−
線フィルムに対して増感スクリーンを用いて一７０″Ｃ
にてさらされ、その結果は第４図に示されている。
第４図において、レーン１から３は、それぞれプラスミ
ドｐＢｃ１２／ＨＩＶ／ＣＡＴ（ｔａｔ＋）、ｐＢｃ１
２／ＨＩＶ／５ｌｉＡＰ（ｔａｔ−）およびｐＢｃ１２
／ＨＩＶ／５ＥＡＰ（ｔａｔ＋）を含有していた。レー
ンＭは、＋４０で標識された分子量マーカー蛋白質を含
んでいた。これから分かるように、免疫沈澱可能な蛋白
質は、プラスミドｐＢｃ１２／ＨＩＶ／ＣＡＴ（ｔａｔ
＋）によっては生成されず、少量の蛋白質がｔａｔの不
在下にプラスミドｐＢｃ１２／ＨＩＶ／５ＥＡＰによっ
て生成された。５ＥＡＰ蛋白質の強度な生成が、ｔａｔ
存在下のプラスミドｐＢｃ１２／ＨＩＶ／５ＥＡＰにつ
いて見られた。このようにして検出されたｔａｔを伴っ
た場合および伴わない場合の発現レベルにおける差異は
、第１表の細胞上澄液中に測定された活性における差異
に類似している。
本発明の多くの修飾および変形が、当業者には明白とな
るであろうように、その精神および範囲から離脱するこ
となく出来るであろう。ここに記載された特定の態様は
、単に例示のために提供されたものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡ
Ｐ）遺伝子および遺伝子を変異させるために使用したオ
リゴデオキシヌクレオチドの塩基１５１０−１５３９の
ヌクレオチド配列を示し、 第２図は、ＣＡＴおよびＩＬ−２インデイケータ−遺伝
子と５ＥＡＰインデイケータ−遺伝子とを比較するため
に使用した種々のｐＢｃ１２／ＨＩＶ発現ベクターの図
式的表示であり、 第３図は、時間の関数として４５０ｎｍにおける吸光度
の変化を示す感染されたＣＯＳ細胞の媒体からの５ＥＡ
Ｐ活性の比色分析の図表表示であり、更に、第４図は、
（３５；）−メチオニンを用いてパルス標識した感染さ
れたＣＯＳ細胞の懸濁液の溶解物からの５ＥＡＰの免疫
沈澱物の非連続性ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動分析の結果を示す。 ＰＬＡＰ オリゴヌクレオチド 第１図 ５’　　ＣＧＣＧＣＡＣＣＣＧＧＧＧＣＧＧＴＣＣＧＴ
ＧＧＴＣＣＣＧＧ　　３’３’　　ＧＣＧＣＧＴＧＧＧ
ＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＡＧＧＧＧＣ５’出願人
　エフ・ホフマン・う・ロシュ・ラントコンパニー・ア
クチェンゲゼルシャフト代理人　弁理士　平　木　祐　
輔 第 図 第 図 時 間（分） 時 間（分〕

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、天然型のヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼと比べ
    てＣ−末端において１１〜２５のアミノ酸残基が削除さ
    れている分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ
    。 ２、天然型のヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼと比べ
    てＣ−末端において２４のアミノ酸残基が削除されてい
    る請求項１に記載の分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホス
    ファターゼ。 ３、請求項１または２に記載の分泌可能なヒト胎盤アル
    カリ性ホスファターゼをコードするためのＤＮＡ配列。 ４、発現制御配列に有効に連結された請求項３に記載の
    ＤＮＡ配列からなる組換えベクター。 ５、請求項４に記載の組換えベクターを含む哺乳動物の
    細胞。 ６、（ａ）請求項４に記載の組換えベクターを含む哺乳
    動物の細胞を培養し、 （ｂ）培養物から分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスフ
    ァターゼを単離することを特徴とする請求項１または２
    に記載の分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ
    の製造方法。 ７、トランスフェクションによって組換えベクターが哺
    乳動物の細胞に導入されることを特徴とする請求項６に
    記載の製造方法。 ８、（ａ）請求項１または２に記載の分泌可能なヒト胎
    盤アルカリ性ホスファターゼをコードするＤＮＡ配列を
    含む哺乳動物細胞の培養物を供給し、 （ｂ）哺乳動物の細胞培養物を遺伝子発現に影響をおよ
    ぼす因子に接触させ、更に （ｃ）培地中の分泌可能なヒト胎盤アルカリ性ホスファ
    ターゼの量を測定することを特徴とする遺伝子発現に影
    響を与える因子の検出方法。 ９、遺伝子発現に影響を与える因子がｔａｔ蛋白質であ
    る請求項８に記載の方法。 １０、遺伝子発現に影響を与える因子を検出するための
    請求項１または２に記載の分泌可能なヒト胎盤アルカリ
    性ホスファターゼの使用。
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