JP3527288B2 - タンパク質−タンパク質相互作用を検出するためのペリプラズム膜結合系 - Google Patents

タンパク質−タンパク質相互作用を検出するためのペリプラズム膜結合系

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質−タンパク
質相互作用のためのアッセイ、融合タンパク質、および
該タンパク質を含むように修飾した宿主細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】細胞
外環境に関する情報は、いわゆるシグナル導入系（sign
al transductionsystems）によって細胞内部に伝達され
る（シュレシンガー（Ｓchlessinger,Ｊ.）、ＴＩＢＳ
１３：４４３〜７（１９８８）；ストック（Ｓtock,Ｊ.
Ｂ.）ら、Ｍicrobiol.Ｒev. ５３：４５０〜４９０（１
９８９））。幾つかのクラスのシグナルトランスデュー
サーは、第一シグナルのインターナリゼーションなしで
シグナルを「伝える」ことができる。そのようなシグナ
ル伝達は、膜結合レセプターにリガンドが結合すること
によって該レセプターのコンフォメーション変化を引き
起こすことによる。
【０００３】そのようなシグナルトランスデューサーの
一つが、ビブリオ・コレラエ（Ｖibrio cholerae）にお
けるｔｏｘＲ−ｃｔｘ系である。Ｃｔｘはコレラ毒素の
遺伝子である。ＴｏｘＲタンパク質は、アミノ末端のＤ
ＮＡ結合ドメイン、疎水性の強い経膜ドメイン、および
カルボキシル末端の環境に制御されるダイマー形成ドメ
インを有する経膜タンパク質である（ミラー（Ｍiller,
Ｖ.Ｌ.）ら、Ｃell ４８：２７１〜２７９（１９８
４））。現在考えられているところでは、上記疎水性経
膜領域がカルボキシル末端をペリプラズムの方へ向け、
一方、アミノ末端は細胞質内に残る。ペリプラズム中の
浸透性または温度の変化が、ｔｏｘＲタンパク質がその
カルボキシル末端とダイマーを形成する能力に影響を及
ぼすと考えられている。このカルボキシルダイマーが、
今度はｔｏｘＲのアミノ末端がｃｔｘプロモーター中の
繰り返し配列に結合する能力を変化させ、それによって
ｃｔｘプロモーターにおいてＲＮＡポリメラーゼが転写
を開始する能力を変化させる（同上）。
【０００４】ｔｏｘＲタンパク質が膜タンパク質である
という仮説を試験するため、ミラー（Ｍiller）らはｔ
ｏｘＲタンパク質をアルカリホスファターゼ（ｐｈｏ
Ａ）と融合させた（Ｃell ４８：２７１〜２７９（１９
８４））。ｐｈｏＡ酵素は天然にはペリプラズム中でダ
イマーとして存在し、ｐｈｏＡ−ｔｏｘＲ融合タンパク
質はホスファターゼ活性およびｃｔｘのｔｏｘＲ活性化
の両方に関して構成的に機能性であった。この結果は、
ｔｏｘＲがアルカリホスファターゼが活性であるペリプ
ラズム中にアルカリホスファターゼを向けることができ
ること、およびアルカリホスファターゼのダイマー形成
能がｔｏｘＲタンパク質をしてｃｔｘ転写を活性化させ
るようにすることができることを示していた。
【０００５】同様の融合実験において、メカラノース
（Ｍekalanos）らは、ダイマー形成および活性にＺｎ2+
を必要とするｐｈｏＡ変異体にｔｏｘＲを融合させた
（個人的な通信）。予想通り、この融合タンパク質のホ
スファターゼ活性はＺｎ2+依存性であったが、ｃｔｘ活
性化もまたＺｎ2+依存性であった。この結果はｔｏｘＲ
活性についてのシグナル導入モデルと一致している。
【０００６】これまで、種々の細菌系を有する原核細胞
（ウツミ（Ｕtsumi,Ｊ.）ら、Ｓcience ２４５：１２４
６〜１２４９）、種々の真核ホルモンレセプターを有す
る組織培養細胞（リーデル（Ｒiedel,Ｈ.）ら、ＥＭＢ
Ｏ Ｊ. ８：２９４３〜２９５４（１９８９））、およ
び細菌性アスパラギン酸結合ドメインおよびインシュリ
ンレセプターを有する組織培養細胞（モー（Ｍoe,Ｇ.
Ｅ.）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ８６：５６８３〜
７（１９８９））においてキメラシグナル導入系が構築
されている。しかしながら、現在までのところ、そのよ
うな系にはビブリオ・コレラエについてｔｏｘＲレセプ
ターを用いていない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、(ａ)(ｉ)ペリ
プラズムダイマー形成ドメイン（たとえば、リガンド結
合ドメイン）、および(ｉｉ)細胞質ｔｏｘＲ ＤＮＡ結
合領域および疎水性ｔｏｘＲ経膜領域を有するｔｏｘＲ
領域、を有する経膜融合タンパク質；および(ｂ)ｃｔｘ
オペロンに機能的に連結したレポーター遺伝子を有する
核酸分子を含み、ダイマー形成（リガンド結合が関与す
るまたは関与しない）が該レポーター遺伝子の発現によ
り表示される宿主細胞に関する。
【０００８】本発明はまた、上記融合タンパク質、対応
する核酸配列、および誘発プロモーターを有する対応発
現ベクターにも関する。さらに、本発明は、本発明の宿
主細胞の培養液をリガンドで処理し、ついでレポーター
遺伝子の発現をスクリーニングすることを特徴とする、
膜結合タンパク質のダイマー形成（たとえば、リガンド
の結合の結果として）を検出する方法に関する。
【０００９】本発明は、種々のリガンド結合ドメインか
らシグナルを生成させるのに用いることができる。選択
したリガンドの存在は、抗生物質耐性または酵素産生に
対する簡単な比色試験により示すことができる。生物学
的に関係の深い相互反応を容易に測定可能なシグナルに
よって示すことができるように、該経膜タンパク質のペ
リプラズム領域は治療に関連するドメインを含んでいて
よい。そのような経膜融合タンパク質はまた、ダイマー
形成ドメイン、リガンド結合ドメイン、タンパク質膜ス
パニング配列（protein membrane-spanning sequence
s）、およびシグナル導入に関する我々の理解を助ける
に違いない。
【００１０】図１は、本発明が用いる機構を示す模式図
である。図１に示すように、リガンド結合タンパク質
（ＬＢＰ）は細胞内膜（ＩＭ）および外膜（ＯＭ）の内
部に位置している。ｔｏｘＲタンパク質の発現レベルが
ある臨界レベルに達すると、ダイマー形成が続いて起こ
る。または、リガンド（Ｌ）がｔｏｘＲ融合タンパク質
のリガンド結合ドメインに結合すると、このことがダイ
マー形成を引き起こす。いずれの場合も、ダイマー形成
は野性型またはｔｏｘＲ融合タンパク質の細胞質ドメイ
ンのコンフォーメーション変化を引き起こし、それによ
ってレポーター遺伝子（ｒ）のプロモーター領域（ｐ）
への結合が誘発される。このＤＮＡ結合によってＲＮＡ
ポリメラーゼが該レポーター遺伝子を転写することが可
能となり、かくして自発的かまたはリガンドに誘発され
たペリプラズムドメインの会合能の結果としてダイマー
形成が表示される。
【００１１】図２〜図５は、コントロールベクターおよ
び融合ベクターを示す。「ＬＡＣｐ」はｌａｃプロモー
ターを示す；「ＡｍｐＲ」はアンピシリン耐性遺伝子；
「Ｓｐｅｃ」はスペクチノマイシン耐性遺伝子；「Ｌａ
ｃＺ」はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；「ＣＴＸｐ」は
コレラ毒素プロモーター；「ＣＡＴ」はクロラムフェニ
コールトランスフェラーゼ遺伝子を示す。 図２：ｐＴＯＸ３ この野性型のＴｏｘＲコントロールベクターは、発現ベ
クターｐＳＰＯＲＴ１中にビブリオ・コレラエのゲノム
からのｔｏｘＲ ＰＣＲクローン（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：
１）を含む。ｔｏｘＲ遺伝子をｌａｃプロモーターの制
御下に置いてあり、ＩＰＴＧ処理により誘導できるよう
にしてある。所望の導入体はアンピシリン処理すること
により選択することができる。ＣｏｌＥＩ開始点はｐＳ
Ｃ１０１開始点と両立する。
【００１２】図３：ｐＴＯＸ５ このｔｏｘＲ融合ベクターは、ベクターｐＳＰＯＲＴ１
中にビブリオ・コレラエのゲノムからの末端の欠けた
（truncated）ｔｏｘＲ ＰＣＲクローン（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２）を含む。ｐＴＯＸ５は外来ドメインのインフ
レームのクローニングを可能とし、一方向欠失に基づい
て一群の融合物を生成させるのに用いることができる。
この末端の欠けたｐＴＯＸ５はｃｔｘプロモーターを活
性化させず、キメラタンパク質中に認められるシグナル
はすべて融合したドメインのダイマー形成能の結果によ
るものである。
【００１３】図４：ｐＣＴＸ３ このレポーター遺伝子ベクターは、ｐ３０８３（Ｉnfec
tion and Ｉmmunology、５８、４１４２〜４１４４頁、
１９９０）からＰＣＲ増幅され新規なプロモーター不含
ｌａｃＺベクター中にクローニングされたコレラ毒素プ
ロモーター、ｃｔｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含む。
この構築物は、ＴｏｘＲまたはＴｏｘＲ融合タンパク質
のダイマー形成の関数としてβ−ガラクトシダーゼを発
現する。ｐＳＣ１０１開始点はＣｏｌＥＩ開始点と両立
する。所望の形質転換体はスペクチノマイシン処理によ
り選択することができる。
【００１４】図５：ｐＣＴＸ４ このベクターは、ｐＣＴＸ３のＬａｃＺ中に挿入したｐ
ＣａＭＶＣＮからのプロモーター不含ＣＡＴ遺伝子を含
む。本ベクターが由来するｐＣＴＸ３ベクターと同様、
ｐＣＴＸ４もまたスペクチノマイシン選択を提供し、ｔ
ｏｘＲまたはｔｏｘＲ融合タンパク質のダイマー形成の
関数としてクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼを発現する。
【００１５】図６および図７は、野性型ｔｏｘＲ遺伝
子、ｐＴＯＸ５からの末端の欠けたｔｏｘＲ、およびｔ
ｏｘＲインフレーム遺伝子融合物についての結果を示
す。本実施例における融合は、重要なコントロールを示
すよく研究されたダイマー形成ドメインである酵母ＧＣ
Ｎ４タンパク質のロイシンジッパー（zipper）ダイマー
形成ドメインへの融合である。
【００１６】図６：ｌａｃＺレポーター遺伝子とのコト
ランスフェクション プラスミドｐＴＯＸ３、ｐＴＯＸ５、およびｐＴＯＸ５
ＧＣＮ４について、この図は、０（第一の棒線）、５０
（第二の棒線）、および２００（第三の棒線）μＭ Ｉ
ＰＴＧの存在下で産生されたβ−ガラクトシダーゼの量
（ミラー単位にて測定）を示す。これら結果は、β−ガ
ラクトシダーゼ発現がＩＰＴＧによるｐＴＯＸ３の野性
型ｔｏｘＲ遺伝子の誘導に依存すること、およびｐＴＯ
Ｘ５における末端の欠けたｔｏｘＲ産物は誘導後でさえ
も発現を活性化することができないことを示している。
ｐＴＯＸ５−ＧＣＮ４で認められる結果は、外来のダイ
マー形成ドメインが誘導活性化を回復し得ることを示し
ている。
【００１７】図７：ＣＡＴレポーター遺伝子とのコトラ
ンスフェクション 図７に示す結果は、野性型ｔｏｘＲおよびキメラｔｏｘ
Ｒ−ＧＣＮ４を発現する株に対して予想されるように、
ｐＣＴＸ４からのクロラムフェニコール耐性遺伝子の活
性化を示す。使用したクロラムフェニコールの量は、各
欄の上部にμｇ／ｍＬで示す。「Ｊ４」はｐＣＴＸ４で
トランスフェクションされたＪＭ１０１株を示す。
「Ｒ」はクロラムフェニコール耐性を、「Ｓ」は感受性
を示す。材料および方法に示すように、ＩＰＴＧの存在
下で細胞を増殖させた。ＩＰＴＧを用いない場合には、
クロラムフェニコール耐性は観察されない。
【００１８】図８は、ｔｏｘＲ−ｔｒｋＣ融合に応用す
る、一方向欠失を生成する方法を示す。ＴｒｋＣはチロ
シンキナーゼクラスのレセプターの成員であり、神経成
長因子ＮＴ３と相互作用する（Ｃell、６６、９６７〜
９７９頁、１９９１）。融合ベクターｐＴＯＸ５中の末
端の欠けたｔｏｘＲ遺伝子の下流にＮｏｔＩ開裂部位に
て全長ｔｒｋＣ ｃＤＮＡクローンを位置させた。Ｓｆ
ｌＩおよびＮｏｔＩで消化した後、このベクターをエク
ソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）で処理すると、
ＳｆｌＩ開裂部位から５'→３'の一方向欠失が開始され
た。ついで、ＥｘｏＩＩＩ処理したプラスミドをヤエナ
リ核で消化した。ライゲーションすると、この処理によ
ってｔｏｘＲと種々の長さのｔｒｋＣ断片との一群の融
合物が得られる。
【００１９】図９〜図１１は、図８に示す手順により調
製したｔｏｘＲ−ｔｒｋＣ融合物についての結果を示
す。 図９：β−ガラクトシダーゼアッセイ 種々の融合物のｔｏｘＲ活性をβ−ガラクトシダーゼ発
現により測定した。アッセイをＩＰＴＧの存在下（１０
０μＭ）および不在下の両方で富培地（「ＬＢ」の欄）
および最小培地（「ＭＩＮ」の欄）中で行った。 図１０：ｔｒｋＣ部分のシークエンシング 図１０に示す表は、欠失変異体の配列をｔｒｋＣおよび
ｔｏｘＲの配列が知られたものと比較することによって
決定した、融合物中で欠失した配列のサイズ（塩基対に
て）および境界を示す。 図１１：ｔｏｘＲ−ｔｒｋＣ融合物の遺伝子地図 図１０の表に示すデータをグラフで表したものであり、
白抜き棒は各融合物において欠失した塩基対の大きさを
示す。
【００２０】図１２〜図１４は、ｐＴＯＸ５のｔｏｘＲ
欠失物へのＨＳＶ ＩＣＰ３５およびＨＩＶインテグラ
ーゼの融合物で得られた結果を示す。 図１２および図１３：ｔｏｘＲ融合物によって誘導され
たβ−ガラクトシダーゼ活性 ＪＭ１０１バックグラウンドでの６時間誘導の結果（図
１２）およびＤＨ５αバックグラウンドでの４時間誘導
の結果（図１３）を示す。Ｙ軸はβ−ガラクトシダーゼ
活性をミラー単位で示す。Ｘ軸はＩＰＴＧの濃度をマイ
クロモルで示す。これら結果は、ｔｏｘＲ−ウイルス融
合タンパク質によるｃｔｘ活性化を確認し、ウイルスド
メインがダイマー形成させたことを示唆している。 図１４：ＴｏｘＲ融合物によって誘導されるクロラムフ
ェニコール耐性 図６および図７と同様、クロラムフェニコールに対する
耐性によってダイマー形成を示され、μｇ／ｍＬで表し
てある。「Ｄ４」は宿主株としてのＤＨ５α株を表し、
残りの術語は図６および図７と同じである。
【００２１】ＴｏｘＲは、アミノ末端にＤＮＡ結合ドメ
インを有する経膜タンパク質をコードする。この細胞内
ドメインは、ｃｔｘオペロンからの発現を活性化する能
力を有する。トランス活性化はｔｏｘＲタンパク質のダ
イマー形成に依存し、ダイマー形成は該タンパク質の細
胞外カルボキシルドメインによって指令される。ｔｏｘ
Ｒ−ｃｔｘ系はタンパク質−タンパク質会合の一次シグ
ナルを受け、これを遺伝子発現の二次メッセージへ導入
することができる。ｔｏｘＲタンパク質が天然で膜に局
在すること（経膜部分による）により、膜タンパク質を
含むキメラ生成に対する魅力的なホストとなっている。
この膜への局限はまた、タンパク質の拡散を二次元脂質
平面に制限するという興味深い性質を有する。ダイマー
形成ドメインの細胞外ペリプラズム空間中の配置は、ダ
イマー平衡に影響を及ぼすかもしれない外来因子への接
近を可能とするであろう。
【００２２】術語の定義 以下の定義は、特別の場合に特に断らない限り、本明細
書を通じて用いる術語に適用される。「ダイマー形成ド
メイン」および「ダイマーを形成し得る領域」なる語
は、自発的にかまたはリガンド結合の結果としてなどに
よりセルフダイマーを形成し得るポリペプチド配列をい
う。ダイマー形成ドメインの例としては、ｔｒｋＣ、Ｇ
ＣＮ４、ＨＳＶ骨格タンパク質ＩＣＰ３５、ＨＩＶイン
テグラーゼなどに由来するものが挙げられる。「レポー
ター遺伝子」なる語は、その発現によって測定可能なシ
グナルを生成するあらゆる遺伝子をいう。レポーター遺
伝子の例としては、β−ガラクトシダーゼおよびクロラ
ムフェニコールトランスフェラーゼの遺伝子が挙げられ
る。他の種々のレポーター遺伝子が当業者によってよく
知られている。
【００２３】製造法 （１）遺伝子構築物 本発明に用いる核酸は、組換え核酸法によって調製する
ことができる。たとえば、ネルズ（Ｎelles）らの組換
えＤＮＡ法（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２６２、１０８５５
（１９８７））を参照。そのような構築物を含有する株
の例としては、ＲＦＭ２０１６ｓｕｐＥｔｈｉΔ（ｐｒ
ｏ−ｌａｃ）／Ｆ'（ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃ
ＩQｌａｃＺΔＭ１５）／ｐＴＯＸ５／ｐＣＴＸ４（Ａ
ＴＣＣ受託番号６９,４０３）およびＲＦＭ２０６３ｓ
ｕｐＥｔｈｉΔ（ｐｒｏ−ｌａｃ）ｄｅｇＰ：：Ｔｎ５
／Ｆ'（ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩQｌａｃＺΔ
Ｍ１５）／ｐＴＯＸ５ｔｒｋＣ１２／ｐＣＴＸ３（ＡＴ
ＣＣ受託番号６９,４０４）が挙げられる（「ＡＴＣ
Ｃ」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、
メリーランド州２０８５２−１７７６をいう）。
【００２４】ＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡ、サブゲノム
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびそれらの組み合わ
せを含む種々の採取源から得ることができる。ゲノムＤ
ＮＡおよびｃＤＮＡは幾つかの方法により得ることがで
きる。所望の配列をコードする細胞を単離し、ゲノムＤ
ＮＡを断片化し（たとえば、１種または２種以上の制限
エンドヌクレアーゼで処理することにより）、ついで得
られた断片をクローニングし、所望の配列に相補的なプ
ローブで同定し、所望の活性をコードする配列の存在に
ついてスクリーニングすることができる。ｃＤＮＡにつ
いては、ｃＤＮＡをクローニングし、得られたクローン
を所望の領域をコードするｃＤＮＡに対するプローブを
用いてスクリーニングすることができる。所望のクロー
ンが単離されたら、ゲノムＤＮＡと実質的に同じ仕方で
処理することができる。
【００２５】ＤＮＡ配列を発現するには、適当な宿主に
よって認識される転写シグナルおよび翻訳シグナルが必
要である。ｔｏｘＲ遺伝子配列を誘導プロモーター（た
とえば、ｌａｃプロモーター）に機能的に連結させて該
系に対する制御を与えるのが好ましい。別法として、ゲ
ノムＤＮＡからのプロモーター領域は、融合タンパク質
のｔｏｘＲまたは他の領域のＤＮＡ配列に結合して得る
ことができる。宿主細胞がｔｏｘＲ領域に結合した転写
制御シグナルおよび翻訳開始シグナルを認識することが
できる限りにおいて、コード配列に隣接する５'領域を
保持し、転写および翻訳制御に用いることができる。こ
の領域は、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、
ＣＡＡＴ配列などの転写および翻訳開始に関与する配列
を含むであろう。一般に、この領域は少なくとも約１５
０塩基対の長さであり、より一般的には約２００塩基対
であり、約１〜２ｋｂを越えることはほとんどない。
【００２６】非コード３'領域もまた、とりわけ停止シ
グナルやポリアデニル化領域などの転写停止制御配列に
ついて保持することができる。加えて、非コード３'領
域はまたエンハンサーを含んでいてよい。転写停止シグ
ナルが宿主細胞において満足のいくほど機能しない場合
には、異なる遺伝子からの機能性の３'領域を置換する
ことができる。この方法において、置換された３'領域
の選択は、発現のために選択した細胞系に依存するであ
ろう。
【００２７】宿主細胞の性質に応じて、種々の広範囲の
転写および翻訳制御配列を用いることができる。制御シ
グナルが宿主細胞中で高発現レベルを有する遺伝子に由
来する場合には、転写および翻訳制御配列はウイルス起
源（たとえば、アデノウイルス、ウシパピローマウイル
ス、シミアンウイルスなど）であってよい。別法とし
て、哺乳動物発現産物（たとえば、アクチン、コラーゲ
ン、ミオシンなど）からのプロモーターを用いることも
できる。転写開始制御シグナルは、遺伝子の発現を調節
することができるように抑制または活性化できるものを
選択する。そのような制御可能な調節法の一つは、温度
感受性の制御シグナルを用いることであり、温度を変化
させることによって発現を抑制または開始させることが
できるようにするものである。他の制御可能な調節法
は、ある種の化学物質に対して感受性の制御シグナルを
用いることである。
【００２８】ｔｏｘＲまたはｃｔｘキメラ遺伝子構築物
を生成させるため、当該技術分野で公知の常法に従って
ＤＮＡ断片をライゲートすることができる。そのような
方法には、粘着末端断片を平滑末端に変える（またはそ
の逆）制限酵素、粘着末端を充填して平滑末端を生成す
るポリメラーゼおよびヌクレオチド、所望でないライゲ
ーションを回避するためのアルカリホスファターゼ、お
よび断片を結合するためのリガーゼの使用が挙げられ
る。ｔｏｘＲおよびその融合パートナーの構築物は、一
緒に連結して単一の一本鎖ＤＮＡを生成させることもで
きるし、またはそれら自体でまたはベクターに連結して
別々の断片として保持することもできる。構築物は、該
構築物が宿主ゲノム中に組み込まれたときに選択を可能
とする遺伝子とともに形質転換により細胞中に導入する
ことができる。通常、構築物は、宿主細胞によって認識
される複製系を有するベクターの一部である。
【００２９】（２）発現ベクター 本発明の分子を産生させるための発現ビヒクルとして
は、プラスミドまたは他のベクターが挙げられる。一般
に、そのようなベクターには、種々のタイプの宿主（原
核生物、酵母、真菌、植物および高等真核生物を含むが
これらに限られるものではない）中での発現を可能とす
る制御配列が含まれる。所望のコード配列および制御配
列を含有する適当な発現ベクターは、当該技術分野で公
知の標準的な組換えＤＮＡ法（多くはサンブルック（Ｓ
ambrook）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボ
ラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク（１９８９）に記載されている）を用
いて構築することができる。
【００３０】本発明において使用する発現ベクターは、
少なくとも、レポーター遺伝子構築物の複製および経膜
融合タンパク質構築物の複製および発現を指令すること
ができなければならない。ある一つのクラスのベクター
では、動物ウイルス（たとえば、ウシパピローマウイル
ス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはＳＶ４
０）に由来する自己複製染色体外プラスミドを提供する
ＤＮＡ要素を利用する。第二のクラスのベクターは、所
望の遺伝子配列の宿主細胞染色体中への組み込みに依存
する。
【００３１】本発明において有用な発現ベクターには、
一般に、複製開始点、発現すべきＤＮＡ配列の５'側
（すなわち、上流）に位置するプロモーター、および転
写停止配列が含まれる。適当な複製開始点としては、た
とえば、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ＳＶ４０およびＭ
１３の複製開始点が挙げられる。適当な停止配列として
は、たとえば、ウシ成長ホルモン、ＳＶ４０、ｌａｃＺ
およびＡｃＭＮＰＶポリヘドラル（polyhedral）ポリア
デニル化シグナルが挙げられる。適当なプロモーターと
しては、たとえば、サイトメガロウイルスプロモータ
ー、ｌａｃＺプロモーター、ｇａｌ１０プロモーターお
よびＡｃＭＮＰＶポリヘドラルプロモーターが挙げられ
る。プロモーター配列はまた、発現を調節するため（た
とえば、栄養物または他のインデューサーの増殖培地中
の存在または不在によって）、誘導性であってもよい。
一例は、バクテリオファージラムダｐｌａｃ５から得ら
れるｌａｃオペロン（ＩＰＴＧによって誘導することが
できる）がある。
【００３２】発現ベクターはまた、所望の生成物の最適
の発現のために他の制御配列を含んでいてよい。そのよ
うな配列としては、発現産物に安定性を付与する安定性
リーダー配列；発現産物を分泌させる分泌リーダー配
列；ＤＮＡ配列の発現を上方制御するエンハンサー；お
よび制限エンドヌクレアーゼによる開裂部位を提供する
制限酵素認識配列が挙げられる。これら材料はすべて当
該技術分野で公知であり、市販されている。たとえば、
オカヤマ（Ｏkayama）、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、３、２８
０（１９８３）を参照。
【００３３】適当な発現ベクターにはまた、形質転換し
た宿主細胞の表現型選択を可能にするマーカー配列が含
まれていてよい。そのようなマーカーは、栄養要求性の
宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（たとえば、抗生
物質耐性）などを付与する。選択可能なマーカー遺伝子
は、発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結することも
できるし、またはコトランスフェクションにより同細胞
中に導入することもできる。選択可能なマーカーの例と
しては、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシ
ン耐性などが挙げられる。
【００３４】実際に使用する発現ベクターの特性は、使
用する宿主細胞と両立するものでなければならない。た
とえば、哺乳動物細胞宿主の場合、発現ベクターは哺乳
動物細胞のゲノムから単離したプロモーター（たとえ
ば、マウスメタロチオネインプロモーター）または該細
胞中で増殖するウイルスから単離したプロモーター（た
とえば、ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーター）を
含んでいてよい。本発明のＤＮＡ配列を挿入することの
できる適当な市販の発現ベクターとしては、ｐＳＰＯＲ
Ｔ（これが好ましい）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳ
Ｋ、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮ
Ａ／Ｎｅｏ、バクロウイルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢ
ａｃ、原核発現ベクターｐｃＤＮＡＩＩおよび酵母発現
ベクターｐＹｅｓ２（以上、すべてインビトロジェン
（Ｉnvitrogen Ｃorp.）、サンジエゴ、カリフォルニア
州から入手可能である）が挙げられる。
【００３５】（３）宿主細胞 本発明はさらに、ｔｏｘＲおよびｃｔｘキメラ遺伝子構
築物のためのＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含む
宿主細胞にも関する。適当な宿主細胞には原核および真
核の両細胞が含まれる。適当な原核宿主細胞としては、
たとえば、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＸＬ１ Ｂ
ｌｕｅ、Ｙ１０９０およびＪＭ１０１が挙げられる。適
当な真核宿主細胞としては、たとえば、スポドプテラ・
フルジペルダ（Ｓpodoptera frugiperda）昆虫細胞、Ｃ
ＯＳ−７細胞、ヒト線維芽細胞、およびサッカロミセス
・セレビシエ細胞が挙げられる。
【００３６】宿主として有用な哺乳動物細胞としては、
線維芽細胞由来の細胞（たとえば、ＶＥＲＯまたはＣＨ
Ｏ−Ｋ１）またはリンパ球由来の細胞（たとえば、ＳＰ
２／０−ＡＧ１４またはＰ３ｘ６３Ｓｇ８）またはそれ
らの誘導体が挙げられる。好ましい哺乳動物宿主細胞と
しては、ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌが挙げられる。培
養腎臓癌腫細胞および３Ｔ３細胞などのような幾つかの
細胞株はウロキナーゼを分泌し、トランスフェクション
に用いることができる（フェリバロ（Ｆerrivalo）ら、
Ｊ.Ｃell Ｐhysiol.、１２１、３６３（１９８４）；ベ
リン（Ｂelin）ら、ＥＭＢＯ Ｊ.、３、１９０（１９８
４））。
【００３７】他の好ましい宿主は酵母である。酵母は、
グリコシレーションを含む翻訳後のペプチド修飾をも行
うことができるという点で実質的な利点を有する。酵母
中での所望のタンパク質の産生に利用することのできる
強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミド
を利用した多くの組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母
は、クローニングした哺乳動物遺伝子産物上でリーダー
配列を認識し、リーダー配列を有するペプチドを分泌す
る。
【００３８】不死化細胞、とりわけミエローマ細胞やリ
ンパ腫細胞も適当な宿主細胞である。これら細胞は、培
養フラスコ中の適当な栄養培地中で増殖させるか、また
は同系（synergenic）宿主（たとえば、マウスまたはラ
ット）または免疫不全宿主または宿主部位（たとえば、
ヌードマウスまたはフクロハムスター（hamster pouc
h））中に注入することができる。とりわけ、これら細
胞を腹水産生およびキメラ分子の回収のために腹腔中に
導入することができる。別法として、これら細胞を皮下
注射し、宿主の血液から抗体を回収することができる。
これら細胞はハイブリドーマ細胞と同様に用いることが
できる。ダイアモンド（Ｄiamond）ら、Ｎ.Ｅng.Ｊ.Ｍe
d.、３０４、１３４４（１９８１）；モノクローナル抗
体：ハイブリドーマ−生物学的分析の新次元（ケナット
（Ｋennatt）ら編）プレナム（１９８０）を参照。
【００３９】発現ベクターの宿主細胞中への導入は、当
該技術分野で知られた種々の方法によって行うことがで
きる。たとえば、発現ベクターでの宿主細胞のトランス
フェクションはリン酸カルシウム沈降法により行うこと
ができる。しかしながら、宿主細胞中に発現ベクターを
導入する他の方法、たとえばエレクトロポレーション、
リポソーム融合、核注入、およびウイルスまたはファー
ジ感染なども用いることができる。
【００４０】発現ベクターを含有する宿主細胞の同定
は、以下の６つの一般的アプローチの１または２以上に
より行うことができる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ダイゼーション；（ｂ）マーカー遺伝子機能の存在また
は不在；（ｃ）宿主細胞中での該遺伝子構築物をコード
するｍＲＮＡ転写物の産生により測定される転写レベル
の評価；（ｄ）遺伝子産物の免疫学的検出；（ｅ）酵素
アッセイ；および（ｆ）ＰＣＲ。第一の方法として、該
遺伝子構築物をコードするＤＮＡ配列の存在を、該ＤＮ
Ａ配列に相補的なプローブを用いたＤＮＡ−ＤＮＡまた
はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出す
ることができる。
【００４１】第二の方法として、ある種のマーカー遺伝
子機能（たとえば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に
対する耐性など）の存在または不在に基づいて組換え発
現ベクター宿主系を同定および選択することができる。
マーカー遺伝子は、同じまたは異なるプロモーターまた
はレポーターの制御下で融合タンパク質配列またはレポ
ーター構築物と同じプラスミド中に位置させることがで
きる。マーカー遺伝子の発現は、該融合タンパク質また
はレポーター遺伝子のＤＮＡ配列を有するベクターのト
ランスフェクションを示す。
【００４２】第三の方法として、融合タンパク質または
レポーターをコードするｍＲＮＡ転写物の産生をハイブ
リダイゼーションアッセイにより評価することができ
る。たとえば、ポリアデニル化ＲＮＡ配列に相補的なプ
ローブを用いたノーザンブロッティングまたはヌクレア
ーゼ保護アッセイにより該ＲＮＡを単離および分析する
ことができる。別法として、宿主細胞の全ＲＮＡを抽出
し、そのようなプローブへのハイブリダイゼーションに
ついてアッセイすることができる。第四の方法として、
たとえば、融合タンパク質またはその一つの領域に対す
る抗体を用いたイムノブロッティング（ウエスタンブロ
ッティング）により、該融合タンパク質またはレポータ
ーの発現を免疫学的に評価することができる。別法とし
て、この方法は、抗体可変領域の公知エピトープを用い
て行うことができる。
【００４３】第五の方法として、融合タンパク質または
レポーターの発現は、その活性をアッセイすることによ
って測定することができる（下記参照）。第六の方法と
して、発現系に存在する配列（すなわち、発現ベクター
配列、融合タンパク質遺伝子配列、またはレポーター遺
伝子配列）に相同なオリゴヌクレオチドプライマーをＰ
ＣＲに用いて予測される長さのＤＮＡ断片を生成させ、
該発現系の宿主細胞中への導入を示すようにする。
【００４４】本発明の発現ベクターおよびＤＮＡ分子は
また配列決定することができる。種々の配列決定法が当
該技術分野で知られている。たとえば、サンガー（Ｓan
ger）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７４、５４
６３〜７（１９７７）に記載されたジデオキシ法、およ
びＰroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７４、５６０〜４
（１９７７）に記載されたマクサム−ギルバート法を参
照。発現ベクターが適当な宿主細胞中に導入されたら、
所望のタンパク質の大量の発現が可能な条件下で該宿主
細胞を培養することができる。
【００４５】融合タンパク質は、抽出、沈殿、クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気
泳動などの常法に従って単離精製することができる。好
ましい方法は、抗フィブリン部位に結合するフィブリン
β鎖のアミノ末端ヘプタペプチドか、またはプラスミノ
ーゲンアクチベーター触媒部位に結合するベンズアミジ
ンのいずれかを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーである。もちろん、すべての発現ベクターおよびＤＮ
Ａ制御配列が本発明のＤＮＡ配列を等しく充分に発現す
るように機能するとは限らないことも理解すべきであ
る。すべての宿主細胞が同じ発現系に対して等しく充分
に機能するわけではない。しかしながら、当業者であれ
ば、不当な実験を行うことなく、また本発明の範囲から
逸脱することなく本明細書に開示される教示に従って発
現ベクター、ＤＮＡ制御配列、および宿主細胞を選択す
ることができるであろう。
【００４６】好ましい態様 以下に本発明の特定の態様を詳細に記載する。これら態
様は例示的なものであり、本発明の広範な適用可能性を
説明する。本発明者らは、ビブリオ・コレラエの全長ｔ
ｏｘＲ遺伝子をベクターｐＳＰＯＲＴの誘導性ｌａｃプ
ロモーターの後方に入れた。このことにより、大腸菌に
おける該系の挙動を特徴付けるために制御することがで
きる。該系を研究するため、本発明者らは末端の欠けた
ｔｏｘＲ遺伝子を同親ベクターのマルチクローニング部
位のすぐ上流にクローニングした（図１および図２〜図
５）。 （１）ＴｒｋＣ融合 ＴｏｘＲ−ｔｒｋＣ融合物を図８に記載するようにして
調製した。種々の長さのｔｒｋＣ断片を有する多数の融
合物をｔｏｘＲ機能（ベクターｐＣＴＸ３を有する宿主
株中で高ＩＰＴＧでのβ−ガラクトシダーゼ活性）につ
いてスクリーニングした。ｔｒｋＣ活性を有するクロー
ンをさらに特徴付け、その結果を図９〜図１１に示す。
【００４７】これら融合物は、外来のｔｒｋＣ配列が
（それ自体の経膜断片なしで）種々のレベルのｔｏｘＲ
機能（融合依存性である）を回復することができること
を示している。ｔｒｋＣの小部分のみを除去する欠失か
らは、一層高レベル（高ＩＰＴＧレベル）の発現にてｔ
ｏｘＲシグナルを示す融合タンパク質が得られる。加え
て、ｔｒｋＣの一層大きな断片を除去する多くの融合物
は、低レベルの発現（ＩＰＴＧなし）でのｔｏｘＲ活性
により示されるように、ダイマー形成能が高められてい
る。実際、ｔｒｋＣ融合物の多くは、それ自体のダイマ
ー形成ドメインを有する野性型ｔｏｘＲタンパク質に比
べてｃｔｘ活性化において一層適合している。可能なモ
デルは、野性型ｔｒｋＣアミノ末端中にある配列が非常
に強力なダイマー形成能をあいまいにしていることを示
唆している。このモデルにおいて、野性型ｔｒｋＣタン
パク質中のＮＴ３結合がコンホメーションの変化をもた
らし、該変化がこの強力な自己会合ドメインを暴露する
のかもしれない。
【００４８】修飾された宿主細胞は、クロラムフェニコ
ール耐性またはβ−ガラクトシダーゼをインディケータ
ーとして用い、ＮＴ３様活性を有するｔｒｋＣリガンド
をスクリーニングすることを可能にする。リガンドに独
立な活性を与えるレベルよりも低い融合発現レベルにお
けるクロラムフェニコール耐性またはβ−ガラクトシダ
ーゼ活性の出現により、リガンド活性が表示されるであ
ろう。
【００４９】（２）他の融合 ｔｒｋＣおよびＧＣＮ−４により指令されたｔｏｘＲ会
合に加え、ＨＳＶ骨格タンパク質ＩＣＰ３５およびＨＩ
Ｖインテグラーゼタンパク質の両者がｔｏｘＲ機能を指
令するのに充分である（図１２〜図１４参照）。本発明
のための他の適当なペリプラズム結合領域としては、細
菌走化性レセプターｔａｒ（アスパラギン酸）およびｔ
ｓｒ（セリン）、ヒトインシュリンレセプターおよびＨ
ＩＶプロテアーゼが挙げられる。そのような融合物はす
べて、それぞれのダイマー形成ドメインに特異的なイン
ヒビターを同定するためのスクリーニングを可能にする
であろう。
【００５０】材料および方法 （１）株 ビブリオ・コレラエ株５６９Ｂｒｐｆ、古典的生物型、
イナバ血清型（スミス（Ｈ.Ｓmith）氏の好意による）
(ＢＭＳカルチャーコレクション番号ＳＣ１５３０７)を
すべてのビブリオ・コレラエＤＮＡの単離に用いた。大
腸菌株ＪＭ１０１（メッシング（Ｍessing）１９７９）
をすべてのｃｔｘトランス活性化実験に用いた。大腸菌
株ＤＨ５α（ギブコ−ＢＲＬ）およびＪＭ１０１を一般
的プラスミド保持および増幅用に用いた。
【００５１】（２）培地 ビブリオ株は０.５％ＮａＣｌを添加したＮＢ（栄養ブ
ロス）中、３０℃にて増殖させた、大腸菌株はＬＢ（ル
リア−ベルタニ）ブロス中、３７℃にて増殖させた。プ
ラスミドの選択が必要な場合には、アンピシリンを５０
μｇ／ｍＬにて用い、スペクチノマイシンを５０μｇ／
ｍＬにて用いた。クロラムフェニコールを本明細書に記
載するように種々の濃度で用いた。
【００５２】（３）遺伝学的技術 プラスミドＤＮＡの単離および操作のために標準法を用
いた（マニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.）、フリッチュ（Ｆr
itsch,Ｅ.Ｆ.）＆サンブルック（Ｓambrook,Ｊ.）（１
９８２）モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリ
ー・マニュアル（コールドスプリングハーバーラボラト
リー、プレインビュー、ニューヨーク州））。ゲノムビ
ブリオＤＮＡの調製は、クラーク（Ｃlark,Ｊ.Ｍ.）＆
スウィッツァー（Ｓwitzer,Ｒ.Ｌ.）（１９７７）Ｅxpe
rimental Ｂiochemistry、２３０頁（フリーマン（Ｗ.
Ｈ.Ｆreeman Ｃo.）、ニューヨーク州）の記載に従って
行った。
【００５３】一方向欠失は、一方向欠失キット（ストラ
タジーン）からのＥｘｏＩＩＩ、ヤエナリヌクレアー
ゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、製造業者により提供さ
れたプロトコールに従って行った。簡単に説明すると、
ＥｘｏＩＩＩを添加する前にプラスミドｐＴＯＸ５ＴＲ
ＫＣをＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ
で消化した。ＥｘｏＩＩＩ混合物から１分間隔で５分間
アリコートを取り、プラスミドの末端をヤエナリヌクレ
アーゼを用いて平滑末端とし、ついでライゲートしてｔ
ｏｘＲ−ｔｒｋＣキメラのｔｒｋＣ部分内に欠失を生じ
させた。これらプラスミドをＪＭ１０１／ｐＣＴＸ３
（Ｊ３）中に形質転換し、ｃｔｘ−ＬＡＣＺをトランス
活性化する能力の測定手段としてβ−ガラクトシダーゼ
についてアッセイした。ついで、ｐＴＯＸ５ＴＲＫＣΔ
１２などの活性な融合物をＡＢＩ ＤＮＡシークエンサ
ー上で配列決定して（カインズル（Ｂ.Ｋeinzle））欠
失の終点を定め、インフレームの融合が生成しているこ
とを確認した。
【００５４】パーキン−エルマーシータスサーマルＤＮ
Ａサイクラー４８０およびＧｅｎｅＡｍｐ ＤＮＡ増幅
キットを用い、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。反応混
合物には、１００μＬの全容量中に１.５ｍＭ塩化マグ
ネシウム、各２００μＭのｄＮＴＰ、２.５ＵのＡmplit
aqポリメラーゼ、１.０μＭの５'および３'プライマー
および１０〜１００ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む１×Ａmpli
taq緩衝液が含まれていた。一般に、増幅は、９４℃で
５分の１サイクル、９４℃で１分の後に５２℃で２分つ
いで７２℃で３分の３５サイクルからなり、７２℃で８
分の最終サイクルで完了した。ＰＣＲ生成物を０.８％
アガロースゲル上で分析し、ついで宿主ベクター中にラ
イゲートする前に制限エンドヌクレアーゼで消化した
（両プライマー中に設けた部位にて）。
【００５５】ｔｏｘＲ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅおよびイムノブロッティングのために標準法を用いた
（マニアチス、フリッチュ＆サンブルック（１９８２）
モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニ
ュアル（コールドスプリングハーバーラボラトリー、プ
レインビュー、ニューヨーク州））。一般に、全細胞タ
ンパク質または精製タンパク質を１０％ＳＤＳダイイチ
（Ｄaiichi）ミニゲル上に負荷し、１×レムリ緩衝液
中、４０ｍＡの定常流にて１時間電気泳動を行った。電
気泳動後、ホーファー（Ｈoeffer）ブロッティングタン
ク中の支持ニトロセルロース膜に３７５ｍＡの定常流に
て１〜２時間移した。１：１０００希釈の一次抗体（ウ
サギ抗ＧＳＴＴＯＸ５ポリクローナル血清）、ついでア
ルカリホスファターゼに結合させた二次抗体（マウスま
たはヤギ抗ウサギモノクローナル抗体、バイオラド）の
１：３０００希釈液を用いて第二のインキュベーション
を行うことによりウエスタン分析を行った。一次抗体を
加える前にトリス緩衝食塩水（ブロット（blotto））中
の５％脱脂粉乳で膜をブロックし、各抗体を添加した後
にブロットで３回洗浄した。アルカリホスファターゼの
ためウエスタンブルー安定化した基質を用い（プロメ
ガ）、抗原性タンパク質を視覚化した。
【００５６】（４）プラスミドベクター ｐＣＴＸ３およびｐＣＴＸ４ ：プラスミドｐＣＴＸ３を
構築するため、ｐＭＬＢ１１０９をＰｓｔＩおよびＢａ
ｌＩで消化し、ついで適当な５ｋｂ断片を単離した。つ
いで、この断片をｐＭＳ４２１の５.７ｋｂ ＰｓｔＩお
よびＳｍａＩ断片にライゲートした。得られたプラスミ
ドｐＣＴＸ２をＥｃｏＲＩで部分消化して１.７ｋｂの
ｌａｃＩQ領域を欠失させた。上記部分消化物のＥｃｏ
ＲＩ末端をクレノウポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用い
て充填し、ついでライゲートしてベクターｐＳＬＡＣ２
を得た。ｐ３０８３（フィンクルスタイン（Ｒ.Ｆinkle
stein））からのＣＴＸプロモーターのＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ両側（flanked）ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩ消化したｐＳＬＡＣ２中にクローニングし
て９.１ｋｂのプラスミドを生成させることによりプラ
スミドｐＣＴＸ３を構築した。プラスミドｐＣＴＸ４
は、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩ消化したｐＣＴＸ３中に
ＣＡＴ遺伝子を含有するｐＣａＭＶＣＮ（ファルマシ
ア）のＢａｍＨＩおよびＣｌａＩ消化断片を挿入するこ
とにより生成させた。
【００５７】ｐＴＯＸ３、ｐＴＯＸ４およびｐＴＯＸ５ プラスミドｐＴＯＸ３を構築するため、スミス氏から得
たビブリオ・コレラエ株５６９Ｂｒｐｆから調製したゲ
ノムＤＮＡを用い、５'ＰｓｔＩ制限部位含有ＰＣＲプ
ライマーおよび３'ＳｆｉＩ制限部位含有ＰＣＲプライ
マーを用いてｔｏｘＲコード領域をＰＣＲ増幅した。得
られたＰＣＲ断片をＰｓｔＩ−およびＳｆｉＩ−消化し
たｐＳＰＯＲＴ１（ＢＲＬ）中にクローニングした。
【００５８】プラスミドｐＴＯＸ４を構築するため、
５'ＰｓｔＩ制限部位を有するＰＣＲプライマーおよび
３'ＳｆｉＩ制限部位および停止コドンの両方を有する
第二プライマーを用い、ｔｏｘＲ読み取り枠の塩基対９
８９にて切り取られたｔｏｘＲコード領域をビブリオ・
コレラエのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。得られた
ＰＣＲ断片をＰｓｔＩ−およびＳｆｉＩ−消化したｐＳ
ＰＯＲＴ１（ＢＲＬ）中にクローニングした。プラスミ
ドｐＴＯＸ５の構築は、ｐＴＯＸ４の構築の場合と全く
同様にしてｔｏｘＲ読み取り枠の塩基対８２７における
末端の欠けたｔｏｘＲコード領域をＰＣＲ増幅すること
により行った。
【００５９】ｐＴＯＸ５ＩＣＰ３５ プラスミドｐＴＯＸ５ＩＣＰ３５を調製するため、ｐＴ
７ＩＣＰ３５Ｋ（デックマン（Ｉ.Ｄeckman））をＫｐ
ｎＩおよびＮｃｏＩで消化してＨＳＶ ＩＣＰ３５コー
ド領域を含有する断片を得た。この断片のＮｃｏＩ部位
をＴａｑポリメラーゼおよびｄＮＴＰで充填した。この
修飾挿入物をＫｐｎＩおよびＳｔｕＩ消化したｐＴＯＸ
５中にクローニングして、ＩＣＰ３５読み取り枠が末端
の欠けたｔｏｘＲ遺伝子の読み取り枠と整列した融合物
を得た。
【００６０】ｐＴＯＸ５ＴＲＫＣ＋ＴＭ プラスミドｐＴＯＸ５ＴＲＫＣ＋ＴＭを構築するため、
ＰＣＲプライマーに由来する停止コドンを有する３'Ｘ
ｂａＩ末端および５'ＨｉｎｄＩＩＩ末端を含有するｐ
ＦＬ１９（バーバシッド（Ｍ.Ｂarbacid））のｔｒｋＣ
読み取り枠の塩基対位置３２〜位置１３９１からのｔｒ
ｋＣコード領域の１.３ｋｂ ＰＣＲ断片を生成させた。
ついで、この断片をＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化
したｐＴＯＸ５中にクローニングして（インフレームで
ない）、ｔｏｘＲに融合した経膜ドメインを通り過ぎて
末端を欠けさせたｔｒｋＣの一方向欠失を生成させるの
に用いることができるベクターを得た。ｐＴＯＸ５ＴＲＫＣ−ＴＭ プラスミドｐＴＯＸ５ＴＲＫＣ−ＴＭをｐＴＯＸ５ＴＲ
ＫＣ＋ＴＭと同様にして生成させたが、このＰＣＲで得
られた１.３ｋｂ（ｔｒｋＣの位置３２〜１３１８）断
片にはｔｒｋＣ経膜ドメインが含まれていなかった。
【００６１】ｐＴＯＸ５ＴＲＫＣ−ＴＭｄｅｌ１２ プラスミドｐＴＯＸ５ＴＲＫＣ−ＴＭΔ１２を調製する
ため、ＳｆｉＩ−およびＮｏｔＩ−消化したｐＴＯＸ５
ＴＲＫＣ−ＴＭをＥｘｏＩＩＩ処理した。ＥｘｏＩＩＩ
処理を１分間隔で停止させ、得られた欠失プラスミドを
Ｔ４リガーゼで再結合する前にヤエナリヌクレアーゼを
加えて平滑末端とした。欠失番号１２を配列決定し、ｐ
ＴＯＸ５ＴＲＫＣ−ＴＭのインフレーム欠失ｔｏｘＲ−
ｔｒｋＣ断片であることが示された。この欠失体の連結
部には欠けたｔｏｘＲ遺伝子の末端からのアミノ酸残基
ＴＧが含まれ、介在リンカーＲＳＲＳＥがｔｒｋＣ配列
の最初のメチオニンに結合していた。ｐＴＯＸ５ＨＩＶＰＲＯＴ プラスミドｐＴＯＸ５ＨＩＶＰＲＯＴは、ＳｆｉＩ消化
したｐＴＯＸ５中にＳｆｉＩを両側に有する３００塩基
対のＰＣＲ増幅ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子（リン（Ｐ−
Ｆ.Ｌin））をクローニングすることにより得られた。
【００６２】ｐＴＯＸ５ＨＩＶＩＮＴ プラスミドｐＴＯＸ５ＨＩＶＩＮＴの調製は、ＰＣＲプ
ライマー（リン）に由来する５'末端のＳｆｉＩ部位お
よび３'末端のＸｂａＩ部位を有するＨＩＶインテグラ
ーゼ遺伝子の８９６塩基対ＰＣＲ生成物をＳｆｉＩおよ
びＸｂａＩ消化したｐＴＯＸ５中に挿入してＨＩＶイン
テグラーゼとｔｏｘＲとのインフレーム融合物を生成さ
せることによって行った。
【００６３】ｐＴＯＸ５ＧＣＮ４ プラスミドｐＴＯＸ５ＬＩＮＫを確立して、ＳａｌＩお
よびＢａｍＨＩ末端で酵母制御（vesulatory）タンパク
質ＧＣＮ４のロイシンジッパー（zippers）のインフレ
ームクローニングを可能とさせた。このベクターは、ｐ
ＴＯＸ５をＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、２つの
アニールしたオリゴヌクレチド（配列５'→３' ＧＴＣ
ＧＡＣＧおよびＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣ）をクロ
ーニングすることにより調製した。ＳａｌＩおよびＢａ
ｍＨＩ消化したｐＪＨ３７０（フー（Ｊ.Ｈu））から１
２９ｂｐ断片を放出させ、ついで該断片をＳａｌＩおよ
びＢａｍＨＩ消化したｐＴＯＸ５ＬＩＮＫ中にクローニ
ングすることにより生成させた。
【００６４】ｐＴＯＸ５ＬＰ１９、ｐＴＯＸ５ＬＶ１
９、ｐＴＯＸ５ＬＹ１９、ｐＴＯＸ５ＬＩ１９、ｐＴＯ
Ｘ５ＬＮ１９、ｐＴＯＸ５ＬＫ１９ プラスミドｐＴＯＸ５ＬＰ１９、ｐＴＯＸ５ＬＶ１９、
ｐＴＯＸ５ＬＹ１９、ｐＴＯＸ５ＬＩ１９、ｐＴＯＸ５
ＬＮ１９、ｐＴＯＸ５ＬＫ１９の調製を、それぞれｐＪ
Ｈ５２４、ｐＪＨ５０５、ｐＪＨ５０６、ｐＪＨ５１
８、ｐＪＨ５２１、ｐＪＨ５２８（フー）からのＳａｌ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を含有している他はｐＴＯＸ５ＧＣ
Ｎ４と同様にして行った。ｐＧＳＴＴＯＸ５ ｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア）をＳｍａＩおよびＢａ
ｍＨＩで消化し、ついで両立する末端を有するｐＴＯＸ
５からのＰＣＲ増幅した欠けたｔｏｘＲ中にクローニン
グすることによりプラスミドｐＧＳＴＴＯＸ５を調製し
た。
【００６５】（５）アッセイ 実質的にメンゼル（Ｍenzel）の方法（Ａnalytical Ｂi
ochemistry １８１、４０〜５０頁 １９８９）に従って
β−ガラクトシダーゼアッセイを行った。クロラムフェ
ニコール耐性に基づくｃｔｘ活性化のアガープレートア
ッセイを、プラスミドｐＣＴＸ４および以下の活性化プ
ラスミドのいずれか；ｐＴＯＸ３、ｐＴＯＸ５、ｐＴＯ
Ｘ５ＧＣＮ４、ｐＴＯＸ５ＩＣＰ３５またはｐＴＯＸ５
ＨＩＶＩＮＴを含有するＪＭ１０１株を用いて行った。
１００μＭ ＩＰＴＧを含有するＬＢ中で一夜培養液を
増殖させた。１〜２μｌの一夜培養液を１００μＭＩＰ
ＴＧおよび本明細書に示すレベルのクロラムフェニコー
ルを含有するＬＢ−アガープレート上にスポットした。
増加レベルの薬剤上での増殖能に基づいてＴｏｘＲ活性
を評価した。ＩＰＴＧの不在下では、すべての株がクロ
ラムフェニコール耐性を示さなかった。
【００６６】本明細書に用いた略語は以下の通りであ
る。 ＡｃＭＮＰＶ：アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａut
ographa californica）多核多角体病ウイルス ｂｐ：塩基対 ＣＡＴ：クロラムフェニコールトランスフェラーゼ ｃＤＮＡ：相補的ＤＮＡ ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス ＨＳＶ：単純ヘルペスウイルス ＩＰＴＧ：イソプロピルチオガラクトシド ｋｂ、ｋｂｐ：キロ塩基対 ＮＴ：ニューロトロフィン（neurotrophin） ＰＣＲ：複製連鎖反応 ｐｈｏＡ：アルカリホスファターゼ ＲＮＡ：リボ核酸
【００６７】
【配列表】
【００６８】配列番号：１ 配列の長さ：１１０５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡ 配列
【表１】
【００６９】配列番号：２ 配列の長さ：８４３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡ 配列
【表２】
【００７０】配列番号：３ 配列の長さ：１４５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡ 配列
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明におけるダイマー形成およびそれに続
くコンホメーション変化およびレポーター遺伝子の発現
によるシグナル表示の機構を示す模式図。
【図２】 ｐＴＯＸ３ベクターを示す模式図。
【図３】 ｐＴＯＸ５ベクターを示す模式図。
【図４】 ｐＣＴＸ３ベクターを示す模式図。
【図５】 ｐＣＴＸ４ベクターを示す模式図。
【図６】 種々の濃度のＩＰＴＧの存在下でプラスミド
ｐＴＯＸ３、ｐＴＯＸ５およびｐＴＯＸ５ＧＣＮ４をｌ
ａｃＺレポーター遺伝子とともにコトランスフェクショ
ンした結果を産生されたβ−ガラクトシダーゼの量で示
すグラフ。
【図７】 プラスミドｐＴＯＸ３、ｐＴＯＸ５およびｐ
ＴＯＸ５ＧＣＮ４をＣＡＴレポーター遺伝子とともにコ
トランスフェクションした結果をクロラムフェニコール
耐性で示すグラフ。
【図８】 ｔｏｘＲ−ｔｒｋＣ融合物に対して一方向欠
失を生成する方法を示す模式図。
【図９】 図８に示す手順により調製したｔｏｘＲ−ｔ
ｒｋＣ融合物についてβ−ガラクトシダーゼアッセイを
行った結果を示す図表。
【図１０】 図８に示す手順により調製したｔｏｘＲ−
ｔｒｋＣ融合物について欠失した配列のサイズおよび境
界部を示す図表。
【図１１】 図１０に示す結果を遺伝子地図で示す模式
図。
【図１２】 ｐＴＯＸ３、ｐＴＯＸ５またはｐＴＯＸ５
ＨＩＶＩＮＴを含有するＪＭ１０１を種々の濃度のＩＰ
ＴＧの存在下で誘導した結果を産生されたβ−ガラクト
シダーゼの量で示すグラフ。
【図１３】 ｐＴＯＸ３、ｐＴＯＸ５またはｐＴＯＸ５
ＨＩＶＩＮＴを含有するＤＨ５αを種々の濃度のＩＰＴ
Ｇの存在下で誘導した結果を産生されたβ−ガラクトシ
ダーゼの量で示すグラフ。
【図１４】 ｐＴＯＸ３、ｐＴＯＸ５、ｐＴＯＸ５ＩＣ
Ｐ３５またはｐＴＯＸ５ＨＩＶＩＮＴを含有するＤＨ５
αまたはＪＭ１０１の種々の濃度のクロラムフェニコー
ルに対する耐性をアッセイした結果を示す図表。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:19 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 1:63 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スコット・ティ・テイラー アメリカ合衆国ペンシルベニア州ランゴ ーン、ウィートシーフ・レイン286番 (56)参考文献 Ｃｅｌｌ，1987年，Ｖｏｌ．48 , ｐ． 271−279 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 19/00 C12P 21/00 - 21/08 C12N 1/00 - 7/08 G01N 33/50 - 33/98 C12Q 1/00 - 1/70 A61K 31/00 - 48/00 A61P 1/00 - 43/00 ＰｕｂＭｅｄ、ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴ Ｎ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）（ｉ）ｔｏｘＲ ＤＮＡ結合領域
    およびｔｏｘＲ疎水性経膜領域を有するｔｏｘＲ領域、
    および （ｉｉ） リガンドの結合によりダイマーを形成し得る
    ペリプラズム領域、 を有する経膜融合タンパク質；および （ｂ）ｃｔｘオペロンに機能的に連結したレポーター遺
    伝子を有する核酸分子を含み、ダイマー形成が該レポー
    ター遺伝子の発現により表示されることを特徴とする宿
    主細胞。
  2. 【請求項２】 （ａ）ｔｏｘＲ ＤＮＡ結合領域および
    ｔｏｘＲ疎水性経膜領域を有するｔｏｘＲ領域、および
    （ｂ） リガンドの結合によりダイマーを形成し得るペ
    リプラズム領域を含む経膜融合タンパク質。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の経膜融合タンパク質を
    コードする核酸分子。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の核酸分子を含む発現ベ
    クター。
  5. 【請求項５】 （ａ）請求項１に記載の宿主細胞の培養
    液をリガンドで処理し、ついで（ｂ）レポーター遺伝子
    の発現についてスクリーニングすることを特徴とする、
    リガンドの結合によってダイマーを形成し得るペリプラ
    ズム領域へのリガンドの結合を検出する方法。
  6. 【請求項６】 ｔｏｘＲ領域が配列番号（ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ）：１の配列を有する請求項１に記載の宿主細胞。
  7. 【請求項７】 ｔｏｘＲ領域が配列番号（ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ）：１の配列を有する請求項２に記載のキメラ経膜
    タンパク質。
  8. 【請求項８】 ｔｏｘＲ領域が配列番号（ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ）：１の配列を有する請求項３に記載の核酸。
  9. 【請求項９】 ｔｏｘＲ領域が配列番号（ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ）：１の配列を有する請求項４に記載の発現ベクタ
    ー。
  10. 【請求項１０】 ｔｏｘＲ領域が配列番号（ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ ＮＯ）：１の配列を有する請求項５に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ｔｏｘＲ領域が配列番号（ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ ＮＯ）：２の核酸配列を有する請求項３に記載の核
    酸。
  12. 【請求項１２】 ｔｏｘＲ領域が配列番号（ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ ＮＯ）：２の核酸配列を有する請求項４に記載の発
    現ベクター。
  13. 【請求項１３】 ｔｏｘＲ領域が配列番号（ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ ＮＯ）：２の核酸配列を有する請求項５に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】 ＡＴＣＣ６９,４０３またはＡＴＣＣ
    ６９,４０４の受託番号を有する請求項１に記載の宿主
    細胞。
  15. 【請求項１５】 ペリプラズム領域がｔｒｋＣのリガン
    ド結合領域を含む請求項１に記載の宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 ペリプラズム領域がｔｒｋＣのリガン
    ド結合領域を含む請求項２に記載のタンパク質。
  17. 【請求項１７】 ペリプラズム領域がｔｒｋＣのリガン
    ド結合領域を含む請求項３に記載の核酸。
  18. 【請求項１８】 ペリプラズム領域がｔｒｋＣのリガン
    ド結合領域を含む請求項４に記載の発現ベクター。
  19. 【請求項１９】 ペリプラズム領域がｔｒｋＣのリガン
    ド結合領域を含む請求項５に記載の方法。
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