CN102112616A - 高容量腺病毒的包装系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产和包装高容量腺病毒的一种新系统，其不需使用辅助病毒，其特征在于整合了在宿主细胞基因组中控制、复制和包装病毒颗粒所需的腺病毒基因，这些导致提高了生产系统的长期稳定性。

Description

高容量腺病毒的包装系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及用于在靶细胞中异源基因表达的载体领域。特别是，本发明涉及用于基因转移的高容量腺病毒载体的生产和包装系统。
技术背景
高容量腺病毒(HC)，也被称为无肠腺病毒(gutless adenovirus)或辅助依赖型腺病毒(helper-dependent adenovirus)，其作为体内的基因治疗的载体是十分有吸引力的，因为其显示了减少的伴随免疫原性，并且具有高的转导效率和广泛的趋向性，无论是在啮齿类或在灵长类中。这些载体的特征在于其仅包含其复制和包装所必须的DNA序列，而缺少其他的腺病毒基因，这一特征导致其可能容纳高达36kb的序列。为了病毒DNA的复制和其在病毒颗粒中的包装，仅被这些载体顺式需要的腺病毒序列为位于线性DNA的两端的ITR(末端反向重复)序列，以及包装信号(ψ)(
Figure BPA00001308537900011
和Hearing，1992，J.Virol.，66：723-731；Hearing和Shenk，1983，Cell，33：695-703)。
由于高容量腺病毒缺乏所有的病毒编码区，其增殖仅可能发生在细胞用第二病毒(称为辅助病毒或辅助性病毒，即，所述病毒能够编码缺陷病毒的复制以及在具有感染能力的病毒颗粒中壳体化所必需的所有蛋白质)共感染时。关于高容量腺病毒载体的生产，辅助病毒的特征在于其在E1腺病毒区域有缺失，并且反向提供了无肠腺病毒后代的复制以及组装所必需的全部病毒蛋白质组分。后者的增殖需要使用能够补充辅助病毒中所述E1区域缺失的细胞系，例如293细胞系(Graham，等，1977，J.Gene.Virol.，36：59-74)或PerC6细胞系(Fallaux等，1998，Hum.Gene Ther.，9：1909-1917).
但是，该增殖系统还导致了不想要的病毒颗粒的产生，所述病毒颗粒用壳体包裹了辅助病毒的基因组并且污染了最终的高容量腺病毒的制剂。迄今为止，已经研发和描述了不同的系统来消除妨碍辅助病毒的包装过程的所述污染物。一般来说，这些系统基于在辅助病毒的包装信号中掺入突变，增加其基因组的大小，更特别的，在病毒生产过程中的包装信号的特异性的消除。
Parks等(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：13565-13570)已经描述了通过Cre-loxP重组系统来消除辅助病毒的ψ包装信号。在该系统中，ψ信号侧面有loxP位点，在表达Cre重组酶的293细胞(293Cre细胞)中进行病毒增殖。当辅助病毒进入细胞时，重组酶切除ψ信号，阻止其被包装，但是保留了其复制能力，因此，保留了包装高容量腺病毒必需的编码序列的表达。
Groth等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：5995-6000)建议利用单向的重组酶，特别是Φ C31重组酶，其中特异性识别的attB/attP位点置于ψ信号侧面。当PhiC31重组酶切除侧面有attB/attP位点的序列时，其修饰了识别序列并将其转换为attR/attL序列，阻止识别再次发生，并因此再次引入ψ信号。
Ng等(2001，Mol.Ther.，3：809-815)建议了一种可选的重组系统FLP/frt，其中在能够表达酵母FLP重组酶的293细胞(293FLP和293CreFLP细胞系)中进行高容量腺病毒载体的增殖，并且，其中辅助病毒的ψ信号的侧面有frt位点，其可被所述FLP重组酶特异性识别。无肠腺病毒的扩增效率(run3中108bfu/ml)，以及辅助病毒的污染水平(CsCl梯度纯化后0.5％)，与以前的Cre-loxP系统产生的那些非常相似。
为了试图改进这些系统，Palmer和Ng(2003，Mol.Ther.，8：846-852)研发了一种衍生自Cre-loxP系统的系统，其中包括了辅助病毒的包装信号的倒置。
另一方面，Sargent等(2004，Gene Ther.，11：504-511)建议基于大小的限制系统，其中使用大于35kb的辅助病毒，其缺失了IX蛋白基因，还使用了能够补充所述缺失的293细胞系。
但是，尽管有所改进，迄今为止，这些系统并不能避免包括在生产过程中的两种病毒的序列的重组，并且，因此导致了样品被复制腺病毒污染。在最近的综述中，Alba等(2005，Gene Ther.，12Suppl 1：S18-27)阐述了污染水平可能摆动，其取决于使用的系统，并相对于产生的高容量腺病毒的病毒颗粒数的0.02％到1％之间摆动。这些污染水平太高以至于不可能用于基因治疗的临床过程。
另外，使用高容量腺病毒的另一个重要的限制涉及其大规模生产的难度。目前，这种类型的生产是复杂的，低效的，并且需要用辅助病毒共感染的大量的连续循环。
为了做到这一点，必须改进程序，并且同时研发替代的系统来生产临床应用需要的数量和质量(不含污染的病毒颗粒)的高容量腺病毒载体。
该问题的理想解决方案将是研发一种大规模生产高容量腺病毒载体的特异性的细胞系。但是，生产系统独立于辅助病毒的参与，形成了衍生自腺病毒基因的高表达水平的细胞毒性问题，迄今为止，该问题极大地限制了这类生产系统的研发。对此，我们不得不加入这项事实：即再生产协调结构蛋白表达与DNA复制的必要事件的正确顺序是极其复杂的，其中所述结构蛋白允许在感染后期病毒颗粒的大量生产(Farley，等，2004，J.Virol.，78：1782-1791).。
WO0072887公开了独立于辅助病毒的高容量腺病毒生产系统，其基于一个二元系统，该二元系统如下组成：(i)包装细胞系，其包含稳定型的减少数量拷贝的环状游离基因以及基于爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的复制元件和缺失E1、E3、E4区域以及基因pTP和DBP的腺病毒基因组，以及(ii)载体，其包含腺病毒基因组的复制和包装必须的元件，并且所述元件在游离基因(E4区，pTP基因和DBP)中不存在，载体还包括异源基因。在该系统中游离基因不被包装在病毒粒子中，因为(i)其缺少包装信号以及(ii)其大小超过了腺病毒的包装能力。
另一方面，WO0042208公开了一种独立于辅助病毒的腺病毒生产系统，其包括(i)腺病毒载体，缺失区域E1，E3和编码纤维蛋白(L5)的基因，其与病毒粒子的装配过程有关，以及(ii)特异性的细胞系，其能够补充所述载体的复制和包装。所有病毒颗粒复制和包装过程中必需的基因都包括在腺病毒载体的序列中。
最终，Catalucci等(2005，J.Virol.，79：6400-6409)最近描述的系统建议使用游离型质粒，其包含爱泼斯坦-巴尔病毒的复制起点，允许其维持293细胞系的核，该细胞系修饰用于核抗原EBNA1(293EBNA)的稳定表达。游离基因包括血清型5的腺病毒的ITR序列，早期区(E2)的基因和包含在腺病毒基因组的E4区中的ORF6。这些腺病毒基因的转录在诱导启动子的控制下进行，同时组成壳体必需的其它基因同样包含在高容量腺病毒的序列中。
一般来说，所有这些独立于辅助病毒的腺病毒载体生产系统受限于可以插入到载体中的DNA序列的大小，因为所有这些腺病毒载体包括一个或多个复制或包装所述载体的方法所必需的腺病毒基因。另外，这些腺病毒基因的存在使得当临床应用时必须承担可能的免疫原性影响的风险。
因此，证实了需要一种获得高容量腺病毒生产系统的技术，其不需要使用辅助腺病毒载体，并且克服了迄今为止的辅助性载体的缺点。
发明概述
一方面，本发明涉及一种多核苷酸(本发明的第一多核苷酸)或一种表达载体，其包括：
(a)第一表达框，其包含编码转录调节子的核酸序列；
(b)第二表达框，其包含编码限制性核酸内切酶的核酸序列，并且其受由(a)中限定的多核苷酸编码的转录调节子活化的转录调节序列的操作控制。
第二方面，本发明涉及一种多核苷酸(本发明的第二多核苷酸)或一种表达载体，其包含：
(a)第一表达框，其包含编码转录调节子的核酸序列；
(b)第二表达框，其包含编码限制性核酸内切酶的核酸序列，并且其受由(a)中限定转录调节子活化的转录调节序列的操作控制，以及
(c)第三表达框，其包含编码选择的腺病毒E1A蛋白质或腺病毒E1A和E1B蛋白质的核酸序列，并且其受由(a)中限定的转录调节子活化的转录调节序列的操作控制。
另一方面，本发明涉及一种多核苷酸(本发明的第三多核苷酸)或表达载体，其包含一个核酸序列，该核酸序列包含重组腺病毒的基因组，其至少缺少ψ包装序列以及编码E1A或E1A/E1B蛋白质的序列，其中包含重组腺病毒的基因组的所述序列侧面有限制性核酸内切酶的特异性识别位点。
另一方面，本发明涉及包含一个或多个本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
另一方面，本发明涉及一种生产细胞的方法，所述细胞适合生产和包装高容量腺病毒的感染性颗粒，该方法包括：
(i)用本发明的第一多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体转染细胞，或使用本发明的第二多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体转染细胞，以及
(ii)用本发明的第三多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体转染细胞。其中步骤(i)和(ii)可以任意顺序进行或同时发生，并且其中如果步骤(i)中的细胞用本发明的第一多核苷酸进行转染，那么随后使用包含编码腺病毒E1A蛋白质以及可选的包含腺病毒E1B蛋白质的序列的细胞。
另一方面，本发明涉及一种通过本发明的方法生产获得的细胞。
另一方面，本发明涉及一种生产高容量腺病毒的系统，其包括
(a)根据本发明的细胞，以及
(b)高容量腺病毒。
另一方面，本发明涉及一种生产高容量腺病毒载体的方法，其包括如下步骤：
(a)用多核苷酸或包含所述多核苷酸的表达载体转染或感染宿主细胞，所述多核苷酸包含想要生产的高容量腺病毒的基因组；
(b)在允许高容量腺病毒复制和包装的条件下培养转染/感染的细胞；
(c)再生高容量腺病毒的病毒颗粒以及，可选的
(d)重复步骤(a)到(c)，其中步骤(c)中生产的高容量病毒颗粒用于后续循环的步骤(a)中；
其中步骤(a)中使用的宿主细胞选自如下的组：
(i)包含本发明的第一多核苷酸的细胞以及编码腺病毒E1A蛋白和可选的腺病毒E1B蛋白的序列，在该情况下，在步骤(a)之前或执行同时用第三多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达载体转染；
(ii)包含本发明的第二多核苷酸的细胞，在该情况下，在步骤(a)之前或执行同时用本发明的第三多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达载体转染；
(iii)包含本发明的第三多核苷酸的细胞，在该情况下，在步骤(a)之前或执行同时用第一多核苷酸转染，其中细胞包含编码腺病毒E1A蛋白质和可选的腺病毒E1B蛋白质的序列；
(iv)包含本发明的第三多核苷酸的细胞，在该情况下，在步骤(a)之前或执行同时用本发明的第二多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达载体转染；
(v)包含本发明的第一多核苷酸、本发明的第三多核苷酸、以及编码腺病毒E1A蛋白质和可选的腺病毒E1B蛋白质的序列的细胞，以及
(vi)包含本发明的第二多核苷酸和本发明的第三多核苷酸的细胞。
附图说明
图1：A.：pGal4-2RU-E1-SceI质粒的图示，其包括根据本发明的A2多核苷酸。AI：编码转录调节子的核酸序列，在这种情况下为GAL4-hPR-p65。AII：编码腺病毒E1A/E1B蛋白质的核酸序列。AIII：编码限制性核酸内切酶的核酸序列，在这种情况下为酿酒酵母(Sacharomyces cerevisiae)的I-SceI。rPII和rPIII：可以被转录调节子GAL4-hPR-p65调节的启动子，其分别引导了E1A/E1B蛋白质以及I-SceI核酸内切酶的转录和表达。在该实施例中，每个启动子区包含腺病毒E1b(PE1b)基因的TATA盒序列，伴随GAL4的UAS(上游激活序列)序列，并且两个启动子共享着相同的UAS结合序列。在这种情况下，引导GAL4-hPR-p65转录调节子的转录和表达的启动子区域包含胸苷激酶(Ptk)的最小启动子，伴随GAL4的UAS(上游激活序列)。3个转录单元(GAL4-hPR-p65，E1A/E1B和I-SceI)的每一个都由多腺苷酸化信号(pA)结束。pUCori：pGeneV5-HisA质粒的复制起点，该质粒用作构建pGal4-2RU-E1-SceI质粒的基础。Amp：用于选择Zeo抗性菌的氨苄青霉素抗性基因。Zeo：真核细胞中选择抗性克隆的Zeocyn抗生素抗性基因。SV40：引导Zeor抗性基因表达的SV40启动子。
B.pRc/Ad2质粒的图示，该质粒包含根据本发明的B多核苷酸。BI：编码腺病毒基因组的核酸序列，在该情况下为血清型5，编码E1A/E1B蛋白质和包装信号(ψ)的区域异常。核酸序列被ITR(末端反向重复)序列限定。BII：限制性核酸内切酶的特异性靶序列，在这种情况下为I-SceI。BIII：核酸序列attB，其促进质粒在真核细胞基因组中整合。该过程由特异性的、单向的PhiC31重组酶介导。colE1：pRC/RSV质粒的复制起点，该质粒用作构建pRcAd2质粒的基础。Amp：用于选择抗性菌克隆的氨苄青霉素抗性基因；Neo：真核细胞中选择抗性克隆的新霉素抗生抗性基因；SV40：引导Neor抗性基因表达的SV40启动子；pA：多腺苷酸化信号。
图2商业系统GeneSwitchTM(Invitrogen)用于由米非司酮诱导的基因表达的转录调控
A.pSwitch质粒用于融合蛋白的表达的，所述融合蛋白由酵母GAL4蛋白质的DNA结合域(GAL4-DBD)、人类孕酮受体的配体结合域(hPR-LBD)和人类F-κB蛋白质的激活域(p65-AD)组成。转录激活子GAL4-hPR-p65的表达受胸苷激酶(Ptk)的最小启动子调控。蛋白质的活性形式与和启动子关联的GAL4-UAS序列的结合调节其自身表达。
B.设计用来克隆目的基因的pGeneV5-HisA质粒。克隆基因的表达受启动子的控制，启动子由E1b(PE1b)的TATA盒和转录激活子(GAL4-UAS)的结合序列组成。
C.GeneSwitchTM系统激活机制。诱导物的存在导致了融合蛋白(其充当了转录激活子，并且由pSwitch质粒组成型表达)的构象变化。这种构象变化由分子的二聚化作用组成，其从非活性状态变为活性状态。同型二聚体具有结合到特异序列(GAL4-UAS)的能力，所述序列位于激活其表达的目的基因的启动子区域(质粒pGeneV5-HisA)，并且在启动子区域控制转录调节子(pSwitch质粒)的表达，在这种情况下用正反馈起始。
图3设计用于来自GeneSwitchTM系统的基因E1a、E1b和I-SceI的转录控制的调节系统方案。pGene-E1-SceI和p2RU-E1-SceI构建体需要存在pSwitch质粒来表达转录调节子GAL4-hPR-p65。另一方面，在单独的构建体中，构建体pRU-E1-SceI和pGal4-2RU-SceI-E1包括E1区的基因(E1a，E1b)、I-SceI基因和编码具有特异启动子区域的调节融合蛋白的基因。所有的这些基因都受具有转录激活结合序列(UAS)的启动子(白色箭头)调控。每个转录单元都以多腺苷酸化信号(pA)结束。
图4由链霉菌属噬菌体的PhiC31整合酶介导的外源DNA的特异性整合。在哺乳动物细胞中，该整合酶用于促进在插入到具有目的基因的载体中的attB序列和细胞染色体上存在的假-attP序列之间的重组。结果，最初的重组序列丢失，而整合载体的两侧为attR和attL区。
图5血清型5腺病毒载体的基因组同源序列(用PacI(P)通过消化从pTG3602质粒纯化)和pRC/A6-A7构建体(用XbaI(X)线性化)之间的重组过程。数字指示了每一个同源区域的腺病毒基因组内的位置。在pRC/A6-A7质粒中，腺病毒序列侧面是I-SceI限制性核酸内切酶(S)的靶序列，同时为了将该质粒整合到哺乳动物细胞基因组中，在5’端插入了attB序列。由重组过程获得的pRcAd2质粒包含缺失190-3528位的腺病毒基因组，该区域对应于E1a和E1b的编码序列。ITR：末端反向重复。colE1：作为pRcAd2质粒构建体的基础的pRC/RSV质粒的复制起点。Amp：用于选择细菌抗性克隆的氨苄青霉素抗性基因。Neo：真核细胞中选择抗性克隆的新霉素抗生素抗性基因。SV40：SV40启动子。pA：多腺苷酸化信号。
图6A.由PhiC31重组酶介导的真核细胞系中的pRcAd2质粒稳定整合。插入序列两侧为attL和attR序列，其是质粒的attB区和细胞基因组的假attP区序列的重组产物。S：I-SceI核酸内切酶的靶；Zeo：Zeomycin抗性基因。
B.腺病毒基因IIIa，IV，蛋白酶(Pr)和编码来自稳定克隆pRc-1的纯化的基因组DNA的病毒聚合酶(Pol)的基因的巢式PCR检测。电泳结果对应于使用针对每个基因特异性设计的第一内部引物的扩增反应分析。也测试pRc-1克隆以检测attB序列。所述扩增的阴性结果证实了由PhiC31重组酶介导的特异性整合。(-)：PCR阴性对照；(+)PCR阳性对照；M：分子量标记(1Kb Plus DNA Ladder；Invitrogen).
图7腺病毒基因IVa2，III和E4区的34kd的ORF的RT-PCR。从在不存在(1)和存在(2)RU486诱导剂条件下孵育的细胞中提取的总RNA样品来获取cDNA。(+)PCR阳性对照；M：分子量标记(1Kb Plus DNA Ladder；Invitrogen)。
图8通过在稳定克隆Gal-13的基因组DNA中进行PCR扩增来检测编码转录调节子GALlery4，I-SceI限制性核酸内切酶的基因以及腺病毒E1区(E1a和E1b)的基因。(-)：PCR阴性对照；(+)PCR阳性对照；M：分子量标记(1Kb Plus DNA Ladder；Invitrogen)。
图9 Western杂交试验来检测E1A蛋白质(A)和I-SceI核酸内切酶(B)。从在不存在(-)以及存在(+)RU486诱导剂条件下孵育的细胞中收集蛋白质提取物。293S细胞系作为E1A蛋白质的阳性对照检测。GADPH：Western杂交检测的阳性对照。
图10腺病毒IIIa，IV，蛋白酶(Pr)基因和编码来源于稳定克隆GAd-1和Gad-6的纯化的基因组DNA的病毒聚合酶(Pol)的基因的巢式PCR检测。电泳结果对应于使用针对每个基因特异性设计的的第一内部引物进行的扩增反应分析。(-)：PCR阴性对照；(+)PCR阳性对照；M：分子量标记(1Kb Plus DNA Ladder；Invitrogen)。
图11：使用稳定克隆的pRc-1作为包装系的0代的KCZ无肠腺病毒产物。病毒提取物在转染后48，72，96和120小时后收集，且滴加到293S细胞系中。获得的病毒的水平为三个独立实验的平均值，且用感染单位(IU)/mL表示。
图12：使用稳定克隆GAd-1和GAd-6作为包装系的0代KCZ无肠腺病毒产物。病毒提取物在转染后48，72，96和120小时后收集，且滴加到293S细胞系中。获得的病毒的水平为三个独立实验的平均值，且用感染单位(IU)/mL表示。
发明详述
本发明的作者设计了一种新的高容量腺病毒载体的生产和包装系统(壳体化)，其不需要使用辅助病毒，并且，其特征在于，其整合了必需的腺病毒基因以用于在宿主细胞的基因组中控制、复制和包装病毒颗粒，其提高了生产系统长期的稳定性。同样，使用的高容量腺病毒载体仅包含病毒粒子的复制和包装必需的序列(ITR序列和ψ信号)，因此，载体的克隆能力优于在其它的不依赖辅助的病毒系统或其它辅助载体中表现出的能力。最后，高容量载体中这些腺病毒基因的缺失消除了在其临床应用时抗该载体的任何免疫应答的风险。
本发明的第一多核苷酸(A1多核苷酸)
在第一方面，本发明涉及一种多核苷酸(下文中的本发明的A1多核苷酸)或一种表达载体，其包括：
(a)第一表达框，其包含编码转录调节子的核酸序列；
(b)第二表达框，其包含编码限制性核酸内切酶的核酸序列，并且其受由(a)中限定的多核苷酸编码的转录调节子活化的转录调节序列的操作控制。
“转录调节子”和“反式作用子”在本发明的内容中的含义相同，都是指能够通过结合到所述基因的非编码区的所述蛋白的特异性识别区上，从而激活确定的基因的转录的蛋白质。在一具体实施方式中，反式作用子或转录调节子是可调控的转录调节子。“可调控的转录调节子”在本发明的内容中可以理解为一种转录调节子，其活性可以被附加因子调控，所述附加因子可以根据包含所含调节子的结合位点的基因提供或移除。本领域技术人员可以理解，本发明包括任意调节转录调节子表达的方法，只要其允许调节的表达并具有最小的调节基础转录。因此，可通过诱导启动子来调节转录激活子，所述诱导启动子响应于诱导剂，其在缺乏诱导剂时表现为无效的或可忽略的基础表达，并且其能够提高位于3’位置的基因的活化。按照诱导剂的类型，诱导启动子分为Tet开关启动子(Gossen和Bujard，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551；Gossen等，1995，Science 268：1766-1769；Rossi和Blau，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9：451-456)；Pip开关启动子(US6287813)；抗孕素依赖型启动子(US2004132086)，蜕皮激素依赖型启动子(Christopherson等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6314-6318；No等，1996，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，93：3346-3351，Suhr等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：7999-8004；和WO9738117)，金属硫蛋白依赖型启动子(WO8604920)和纳巴霉素依赖型启动子(Rivera等，1996，Nat.Med.2：1028-32).
可选的，本发明涵盖了转录调节子的应用，其诱导发生不是通过表达水平的提高，而是通过导致转录活性提高的诱导剂，一般源自通过调节子从细胞质到细胞核的迁移。这种类型的转录调节子通常由DNA结合域或者DBD(一种配体结合域)或LBD以及一种激活域或AD组成。
DNA结合域可以是任意的域，其存在一个已知的特异性结合元件，包括合成的、嵌合的或类似的DNA结合域。本发明的合适的DNA结合域包括(i)同源域(Scott等，1989，Biochim.Biophys.Acta 989：25-48；Rosenfeld等，1991，Genes Dev.5：897-907)，一般规则下，由大约61个氨基酸的链形成，其具有由3个α螺旋组成的二级结构，(ii)锌指，由两到三打通式为Cys2His2串联组织(例如，TFIIIA、Zif268、Gli和SRE-ZBP)的DNA的锌指形成，其中每个组件包含能够与3到5个碱基对的DNA区域接触的α螺旋，需要至少3个锌指来产生高亲和DNA结合位点并且需要至少2个锌指来产生低亲和DNA结合位点，(iii)称作螺旋-转角-螺旋或HLH的DNA结合域，例如MAT1、MAT2、MATa1、控制触角基因、超级双胸基因、Engrailed、Paired、Fushi tarazu、HOX、Unc86、Oct1、Oct2和Pit-1，(iv)亮氨酸拉链型DNA结合域，例如GCN4、C/EBP、c-Fos/c-Jun和JunB。本发明中合适的DNA结合域的例子包括DNA结合域GAL4、LexA、转录因子、H族细胞核受体、甾/甲状腺激素超家族细胞核受体。本领域技术人员可以理解使用由一些DNA结合基序组成的杂合的DNA结合域，所述基序可能识别DNA结合位点而不是那些包括他们的元件。因此，可能使用由锌指和同源框的结合形成的DNA结合域。在一优选的具体实施方式中，DNA结合域来自酿酒酵母的GAL4蛋白质。
适用于本发明的能够提高包含其的转录激活子的核定位的配体结合序列包括：衍生自PPAR(过氧化物酶增殖体激活受体)的定位序列，其在15-脱氧-[δ]-前列腺素J2的存在下迁移到核中；视黄酸受体，其在9-顺式视黄酸的α、β或γ异构体存在下迁移到核中；能被视黄酸和TTNPB激活的法尼醇X受体，能被24-羟基胆甾醇激活的肝脏X受体，能被4-氨基-丁基苯甲酸酯激活的苯甲酸酯X受体，组成型雄甾烷受体，被抗炎松-16-腈诱导的孕烷受体，被利福霉素诱导的甾体和外源性受体，被甲羟孕酮以及米非司酮的激动剂和拮抗剂以及19-去甲睾酮衍生物诱导的孕酮受体，被糖皮质激素激活的糖皮质激素受体，被T3和/或T4激活的甲状腺激素受体，以及被雌激素以及其衍生物例如17β雌二醇和雌二醇激活的雌激素受体，被“tet关闭”的四环素/脱氧土霉素诱导的tTA反式作用子(Gossen和Bujard，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551)，被“tet开启”的四环素诱导的rtTA反式作用子(Gossen等，1995，Science，268：1766-1769)，被米乐甾酮A或蜕皮激素受体类似物诱导的tTA反式作用子(No等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351)，被RSL1配体诱导的反式作用子，例如最初被Palli等(2003，Eur.J.Biochem.，270：1308-1315)描述的RheoSwitch系统，被纳巴霉素或纳巴霉素类似物诱导的反式作用子(Ho等，1996，Nature，382：822-826；Amara等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：10618-10623)，以及被香豆霉素/新生霉素诱导的反式作用子，其分别扮演了竞争性的诱导剂和抑制剂(Zhao等，2003，Hum.Gene Ther.，14：1619-1629)。在一优选的具体实施方式中，LBD为人孕酮受体的配体结合域，其可以用合成的抗孕素激活，所述抗孕素包括孕酮衍生物如RU486或米非司酮，并且其在病人上不显示任何作用，参见Wang等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1994，91：8180-4)。
最后，激活域可以是H族细胞核受体、甲状腺或甾体激素的细胞核受体的激活域，或是VP16、GAL4、NF-κB、B42、BP64或p65的激活域。在一优选的具体实施方式中，激活域来自人NF-κB蛋白质。
在一优选的具体实施方式中，转录激活因子是一种称为GAL4-hPR-p65的融合蛋白，其包含酿酒酵母的GAL4的DNA结合域(Laughon和Gestel和，1984，Mol.Cell Biol.，4：260-267；Marmorstein等，1992，Nature，356：408-414)，人孕酮受体的配体结合域(Kastner等，1990，Embo J.，9：1603-1614；Wang等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：8180-8184)以及人NF-κB蛋白的激活域(Burcin等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：355-360；Deloukas和Van Loon，1993，Hum.Mol.Genet.，2：1895-1900)。该转录调节子被米非司酮或其类似物RU487诱导。当不存在米非司酮时，调节子融合蛋白在胸苷激酶的最小启动子下组成表达。该蛋白主要位于细胞核中并且无活性。在添加诱导剂米非司酮或其类似物RU486后，其与GAL4-hPR-p65的hPR-LBD区高亲和性的结合，引起了构象改变从而导致了蛋白的二聚化作用以及其转换为活性形式。这些同型二聚体能够结合到特异位点(UAS：上游激活序列)引起定位在所述激活序列的3’方向的基因的转录，并且因此激活目的基因以及编码真正的转录因子的基因的转录(图2C)。
本领域技术人员可以理解这种类型的转录调节子，其活性由添加外源化合物调节，而不要求其转录受到特定的精细转录控制，所述外源化合物提高调节子向细胞核迁移或使其构象改变到活性形式。一般情况下，编码反式作用子或转录调节子的序列伴随着引导其转录和表达的合适的启动子，并且伴随着多腺苷酸化信号。因为不需要对这种类型的调节子的转录进行精确的控制，所以其可以受组成型启动子调控。这不应是一个限制，除此之外，最小启动子可以是，组成型病毒启动子如CMV或RSV，或真核细胞组成型启动子，如PGK或EF1。可选的，可能包括在编码转录调节子的基因的启动子区域中的有转录调节子的应答元件，这样其表达通过正反馈循环导致表达增加。在一具体实施方式中，转录调节子由一个或几个GAL4DNA结合域的结合元件组成的区域调控，优选4个GAL4DNA结合域的结合元件，其与单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(Ptk)的最小启动子结合。
A1多核甘酸的第二元件包含一个表达框，该表达框编码一种限制性核酸内切酶，其受本发明的第一多核苷酸中存在的第一表达框编码的转录调节子的操作控制。限制性核酸内切酶是一种通过识别和断裂特异的DNA位点来切开双链DNA的酶。本发明的核酸内切酶指的是一种不识别人细胞的DNA基因组的特异位点的核酸内切酶，并且因此，其不在所述细胞的天然基因组上产生断裂。这不应是一个限制，除此之外，限制性核酸内切酶可以是I-SceI、PI-SceI，、I-PpoI、I-DmoI或PI-TliI。在一具体实施方式中，由A1多核苷酸编码的限制性核酸内切酶为酿酒酵母的I-SceI。包含限制性核酸内切酶的编码序列的多核苷酸受由本发明的多核苷酸的第一元件编码的转录调节子的结合序列的操作控制。这样，启动子应答激活或抑制核酸内切酶的转录和表达的反式作用子的结合。但是，反式作用子与启动子结合和相互作用的能力依赖于调节因子是否结合到配体或诱导剂上。结果是，可以通过控制诱导剂的有效性调节目的基因的转录。在一些情况下，诱导剂激活和有利于基因的转录和表达，同时在另一些情况中，诱导剂的存在抑制其表达。在一优选的具体实施方式中，转录调节子为GAL4-hPR-p65，编码限制性核酸内切酶的多核苷酸位于可变数目的对GAL4 DNA结合域的结合序列的3’位置。在一更优选的具体实施方式中，编码限制性核酸内切酶的基因位于由6个GAL4转录因子的结合序列和E1b(PE1b)腺病毒基因的TATA盒的序列组成的调节子元件的3’位置(Lillie和Green，1989，Nature，338：39-44)。
在A1多核苷酸的一具体实施方式中，转录调节子为GAL4-hPR-p65，限制性核酸内切酶为I-SceI。
本发明的第二多核苷酸(A2多核苷酸)
在第二方面，本发明涉及一种多核苷酸(下文中的A2多核苷酸)或表达载体，其包括
(a)第一表达框，其包含编码转录调节子的核酸序列；
(b)第二表达框，其包含编码限制性核酸内切酶的核酸序列，并且其受由(a)中限定的转录调节子活化的转录调节序列的操作控制，以及
(c)第三表达框，其包含一个核酸序列，该核酸序列编码选定的腺病毒E1A蛋白质或腺病毒E1A和E1B蛋白质，且其受由(a)中限定的转录调节子活化的转录调节序列的操作控制。
A2多核苷酸的原件(a)和(b)本质上对应于那些组成本发明的第一多核苷酸的部分，并且上文已经进行了描述。
A2多核苷酸的组分(c)包含一种表达框，其包含编码选定的腺病毒E1A蛋白质或腺病毒E1A和E1B蛋白质的核酸序列。基因E1A以及可选的E1B可能来自任何种类或人腺病毒血清型(已经从人类中进行了分离)的腺病毒基因组，例如血清型2(Ad2)、5(Ad5)、11(Ad11)或3(Ad3)。在一具体实施方式中，所述组分包括限定在腺病毒血清型5的基因组505-3511位置之间的序列(GenBank：AC000008)。该序列受可被转录调节子(a)激活的转录调节子序列的操作调控。这样，启动子应答激活或抑制结构基因E1A和E1B的转录和表达的反式作用子的结合。但是，反式作用子与启动子结合和相互作用的能力依赖于调节因子是否结合到配体或诱导剂上。结果是，可能通过诱导剂的应用控制调节E1A和可选的E1B基因的转录。在一个优选的具体实施方式中，本发明的A2多核苷酸的组分(c)受到由6个GAL4转录因子的结合序列和E1b(PE1b)腺病毒基因的TATA盒序列组成的杂合启动子的控制(Lillie和Green，1989，Nature，338：39-44)。
本领域技术人员可以理解对应于转录激活因子的A2多核苷酸的基因的取向对其功能是不重要的。因此，在一优选的具体实施方式中，第二和第三框反向转录。在另一优选的具体实施方式中，控制第二和第三框的转录调节序列共享相同的对于转录调节子(a)的结合位点。在一优选的具体实施方式中，编码限制性核酸内切酶的基因和腺病毒蛋白在相同的由6个GAL4转录因子的结合序列和E1b(PE1b)腺病毒基因的TATA盒序列组成的杂合启动子的控制下(Lillie和Green，1989，Nature，338：39-44)。在一更优选的具体实施方式中，本发明的A2多核苷酸的第二和第三框反向转录并且共享GAL4转录因子的DNA结合域的结合序列。
在A2多核甘酸的一特别的具体实施方式中，第一表达框(a)包含编码转录调节子GAL4-hPR-p65的序列，第二表达框(b)包含编码在一个或几个GAL4蛋白质的结合位点的控制下的I-SceI限制性核酸内切酶的序列，以及第三表达框(c)包含在一个或几个GAL4蛋白质的结合位点控制下的E1A和E1B基因的序列。在一更优选的具体实施方式中，引导编码I-SceI限制性核酸内切酶的序列和E1A和E1B基因的序列的表达的调节启动子共享相同的GAL4-hPR-p65应答元件。
本发明的第三多核苷酸(B多核苷酸)
另一方面，本发明涉及一种多核苷酸(下文的B多核苷酸)或表达载体，其包括核酸序列，该核酸序列包含重组腺病毒的基因组，并且其至少缺失ψ包装序列以及编码E1A蛋白质或E1A/E1B蛋白质的序列，其中所述包含重组腺病毒的基因组的所述序列侧面有限制性核酸内切酶的特异性识别序列。腺病毒基因组的序列可以从任意种类的人腺病毒血清型(其在人类中已经被分离)的腺病毒基因组中产生，例如血清型2(Ad2)、5(Ad5)、11(Ad11)或3(Ad3)。
优选的，限制性核酸内切酶的识别序列侧面为位于末端ITR序列的5’和3’位置的腺病毒基因组，其中也可以发现用于所述基因组复制和转录的合适的区域。本领域技术人员可以理解在B多核苷酸中使用的限制靶将依赖于在本发明的A1和A2多核苷酸中编码的限制性核酸内切酶。因此，在腺病毒基因组侧面的靶序列为限制性核酸内切酶的特异识别序列，所述限制性核酸内切酶与已经描述过的由A1和A2多核苷酸编码的内切酶具有相同的特性和需要。这不应是一个限制，除此之外，序列可能被I-SceI、PI-SceI、I-PpoI、I-DmoI或PI-TliI核酸内切酶特异性识别。在一具体实施方式中，它们被I-SceI核酸内切酶特异性识别。
另外，在另一优选的具体实施方式中，依据本发明的B多核苷酸包含促进所述多核苷酸插入到包装细胞的基因组中的序列。在一更优选的具体实施方式中，所述的利于整合入基因组的序列为整合酶的特异性识别序列。优选的，整合酶的靶序列位于核酸内切酶的第一识别序列的5’位置。
本发明具体实施方式中合适的整合酶的靶序列包括，但不限于，P1噬菌体的Cre重组酶的靶序列(LoxP)，酿酒酵母的FLP重组酶的靶序列(Frt)，链霉菌属ΦC31噬菌体的整合酶的靶序列(attB，attP)，TP901-1重组酶的靶序列，R4重组酶的靶序列，或λ整合酶的靶序列。在一优选的具体实施方式中，本发明的靶序列包括噬菌体的整合酶的特异序列，其介导两个DNA的特异位点或序列的单向重组。更具体的，整合酶属于丝氨酸整合酶家族，其特征在于它们利用催化性丝氨酸残基来断裂DNA链(Thorpe和Smith，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：5505-5510)。被这些整合酶识别的重组位点(attB和attP)具有不同的序列并且比被其它重组酶识别的重组序列更短。由该类型的整合酶介导的整合是受重组序列严格调控的单向过程(Thorpe等，2000，Mol.Microbiol.，38：232-241)。另一个重要的特征是在宿主中attP和attB之间的重组不需要辅因子来操作。这些整合酶目前用于哺乳动物细胞中的基因操作过程中，并且其已经显示了在外源引进的attP位点或在与所述attP位点具有部分同一性的天然序列(假-attP)处介导遗传物质的有效的整合。这不应是一个限制，除此之外，整合酶的靶序列可以是PhiC31，TP901-1或R4整合酶的特异识别序列。在一具体实施方式中，整合酶的靶序列为attB，对应于PhiC31噬菌体的整合酶的特异性的细菌DNA上的锚定位点。该整合酶可介导在人细胞基因组上的attB序列和假-attP序列间的单向重组。
因此，在另一优选的具体实施方式中，B多核苷酸从5’到3’方向包括：可选的，整合酶识别序列；第一核酸内切酶识别；腺病毒基因组(其界限由腺病毒的ITR确定)；限制性核酸内切酶的第二序列。
本发明的载体和宿主细胞及其获得方法
本发明的多核苷酸可能是独立的或是组成载体的一部分，所述载体允许所述多核苷酸在合适的宿主细胞中增殖。因此，在另一方面，本发明涉及一种载体，例如表达载体，其包含本发明的A1、A2或B多核苷酸。
适合本发明的多核苷酸插入的的载体包括原核生物中的表达载体，例如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、CoIE1、pCR1、RP4，噬菌体和“穿梭”载体例如pSA3和pAT28，酵母中的表达载体例如2μm型质粒、整合质粒的载体，YEP载体，着丝粒质粒及类似物，昆虫细胞中的表达载体例如pAC系列和pVL系列的载体，植物中的表达载体例如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列的载体或类似载体，以及真核细胞中的表达载体，如基于病毒载体(腺病毒，腺病毒相关病毒，以及反转录病毒，特别是，慢病毒)以及非病毒载体，如pSilencer 4.1-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDT1。特别适于所述多核苷酸插入的载体为高级真核细胞中的表达载体，其基于病毒载体(例如腺病毒相关病毒、反转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、SV40和甲病毒)或还基于非病毒载体(例如质粒)，能够在宿主细胞中维持和/或复制和/或表达。在一更具体的实施方式中，所述表达载体适宜转染或感染离体的哺乳动物细胞，特别是人类细胞。
典型地，真核细胞表达载体包括，例如，一个或多个克隆基因，并且位于5’和3’的序列的转录控制下，以及选择标记。这不应被认为是限制，控制序列包括能在真核细胞中表达的启动子(包含转录起始位点)，核糖体结合位点，RNA加工信号，转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
优选的，载体包括报告或选择基因，其赋予了表达它的细胞一种表现型，并且促进在与载体接触后掺入所述载体的细胞的鉴定和/或选择。优选的，选择的表型在真核细胞中在转染或感染前不表达。在本发明的内容中有用的报告基因包含lacZ、荧光素酶、胸苷激酶、GEP及类似物。在本发明的内容中有用的选择基因包括，例如，抗新霉素基因，其赋予了对G418氨基葡糖苷的抗性，潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予了潮霉素抗性，ODC基因，其赋予了鸟氨酸脱羧酶抑制剂(2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸：DFMO)抗性，二氢叶酸还原酶基因，其赋予了甲氨蝶呤抗性，嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因，其赋予了嘌呤霉素抗性，ble基因，其赋予了抗zeocyn抗性，腺苷脱氨酶基因，其赋予了9-β-D-木呋喃糖腺嘌呤抗性，胞嘧啶脱氨酶基因，其允许细胞在存在N-(磷酰基乙酰基)-L-天冬氨酸的条件下生长，胸苷激酶基因，其允许细胞在存在氨基蝶呤的条件下生长，黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因，其允许细胞在存在黄嘌呤和不存在鸟嘌呤的条件下生长，大肠杆菌的trpB基因，其允许细胞在存在替代色氨酸的吲哚的条件下生长，大肠杆菌的hisD基因，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸。选择基因整合到质粒中，质粒可能包括，附加的，在真核细胞中表达所述基因的合适的启动子(例如，CMV或SV40启动子)，翻译最佳起始位点(例如，依据所谓的Kozak法则的位点或IRES)，多腺苷酸化位点，举例来说，如SV40的多腺苷酸化位点或磷酸甘油酸激酶的多腺苷酸化位点，或内含子，举例来说，如β球蛋白基因的内含子。可选的，可在相同的载体中同时联合使用报告基因和选择基因。
本发明的多核苷酸和包含其的表达载体可以通过本领域技术人员已知的分子生物学和基因工程的常规技术来生产，并且其在概述和手册中已经得到公认，例如“Molecular Cloning：a Laboratory manual”，J.Sambrook和D.W.Russel，Eds.，Publisher：Cold Spring Harbor Laboratory Press，third edition，2001(ISBN 978-0879695774)。同样也有能够促进用于本发明的多核苷酸的表达载体构建的商售系统。因此，例如，包含A多核苷酸的哺乳动物表达载体的构建可以更容易，如果使用例如GeneSwitchTM诱导表达系统(Invitrogen，Carlsbad CA92008 USA，Catalog nos.K1060-01和K1060-2)，其允许构建用于米非司酮诱导的目的基因表达的载体；RheoSwitchTM诱导表达系统(New England Biolabs，Beverly，MA01915-5599 USA)，其允许配体RLS1诱导的目的基因的表达；或任何其它的相同作用的商售系统。
本发明的多核苷酸和载体可组成宿主细胞的部分，宿主细胞提供了作为载体的增殖工具和生产重组腺病毒的包装细胞的双重作用。因此，另一方面，本发明涉及宿主细胞，其包含本发明的A1多核苷酸，A2或B或包含任意前述的多核苷酸的表达载体。如果细胞用作生产腺病毒的包装细胞，其必须能够支持腺病毒的生产和感染。根据该实施方式，合适的真核细胞将可以是任何允许感染和复制腺病毒的细胞。
在一优选的具体实施方式中，细胞系可以是稳定细胞系。这不应作为限制，宿主细胞可以为HeLa、A549、KB、HuH7细胞，或其它能够支持腺病毒生命周期的真核细胞。如果E1A或E1A/E1B多肽是细胞支持的(该情况下其中使用了本发明的A1多核苷酸)，其表达可通过诱导剂受调节启动子的控制，因为包括在B多核苷酸中的腺病毒基因的表达的起始的更强的控制，而因此限制了最大化了源自过量病毒表达蛋白的可能的细胞毒性效果的风险。该情况下，细胞将不适合表达所述组成的蛋白，例如293或PerC6细胞。
在一具体实施方式中，宿主细胞来源于哺乳动物，优选灵长类，特别是人类。在一优选的具体实施方式中，细胞系是肺癌系。在一更优选的具体实施方式中，宿主细胞是A549系细胞。该细胞系最初由Giard等(1973，J.Natl.Cancer Inst.，51：1417-1423)发现，随后被Lieber等深入研究(1976，Int.J.Cancer.，17：62-70)，其具有对腺病毒感染的高敏感性，从而赋予了其作为病毒生产细胞系的高的潜能(Smith等，1986，J.Clin.Microbiol.，24：265-268).
在一优选的具体实施方式中，本发明涉及包含本发明的A1多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的宿主细胞。在一更优选的具体实施方式中，细胞额外包括编码腺病毒E1A蛋白质的序列以及可选的编码腺病毒E1B蛋白质的序列。
在另一优选的具体实施方式中，本发明涉及一种包含本发明的A2多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的宿主细胞。
在另一具体实施方式中，本发明涉及一种包含本发明的B多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的宿主细胞。
在另一具体实施方式中，本发明涉及一种包含本发明的A1多核苷酸和B多核苷酸的宿主细胞。在一更优选的具体实施方式中，所述细胞包括附加的编码腺病毒E1A蛋白质的序列和可选的编码腺病毒E1B蛋白质的序列。
在另一具体实施方式中，本发明涉及一种包含本发明的A2多核苷酸和B多核苷酸的宿主细胞。
包含本发明的A1和B多核苷酸的细胞和包含A2和B多核苷酸的细胞都特别适合于生产和包装高容量腺病毒载体，因此，包含本发明的A1和B多核苷酸的细胞和包含A2和B多核苷酸的细胞能够用于生产和包装所述的载体的程序和系统中。但是，对于生产腺病毒特别有用的是那些，其中靶点位于B多核苷酸中缺损的腺病毒基因组侧面，其对应于由A1和A2多核苷酸编码的限制性核酸内切酶，因为，另外，由A1或A2多核苷酸编码的限制性核酸内切酶不能作用于释放腺病毒基因组的B多核苷酸上，这对于所述基因组的复制和转录是十分关键的。
本发明的宿主细胞可以通过暂时引入本发明的多核苷酸或载体，或优选的，通过以稳定方式引入所述载体或多核苷酸来获得。为此，必须在适合于将DNA引入细胞的条件下将本发明的载体和宿主细胞接触。本发明的载体使用本领域技术人员已知的任意转染方法(参见Ausubel，F.M.等，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons Inc；2003)，9.1-9.5部分)引入要研究的目标细胞中。具体来说，细胞能够通过DNA与磷酸钙、二乙胺乙基葡聚糖、聚凝胺的共沉淀、电穿孔、显微注射、由脂质体介导的融合、脂质转染、反转录病毒感染和biolistic转染来进行转染。
因此，在另一方面，本发明涉及一种生产适于生产和包装高容量腺病毒感染颗粒的细胞的方法，其包括
(i)用本发明的A1多核苷酸转染细胞以及
(ii)用本发明的B多核苷酸转染所述细胞
其中步骤(i)和(ii)可以任意顺序或同时进行，其中使用包含编码腺病毒E1A蛋白质以及可选的腺病毒E1B蛋白质的序列的细胞。
因此，在另一方面，本发明涉及一种生产适于生产和包装高容量腺病毒感染颗粒的方法，其包括
(i)用本发明的A2多核苷酸转染细胞，以及
(ii)用本发明的B多核苷酸转染所述细胞，
其中步骤(i)和(ii)可以任意顺序或同时进行。
本领域技术人员可以理解的是，可执行上述的方法中的步骤(i)和(ii)从而使多核苷酸或载体暂时在细胞中，或任选的，可以获得A1/A2和/或B多核苷酸的稳定表达。在宿主细胞中想要获得本发明的载体的稳定表达的情况下，在转染或感染步骤中必须包括编码确定抗生素抗性的基因，从而可能选择出DNA在染色体外的在其基因组中整合DNA的细胞系。使得可选择细胞的基因可以组成相同载体的一部分，载体包含本发明的构建目标或，任选的，其可以由包含所述抗性基因的第二质粒的共转染单独提供。在后一种情况中，提供对于抗性基因摩尔过量的包含DNA构建体的质粒给转染混合物，从而使得每个抗性基因的整合过程中，都很可能整合包含要研究的目标启动子的基因。优选的，包含DNA构建体的质粒提供的量超过包含抗性报告基因的至少5倍。优选的，抗性基因包含在本发明的载体中。合适的用于转染的抗性基因已经在之前进行了描述。因此，在一优选的具体实施方式中，根据本发明的包含A1和B或A2和B多核苷酸的细胞的生产方法包括附加的选择步骤，其中稳定整合第一和/或第二多核苷酸的细胞被选择出来，其基于在步骤(i)和步骤(ii)中使用的多核苷酸中存在的选择标记。
在另一方面，包含A2多核苷酸的表达载体的转染使得可能选择稳定整合多核苷酸的细胞克隆(培养基中培养细胞直至4个月)。有利的是，已经证实E1A/E1B蛋白质的表达和限制性核酸内切酶的表达被抑制，维持了对细胞无害的基础表达水平并且所述表达能够通过将合适量的适宜使用的特异构建体的诱导剂添加到培养基中来进行诱导和激活。
另外，在特殊的情况下，当使用包含整合酶识别位点的B多核苷酸的变体时，必须通过包含B多核苷酸的表达载体和编码与表达整合酶并且识别整合酶的识别序列的质粒共转染来进行步骤(ii)，从而使得B多核苷酸整合入细胞基因组中。优选的，在整合酶的识别位点为attB位点的情况下，步骤(ii)包含用编码PhiC31噬菌体的整合酶的质粒共转染，其允许B多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体通过在attB序列和在人类细胞的染色体上存在的假-attP序列间的重组整合到细胞基因组中。该单向的重组和整合由PhiC31整合酶介导。为了不同的病毒区域的表达以及随后存在于B多核苷酸上的病毒基因组的复制，病毒的ITR末端必须是自由的，除此之外还需要存在病毒E1A/E1B蛋白质。因此，产生的细胞带有缺陷腺病毒的基因组，但其不会被表达或复制。虽然整合也可能随机发生在B多核苷酸上，但是，假-attP序列的整合是主要的，并且不会丢失遗传物质。
上述的方法使得能够生产适合于包装高容量腺病毒载体的细胞系。因此，在另一方面，本发明涉及一种通过上述的任意方法获得的细胞。特别是，本发明考虑到包含A1和B多核苷酸或A2和B多核苷酸的细胞，其中所述多核苷酸可以稳定整合到细胞基因组中或可以被暂时地发现。
生产和包装本发明的腺病毒载体的系统和方法
通过引入本发明的多核苷酸或包含其的载体到细胞系中来生产的包装细胞可以用于高容量腺病毒载体的产生，通过在所述细胞中引入包含目的基因的腺病毒基因组，用包含腺病毒基因组的多核苷酸转染或用包含所述基因的重组腺病毒感染。在用包含腺病毒基因组(其相应包含目的基因)的腺病毒/多核苷酸感染/转染后，将细胞与促进包含在A1或A2多核甘酸中的基因表达的试剂接触，转录调节子开始在细胞中生产，相应激活编码限制性核酸内切酶的基因的转录。相应地，其作用于B多核苷酸中包含的缺陷腺病毒基因组的侧面的靶位点，导致其从细胞基因组中分离，这是组成所述基因组的部分的腺病毒基因的后续转录的必要条件。来自B多核苷酸的腺病毒基因的转录还需要由A2多核苷酸编码的早期E1A和E1B基因的表达，在这种情况其应答转录调节子的激活，或者在实际的包装细胞中，其同样受转录调节子的调控。
因此，在另一方面，本发明涉及一种生产高容量腺病毒的系统，其包括
(a)根据本发明的细胞，以及
(b)高容量腺病毒。
在另一方面，本发明涉及一种生产和包装高容量腺病毒载体的方法，其包括如下步骤：
(a)用多核苷酸或包含所述多核苷酸的表达载体转染或感染宿主细胞，所述多核苷酸包含想要生产的高容量腺病毒的基因组；
(b)在允许高容量腺病毒复制和包装的条件下培养转染/感染的细胞；
(c)再生高容量腺病毒的病毒粒子，以及，可选的
(d)重复步骤(a)到(c)，其中步骤(c)中产生的高容量病毒粒子用于后续循环的步骤(a)中；
其中步骤(a)中的宿主细胞选自如下的组：
(i)细胞，其包含本发明的A1多核苷酸以及编码腺病毒E1A蛋白和可选的腺病毒E1B蛋白的序列，该情况下，在步骤(a)之前或进行同时用本发明的B多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达载体转染；
(ii)细胞，其包含本发明的A2多核苷酸，该情况下在步骤(a)之前或进行同时用本发明的B多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达载体转染；
(iii)细胞，其包含本发明的B多核苷酸，该情况下在步骤(a)之前或进行同时用本发明的A1多核苷酸转染，其中该细胞包含编码腺病毒E1A蛋白和可选的腺病毒E1B蛋白质的序列；
(iv)细胞，其包含本发明的B多核苷酸，该情况下在步骤(a)之前或进行同时用本发明的A2多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达载体转染；
(v)细胞，其包含本发明的A1多核苷酸，本发明的B多核苷酸，以及编码腺病毒E1A蛋白质和可选的腺病毒E1B蛋白质的序列，以及
(vi)细胞，其包含本发明的A2多核苷酸和本发明的B多核苷酸。
生产和包装高容量腺病毒载体的方法的步骤(a)包括将包装细胞与高容量腺病毒或与包含所述腺病毒基因组的多核苷酸或载体接触。
根据本发明，“高容量腺病毒”应理解为，那些被称为辅助依赖型或无肠的腺病毒的重组病毒，其特征在于其缺失腺病毒基因组中除了ITR 5’和3’以及ψ包装区域外的所有基因，例如，如Alba等(2005，Gene Therapy，12：S18-S27)所述。这些腺病毒允许高达36kb的异源序列进入，因为其缺失自身的腺病毒基因组序列。根据本发明的方法可掺入到无肠载体中的异源基因，其包括编码下列物质的基因：红细胞生成素(EPO)、瘦素、促肾上腺皮质素释放激素(CRH)、生长素释放激素(GHRH)、促性腺素释放素(GnRH)、促甲状腺激素释放素(TRH)、催乳素释放激素(PRH)、褪黑激素释放激素(MRH)、催乳素释放激素(PIH)、生长抑制素、促肾上腺皮质素(ACTH)、somatropic或生长激素(GH)、黄体化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺素(TSH或促甲状腺激素)、催乳素、催产素、抗利尿激素(ADH或加压素)、褪黑激素、Müllerian抑制因子、降钙素、甲状旁腺激素、胃泌激素、胆囊收缩素(CCK)、胰泌素、PBGD、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)、心房钠尿肽(APN)、人绒毛膜促性腺素(hCG)、胰岛素、胰高血糖素、生长抑制素、胰多肽(PP)、瘦素、神经肽Y、凝乳酶、血管紧张素I、血管紧张素II、因子VIII、因子IX、组织因子、因子VII、因子X、凝血酶、因子V、因子XI、因子XIII、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8和趋化因子)、白介素16(IL-16)、白介素15(IL-15)、白介素24(IL-24)、α，β，γ干扰素、CD3、ICAM-1、LFA-1、LFA-3、趋化因子(包括RANTES 1α、MIP-1α、MIP-1β)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形态发生蛋白质(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF和KGF)、表皮生长因子(EGF及相关物)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、角膜细胞生长因子、内皮生长因子、抗胰蛋白酶1α、肿瘤坏死因子、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、心脏营养素1(CT-1)、制瘤素M(OSM)、双调蛋白(AR)、环孢素、纤维蛋白原、乳铁蛋白、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、糜蛋白酶、免疫球蛋白、水蛭素、超氧化物歧化酶、伊米苷酶、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖苷酶-α，α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶、硫酶、α-人半乳糖苷酶A、蛋白酶抑制因子α-1、乳糖酶、胰酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)、腺苷脱氨酶、免疫球蛋白、白蛋白、A型和B型肉毒毒素、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶、玻璃酸酶、木瓜蛋白酶、L-天冬酰胺酶、重组水蛭素、链激酶、转化生长因子β肽(TGF-β)(例如在WO0331155，WO200519244和WO0393293中描述的，其内容通过引用并入本申请)、适合干扰RNA分子(shRNA、siRNA、miRNA、核糖核蛋白U1的修饰RNA)的转录的表达框。除了所述异源基因外，本发明中使用的无肠腺病毒可包括填充区域，例如Parks等描述的衍生自λ噬菌体的基因组的填充片段序列(1999，J.Virol.，73：8027-8034)或S和ig等描述的出现在pSTK120中的填充片段DNA(2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：1002-1007)。这些区域典型地包含在人类基因组中出现的序列并且能够提高与腺病毒控制相关的异源基因的表达，其替换了所述人填充DNA，而包含λ噬菌体的22kb片段，Parks等(1999，J.Virol.，73：8027-8034)对此进行了描述。人填充DNA的全长可能是变化的，但是在20～30kb间摆动，优选20～25kb，或更优选的21～23kb，例如22kb。在所述填充DNA中在顺式上作用的序列的数目可能在2，3，4或更多之间变化，并且非限制性地包括重复的16.2kb的白斑样结构域(参见Smith等，1995，Mol.Cell.Biol.，15：5165-5172)；基质附着区域(MAR)例如，包含6型腺病毒的左侧末端或免疫球蛋白κ的基质附着区域的两份拷贝的4.2kb的片段(参见Betz等，1994，Cell，77：239-248)；肝细胞控制区域(HCR)，例如包含所述HCR的1.2kb片段(参见Miao等，2000，Molecular Therapy，1：522-532)；或其他基质附着区域，例如鸡溶菌酶的2.8kb区域(参见Phi-Van等，1990，Mol.Cell.Biol.10：2302-2307)；干扰素β的5’区的基质附着区域(参见Bode等.1992，Science，10：195-197)或其它非编码人类序列，例如末端着丝粒或着丝粒序列。
使用本领域技术人员已知的技术将宿主细胞与包含腺病毒基因组的腺病毒接触，例如所述多核苷酸或包含其的载体的转染，通过用磷酸钙、二乙胺乙基葡聚糖、聚凝胺与DNA的共沉淀，电穿孔，显微注射，脂质体介导的融合，通过反转录和biolistic转染的感染。可选的，还可能将细胞同想要增殖的腺病毒接触，这种情况下腺病毒感染细胞的实际能力允许所述基因组引入细胞中。
“包装细胞”应理解为本发明中描述的任意细胞，并且其至少包括本发明的A1/A2多核苷酸或B多核苷酸。本领域技术人员可以理解的是可使用不同的包装细胞。但是，依赖于包装细胞中存在或不存在本发明的一个或多个多核苷酸，步骤(a)将先于或与转染步骤同时进行，其中细胞与本发明的多核苷酸接触，该多核苷酸其未出现在包装细胞中，并且需要其来提供元件，该元件对于提供腺病毒基因组的复制以及在细胞中生产腺病毒装配必须的多肽是必要的。因此，还可将包含本发明的A1多核苷酸和编码腺病毒E1A蛋白质以及可选的腺病毒E1B蛋白质的细胞作为包装细胞。但是，使用该包装细胞需要先于或与步骤(a)同时进行的步骤，该步骤中包含用本发明的B多核苷酸或包含所述多核苷酸的表达载体转染所述细胞。
使用包含本发明的A2多核苷酸的细胞时，步骤(a)应当先于或与用本发明的B多核苷酸或包含所述多核苷酸的表达载体转染的步骤同时进行。
使用包含本发明的B多核苷酸的细胞作为包装细胞时，步骤(a)应当先于或与用本发明的A1多核苷酸转染的步骤同时进行，并且，在该情况下，细胞应当额外包括编码腺病毒E1A蛋白质以及可选的腺病毒E1B蛋白质的序列。
在使用包含本发明的B多核苷酸的细胞时，步骤(a)应当先于或与用本发明的A2多核苷酸或包含所述多核苷酸的表达载体转染的步骤同时进行。
还可能使用包含本发明的A1多核苷酸、本发明的B多核苷酸以及编码腺病毒E1A蛋白质和可选的腺病毒E1B蛋白质的序列的细胞，或可选的包含本发明的A2和B多核苷酸的细胞。
本发明的方法的步骤(b)包括将步骤(a)中获得的转染/感染细胞在允许高容量腺病毒复制和包装的条件下培养。为此，所述条件必须允许由A1或A2多核苷酸编码的转录调节子的表达，以便于其作用于他们在存在于A1和A2多核苷酸中的核酸内切酶的基因的调节子区域的结合位点上以及作用于存在于A2多核苷酸的腺病毒E1A和E1B基因的调节子区域的结合位点上。为此，在由A1和A2多核苷酸编码的转录调节子为可激活的调节子时，步骤(b)包含将细胞与能够激活转录调节子的试剂接触。在一优选的具体实施方式中，由A1和A2多核苷酸编码的转录调节子为GAL4-hPR-p65，如前文所述，在该情况下，诱导剂为米非司酮。
步骤(b)在必要的时间内执行，从而使病毒粒子的浓度达到足够高，这通过标准方法例如HPLC-based Resource Q方法来测定，如Shabram等(1997，Hum.Gene Ther.，8：453-465)所述的，或通过细胞的病变效果的直观观察来间接确定。可选的，细胞培养可包括添加新鲜的培养基。
在步骤(c)中，从步骤(b)中产生的腺病毒从细胞培养物中回收。为此，必须分离培养基中的细胞，通过本领域技术人员已知的任意方法(胰蛋白酶消化以及离心或过滤)，在惰性的溶液中溶解细胞(冻融循环，均化，超声处理，空化作用，使用洗涤剂及其类似物)以及通过已知的方法例如CsCl梯度的超速离心来纯化腺病毒颗粒，不同种类的色谱法也可用来纯化腺病毒，例如离子色谱和金属螯合亲和色谱的组合(Huyghe等，1996，Hum.Gene Ther.，6：1403-1416)，离子交换色谱和凝胶部分色谱的组合(WO07059473)，二乙胺基乙基(DEAE)纤维素色谱(Haruna等，1961，Virology 13，264-267)，羟磷灰石色谱(US2002/0064860)以及其他树脂如软凝胶(琼脂糖)，基于包含许可色谱的合成聚合物的大孔聚合物(部分凝胶)以及基于硬胶囊中的软凝胶的材料(例如，Ceramic HyperD
Figure BPA00001308537900291
 F)(Rodrigues，1997，J.Chromatogr.B Biomed.Sci.Appl.，699：47-61)的色谱。
步骤(d)，其是可选的，包括重复步骤(a)到(c)一次或几次。为此，在每个循环的步骤(a)，以之前的循环中的步骤(c)中获得的腺病毒颗粒作为起始材料。这样，本发明的步骤可以循环几次，在每个循环中获得更多数量的腺病毒颗粒。
下文中，本发明基于以下实施例进行详细说明，实施例仅用于说明，其对本发明的保护范围没有限制。
具体实施方式
实施例1：用于诱导E1a、E1b腺病毒基因和I-SceI限制性内切酶表达的pGal4-2RU-E1-SceI质粒的构建
在本实施例中，pGal4-2RU-E1-SceI质粒被特异性地设计用于在转录水平控制腺病毒基因E1a和E1b的表达，其包含本发明所定义的A2多核苷酸。在这个构建体中，包括编码I-SceI限制性核酸内切酶的基因，并且位于相同类型的转录控制之下。控制E1a、E1b和I-SceI基因表达的转录调节子由包含在A2多核苷酸中的核苷酸序列组成型表达。
本发明包含的转录调节的机制由抗孕酮系统米非司酮所介导(Burcin等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：355-360)。所述调控是通过融合蛋白发生，所述融合蛋白对内源性人类激素不敏感，但是在足够低剂量的合成孕酮(RU486)存在的条件下激活，以避免在人体中的二次作用。
基于pGal4-2RU-E1-SceI质粒的构建，使用商业化的系统GeneSwitchTM(Invitrogen，Carlsbad CA92008 USA，Catalog nos.K1060-01和K1060-2)。该系统提供了用于设计包括A2多核苷酸质粒所需要的所有遗传组分。
GeneSwitchTM系统的第一个组分为pSwitch载体(图2A)，其编码作为转录激活因子的融合蛋白GAL4-hPR-p65。该蛋白分为一个酿酒酵母的GAL4蛋白的DNA结合域(DBD)(Laughon和Gestel，1984，Mol.Cell Biol.，4：260-267；Marmorstein等，1992，Nature，356：408-414)，一个缩短的人类孕酮受体的配体结合域(hPR-LBD)(Kastner等，1990，Embo J.，9：1603-1614；Wang等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：8180-8184)和人类NF-kB蛋白的激活域(Burcin等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：355-360；Deloukas和van Loon，1993，Hum.Mol.Genet.，2：1895-1900)。该调控蛋白的表达受来自酿酒酵母的GAL4的激活序列结合的杂交启动子(UAS：上游激活序列)(Giniger等，1985，Cell，40：767-774；Wang等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：8180-8184)和单一疱疹病毒的基因胸苷激酶(Ptk)的最小启动子的调控。该启动子的激活区域包括5′-(T/C)GGAGTACTGTCCTCCG-3′(SEQ ID NO：1)序列的4个拷贝。每一拷贝作为GAL4转录因子DNA结合域的两分子的结合位点。(Marmorstein等，1992，Nature，356：408-414)。
GeneSwitchTM系统的第二组分是pGene/V5-HisA质粒(图2B)，其控制目的基因的表达。在该情况下，控制转录的杂交启动子包含6个GAL4转录因子的结合序列和E1b腺病毒基因的TATA盒序列(Lillie和Green，1989，Nature，338：39-44)。
在不存在米非司酮的条件下，该系统将从胸苷激酶最小化启动子组成型表达调节子融合蛋白质GAL4-hPR-p65。该蛋白质主要定位在细胞核内并且未活化。当加入诱导物米非司酮或者他的类似物RU486时，其具有高亲和力地结合到GAL4-hPR-p65的hPR-LBD区域，引发构象改变导致蛋白质二聚体化并且其转换成活化形式。这些同源二聚体同位于pGene/V5-HisA和pSwitch质粒的GAL4(UAS)的结合序列相互作用，从而激活目的基因和编码现有转录因子的基因的转录(图2C)。
基于本发明建议的想法，即将Ad5的E1区和I-SceI核酸内切酶基因位于诱导系统GeneSwitchTM的控制之下，最初就可设计调控系统、位于505和3511之间的腺病毒基因组序列(Ad5(505-3511))(GenBank：AC000008)和I-SceI编码基因的不同组合。在这些组合中，调节机制基于1个或2个质粒的使用并且其中E1基因和I-SceI基因仍然受单个启动子调控或者受依次在相同或者不同的方向设置的不同启动子的调控(图3A)。测试这些组合中的每一个，以确定它们对E1区和基因I-SceI的表达的调节能力和稳定整合到细胞基因组的能力。所有这些组合中，pGal4-2RU-E1-SceI构建体被认为最适合用于设计非依赖型高能腺病毒的辅助者产生系统。
用于繁殖该构建体的细菌菌株如下所述为大肠杆菌DH5α和大肠杆菌STBL2。DH5α菌株在37℃下，STBL2在30℃下，在加入了氨苄青霉素(100μg/mL)(Sigma-Aldrich)的作为选择培养基的LB培养基(LB)中(Sigma-Aldrich，28760 Madrid，Spain)生长。细菌按照最初由Hanahan描述的CaCl2方案(1983，J.Mol.Biol.，166：557-580)转化。为此，将10-20ng的质粒DNA与100μL的感受态细胞混合，并且冰中保持30分钟。随后，为了提高该过程的效率，混合物在42℃孵育1分钟，并且迅速转移到冰中，其中混合物进一步孵育2分钟。最后，加入1mL的LB培养基，37℃搅拌孵育1小时。
分别地，使用FX微质粒制备试剂盒系统(GE Healthcare Europe，8290 Barcelona，Spain)和QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia CA91355，USA)按照产品说明书进行质粒的纯化和DNA片段的纯化，其已经在琼脂糖凝胶中分离并由限制性酶消化。
在DNA片段克隆中，连接反应被设计为20μL终体积，具有1U的T4 DNA连接酶(New England Biolabs，Beverly MA01915-5599，USA)和2μL 10X反应缓冲溶液(New England Biolabs)。在片段具有平末端的情况下，反应被设计为20μL终体积，具有1U的T4DNA连接酶(New England Biolabs)，2μl 10X反应缓冲溶液(New England Biolabs)和2μl 50％PEG-4000。在所有情况下，所有反应在室温孵育2小时并且在引入相应大肠杆菌菌株前，在65℃/10分钟使反应失活。重组克隆基于载体编码的抗性标记进行选择并且通过限制性核酸内切酶消化和在1％琼脂糖凝胶中电泳进行验证。
在pGal4-2RU-E1-SceI质粒合成过程中所设计的所有PCR反应在以下条件下进行：1U Taq聚合酶(BioTaq，Bioline，London NW2 6EW，UK)，PCR缓冲液(Bioline)，MgCl2 4mM，每种dNTP 0.4mM，每种引物10pmol，DNA和无菌去离子水，直到终体积为50μl。扩增反应的条件如下：95℃，4分钟，1个变性循环；94℃，50秒的变性，50℃，与引物杂交40秒并且在72℃，延伸40秒，29个循环；在72℃最终延伸，5分钟，1个循环。为了分析扩增产物，样本与1.5μL的上样溶液混合(在蒸馏水中0.25％溴酚蓝；40％甘油；100mM EDTA)并且在具有TAE 1X缓冲溶液(40mM Tris碱；20mM冰醋酸；1mM EDTA，pH 8.0)的琼脂糖凝胶中通过电泳分析，用溴化乙锭(0.5μg/mL)染色显示DNA。
pGal4-2RU-E1-SceI调节质粒以如下所述的5个步骤设计：
(1)rGene-LinkerRu2载体的构建
用SbfI(位置38)和BamHI(位置2484)限制性内切酶线性化pSwitch质粒，使其包括接头RU2。接头RU2预先用引物合成：
接头RU-1：
5′-GGACCACCAAGGATCCTCTAGAACCGTTTAAACACCACTAGTCCAACGCGTGATATCACCGCGGCCGCA-3′(SEQ ID NO：2)
接头RU-2：
5′-GATCTGCGGCCGCGGTGATATCACGCGTTGGACTAGTGGTGTTTAAACGGTTCTAGAGGATCCTTGGTGGTCCTGCA-3′(SEQ ID NO：3)
在退火反应中，浓度为50mM的10μL每种引物在缓冲溶液(50mM Tris-HCl pH8.0；100mM NaCl；1mM EDTA)中混合。反应条件如下：95℃下2分钟和52℃下10分钟。之后接头RU2引物用T4多核苷酸激酶按照产品说明书磷酸化(New England Biolabs)。该反应在37℃下孵育30分钟，并且在65℃下15分钟使其失活。然后，将接头RU2同pSwitch载体进行连接，并且将其转化进入大肠杆菌DH5α中。得到的构建体成为pSwitch-LinkerRU2。
之后，用FspI酶(在pSwitch中位置6623)和ApaI(在pSwitch中位置2721)消化pSwitch-LinkerRU2载体，释放拖出部分pSwitch载体邻近序列的接头RU2。这个片段亚克隆进入预先用相同酶消化的pGeneV5-HisA载体。所得到的载体称为pGene-LinkerRU2，并且成为pGal4-2RU-E1-SceI载体构建的基础。
2)腺病毒E1区的克隆
从pGL-3基本载体(Groskreutz和Schenborn，1997，Methods Mol.Biol.，63：11-30)用BamHI和XbaI消化，释放出一个包括SV40(SV40pA)聚腺苷酸化信号的262bp的片段。该序列克隆到预先用同样的酶消化的pBluescript II KS(+)质粒(Stratagene，La Jolla CA92037，USA)中，以获得pBS-SV40pA质粒。
同时，依次用SalI(位置151)和PvulI(位置895)酶消化pGeneV5-HisA质粒，可以分离得到牛生长荷尔蒙(BGHpA)的聚腺苷酸化信号。这个744bp的片段克隆到预先用SalI和BamHI线性化的pBS-SV40pA质粒中，并且其BamHI末端预先用Klenow按照制造商土建(DNA Polymerase I，Large(Klenow)fragment；New England Biolabs)钝化。这样，产生了包括由BamHI限制性酶的靶序列连接的聚腺苷酸化信号BGH和SV40的插入物。
之后，合成pGeneLinkerRu2-2pA质粒。为此，用XbaI消化pBS-BGHpA-SV40pA载体，得到一个623bp的片段，其包括2个聚腺苷酸化序列并且其被克隆到pGene-LinkerRU2质粒的LinkerRU2中的XbaI位点。通过用PmeI限制性酶切证实插入物的正确方向(5′-SV40pA-BGHpA-3′)。
Ad5的E1区用以下引物通过PCR扩增：
ad19  5′-GAGTGCCAGCGAGTAGAGTT-3′(SEQ ID NO：4)，和
ad22  5′-GAATTCTCAATCTGTATCTTCATC-3′(SEQ ID NO：5)。
所得到的3kb产物被克隆到用于PCR产物的特殊载体pGemT-Easy(Promega Biotech Ibérica，28108 Madrid，Spain)中。通过用EcoRI消化，所述E1区被纯化，并且其被亚克隆进入pGeneLinkerRU2-2pA载体的EcoRI靶，并且其被定位在BGHpA聚腺苷酸化信号的“下游”。所得到的质粒称为pGeneLinkerRU2-2pA-E1.
(3)GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD基因(转录调节子)和它的自调节 启动子区的克隆
用SbfI(位置38)和BamHI(位置2485)限制性内切酶消化pSwitch载体分离转录调节子的结合序列(UAS区)，激酶蛋白质的最小启动子和编码转录激活子GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD的基因。该2.4kb的SbfI-BamHIg片段被克隆到预先用同样的酶消化的pGeneLinkerRU2-2pA质粒中，并且导致多聚腺苷酸化序列SV40pA的缺失。所得到的构建体命名为pGeneLinkerRU2-Gal4-BGHpA-E1。
为了恢复第二聚腺苷酸化信号，通过BamHI消化，从最初的pGeneLinkerRU2-2pA构建体纯化SV40pA序列。该0.2kb的片段被克隆到pGeneLinkerRU2-Gal4-BGHpA-E1质粒的单一BamHI靶中。
(4)I-SceI基因的克隆
编码I-SceI核酸内切酶的基因用以下引物通过PCR从pI-SceI质粒(Choμlika等，1994，C.R.Acad.Sci.III，317：1013-1019)中获得：
SceI-b1 5′-AAACCATGGGATCAAGATCGC-3′(SEQ ID NO：6)，和
SceI-b2 5′-CCCTCTAGATTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGA-3′(SEQ ID NO：7)。当它被克隆进入pGemT-Easy之后，通过用NotI限制性酶消化释放。纯化后片段的末端用Klenow片段根据产品说明书(New England Biolabs)钝化，并且随后用SpeI限制性酶进行二次消化。最后0.8kb的纯化片段被克隆到pGeneV5-HisA载体的SpeI(位置478)和NotI(位置522，用Klenow处理)靶之间。用Klenow处理使得NotI靶缺失。所得到的质粒称为pGene-ISceI。
用XbaI消化pGene-ISceI质粒释放一个包括受E1b腺病毒基因最小启动子转录调控的核酸内切酶I-SceI基因的1.2kb的片段。该片段被亚克隆在局部SpeI兼容靶内，在pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-E1质粒内，在聚腺苷酸化序列BGH和E1区之间。获得的构建体称为pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-ISceI-E1。
5)用于控制I-SceI和腺病毒E1区转录的双诱导启动子的克隆
用引物通过PCR扩增得到pGeneV5-HisA载体的包括结合到转录激活子(UAS)和最少启动子PE1B的区域，引物为：
PRU-1 5′-AATACTAGTCCGAGCTCTTACGCGGGTC-3′(SEQ ID NO：8)，和
PRU-2 5′-AATACGCGTGGTGGCCTGTGAAGAGAAAAAA-3′(SEQ ID NO：9)，并将其亚克隆到pGemT-Easy载体中。然后，该插入物用NotI消化使其释放，并亚克隆进入GeneLinkerRU2-Gal4-2pA-ISceI-E1构建体，其中NotI靶点位于I-SceI最小启动子PE1b和腺病毒E1区之间。所得到的构建体称为pGal4-2RU-SceI-E1(图3B)
实施例2：pRCAd2质粒的构建体，用于将删除包装信号和E1a、E1b基因的腺病毒基因组整合进哺乳动物细胞，以及编码I-SceI核酸内切酶
其中包含腺病毒基因组、包装信号(ψ)以及对应于早期基因E1a和E1b的区域的序列被删除，以对其他病毒基因的表达进行更好控制。同样，该腺病毒序列在两端由酿酒酵母(Anglana和Bacchetti，1999，Nucleic Acids Res.，27：4276-4281)的I-SceI限制性核酸内切酶的识别序列限定，由于他们靶序列的大小(TAGGGATAACAGGGTAA-SEQ ID NO：8)以及其高度的特异性，其不识别转染的细胞基因组中的序列。这些序列的插入仅在I-SceI蛋白质存在的条件下便于病毒基因组的释放，这种消化释放的腺病毒的ITR末端对于病毒DNA的正确转录和复制是必需的。
最后，构建体的5’末端已经包括attB序列，该序列促使质粒整合到细胞基因组中，这是一个由酿酒酵母噬菌体的PhiC31重组酶介导的过程。这种酶具有极大的作为在哺乳动物细胞中外源DNA整合系统的潜能。因为它同其他重组酶相比，其提高了特异性、单向反应并且拥有较高的净整合频率。(Thyagarajan等，2001，Mol.Cell.Biol.，21：3926-3934)。PhiC31整合酶的识别序列称为attB和attP，并且他们的序列是不同的。整合反应之后，得到的att序列不同于初始的attB和attP序列，阻止了二次重组反应的可能性。在人类细胞中，PhiC31能够在基因组的一些点介导重组事件。这些点存在着与attP具有部分同一性的序列，被称为假-attP(图4)。根据Thyagarajan等人(2001，supra)，假-attP序列的总数可能在102到103之间，其可能产生的整合频率高于由同源重组介导的整合2-3倍，并且甚至高于由其他特殊重组酶例如Cre重组酶介导的整合10到100倍。
用于构建体繁殖的大肠杆菌菌株如下所述为DH5α、STBL2和BJ5183。细菌按照实施例1所述的CaCl2方案转化。使用DH5α和BJ5183菌株时，在37℃在加入了氨苄青霉素(100μg/mL)(Sigma-Aldrich)的LB培养基(Sigma-Aldrich)中生长，使用大肠杆菌STBL2菌株时，在30℃生长。
在pRcAD2质粒的合成过程中，所有设计的PCR反应按照实施例1所述的相同条件实施。用于核酸纯化和处理的一般程序也如实施例1中所描述。
pRcAD2载体的设计分为如下4个步骤：
1)attB-ISceI-Ad(1-190)序列的克隆
pRcAd2载体构建的第一步为以pTA-attB质粒为模板用引物通过PCR扩增attB区(Groth等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：5995-6000)：
attB-P1 5′-AGATCTGTCGACGATGTAGGTCACGGTCTCCGAAGC-3′(SEQ ID NO：11)和
attB-P2 5′-TTAATTAATTACCCTGTTATCCCTAGTCGACATGCCCGCCGTGA-3′(SEQ ID NO：12)。
扩增的片段按照产品说明书被亚克隆到用于PCR产物的特殊载体pGemT-Easy(Promega)。attB-P2引物包括具有酿酒酵母I-SceI限制性核酸内切酶的识别序列的接头。
通过限制性酶NcoI和PacI消化使得attB-I-SceI片段(316bp)从pGemT-Easy载体释放。并且将其亚克隆到预先用同样的酶消化的pGemT/A6质粒。用PCR扩增包括位于1到190之间的血清型5的腺病毒基因组区获得pGemT/A6，使用的引物为：
ad63：5′-AGATCTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCTT-，(SEQ ID NO：13)和
ad64：5′-AGATCTCGGCGCACACCAAAAACGTC-3′(SEQ ID NO：14)，并且将其克隆进入pGemT-Easy载体。
在所得到的构建体pGemT/attB-A6中，I-SceI的限制性靶被插入到attB区和腺病毒基因组位置1之间。
2)Ad(3528-4459)区的克隆
该512bp的插入物attB-ISceI-Ad(1-190)通过用BglII消化分离，并且被亚克隆进入pRC/A4-A5载体。这个载体是包括在位置3528到4459之间的腺病毒序列使用引物的扩增产物，使用的引物为：
ad57 5′-AGATCTCGTGGCTTAAGGGTGGGAAA-3′(SEQ ID NO：15)，和
ad58 5′-TCTAGATTATATGGCTGGGAACATAGCC-3′(SEQ ID NO：16)，
并且用真核表达pRC/RSV(Invitrogen)克隆，其进一步包括氨苄青霉素抗性基因，用于哺乳动物细胞筛选的新霉素抗性基因。对于在pRC/RSV的Ad(3528-4459)序列插入物，在引物ad57和ad58的5‘末端分别包含BglII和XbaI的靶序列。该插入物被整合至该载体的位置13到701之间。
从attB-SceI-Ad(1-190)片段同载体pRC/A4-A5的连接所得到的构建体称为pRC/A6-A5。通过这种方法，腺病毒的E1区被删除，并且被定位于位置190和3528之间。
3)Ad(34901-35938)区的克隆
腺病毒基因组(位置34901-35938)的3‘末端用如下引物扩增：
ad59：5′-TCTAGATTAGCTATGCTAACCAGCGTAG-3′(SEQ ID NO：17)，和
ad65：5′-GGTACCTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCTT-3′(SEQ ID NO：18)。
Ad65引物的5’末端包含I-SceI限制性内切酶的靶序列(下划线部分)。两个引物在它们的5’包含用于XbaI(ad59)和KpnI(ad65)的限制性靶。扩增产物1060bp的片段用这些酶切割以便于他们Ad(3528-4459)区的“下游”亚克隆插入到pRC/A6-A5载体。获得的构建体称为pRC/A6-A7。
4)pRcAd2质粒的获得
pRC/A6-A7用XbaI线性化，并且用碱性磷酸酶按照产品说明书去磷酸化(Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal(CIP)；New England Biolabs)。
同时，用PacI消化pTG3602质粒(Chartier，et al.，1996，J.Virol.，70：4805-4810)，释放腺病毒血清型5基因组的完全拷贝，并通过用碱性磷酸酶使其末端去磷酸化，避免其再循环。
线性化的载体pRC/A6-A7和释放的pTG3602质粒的插入物两者同时用于转移大肠杆菌BJ5183的电适应的细菌菌株(BJ5183 Electroporation competent cells；Stratagene)。这些细胞专门设计用于启动在包含目的基因的转化载体和包含腺病毒基因组的载体的同源序列间的重组过程。在这种情况下，两个DNA片段(Ad(3528-4459)和Ad(34901-35938区)都包括的该同源区有助于所述重组过程，其分辨率使腺病毒基因组插入到pRN/A6-A7载体中并且在病毒的位置4459之后(图5)。
按照产品说明书，电穿孔过程在Gene Pulser(Biorad)电穿孔系统中按照如下参数进行：电压：2.5KV；电阻：200Ω；电容：25μF；脉冲持续时间：5m。最后，加入1mL的LB培养基，并且悬液液在37℃孵育1小时。之后，制备转化细胞的系列稀释液。在加入了氨苄青霉素(100μg/mL)作为pRC/A6-A7质粒选择抗生素的培养基的平板上对其进行培养。37℃持续培养直到出现抗性克隆。
仅在得到的其中一个克隆中用HindIII限制性分析证实了腺病毒基因组的正确插入，其被称为pRcAd2。
pRcAd2质粒包括腺病毒的全基因组，除了位于位置190和3528之间并且对应于E1区的区域。该序列被I-SceI限制性靶限定，并且在它的5‘端具有attB序列(图5)。
实施例3：用于生产和包装高容量腺病毒载体的稳定细胞系的构建和表征
本发明计划生产设计用于生产和包装高容量腺病毒载体的稳定细胞系。这些细胞将能够产生对于病毒复制、装配和行使功能所必须的所有元件。
由于高水平的病毒蛋白质引起的细胞毒性，由米非司酮诱导的转录调节系统控制基因E1a和E1b的表达，该系统也能指导腺病毒基因组剩余部分的表达和复制。依次地，这个相同的系统控制腺病毒基因组的释放物整合进入真核细胞的基因组所必须的I-SceI限制性核酸内切酶的产生，其提供了第二水平的转录控制。诱导反应(并且因此产生病毒颗粒)在加入到含米非司酮或其类似物RU486的培养基时开始。
由于在整个生产过程中，并不需要使用辅助病毒，由本发明人发明的系统允许病毒产物提取，且不含有包含所述辅助病毒基因组拷贝的病毒颗粒的不期望的残余污染物。
在本实施方案中，人类肺癌A549细胞系用于非依赖性高容量辅助载体生产系统的设计。该细胞系由Giard等人(1973，J.Natl.Cancer Inst.，51：1417-1423)最先发现，并且随后被Lieber等人(1976，Int.J.Cancer.，17：62-70)深度研究，其对腺病毒感染有高度敏感性，具有作为病毒生产线的高度潜能(Smith et al.，1986，J.Clin.Microbiol.，24：265-268)。该细胞易于培养，没有形态学上的变异，并且在培养10和14天之间仍然能够繁殖，而没有表现出重要的蜕化信号。
实施例3.1 通过转染pRcAd2质粒用于腺病毒基因组(B多核苷酸)稳定 整合的细胞系的产生
为了产生能够补充涉及复制、壳体形成和高容量腺病毒包装的病毒蛋白合成的包装细胞系，A549细胞在37℃，5％CO2下于10cm2板中孵育，直到达到80％融合(confluence)。用具有3ug的pRcAd2构建体(提供新霉素抗性(neor))和1ug的pCMV-Int质粒的脂质体共转染细胞(Groth等人.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：5995-6000)，其编码酿酒酵母PhiC31噬菌体的整合酶，并且促使质粒稳定整合进细胞基因组(图6A)。
两个质粒的DNA预先稀释在500μl不含OPTI-MEM血清(Gibco
Figure BPA00001308537900411
：Invitrogen，Carlsbad CA92008，USA)的培养基中。为了加强DNA和阳离子脂质体之间的复合物的形成，以1∶0.75(DNA∶Plus Reagent)的比例加入反应物Plus Reagent(Invitrogen)。室温孵育5分钟之后，加入6μl脂质体LTX(Invitrogen)，并且混合物再在室温孵育25分钟。之后，稀释液逐滴加入以下细胞培养基DMEM中，其添加有：10％胎牛血清(Gibco
Figure BPA00001308537900412
)；1％L-谷氨酰胺(200mM，于0.85％NaCl中；Lonza Ibérica，08006巴塞罗那，西班牙)，以及1％青霉素/链霉素(10mg/mL，在0.85％NaCl中)；Gibco
Figure BPA00001308537900413
)。在37℃，5％CO2条件下孵育4小时后，用新鲜DMEM培养基替换原培养基，并且继续培养24小时。最后，去掉培养基，之后用1X磷酸盐缓冲溶液(PBS)(Gibco)清洗，用胰蛋白酶(Trypsin-EDTA；Gibco)悬浮转染细胞，并且室温下以1250rpm离心5分钟。细胞沉淀重悬在6mL培养基中，并且分布在3个60cm2的板中。新鲜培养基中加入浓度为600ug/mL的新霉素类似物，在此还补充选择抗生素G418。每两天更换一次培养基，直到出现抗抗生素的分离的克隆(2-3周)。用胰蛋白酶悬浮细胞克隆，并且转移到含选择培养基的0.3cm2孔中，继续培养直到达到80％融合，并且之后转移到更大表面积的孔中。这些连续步骤之后，分离抗G418的克隆，并且命名为pRc-1。为了证实该克隆的稳定性，细胞培养4个月而没有观察到任何形态学或者增殖能力的改变。
为了在分离的克隆中确定pRcAd2质粒的的整合，用QIAmp DNA微试剂盒(Qiagen)系统按照产品说明书提取pRc-1克隆的基因组DNA。DNA用于巢式-PCR分析以检测腺病毒基因IIIa、IV、编码蛋白酶的基因，以及编码病毒聚合酶的基因的存在。用于检测的引物为：
Figure BPA00001308537900421
用巢式-PCR(引物1和2)的外部引物的PCR反应在以下条件下进行：1U的Taq聚合酶(BioTaq，Bioline)，PCR缓冲液(Bioline)，1.5mM MgCl2，每种dNTP 0.4mM，每种引物10pmol，DNA和无菌去离子水，直到终体积为50μl。扩增的条件如下：94℃，2分钟，1个循环；94℃，50秒的变性，用引物杂交50秒(Tm根据待扩增的基因，见表)并且在72℃，延伸50秒；94℃，50秒的变性；用引物杂交50秒(Tm根据待扩增的基因，见表)并且在72℃，延伸50秒，35个循环；在72℃最终延伸，7分钟，1个循环。用巢式-PCR内部引物(引物3和4)进行的扩增反应从之前的PCR反应中取2μL，并且在以下条件下进行：1U的Taq聚合酶(BioTaq，Bioline)，PCR缓冲液(Bioline)，2.5mM MgCl2，每种dNTP 0.4mM，每种引物10pmol，DNA和无菌去离子水，直到终体积为50μL。在这种情况下，扩增条件为：94℃，变性50秒，用引物杂交50秒(Tm根据待扩增的基因，见表)并且在72℃，延伸50秒，35个循环；1个循环，在72℃最终延伸，7分钟。
attB区的缺失也用引物attB-P1、ttBp2通过PCR反应证实(实施例2)。PCR反应在以下条件下进行：1U的Taq聚合酶(BioTaq，Bioline)，PCR缓冲液(Bioline)，4mM MgCl2，每种dNTP 0.4mM，每种引物10pmol，DNA和无菌去离子水，直到终体积为50μl。扩增反应的条件如下：95℃变性，4分钟，1个循环；94℃，50秒的变性，50℃，引物第一次杂交40秒，72℃，延伸40秒，29个循环；在72℃最终延伸，5分钟，1个循环。
为了分析扩增产物，样本与1.5μL的上样溶液混合(0.25％溴酚蓝在蒸馏水中；40％甘油；100mM EDTA)并且在具有TAE 1X缓冲溶液(40mM Tris碱；20mM冰醋酸；1mM EDTA，pH 8.0)的琼脂糖凝胶(1％)中电泳分析，用溴化乙锭(0.5μg/ml)染色显示DNA。
所得到的结果(图6B)证实了B多核苷酸在真核细胞A549基因组中的正确整合。attB区的缺失进一步证实了所述整合被PhiC31整合酶特异性地单向地介导。
随后，并且为了检测腺病毒基因的表达，在37℃，5％CO2条件下，在20cm2板中孵育pRC-1克隆，直到达到80％融合。此时，用5ug稀释的pGal4-2RU-SceI-E1构建体，Plus Reagent(1∶0.75)和12μL脂质体LTX，按照之前提到的步骤转染细胞。在浓度为10-8M的RU486诱导物存在的条件下，通过一个板的双份孵育来进行转染。孵育48小时后，细胞用1ml的TRIZOL(Invitrogen)裂解，并进一步按照产品说明书提取总RNA。该RNA用于使用腺病毒基因特殊引物的反转录分析(RT)-PCR。
基因  引物  序列                             SEQ ID NO：
IVa2  PRC1  5′-TGATCCAGTCGTAGCAGGAG-3′     35
      PRC4  5′-ACGATCTCATCCTGGAACAC-3′     36
III   III1  5′-GCCAGTGGCGGCGGCGCTGGG-3′    37
      III2  5′-CCGATGTCGCTTTCCAGAACC-3′    38
E4    E4-1  5′-CGTGCGAGGTCTTCCCTGCAG-3′    39
      E4-2  5′-CTACATGGGGGTAGAGTCATA-3′    40
为了这些分析，在反应缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.4；2mM MgCl2；50mM KCl)中，1μg RNA预先用1单位DNA酶(DNasaI amplification grade；Invitrogen)处理，终体积为10μl。反应在室温下孵育15分钟，并且通过加入1μL的25mM EDTA溶液并在65℃孵育10分钟使DNA酶失活。在cDNA合成反应中，使用625ng不含DNA的RNA。样本同10pmol的特异性引物，1μL的dNTPs(10mM)和水混合直到终体积13μl后，开始反转录反应。在65℃孵育5分钟之后，混合物在冰中冷却，并使用2μL 0.1M DTT和4μL的反应缓冲液(250mM Tris-HCl，pH 8.3；375mM KCl；15mM MgCl2)。最后，在37℃新孵育2分钟之后，加入200U的M-MLV反转录酶(Invitrogen)并且继续在37℃孵育50分钟。之后，得到的cDNA在PCR反应中作为模板，以扩增用于研究的基因的转录产物。在所有情况下，用基因组DNA作为阴性对照和检查污染物存在，包括的扩增反应使用DNA酶处理的RNA作为模板。用于从反转录反应获得的cDNA进行PCR反应的扩增条件同用基因组DNA的扩增反应的条件相同。
在图7中，这些分析的结果证实了稳定整合进真核细胞染色体的腺病毒基因的转录能力。
最后，为了证实细胞从病毒mRNA产生病毒蛋白质的能力，通过免疫细胞化学分析法分析病毒壳体的蛋白质检测。为了诱导蛋白质合成，pRc-1克隆预先用pGal4-2RU-SceI-EI构建体转染。转染分两组进行，在RU486诱导物存在和不存在的条件下孵育细胞。孵育24小时后，细胞用胰蛋白酶离壁，并且8x104细胞转移到4室培养载波片(BD Falcon Cμltureslide；BD Biosciences，Erembodegem 9320，Belgium)，加入新的含有和不含有诱导物RU486的培养基。随后一天，去掉培养基，并且用PBS清洗细胞。之后，细胞用-20℃预冷的丙酮∶甲醇(1∶1)溶液固定。残留的固定溶液在室温挥发(30分钟)，并且载波片用1X PBS浸泡。用PBS清洗3次，每次3分钟，之后，用预先用PBS稀释(1∶75)的第一抗体(小鼠抗-腺病毒单克隆抗体混合物；Millipore Ibérica，28050 Madrid，西班牙)杂交。所述杂交反应在4℃，黑暗、潮湿的室中过夜进行。第二天，过量抗体用PBS清洗(3次，每次3分钟)并且用同样在PBS中稀释(1∶400)的第二抗体(免疫纯山羊抗小鼠IgG-过氧化酶；PierceBiotechnology，Rockford IL61105，USA)进行杂交。杂交反应在室温、黑暗条件下孵育45分钟。再一次样本用1X PBS清洗3次，并且按照产品说明书用DAB色原(DakoCytomation Liquid DAB Substrate Chromogen System；Dako Diagnósticos，Sant Just Desvern E-08960，Barcelona，Spain)显色。为了细胞核的特异性染色，样本用Mayer’s Hematoxilin(5s)反染色，并且15分钟后在水中清洗。样本通过在70％、96％和100％的乙醇中浸泡1分钟以及在二甲苯中浸泡10分钟，进行脱水。
在样本中检测到的棕色着色证实了病毒壳体蛋白质的合成。尽管在没有诱导物时也检测到了这些蛋白质少量基础性的产生，免疫细胞化学的结果显示了在RU486诱导物存在的条件下在病毒蛋白质表达水平方面的明显区别，证实了米非司酮调控系统在整合到pRc-1克隆基因组的病毒基因表达的控制中的功能。
实施例3.2：用pGAl4-2RUSceI-E1质粒(多核苷酸A)的A549细胞的转 染，用于产生整合了E1区和I-SceI基因的稳定细胞系，E1区和I-SceI基因二者 都受米非司酮诱导的转录调节控制
在第二个实施方案中，设计了稳定的细胞系，其中本发明中限定的A2多核苷酸被整合(图1A)。因此，从而获得的细胞系具有对起始和控制包括B多核苷酸的腺病毒基因表达所必需的基因。这些基因，例如编码I-SceI限制性核酸内切酶基因和依次编码E1A和E1B蛋白的E1腺病毒区，相应位于由米非司酮调控的启动子的控制之下。A2多核苷酸包括调节因子GAL4-hPR-p65，因此，它将被同时整合进入细胞基因组。通过改造的细胞，所述反式激活因子将组成型表达。
为了获得该细胞系，A549细胞在37℃，5％CO2条件下，在10cm2培养板中孵育，直到达到80％融合。细胞用pGal4-2RUSceI-E1构建体(Zeomycin抗性基因(zeor))通过脂质体法转染，并且按照3.1部分所述步骤得到pRc-1克隆。细胞在加入了10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺、以及1％P/S、以及浓度为400ug/mL的抗生素Zeomycin的DMEM培养基中孵育。进行连续扩增之后，一个抗抗生素的克隆被分离，并且命名为Gal-13。因为对于pRc-1克隆，Gal-13克隆的稳定性通过它在超过4个月的培养和超过35连续扩增进行检测。
对细胞基因组DNA的PCR检测证实了腺病毒基因E1a和E1b、编码I-SceI核酸内切酶的基因和编码调节转录和被米非司酮诱导的GAL4-hPR-p65融合蛋白质的基因的存在。使用的引物是：
Figure BPA00001308537900461
细胞基因组DNA用QIAmp DNA微试剂盒系统(Qiagen)按照产品说明书提取并且PCR反应在以下条件下进行：1U的Taq聚合酶(BioTaq，Bioline)，PCR缓冲液(Bioline)，4mM MgCl2，每种dNTP 0.4mM，每种引物10pmol，DNA和无菌去离子水，直到终体积为50μl。扩增反应如下：95℃变性，4分钟，1个循环；94℃，50秒的变性，50℃引物第一次杂交40秒，72℃延伸40秒，29个循环；在72℃最终延伸，5分钟，1个循环。为了分析扩增产物，样本与1.5μL的上样溶液混合(0.25％溴酚蓝在蒸馏水中；40％甘油；100mM EDTA)并且它们在具有TAE 1X缓冲溶液(40mM Tris碱；20mM冰醋酸；1mM EDTA，pH 8.0)的琼脂糖凝胶(1％)中电泳分析，用溴化乙锭(0.5μg/ml)染色显示DNA。该扩增结果证实A2多核苷酸包括的基因正确整合进入了A549细胞的基因组(图8)。
之后，为了检测由米非司酮诱导的系统的基因表达调控能力，用Western Blot分析获得的蛋白质样本中E1A和I-SceI蛋白质的合成，所述蛋白质从在浓度为10-8M的RU486诱导物存在或不存条件下孵育的培养物中获得。蛋白质提取物在500μL的1X被动裂解缓冲液(Promega)中纯化，并且总蛋白水平用Bradford技术进行蛋白质定量以确定(Bradford，1976，Anal.Biochem.，72：248-254)。样本通过在间断聚丙烯酰胺-SDS凝胶和Laemli电泳缓冲液(25mM Tris-HCl；192mM甘氨酸；0.1％w/v SDS)中电泳进行分析。分离胶由在含有0.1％SDS的0.39M Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.8)的12％聚丙烯酰胺组成。0.1％PSA和0.94％TEMED作为催化剂使用。对于这个部分，堆积胶由在含0.1％SDS，0.1％PSA和0.01％TEMED的0.125M Tris-HCl(pH6.8)缓冲溶液的5％聚丙烯酰胺组成。在4℃，样本在转移缓冲液(0.3％Tris碱；186mM甘氨酸；20％甲醇)中用2小时转移到Hybond-P膜(GE Healthcare Europe)上。之后，膜在4℃在PBS+Tween(0.05％)的5％的牛奶溶液中封闭过夜。室温，在1％的牛奶+PBS-Tween溶液中用第一抗体进行杂交1.5小时。过量抗体用PBS-Tween清洗3次，每次10分钟去除。室温，在1％牛奶+PBS-Tween溶液中用第二抗体进行杂交30分钟。在E1A蛋白质检测中，使用抗体抗-腺病毒2E1A(小鼠)(1∶500)(Calbiochem
Figure BPA00001308537900481
：EMD，La Jolla CA92039-2087，USA)并且用免疫纯级山羊抗-小鼠IgG-过氧化物酶(1∶5000)(Pierce Biotechnology)作为第二抗体。而在检测I-SceI蛋白质的情况下，使用高亲和力的单一抗体抗-HA-过氧化物酶(1∶500)(Roche Diagnostics，08174 Barcelona，Spain)。用PBS-Tween溶液清洗膜3次，每次10分钟，之后，完成了膜制备。为此，按照产品说明书使用Western发光化学荧光反应物系统(Perkin-Elmer，28760Madrid，Spain)。所得到的结果如图9所示，并且证实了所分析蛋白质的正确产生，以及在诱导物存在的条件下，这些蛋白质表达水平的提高。但是，还必须考虑的是在诱导物不存在的条件下，受到调控影响的蛋白质仍有基本表达。
实施例3.3 用Gal4-2RUSceI-E1(多核苷酶A)和pRcAd2(B多核苷酶)质粒 双转染A549细胞生产稳定细胞系
为了得到具有在病毒颗粒产生过程中所有必需基因的独特的细胞系，抗Zeomycin克隆Gal-13(实施例3.2)用包含剩余腺病毒基因的pRcAd2(neor)构建体和编码PhiC31整合酶的pCMV-Int质粒转染。转染条件同获得Gal-13克隆使用的条件相同，并且在抗生素G418(600μg/mL)和Zeomycin(400μg/mL)存在的条件下筛选。筛选分离得到2个双抗性克隆(zeor+neor)，其分别称为GAd-1和GAd-6。两个克隆的形态学特征明显不同于亲本细胞系A549及其衍生品Gal-13。新转染的克隆倾向于球型并且尺寸更小。形态学上的改变可能是由于之前在Gal-13克隆中检测到的E1基因的基础转录，其为克隆进pRc-Ad2质粒和插入细胞基因组的剩余腺病毒基因转录所必须。但是，病毒蛋白质水平不明显影响细胞的稳定性和增殖能力，这在它们培养超过4个月期间已经被证实了。
为了证实在GAd-1和GAd-6克隆中pRcAd2质粒的整合，按照产品说明书用QIAmp DNA微试剂盒系统(Qiagen)提取基因组DNA。该DNA用于巢式-PCR分析，以检测腺病毒基因IIIa、IV、编码蛋白酶的基因和编码病毒聚合酶基因的存在。用于检测的引物同3.1部分所使用的一致。同样地，扩增反应也在与在3.1部分中描述的相同条件下进行。
扩增产物在具有TAE 1X缓冲溶液(40mM Tris Base；20mM冰醋酸；1mM EDTA，pH 8.0)的琼脂糖凝胶(1％)中电泳分析，并且通过用溴化乙锭(0.5μg/ml)染色使DNA可视化(图10)。
为了证实病毒蛋白质的合成，设计免疫细胞化学分析用于检测病毒壳体。在这种情况下，在浓度为10-8M的RU486诱导物存在和不存在的两个条件下，孵育GAd-1和GAd-6克隆48小时。之后，6x104细胞被转移到4孔培养板(BD Falcon Cμltureslide；BD)中，并且同在pRc-1细胞系情况下所做的一样，小鼠抗腺病毒单克隆抗体混合物(Millipore)在PBS(1∶75)中稀释作为第一抗体，并且抗体免疫纯级山羊抗-小鼠IgG-过氧化物酶(Pierce Biotechnology)也在PBS中稀释(1∶400)作为第二抗体。
在样本中检测到的棕色着色证实了病毒壳体蛋白的合成。但是，在RU486诱导物存在和不存在的条件下孵育的样本没有检测到明显的不同。因此，逃离了转录调节子GAL4-hPR-p65的控制的E1蛋白的基础表达对于启动整合到细胞基因组中的剩余腺病毒基因的表达是足够的。
实施例4：KCZ无肠病毒的感染颗粒的生产和包装
实施例4.1：用两个质粒通过共转染系统在pRc-1包装细胞系中的KCZ病 毒的生产和包装
在本实施例中，选自实施例3.1产生的细胞系的克隆用于高容量腺病毒或者无肠腺病毒的生产和包装。这个生产系统使得不需要使用辅助病毒作为在pRcAd2质粒中删除的基因的补充并且稳定整合进真核细胞染色体中的高容量腺病毒的病毒提取物成为可能。
为了补偿E1区的缺失，在生产步骤的每一步中，该系统需要用pGal4-2RU-SceI-E1质粒转染细胞系。该补充质粒从由米非司酮调节的诱导启动子表达E1a和E1b基因，这些基因将启动剩余腺病毒基因的表达。而且，整合的病毒基因组仅可能在I-SceI核酸内切酶时表达复制。I-SceI核酸内切酶包括在pGal4-2RU-SceI-E1质粒中，并且也在转录水平被GAL4-hPR-p65调节子控制。因此，病毒基因的释放和它的复制的起始将允许获得它的多拷贝和用于高容量腺病毒壳体化的充分水平的病毒蛋白和在高滴度的纯化。
为了检测该系统产生感染性颗粒的能力，在37℃，5％CO2条件下，pRc-1克隆的8x105细胞在20cm2培养板中孵育，直到达到80％融合。之后，用5ug的pGal4-2RU-SceI-E1和12ug的KCZ无肠载体共转染细胞。KCZ无肠载体预先用限制性酶PmeI消化，以除去复制区、氨苄青霉素抗性基因，并且使载体的ITR末端自由化，作为报告基因，KCZ载体携带有细菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)。
在共转染中，脂质体作为一个系统被用于DNA在真核细胞的整合，因此，两种质粒的DNA预先稀释在1ml不含OPTI-MEM(Gibco
Figure BPA00001308537900501
)血清的培养基中，为了增强DNA和阳离子脂质体之间复合物的形成，Plus Reagent(Invitrogen)反应剂以1∶0.75的比例加入。在室温孵育5分钟之后，加入12μL Lipofectamine LTX(Invitrogen)，并且混合物再在室温孵育25分钟。之后，稀释液逐滴地加入细胞培养基中(DMEM，加入10％胎牛血清)。在37℃，5％CO2条件下孵育4小时后，用添加了2％胎牛血清和浓度为10-8M的RU486诱导物的新鲜DMEM培养基替换。
由于没有观察到明显的细胞病变作用，细胞培养48～120小时，之后，在它们的各自培养基中在不用的时间点收集细胞。1250rpm离心5分钟之后，沉淀重悬在200μL的0.1M Tris-HCl(pH 8.0)溶液中，通过3次反复的冻融裂解细胞。细胞碎片被离心，并且上清的滴度通过感染了KCZ载体制剂的293S细胞的X-gal染色确定。为此，293S细胞在加入了2％胎牛血清和1％Na-丙酮酸酯的DMEM培养基的2cm2孔生长，直到达到80％融合。之后，去除培养基并且用稀释在2％DMEM+FBS+1％Na-丙酮酸酯中的病毒提取物的连续稀释液感染细胞。在37℃，5％CO2条件下孵育4小时后，加入新鲜培养基，进一步继续孵育48小时。最后，在室温用含0.5％戊二醛的PBS溶液固定细胞10分钟，环境温度下在PBS中清洗3次，并且用加入了20mM MgCl2、5mM K3Fe(CN6)和5mM K4Fe(CN6)，含1mg/mL的X-gal(5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-β-半乳糖皮蒽)的PBS在37℃染色4小时
根据获得的结果，当使用pRc-1克隆作为生产和包装细胞系时，0代的产量在48-72小时之后达到最大水平，并且大约7x105感染单位(ui)/mL。在进行的连续扩增中，这些提取物被用于感染新的预先用pGal4-2RU-SceI-E1质粒转染的pRc-1细胞。因此，所述系统允许摆脱了源自辅助病毒的感染性颗粒的高容量腺病毒提取物的回收，同样其以高产量水平获得。
实施例4.2 在GAd-1和GAd-6克隆的细胞中KCZ病毒的生产和包装。具 有高容量载体的独特转染系统
以下描述的生产系统使用改造的细胞系作为包装细胞，其中本发明所述的A2和B多核苷酸已经被稳定整合(图1A，1B)。除了对应高容量腺病毒载体的多核苷酸之外，该细胞系不需要其他额外元件(质粒或辅助病毒)以产生具有感染能力的病毒颗粒。
该系统在单个细胞中整合了对于高容量腺病毒(B多核苷酸)的壳体化和复制所必须的腺病毒基因，以及对于控制上述病毒蛋白质的高水平表达必需的E1区和I-SceI限制性核酸内切酶(A2多核苷酸)的基因。最后，生产过程的起始被来自他的相应诱导启动子和转录激活因子GAL4-hPR-p65的限制性核酸内切酶的表达和E1区基因的表达所调节。
在本发明的感染颗粒产生的实施例中，GAd-6和GAd-1包装细胞系用12ug的KCZ无肠载体转染，其编码β-半乳糖苷酶报告基因并且预先用PmeI限制性酶线性化，如实施例4.1所述。高容量载体的转染按照在用pRc-1包装细胞系(实施例4.1)的产生系统中所描述的步骤进行。
细胞在具有2％胎牛血清和存在浓度为10-8M的RU486诱导物的DMEM培养基中孵育48～120小时。在不同时间后，收集细胞，在1250rpm离心5分钟，并且细胞最后重悬在200μL的0.1M Tris-HCl溶液中。用3次反复冻融裂解之后，细胞残余物被离心，并且上清在293S细胞系中按照之前实施例中所描述的方案滴定。
使用Gad-1作为生产和包装细胞系，在0代的生产水平高至1.7x106感染单位(ui/mL)，同样对于GAd-6克隆，得到3x106ui/mL(图12)的滴度。
在前述实施例中，在进行连续扩增时，这些提取物被用于感染新的包装细胞。本发明实施方式中所述的系统不同于之前的两质粒共转染(实施例4.1)的系统或者其他的通过消除包装细胞在每一个运行的病毒扩增中的转染/感染过程的辅助病毒依赖系统。该特征明显地降低了生产时间并且提高产量。另一个极大的优势是不存在辅助病毒的污染，其简化了病毒纯化过程，并且允许充足数量的生产，以用于人类基因治疗过程。
Figure ISB00000453337900011
Figure ISB00000453337900021
Figure ISB00000453337900031
Figure ISB00000453337900041
Figure ISB00000453337900051
Figure ISB00000453337900071

Claims (28)

1.一种多核苷酸或一种表达载体，其包括：
(a)第一表达框，其包含编码转录调节子的核酸序列；
(b)第二表达框，其包含编码限制性核酸内切酶的核酸序列，且该核酸序列受由(a)限定的多核苷酸编码的转录调节子活化的转录调节序列的操作控制。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸或表达载体，其中由表达框(a)编码的转录调节子为可激活的转录调节子。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸或表达载体，其中可激活的转录调节子(a)由GAL4的DNA结合域、人孕酮受体的配体结合域和NF-kappaB p65的激活域组成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸或表达载体，其中由表达框(b)编码的限制性核酸内切酶为I-SceI。
5.一种多核苷酸或一种表达载体，其包含：
(a)第一表达框，其包含编码转录调节子的核酸序列；
(b)第二表达框，其包含编码限制性核酸内切酶的核酸序列，该核酸序列受由(a)限定的转录调节子活化的转录调节序列的操作调控；以及
(c)第三表达框，其包含编码选择的腺病毒E1A蛋白质或腺病毒E1A和E1B蛋白质的核酸序列，该核酸序列受由(a)限定的转录调节子活化的转录调节序列的操作调控。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸或表达载体，其中第二和第三表达框以反方向转录。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸或表达载体，其中控制第二和第三表达框的转录的调节子序列共享相同的转录调节子(a)的结合位点。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的多核苷酸或表达载体，其中由表达框(a)编码的转录调节子为可激活的转录调节子。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸或表达载体，其中可激活的转录调节子(a)由GAL4的DNA结合域、人孕酮受体的配体结合域和NF-kappaB p65的激活域组成。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的多核苷酸或表达载体，其中由表达框(b)编码的限制性核酸内切酶为I-SceI。
11.一种多核苷酸或表达载体，其包含一个核酸序列，该核酸序列包含一个重组腺病毒的基因组，所述重组腺病毒的基因组至少缺失ψ包装序列以及编码E1A或E1A/E1B蛋白质的序列，其中包含重组腺病毒的基因组的所述序列侧面有限制性核酸内切酶的特异性识别序列。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸或表达载体，其进一步包含整合酶特异性识别的核酸序列，其中整合酶识别序列在限制性核酸内切酶的第一识别序列的5’位置。
13.根据权利要求12所述的多核苷酸或表达载体，其中被整合酶识别、特别是被PhiC31整合酶识别的核酸序列为attB。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的多核苷酸或载体，其中核酸内切酶的识别序列为I-SceI核酸内切酶特异识别的序列。
15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸或表达载体。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其进一步包括，编码腺病毒E1A蛋白质的序列以及可选的编码腺病毒E1B蛋白质的序列。
17.一种宿主细胞，其包含根据权利要求5-10中任一项所述的多核苷酸或表达载体。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的宿主细胞，其进一步包括，根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸或表达载体，或其可通过将根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸整合到根据权利要求15-17中任一项所述的宿主细胞中获得的。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中源自根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸或表达载体的病毒基因组的侧面的限制性靶能够被限制性核酸内切酶特异性识别，限制性核酸内切酶位于被源自根据权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸的转录调节子(a)激活的转录调节子序列的操作控制下。
20.一种适合产生和包装高容量腺病毒的感染性颗粒的细胞的生产方法，所述方法包括：
(i)用根据权利要求1-4中任一项所述的第一多核苷酸或用包含所述多核苷酸的载体转染细胞，或使用根据权利要求5-10中任一项所述的多核苷酸或用包含所述多核苷酸的载体转染细胞，以及
(ii)用根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸或用包含所述多核苷酸的载体转染细胞
其中步骤(i)和(ii)可以以任意顺序进行或同时发生，并且其中如果步骤(i)中的细胞用权利要求1-4中任一项所述多核苷酸进行了转染，随后使用包含编码腺病毒E1A蛋白质以及可选的腺病毒E1B蛋白质的序列的细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)包括附加的筛选步骤，其中，基于存在于步骤(i)和(ii)中使用的多核苷酸上的选择标记，从而选出稳定整合第一和/或第二多核苷酸的细胞。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸进一步包含被整合酶特异性识别的核酸序列，并且步骤(ii)中执行的转染进一步包括，编码对于所述识别序列特异性的整合酶的核酸序列。
23.根据权利要求22所述的方法，其中特异性整合酶为链霉菌PhiC31噬菌体的整合酶，并且其中特异性识别位点为attB位点。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法生产的细胞。
25.一种生产高容量腺病毒的系统，其包括：
(a)根据权利要求15-19和24中任一项所述的细胞，以及
(b)高容量腺病毒。
26.一种生产高容量腺病毒载体的方法，其包括如下步骤：
(a)用多核苷酸或包含所述多核苷酸的表达载体转染或感染宿主细胞，所述多核苷酸包含想要生产的高容量腺病毒的基因组；
(b)在允许高容量腺病毒复制和包装的条件下培养转染/感染的细胞；
(c)再生高容量腺病毒的病毒颗粒，以及，可选的
(d)重复步骤(a)到(c)，其中步骤(c)中生产的高容量病毒颗粒用于后续的循环的步骤(a)中；
其中步骤(a)中使用的宿主细胞选自如下的组：
(i)细胞，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸以及编码腺病毒E1A蛋白质和可选的腺病毒E1B蛋白质的序列，该情况下在步骤(a)之前或执行同时用根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达载体转染，
(ii)细胞，其包含根据权利要求5-10中任一项所述的多核苷酸，该情况下，在步骤(a)之前或执行同时用根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达载体转染，
(iii)细胞，其包含根据权利要求11-14任中任一项所述的多核苷酸，该情况下在步骤(a)之前或执行同时用根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸转染，其中细胞包含编码腺病毒E1A蛋白质和可选的腺病毒E1B蛋白质的序列，
(iv)细胞，其包含根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸，该情况下，在步骤(a)之前或执行同时用根据权利要求5-10中任一项所述的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达载体转染，
(v)细胞，其包含权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，根据权利要求11-14任一项所述的多核苷酸，以及编码腺病毒E1A蛋白质和可选的腺病毒E1B蛋白质的序列，以及
(vi)细胞，其包含根据权利要求5-10中任一项所述的多核苷酸和根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸。
27.根据权利要求26所述的方法，步骤(b)的培养在存在转录调节子的特异性诱导剂的条件下进行，所述转录调节子由包含在根据权利要求1-4和5-10中任一项所述的多核苷酸的核酸序列编码。
28.根据权利要求27所述的方法，其中转录调节子由GAL4的DNA结合域、人孕酮受体的配体结合域以及NF-kappaB p65的激活域组成，并且诱导剂为合成的抗孕素，优选为米非司酮。
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