DE60018171T3

DE60018171T3 - Verwendung von adenovirus e1 protein kodierenden sequenzen, zur herstellung von rekombinanten proteinen in menschlichen zellen.

Info

Publication number: DE60018171T3
Application number: DE60018171T
Authority: DE
Inventors: Guus Hateboer; Cornelia Karina VERHULST; Johan Govert SCHOUTEN; Gerardus Alphonsus UYTDEHAAG; Abraham Bout
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-17
Publication date: 2010-05-20
Anticipated expiration: 2020-04-18
Also published as: DE60043273D1; WO2000063403A3; EP1533380A3; CN100457914C; CN1360638A; PT1161548E; EP2163640A1; EP2163640B1; CA2370477A1; DK1161548T4; HK1048138B; EP1533380B1; ATE536417T1; CY1109759T1; ES2237420T3; EP1161548A2; DK1533380T3; NO20014977D0; JP4210036B2; DK2163640T3

Description

Die Erfindung betrifft die in den Patentansprüchen definierten Ausführungsformen. Somit betrifft sie den Bereich der Herstellung rekombinanter Proteine, insbesondere die Verwendung einer menschlichen Zelle zur Herstellung von Proteinen. Des Weiteren betrifft die Erfindung den Bereich der Herstellung monoclonaler Antikörper, insbesondere die Verwendung einer menschlichen Zelle zur Herstellung monoclonaler Antikörper. Des Weiteren betrifft die Erfindung den Bereich der Herstellung viraler Proteine. Die Erfindung ist besonders verwendbar zur Herstellung von Impfstoffen zum Schutz vor viralen Pathogenen bei Vertebraten, besonders bei Säugern und speziell beim Mensch.
Verfahren und Zusammensetzungen werden hiermit zur Herstellung rekombinanter Proteine offenbart. Die Erfindung ist besonders verwendbar zur Herstellung von Proteinen, die post-translationale oder peri-translationale Modifikationen wie die Glycosylierung und die richtige Faltung erfordern.
Die Expression humaner rekombinanter Proteine in heterologen Zellen ist gut dokumentiert worden. Es sind viele Herstellungssysteme, reichend von Bakterien, Hefen und Pilzen bis zu Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, für rekombinante Proteine erhältlich geworden. Dennoch sind einige Herstellungssysteme trotz dieser Entwicklungen noch nicht optimal oder nur zur Herstellung spezifischer Proteinklassen geeignet. So können beispielsweise Proteine, die post- oder peri-translationale Modifikationen wie die Glycosylierung, γ-Carboxylierung oder γ-Hydroxylierung erfordern, in prokaryontischen Herstellungssystemen nicht hergestellt werden. Ein anderes gut bekanntes Problem mit prokaryontischen Expressionssystemen ist die häufig falsche Faltung des herzustellenden Produktes, was in vielen Fällen sogar zu unlöslichen Einschlusskörpern führt. Eukaryontische Systeme stellen eine Verbesserung dar, besonders bei der Herstellung von Proteinen, die von Eukaryonten stammen, aber die erhältlichen Herstellungssysteme leiden noch unter einer Vielzahl an Rückschlägen. So beeinflusst beispielsweise die Hypermannosylierung in Hefestämmen die Fähigkeit von Hefen, Glycoproteine richtig zu exprimieren. Verabreicht man ein auf diese Weise hergestelltes, therapeutisches Protein einem Patienten, führt Hypermannosylierung oft sogar zu Immunreaktionen. Des Weiteren unterscheiden sich die Sekretionssignale der Hefe von den Signalen der Säuger, was zu einem erschwerten Transport von Säugerproteinen, einschließlich humaner Polypeptide, in den Extrazellularraum führt, was wiederum zu Problemen bei der kontinuierlichen Herstellung und/oder Isolation führt. Man verwendet Säugerzellen in großem Umfang zur Herstellung derartiger Proteine, weil sie in der Lage sind, beträchtliche post-translationale Modifikationen durchzuführen. Die Expression rekombinanter Proteine in Säugerzellen hat sich in den vergangenen Jahren dramatisch entwickelt, was in vielen Fällen zu einer Routinetechnologie geführt hat. So sind besonders die Eizellen des Chinesischen Hamsters (CHO) zum routinemäßigen und üblichen Herstellungssystem für die Entwicklung biopharmazeutischer Proteine und von Proteinen für diagnostische Zwecke geworden. CHO-Zellen sind aufgrund einer Anzahl von Eigenschaften als Wirtszelle sehr geeignet: man erreicht mit CHO-Zellen ein außerordentlich hohes Produktionsniveau; die Zelllinie liefert ein sicheres Herstellungssystem, das frei von infektiösen oder Virus-ähnlichen Partikeln ist; CHO-Zellen sind umfangreich charakterisiert worden, obwohl die Geschichte der ursprünglichen Zelllinie unbekannt ist; bei Verwendung von serumfreien Kulturmedien können CHO-Zellen in Suspension in Bioreaktoren bis zu hoher Dichte wachsen; um ein einfaches Selektionssystem zu erhalten, hat man von CHO durch die Einführung eines exogenen dhfr-Gens mit anschließender gut kontrollierter Amplifikation der dhfr-Gene und des Transgens unter Verwendung von Methotrexat eine dhfr-Mutante (DG-44-Clon. Urlaub et al., 1983) entwickelt.
Dennoch werfen Glycoproteine oder Proteine, die mindestens zwei (verschiedene) Untereinheiten umfassen, weiterhin Probleme auf. Die biologische Aktivität von glycosylierten Proteinen kann durch die exakte Beschaffenheit der Oligosaccharidkomponente grundlegend beeinflusst werden. Die Art der Glycosylierung kann auch auf die Immunogenität, die Zielrichtung und die Pharmakokinetik des Glycoproteins signifikante Auswirkungen haben. In den vergangenen Jahren hat man große Fortschritte bei den zellulären Faktoren gemacht, die die Glycosylierung bestimmen und es sind viele Glycosyl-Transferase-Enzyme cloniert worden. Dies führte zu Forschungsvorhaben, die die Stoffwechselmodifikationen des Glycosylierungsapparates zum Ziel hatten (Fussenegger et al., 1999; Lee et al., 1989; Vonach et al., 1998; Jenkins et al., 1998; Zhang et al., 1998; Muchmore et al., 1989). Beispiele für derartige Strategien werden nachstehend beschrieben.
Den CHO-Zellen fehlt ein funktionelles α-2,6-Sialyltransferase-Enzym, was zu einer ausschließlichen Addition von Sialinsäuren an Galactose via α-2,3-Bindungen führt. Es ist bekannt, dass das Fehlen von α-2,6-Bindungen die Entfernung eines Proteins aus dem Blutstrom verstärken kann. Zur Überwindung dieses Problems wurden CHO-Zellen durch Transfektion der geeigneten Glycosyl-Transferasen so modifiziert, dass sie dem humanen Glycanprofil ähnlich sind. CHO-Zellen können auch keine Lewis^x-Oligosaccharide herstellen. Man hat CHO-Zellen entwickelt, die humane N-Acetyl-D-Glucosaminyl-Transferase und α-1,3-Fucosyl-Transferase III exprimieren. Im Gegensatz dazu ist bekannt, dass Nagerzellen, einschließlich CHO-Zellen, ein Enzym, das dem Menschen fehlt, die CMP-N-Acetylneuraminsäure-Hydrolase, die CMP-N-Acetyl-neuraminsäuren glycosyliert, produzieren (Jenkins et al., 1996). Die Proteine mit diesem Glycosylierungstyp können eine starke Immunantwort auslösen, wenn, man sie injiziert (Kawashima et al., 1993). Die kürzlich erfolgte Identifikation des Nagergens, das das Hydrolaseenzym codiert, wird sehr wahrscheinlich die Entwicklung von CHO-Zellen, denen diese Aktivität fehlt, erleichtern und wird diese Nagertyp-Modifikation verhindern.
Somit lehrt das Fachgebiet, dass es möglich ist, das Glycosylierungspotential von Säugerwirtszellen durch die Expression humaner Glycosyl-Transferase-Enzyme zu ändern. Dennoch, obwohl die CHO-abgeleiteten Glycanstrukturen auf den rekombinanten Proteinen diejenigen nachahmen können, die auf ihren natürlichen humanen Gegenstücken vorhanden sind, sind sie noch lange nicht mit ihnen identisch. Ein anderes mögliches Problem besteht darin, dass nicht alle Glycosylierungsenzyme cloniert wurden und deshalb für eine Stoffwechselmodifikation erhältlich sind. Der therapeutische Einsatz von Proteinen, die sich von ihren natürlichen humanen Gegenstücken unterscheiden, kann zu einer Aktivierung des Immunsystems des Patienten führen und unerwünschte Reaktionen auslösen, die sich auf die Wirksamkeit der Behandlung auswirken können.
Andere Probleme bei der Verwendung von nicht-menschlichen Zellen können von der falschen Faltung der Proteine, zu der es während oder nach der Translation kommt, herrühren, was von der Anwesenheit der verschiedenen erhältlichen Chaperonproteine abhängig sein könnte. Eine abnormale Faltung kann vorkommen und zu einer Abnahme oder zum Verlust der biologischen Aktivität des Proteins führen. Des Weiteren ist es sehr wichtig, dass die verschiedenen Polypeptide, die zusammen Proteine wie monoclonale Antikörper bilden werden, die aus den verschiedenen Untereinheiten bestehen, gleichzeitig in den korrekten relativen Mengen exprimiert werden. Menschliche Zellen werden alle erforderlichen Eigenschaften zur korrekten Expression und Bildung von humanen Proteinen besser bereitstellen können.
Somit ist es offensichtlich wünschenswert, zur Herstellung humaner rekombinanter Proteine Verfahren. zu haben, die eine menschliche Zelle benutzen, die eine einheitliche, für den Menschen typische Prozessierung wie post-translationale und peri-translationale Modifikationen wie die Glycosylierung, die vorzugsweise auch für eine Produktion in großem Umfang geeignet ist, liefert.
Somit liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von wenigstens einer proteinartigen Substanz in einer Zelle, umfassend eine eukaryontische Zelle, die eine Sequenz hat, die E1A- und E1B-Proteine eines Adenovirus oder eines funktionellen Homologs, Fragments und/oder eines Derivats davon in ihrem Genom codiert, wobei die Zelle aus ihrem Genom kein strukturelles adenovirales Protein oder eine darin integrierte Sequenz codiert und wobei die Zelle von einer humanen embryonalen Retinoblastenzelle (HER) stammt, wobei das Verfahren das Einführen eines Gens, das eine rekombinante proteinartige Substanz codiert, und in das Genom integriert ist, in die Zelle, das Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Medium und das Ernten von mindestens einer proteinartigen Substanz aus der Zelle und/oder dem Medium umfasst. Eine proteinartige Substanz ist eine Substanz, die mindestens zwei Aminosäuren umfasst, die durch eine Peptidbindung verknüpft sind. Die Substanz kann außerdem ein oder mehrere andere Moleküle umfassen, die physikalisch an den Aminosäureteil gebunden sind oder nicht. Zu den nicht-begrenzenden Beispielen für derartige andere Moleküle gehören Kohlenhydrat- und/oder Lipidmoleküle. Nucleinsäuren, die ein strukturelles Protein eines Adenovirus codieren, sollten aus mehreren Gründen nicht vorhanden sein. Einer dieser Gründe liegt darin, dass die Anwesenheit eines strukturellen Proteins von einem Adenovirus in einer Zubereitung des hergestellten Proteins in vielen Anwendungen eines derartig hergestellten Proteins höchst unerwünscht ist. Eine Entfernung eines derartigen strukturellen Proteins aus dem Produkt erreicht man am besten, indem man sein Vorkommen in der Zubereitung verhindert. In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die proteinartige Substanz, die aus der Zelle geerntet wurde, und die Zelle selbst von derselben Spezies. Soll das Protein beispielsweise an Menschen verabreicht werden, so ist es vorzuziehen, dass beide, die Zelle und die proteinartige Substanz, die aus der Zelle geerntet wurde, vom Menschen stammen. Ein Vorteil einer menschlichen Zelle liegt darin, dass die meisten der kommerziell attraktivsten Proteine vom Menschen stammen. Die proteinartige Substanz, die aus der Zelle geerntet wird, kann jede proteinartige Substanz sein, die von der Zelle hergestellt wird. In einer Ausführungsform wird mindestens eine der geernteten proteinartigen Substanzen von diesem Gen codiert. In einer anderen Ausführungsform wird zur Verstärkung und/oder zur Induktion der Expression von einem oder mehreren endogen vorhandenen Genen in einer Zelle ein Gen in die Zelle eingefügt. Zum Beispiel indem man in die Zelle ein Gen einfügt, das ein Protein codiert, das die Expression der proteinartigen Substanz in der Zelle verstärken kann.
Mit einem Gen ist eine Nucleinsäure gemeint, umfassend eine Nucleinsäure von Interesse in einem exprimierbaren Format wie etwa eine Expressionskassette. Die Nucleinsäure von Interesse kann vom natürlichen Promotor oder von einem Derivat davon oder von einem vollständig heterologen Promotor exprimiert werden. Die Nucleinsäure von Interesse kann Introns enthalten oder nicht. Entsprechend kann es sich um eine cDNA oder um eine cDNA-ähnliche Nucleinsäure handeln. Die Nucleinsäure von Interesse kann ein Protein codieren. Alternativ kann die Nucleinsäure von Interesse eine Antisense-RNA codieren.
Die Erfindung liefert außerdem ein Verfahren zur Herstellung von wenigstens einem humanen rekombinanten Protein in einer Zelle, umfassend das Versorgen einer Zelle, die von einer HER-Zelle abstammt und eine Sequenz hat, die E1A- und E1B-Proteine von einem Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon in ihrem Genom codiert, wobei die Zelle keine strukturellen adenoviralen Proteine bildet, mit einer Nucleinsäure, die das humane rekombinante Protein codiert und in das Genom integriert ist, das Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Medium und das Ernten von wenigstens einem humanen rekombinanten Protein aus dieser Zelle und/oder aus dem Medium. Bis zur vorliegenden Erfindung hat man, wenn überhaupt, kaum geeignete Zellen gefunden, um humane rekombinante Proteine auf reproduzierbare und steigerbare Weise herzustellen. Wir haben jetzt entdeckt, dass Zellen, die von HER-Zellen abstammen und die zumindest adenovirale E1A- und E1B-Sequenzen in ihrem Genom enthalten, in der Lage sind, relativ unabhängig von exogenen Wachstumsfaktoren zu wachsen (sie sind durch die Anwesenheit von E1 immortalisiert). Des Weiteren sind diese Zellen in der Lage, rekombinante Proteine in signifikanten Mengen zu produzieren, und sie können das rekombinante Protein, das gebildet wurde, korrekt prozessieren. Natürlich werden diese Zellen auch in der Lage sein, nicht-humane Proteine herzustellen. Die humanen Zelllinien, die verwendet wurden, um rekombinante Proteine in jeder signifikanten Menge herzustellen, sind oft Tumor-(transformierte)Zelllinien. Die Tatsache, dass die meisten menschlichen Zellen, die zur Herstellung rekombinanter Proteine verwendet wurden, von Tumoren abstammen, fügt der Arbeit mit diesen speziellen Zelllinien ein zusätzliches Risiko hinzu und führt zu sehr strengen Isolationsverfahren für das rekombinante Protein, um eine transformierende Aktivität oder tumorigenes Material im jeweiligen Protein oder in anderen Zubereitungen zu verhindern. Im erfindungsgemäßen Verfahren stammt die Zelle von einer primären HER-Zelle ab. Um auf unbestimmte Zeit zu wachsen, muss man eine primäre Zelle irgendwie immortalisieren, was in vorliegender Erfindung durch die Einführung von Adenovirus E1 erreicht worden ist. Es herrscht im Fachgebiet hinsichtlich der Grenze zwischen transformiert und immortalisiert noch Unklarheit. Wir meinen hier, dass sich der Unterschied darin zeigt, dass immortalisierte Zellen unbegrenzt wachsen, während der Phänotyp noch vorhanden ist und transformierte Zellen ebenfalls unbegrenzt wachsen, aber gewöhnlich eine dramatische Veränderung im Phänotyp aufweisen.
Um eine (kontinuierliche) Herstellung von rekombinanten Proteinen durch Zellkulturen in großem Umfang zu erreichen, wird es im Fachgebiet bevorzugt, Zellen zu verwenden, die zum Wachsen keine Verankerung brauchen. Die Zellen der vorliegenden Erfindung haben diese Fähigkeit. Die Fähigkeit, unabhängig von einer Verankerung zu wachsen, wird verbessert, wenn die Zellen eine Sequenz enthalten, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder ein Analog oder ein Fragment davon in ihrem Genom codiert, wobei die E2A-codierende Sequenz vorzugsweise eine temperatur-empfindliche Mutante E2A wie etwa ts125 codiert. Man verwendet vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Verfahren, um ein sauberes und sicheres Herstellungssystem zu haben, aus dem man einfach das gewünschte rekombinante Protein isoliert, wobei die menschliche Zelle keine anderen adenoviralen Sequenzen enthält. Für die Verfahren und Verwendungen der Erfindung wird die Zelle PER.C6 wie unter ECACC-Nr. 96022940 hinterlegt, oder ein Derivat davon am stärksten bevorzugt. PER.C6 lassen sich besser handhaben als beispielsweise transformierte menschliche 293-Zellen, die ebenfalls durch die E1-Region des Adenovirus immortalisiert wurden. PER.C6-Zellen wurden sehr ausführlich charakterisiert und dokumentiert, wobei sie sich für die Maßstabsvergrößerung, das Suspensionswachstum und die Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren wesentlich besser eignen. Besonders die Tatsache, dass PER.C6 auf höchst reproduzierbare Weise in Suspension gebracht werden kann, macht sie für eine Produktion in großem Umfang sehr geeignet. Des Weiteren ist die PER.C6-Zelllinie durch das Wachstum in Bioreaktoren, wo sie zu sehr hohen Dichten heranwächst, gekennzeichnet worden.
Die erfindungsgemäßen Zellen, insbesondere PER.C6, haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie in Abwesenheit von Serum, das vom Tier oder vom Mensch stammt, oder von Serumkomponenten, die vom Tier oder vom Mensch stammen, gezüchtet werden können. Somit ist eine Isolation einfacher, während die Sicherheit gleichzeitig aufgrund des Fehlens von zusätzlichen menschlichen oder tierischen Proteinen in der Kultur erhöht wird und das System sehr zuverlässig ist (synthetische Medien sind am besten reproduzierbar). Des Weiteren fügt die Anwesenheit der Frühen Region 1A (E1A) des Adenovirus im Vergleich zu (menschlichen) Zelllinien, denen dieses bestimmte Gen fehlt, auf einer anderen Ebene Vorteile hinzu: man weiß, dass E1A als transkriptionaler Aktivator die Transkription des Enhancers/Promotors der Sehr Frühen Gene des Cytomegalievirus verstärkt (Olive et al., 1990; Gorman, et al., 1989). Ist das rekombinante Protein, das herzustellen ist, unter der Kontrolle des CMV-Enhancers/Promotors, nimmt das Expressionsniveau in diesen Zellen zu und nicht in Zellen, die kein E1A haben. Wie der CMV-Promotor sind auch E1A-Promotoren in Zellen, die ein oder mehrere E1A-Produkte exprimieren, aktiver als in Zellen, die solche Produkte nicht exprimieren. Man weiß, dass die Verstärkung der E1A-Expression tatsächlich ein Kennzeichen einiger anderer Promotoren ist. In der vorliegenden Erfindung werden derartige Promotoren als funktionelle Homologe von E1A-Promotoren betrachtet. Die Wirkung von E1A kann durch die Anziehungskraft von Transkriptionsaktivatoren des E1A-Promotors oder von einem Homolog davon und/oder durch die Entfernung/Verhinderung der Bindung von transkriptionalen Repressoren an den Promotor vermittelt werden. Die Bindung von Aktivatoren und Repressoren an einen Promotor erfolgt auf sequenzabhängige Art. Ein funktionelles Derivat und/oder Fragment eines E1A-Promotors oder Homologs davon umfasst daher zumindest die bindende Sequenz der Nucleinsäure von einem Aktivator und/oder Repressor, der von mindestens einem E1A-Protein reguliert wird.
Ein anderer Vorteil von Zellen der Erfindung liegt darin, dass sie das E1B-Gen des Adenovirus konstitutiv beherbergen und exprimieren. Adenovirus E1B ist ein gut bekannter Inhibitor des programmierten Zelltodes oder Apoptose. Diese Hemmung geschieht sowohl durch die Bindung des 55K-E1B-Produktes an den Transkriptionsfaktor p53 als auch durch anschließende Hemmung (Yew und Berk, 1992). 19K-E1B, das andere Produkt der E1B-Region, kann die Apoptose verhindern, indem es die zellulären Todesproteine Bax und Bak, beides Proteine, die von p53 kontrolliert werden, bindet und dadurch hemmt (White et al., 1992; Debbas und White, 1993; Han et al., 1996; Farrow et al., 1995). Diese Eigenschaften können für die Expression von rekombinanten Proteinen, die, wenn sie überexprimiert werden, über einen p53-abhängigen Weg an der Induktion der Apoptose beteiligt sein könnten, äußerst hilfreich sein.
Des Weiteren liefert die Erfindung die Verwendung einer Zelle, die von einer HER-Zelle abstammt, zur Herstellung eines humanen rekombinanten Proteins, wobei die Zelle eine Sequenz hat, die E1A- und E1B-Proteine eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon in ihrem Genom codiert, und die Zelle keine strukturellen adenoviralen Proteine produziert. In einer anderen Ausführungsform liefert die Erfindung eine derartige Verwendung, wobei die menschliche Zelle von einer primären Zelle abstammt, und vorzugsweise eine PER.C6-Zelle oder ein Derivat davon ist. Des Weiteren liefert die Erfindung eine erfindungsgemäße Verwendung, bei der die Zelle des Weiteren eine Sequenz umfasst, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analog oder Fragment davon in ihrem Genom codiert, wobei E2A vorzugsweise temperaturempfindlich ist.
Die Erfindung stellt auch ein humanes rekombinantes Protein bereit, das man mit einem erfindungsgemäßen Verfahren oder durch eine erfindungsgemäße Verwendung erhält, wobei das humane rekombinante Protein ein humanes Glycosylierungsmuster hat, das sich von dem isolierten natürlichen humanen Gegenstück unterscheidet.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine menschliche Zelle bereit, die von einer HER-Zelle stammt und eine Sequenz hat, die E1A und E1B eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon in ihrem Genom codiert, wobei die Zelle keine strukturellen adenoviralen Proteine herstellt und ein Gen besitzt, das ein humanes rekombinantes Protein codiert, das in das Genom der Zelle integriert ist und einen monoclonalen Antikörper oder Erythropoietin oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon codiert, und vorzugsweise eine menschliche Zelle ist, die von PER.C6 abstammt, wie unter ECACC-Nr. 96022940 hinterlegt.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine derartige menschliche Zelle, PER.C6/E2A, bereit, die des Weiteren eine Sequenz enthält, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analog oder Fragment davon in ihrem Genom codiert, wobei E2A vorzugsweise temperaturempfindlich ist.
Die Proteine, die mit den Verfahren der Erfindung exprimiert werden sollen, sind dem Fachmann gut bekannt. Es handelt sich vorzugsweise um humane Proteine, die in der Natur vorzugsweise eine bestimmte Prozessierungsart durchlaufen, wie etwa die Sekretion, die oder der durch Chaperone kontrollierte Faltung und/oder Transport, die Co-Synthese mit anderen Untereinheiten, die Glycosylierung oder die Phosphorylierung. Typische Beispiele für eine therapeutische oder diagnostische Verwendung schließen monoclonale Antikörper, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, den gewebespezifischen Plasminogen-Aktivator (tPA), den Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF) und das humane Erythropoietin (EPO) ein. EPO ist ein typisches Produkt, dessen Aktivität und Immunogenität, besonders in vivo, stark von seinem Glycosylierungsmuster abhängt. Bisher kann man durch die Verwendung von CHO-Zellen relativ große Mengen an EPO erreichen, das im Vergleich zu EPO, das man aus menschlichem Urin gereinigt hat, anders glycosyliert ist, auch wenn es bei der Verstärkung der Erythrocytenbildung genauso aktiv ist. Die andersartige Glycosylierung dieses EPO führt jedoch in einem Empfänger zu Problemen mit der Immunogenität und zu Problemen durch eine veränderte Halbwertszeit.
Die vorliegende Erfindung offenbart für diesen Zweck auch eine neuartige immortalisierte HER-Zelllinie und die Herstellungsverwendungen davon. PER.C6-Zellen ( WO 97/00326 ) wurden mit Hilfe eines Plasmids, das die E1A- und E1B-codierenden Sequenzen (Ad5 Nucleotide 459–3510) des Adenovirus vom Serotyp 5 (Ad5) enthielt, unter der Kontrolle des humanen Phosphoglyceratkinase-Promotors (PGK) durch Transfektion von primären humanen embryonalen Retinazellen erzeugt. Folgende Merkmale machen PER.C6 als einen Wirt für die Herstellung rekombinanter Proteine besonders brauchbar: 1. vollständig gekennzeichnete humane Zelllinie; 2. entwickelt in Übereinstimmung mit GLP; 3. kann als Suspensionskultur in definiertem serumfreiem Medium ohne jegliche von Mensch oder Tier abgeleitete Proteine gezüchtet werden; 4. Wachstum passend zu Rollflaschen, Schüttelkolben, Spinnerkolben und Bioreaktoren mit Verdoppelungszeiten von etwa 35 Std.; 5. Anwesenheit von E1A, wodurch eine Hochregulierung der Expression der Gene, die vom CMV-Enhancer/Promotor kontrolliert werden, verursacht wird; 6. Anwesenheit von E1B, das die p53-abhängige Apoptose verhindert, die möglicherweise durch eine Überexpression der rekombinanten Transgene verstärkt wird.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren der Erfindung bereit, in dem die Zelle in der Lage ist, 2- bis 200-mal mehr rekombinantes Protein und/oder proteinartige Substanz herzustellen als herkömmliche Säuger-Zelllinien. Vorzugsweise werden die herkömmlichen Säuger-Zelllinien aus der Gruppe bestehend aus CHO-, COS-, Vero-, Hela-, BHK- und Sp-2-Zelllinien ausgewählt.
Unter einem Aspekt der Erfindung ist die proteinartige Substanz oder das Protein ein monoclonaler Antikörper. Antikörper, oder Immunglobuline (Igs), sind Serumproteine, die bei der humoralen Immunantwort eine zentrale Rolle spielen, indem sie Antigene binden und inaktivieren oder die Entzündungsreaktion auslösen, was zu ihrer Eliminierung führt. Antikörper sind in der Lage zu hochspezifischen Interaktionen mit einer großen Vielfalt von Liganden, einschließlich Tumor-assoziierten Markern, viralen Hüllproteinen und Glycoproteinen der Zelloberfläche von Lymphocyten. Sie sind daher potentiell sehr nützliche Mittel für die Diagnose und Behandlung menschlicher Erkrankungen. Die rekombinante monoclonale und einkettige Antikörpertechnologie eröffnet neue Perspektiven für die Entwicklung neuartiger therapeutischer und diagnostischer Mittel. Man hat monoclonale Antikörper der Maus als therapeutische Mittel in einer großen Vielfalt von klinischen Versuchen zur Behandlung von infektiösen Krankheiten und von Krebs verwendet. Der erste Bericht über die Behandlung eines Patienten mit einem murinen monoclonalen Antikörper wurde 1980 veröffentlicht (Nadler et al., 1980). Die Wirkungen, die man mit diesen Mitteln beobachtet hat, waren jedoch im Allgemeinen ziemlich enttäuschend (für einen Überblick siehe Lowder et al., 1986, Mellstedt et al., 1991, Baldwin und Byers 1986). Rekombinante monoclonale Antikörper (Immunglobuline) werden traditionell von B-Zell-Hybridomen hergestellt. Solche Hybridome stellt man her, indem man eine Immunglobulin-bildende B-Zelle, die man zuvor anhand ihrer Spezifität ausgewählt hat, mit einer Myelomzelle der Maus verschmilzt und die B-Zelle dadurch immortalisiert. Die ursprüngliche Strategie zur Immortalisierung von B-Zellen der Maus wurde 1975 entwickelt (Köhler und Milstein). Immunglobuline, die man in solchen Hybridomen herstellt, haben jedoch den Nachteil, dass sie von der Maus stammen, was zu einer schwachen Antikörperspezifität, einer geringen Antikörperaffinität und zu einer schweren Wirt(host)-anti-Maus-Antikörperantwort (HAMA, Shawler et al., 1985) führt. Diese HAMA-Antwort kann zu Entzündung, Fieber und sogar zum Tod des Patienten führen. Antikörper der Maus haben im Menschen eine geringe Affinität und aus bisher unbekannten Gründen haben sie im menschlichen Kreislauf im Vergleich zu menschlichen Antikörpern (21 Tage, Frödin et al., 1990) eine extrem kurze Halbwertszeit (19–42 Stunden). Im Zusammenhang mit der Schwere der HAMA-Antwort hat das zur Entwicklung alternativer Strategien zur Erzeugung von mehr humanen oder vollständig humanisierten Immunglobulinen geführt (Überblick bei Owens und Young 1994, Sandhu 1992, Vaswani et al., 1998). Eine dieser Strategien nutzt die konstanten Regionen des humanen Immunglobulins als Ersatz für die murinen Gegenstücke, was zu einer neuen Generation von ”chimären” und ”humanisierten” Antikörpern führt. Man wendet diese Herangehensweise an, da die HAMA-Antwort hauptsächlich auf den konstanten Domänen beruht (Oi et al., 1983; Morrison et al., 1984). Ein Beispiel für einen derartigen chimären Antikörper ist CAMPATH-1H (Reichmann et al., 1988). Der CAMPATH-1H-Ak, der bei der Behandlung des Non-Hodgkin-B-Zell-Lymphoms und der rheumatoiden refraktären Arthritis verwendet wird, richtet sich gegen das humane Antigen CAMPATH-1 (CDw52), das auf allen lymphoiden Zellen und auf Monocyten, aber nicht auf den anderen Zelltypen vorkommt (Haie et al., 1988, Isaacs et al., 1992). Andere Beispiele sind Rituxan (Rituximab), das gegen das humane CD20 (Reff et al., 1994) gerichtet ist, und 15C5, ein chimärer Antikörper, der sich gegen das humane Fragment-D-Dimer wendet (Vandamme et al., 1990, Bulens et al., 1991) und zur Abbildung von Blutgerinnseln verwendet wird. Da diese neue Generation chimärer Antikörper aber noch immer teilweise murin sind, können sie in Menschen eine Immunantwort auslösen, wenn auch nicht so schwer wie die HAMA-Antwort gegen Antikörper, die komplett von der Maus stammen.
Bei einer anderen, besser entwickelten Herangehensweise werden Bereiche von Resten, die sich in den variablen Domänen des Antikörpers befinden, die aber offensichtlich für die Antigenerkennung nicht essentiell sind, durch menschenähnlichere Aminosäuren-Abschnitte ersetzt, was zu einer zweiten Generation oder zu hyperchimären Antikörpern führt (Vaswani et al., 1998). Ein gut bekanntes Beispiel für diese Herangehensweise ist Herceptin (Carter et al., 1992), ein Antikörper, der zu 95% menschlich ist, sich gegen HER2 (ein tumorspezifisches Antigen) richtet und bei Brusttumor-Patienten verwendet wird.
Eine bessere Methode, rekombinante Immunglobuline der Maus zu ersetzen, wäre die Erzeugung humaner Immunglobuline. Da es bedeutenderweise unmoralisch ist, Menschen mit experimentellen biologischen Materialien zu immunisieren, ist es nicht möglich, anschließend spezifische B-Zellen zur Immortalisierung auszuwählen, wie es mit B-Zellen der Maus gezeigt wurde (Köhler und Milstein, 1975). Obwohl man B-Zellen von Patienten als spezifische Antikörper gegen Krebsantigene ausgewählt hat, ist es im Vergleich zu Antikörpern der Maus technisch schwieriger, humane Immunglobuline aus menschlichem Material herzustellen (Köhler und Milstein, 1975). Durch die Verwendung von Phagen-Display-Genbanken für Antikörper, die variable Domänen von menschlichem Ursprung exprimieren, wurde es möglich, einen rekombinanten Ansatz zur Herstellung vollständig humaner Antikörper zu entwickeln (McCafferty et al., 1990, Clarkson et al., 1991, Barbas et al., 1991, Garrard et al., 1991, Winter et al., 1994, Burton und Barbas, 1994). Diese variablen Regionen werden anhand ihrer spezifischen Affinität für bestimmte Antigene ausgewählt und anschließend mit den konstanten Domänen der humanen Immunglobuline verknüpft, was zu rekombinanten humanen Immunglobulinen führt. Ein Beispiel für diese letztere Herangehensweise ist der einkettige Fv-Antikörper 17-1A (Riethmuller et al., 1994), der in ein intaktes humanes IgG1-kappa-Immunglobulin, das UBS-54 genannt wird und gegen das tumorassoziierte EpCAM-Molekül gerichtet ist (Huls et al., 1999) umgewandelt wurde.
Es gibt diverse Herstellungssysteme zur Erzeugung rekombinanter Immunglobuline. Die Immunglobuline der Maus, die man zuerst in klinischen Versuchen verwendet hat, wurden in großen Mengen in ihrer spezifischen Eltern-B-Zelle hergestellt und zur Immortalisierung mit einer Myelomzelle der Maus verschmolzen. Es ist ein Nachteil dieses Systems, dass die hergestellten Immunglobuline vollständig von der Maus stammen und im menschlichen Patienten zu einer dramatischen Immunantwort (HAMA-Antwort) führen (wie oben beschrieben).
Teilweise humanisierte oder humane Antikörper haben keine Eltern-B-Zelle, die man immortalisieren kann und müssen deshalb in anderen Systemen wie den Eizellen des Chinesischen Hamsters (CHO) oder den Nierenzellen von Babyhamstern (BHK) hergestellt werden. Man kann auch Zellen verwenden, die normalerweise zur Herstellung von Immunglobulin geeignet sind, wie Tumor-abgeleitete Myelomzellen des Menschen oder der Maus. Die Antikörpermengen, die man in Myelomzellen erhält, sind jedoch im Allgemeinen relativ gering (±0,1 µg/ml), verglichen mit denjenigen, die man in den ursprünglich identifizierten und immortalisierten B-Zellen erhält, die vollständig murine Immunglobuline produzieren (±10 µg/ml, Sandhu 1992).
Um diese und andere Mängel zu umgehen, werden verschiedene Systeme entwickelt, um humanisierte oder humane Immunglobuline in größeren Mengen herzustellen.
Es wurde zum Beispiel kürzlich gezeigt, dass transgene Mäusestämme hergestellt werden können, deren Maus-IgG-Gene durch deren menschliche Gegenstücke ersetzt wurden (Bruggeman et al., 1991, Lonberg et al., 1994, Lonberg und Huszar, 1995, Jacobovits, 1995). Künstliche Hefechromosomen (YACs), die große Fragmente der Immunglobulin(Ig)-Loci der humanen schweren und leichten (kappa) Kette enthalten, wurden in Ig-inaktivierte Mäuse eingefügt, was zu einer Produktion von humanen Antikörpern führte, die einschließlich der Umlagerung, der Zusammenlagerung und des Repertoires der Gene derjenigen im Menschen sehr ähnelte (Mendez et al., 1997, Green et al., 1994). In ähnlicher Weise haben Fishwild et al., (1996) mit Hilfe der folgenden konventionellen Hybridomtechnologie humane Ig-Transgenics konstruiert, um humane Immunglobuline zu erhalten. Die Hybridomzellen schieden humane Immunglobuline aus mit Eigenschaften, die einschließlich des Stabilitäts-, Wachstums- und Sekretions-Niveaus denjenigen von Mäusen des Wildtyps ähnlich waren. Rekombinante Antikörper, die von solchen transgenen Mäusestämmen hergestellt werden, tragen keine nicht-humanen Aminosäuresequenzen.
Trotz alledem haben die bis jetzt hergestellten humanen Immunglobuline den Nachteil, dass sie in nicht-menschlichen Zellen hergestellt werden, was zu nicht-humanen post-translationalen Modifikationen wie der Glycosylierung und/oder der Faltung der Untereinheiten führt. Alle Antikörper werden an konservierten Positionen in ihren konstanten Regionen glycosyliert und die Anwesenheit von Kohlenhydraten kann für Funktionen der Antigenclearance, wie die Komplementaktivierung bedenklich sein. Die Struktur des gebundenen Kohlenhydrates kann sich auch auf die Antikörperaktivität auswirken. Die Glycosylierung des Antikörpers kann von der Zelle, in der sie abläuft, von der Konformation des Antikörpers und von den Bedingungen der Zellkultur beeinflusst werden. So tragen beispielsweise Antikörper, die in Zellen der Maus hergestellt werden, Glycane, die den Gal-alphal-3Gal-Rest enthalten, der in Proteinen aus menschlichen Zellen fehlt (Borrebaeck et al., 1993, Borrebaeck, 1999). Menschen haben einen sehr hohen anti-Gal-alphal-3Gal Antikörpertiter (100 µg/ml, Galili, 1993), was zu einer schnellen Entfernung von (murinen) Proteinen, die in ihren Glycanen diesen Rest tragen, führt. Es wurde bald offenkundig, dass Patienten über verlängerte Zeiträume mit sehr hohen Dosen an rekombinanten Immunglobulinen behandelt werden müssen, um eine Wirkung zu erzielen. Es scheint wahrscheinlich, dass sich post-translationale Modifikationen an humanen oder humanisierten Immunglobulinen, die nicht in menschlichen Zellen gebildet werden, stark auf die Clearance-Rate dieser Antikörper aus dem Blutstrom auswirken.
Es ist nicht geklärt, warum Immunglobuline, die von CHO-Zellen gebildet werden, ebenfalls in sehr hohen Dosierungen angewendet werden müssen, da der Gal-alpha1-3Gal-Rest in Glycanen auf Proteinen, die von dieser Zelllinie stammen, nicht vorhanden ist (Rother und Squinto, 1996). Deshalb sind neben den Gal-alphal-3Gal-Resten wahrscheinlich andere post-translationale Modifikationen an den spezifischen Immunantworten im Menschen gegen vollständig humane oder humanisierte Immunglobuline, die von solchen CHO-Zellen gebildet werden, beteiligt.
Somit lehrt das Fachgebiet, dass es möglich ist, humanisierte Antikörper ohne murinstämmige Proteinsequenzen herzustellen. Dennoch unterscheidet sich die gegenwärtige Generation rekombinanter Immunglobuline noch von ihren natürlichen menschlichen Gegenstücken, z. B. durch post-translationale Modifikationen wie die Glycosylierung und die Faltung. Dies kann zu einer Aktivierung des Immunsystems des Patienten führen und unerwünschte Antworten auslösen, die sich auf die Wirksamkeit der Behandlung auswirken können. Daher braucht das gegenwärtige Herstellungssystem, trotz der Entwicklung chimärer Antikörper, noch eine Optimierung, um vollständig humane oder humanisierte aktive Antikörper herzustellen.
Es ist daher eindeutig wünschenswert, Verfahren zu entwickeln, um vollständig humane Antikörper herzustellen, die sich entsprechend verhalten und die zusätzlich mit höheren Erträgen, wie in menschlichen Myelomzellen beobachtet, hergestellt werden.
Somit wäre es für das Fachgebiet eine Verbesserung, eine menschliche Zelle bereitzustellen, die eine einheitliche Proteinprozessierung vom menschlichen Typ wie post-translationale und peri-translationale Modifikationen wie beispielsweise der Glycosylierung, aber nicht darauf begrenzt, aufweist. Des Weiteren wäre es vorteilhaft, ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Säugerzelle und von Immunglobulinen von rekombinanten Säugerzellen in großem Produktionsumfang bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt daher des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung von wenigstens einer variablen Domäne eines Immunglobulins in einer rekombinanten Säugerzelle bereit, umfassend das Bereitstellen einer Zelle, die von einer HER-Zelle abstammt und die eine Nucleinsäure umfasst, die E1A- und E1B-Proteine eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog und/oder Fragment davon in ihrem Genom codiert, und des Weiteren eine zweite Nucleinsäure umfasst, die das in ihr Genom integriertes Immunglobulin codiert, das Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Medium und das Ernten von wenigstens einem monoclonalen Antikörper aus der Zelle und/oder aus dem Medium.
Man hat früher, wenn überhaupt, wenige menschliche Zellen gefunden, die zur Herstellung von Immunglobulinen auf reproduzierbare und steigerbare Weise geeignet sind. Die Zellen der vorliegenden Erfindung enthalten adenovirale E1A- und E1B-Proteine und haben die Fähigkeit, relativ unabhängig von exogenen Wachstumsfaktoren zu wachsen.
Des Weiteren sind diese Zellen in der Lage, Immunglobuline in signifikanten Mengen zu bilden und die erzeugten Immunglobuline in korrekter Form zu prozessieren.
Die Tatsache, dass Zelltypen, die man zur Immunglobulin-Produktion verwendet hat, von Tumoren abstammen, fügt der Arbeit mit diesen bestimmten Zelllinien ein zusätzliches Risiko hinzu und führt zu sehr strengen Isolationsmaßnahmen für die Immunglobuline, um eine Transformationsaktivität oder tumorigenes Material in einer der Zubereitungen zu verhindern. Man bevorzugt daher den Einsatz eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Zelle von einer primären Zelle stammt. Eine primäre Zelle muss immortalisiert werden, was in vorliegender Erfindung durch die Einführung eines adenoviralen E1-Proteins erreicht wurde, um auf unbestimmte Zeit wachsen zu können. Um mit Hilfe von Zellkulturen eine (kontinuierliche) Herstellung von Immunglobulinen in großem Umfang zu erreichen, verwendet man vorzugsweise Zellen, die ohne die Notwendigkeit zur Verankerung wachsen können. Die Zellen der vorliegenden Erfindung besitzen diese Fähigkeit. Die von einer Verankerung unabhängige Wachstumsfähigkeit wird verbessert, wenn die Zellen eine vom Adenovirus stammende Sequenz enthalten, die E2A (oder ein funktionelles Derivat oder Analog oder Fragment davon) in ihrem Genom codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert die E2A-codierende Sequenz eine temperaturempfindliche Mutante E2A wie etwa ts125. Die Zelle kann zusätzlich eine Nucleinsäure (die z. B. tTa codiert) enthalten, die eine regulierte Expression des beteiligten Gens ermöglicht, wenn sie der Kontrolle eines Promotors (z. B. eines TetO-Promotors) unterstellt wird.
Die Nucleinsäure kann eine schwere Kette, eine variable schwere Kette, eine leichte Kette und/oder eine variable leichte Kette eines Immunglobulins codieren. Alternativ dazu kann eine einzelne oder andere Nucleinsäure als ein Gegenstück zur ersten Nucleinsäure eine oder mehrere variable Domäne(n) eines Ig (oder eines funktionellen Derivats, Homologs und/oder Fragments davon) codieren (oben beschrieben).
Eine oder mehrere Nucleinsäure(n), die hier beschrieben wird/werden, kann/können ein ScFv codieren und human oder humanisiert sein. Die Nucleinsäure(n) der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise der Kontrolle eines induzierbaren Promotors (oder eines funktionellen Derivats davon) unterstellt.
Um ein sauberes und sicheres Herstellungssystem zu haben, aus dem man leicht die gewünschten Immunglobuline isolieren kann, verwendet man vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die HER-Zelle keine anderen adenoviralen Sequenzen enthält. PER.C6 oder ein Derivat davon, wie unter ECACC-Nr. 96022940 hinterlegt, ist die am stärksten zu bevorzugende Zelle für die Verfahren und Verwendungen der Erfindung. Man hat herausgefunden, dass PER.C6 besonders in der Handhabung stabiler ist als beispielsweise transformierte humane 293-Zellen, die durch die adenovirale E1-Region immortalisiert wurden. PER.C6-Zellen sind ausführlich beschrieben und dokumentiert worden, wobei sie bei der Vermehrung, beim Suspensionswachstum und bei der Wachstumsfaktor-Unabhängigkeit eine gute Entwicklung gezeigt haben.
Des Weiteren kann man PER.C6 auf höchst reproduzierbare Art in eine Suspension integrieren, was sie für eine Produktion in großem Umfang besonders geeignet macht. In dieser Hinsicht hat man die PER.C6-Zelllinie für ein Wachstum im Bioreaktor, wo sie zu sehr hohen Dichten heranwachsen kann, gekennzeichnet.
Man kann die Zellen der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise in Abwesenheit von Serum, das vom Tier oder vom Mensch stammt, oder von Serumbestandteilen, die vom Tier oder vom Mensch stammen, kultivieren. Dadurch wird die Isolation monoclonaler Antikörper vereinfacht und die Sicherheit wird aufgrund des Fehlens zusätzlicher menschlicher oder tierischer Proteine in der Kultur verstärkt. Weiterhin erhöht die Abwesenheit von Serum die Zuverlässigkeit des Systems, da die Verwendung synthetischer Medien, wie sie hier in Betracht kommt, die Reproduzierbarkeit verstärkt. Des Weiteren liefert die Erfindung die Verwendung einer rekombinanten HER-Zelle zur Herstellung von mindestens einer variablen Domäne eines Immunglobulins, wobei die Zelle eine Sequenz aufweist, die E1A- und E1B-Proteine eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon in ihrem Genom codiert, wobei die Zelle keine strukturellen adenoviralen Proteine bildet. Die HER-Zelle ist vorzugsweise eine PER.C6-Zelle oder ein Derivat davon.
Weiterhin liefert die Erfindung eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei die Zelle des Weiteren eine Sequenz umfasst, die E2A (oder ein funktionelles Derivat oder Analog oder Fragment davon) in ihrem Genom codiert, wobei E2A vorzugsweise temperaturempfindlich ist. Zusätzlich liefert die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung der Erfindung, worin die Zelle des Weiteren ein trans-aktivierendes Protein für die Induktion des induzierbaren Promotors enthält. Die Erfindung liefert auch Immunglobuline, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren oder mit einer erfindungsgemäßen Verwendung erhältlich sind.
Die Immunglobuline, die in den Zellen der vorliegenden Erfindung exprimiert werden sollen, sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für rekombinante Immunglobuline schließen Herceptin, Rituxan (Rituximab), UBS-54, CAMPATH-1H und 15C5 ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiter Verfahren zur Herstellung von wenigstens einer variablen Domäne eines Immunglobulins in einer rekombinanten Säugerzelle, indem man die immortalisierte rekombinante HER-Zelle der Erfindung verwendet, in einem geeigneten Medium kultiviert und aus der rekombinanten HER-Zelle und/oder aus dem Medium mindestens eine variable Domäne eines ausgewählten Ig erntet. Man kann Immunglobuline, variable Domänen der Immunglobuline oder Derivate davon für die therapeutische Behandlung von Säugern oder für die Herstellung von Arzneimitteln verwenden.
Andererseits liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines viralen Proteins, das kein Adenovirus oder adenovirales Protein ist, zur Verwendung als Impfstoff, umfassend das Bereitstellen einer Zelle, die von einer HER-Zelle abstammt und mit mindestens einer Sequenz, die E1A und E1B eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat davon codiert, das Versorgen der Zelle mit einer Nucleinsäure, die das in ihr Genom integrierte virale Protein codiert, das Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Medium, das die Expression des viralen Proteins ermöglicht, und das Ernten des viralen Proteins aus dem Medium und/oder der Zelle. Bis zu vorliegender Erfindung gibt es, wenn überhaupt, wenige (menschliche) Zellen, die man geeignet fand, virale Proteine auf eine reproduzierbare und steigerbare Art und/oder in ausreichend hohen Mengen und/oder auf leichte Art zu reinigen zur Verwendung als Impfstoffe herzustellen. Wir haben jetzt herausgefunden, dass HER-Zellen, die adenovirale E1A- und E1B-Sequenzen in ihrem Genom enthalten, in der Lage sind, das virale Protein in signifikanten Mengen zu bilden.
Gemäß der Erfindung stammt die Zelle von einer primären HER-Zelle ab, vorzugsweise von einer HER-Zelle, die durch ein Genprodukt des E1-Gens immortalisiert ist. Natürlich muss man eine primäre Zelle immortalisieren, damit sie wachsen kann. Ein gutes Beispiel für eine solche Zelle ist eine Zelle, die von einem humanen embryonalen Retinoblasten stammt.
In erfindungsgemäßen Zellen ist es wichtig, dass die E1-Gensequenzen während des Zellzyklus nicht verloren gehen. Daher ist die Sequenz, die die Genprodukte des E1-Gens codiert, im Genom der (humanen) Zelle vorhanden. Aus Sicherheitsgründen sind unnötige adenovirale Sequenzen in den erfindungsgemäßen Zellen mit größtmöglicher Sorgfalt zu verhindern. Zur Bereitstellung von Zellen, die keine adenoviralen strukturellen Proteine bilden, gibt es daher eine andere Ausführungsform der Erfindung. Um jedoch eine (kontinuierliche) Herstellung von Virusprotein durch eine Zellkultur in großem Umfang zu erreichen, verwendet man bevorzugt Zellen, die wachsen können ohne eine Verankerung zu brauchen. Die Zellen der vorliegenden Erfindung haben diese Fähigkeit. Für ein sauberes und sicheres Herstellungssystem, von dem man das Virusprotein leicht bergen und, falls gewünscht, reinigen kann, verwendet man vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die menschliche Zelle keine anderen adenoviralen Sequenzen enthält. Am meisten bevorzugt man für die Verfahren und Verwendungen der Erfindung die Zelle PER.C6, wie unter ECACC-Nr. 96022940 hinterlegt, oder ein Derivat davon.
Somit stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, das eine erfindungsgemäße Zelle verwendet, wobei die Zelle des Weiteren eine Sequenz enthält, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analog oder Fragment davon codiert, vorzugsweise eine Zelle, in der die Sequenz, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analog oder Fragment davon codiert, im Genom der menschlichen Zelle vorhanden ist, und am meisten bevorzugt eine Zelle, in der die E2A-codierende Sequenz eine temperaturempfindliche Mutante von E2A codiert.
Des Weiteren stellt die Erfindung, wie dargelegt, ein erfindungsgemäßes Verfahren bereit, bei dem die (menschliche) Zelle in der Lage ist, in Suspension zu wachsen. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, bei dem die menschliche Zelle in Abwesenheit von Serum kultiviert werden kann. Die erfindungsgemäßen Zellen, insbesondere PER.C6, haben den zusätzlichen Vorteil, dass man sie in Abwesenheit von Serum oder von Serumbestandteilen kultivieren kann. Somit ist eine Isolation einfach, die Sicherheit wird verstärkt und die Zuverlässigkeit des Systems ist gut (synthetische Medien sind für die Reproduzierbarkeit am besten). Die menschlichen Zellen der Erfindung basieren auf HER-Zellen und sind zu normalen post- und peritranslationalen Modifikationen und zum Zusammenbau fähig. Das bedeutet, dass sie zur Herstellung von viralen Proteinen zur Verwendung in Impfstoffen sehr geeignet sind.
Somit stellt die Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren bereit, wobei das virale Protein ein Protein enthält, das eine post-translationale und/oder peri-translationale Modifikation durchläuft, besonders wenn die Modifikationen eine Glycosylierung enthalten. Der Impfstoff kann zur Impfung von Menschen verwendet werden. Der Impfstoff ist aber auch bei Tieren wirksam. In dieser Ausführungsform wird der Impfstoff vorzugsweise erfindungsgemäß hergestellt, wobei die Zelle von derselben Species stammt, von der das virale Protein im Impfstoff stammt. Ein virales Protein kann das gesamte virale Protein oder ein funktionelles Äquvalent davon sein. Ein funktionelles Äquvalent eines viralen Proteins ist zumindest ein immunogener Teil des viralen Proteins. Ein gutes Beispiel für einen viralen Impfstoff, der auf zuverlässige Art schwierig herzustellen ist, ist der Influenza-Impfstoff. Die Erfindung stellt ein erfindungsgemäßes Verfahren bereit, wobei die viralen Proteine wenigstens eine der Neuraminidasen des Influenzavirus und/oder ein Hämagglutinin enthalten. Andere virale Proteine (Untereinheiten), die man mit den erfindungsgemäßen Verfahren herstellen kann, schließen Proteine vom Enterovirus wie Rhinovirus, Aphtovirus oder Poliomyelitisvirus, Herpesvirus wie Herpes simplex Virus, Pseudorabiesvirus oder Rinderherpesvirus, Orthomyxovirus wie Influenzavirus, Paramyxovirus wie Newcastle-Disease-Virus, respiratorischen Syncytialvirus, Mumpsvirus oder einem Masernvirus, Retrovirus wie dem humanen Immundefizienz-Virus oder Parvovirus oder Papovavirus, Rotavirus oder Coronavirus wie dem übertragbaren Gastroenteritis-Virus oder Flavivirus wie dem von Zecken übertragenen Encephalitis-Virus oder Gelbfiebervirus, Togavirus wie Rubellavirus oder Östlichen, Westlichen oder Venezuelanischen Pferde-Encephalomyelitisvirus, Hepatitis verursachenden Virus wie Hepatitis-A- oder Hepatitis-B-Virus, Pestivirus wie Schweinepestvirus oder Rhabdovirus wie Tollwutvirus. Die Erfindung liefert auch die Verwendung einer menschlichen Zelle, die von einer HER-Zelle stammt und eine Sequenz hat, die E1A- und E1B-Proteine eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon in ihrem Genom codiert, wobei die Zelle keine strukturellen adenoviralen Proteine bildet, um wenigstens ein virales Protein zur Verwendung in einem Impfstoff herzustellen. Natürlich werden für eine solche Verwendung die Zellen, die man bei den erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, ebenfalls bevorzugt. Die Erfindung liefert auch die Produkte, die aus den erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen hervorgehen, vor allem virale Proteine, die man gemäß dieser Verwendungen und/oder Verfahren erhält, besonders, wenn sie in ein Arzneimittel eingebracht werden, das geeignete Excipienten und in einigen Strukturen (Untereinheiten) Adjuvantien umfasst. Soweit sie noch nicht durch die bereits registrierten Impfstoffe erhältlich sind, können die Dosierung und die Formen der Verabreichung durch normale klinische Tests ermittelt werden.
Somit liefert die Erfindung auch ein virales Protein zur Verwendung in einem Impfstoff, den man mit einem Verfahren oder mit einer Verwendung gemäß der Erfindung erhält, wobei das virale Protein frei ist von jeglicher nicht-humanen proteinartigen Säuger-Substanz, und ein Arzneimittel, das ein solches virales Protein enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Influenza-Impfstoffe bereit, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren oder mit einer erfindungsgemäßen Verwendung erhältlich sind.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration der Erfindung bereitgestellt, wobei sie den Umfang der Erfindung nicht begrenzen sollen. Das humane Erythropoietin-Molekül (EPO) enthält vier Kohlenhydratketten. Drei enthalten N-Verbindungen mit Asparaginen und eine enthält eine O-Verbindung zu einem Serinrest. Die Bedeutung der Glycosylierung für die biologische Aktivität von EPO ist gut dokumentiert worden (Delorme et al., 1992; Yamaguchi et al., 1991). Die cDNA, die humanes EPO codiert, wurde in PER.C6-Zellen und PER.C6/E2A-Zellen cloniert und exprimiert, eine Expression wurde nachgewiesen und das Glycosylierungsmuster wurde analysiert.
Beispiel 1: Bildung von elementaren Expressionsvektoren.
Plasmid pcDNA3,1/Hygro(–) (Invitrogen) wurde mit NruI und EcoRV gespalten, an den 5'-Enden mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (SAP, GIBCO Life Tech.) dephosphoryliert und das Plasmidfragment, dem der sehr frühe Enhancer und -Promotor des Cytomegalievirus (CMV) fehlt, wurde vom Gel gereinigt. Plasmid pAdApt, das den CMV-Enhancer/Promotor (–735 bis +95) in voller Länge neben den überlappenden Adeno-abgeleiteten Sequenzen zur Bildung des rekombinanten Adenovirus enthält, wurde mit AvrII gespalten, mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und mit HpaI gespalten; das Fragment, das den CMV-Enhancer und -Promotor enthält, wurde auf Agarose-Gel gereinigt. Dieses CMV-Enhancer- und -Promotor-Fragment wurde glattendig/glattendig an das NruI/EcoRV-Fragment von pcDNA3,1/Hygro(–) ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als pcDNA2000/Hyg(–) bezeichnet.
Plasmid pcDNA2000/Hyg(–) wurde mit PmlI gespalten und das linearisierte Plasmid, dem das Marker-Gen für Hygromycin-Resistenz fehlt, wurde vom Gel gereinigt und religiert. Das entstandene Plasmid wurde als pcDNA2000 bezeichnet.
Plasmid pcDNA2000 wurde mit PmlI gespalten und durch SAP an beiden Enden dephosphoryliert. Plasmid pIG-GC9, das die humane DHFRcDNA des Wildtyps enthält (Havenga et al., 1998), wurde verwendet, um das DHFR-Gen des Wildtyps durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit eingefügten, nicht-codierenden PmlI-Schnittstellen stromaufwärts und stromabwärts der cDNA zu erhalten. Die PCR-Primer, die verwendet wurden, waren aufwärts von DHFR: 5'-GAT CCA CGT GAG ATC TCC ACC ATG GTT GGT TCG CTA AAC TG-3' und abwärts von DHFR: 5'-GAT CCA CGT GAG ATC TTT AAT CAT TCT TCT CAT ATAC-3'. Das PCR-Produkt wurde mit PmlI gespalten und zur Ligierung in pcDNA2000 (gespalten mit PmlI und mit SAP dephosphoryliert) verwendet, um pcDNA2000/DHFRwt zu erhalten (1). Die Wildtypsequenzen und die korrekt verwendeten Clonierungsstellen wurden durch doppelsträngiges Sequenzieren bestätigt. Darüber hinaus wurde eine mutierte Version des humanen DHFR-Gens (DHFRm) verwendet, um durch die Auswahl einer möglichen Integration des Transgens in eine genomische Region mit hoher transkriptionaler Aktivität eine 10.000-fach höhere Resistenz gegen Methotrexat in PER.C6 und PER.C6/E2A zu erreichen. Diese Mutante trägt in Position 32 (Phenylalanin statt Serin) und in Position 159 (Leucin statt Prolin) eine Aminosäure-Substitution, die durch das PCR-Verfahren eingefügt wurde. PCR wurde bei Plasmid pIG-GC12 (Havenga et al., 1998) verwendet, um die mutierte Version von humanem DHFR zu erhalten. Eine Clonierung dieser Mutante ist mit dem Wildtyp-DHFR vergleichbar. Das Plasmid, das man mit dem mutierten DHFR erhalten hat, wurde als pcDNA2000/DHFRm bezeichnet.
pIPspAdapto (Galapagos) wurde mit AgeI- und BamHI-Restriktionsenzymen gespalten. Das entstandene Polylinker-Fragment hat folgende Sequenz: 5'-ACC GGT GAA TTC GGC GCG CCG TCG ACG ATA TCG ATC GGA CCG ACG CGT TCG CGA GCG GCC GCA ATT CGC TAG CGT TAA CGG ATC C-3'. Die verwendeten AgeI- und BamHI-Erkennungsstellen sind unterstrichen. Dieses Fragment enthält einige einzigartige Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme und wurde auf Agarose-Gel gereinigt und an ein AgeI/BamI-gespaltenes und auf Agarose-Gel gereinigtes pcDNA2000/DHFRwt-Plasmid ligiert (2).
pIPspAdapt7 (Galapagos) wird mit AgeI- und BamHI-Restriktionsenzymen gespalten und hat folgende Sequenz: 5'-ACC GGT GAA TTG CGG CCG CTC GCG AAC GCG TCG GTC CGT ATC GAT ATC GTC GAC GGC GCG CCG AAT TCG CTA GCG TTA ACG GAT CC-3'. Die verwendeten AgeI- und BamHI-Erkennungsstellen sind unterstrichen. Das Polylinker-Fragment, das auf Agarose-Gel gereinigt und an AgeI/BamI-gespaltenes und auf Agarose-Gel gereinigtes pcDNA2000/DHFRwt ligiert wird, enthält einige einzigartige Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme (andere als pIPspAdapto). Dies führt zu pcDNA2002/DHFRwt (3).
pcDNA2000/DHFRwt wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym PvuII verdaut. In diesem Plasmid gibt es zwei PvuII–Schnittstellen und die Clonierung wurde in die Schnittstelle zwischen SV40 poly(A) und ColE1, nicht in die PvuII–Schnittstelle stromabwärts von BGH-poly(A), durchgeführt. Ein Gemisch des an einer Stelle gespaltenen Plasmids wurde mit SAP dephosphoryliert, mit Klenow-Enzym glattendig gemacht und auf Agarose-Gel gereinigt. pcDNA2001/DHFRwt wurde mit MunI- und PvuII-Restriktionsenzymen gespalten, mit Klenow und freien Nucleotiden aufgefüllt, um beide Enden glattendig zu machen. Das entstandene CMV-Promotor-Linker-BGH-poly(A)-enthaltende Fragment wurde über Gel isoliert und vom Vektor getrennt. Dieses Fragment wurde in den teilweise verdauten und dephosphorylierten Vektor ligiert und auf seine Orientierung und seine Insertions-Schnittstelle hin überprüft. Das entstandene Plasmid wurde pcDNAs3000/DHFRwt genannt (4).
Beispiel 2: Bildung von EPO-Expressionsvektoren.
Die Volllängen-cDNA des humanen EPO wurde unter Einsatz der Oligonucleotid-Primer EPO-START: 5' AAA AAG GAT CCG CCA CCA TGG GGG TGC ACG AAT GTC CTG CCT G-3' und EPO-STOP: 5' AAA AAG GAT CCT CAT CTG TCC CCT GTC CTG CAG GCC TC-3' (Cambridge Bioscience Ltd) in einer PCR bei einer humanen adulten Leber-cDNA-Genbank cloniert. Das amplifizierte Fragment wurde in pUC18, das mit BamHI linearisiert war, cloniert. Die Sequenz wurde durch doppelsträngiges Sequenzieren überprüft. Dieses Plasmid, das die EPO-cDNA in pUC18 enthält, wurde mit BamHI gespalten und die EPO-Insertion vom Agarose-Gel gereinigt. Die Plasmide pcDNA2000/DHFRwt und pcDNA2000/DHFRm wurden mit BamHI linearisiert, am 5'-Überhang mit SAP dephosphoryliert und die Plasmide vom Agarose-Gel gereinigt. Das EPO-cDNA-Fragment wurde in die BamHI-Schnittstellen von pcDNA2000/DHFRwt und von pcDNA2000/DHFRm ligiert; die entstandenen Plasmide wurden als pEPO2000/DHFRwt (5) und als pEPO2000/DHFRm bezeichnet.
Beispiel 3: Bildung von UBS-54-Expressionsvektoren.
Die konstanten Domänen (CH1, -2 und -3) des Gens für die schwere Kette des humanen Immunglobulins G1 (IgG1), einschließlich Intron-Sequenzen und Verbindungs-Domäne (Gelenk), wurden mit Hilfe von PCR unter Verwendung eines Primers stromaufwärts und stromabwärts erzeugt. Die Sequenz des Primers stromaufwärts (CAMH-UP) ist: 5'-GAT CGA TAT CGC TAG CAC CAA GGG CCC ATC GGT C-3', wobei die Anelierungs-Nucleotide in Kursivschrift dargestellt sind und zwei sequentielle Erkennungsstellen (EcoRV und NheI) für Restriktionsenzyme unterstrichen sind.
Die Sequenz des Primers stromabwärts (CAMH-DOWN) ist: 5'-GAT CCT TTA AAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG-3', wobei die Anelierungs-Nucleotide in Kursivschrift dargestellt sind und die eingefügte Erkennungsstelle für das PmeI-Restriktionsenzym unterstrichen ist.
Die Abfolge der Domänen der schweren Kette des humanen IgG1 ist folgendermaßen: CH1-Intron-Gelenk-lntron-CH2-Intron-CH3. Die PCR wurde an einem Plasmid (pCMgamma-NEO-Skappa-Vgamma-Cgamma hu) durchgeführt, das die schwere Kette eines humanisierten Antikörpers enthält, der gegen das D-Dimer des humanen Fibrinogens gerichtet ist (Vandamme et al., 1990). Dieser Antikörper wurde 15C5 genannt und die Humanisierung wurde durchgeführt, indem man die humanen konstanten Domänen einschließlich der Intron-Sequenzen eingefügt hat (Bulens et al., 1991).
Die PCR führte zu einem Produkt von 1621 Nucleotiden. Die NheI- und PmeI-Schnittstellen wurden eingefügt, um auf einfache Art in den pcDNA2000/Hyg(–)-Polylinker zu clonieren. Die NheI-Schnittstelle codierte zwei Aminosäuren (Ala und Ser), die Teil der konstanten CH1-Region sind, die aber nicht mit der DNA, die sich in der Matrize befindet, hybridisierten (Crowe et al., 1992).
Das PCR-Produkt wurde mit NheI- und PmeI-Restriktionsenzymen gespalten, auf Agarose-Gel gereinigt und in pcDNA2000/Hygro(–) ligiert, das mit NheI und PmeI gespalten und über Agarose-Gel gereinigt war. Dies führte zu Plasmid pHC2000/Hyg(–) (7), das man verwenden kann, um die konstanten Domänen der humanen schweren Ketten, einschließlich der Introns, mit jeder möglichen variablen Region von jeder zur Humanisierung identifizierten schweren Kette des Immunglobulins zu verbinden.
Die konstante Domäne der leichten Kette des Gens des humanen Immunglobulins (IgG1) wurde mit Hilfe von PCR erzeugt, indem man einen Primer stromaufwärts und einen stromabwärts verwendete: Die Sequenz des Primers stromaufwärts (CAML-UP) lautet 5'-GAT CCG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT C-3', wobei die Anelierungs-Nucleotide in Kursivschrift dargestellt sind und eine eingefügte Erkennungsstelle des SunI-Restriktionsenzyms unterstrichen ist.
Die Sequenz des Primers stromabwärts (CAML-DOWN) lautet 5'-GAT CGT TTA AAC CTA ACA CTC TCC CCT GTT G-3', wobei die Anelierungs-Nucleotide in Kursivschrift dargestellt sind und eine eingefügte Erkennungsstelle des PmeI-Restriktionsenzyms unterstrichen ist.
Die PCR wurde mit einem Plasmid (pCMkappa-DHFR13-15C5-kappa-humanisiert) durchgeführt, das die murine Signalsequenz und die murine variable Region der leichten Kette von 15C5, verbunden mit der konstanten Domäne der leichten Kette des humanen IgG1 trägt (Vandamme et al., 1990; Bulens et al., 1991).
Die PCR führte zu einem Produkt von 340 Nucleotiden. Die SunI- und PmeI-Schnittstellen wurden zur Clonierung in den pcDNA2001/DHFRwt-Polylinker eingefügt. Die SunI-Schnittstelle codierte zwei Aminosäuren (Arg und Thr), wobei der Threoninrest Teil der konstanten Region der leichten Ketten des humanen Immunglobulins ist, während der Argininrest Teil der variablen Region von CAMPATH-1H ist (Crowe et al., 1992). Dadurch wurde ein anschließendes 3'-Clonieren in die SunI-Schnittstelle, die in dem Plasmid einmal vorkam, möglich. Das PCR-Produkt wurde mit SunI- und PmeI-Restriktionsenzymen gespalten, über Agarose-Gel gereinigt und in ein pcDNA2001/DHFRwt ligiert, das von BamHI und PmeI gespalten, mit Agarose-Gel-gereinigt und mit Klenow-Enzym und freien Nucleotiden glattendig gemacht wurde. Die Ligierung in der korrekten Ausrichtung führte zum Verlust der BamHI-Schnittstelle am 5'-Ende und zum Erhalt der SunI- und der PmeI-Schnittstellen. Das entstandene Plasmid, das man zur Humanisierung zur Verbindung der humanen konstanten Domäne der leichten Ketten mit jeder möglichen variablen Region von jeder identifizierten leichten Kette des Immunglobulins verwenden kann, wurde pLC2001/DHFRwt genannt (8).
pNUT-C-gamma (Huls et al., 1999) enthält die konstanten Domänen, Introns und die Gelenk-Region der schweren Kette des humanen IgG1 (Huls et al., 1999) und erhielt stromaufwärts von der ersten konstanten Domäne die variable Domäne der gamma-Kette des vollständig humanisierten monoclonalen Antikörpers UBS-54, dem die folgende Leader-Peptid-Sequenz vorangeht: MACPGFLWALVISTCLEFSM (Sequenz: 5'-ATG GCA TGC CCT GGC TTC CTG TGG GCA CTT GTG ATC TCC ACC TGT CTT GAA TTT TCC ATG-3'). Dies führte zu einer Insertion, die ungefähr 2 kB lang ist. Die gesamte gamma-Kette wurde mit Hilfe eines Primers stromaufwärts (UBS-UP) und des Primers CAMH-DOWN stromabwärts PCR-amplifiziert. Die Sequenz von UBS-UP lautet folgendermaßen: 5'-GAT CAC GCG TGC TAG CCA CCA TGG CAT GCC CTG GCT TC-3', wobei die eingefügten MluI- und NheI-Schnittstellen unterstrichen sind und die perfekte Kozak-Sequenz kursiv dargestellt ist. Das entstandene PCR-Produkt wurde mit NheI- und PmeI-Restriktionsenzymen gespalten, über Agarose-Gel gereinigt und mit dem Plasmid pcDNA2000/Hygro(–) ligiert, das ebenfalls mit NheI und PmeI gespalten, mit tSAP dephosphoryliert und über Gel gereinigt wird. Das entstandene Plasmid wurde pUBS-Heavy2000/Hyg(–) genannt (9). pNUT-C-kappa enthält die konstante Domäne der leichten kappa-Kette des humanen IgG1 (Huls et al., 1999) und erhielt die variable Domäne der vollständig humanisierten kappa-Kette des monoclonalen Antikörpers UBS-54, angeführt von folgendem Leader-Peptid: MACPGFLWALVISTCLEFSM (Sequenz: 5'-ATG GCA TGC CCT GGC TTC CTG TGG GCA CTT GTG ATC TCC ACC TGT CTT GAA TTT TCC ATG-3', zu Einzelheiten über das Plasmid siehe UBiSys). Dies führte zu einer Insertion, die ungefähr 1,2 kB lang ist. Die gesamte Insertion wurde mit Hilfe des Primers UBS-UP stromaufwärts und des Primers CAML-DOWN stromabwärts PCR-amplifiziert, wodurch die Translationsstartstelle modifiziert wurde. Das entstandene PCR-Produkt wurde mit NheI- und PmeI-Restriktionsenzymen gespalten, über Agarose-Gel gereinigt und mit pcDNA2001/DHFRwt ligiert, das ebenfalls mit NheI und PmeI gespalten, mit tSAP dephosphoryliert und über Gel gereinigt wurde, wodurch pUBS-Light2002/DHFRwt entstand (10). Zur Entfernung des zusätzlichen Introns, das sich zwischen der variablen Domäne und der ersten konstanten Domäne, die in pNUT-Cgamma vorkommt, befindet und zur Verbindung des Signalpeptids und der variablen Domäne mit den konstanten Domänen der schweren Kette des humanen IgG1 des Wildtyps, dem mehrere Polymorphismen fehlen, die in der konstanten Domäne in pNUT-Cgamma am Carboxyl-Ende vorkommen, wird mit dem Primer UBS-UP und dem Primer UBSHV-DOWN ein PCR-Produkt erzeugt, das die folgende Sequenz hat: 5'-GAT CGC TAG CTG TCG AGA CGG TGA CCA G-3', wobei die eingefügte NheI-Schnittstelle unterstrichen ist und die Anelierungs-Nucleotide kursiv geschrieben sind. Das entstandene PCR-Produkt wird mit dem NheI-Restriktionsenzym gespalten, über Gel gereinigt und mit einem NheI-gespaltenen und SAP-dephosphorylierten pHC2000/Hyg(–)-Plasmid, das über Gel gereinigt wurde, ligiert. Das Plasmid mit der Insertion in der richtigen Orientierung und im richtigen Leserahmen wird pUBS2-Heavy2000/Hyg(–) genannt (11).
Zur Entfernung eines zusätzlichen Introns, das sich zwischen der variablen Domäne und der konstanten Domäne, die in pNUT-Ckappa vorkommt, befindet, und zur Verbindung des Signalpeptids und der variablen Domäne mit der konstanten Domäne der leichten Kette des humanen IgG1 des Wildtyps wurde mit dem Primer UBS-UP und dem Primer UBSLV-DOWN ein PCR-Produkt erzeugt, das die folgende Sequenz hat: 5'-GAT CCG TAC GCT TGA TCT CCA CCT TGG TC-3', wobei die eingefügte SunI-Schnittstelle unterstrichen ist. Dann wurde das entstandene PCR-Produkt mit den MluI- und SunI-Restriktionsenzymen gespalten, über Gel gereinigt und mit Plasmid pLC2001/DHFRwt ligiert, das mit MluI und SunI gespalten und über Gel gereinigt wurde. Das entstandene Plasmid wurde pUBS2-Light2001/DHFRwt genannt (12).
Das PCR-Produkt der schweren Kette von voller Länge von UBS-54 wird mit den NheI- und PmeI-Restriktionsenzymen gespalten und mit Klenow-Enzym glattendig gemacht. Dieses Fragment wird mit dem Plasmid pcDNAs3000/DHFRwt ligiert, das mit dem BstXI-Restriktionsenzym gespalten wird, glattendig gemacht, mit SAP dephosphoryliert und über Gel gereinigt wird. Das Plasmid mit der Insertion der schweren Kette wird PUBS-Heavy3000/DHFRwt genannt. Anschließend wird das PCR-Produkt der leichten Kette mit MluI- und PmeI-Restriktionsenzymen gespalten, glattendig gemacht, über Gel gereinigt und mit PUBS-Heavy3000/DHFRwt ligiert, das mit HpaI gespalten, mit tSAP dephosphoryliert und über Gel gereinigt wird, Der entstandene Vektor wird PUBS-3000/DHFRwt genannt (13). Das Gen, das die schwere Kette von UBS-54 ohne Intron zwischen der variablen Domäne und der ersten konstanten Region und mit einer konstanten Region (2031 Nucleotide) mit einem Carboxyl-Ende des Wildtyps codiert, wird nach der Spaltung von pUBS2-2000/Hyg(–) durch EcoRI und PmeI und nach Behandlung mit Klenow-Enzym und freien Nucleotiden, um die EcoRI-Schnittstelle glattendig zu machen, über Gel gereinigt. Anschließend wird die Insertion mit Plasmid pcDNAs3000/DHFRwt ligiert, das mit BstXI gespalten, glattendig gemacht, mit SAP dephosphoryliert und über Gel gereinigt wird. Das entstandene Plasmid wird pUBS2-Heavy3000/DHFRwt genannt. pUBS2-Light2001/DHFRwt wird dann mit EcoRV und PmeI gespalten und die Insertion aus 755 Nucleotiden, die das Signalpeptid enthält, das an die variable Domäne der kappa-Kette von UBS-54 und an die konstante Domäne der kappa-Kette des humanen IgG1 ohne eine Intron-Sequenz gebunden ist, wird über Gel gereinigt und mit pUBS2-Heavy3000/DHFRwt ligiert, das mit HpaI gespalten, mit tSAP dephosphoryliert und über Gel gereinigt wird. Das entstandene Plasmid wird pUBS2-3000/DHFRwt genannt (14).
Plasmid pRc/CMV (Invitrogen) wurde mit BstBI-Restriktionsenzymen gespalten, mit Klenow-Enzym glattendig gemacht und anschließend mit XmaI-Enzym gespalten. Das Fragment, das das Gen für Neomycinresistenz enthält, wurde über Agarose-Gel gereinigt und mit dem pUBS2-Light2001/DHFRwt-Plasmid ligiert, das mit XmaI- und PmlI-Restriktionsenzymen gespalten, anschließend mit SAP dephosphoryliert und über Gel gereinigt wurde, um die DHFR-cDNA zu entfernen. Das entstandene Plasmid wurde PUBS-Light2001/Neo genannt. Das Fragment wurde ebenfalls mit einem XmaI/PmlI-gespaltenen und gelgereinigten pcDNA2001/DHFRwt-Plasmid ligiert, wobei pcDNA2001/Neo entstand. Das PCR-Produkt der variablen Domäne von UBS-54 und das gespaltene und gereinigte PCR-Produkt der konstanten Domäne wurden in einer drei-Punkt-Ligierung mit einem MluI/PmeI-gespaltenen pcDNA2001/Neo verwendet. Das entstandene Plasmid wurde pUBS2-Light2001/Neo genannt.
Beispiel 4: Bildung von CAMPATH-1H-Expressionsvektoren.
Cambridge Bioscience Ltd. (UK) stellt ein Fragment aus 396 Nucleotiden her, das eine perfekte Kozak-Sequenz, gefolgt von der Signalsequenz und der variablen Region der veröffentlichten leichten Kette von CAMPATH-H1 enthält (Crowe et al., 1992). Dieses Fragment enthält am 5'-Ende eine einzige eingefügte HindIII-Schnittstelle und am 3'-Ende eine einzige eingefügte SunI–Schnittstelle und wird in einen geeigneten Shuttlevektor cloniert. Dieses Plasmid wird mit HindIII und SunI gespalten und das entstandene CAMPATH-1H-Fragment mit leichter Kette wird über Gel gereinigt und in ein HindIII/SunI-gespaltenes und über Agarose-Gel gereinigtes pLC2001/DHFRwt ligiert. Das entstandene Plasmid wird pCAMPATH-Light2001/DHFRwt genannt. Cambridge Bioscience Ltd. (UK) stellte ein Fragment aus 438 Nucleotiden her, das eine perfekte Kozak-Sequenz, gefolgt von der Signalsequenz und der veröffentlichten variablen Region der schweren Kette von CAMPATH-H1 enthält (Crowe et al., 1992), die in einen geeigneten Clonierungsvektor cloniert wurde. Dieses Produkt enthält am 5'-Ende eine einzige Erkennungsstelle für das HindIII-Restriktionsenzym und am 3'-Ende eine einzige Erkennungsstelle für das NheI-Restriktionsenzym. Dieses Plasmid wurde mit HindIII und NheI gespalten und das entstandene CAMPATH-1H-Fragment mit schwerer Kette wurde auf Gel gereinigt und in ein gereinigtes und HindIII/NheI-gespaltenes pHC2000/Hyg(–) ligiert. Das entstandene Plasmid wurde pCAMPATH-Heavy2000/Hyg(–) genannt.
Beispiel 5: Bildung von 15C5-Expressionsvektoren.
Die schwere Kette der humanisierten Version des monoclonalen Antikörpers 15C5, der gegen das D-Dimer des humanen Fibrinfragmentes gerichtet ist (Bulens et al., 1991; Vandamme et al., 1990), die aus den humanen konstanten Domänen einschließlich Intronsequenzen, Gelenk-Region und variablen Regionen besteht, wobei das Signalpeptid der leichten kappa-Kette von 15C5 vorangeht, wird durch PCR mit Hilfe von CAMH-DOWN als Primer stromabwärts und 15C5-UP als Primer stromaufwärts, auf dem Plasmid ”pCMgamma-NEO-Skappa-Vgamma-Cgamma-hu” als Matrize amplifiziert. 15C5-UP hat die folgende Sequenz: 5'-GA TCA CGC GTG CTA GCC ACC ATG GGT ACT CCT GCT CAG TTT CTT GGA ATC-3', wobei die eingefügten MluI- und NheI-Restriktions-Erkennungsstellen unterstrichen sind und die perfekte Kozak-Sequenz kursiv dargestellt ist. Zur richtigen Einfügung des geeigneten Kozak-Kontextes wird das Adenin an Position +4 (das Adenin im ATG-Startcodon hat +1) durch ein Guanin ersetzt, was zu einer Mutation von einer Arginin- in eine Glycin-Aminosäure führt. Position +6 von Guanin wird durch ein Thymin ersetzt und die Position +9 von Cytosin wird durch Thymin ersetzt, um eine Primer-Dimerisation zu verhindern. Letztere Mutation lässt den Threoninrest intakt. Das entstandene PCR-Produkt wurde mit NheI- und PmeI–Restriktionsenzymen gespalten, über Gel gereinigt und mit einem NheI- und PmeI–gespaltenen pcDNA2000/Hygro(–), das mit SAP dephosphoryliert und über Agarose-Gel gereinigt wird, ligiert. Das entstandene Plasmid wird p15C5-Heavy2000/Hyg(–) genannt. Die leichte Kette der humanisierten Version des monoclonalen Antikörpers 15C5, der gegen das D-Dimer des humanen Fibrinfragments gerichtet ist (Bulens et al., 1991; Vandamme et al., 1990), die aus der humanen konstanten Domäne und variablen Regionen besteht, denen ein Signalpeptid aus 20 Aminosäuren vorangeht, wird durch PCR auf dem Plasmid ”pCMkappa-DHFR13-15C5kappa-hu” als Matrize amplifiziert, wobei CAML-DOWN als Primer stromabwärts und 15C5-UP als Primer stromaufwärts verwendet wird. Das entstandene PCR-Produkt wird mit NheI- und PmeI-Restriktionsenzymen gespalten, über Gel gereinigt und mit einem NheI- und PmeI-gespaltenen pcDNA2001/DHFRwt, das mit SAP dephosphoryliert und über Agarose-Gel gereinigt wird, ligiert. Das entstandene Plasmid wird p15C5-Light2001/DHFRwt genannt.
Beispiel 6: Ermittlung des Selektionsniveaus für Methotrexat, Hygromycin und G418.
PER.C6 und PER.C6/E2A wurden in verschiedenen Dichten ausgesät. Die Startkonzentration von Methotrexat (MTX) bewegte sich bei diesen Empfindlichkeitsstudien zwischen 0 nM und 2500 nM. Die Konzentration, die für beide Zelllinien gerade eben letal war, wurde bestimmt; wurden die Zellen in Dichten von 100.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen ausgebracht, waren die Vertiefungen bei 10 nM noch zu 100% konfluent und bei 25 nM zu ungefähr 90–100% konfluent, während bei einer Konzentration von 50 nM und darüber und nach mehr als 6 bis zu 15 Tagen Inkubation die meisten Zellen getötet wurden. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgelistet. PER.C6-Zellen wurden auf ihre Wider-standsfähigkeit gegen eine Kombination von Hygromycin und G418 getestet, um herauswachsende stabile Kolonien auszuwählen, die sowohl die schweren als auch die leichten Ketten für die jeweiligen rekombinanten monoclonalen Antikörper exprimierten, die von Plasmiden codiert werden, die entweder ein Hygromycin- oder ein Neomycin-Resistenzgen tragen. Wurden die Zellen auf normalem Medium, das 100 µg/ml Hygromycin und 250 µg/ml G418 enthält, gezüchtet, wurden die nicht-transfizierten Zellen getötet und stabile Kolonien konnten sich bilden (siehe Beispiel 7).
CHO-dhfr-Zellen ATCC:CRL9096 werden in verschiedenen Dichten in ihrem jeweiligen Kulturmedium ausgebracht. Die Startkonzentration von Methotrexat bewegt sich bei diesen Empfindlichkeitsstudien bei ungefähr 0,5 nM bis zu 500 nM. Die Konzentration, die für die Zelllinie gerade eben letal ist, wird bestimmt und anschließend im Fall der Selektion der schweren Kette von IgG (hyg) und der Selektion der leichten Kette (dhfr) direkt nach der Wachstumsselektion mit Hygromycin verwendet.
Beispiel 7: Transfektion von EPO-Expressionsvektoren, um stabile Zelllinien zu erhalten.
Zellen der Zelllinien PER.C6 und PER.C6/E2A wurden auf 40 Gewebskulturplatten (10 cm Durchmesser) mit ungefähr 2–3 Millionen Zellen/Platte aufgebracht und über Nacht unter ihren jeweiligen Bedingungen (10% CO₂-Konzentration und eine Temperatur, die für PER.C6/E2A bei 39°C und für PER.C6 bei 37°C liegt) gehalten. Am nächsten Tag wurden die Transfektionen alle bei 37°C mit Hilfe von Lipofectamin (Gibco) durchgeführt. Nachdem sie nach 4 Stunden mit frischem Medium (DMEM) versetzt worden waren, wurden die PER.C6/E2A-Zellen wieder auf 39°C umgestellt, während die PER.C6-Zellen bei 37°C gehalten wurden. Von jeder Zelllinie wurden gemäß Standardprotokollen 20 Platten mit 5 µg ScaI-gespaltenem pEPO2000/DHFRwt transfiziert und 20 Platten wurden mit 5 µg ScaI-gespaltenem pEPO2000/DHFRm transfiziert. Weitere 13 Platten dienten als negative Kontrollen für die Abtötung durch Methotrexat und die Wirksamkeit der Transfektion, die bei ungefähr 50% lag. Am nächsten Tag wurde zu den Platten MTX, das in Medium, das dialysiertes FBS enthielt, gelöst war, in Konzentrationen zwischen 100 und 1000 nM für DHFRwt und 50.000 bis 500.000 nM für DHFRm hinzugefügt. Die Zellen wurden über einen Zeitraum von 4–5 Wochen inkubiert. Das Gewebemedium (das MTX enthielt) wurde alle zwei bis drei Tage aufgefrischt. Die Zellen wurden täglich auf Todesfälle überwacht, wobei zwischen den positiven und negativen Kontrollen verglichen wurde. Herauswachsende Kolonien wurden entnommen und subkultiviert. Von den Transfektanten, die das mutierte DHFR-Gen erhielten, konnten keine positiven Clone subkultiviert werden, sehr wahrscheinlich aufgrund toxischer Auswirkungen der hohen MTX-Konzentrationen, die verwendet wurden. Von den PER.C6- und PER.C6/E2A-Zellen, die mit dem DHFR-Gen des Wildtyps transfiziert wurden, konnten nur im Verlauf der ersten Passagen, wenn die Zellen auf 100 nM MTX gezüchtet wurden, Zelllinien etabliert werden, obwohl sich auf Platten mit 250 und 500 nM MTX Kolonien bildeten. Diese Clone waren während des Subkultivierens nicht lebensfähig und wurden aussortiert.
Beispiel 8: Subkultivierung von transfizierten Zellen.
Von jeder Zelllinie wurden anschließend ungefähr 50 ausgewählte Kolonien, die gegenüber der Schwellen-MTX-Konzentration resistent waren, in Platten mit 96 Vertiefungen, 24 Vertiefungen, 6 Vertiefungen und in T25-Erlenmeyerkolben in ihrem jeweiligen Medium plus MTX gezüchtet. Wenn die Zellen in den T25-Gewebskultur-Erlenmeyerkolben ihr Wachstum erreicht hatten, wurde mindestens ein Gefäß von jedem Clon eingefroren und aufbewahrt und anschließend auf die Bildung von humanem rekombinantem EPO hin überprüft. Hierfür wurde der kommerzielle ELISA-Kit von R&D Systems verwendet (Quantikine IVD humanes EPO, Quantitative Colorimetric Sandwich ELISA, Kat. # DEPOO). Da die verschiedenen Clone unterschiedliche Wachstumskennzeichen und Wachstumskurven zu haben schienen, wurde für die EPO-Herstellung folgender Standard festgelegt: Am Tag 0 wurden die Zellen in T25-Gewebskultur-Erlenmeyerkolben in Konzentrationen, die sich zwischen 0,5 und 1,5 Millionen pro Erlenmeyerkolben bewegten, ausgebracht. Am Tag 4. Kulturüberstand wurde entnommen und im EPO-ELISA verwendet. Hiervon wurde das Produktionsniveau als ELISA-Einheiten pro Million ausgebrachter Zellen pro Tag (U/1E6/Tag) festgelegt. Einige dieser Clone sind in Tabelle 2 angegeben.
Der folgenden Auswahl gut produzierender Clone erfolgte auf der Basis von hoher Expression, Kulturverhalten und Lebensfähigkeit. Um Untersuchungen zur langfristigen Lebensfähigkeit, zum Suspensionswachstum in Rollflaschen und im Bioreaktor während verlängerter Zeiträume zu ermöglichen, wurden weitere Gefäße mit den Clonen, die am besten produzierten, eingefroren und für weitere Untersuchungen wurden von jeder Zelllinie die folgenden besten Produzenten ausgewählt: P8, P9, E17 und E55, wobei ”P” für PER.C6 steht und ”E” für PER.C6/E2A. Diese Clone werden subkultiviert und über einen Zeitraum von zwei Monaten zunehmenden Dosen von Methotrexat ausgesetzt. Man beginnt mit der Schwellen-Konzentration und erhöht die Konzentration auf ungefähr 0,2 mM. Während dieser zwei Monate werden die EPO-ELISA-Experimente auf einer normalen Basis durchgeführt, um eine Zunahme der EPO-Produktion festzustellen. Bei der höchsten Methotrexat-Konzentration wird der stabilste Produzent ausgewählt, mit den Mengen des besten CHO-Clons verglichen und für Zellbankherstellung (RL) verwendet. Von jedem anderen Clon werden 5 Gefäße eingefroren. Die Anzahl der amplifizierten EPO-cDNA-Kopien wird mit Hilfe des Southern-Blot-Verfahrens nachgewiesen.
Beispiel 9: EPO-Herstellung in Bioreaktoren.
P9, die leistungsfähigste EPO-produzierende, transfizierte, stabile Zelllinie von PER.C6 wurde in Suspension gebracht und die Produktion auf 1 bis 2 Liter-Fermenter gebracht. Um P9 in Suspension zu bringen, wurden anhaftende Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit JRH-ExCell-525-Medium für PER.C6 (JRH) inkubiert, wonach sich die Zellen vom Erlenmeyerkolben lösen und die Suspensionskultur bilden. Die Zellen wurden in zwei MTX-Konzentrationen gehalten: 0 nM und 100 nM. Das allgemeine EPO-Produktionsniveau, das man mit diesen Konzentrationen (in Rollflaschen) erhielt, lag bei 1500 beziehungsweise 5700 Einheiten pro Million ausgebrachter Zellen pro Tag. Obwohl man die geringeren Erträge in Abwesenheit von MTX mit der Entfernung der integrierten DNA erklären kann, scheint die integrierte DNA eine bremsende Wirkung zu haben, da Zellen, die über längere Zeiträume bei geringeren MTX-Konzentrationen gehalten werden, ihre früheren Erträge erreichen, wenn man sie wieder in MTX-Konzentrationen von 100 nM überträgt (siehe Beispiel 11).
Die P9-Zellsuspension wurde normal mit 100 nM MTX gezüchtet und zur Inokulation von Bioreaktoren verwendet. Es wurden zwei Bioreaktor-Ansätze überprüft:
Perfusions-Kulturen und wiederholte Batch-Kulturen.
A. Perfusion in einem 2-Liter-Bioreaktor.
Die Zellen wurden in einer Konzentration von 0,5 × 10⁶ Zellen pro ml ausgebracht und die Perfusion wurde am Tag 3 gestartet, nachdem die Zellen eine Dichte von ungefähr 2,3 × 10⁶ Zellen pro ml erreicht hatten. Die Perfusionsrate lag bei 1 Volumen alle 24 Stunden bei einer Entnahme von ungefähr 250 ml alle 24 Stunden. Bei diesem Ansatz behielten die P9-Zellen für mehr als einen Monat eine konstante Dichte von ungefähr 5 × 10⁶ Zellen pro ml und eine Lebensfähigkeit von fast 95%. Die EPO-Konzentration wurde auf regulärer Basis bestimmt und ist in 15 dargestellt. Im 2-Liter-Perfusions-Bioreaktor konnten die P9-Zellen ein Produktionsniveau von ungefähr 6000 ELISA-Einheiten pro ml aufrechterhalten. Bei einer Perfusionsrate von 1 Arbeitsvolumen pro Tag (1,5 bis 1,6 Liter) bedeutet dies, dass die P9-Zellen bei diesem 2-Liter-Ansatz in Abwesenheit von MTX ungefähr 1 × 10⁷ Einheiten pro Tag pro 2-Liter-Bioreaktor produzierten.
B. Wiederholte Batchkultur in einem 2-Liter-Bioreaktor.
Man verwendete P9-Suspensionszellen, die in Rollflaschen gezüchtet worden waren, um einen 2-Liter-Bioreaktor in Abwesenheit von MTX zu inokulieren und ließ sie bis zu einer Dichte von ungefähr 1,5 Millionen Zellen pro ml wachsen, wonach ein Drittel der Population entfernt wurde (±1 Liter alle 2 bis 3 Tage) und die verbleibende Kultur wurde mit frischem Medium verdünnt, um wieder eine Dichte von 0,5 Millionen Zellen pro ml zu erreichen. Dieses Verfahren wurde 3 Wochen lang wiederholt und das Arbeitsvolumen bei 1.6 Litern gehalten. Die EPO-Konzentrationen wurden im entfernten Medium bestimmt und sind in 16 dargestellt. Die Durchschnittskonzentration lag bei ungefähr 3000 ELISA-Einheiten pro ml. Dies bedeutet, dass die P9-Zellen in diesem 2-Liter-Ansatz während eines durchschnittlichen Zeitraums von 2 Tagen, wonach die Population verdünnt wurde, in Abwesenheit von MTX ungefähr 1,5 × 10⁶ Einheiten pro Tag produzierten.
C. Wiederholte Batchkultur in einem 1-Liter-Bioreaktor mit verschiedenen Konzentrationen von gelöstem Sauerstoff, verschiedenen Temperaturen und verschiedenen pH-Werten.
Man ließ frische P9-Suspensionszellen in Anwesenheit von 100 nM MTX in Rollflaschen wachsen und verwendete sie zur Inokulation von 4 × 1-Liter-Bioreaktoren bis zu einer Dichte von 0,3 Millionen Zellen pro ml in JRH-Excell-525-Medium. Die EPO-Erträge wurden nach 3, 5 und 7 Tagen bestimmt. Die ersten überprüften Ansätze enthielten: 0,5%, 10%, 150% und als positive Kontrolle 50% Gelösten Sauerstoff (%DO). PER.C6- und P9-Zellen werden normalerweise bei 50% DO gehalten. In einem weiteren Durchgang wurden P9-Zellen inokuliert und bei verschiedenen Temperaturen (32°C, 34°C, 37°C und 39°C) auf eine EPO-Produktion überprüft, wobei 37°C der normale Ansatz für PER.C6 und P9 ist, und im dritten Durchgang wurden frische P9-Zellen inokuliert und bei verschiedenen pH-Werten (pH 6,5, pH 6,8, pH 7,0 und pH 7,3) auf eine EPO-Produktion überprüft. PER.C6-Zellen werden normalerweise bei einem pH-Wert von 7,3 gehalten. Ein Überblick über die EPO-Erträge (drei Tage nach Ausbringung) wird in 17 gezeigt. Die EPO-Konzentrationen nehmen offensichtlich zu, wenn die Temperatur von 32°C auf 39°C steigt, was man auch bei den PER.C6/E2A-Zellen, die bei 39°C wuchsen, beobachtet hat (Tabelle 4) und für P9 ist innerhalb des hier getesteten Bereichs 50% DO optimal. Bei einem pH-Wert von 6,5 können die Zellen nicht überleben, da die Lebensfähigkeit in diesem Bioreaktor nach 7 Tagen unter 80% abfiel. EPO-Proben, die in diesen Ansätzen produziert worden waren, werden mit Hilfe der 2D-Elektrophorese auf Glycosylierung und Ladung überprüft (siehe auch Beispiel 17).
Beispiel 10: Amplifikation des DHFR-Gens.
Einige der in Beispiel 8 beschriebenen Zelllinien wurden in einem Amplifikationsexperiment verwendet, um festzustellen, ob es möglich ist, die Anzahl der DHFR-Gene durch eine Zunahme der MTX-Konzentration über einen Zeitraum von mehr als zwei Monaten zu erhöhen. Man fing mit der Schwellen-Konzentration (100 nM) an und erhöhte die Konzentration in Zwischenschritten von 200 nM, 400 nM, 800 nM und 1200 nM bis auf 1800 nM. Während dieses Zeitraums wurden die EPO-ELISA-Experimente auf regulärer Basis durchgeführt, um die Einheiten pro Million ausgebrachter Zellen pro Tag nachzuweisen (18). Bei der höchsten MTX-Konzentration (1800 nM) wurden einige Gefäße eingefroren. Zellniederschläge wurden erhalten und DNA wurde extrahiert, die anschließend mit BglII gespalten wurde, da dieses Enzym im Bereich des DHFR-Gens des Wildtyps in pEPO2000/DHFRwt schneidet (5), so dass eine unterschiedliche DHFR-Bande dieser Größe in einem Southern-Blot-Verfahren von den endogenen DHFR-Banden zu unterscheiden sein würde. Man ließ diese DNA laufen und es wurde ein Blot hergestellt und der Blot wurde mit einer radioaktiven DHFR-Sonde und anschließend mit einer Adenovirus-E1-Sonde als Hintergrundkontrolle hybridisiert (19). Die Intensitäten der Hybridisierungsbanden wurden in einem Phosphorabbildungsgerät gemessen und auf Hintergrundlevel korrigiert. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Es ist offensichtlich möglich, in PER.C6-Zellen eine Amplifikation des DHFR-Gens zu erhalten, wenn auch in diesem Fall nur mit dem endogenen DHFR und nicht mit dem integrierten Vektor.
Beispiel 11: Stabilität der EPO-Expression in stabilen Zelllinien.
Einige der in Beispiel 8 erwähnten Zelllinien wurden einer langfristigen Kultivierung in Anwesenheit und Abwesenheit von MTX ausgesetzt. Die EPO-Konzentrationen wurden regelmäßig gemessen, wobei pro T25-Erlenmeyerkolben 1,0 bis 1,5 × 10⁶ Zellen ausgebracht und für 4 Tage belassen wurden, um das Produktionsniveau von EPO pro Million ausgebrachter Zellen pro Tag zu berechnen. Die Ergebnisse sind in 20 dargestellt. Daraus lässt sich schließen, dass es in P9-Zellen eine relativ stabile EPO-Expression gibt, wenn die Zellen in Anwesenheit von MTX kultiviert werden, und dass es in Abwesenheit von MTX zu einer Abnahme der EPO-Produktion kommt. Wurden die P9-Zellen jedoch wieder in 100 nM MTX gebracht, nachdem sie über einen längeren Zeitraum ohne MTX kultiviert worden waren, erreichte das exprimierte EPO sein ursprüngliches Niveau (± 3000 ELISA-Einheiten pro Million ausgebrachter Zellen pro Tag), was darauf hindeutet, dass die integrierten Plasmide abgeschaltet, aber stabil integriert sind und wieder angeschaltet werden können. Zwischen den Zelllinien P8 und P9 scheint es Unterschiede zu geben, weil das Produktionsniveau von P8 in Anwesenheit von MTX mit der Zeit über eine hohe Anzahl von Passagen hinweg abnimmt (20A), während die P9-Produktion über mindestens 62 Passagen hinweg stabil bleibt (20B).
Beispiel 12: Vorübergehende Expression von rekombinantem EPO in anhaftenden Zellen und in Suspensionszellen nach Plasmid-DNA-Transfektionen.
pEPO2000/DHFRwt-, pEPO2000/DHFRm- und pAdApt.EPO-Plasmide von Beispiel 2 werden auf Säulen von E. coli gereinigt und mit Hilfe von Lipofectamin, Elektroporation, PEI oder anderen Verfahren transfiziert. PER.C6- oder PER.C6/E2A-Zellen werden gezählt und in DMEM plus Serum oder in JRH-Excell-525-Medium oder in einem Medium, das für eine Transfektion in Suspension geeignet ist, ausgebracht.
Die Transfektion wird, gemäß der Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, bei 37°C abhängig vom verwendeten Transfektionsvefahren bis zu 16 Stunden lang durchgeführt. Anschließend werden die Zellen verschiedenen Temperaturen ausgesetzt und das Medium wird durch frisches Medium mit oder ohne Serum ersetzt. Für den Fall, dass es erforderlich ist, Medium zu erhalten, das völlig frei von Serumkomponenten ist, wird das frische Medium, das kein Serum enthält, nach 3 Stunden wieder entfernt und wieder durch Medium, das keine Serumkomponenten enthält, ersetzt. Zur Feststellung der rekombinanten EPO-Produktion werden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen. Erträge an rekombinantem Protein werden mit Hilfe eines ELISA-Kits (R&D Systems) bestimmt, wobei 1 Einheit ungefähr 10 ng an rekombinantem CHO-produziertem EPO-Protein (100.000 Einheiten/mg) entspricht. Die in diesen Experimenten verwendeten Zellen wachsen je nach ihrer Herkunft, ihren Merkmalen und der Temperatur mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Deshalb wird die Menge des produzierten rekombinanten EPO im Allgemeinen in ELISA-Einheiten/10⁶ ausgebrachten Zellen/Tag berechnet, wobei berücksichtigt wird, dass die Antiseren, die im ELISA-Kit verwendet werden, nicht zwischen nicht- und hochglycosyliertem rekombinantem EPO unterscheiden. Im Allgemeinen werden die Proben für diese Berechnungen am Tag 4, nachdem man das Medium nach der Transfektion ausgewechselt hat, entnommen.
PER.C6/E2A-Zellen, die mit Hilfe von Lipofectamin bei 37°C transfiziert und anschließend bei 39°C in Anwesenheit von Serum gezüchtet wurden, produzierten typischerweise 3100 Einheiten/10⁶ Zellen/Tag. In Abwesenheit von Serumkomponenten ohne jegliche Auffrischung mit serumfreiem Medium, produzierten diese Lipofectamin-transfizierten Zellen typischerweise 2600 Einheiten/10⁶ Zellen/Tag. PER.C6-Zellen, die mit Hilfe von Lipofectamin bei 37°C transfiziert und anschließend bei 37°C in Anwesenheit von Serum gezüchtet wurden, produzierten typischerweise 750 Einheiten/10⁶ Zellen/Tag und in Abwesenheit von Serum 590 Einheiten/10⁶ Zellen/Tag. Zum Vergleich wurden die gleichen Expressionsplasmide pEPO2000/DHFRwt und pEPO2000/DHFRm ebenfalls verwendet, um Eizellen des Chinesischen Hamsters (CHO, ECACC-Nr. 85050302) mit Hilfe von Lipofectamin, PEI, Calciumphosphat-Verfahren und anderen Verfahren zu transfizieren. Wurden CHO-Zellen mit Hilfe von Lipofectamin transfiziert und anschließend in Hams-F12-Medium in Anwesenheit von Serum kultiviert, erhielt man einen Ertrag von 190 Einheiten/10⁶ Zellen/Tag. In Abwesenheit von Serum wurden 90 Einheiten/10⁶ Zellen/Tag produziert, obwohl man höhere Erträge erzielen kann, wenn die Transfektionen in DMEM durchgeführt werden.
Es wurden auch verschiedene Platten, die anhaftende PER.C6/E2A-Zellen enthielten, bei 37°C mit pEPO2000/DHFRwt-Plasmid transfiziert und anschließend 32°C, 34°C, 37°C oder 39°C ausgesetzt, um den Einfluss der Temperatur auf die rekombinante EPO-Produktion festzustellen. Berechnet anhand einer Probe von Tag 4 wurde ein temperaturabhängiges Produktionsniveau beobachtet, das von 250 bis 610 Einheiten/10⁶ ausgebrachter Zellen/Tag reichte, was darauf hindeutet, dass der zwischen PER.C6 und PER.C6/E2A beobachtete Unterschied im Produktionsniveau zum Teil an den Inkubationstemperaturen liegt (siehe auch 17). Da PER.C6/E2A bei 37°C gut wächst, wurden weitere Untersuchungen bei 37°C durchgeführt.
Verschiedene Platten, die anhaftende PER.C6- und PER.C6/E2A-Zellen enthalten, wurden mit pEPO2000/DHFRwt, pEPO2000/DHFRm und pAdApt.EPO mit Hilfe von Lipofectamin transfiziert. Vier Stunden nach der Transfektion wurde das DMEM entweder durch DMEM plus Serum oder durch JRH-Medium ohne Serum ersetzt und EPO konnte sich im Überstand für einige Tage anreichern, um die Konzentrationen, die in den verschiedenen Medien produziert wurden, festzustellen. PER.C6-Zellen wurden bei 37°C inkubiert, während PER.C6/E2A-Zellen bei 39°C gehalten wurden. Da sie eine ähnliche Expressionskassette enthalten, wurden die Daten der verschiedenen Plasmide gemittelt. Berechnet anhand einer Probe von Tag 6, erhielt man folgende Daten: PER.C6, die in DMEM gewachsen waren, produzierten 400 Einheiten/10⁶ ausgebrachter Zellen/Tag und wenn sie in JRH-Medium gehalten wurden, produzierten sie 300 Einheiten/10⁶ ausgebrachter Zellen/Tag. PER.C6/E2A, die in DMEM gewachsen waren, produzierten 1800 Einheiten/10⁶ ausgebrachter Zellen/Tag und wenn sie in JRH-Medium gehalten wurden, produzierten sie 1100 Einheiten/10⁶ ausgebrachte Zellen/Tag. Erneut wurde ein klarer Unterschied im Produktionsniveau zwischen PER.C6 und PER.C6/E2A beobachtet, obwohl dies zum Teil an den Temperaturunterschieden liegen könnte (siehe oben). Bei den PER.C6/E2A-Zellen war jedoch ein signifikanter Unterschied zwischen der Konzentration in DMEM vs der Konzentration in JRH-Medium, obwohl dieser Effekt bei PER.C6-Zellen beinahe komplett verschwunden war.
Die Daten zur EPO-Expression, die in diesem System erhalten wurden, sind in Tabelle 4 aufgelistet. PER.C6 und Derivate davon können zur Maßstabs-Vergrößerung des DNA-Transfektionssystems verwendet werden. Gemäß Wurm und Bernard (1999) können Transfektionen bei Suspensionszellen mit 1–10 Liter-Ansätzen durchgeführt werden, wobei mit Hilfe der Elektroporation Erträge von 1–10 mg/l (0,1–1 pg/Zelle/Tag) an rekombinantem Protein erreicht worden sind. Es besteht ein Bedarf für ein System, bei dem dies gut kontrolliert werden kann und die Erträge höher sein könnten, besonders zur Durchmusterung von großen Mengen von Proteinen und toxischen Proteinen, die nicht in einem stabilen Ansatz hergestellt werden können. Mit den Lipofectamin-Transfektionen in den besten PER.C6-Zellen in Abwesenheit von Serum erreichten wir 590 Einheiten/Million Zellen/Tag (+/– 5,9 pg/Zellen/Tag, wenn 1 ELISA-Einheit ungefähr 10 ng EPO entspricht), während PER.C6/E2A 31 pg/Zelle/Tag erreichte (in Anwesenheit von Serum). Das Medium, das für die Suspensionskulturen von PER.C6 und PER.C6/E2A verwendet wird (JRH-Excell-525) unterstützt effiziente vorübergehende DNA-Transfektionen nicht, wenn man Komponenten wie PEI verwendet. Deshalb wird das Medium daran angepasst, die Herstellung von rekombinantem EPO nach der Transfektion von pEPO2000/DHFRwt und pEPO2000/DHFRm, die eine rekombinante humane EPO-cDNA enthalten, und von pcDNA2000/DHFRwt zu ermöglichen, das andere cDNAs, die rekombinante Proteine codieren, enthält.
Zur Elektroporation oder bei anderen Verfahren zur Durchführung der Transfektion mit den gleichen Expressionsplasmiden verwendet man 1 bis 10 Liter Suspensionskulturen von PER.C6 und PER.C6/E2A, die in angepasstem Medium wachsen, um vorübergehende DNA-Transfektionen unter Verwendung von gereinigter Plasmid-DNA zu unterstützen. Nach einigen Stunden wird das Transfektionsmedium entfernt und durch frisches Medium ohne Serum ersetzt. Das rekombinante Protein kann sich im Überstand für einige Tage anreichern, wonach der Überstand geerntet wird und alle Zellen entfernt werden. Der Überstand wird für eine Prozessierung stromabwärts verwendet, um das rekombinante Protein zu reinigen.
Beispiel 15: Reinigung und Analyse von rekombinantem EPO.
In Bioreaktoren werden große Chargen wachsender Zellen hergestellt, das ausgeschiedene rekombinante humane EPO-Protein wird mit. Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt. Das aus stabilen PER.C6- und PER.C6/E2A-Clonen oder Transfektanten gereinigte, rekombinante humane EPO-Protein wird durch Vergleich mit kommerziell erhältlichem EPO und gereinigtem EPO von humaner Herkunft (Urin) mit Hilfe von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, auf Glycosylierung und Faltung überprüft (siehe Beispiel 16 und 17). Gereinigte und glycosylierte EPO-Proteine von PER.C6 und PER.C6/E2A werden mit in-vivo-Experimenten und in Mäusemilz, wie beschrieben (Krystal (1983), sowie mit in-vitro-Versuchen (siehe Beispiel 18) auf ihre biologische Aktivität überprüft.
Beispiel 16: Aktivität der beta-Galactosid-alpha-2,6-Sialyltransferase in PER.C6
Man weiß, dass die Eizellen des Chinesischen Hamsters (CHO) kein Gen für beta-Galactosid-alpha-2,6-Sialyltransferase enthalten, was zum Fehlen von alpha-2,6-verknüpften Sialinsäuren an den Enden der N- und O-verknüpften Oligosaccharide endogener und rekombinanter Glycoproteine, die von diesen CHO-Zellen gebildet werden, führt. Da in CHO-Zellen das Gen für die alpha-2,3-Sialyltransferase vorhanden ist, gehören Proteine, die in diesen Zellen gebildet werden, typischerweise zum 2,3-Bindungstyp. EPO, das aus menschlichem Urin gereinigt wurde, enthält jedoch sowohl alpha-2,3- als auch alpha-2,6-verknüpfte Sialinsäuren. Um festzustellen, ob PER.C6-Zellen, eine humane Zelllinie, rekombinantes EPO bilden können, das sowohl alpha-2,3- als auch alpha-2,6-Verbindungen enthält, wurde an rekombinantem EPO, das nach Transfektion mit EPO-Expressionsvektoren von PER.C6-Zellen gebildet worden war, ein direkter Neuraminidase-Test durchgeführt. Zur Kontrolle wurden kommerziell erhältliche Eprex-Proben verwendet, die von CHO-Zellen stammten und nur Sialinsäure-Verbindungen vom alpha-2,3-Typ enthalten sollten. Die verwendeten Neuraminidasen waren vom Newcastle-Disease-Virus (NDV), das alpha-2,3-verknüpfte Neuraminsäuren (Sialinsäuren) spezifisch von N- und O-verknüpften Glykanen spaltet, und von Vibriocholerae (VC), das unspezifisch sämtliche endständige N- oder O-verknüpfte Sialinsäuren spaltet (alpha-2,3-, alpha-2,6- und alpha-2,8-Verbindungen). Beide Neuraminidasen waren von Boehringer und wurden gemäß der Anweisungen des Herstellers mit den Proben inkubiert. Die Ergebnisse sind in 21A dargestellt. Auf den Bahnen 2 und 3 (Behandlung mit NDV-Neuraminidase) wird im Vergleich zu Bahn 1 (unbehandeltes PER.C6-EPO) eine leichte Verschiebung beobachtet. Inkubierte man diese EPO-Probe mit VC-abgeleiteter Neuraminidase, wird im Vergleich zu NDV-behandelten Proben sogar eine schneller wandernde Bande beobachtet. Mit dem kommerziell erhältlichen Eprex wurde jedoch nur dann eine Verschiebung beobachtet, wenn NDV-abgeleitete Neuraminidase verwendet wurde (Bahnen 6 und 7 verglichen mit der unbehandelten Probe in Bahn 5) und nicht, wenn VC-Neuraminidase verwendet wurde (Bahn 8).
Um weiterhin zu zeigen, dass wirklich keine Sialinsäuren vom alpha-2,6-Bindungstyp auf CHO-Zellen vorkommen, dass sie aber tatsächlich bei Proteinen auf der Zelloberfläche von PER.C6-Zellen vorhanden sind, wurde das folgende Experiment durchgeführt: CHO-Zellen wurden mit Hilfe von Trypsin-EDTA von der festen Unterstützung gelöst, während PER.C6-Zellen als Suspensionszellen verwendet wurden. Beide Suspensionen wurden einmal mit Mem-5%-FBS gewaschen und in diesem Medium für 1 Std. bei 37°C inkubiert. Nachdem sie mit PBS gewaschen worden waren, wurden die Zellen auf ungefähr 10⁶ Zellen/ml in Bindemedium (Trisgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,5, 0,5%BSA und je 1 mM MgCl₂, MnCl₂ und CaCl₂) resuspendiert. Aliquots der Zellen wurden für 1 Std. bei Zimmertemperatur mit den DIG-markierten Lectinen Sambucus nigra-Agglutinin (SNA) und Maackia amurensis-Agglutinin (MAA) inkubiert, die spezifisch an Sialinsäurebindungen vom alpha-2,6-Gal- bzw. vom alpha-2,3-Gal-Typ binden. Kontrollzellen wurden ohne Lectine inkubiert. Nach 1 Stunde wurden sowohl die Lectin-behandelten als auch die Kontrollzellen mit PBS gewaschen und dann für 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit FITC-markiertem anti-DIG-Antikörper (Boehringer-Mannheim) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit einem FACsort-Apparat (Becton Dickinson) auf Fluoreszenzintensität analysiert. Die FACS-Analyse ist in 21B dargestellt. Wird das SNA-Lectin mit CHO-Zellen inkubiert, ist im Vergleich zu nicht-behandelten Zellen keine Verschiebung erkennbar, während man eine deutliche Verschiebung (dunkle Felder) im Vergleich zu nicht-behandelten Zellen (offene Felder) beobachtet, wenn dieses Lectin mit PER.C6-Zellen inkubiert wird. Werden beide Zelllinien mit dem MAA-Lectin inkubiert, zeigen beide Zelllinien im Vergleich zu nicht-behandelten Zellen eine deutliche Verschiebung.
Diese EPO-Spaltungen und FACS-Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass es in humanen PER.C6-Zellen eine beta-Galactosid-alpha-2,6-Sialyltransferase-Aktivität gibt, die es in Hamster-CHO-Zellen nicht gibt.
Beispiel 17: Bestimmung des Sialinsäuregehaltes in EPO, das in PER.C6 gebildet wurde.
Die endständigen Neuraminsäuren (oder Sialinsäuren), die sich auf den N- und O-verknüpften Glykanen von EPO befinden, schützen das Protein davor, durch Leberenzyme aus dem Blutstrom entfernt zu werden. Da diese Sialinsäuren negativ geladen sind, kann man darüber hinaus abhängig von ihrer Ladung oder ihrem spezifischen pJ-Wert zwischen verschiedenen EPO-Formen unterscheiden. Daher wurde EPO, das von PER.C6- und CHO-Zellen gebildet worden war, in 2-dimensionaler Elektrophorese verwendet, wobei die Proteine in der ersten Dimension anhand ihrer Ladung (pH-Bereich 3–10) und in der zweiten Dimension anhand ihres Molekulargewichts weiter getrennt werden.
Anschließend wurden die Proteine geblottet und in einem Western-Blot-Verfahren mit einem anti-EPO-Antikörper nachgewiesen.
Das getrennte EPO-Protein kann auch nachgewiesen werden, indem man das Gel mit Hilfe von Coomassie-Blau oder mit Silberfärbeverfahren anfärbt und anschließend verschiedene Flecken vom Gel entfernt und die spezifische Glycan-Zusammensetzung der verschiedenen N- oder O-verknüpften Glycosylierungen, die auf dem Protein vorkommen, mit Massenspektrometrie bestimmt.
22A zeigt einige EPO-Proben, die von P9-Überständen stammen. P9 ist die PER.C6-Zelllinie, die rekombinantes humanes EPO stabil exprimiert (siehe Beispiel 8). Diese Proben werden mit kommerziell erhältlichem Eprex verglichen, das nur EPO-Formen enthält, die ungefähr 9 bis 14 Sialinsäuren enthalten. Daher sollte Eprex negativ geladen sein und zur pH 3-Seite des Gels ausgerichtet sein. 22B zeigt einen Vergleich zwischen EPO, das von P9 eines Ansatzes mit anhaftenden Zellen stammt, wobei die Zellen in DMEM-Medium gezüchtet wurden, und EPO, das von CHO-Zellen stammt, die vorübergehend mit dem pEPO2000/DHFRwt-Vektor transfiziert wurden. Offensichtlich kann man in den CHO-Proben keine unteren EPO-Formen finden, während man in der P9-Probe sämtliche Formen sehen kann. Der Sialinsäuregehalt wird angegeben, indem man die Banden, die in der ersten Dimension getrennt wurden, von 1 bis 14 durchnummeriert. Da das Western-Blot-Verfahren mit Hilfe von ECL durchgeführt wurde und da es relativ unklar ist, welcher Antikörper auf dem Blot zum Nachweis der EPO-Moleküle verwendet wurde und da man nicht weiß, ob eine Glycosylierung die Erkennung durch den Antikörper oder den Transfer zur Nitrocellulose hemmen kann, ist es nicht möglich, den prozentualen Anteil jeder Form, die in diesen Gemischen vorkommt, zu bestimmen. Es ist jedoch möglich zu bestimmen, ob die getrennten Formen der Sialinsäure enthaltenden EPO-Moleküle vorhanden sind. Man kann daraus schließen, dass PER.C6 den gesamten Umfang der 14 Isoformen des rekombinanten humanen EPO, die Sialinsäure enthalten, bilden kann.
Beispiel 18: In-vitro-Funktionalität von EPO, das in PER.C6 gebildet wurde.
Die Funktion des rekombinanten EPO in vivo wird durch seine Halbwertszeit im Blutkreislauf bestimmt. Die Entfernung von EPO erfolgt durch Leberenzyme, die an Galactosereste in den Glycanen binden, die nicht durch Sialinsäuren geschützt sind, und durch Ausscheidung durch die Niere. Es ist nicht bekannt, ob diese Filtration durch die Niere aufgrund einer Fehlfaltung oder aufgrund von Unter- oder Fehl-Glycosylierung erfolgt. Des Weiteren werden auch EPO-Moleküle, die ihre Ziele im Knochenmark erreichen und an den EPO-Rezeptor auf den Vorgängerzellen binden, aus dem Kreislauf entfernt. Die Bindung an den EPO-Rezeptor und die Signalgebung stromabwärts hängen ganz wesentlich vom richtigen Glycosylierungsstatus des EPO-Moleküls ab. Bis zu einem gewissen Grad können Sialinsäuren die Bindung von EPO an den EPO-Rezeptor hemmen, was zu einer geringeren Wirksamkeit des Proteins führt. Da die Sialinsäuren jedoch verhindern, dass EPO entfernt wird, sind diese Zucker unentbehrlich für seine Funktion, um das Protein auf seinem Weg zum EPO-Rezeptor zu schützen. Entfernt man Sialinsäuren in vitro von EPO, kommt es zu einer besseren Bindung an den Rezeptor, was zu einer verstärkten Signalgebung stromabwärts führt. Das bedeutet, dass sich die Funktionalitäten in vivo und in vitro in signifikanter Weise unterscheiden, obwohl eine richtige EPO-Rezeptor-Bindungseigenschaft in vitro trotz der Möglichkeit einer Unter-Sialisierung, die in vivo zu einer kurzen Halbwertszeit führt, überprüft werden kann (Takeuchi et al., 1989).
Es wurden einige in vitro-Versuche zur EPO-Funktionalität beschrieben, wovon die Stimulation der IL3-, GM-CSF- und EPO-abhängigen humanen Zelllinie TF-1 am häufigsten verwendet wird. Hiermit kann man die Anzahl der Einheiten pro mg in vitro bestimmen (Kitamura et al., 1989; Hammerling et al., 1996). Zu anderen in vitro-Versuchen gehört die Bildung roter Kolonien unter einer Agaroseschicht von Knochenmarkszellen, die durch EPO zur Differenzierung angeregt wurden, die Integration von ⁵⁹Fe in das Häm gezüchteter Knochenmarkszellen der Maus (Krystal et al., 1981 und 1983; Takeuchi et al., 1989) sowie in Knochenmarkszellen der Ratte (Goldwasser et al., 1975) und der Radio-Immun-Assay (RIA), mit dessen Hilfe die Erkennung von EPO in Antiseren bestimmt wird. Von PER.C6/E2A-Zellen gebildetes EPO wurde verwendet, um TF-1-Zellen folgendermaßen zu stimulieren: die Zellen wurden Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von etwa 10.000 Zellen pro Vertiefung in Medium ohne IL3 oder GM-CSF, die die Wachstumsfaktoren sind, die diese Zellen in Kultur zu unendlichem Wachstum anregen können, ausgebracht. Anschließend wird Medium bis zu Endkonzentrationen von 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 und 10 Einheiten pro ml hinzugefügt. Diese Einheiten wurden mit ELISA bestimmt, während die Einheiten der positiven Kontrolle Eprex bekannt waren (4000 Einheiten pro ml) und bis zur gleichen Konzentration verdünnt wurden. Die Zellen wurden mit diesen EPO-Proben 4 Tage lang inkubiert, danach wurde ein MTS-Versuch (Promega) durchgeführt, um mit Hilfe einer Fluoreszenzmessung bei 490 nm (die Fluoreszenz ist nach einem Transfer von MTS in Formazan nachweisbar) nach lebenden Zellen zu suchen. 23 zeigt die Aktivität von zwei Proben, die von PER.C6/E2A-Zellen stammen, die mit einem EPO-Expressionsvektor transfiziert und anschließend 4 Tage lang bei 37°C und 39°C inkubiert wurden. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Proben, die man bei 39°C gehalten hat, aktiver sind als Proben, die man bei 37°C gehalten hat, was darauf hindeuten könnte, dass der Sialinsäuregehalt bei höheren Temperaturen suboptimal ist. Hiermit wird gezeigt, dass EPO, das von PER.C6-gebildet wurde, TF-1-Zellen in einem in vitro-Versuch stimulieren kann, was stark darauf hindeutet, dass das EPO, das in dieser humanen Zelllinie gebildet wird, mit dem EPO-Rezeptor interagieren und eine Differenzierung anregen kann.
Beispiel 19: Herstellung von murinen, humanisierten und humanen rekombinanten monoclonalen Antikörpern in PER.C6 und PER.C6/E2A.
A. Vorübergehende DNA-Transfektionen
cDNA's, die die schweren und leichten Ketten von murinen, humanisierten und humanen monoclonalen Antikörpern (mAbs) codieren, werden in zwei verschiedenen Systemen cloniert: eines, bei dem die schweren und leichten Ketten in ein einziges Plasmid (ein modifiziertes pcDNA2000/DHFRwt-Plasmid) eingebaut werden, und das andere ist ein System, bei dem cDNA's für schwere und leichte Ketten getrennt in zwei verschiedene Plasmide cloniert werden (siehe Beispiele 1, 3, 4 und 5). Diese Plasmide können den gleichen Selektionsmarker (wie DHFR) tragen oder jedes trägt seinen eigenen Selektionsmarker (einen, der das DHFR-Gen enthält, und einen, der zum Beispiel den Neo-Resistenzmarker enthält). Es ist für vorübergehende Expressionssysteme nicht wichtig, welche Selektionsmarker im Rückgrat des Vektors vorkommen, da keine anschließende Selektion durchgeführt wird. In den üblichen und normalen Transfektionsverfahren, die im Fachgebiet verwendet werden, transfiziert man gleiche Mengen von Plasmiden. Ein Nachteil der Integration sowohl der schweren als auch der leichten Kette in ein einziges Plasmid liegt darin, dass die Promotoren, die die Expression von beiden cDNA's antreiben, sich gegenseitig beeinflussen könnten, was zu einem ungleichen Expressionsniveau beider Untereinheiten führt, obwohl die Anzahl der cDNA-Kopien von jedem Gen genau dieselbe ist.
Plasmide, die die cDNA's der schweren und leichten Kette eines murinen und eines humanisierten monoclonalen Antikörpers enthalten, werden transfiziert und nach mehreren Tagen wird die Konzentration an korrekt gefaltetem Antikörper mit Hilfe von Verfahren bestimmt, die dem Fachmann bekannt sind. Bedingungen wie die Temperatur und das verwendete Medium werden sowohl für PER.C6- als auch für PER.C6/E2A-Zellen überprüft. Die Funktionalität des gebildeten rekombinanten Antikörpers wird durch Bestimmung der Affinität für das spezifische Antigen kontrolliert.
C. Stabile Produktion und Amplifikation des eingebauten Plasmids.
Expressionsplasmide, die sowohl die schwere als auch die leichte Kette tragen, und Plasmide, die die schwere und leichte Kette getrennt tragen, werden zur Transfektion anhaftender PER.C6-, PER.C6/E2A- und CHO-dhfr-Zellen verwendet. Anschließend werden die Zellen MTX und/oder Hygromycin und Neomycin exponiert, um sie für den Einbau der verschiedenen Plasmide auszuwählen. Zusätzlich wird eine doppelte Selektion mit G418 und Hygromycin durchgeführt, um eine Auswahl für den Einbau von Plasmiden, die das Resistenzgen gegen Neomycin und Hygromycin tragen, zu treffen. Man bestimmt die Expression von funktionellen monoclonalen Antikörpern in voller Länge und die am besten exprimierenden Clone werden für anschließende Studien verwendet, die die Stabilität des Einbaus, die Erkennung der Anzahl der Kopien, die Bestimmung der Mengen beider Untereinheiten und die Fähigkeit, bei zunehmender MTX-Konzentration zu amplifizieren, einschließen, nachdem man die leistungsfähigsten Zelllinien zur mAb-Produktion in größeren Ansätzen wie in Perfusions- und (Zufuhr) Batch-Bioreaktoren verwendet und danach die Menge und Qualität der mAbs optimiert.
Beispiel 20: Transfektion von mAb-Expressionsvektoren, um stabile Zelllinien zu erhalten.
PER.C6-Zellen wurden in DMEM plus 10% FBS in 47 Gewebekulturplatten (10 cm Durchmesser) mit ungefähr 2,5 × 10⁶ Zellen pro Platte ausgebracht und über Nacht unter ihren normalen Kulturbedingungen (10% CO₂-Konzentration und 37°C) gehalten. Am nächsten Tag wurden in 39 Platten Co-Transfektionen bei 37°C mit Lipofectamin gemäß Standardprotokollen mit 1 µg mit MunI gespaltenem und gereinigtem pUBS-Heavy2000/Hyg(–) und mit 1 µg mit ScaI gespaltenem und gereinigtem pUBS-Light2001/Neo (siehe Beispiel 3) pro Platte durchgeführt, wobei 2 Platten als Kontrollen mit 1 µg MunI-gespaltenem und gereinigtem pcDNA2000/Hyg(–) und 1 µg ScaI-gespaltenem und gereinigtem pcDNA2001/Neo co-transfiziert wurden. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden 4 Platten mit einem LacZ-Kontrollvektor transfiziert, wobei 2 Platten nicht transfiziert wurden und als negative Kontrollen dienten.
Nach 5 Stunden wurden die Zellen zweimal mit DMEM gewaschen und ohne Selektion mit frischem Medium weitergefüttert. Am nächsten Tag wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt, das verschiedene Selektionsreagentien enthielt: 33 Platten der Co-Transfektanten der schweren und leichten Kette, 2 Platten, die mit den leeren Vektoren transfiziert wurden, und die 2 negativen Kontrollen (keine Transfektion) wurden nur mit 50 µg pro ml Hygromycin inkubiert, 2 Platten der Co-Transfektanten der schweren und leichten Kette und 2 Transfektionseffizienz-Platten (LacZ-Vektor) wurden nur mit 500 µg pro ml G418 inkubiert, während 2 Transfektionseffizienz-Platten nicht mit Selektionsmedium behandelt wurden, sondern zur Bestimmung der Transfektionseffizienz, die bei 40% lag, verwendet wurden. 2 Platten wurden mit einer Kombination von 50 µg pro ml Hygromycin und 250 µg pro ml G418 inkubiert und 2 Platten wurden mit 25 µg pro ml Hygromycin und 500 µg pro ml G418 inkubiert.
Da die Zellen übermäßig wuchsen, wenn man sie nur mit Hygromycin allein inkubierte, wurde beschlossen, dass eine Kombination von Hygromycin- und G418-Selektion diejenigen Zellen sofort abtöten würde, die nur einen Typ der zwei Vektoren, die transfiziert worden waren, eingebaut haben. Daher wurden 7 Tage nach der Ausbringung alle Co-Transfektanten mit einer Kombination von 100 µg pro ml Hygromycin und 500 µg pro ml G418 weiter inkubiert. Die Zellen wurden 2 oder 3 Tage mit Medium, das die gleichen Konzentrationen des Selektionsagens enthielt, aufgefrischt. 14 Tage nach Ausbringung wurden die Konzentrationen auf 250 µg pro ml G418 und auf 50 µg pro ml Hygromycin eingestellt. 22 Tage nach Ausbringung war eine große Anzahl von Kolonien zu einem Ausmaß herangewachsen, das es ermöglichte, auszuwählen, zu entnehmen und zu subkultivieren. Es wurden ungefähr 300 getrennte Kolonien ausgewählt und von den 10 cm-Platten entnommen und anschließend via Platten mit 96 Vertiefungen und/oder 24 Vertiefungen via 6 Vertiefungen zu T25-Erlenmeyerkolben gezüchtet. In diesem Stadium wurden die Zellen eingefroren (4 Gefäße pro subkultivierter Kolonie) und mittels ELISA, wie im Beispiel 26 beschrieben, wurde das Produktionsniveau des rekombinanten UBS-54-mAb im Überstand bestimmt.
CHO-dhfr-Zellen werden in DMEM plus 10% FBS sowie mit Hypoxanthin und Thymidin in Gewebekulturplatten (10 cm Durchmesser) mit ungefähr 1 Million Zellen pro Platte ausgebracht und über Nacht unter normalen Bedingungen gehalten und am nächsten Tag zur Co-Transfektion mit pUBS-Heavy2000/Hyg(–) und pUBS-Light2001/DHFRwt gemäß Standardprotokollen mit Hilfe von Lipofectamin verwendet. Das Medium wird nach ein paar Stunden durch frisches Medium ersetzt und zu verschiedenen Dichten aufgeteilt, um den Zellen zu ermöglichen, sich an das Selektionsmedium anzupassen, wenn eine stabile Integration ohne ein mögliches Auswachsen der nicht-transfizierten Zellen stattfindet. Zuerst werden Kolonien anhand ihrer Hygromycin-Resistenz ausgewählt und anschließend wird MTX hinzugefügt, um in diesen subkultivierten Zelllinien 2 Plasmide auf doppelte Integration auszuwählen.
Die Transfektionen werden, wie für pUBS-Heavy2000/Hyg(–) und für pUBS-Light2001/Neo beschrieben, mit pUBS2-Heavy2000/Hyg(–) und pUBS2-Light2001/Neo in PER.C6 und PER.C6/E2A durchgeführt und die Selektion wird entweder mit anschließender Inkubation mit Hygromycin, gefolgt von G418, oder, wie oben beschrieben, mit einer Kombination beider Selektionsreagentien durchgeführt. CHO-dhfr-Zellen werden mit pUBS2-Heavy2000/Hyg(–) und pUBS2-Light2001/DHFRwt, wie für pUBS-Heavy2000/Hyg(–) und für pUBS-Light2001/DHFRwt beschrieben, transfiziert und die Selektion wird in aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt, wobei die Zellen zuerst mit Hygromycin ausgewählt werden, wonach man die Integration des Vektors für die leichte Kette durch Selektion in MTX kontrolliert.
Des Weiteren werden auch PER.C6- und PER.C6/E2A-Zellen für Transfektionen mit pUBS-3000/Hyg(–) und pUBS2-3000/Hyg(–) verwendet, während CHO-dhfr-Zellen mit pUBS-3000/DHFRwt und pUBS2-3000/DHFRwt transfiziert werden, wonach eine Selektion und weitere Amplifikation der eingebauten Plasmide bei zunehmender MTX-Konzentration durchgeführt wird. Im Fall der pcDNAs3000-Plasmide wird eine gleiche Anzahl von mRNA's sowohl bei der schweren als auch bei der leichten Kette erwartet, während es im Fall der zwei verschiedenen Vektoren unklar ist, ob zwischen den zwei Untereinheiten des Immunglobulins ein richtiges Gleichgewicht erreicht wird. Mit PER.C6, PER.C6/E2A und CHO-dhfr werden ebenfalls Transfektionen mit Expressionsvektoren, wie in Beispiel 4 und 5 beschrieben, durchgeführt, um stabile Zelllinien zu erhalten, die den humanisierten IgG1-mAbCAMPATH-1H beziehungsweise den humanisierten IgG1-mAb15C5 exprimieren.
Beispiel 21: Subkultivieren transfizierter Zellen.
Von PER.C6-Zellen, die mit pUBS-Heavy2000/Hyg(–) und pUBS-Light2001/Neo transfiziert wurden, wurden ungefähr 300 Kolonien, die in Medium, das Hygromycin und G418 enthält, gezüchtet worden waren, im Allgemeinen anchließend in Platten mit 96 Vertiefungen, 24 Vertiefungen und 6 Vertiefungen in ihrem jeweiligen Medium plus ihren jeweiligen Selektionsagentien weitergezüchtet. Zellen, die in Platten mit 24 Vertiefungen wachsen konnten, wurden mittels ELISA, wie in Beispiel 26 beschrieben, auf eine mAb-Produktion hin überprüft. Waren die Zellen erfolgreich, wurde mindestens ein Gefäß von jedem Clon eingefroren und aufbewahrt und die Zellen anschließend getestet und subkultiviert. Die Auswahl eines gut produzierenden Clons beruht auf hoher Expression, Kulturverhalten und Lebensfähigkeit. Um Überprüfungen auf langfristige Überlebensfähigkeit, Amplifikation der integrierten Plasmide und Suspensionswachstum über ausgedehnte Zeiträume zu ermöglichen, werden die am besten produzierenden Clone eingefroren, wovon eine Anzahl der besten Produzenten jeder Zelllinie für weitere Arbeiten ausgewählt wird. Ähnliche Experimente werden mit CHO-dhfr-Zellen, die mit verschiedenen Plasmiden transfiziert wurden, und mit PER.C6- und PER.C6/E2A-Zellen, die mit anderen Kombinationen von schweren und leichten Ketten sowie mit anderen Kombinationen von Selektionsmarkern transfiziert wurden, durchgeführt.
Beispiel 22: mAb-Produktion in Bioreaktoren.
Die transfizierte Zelllinie von PER.C6, die UBS-54 am besten herstellt, wird in Suspension gebracht, indem die Zellen in PBS gewaschen und dann in JRH-ExCell-525-Medium kultiviert werden, zuerst in kleinen Kultur-Erlenmeyerkolben und anschließend in Rollflaschen, und die Produktion bis hin zu 1- bis 2-Liter-Fermentern gesteigert wird. Die Zellen werden weiterhin der Selektion mit Hygromycin und G418 ausgesetzt, bis erwiesen ist, dass die Integration der Vektoren über längere Zeiträume stabil ist. Dies ist der Fall, wenn die Zellen sich noch in ihrer anhaftenden Phase oder wenn die Zellen sich in Suspension befinden.
PER.C6-Zellen, die in Suspension wachsen und mAb bilden, werden im Allgemeinen mit Hygromycin und G418 kultiviert und zur Inokulation von Bioreaktoren aus Rollflaschen verwendet. Nach dem Wachstum der Zellen in Perfusions-Bioreaktoren und in Zufuhrbatch-Ansätzen werden die produzierten mAb auf Produktionserträge, Funktionalität und Qualität überprüft.
A. Perfusion in einem 2-Liter-Bioreaktor
Die Zellen werden mit einer Konzentration von ungefähr 0,5 × 10⁶ Zellen pro ml in Suspensionsmedium in Abwesenheit selektierender Agentien ausgebracht und die Perfusion wird nach einigen Tagen, wenn die Zelldichte ungefähr 2 bis 3 × 10⁶ Zellen pro ml erreicht, gestartet. Die Perfusionsrate beträgt im Allgemeinen 1 Volumen pro 24 Stunden mit einer Entnahme von ungefähr 250 ml pro 24 Stunden. In diesem Ansatz bleiben die Zellen normalerweise für über einen Monat bei einer konstanten Dichte von ungefähr 5 × 10⁶ Zellen pro ml und einer Lebensfähigkeit von fast 95%. Das Produktionsniveau von mAb wird auf regulärer Basis bestimmt.
B. Zufuhrbatch-Ansatz in einem 2-Liter-Bioreaktor
Für einen Startlauf verwendet man PER.C6-Suspensions-Zellen, die mAb produzieren und in Rollflaschen gewachsen sind, zur Inokulation eines 2-Liter-Bioreaktors in Abwesenheit von Selektionsagentien bis zu einer Dichte von 0,3 bis 0,5 Millionen Zellen pro ml in einem Arbeitsvolumen von 300 bis 500 ml und lässt sie wachsen, bis die Lebensfähigkeit der Zellkultur auf 10% abfällt. Als Standard für die Lebenszeit einer Kultur bestimmt man, an welchem Tag nach der Inokulation die Dichte der lebenden Zellen unter 0,5 Millionen Zellen pro ml abfällt. Normalerweise wachsen die Zellen bis zu einer Dichte von 2 bis 3 Millionen Zellen pro ml, danach werden die Komponenten des Mediums begrenzend und die Lebensfähigkeit nimmt ab. Des Weiteren wird bestimmt, wie viel von den essentiellen Komponenten wie Glucose und Aminosäuren im Medium von den Zellen konsumiert wird. Anschließend wird bestimmt, welche Aminosäuren gebildet werden und welche anderen Produkte sich in der Kultur anreichern. Abhängig davon werden konzentrierte Futterproben hergestellt, die zu regelmäßigen Zeitpunkten hinzugefügt werden, um die Lebenszeit der Kultur zu erhöhen und damit die mAb-Konzentration im Überstand zu erhöhen. In einem anderen Ansatz werden 10-fach konzentrierte Proben des Mediums entwickelt, die zu verschiedenen Zeitpunkten zu den Zellen hinzugefügt werden und die Lebensfähigkeit der Zellen ebenfalls für einen längeren Zeitraum erhöhen, was letztlich zu einer höheren mAb-Konzentration im Überstand führt.
Beispiel 23: Vorübergehende Expression humanisierter rekombinanter monoclonaler Antikörper.
Für vorübergehende Transfektionsexperimente in PER.C6-Zellen wurden die richtigen Kombinationen der Vektoren verwendet, die die Gene der schweren und leichten Kette von UBS-54 enthalten. Hierfür ist es nicht wichtig, welcher Selektionsmarker ins Rückgrat des Plasmids eingefügt wird, weil die Expression nur kurze Zeit (2–3 Tage) dauert. Im Allgemeinen dient Lipofectamin als Transfektionsverfahren, obwohl man für eine effiziente Transfektion auch andere kationische Lipidkomponenten verwenden kann. Vorübergehende Verfahren werden von Ansätzen mit T25-Erlenmeyerkolben auf Bioreaktoren mit mindestens 10 Litern extrapoliert. Am Tag 1 wurden ungefähr 3,5 Millionen PER.C6- und PER.C6/E2A-Zellen in einen T25-Erlenmeyerkolben ausgebracht. Am Tag 2 wurden die Zellen mit Hilfe von Lipofectamin mit maximal 8 µg Plasmid-DNA transfiziert und nach 2–4 Stunden erfolgte eine Auffrischung und man ließ sie 2 Tage stehen. Dann wurde der Überstand geerntet und die Antikörper-Titer wurden in einem quantitativen ELISA für humane IgG1-Immunglobuline (CLB, siehe auch Beispiel 26) gemessen. Die Mengen an totalem humanem Antikörper in diesem System betragen für PER.C6 ungefähr 4,8 µg/Million ausgebrachter Zellen und für PER.C6/E2A 11,1 µg/Million ausgebrachter Zellen. Um sowohl zu bestimmen, wie viel von dem hergestellten Antikörper von vollständiger Größe und aus zwei schweren und zwei leichten Ketten aufgebaut ist, als auch die Expressionsmengen der schweren und/oder leichten Kette allein und verbunden durch Disulfid-Brücken, werden Kontroll-ELISA's entwickelt, die die Untereinheiten getrennt erkennen. Es werden verschiedene einfangende und färbende Antikörper-Kombinationen verwendet, die alle human(isiert)e IgG1-Untereinheiten erkennen. Überstände von PER.C6-Transfektanten (transfiziert mit Kontrollvektoren oder mit pUBS-Heavy2000/Hyg(–) und pUBS-Light2001/DHFRwt) wurden auf Produktion von mAb mit vollständiger Größe überprüft (24). Die Proben wurden mit und ohne DTT behandelt, wobei man zwischen vollständigem mAb (nicht reduziert) und getrennter schwerer und leichter Kette (reduziert) unterscheiden kann. Wie erwartet, wird die schwere Kette nur ausgeschieden, wenn die leichte Kette co-exprimiert wird und der Antikörper größtenteils vollständig ist.
Beispiel 24: System zur Maßstabsvergrößerung für vorübergehende Transfektionen.
PER.C6 und Derivate davon werden zur Maßstabsvergrößerung des DNA-Transfektions-Systems verwendet. Gemäß Wurm und Bernard (1999), können Transfektionen an Suspensionszellen mit 1–10 Liter Ansätzen mit Hilfe der Elektroporation durchgeführt werden, wobei man Erträge von 1–10 mg/l (0,1–1 pg/Zelle/Tag) an rekombinantem Protein erhielt.
Man braucht ein System, in dem dies gut kontrolliert werden kann und die Erträge höher sein könnten, besonders zur Durchmusterung einer großen Anzahl von Proteinen und toxischen Proteinen, die nicht in einem stabilen Ansatz hergestellt werden können. Da Zelllinien wie CHO darüber hinaus durch Agentien wie Lipofectamin, die eine Apoptose auslösen, schwerwiegend betroffen sind, weist man im Fachgebiet darauf hin, dass man Zellen braucht, die dagegen resistent sind. Da PER.C6 durch Transfektionsverfahren kaum betroffen ist, scheint es, dass PER.C6 und Derivate davon für diese Zwecke verwendbar sind. Man verwendet zur Elektroporation oder bei anderen Verfahren, die die Transfektion mit den gleichen Expressionsplasmiden durchführen, 1 bis 50 Liter Suspensionskulturen von PER.C6 und PER.C6/E2A, die in Medium wachsen, das man mit Hilfe von gereinigter Plasmid-DNA zur Unterstützung vorübergehender DNA-Transfektionen angepasst hat. Nach einigen Stunden wird das Transfektionsmedium entfernt und durch frisches Medium ohne Serum ersetzt. Das rekombinante Protein darf sich im Überstand für einige Tage anreichern, der Überstand wird danach geerntet und alle Zellen werden entfernt. Der Überstand wird für die Prozessierung stromabwärts verwendet, um das rekombinante Protein zu reinigen.
Beispiel 26: Entwicklung eines ELISA zur Bestimmung humaner mAbs.
Greiner-Microlon-Platten # 655061 wurden mit einem monoclonalen anti-humanen IgG1-kappa-Antikörper (Pharmigen #MO32196 0,5) mit 100 µl pro Vertiefung in einer Konzentration von 4 µg pro ml in PBS beschichtet. Die Inkubation wurde über Nacht bei 4°C oder für 90 Minuten bei 37°C durchgeführt. Dann wurden die Vertiefungen dreimal mit 0,05% Tween/PBS (400 µl pro Vertiefung) gewaschen und anschließend mit 100 µl 5% Milch, gelöst in 0,05% Tween/PBS pro Vertiefung, für 30 Minuten bei 37°C blockiert und dann wurde die Platte dreimal mit 400 µl 0,05% Tween/PBS pro Vertiefung gewaschen. Als Standard wurde ein gereinigter, humaner IgG1-Antikörper verwendet (Sigma, #108H9265), der mit 0,5% Milch/0,05% Tween/PBS in Verdünnungen von 50 bis 400 ng pro ml verdünnt wurde. Pro Vertiefung wurde 100 µl Standard für 1 Std. bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Platte dreimal mit 400 µl 0,05% Tween/PBS pro Vertiefung gewaschen. Als zweiter Antikörper wurde ein mit Biotin markierter, monoclonaler anti-humanes IgG1-Antikörper der Maus (Pharmingen #MO45741) in einer Konzentration von 2 ng pro ml verwendet. Pro Vertiefung wurden 100 µl dieses Antikörpers hinzugefügt und für 1 Std. bei 37°C inkubiert und die Vertiefungen wurden dreimal mit 400 µl 0,05% Tween/PBS gewaschen.
Anschließend wurde Konjugat hinzugefügt: pro Vertiefung 100 µl einer 1:1000-Verdünnung einer Streptavidin-HRP-Lösung (Pharmingen #MO45975) und 1 Std. bei 37°C inkubiert und die Platte wurde erneut dreimal mit 400 µl 0,05% Tween/PBS pro Vertiefung gewaschen.
Eine ABTS-Tablette (Boehringer Mannheim #600191-01) wurde in 50 ml ABTS-Puffer (Boehringer Mannheim #60328501) gelöst und 100 µl dieser Lösung wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und für 1 Std. bei Zimmertemperatur oder bei 37°C inkubiert. Schließlich wurde der OD bei 405 nm gemessen. Proben des Überstands von Zellen, die mit Vektoren, die mAb codieren, transfiziert worden waren, wurden gewöhnlich gelöst und mit 0,5% Milch/0,05% Tween/PBS verdünnt. Falls Proben nicht mit dem linearen Bereich der Standardkurve übereinstimmten, wurden andere Verdünnungen verwendet.
Beispiel 27: Herstellung von Influenza-HA- und NA-Proteinen in einer menschlichen Zelle für Impfstoffe mit rekombinanter Untereinheit.
cDNA-Sequenzen von Genen, die Hämagglutinin-(HA) und Neuraminidase-(NA)-Proteine von bekannten und regelmäßig erscheinenden neuartigen Influenza-Virusstämmen codieren, werden mit Primern für herkömmliches Clonieren in pcDNA2000-, pcDNA2001-, pcDNA2002- und pcDNAs3000-Vektoren mit Hilfe von PCR bestimmt und erzeugt (siehe Beispiel 1). Anschließend werden diese entstandenen Expressionsvektoren für eine stabile und vorübergehende Expression der rekombinanten Proteine in PER.C6 und Derivaten davon transfiziert, um zur Produktion von rekombinanten HA- und NA-Proteinen zu führen, die deshalb auf eine vollständig standardisierte Weise mit menschlichen Zellen unter genauen und gut definierten Bedingungen hergestellt werden. Man lässt die Zellen diese rekombinanten HA- und NA-Proteine für einen Standardzeitraum anreichern. Verwendet man den pcDNAs3000-Vektor, ist es möglich, beide cDNA's gleichzeitig zu clonieren und von den Zellen beide Proteine zur gleichen Zeit herstellen zu lassen. Man reinigt die Proteine von getrennten oder kombinierten Kulturen gemäß Standardtechniken, vom Fachmann werden die endgültigen Titer von HA und NA bestimmt und die Aktivitäten der Proteine werden überprüft. Dann werden die gereinigten rekombinanten Proteine für Impfstudien und schließlich für Impfzwecke in großem Umfang verwendet.
Man erhielt das HA1-Fragment des Influenza-Virus des Schweins A/swine/Oedenrode/7C/96 (Genbank-Zugangsnummer AF092053) mit PCR mit Hilfe des Vorwärts-Primers mit folgender Sequenz: 5'-ATT GGC GCG CCA CCA TGA AGA CTA TCA TTG CTT TGA GCT AC-3', und mit einem entgegengesetzten Primer mit folgender Sequenz: 5'-GAT GCT AGC TCA TOT AGT TTG TTT TTC TGG TAT ATT CCG-3'. Das resultierende PCR-Produkt von 1,0 kB wurde mit AscI- und NheI-Restriktionsenzymen gespalten und mit einem AscI- und NheI-gespaltenen und gereinigten pcDNA2001/DHFRwt-Vektor ligiert, wodurch pcDNA2001/DHFRwt-swHA1 entstand. Des Weiteren wurde das HA2-Fragment desselben Virus mit PCR amplifiziert mit Hilfe desselben Vorwärts-Primers, wie für HA1 beschrieben, und mit einem anderen entgegengesetzten Primer mit folgender Sequenz: 5'-GAT GCT AGC TCA GTC TTT GTA TCC TGA CTT CAG TTC AAC ACC-3'. Das resultierende HA2-PCR-Produkt von 1,6 kB wurde auf identische Art cloniert, wie für HA1 beschrieben, wodurch pcDNA2001/DHFRwt-swHA2 entstand.
Beispiel 28: Integration von cDNA's, die post-translational modifizierende Enzyme codieren.
Da das Produktionsniveau von rekombinantem Protein in stabilen und vorübergehend transfizierten und infizierten PER.C6 und PER.C6/E2A extrem hoch ist und da man ein höheres Expressionsniveau gewöhnlich über eine DHFR-abhängige Amplifikation erhält, die auf einer Zunahme der MTX-Konzentration beruht, könnte es zu einer ”Austitrierung” der endogenen Enzymmengen, die an den post-translationalen Modifikationen beteiligt sind, kommen.
Deshalb werden cDNA's, die humane Enzyme codieren, die an verschiedenen Formen post-translationaler Modifikationen und an Verfahren wie der Glycosylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung, der Faltung und Steuerung beteiligt sind, in PER.C6 und PER.C6/E2A überexprimiert, um ein funktionelleres rekombinantes Produkt in größtmöglichen Mengen in kleinen und großen Ansätzen herstellen zu können. Es wurde gezeigt, dass CHO-Zellen modifiziert werden können, indem man eine alpha-2,6-Sialyltransferase einführte, um die Expression und die Bioaktivität von tPA und von humanem Erythropoietin zu verstärken (Zhang et al., 1998, Minch et al., 1995, Jenkins et al., 1998). Andere Gene wie beta-1,4-Galactosyl-Transferase wurden ebenfalls in Insekten- und in CHO-Zellen eingefügt, um die Strukturen der N-verknüpften Oligosaccharidverzweigung zu verbessern und die Konzentration der Sialinsäuren an den endständigen Resten zu verstärken (Weikert et al., 1999; Hollister et al., 1998). Zur weiteren Steigerung des Sialinsäuregehalts der rekombinanten Proteine, die von dieser humanen Zelllinie gebildet werden, modifiziert man PER.C6-Zellen durch den Einbau von cDNA's, die die alpha-2,3-Sialyltransferase-, die alpha-2,6-Sialyltransferase- und die beta-1,4-Galactosyl-Transferase-Proteine codieren.
Beispiel 31: Erzeugung von PER.C6-abgeleiteten Zelllinien, die kein funktionelles DHFR-Protein haben.
Man verwendet PER.C6-Zellen, um das DHFR-Gen mit Hilfe von verschiedenen Systemen auszuschalten, um Zelllinien zu erhalten, die man zur Amplifikation des exogen integrierten DHFR-Gens verwenden kann, das von den Vektoren, die in den Beispielen 1 bis 5 beschrieben sind, oder von anderen Vektoren, die DHFR exprimieren, codiert wird. PER.C6-Zellen werden auf das Vorhandensein von verschiedenen Chromosomen überprüft und anhand einer geringen Kopienmenge des Chromosoms, das das humane DHFR-Gen trägt, ausgewählt. Anschließend werden diese Zellen bei Knock-out-Experimenten verwendet, wobei der offene Leserahmen des DHFR-Gens unterbrochen und durch einen Selektionsmarker ersetzt wird. Um eine doppelte Knock-out-Zelllinie zu erhalten, werden beide Allele via homologe Rekombination mit Hilfe von zwei verschiedenen Selektionsmarkern oder mit einem anderen System, wie beispielsweise für CHO-Zellen beschrieben, entfernt (Urlaub et al., 1983).
Man verwendet auch andere Systeme, wobei die Funktionalität des DHFR-Proteins vermindert oder vollständig entfernt wird, zum Beispiel durch die Verwendung von anti-sense-RNA oder via RNA/DNA-Hybride, deren Gen nicht entfernt oder ausgeschaltet ist, die Produkte des Gens aber stromabwärts in ihrer Funktion gestört werden.
Beispiel 32: Langfristige Herstellung rekombinanter Proteine mit Hilfe von Protease- und Neuraminidase-Inhibitoren.
Die in Beispiel 8 beschriebenen stabilen Clone werden für eine langfristige Expression in Anwesenheit und in Abwesenheit von MTX, Serum und Protease-Inhibitoren verwendet. Lässt man stabile oder transfizierte Zellen mehrere Tage lang rekombinantes humanes EPO-Protein anreichern, beobachtet man eine sich abflachende Kurve anstelle eines geraden Anstiegs, was darauf hindeutet, dass das angereicherte EPO mit der Zeit abgebaut wird. Dies könnte ein inaktiver Prozess sein, der auf externen Faktoren wie Licht oder Temperatur beruht. Es könnte auch sein, dass spezifische Proteasen, die von den lebensfähigen Zellen gebildet oder als Folge der Lyse toter Zellen freigesetzt werden, das rekombinante EPO-Protein verdauen. Deshalb fügt man dem Kulturmedium nach der Transfektion und den stabil produzierenden Zellen CuSO₄ in zunehmender Konzentration hinzu, um eine stabilere Produktionskurve zu erhalten: die Zellen werden einige Tage lang kultiviert und die EPO-Menge wird zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. CuSO₄ ist ein bekannter Inhibitor der Protease-Aktivität, der während der Prozessierung stromabwärts und der EPO-Reinigung einfach entfernt werden kann. Man verwendet die optimalste CuSO₄-Konzentration, um nach vorübergehender Expression in Folge von DNA-Transfektion und viralen Infektionen rekombinantes humanes EPO-Protein herzustellen.
Man verwendet die optimale CuSO₄-Konzentration des Weiteren auch bei der EPO-Herstellung in stabilen Clonen. Im Fall von EPO, bei dem die Anwesenheit von endständigen Sialinsäuren wichtig ist, um ein lange Kreislaufhalbwertszeit des rekombinanten Proteins sicherzustellen, ist es erforderlich, hochgradig sialisiertes EPO herzustellen. Da lebende Zellen Neuraminidasen bilden, die durch die Aktivierung von Stressfaktoren ausgeschüttet werden können, ist es wahrscheinlich, dass gebildetes EPO aufgrund dieser Stressfaktoren und der gebildeten Neuraminidasen seine Sialinsäuren verliert. Um die Entfernung der Sialinsäuren zu verhindern, werden zum Medium Neuraminidase-Inhibitoren hinzugefügt, wodurch es zu einer verlängerten Bindung der Sialinsäuren an das gebildete EPO kommt.
Beispiel 33: Stabile Expression rekombinanter Proteine in menschlichen Zellen mit Hilfe des amplifizierbaren Glutamin-Synthetase-Systems.
Man verwendet PER.C6 und Derivate davon, um mit Hilfe des Glutamin-Synthetase-Systems (GS) rekombinante Proteine stabil zu exprimieren. Zuerst überprüft man, ob die Zellen die Fähigkeit haben, in Glutamin-freiem Medium zu wachsen. Falls die Zellen in Glutamin-freiem Medium nicht wachsen können, bedeutet das, dass diese Zellen nicht genug GS exprimieren, was letztlich zum Tod der Zellen führt. Man kann das GS-Gen als einen Selektionsmarker in Expressionsvektoren integrieren (wie für das DHFR-Gen beschrieben) und es durch eine zunehmende Methionin-Sulphoximin-(MSX)-Konzentration amplifizieren, was zu einer Über-Expression des betreffenden rekombinanten Proteins führt, da der gesamte stabil integrierte Vektor co-amplifiziert werden wird, wie für DHFR gezeigt wurde. Das GS-Gen-Expressionssystem wurde nach einem Bericht von Sanders et al. (1984) realisierbar und von Cockett et al. (1990) wurde zwischen dem DHFR-Selektionssystem und GS ein Vergleich durchgeführt. Die Herstellung von rekombinanten mAbs mit Hilfe von GS wurde zuerst von Bebbington et al. (1992) beschrieben.
Das GS-Gen wird in das Vektor-Rückgrat, wie in Beispiel 1 beschrieben, oder in cDNA's, die rekombinante Proteine codieren, cloniert und die schweren und leichten Ketten von mAbs werden in die erhältlichen Vektoren, die das GS-Gen tragen, cloniert. Anschließend werden diese Vektoren in PER.C6 transfiziert und mit MSX-Konzentrationen, die ein Wachstum der Zellen bei stabiler Integration der Vektoren ermöglichen werden, ausgewählt.
Beispiel 34: Herstellung von rekombinantem-HIV-gp 120-Protein in einer menschlichen Zelle.
Man bestimmt die cDNA, die das hochgradig glycosylierte Hüllprotein gp120 des Humanen immundefizienz-Virus (HIV) codiert, und erhält sie durch PCR mit Hilfe von Primern, die im Stromaufwärts-Primer eine perfekte Kozak-Sequenz für die richtigen Sequenzen des Translationsstarts und der bequemen Restriktionserkennung beherbergen, um in die Expressionsvektoren zu clonieren, wie in Beispiel 1 beschrieben. Anschließend wird dieses PCR-Produkt an beiden Strängen sequenziert, um sicherzustellen, dass keine PCR-Fehler eingefügt werden.
Der Expressionsvektor wird in PER.C6, Derivate davon und CHO-dhfr-Zellen transfiziert, um stabil produzierende Zelllinien zu erhalten. Die Unterschiede in der Glycosylierung zwischen CHO-produziertem und PER.C6-produziertem gp120 werden mit 2D-Elektrophorese-Experimenten und anschließenden Massenspektrometrie-Experimenten bestimmt, da gp120 ein stark glycosyliertes Protein mit vorwiegend O-verknüpften Oligosacchariden ist. Das rekombinante Protein wird vom Fachmann gereinigt und anschließend zu Funktionalitäts- und anderen Versuchen verwendet. Das gereinigte Protein wird für Impfzwecke zur Prävention von HIV-Infektionen verwendet.
Legende zu den Figuren

1. pcDNA2000/DHFRwt
2. pcDNA2001/DHFRwt
3. pcDNA2002/DHFRwt
4. pcDNAs3000/DHFRwt
5. pEPO2000/DHFRwt
7. pHC2000/Hyg(–)
8. pLC2001/DHFRwt
9. PUBS-Heavy2000/Hyg(–)
10. pUBS-Light2001/DHFRwt
11. pUBS2-Heavy2000/Hyg(–)
12. pUBS2-Light2001/DHFRwt
13. pUBS-3000/DHFRwt
14. pUBS2-3000/DHFRwt
15. EPO-Konzentration in einem 2-Liter-Perfusions-Bioreaktor, angegeben in ELISA-Einheiten pro ml.
16. EPO-Konzentration in einem 2-Liter-Wiederholungsbatch-Bioreaktor, wobei die Zelldichten alle 2 bis 3 Tage auf 0,5 × 10⁶ Zellen pro ml zurückgebracht wurden.
17. EPO-Konzentration von stabil produzierenden P9-Zellen, drei Tage nach Inokulation mit 0,3 × 10⁶ Zellen pro ml in einem Ansatz mit 4 × 1-Liter-Wiederholungsbatch-Bioreaktor bei verschiedenen Bedingungen: Links. Verschiedene Ansätze für Gelösten Sauerstoff. Mitte. Verschiedene Temperaturen. Rechts. Verschiedener konstanter pH-Wert. Standardansätze für P9-Zellen mit 50% DO (gelöster Sauerstoff), 37°C und pH 7,3. Bei jedem Durchgang wurde ein getrennter Kontrolldurchgang mit diesen Ansätzen durchgeführt, was in jedem Ansatz als vierter Balken dargestellt wird.
18. EPO-Produktion als Folge einer Zunahme der MTX-Konzentration in den PER.C6-abgeleiteten Zelllinien P8 und P9, berechnet als ELISA-Einheiten pro Million ausgebrachter Zellen pro Tag.
19. Amplifikation des DHFR-Gens als Folge einer Zunahme der MTX-Konzentration. Southern-Blot-Verfahren mit BgIII-gespaltene DNA, die von normalen PER.C6-Zellen (nicht in Anwesenheit von MTX gewachsen) und von P8- und P9-Zellen (in Anwesenheit von 100 nM, 800 nM und 1800 nM MTX) stammt. Der Blot wurde zuerst mit einer radioaktiven DHFR-Sonde hybridisiert, anschließend davon befreit und dann mit einer radioaktiven Adenovirus-E1-Sonde als eine interne Kontrolle inkubiert.
20. Stabilität der rekombinanten EPO-Expression von zwei Zelllinien: P8 (A) und P9 (B). Die Zellen wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von MTX über ungefähr 60 Passagen über einen Zeitraum von mehr als 4 Monaten kultiviert und die EPO-Produktion wurde in ELISA-Einheiten pro Million ausgebrachter Zellen pro Tag berechnet.
21. Aktivität der beta-Galactosid-alpha-2,6-Sialyltransferase in PER.C6- verglichen mit CHO-Zellen. A. Western-Blot-Verfahren mit EPO aus dem Überstand von PER.C6-Zellen, die mit einem EPO-Expressionsplasmid (links) und mit Eprex (rechts) transfiziert wurden. PER.C6-EPO wurde ohne Behandlung (Bahn 1), nach Behandlung mit NDV-abgeleiteter Neuraminidase in zwei getrennten Puffern (Bahnen 2 und 3) und nach Behandlung mit VC-abgeleiteter Neuraminidase (Bahn 4) durchgeführt. Eprex wurde ebenfalls ohne Behandlung durchgeführt (Bahn 5) und nach ähnlichen Behandlungen mit Neuraminidasen (Bahnen 5 bis 8). B. Verschiebung in der FACS-Analyse von PER.C6- (rechte Abbildungen) und CHO-Zellen (linke Abbildungen) nach Behandlung mit einem anti-DIG-Antikörper, der die zwei DIG-verknüpften Lectine erkennt, die mit den Zellen inkubiert wurden (wobei dunkle Felder entstehen), die entweder spezifisch alpha-2,6-Verbindungen zwischen Sialinsäuren und Galactosen (Sambucus nigra-Agglutinin, obere Abbildungen) und alpha-2,3-Sialinsäure-Galactose-Verbindungen (Maackia amurensis-Agglutinin, untere Abbildungen) erkennen, im Vergleich zu einer FACS-Analyse mit Zellen, die nicht mit Lectin behandelt wurden (offene Felder).
22. 2D/Western-Analyse von rekombinantem EPO, das in verschiedenen Kultur-Ansätzen hergestellt wurde. A. P9-Zellen, die rekombinantes humanes EPO stabil exprimieren, wurden in DMEM in T175 Erlenmeyerkolben und in JRH-Excell-525-Medium in Rollflaschen und in Bioreaktoren gezüchtet, mit 2D-Elektrophorese getrennt, geblottet und mit H612, einem anti-EPO-Antiserum, inkubiert. Proben, die den gesamten Bereich von EPO (aus P9-Überständen), das Sialinsäure enthält, enthalten, wurden mit kommerziell erhältlichem Eprex verglichen, das ausschließlich die EPO-Formen mit höheren Sialinsäuren enthält (links). B. EPO, das von anhaftenden P9-Zellen stammt, die in einem Bindungs-Ansatz in DMEM-Medium gewachsen sind, verglichen mit EPO, das von vorübergehend transfizierten CHO-Zellen stammt, die ebenfalls in DMEM kultiviert wurden. Es wurde mit FBS kultiviert, das aber entfernt wurde, bevor mit der EPO-Anreicherung begonnen wurde. Der vermutete Sialinsäuregehalt in diesen Proben (1–14) wird zwischen den zwei Blots angegeben.
23. In vitro-Funktionalitäts-Versuch mit PER.C6/E2A-EPO, das bei 37°C mit Hilfe von humanen TF-1-Zellen hergestellt wurde, verglichen mit kommerziell erhältlichem Eprex, das von CHO-Zellen hergestellt wird.
24. Western-Blot-Verfahren mit Hilfe eines anti-humanen schwere IgG1-Kette-Antikörpers mit schwerer Kette in Überständen von PER.C6-Zellen, die mit pUBS-Heavy2000/Hyg(–) und PUBS-Light2001/DHFRwt (Bahn 6) oder mit den Vektoren einzeln (Bahnen 4 und 5) co-transfiziert wurden. Als positive Kontrolle wurde verdünntes humanes Serum aufgetragen (IgG, Bahn 1) und als negative Kontrolle wurde ein Expressionsvektor, der LacZ codiert, transfiziert (Kontrolle, Bahn 3) sowie ein Marker (M, Größen nicht dargestellt) aufgetragen (Bahn 2). Die obere Abbildung stammt von einem Gel, das mit Proben von den Transfektanten beladen wurde, die nicht mit DTT behandelt wurden, wobei die Disulfidbrücken der schweren und leichten Kette intakt bleiben und ein vollständiges mAb von ungefähr 220 kD nachgewiesen wird. Die untere Abbildung zeigt Proben von denselben Transfektanten, die mit DTT behandelt wurden, dessen Disulfidbrücken entfernt sind, was zu einer vollständigen Trennung der schweren und leichten Kette führt. Der Blot wurde mit einem Antikörper inkubiert, der die schweren Ketten von humanem IgG1 erkennt. Die leichte Kette wird anhand der Hintergrunderkennung durch den zweiten (polyclonalen) Antikörper, der für das ECL-Western-Verfahren verwendet wird, angefärbt.

Literatuverzeichnis

Baldwin RW, Byers VS (1986) Monoclonal antibodies in cancer treatment. Lancet 1, 603–605.
Barbas CF, Kang AS, Lerner RA und Benkovic SJ (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: The gene III site. Proc Natl Acad Sci USA. 88, 7978
Bebbington CR, Renner G, Thomson S, Abrams D, Yarranton GT (1992) High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Bio/technology 10, 169–175.
Borrebaeck CAK, Malmborg A-C und Ohlin M (1993) Does endogenous glycosylation prevent the use of mouse monoclonal antibodies as cancer therapeutics? Immunology Today 14, 477–479.
Borrebaeck CAK (1999) Human monoclonal antibodies: The emperor's new clothes? Nature Biotech. 17, 621.
Boshart W, Weber F, Jahn G, Dorsch-Hasler K, Fleckenstein B, Schaffner W (1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41, 521–530.
Bruggeman M, Spicer C, Buluwela L, Rosewell I, Barton S, Surani MA, Rabbits TH (1991) Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus. Eur J Immunol. 21, 1323–1326.
Bulens F., Vandamme A-M., Bernar H., Nelles L., Lijnen RH. und Collen D (1991) Construction and characterization of a functional chimeric murine-human antibody directed against human fibrin fragment-D dimer. Eur J Biochem. 195, 235–242.
Burton DR und Barbas III CF (1994) Human antibodies from combinatorial libraries. Adv Immunol. 57, 191–280.
Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, Rowland AN, Kotts C, Carver ME und Shephard HM (1992) Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 89, 4285–4289.
Clarkson T, Hoogenboom HR, Griffiths A und Winter G (1991) Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 353, 624.
Cockett MI, Bebbington CR, Yarranton GT (1990) High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in chines hamster ovary cells using glutamine synthetase gene amplification. Bio/technology 8, 662–667.
Crowe JS., Hall VS., Smith MA., Cooper HJ. und Tite JP (1992) Humanized monoclonal antibody CAMPATH-1H: myeloma cell expression of genomic constructs, nucleotide sequence of cDNA constructs and comparison of effector mechanisms of myeloma and Chinese hamster ovary cell-derived material. Clin Exp Immunol 87, 105–110.
Debbas M, White E (1993) Wild-type p53 mediates apoptosis by E1A, which is inhibited by E1B. Genes Dev. 7, 546–554.
Delorme E, Lorenzini T, Giffin J, Martin F, Jacobsen F, Boone T, Elliot S (1992) Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin. Biochemistry 31, 9871–9876.
Farrow SN, White JH, Martinou I, Raven T, Pun KT, Grinham CJ, Martinou JC, Brown R (1995) Cloning of a bcl-2 homologue by interaction with adenovirus E1B 19K. Nature 374, 731–733.
Fishwild DM, O'Donnell SL, Bengoechea T, Hudson DV, Harding F, Bernhard SL, Jones D, Kay RM, Higgins KM, Schramm SR, Lonberg N (1996) High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice. Nat Biotechnol. 14, 845–851.
Fussenegger M, Bailey JE, Hauser H, Mueller PP (1999) Genetic optimization of recombinant glycoprotein production by mammalian cells. Trends Biotechn. 17, 35–42.
Frödin JE, Lefvert AK, Mellstedt H (1990) Pharmacokinetics of the mouse monoclonal antibody 17-1A in cancer patients receiving various treatment schedules. Cancer Res. 50, 4866–4871.
Galili U (1993) Interaction of the natural anti-Gal antibody with alpha-galactosyl epitopes: a major obstacle for xenotransplantation in humans. Immunol Today 14, 480–482.
Garrard L, Yang M, O'Connell M, Kelley R und Henner DJ (1991) Fab assembly and enrichment in a monovalent phage display system. BioTechnology 9, 1373.
Goldwasser E, Eliason JF, Sikkema D (1975) An assay for erythropoietin in vitro at the milliunit level. Endocrinology 97, 315–23.
Green LL, Hardy MC, Maynard-Currie CE, Tsuda H, Louie DM, Mendez MJ, Abderrahim H, Noguchi M, Smith DH, Zeng Y (1994) Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat Genet. 7, 13–21.
Gorman CM, Gies D, McCray G, Huang M (1989) The human cytomegalovirus major immediate early promoter can be trans- activated by adenovirus early proteins. Virology 171, 377–385.
Hale G, Dyer MJS, Clark MR, Phillips JM, Marcus R, Reichmann L, Winter G und Waldmann H (1988) Remission induction in non-Hodgkin lymphoma with reshaped human monoclonal antibody CAMPATH-1H. Lancet 2, 1394–1399.
Hammerling U, Kroon R, Wilhelmsen T, Sjödin L (1996) In vitro bioassay for human erythropoietin based on proliferative stimulation of an erythroid cell line and analysis of carbohydrate-dependent microheterogeneity. J Pharm Biomed An. 14, 1455–1469.
Han J, Sabbatini P, Perez D, Rao L, Modha D, White E (1996) The E1B 19K protein blocks apoptosis by interacting with and inhibiting the p53-inducible and death-promoting Bax protein. Genes Dev. 10, 461–477.
Havenga MJ, Werner AB, Valerio D, van Es HH (1998) Methotrexate selectable retroviral vectors for Gaucher disease. Gene Ther. 5, 1379–1388.
Hollister JR, Shaper JH, Jarvis DJ (1998) Stable expression of mammalian beta1,4-galactosyltransferase extends the N-glycosylation pathway in insect cells. Glycobiology 8, 473–480.
Huls GA., Heijnen IAFM., Cuomo ME., Koningsberger JC., Wiegman L., Boel E., Van der Vuurst de Vries A-R., Loyson SAJ., Helfrich W., Van Berge Henegouwen GP., Van Meijer M., De Kruif J. und Logtenberg T (1999) A recombinant, fully human monoclonal antibody with antitumor activity constructed from phage-displayed antibody fragments. Nature Biotechnol. 17, 276–281.
Isaacs JD, Watts RA, Hazleman BL, Hale G, Keogan MT, Cobbold SP, Waldmann H (1992) Humanised monoclonal antibody therapy for rheumatoid arthritis. Lancet 340, 748–52.
Jacobovits A (1995) Production of fully human antibodies by transgenic mice. Curr Opin Biotechnol. 6, 561–566.
Jenkins N, Parekh RB, James DC (1996) Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat Biotechnol. 14, 975–81.
Jenkins N, Buckberry L, Marc A, Monaco L (1998) Genetic engineering of alpha 2,6-sialyltransferase in recombinant CHO cells. Biochem Soc Trans. 26, S115.
Kawashima I, Ozawa H, Kotani M, Suzuki M, Kawano T, Gomibuchi M. Tai T (1993) Characterization of ganglioside expression in human melanoma cells: immunological and biochemical analysis. J Biochem (Tokyo) 114, 186–193.
Kay R, Takei F, Humphries RK (1990) Expression cloning of a cDNA encoding M1/69. J Immunol. 145, 1952–1959.
Kitamura T, Tange T, Terasawa T, Chiba S, Kuwaki T, Miyagawa K, Piao Y-F, Miyazono K, Urabe A, Takaku F (1989) Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin. J Cell Physiol. 140, 323–334.
Köhler G und Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495.
Krystal, G, Eaves, AC, Eaves CJ (1981) A quantitative bioassay for erythropoietin, using mouse bone marrow. J Lab Clin Med. 97, 144–157.
Krystal G (1983) A simple microassay for erythropoietin based on 3H-thymidine incorporation into spleen cells from phenylhydrazine treated mice. Exp Hematol. 11, 649–660.
Lee EU, Roth J, Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264, 13848–13855.
Levrero M, Barban V, Manteca S, Ballay A, Balsamo C, Avantaggiata ML, Natoli G, Skellekens H, Tiollais P, Perricaudet M (1991) Defective and non-defective adenovirus vectors for expression foreign genes in vitro and in vivo. Gene 101, 195–202.
Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG (1994) Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368, 856–859.
Lonberg N, Huszar D (1995) Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol. 13, 65–93.
Lowder JN, Meeker TC, Levy R (1985) Monoclonal antibody therapy of lymphoid malignancy. Cancer Surv. 4, 359–375.
McCafferty J, Griffiths AD, Winter G und Chiswell DJ (1990) Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348, 552.
Mellstedt H, Frodin JE, Masucci G, Ragnhammar P, Fagerberg J, Hjelm AL, Shetye J, Wersall P, Osterborg A (1991) The therapeutic use of monoclonal antibodies in colorectal carcinoma. Semin Oncol. 18, 462–477.
Mendez MJ, Green LL, Corvalan JR, Jia XC, Maynard-Currie CE, Yang XD, Gallo ML, Louie DM, Lee DV, Erickson KL, Luna J, Roy CM, Abderrahim H, Kirschenbaum F, Noguchi M, Smith DH, Fukushima A, Hales JF, Klapholz S, Finer MH, Davis CG, Zsebo KM, Jakobovits A (1997) Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nat Genet. 15, 146–156.
Minch SL, Kallio PT, Bailey JE (1995) Tissue plasminogen activator coexpressed in Chinese hamster ovary cells with alpha(2,6)-sialyltransferase contains NeuAc alpha(2,6)Gal beta(1,4)Glc-N-AcR linkages. Biotechn Prog. 11, 348–351.
Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT (1984) Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 6851–6855.
Muchmore EA, Milewski M, Varki A, Diaz S (1989) Biosynthesis of N-glycolyneuraminic acid. The primary site of hydroxylation of N-acetylneuraminic acid is the cytosolic sugar nucleotide pool. J Biol Chem. 264, 20216–20223.
Nadler L, Stashenko P, Hardy R, Kaplan W, Burton L, Kufe DW, Antman KH, Schlossman SF (1980) Serotherapy of a patient with a monoclonal antibody directed against a human lymphomaassociated antigen. Cancer Res. 40, 3147–3154.
Oi VT, Morrison SL, Herzenberg LA, Berg P (1983) Immunoglobulin gene expression in transformed lymphoid cells. Proc Natl Acad Sci US A. 1983 80 , 825-829 .
Olive DM, Al-Mulla W, Simsek M, Zarban S, al-Nakib W (1990) The human cytomegalovirus immediate early enhancer-promoter is responsive to activation by the adenovirus-5 13S E1A gene. Arch Virol. 112, 67–80.
Owens RJ und Young RJ. (1994) The genetic engineering of monoclonal antibodies. J. Immunol Methods 168, 149–165.
Reff ME, Carner K, Chambers KS, Chinn PC, Leonard JE, Raab R, Newman RA, Hanna N und Anderson DR (1994) Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood 83, 435–445.
Reichmann L, Clark M, Waldmann H und Winter G (1988) Reshaping human antibodies for therapy. Nature 322, 323–327.
Riethmuller G, Riethmuller G, Schneider-Gadicke E, Schlimok G, Schmiegel W, Raab R, Hoffken K, Gruber R, Pichlmaier H, Hirche H, Pichlmayr R, et al. (1994) Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. Lancet 343, 1177–1183.
Rother RP und Squinto SP (1996) The alpha-Galactosyl epitope: A sugar coating that makes viruses and cells unpalatable. Cell 86, 185–188.
Sanders PG, Wilson RH (1984) Amplification and cloning of the Chinese hamster glutamine synthetase gene. EMBO J. 3, 65–71.
Sandhu JS (1992) Protein Engineering of antibodies. Critical Rev Biotechnology 12, 437–462.
Shawler DL, Bartholomew RM, Smith LM und Dillman RO (1985) Human immune response to multiple injections of murine monoclonal IgG. J Immunol. 135, 1530.
Takeuchi M, Inoue N, Strickland TW, Kubota N, Wada M, Shimizu R, Hoshi S, Kozutsumi H, Takasaki S, Kobata A (1989) Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Proc Natl Acad Sci USA. 86, 7819–7822.
Urlaub G, Kas E, Carothers AM, Chasin LA (1983) Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells. Cell 33, 405–412.
Vandamme A-M., Bulens F., Bernar H., Nelles L., Lijnen RH. und Collen D (1990) Construction and characterization of a recombinant murine monoclonal antibody directed against human fibrin fragment-D dimer. Eur J Biochem. 192, 767–775.
Vaswani SK und Hamilton RG (1998) Humanized antibodies as potential therapeutic drugs. Ann Allergy, Asthma and Immunol. 81, 105–115.
Vonach B, Hess B, Leist C (1998) Construction of a novel CHO cell line coexpressing human glucosyltransferases and fusion PSGL-1-immunoglobulin G. In: O. -W. Merten et al (Hrsg.), New developments and new applications in animal cell technology, pp. 181–183, Kluwer Academic Publishers.
Weikert S, Papac D, Briggs J, Cowfer D, Tom S. Gawlitzek M, Lofgren J, Mehta S, Chisholm V, Modi N, Eppler S, Carroll K, Chamow S, Peers D, Berman P, Krummen L (1999) Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize sialic acid content of recombinant glycoproteins. Nature Biotechnology 17, 1116–1121.
White E, Sabbatini P, Debbas M, Wold WS, Kusher DI, Gooding LR (1992) The 19-kilodalton adenovirus E1B transforming protein inhibits programmed cell death and prevents cytolysis by tumor necrosis factor alpha. Mol Cell Biol. 12, 2570–2580.
Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE und Hoogenboom HR (1994) Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol. 12, 433–455.
Wurm F, Bernard A (1999) Large-scale transient expression in mammalian cells for recombinant protein production. Curr Opin Biotechnol. 10, 156–159.
Yamaguchi K, Akai K, Kawanishi G, Ueda M, Masuda S, Sasaki R (1991) Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties. J Biol Chem. 266, 20434–20439.
Yew PR, Berk AJ (1992) Inhibition of p53 transactivation required for transformation by adenovirus early 12 protein. Nature 357, 82–85.
Zhang X, Lok SH, Kam OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta. 27, 441–452.

TABELLEN: Erträge an rekombinantem EPO

Tabelle 1. Zusammenfassung des Methotrexat-(MTX)-bedingten Absterbens von PER.C6 und PER.C6/E2A nach 6 und 15 Tagen Inkubation mit verschiedenen MTX-Konzentrationen. Die Zellen wurden am Tag 0 ausgebracht und die Inkubationen mit MTX begannen am Tag 1 und wurden 6 Tage lang fortgesetzt. Dann wurde die Konfluenz (%) ermittelt, das Medium durch frisches Medium plus MTX ersetzt und die Inkubation für weitere 9 Tage fortgesetzt, wonach die Konfluenz (%) erneut ermittelt wurde (Tag 15).

PER.C6		0	1	5	10	25	50	100	250	500	1000	2500	nM MTX
1E5 Zellen/Vertiefung Platte mit 6 Vertiefungen	Tag 6	70	70	70	60	< 5	< 1	0,5	0	0	0	0	% Konfluenz
1E5 Zellen/Vertiefung Platte mit 6 Vertiefungen	Tag 15	100	100	100	100	< 10	< 5	0	0	0	0	0	% Konfluenz

PER.C6/E2A		0	1	5	10	25	50	100	250	500	1000	2500	nM MTX
1E5 Zellen/Vertiefung Platte mit 6 Vertiefungen	Tag 6	100	100	100	100	< 100	5	5	4	1	< 1	< 1	% Konfluenz
1E5 Zellen/Vertiefung Platte mit 6 Vertiefungen	Tag 15	100	100	100	100	< 10	< 5	0	0	0	0	0	% Konfluenz

PER.C6-Zelllinien	ELISA-Einheiten/1E6 ausgebrachten Zellen/Tag
P3	735
P5	0
P7	1733
P8	2522
P9	3839
P13	0
P15	0
P42	< 1

PER.C6/E2A-Zelllinien	ELISA-Einheiten/1E6 ausgebrachten Zellen/Tag
E17	325
E55	1600

Tabelle 3. Amplifikationsrate von endogener und integrierter DHFR-DNA. Die Intensitäten der hybridisierenden Banden in den Southern-Blot-Verfahren von Figur 19 wurden in einem Phosphorabbildungsgerät gemessen und vom Hintergrundrauschen bereinigt, um schließlich die ungefähren Amplifikationsraten der endogenen und der integrierten DHFR-Gene zu berechnen.

P8	E1-Sonde	Integriertes dhfr	Amplifikation	Endogenes dhfr	Amplifikation
100 nM	719624	3375		18649
800 nM	913578	2976	× 0,882	45283	× 2,428
1800 nM	831952	2950	× 0,874	81506	× 4371

P9	E1-Sonde	Integriertes dhfr	Amplifikation	Endogenes dhfr	Amplifikation
100 nM	804142	16606		31161
1800 nM	842268	14430	× 0,869	69542	× 2,232

Tabelle 4. EPO-Erträge in vorübergehenden DNA-Transfektionen. Die Erträge pro Million ausgebrachter Zellen wurden mit einem EPO-ELISA in Überständen von PER.C6-, PER.C6/E2A- und CHO-Zellen bestimmt, die in Abwesenheit oder Anwesenheit von Fötalem Rinderserum bei verschiedenen Inkubationstemperaturen mit dem pEPO2000/DHFRwt-Expressionsvektor, wie in Beispiel 12 beschrieben, transfiziert wurden.

Zelllinie	±FBS	Temperatur	EPO-Erträge (ELISA-Einheiten/1E6 Zellen/Tag)
PER.C6/E2A	+	39°C	3100
PER.C6/E2A	–	39°C	2600
PER.C6	+	37°C	750
PER.C6	–	37°C	590
CHO	+	37°C	190
CHO	–	37°C	90

Claims

Verfahren zur Herstellung von wenigstens einem rekombinanten Protein in einer Zelle, umfassend das Bereitstellen einer Zelle, die in ihrem Genom Sequenzen umfasst, die E1A und E1B eines Adenovirus codieren, wobei die Zelle in ihrem Genom keine Sequenz umfasst, die ein strukturelles adenovirales Protein codiert, und wobei die Zelle von einem humanen embryonalen Retinoblasten stammt, wobei das Verfahren das Einführen eines Gens, das ein rekombinantes Protein codiert, in die Zelle, das Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Medium und das Ernten des rekombinanten Proteins aus der Zelle und/oder dem Medium umfasst, wobei das rekombinante Protein von Nucleinsäure codiert wird, die in das Genom dieser Zelle integriert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenzen in dem Genom der Zelle, die E1A und E1B codieren, von den Nucleotiden 459–3510 des Adenovirus-5-Genoms abgeleitet sind.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Sequenz, die E1A codiert, vom humanen PGK-Promotor reguliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle eine PER.C6-Zelle, wie sie unter ECACC-Nr. 96022940 hinterlegt ist, oder ein Derivat davon ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zelle während des Kultivierens in Suspension vorliegt.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das geeignete Medium frei von Serum ist, das von Tier oder Mensch abgeleitet ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Protein ein humanes Protein ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Protein wenigstens eine variable Domäne eines Immunglobulins umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das rekombinante Protein ein Immunglobulin ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das rekombinante Protein ein monoclonaler Antikörper ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei dem rekombinanten Protein um ein Erythropoietin oder ein funktionelles Derivat, Homologes oder Fragment davon handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das rekombinante Protein ein virales Protein, aber kein adenovirales Protein ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das virale Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: einer Influenzavirus-Neuramidase und/oder einem Hämagglutinin; einem Enterovirus-Protein; einem Herpesvirus-Protein; einem Orthomyxovirus-Protein; einem Retrovirus-, einem Parvovirus- oder einem Papovavirus-Protein; einem Rotavirus- oder einem Coronavirus-Protein; einem Togavirus-Protein, einem Rubellavirus-Protein oder einem Protein eines Östlichen, Westlichen oder Venezuelanischen Pferde-Encephalomyelitisvirus; einem Protein eines Hepatitis verursachenden Virus, einem Hepatitis-A-Protein oder einem Hepatitis-B-Virus-Protein; und einem Pestivirus-Protein, wie einem Schweinepestvirusprotein oder einem Rhabdovirusprotein, wie einem Rabiesvirusprotein.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Protein von einer Nucleinsäure codiert wird, die sich unter der Kontrolle des CMV-Promotors befindet.
Zelle, die in ihrem Genom Sequenzen umfasst, die E1A und E1B eines Adenovirus codieren, wobei die Zelle keine Sequenz umfasst, die ein strukturelles adenovirales Protein codiert, und wobei die Zelle von einem humanen embryonalen Retinoblasten stammt, wobei die Zelle weiterhin ein Gen umfasst, das ein rekombiantes Protein codiert, das in das Genom der Zelle integriert ist, wobei das rekombinante Protein ein monoclonaler Antikörper ist oder wobei das rekombinante Protein ein Erythropoietin, oder ein funktionelles Derivat, Homologes oder Fragment davon ist.
Zelle gemäß Anspruch 15, wobei die Sequenzen in dem Genom der Zelle, die E1A und E1B codieren, von den Nucleotiden 459–3510 des Adenovirus-5-Genoms abgeleitet sind.
Zelle gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei die Sequenz, die E1A codiert, vom humanen PGK-Promotor reguliert wird.
Zelle gemäß Anspruch 15, wobei die Zelle eine PER.C6-Zelle, wie sie unter ECACC-Nr. 96022940 hinterlegt ist, oder ein Derivat davon ist, des Weiteren umfassend das Gen, das ein rekombinantes Protein codiert, das in ihr Genom integriert ist.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei das rekombinante Protein ein humanes Protein ist.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei das rekombinante Protein von einer Nucleinsäure codiert wird, die sich unter der Kontrolle eines CMV-Promotors befindet.
Zellkultur, die eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20 und ein geeignetes Medium umfasst.
Zellkultur gemäß Anspruch 21, wobei die Zellkultur eine Suspensionskultur ist.
Zellkultur gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei das geeignete Medium frei von Serum ist, das von Tier oder Mensch abgeleitet ist.