NO328951B1

NO328951B1 - Fremgangsmate ved rekombinant fremstilling av proteiner i en human celle

Info

Publication number: NO328951B1
Application number: NO20014977A
Authority: NO
Inventors: Abraham Bout; Guus Hateboer; Karina Cornelia Verhulst; Govert Johan Schouten; Alphonsus Gerardus Cornelis Maria Uytdehaag
Original assignee: Crucell Holland Bv
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2010-06-28
Also published as: ATE447617T1; ATE536417T1; MXPA01010360A; SI1161548T1; DE60043273D1; DK2163640T3; ES2237420T5; IL145849A; HK1048138A1; EP1533380B1; EP1533380A2; NO20014977L; NZ514951A; EP2163640B1; CY1109759T1; DK1161548T4; EP1161548B2; DK1533380T3; SI1161548T2; ATE289354T1

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å fremstille minst ett rekombinant protein i en celle omfattende å fremskaffe en PER.C6-celle som deponert under ECACC nr. 96022940 eller et derivat derav, hvor fremgangsmåten omfatter å utstyre nevnte celle med et gen som koder for et rekombinant protein, dyrke nevnte celle i et egnet medium og innhøste det rekombinante protein fra nevnte celle og/eller medium, hvor nevnte rekombinante protein er kodet av en nukleinsyre som er integrert i genomet av nevnte celle

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan videre benyttes for fremstilling av antistoffer, nærmere bestemt monoklonale antistoffer. Oppfinnelsen er spesielt nyttig for fremstilling av vaksiner for å lette beskyttelsen mot virale pato-gener i hvirveldyr, spesielt pattedyr og særlig mennesker.

Fremgangsmåter er beskrevet heri for fremstilling av rekombinante proteiner. Oppfinnelsen er spesielt nyttig for fremstilling av proteiner som krever post-translasjonale eller peritranslasjonale modifikasjoner, så som glykosylering og passende folding.

Ekspresjonen av rekombinante menneskeproteiner i heterologe celler er veldokumentert. Mange produksjonssystemer for rekombinante proteiner er blitt tilgjengelige, varierende fra bakterier, gjær og fungi til insektceller, planteceller og pattedyrceller. Imidlertid er, til tross for disse utvik-linger, noen produksjonssystemer fremdeles ikke optimale, eller bare egnet for fremstilling av spesifikke klasser av proteiner. For eksempel kan proteiner som krever post- eller peri-translasjonale modifikasjoner, så som glykosylering, y-karboksylering eller y-hydroksylering, ikke fremstilles i prokaryotiske produksjonssystemer. Et annet velkjent problem med prokaryotiske ekspresjonssystemer er den ofte ukorrekte folding av produktet som skal fremstilles, som til og med fører til uløselige inklusjonsstoffer i mange tilfeller. Eukaryotiske systemer er en forbedring i fremstillingen av spesielt eukaryotisk avledede proteiner, men de tilgjengelige produksjonssystemer lider fremdeles av flere ulemper. Hypermannosyleringen i for eksempel gjær-stammer påvirker gjærcellenes evne til å uttrykke glykoproteiner på passende måte. Hypermannosylering fører ofte til immunreaksjoner når et således fremstilt terapeutisk protein administreres til en pasient. Videre er gjærcellenes sekresjonssignaler forskjellig fra pattedyrenes signaler, hvilket fører til en mer problematisk transport av pattedyrenes proteiner, inklusive humane polypeptider, til det ekstracellulære, som i sin tur resulterer i problemer med kontinuerlig produksjon og/eller isolasjon. Pattedyrceller anvendes i stor utstrekning for fremstilling av slike proteiner, på grunn av deres evne til å utføre utstrakte post-translasjonale modifikasjoner. Ekspresjonen av rekombinante proteiner i pattedyrceller har utviklet seg dramatisk under de senere år, og dette har resultert i mange hendelser i den rutinemessige teknologi. Spesielt er ovarieceller fra kinesiske hamstere (CHO-celler) blitt et rutinemessig og bekvemt produksjonssystem for utvikling av biofarmasøytiske proteiner og proteiner for diagnostiske formål. Et antall karakteristiske trekk gjør CHO meget egnet som vertscelle: Produksjonsnivåene som kan oppnås i CHO-celler er ekstremt høye; cellelinjen tilveiebringer et sikkert produksjons-system, som er fritt for smittsomme eller viruslignende partikler; CHO-celler er blitt karakterisert inngående, skjønt historien for den opprinnelige cellelinje er uklar; CHO-celler kan vokse i suspensjon til høye tettheter i bioreaktorer under anvendelse av serumfrie kulturmedier; en dhrf-mutant av CHO (DG-44-klon. Urlaub et al, 1983) er blitt utviklet for å tilveiebringe et lett seleksjonssystem ved å innføre et eksogent dhrf-gen og deretter en velkont-rollert amplifikasjon av dhrf-genet og transgenet under anvendelse av metotrexat.

Imidlertid fortsetter glykoproteiner eller proteiner omfattende minst to (forskjellige) underenheter å utgjøre problemer. Den biologiske aktivitet hos glykosylerte proteiner kan inngående påvirkes av oligosakkaridkomponentens eksakte natur. Typen av glykosylering kan også ha signifikante virkninger på glykoproteinets immunogenisitet, mål-retting og farmakokinetikk. I de senere år er det blitt gjort vesentlige fremskritt i de cellulære faktorer som be-stemmer glukosyleringen, og mange glykosyltransferase-enzymer er blitt klonet. Dette har resultert i forskning rettet på metabolisk konstruksjon av glykosyleringsmaskineriet (Fussenegger et al, 1999; Lee et al, 1989; Vonach et al, 1998; Jenkins et al, 1998; Zhang et al, 1998; Muchmore et al, 1989). Eksempler på slike strategier er beskrevet ne-denfor.

CHO-cellene mangler et funksjonelt a-2,6-sialyl-transfer-ase-enzym, og dette resulterer i at det utelukkende adderes sialsyrer til galaktose via a-2,3-bindinger. Det er kjent at fravær av a-2,6-bindinger kan forsterke klareringen av et protein fra blodstrømmen. For å ta fatt på dette problem er det blitt konstruert CHO-celler som ligner den humane glykanprofil, ved transfeksjon av de egnede glykosyltrans-feraser. CHO-cellene er også ute av stand til å produsere Lewis<x->oligosakkarider. Det er blitt utviklet CHO-cellelinjer som uttrykker human N-acetyl-D-glukosaminyltransferase og a-1,3-fucosyl-transferase III. I motsetning til dette er det kjent at celler fra gnagere, inklusive CHO-celler, produserer CMP-N-acetylneuraminsyrehydrolase som glykosyle-rer CMP-N-acetylneuraminsyrer (Jenkins et al, 1996), et enzym som er fraværende i mennesker. Proteinene som bærer dette type av glykosylering, kan fremkalle en sterk immunrespons når de injiseres (Kawashima et al, 1993). Den ny-lige identifisering av gnagergenet som koder hydrolase-enzymet, vil høyst sannsynlig underlette utviklingen av CHO-celler som mangler denne aktivitet og vil unngå denne gnagertypiske modifikasjon.

Ifølge fagkunnskapen er det mulig å endre glykosylerings-potensialet i vertsceller fra pattedyr ved ekspresjon av humane glykosyltransferase-enzymer. Selv om de CHO-avledede glykan-strukturer på de rekombinante proteiner kan imitere de som er nærværende på deres naturlige humane motparter, er de likevel langt fra identiske. Et annet potensielt problem er at ikke alle glykosyleringsenzymer er blitt klonet og derfor tilgjengelige for metabolisk konstruksjon. Terapeutisk administrasjon av proteiner som atskiller seg fra sine naturlige humane motparter, kan resultere i aktivering av immunsystemet i pasienten og forårsake uønskede responser som kan påvirke effektiviteten av behandlingen. Andre problemer ved anvendelse av ikke-menneskeceller kan oppstå på grunn av ukorrekt folding av proteinene, hvilket opptrer under eller etter omdannelse som kan være avhengig av nærvær av de forskjellige tilgjengelige chaperon-proteiner. Aberrant folding kan opptre, og dette fører til en re-duksjon eller fravær av biologisk aktivitet hos proteinet. Videre er simultan ekspresjon av separate polypeptider som sammen vil danne proteiner bestående av de forskjellige underenheter, så som monoklonale antistoffer, i korrekte re-lative mengder, av stor viktighet. Menneskeceller vil bedre være i stand til å fremskaffe alle nødvendige innretninger for å uttrykke menneskeproteiner og behandle dem korrekt.

Det er tidligere beskrevet av Berg et al.("High level expression of secreted proteins from cells adapted to serum-free suspension culture", Biotechniques, vol. 14, nr. 6, 1993, s. 972-8, ISSN: 0736-6205) høy ekspresjon av humant protein i stabile, rekombinante 293-celler i serumfri sus-pens j on s dy r kn ing.

Fra Fallaux et al ("New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses", Human Gene Therapy, vol. 9 nr. 13, 1998, s. 1909-17; ISSN: 1043-0342) er det kjent cellelinjen PER.C6 hvor denne cellelinjen blir brukt som en hjelpecelle I produksjonen av recombinante adenovi-rusvektorer.

Det er klart ønskelig å ha fremgangsmåter for å fremstille rekombinante menneskeproteiner, hvilke fremgangsmåter in-volverer en menneskecelle som tilveiebringer stabile men-nesketypiske prosesser, så som post-translasjonale og peritranslasjonale modifikasjoner, for eksempel glykosylering, og hvilke fortrinnsvis også er egnet for produksjon i stor skala.

Således tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille minst et rekombinant protein i en PER.C6-celle deponert under ECACC nr. 96022940 eller et derivat derav utgjørende en eukaryotisk celle med et gen som koder for et rekombinant protein så som minst ett El-protein av et adenovirus eller et derivat derav i sitt genom, hvilken celle ikke koder et strukturelt adenoviralt protein fra sitt genom eller en sekvens integrert deri, hvilken fremgangsmåte omfatter de trekk som går frem av krav 1. Eksempler på slike andre molekyler omfatter karbohydrat og/eller lipid-molekyler. Nukleinsyre som koder et adenoviralt strukturelt protein bør ikke være nærværende av flere grunner. En av grunnene er at nærvær av et adenoviralt strukturelt protein i en tilberedning av produsert protein, er høyst uønsket i mange applikasjoner av slikt produsert protein. Fjerning av slikt strukturelt protein fra produktet oppnås best ved å unngå at det opptrer i fremstillingen. Hvis proteinet er ment å skulle administreres til mennesker, er det foretrukket at både cellen og proteinet høstet fra nevnte celle stammer fra mennesker. En fordel med en menneskecelle er at mesteparten av de kommersielt mest attraktive proteiner er fra mennesker.

Med et gen menes en nukleinsyre omfattende en nukleinsyre av interesse i et format som kan uttrykkes, så som en eks-presjonskassett. Nukleinsyren av interesse kan uttrykkes fra den naturlige promoter eller et derivat derav eller en helt homolog promoter. Nukleinsyren av interesse kan omfatte introner eller ikke. På lignende måte kan den være en cDNA- eller cDNA-lignende nukleinsyre. Nukleinsyren av interesse kan kode et protein. Alternativt kan nukleinsyren av interesse kode et anti-sense-RNA.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å fremstille minst ett humant rekombinant protein i en PER.C6-celle, hvilken fremgangsmåte omfatter å utstyre en menneskecelle som har en sekvens som koder minst ett immortaliserende El-protein av et adenovirus eller et funksjonelt derivat derav i sitt genom, hvilken celle ikke produserer strukturelle adenovirusproteiner, med en nukleinsyre som koder nevnte humane rekombinante protein, å dyrke nevnte celle i et egnet medium og å høste minst ett humant rekombinant protein fra nevnte celle og/eller nevnte medium. Før foreliggende oppfinnelse var det få, hvis noen i det hele tatt, menneskeceller som var funnet å være egnet til å produsere rekombinante menneskeproteiner på en reproduserbar og oppskalerbar måte. Vi har nå funnet at celler som omfatter i det minste immortaliserende adenovirale El-sekvenser i sitt genom, er i stand til å vokse (de immortaliseres i nærvær av El) relativt uavhengig av eksogene vekstfaktorer. Videre er disse PER.C6-celler i stand til å produsere rekombinante proteiner i signifikante mengder og er i stand til å produsere korrekt det rekombinante protein som skal lages. Naturligvis vil disse celler også være i stand til å produsere ikke-menneske proteiner. De humane cellelinjer som er blitt anvendt til å produsere rekombinante proteiner i enhver signifikant mengde, er ofte tumor-holdige (transformerte) cellelinjer. Det faktum at de fleste menneskeceller som er blitt anvendt for produksjon av rekombinante proteiner, er tumoravledet bidrar til en ekstra risiko ved arbeidet med disse spesielle cellelinjer og resulterer i meget strenge isolasjonsprosedyrer for det rekombinante protein for å unngå å omdanne aktivitet eller tumorfremkallende materiale i et protein eller andre prepa-rater .

For å oppnå (kontinuerlig) fremstilling i stor skala av rekombinante proteiner via cellekultur, er det foretrukket i faget å ha celler som er i stand til å vokse uten at det er nødvendig med forankring. Cellene benyttet i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse har denne evne. Den forankringsuavhengige vekstevne forbedres når cellene omfatter en sekvens som koder E2A eller et funksjonelt derivat eller en analog eller et fragment derav i sitt genom, hvorved fortrinnsvis nevnte E2A-kodende sekvens koder en temperaturfølsom mutant E2A, så som tsl25. For å oppnå et rent og sikkert produksjons-system fra hvilket det er lett å isolere det ønskede rekombinante protein, er det foretrukket å ha en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen, hvorved nevnte celle omfatter ingen andre adenovirale sekvenser. PER.C6-celler er lettere å behandle enn for eksempel transformerte humane 293-celler som også er blitt immortalisert ved hjelp av El-regionen fra adenovirus. PER.C6-cellene er blitt karakterisert og er blitt dokumentert i meget stor utstrekning, og de er signifikant lettere å ha med å gjøre når det gjelder oppskalering, suspensjonsvekst og vekstfaktoruavhengighet. Spesielt det faktum at PER.C6 kan bringes i suspensjon på meget reproduserbar måte, er noe som gjør den meget egnet for produksjon i stor skala. Videre er PER.C6-cellelinjen blitt karakterisert med hensyn til bioreaktorvekst hvor den vokser til meget høye tettheter.

PER.C6-cellene har den ytterligere fordel at de kan dyrkes i fravær av dyre- eller menneskeavledet serum eller dyre- eller menneskeavledede serumkomponenter. Således er isolasjonen lettere, og sikkerheten øker på grunn av fravær av ytterligere menneske- eller dyreproteiner i kulturen, og systemet er meget pålitelig (syntetiske medier er de beste vedrørende reproduserbarhet). Videre tilføyer nærvær av Early-regionen IA (EIA) i adenovirus fordeler på et annet nivå sammenlignet med (humane) cellelinjer som mangler dette spesielle gen: EIA som transkripsjonal aktivator er kjent for å forsterke transkripsjon fra forsterkeren/- promoteren av "Cytomegalovirus Immediate Early"-genene (Olive et al, 1990; Gorman et al, 1989). Når det rekombinante protein som skal fremstilles, er under kontroll av CMW-forsterkeren/promoteren, øker ekspresjonsnivåene i nevnte celler og ikke i celler som mangler EIA.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør videre høyning av fremstillingen av et rekombinant protein i en PER.C6-celle, hvor nevnte celle utstyres med en nukleinsyre som koder for nevnte protein, hvorved nevnte kodende sekvens er under kontroll av en CMV-promoter, en ElA-promoter eller en funksjonell homolog, et derivat og/eller et fragment derav, og videre å utstyre nevnte celle med ElA-aktivitet eller ElA-lignende aktivitet. Liksom CMV-promoteren er også E1A-promotere mer aktive i celler som uttrykker et eller flere ElA-produkter, enn i celler som ikke uttrykker slike produkter. Det er kjent at faktisk er ElA-ekspresjonsfor-sterkningen karakteristisk for flere andre promotere. For foreliggende oppfinnelse er slike promotere ansett å være funksjonelle homologer av ElA-promotere. ElA-effekten kan være mediert ved tiltrekningen av transkripsjonsaktivatorer i ElA-promoteren eller en homolog derav og/eller ved å fjerne/unngå binding av transkripsjonsrepressorer til promoteren. Bindingen av aktivatorer og repressorer til en promoter opptrer på sekvensavhengig måte. Et funksjonelt derivat av en ElA-promoter omfatter derfor minst nukleinsy-rebindingssekvensen i minst én ElA-proteinregulert aktivator og/eller repressor.

En annen fordel ved cellene benyttet i fremgangsmåten iføl-ge oppfinnelsen er at de tar imot og uttrykker konstitutivt Adenovirus ElB-genet. Adenovirus E1B er en velkjent inhibitor av programmert celledød eller apoptose. Denne inhibisjon opptrer enten via 55K ElB-produktet ved dets binding til transkripsjonsfaktoren p53 og påfølgende inhibisjon (Yew og Berk, 1992). Det andre produkt av ElB-regionen, 19K E1B, kan forhindre apoptose ved å binde og derved hemme den cellulære død for proteinene Bax og Bak, begge proteiner som er under kontroll av p53 (White et al, 1992; Debbas og White, 1993; Han et al, 1996; Farrow et al. 1995). Disse trekk kan være ekstremt nyttige for ekspresjonen av rekombinante proteiner som, når de overuttrykkes, kan være involvert i induksjonen av apoptose via en p53-avhengig reak-sjonsvei .

Proteiner som vil kunne uttrykkes i PER.C6-celler ved anvendelse av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, er velkjent for personer med utdannelse i faget. De er fortrinnsvis menneskeproteiner som fortrinnsvis gjennomgår en form for behandling i naturen, så som sekresjon, chaperon-folding og/eller transport, kosyntese med andre underenheter, glykosylering, fosforylering. Typiske eksempler på terapeutisk eller diagnostisk anvendelse omfatter monoklonale antistoffer som omfattes av flere underenheter, vevsspesi-fikk plasminogen aktivator (tPA), granulocytt-koloni-stimulerende faktor (G-CSF) og humant erytropoietin (EPO). EPO er et typisk produkt som, spesielt in vivo, sterkt avhenger av sitt glykosyleringsmønster for sin aktivitet og immunogenesitet. Så langt kan relativt høye nivåer av EPO oppnås ved anvendelse av CHO-celler som er forskjellig glykosylert sammenlignet med EPO foredlet fra menneskeurin, selv om de er like aktive i høyningen av erytrocytt-produksjonen. Den forskjellige glykosylering av slikt EPO fører imidlertid til immunogenesitetsproblemer og endrede halveringstidsproblemer i en mottaker.

I foreliggende oppfinnelse benyttes en immortalisert menneskecellelinje, PER.C6-celler (WO 97/00326), som ble generert ved transfeksjon av primære embryonale retinaceller fra mennesker, ved anvendelse av et plasmid som inneholdt Adenovirus serotype 5 (Ad5) ElA-and ElB-kodende sekvenser (Ad5-nukleotidene 459-3510) under kontroll av den humane fosfoglyceratkinase(PGK)-promoter.

Følgende trekk gjør PER.C6 spesielt nyttig som vert for produksjonen av rekombinante proteiner: 1. helt ut karakterisert menneskecellelinje; 2. utviklet i samsvar med GLP;

3. kan dyrkes som suspensjonskulturer i fastsatt serumfritt medium, fritt for ethvert menneske- eller dyreavledet protein; 4. vekstkompatibelt med rulleflasker, rystekolber, dreiekolber og bioreaktorer med dubleringstider på omkring 35 timer; 5. nærvær av EIA som forårsaker en oppregulering av ekspresjonen av gener som er under kontroll av CMW-forsterkeren/promoteren; 6. nærvær av E1B som forhindrer p53-avhengig apoptose, muligens forsterket ved overekspresjon av det rekombinante transgen.

I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte hvor nevnte celle er i stand til å produsere 2 til 200 ganger mer rekombinant protein enn konvensjonelle pattedyrscellelinjer. Fortrinnsvis velges nevnte konvensjonelle pattedyrcellelinjer fra gruppen bestående av CHO-, COS-, Vero-, Hela-, BHK- og Sp-2-cellelinjer.

I et aspekt av oppfinnelsen er proteinet et monoklonalt antistoff. Antistoffer, eller immunoglobuliner (Igs), er se-rumproteiner som spiller en sentral rolle i den humorale immunrespons, ved å binde antigener og inaktivere dem eller utløse den inflammatoriske respons, hvilket resulterer i at de elimineres. Antistoffer er i stand til høyst spesifikke vekselvirkninger med mange forskjellige ligander, inklusive tumorforbundne markører, virale kappeproteiner og lymfocyt-tiske celleoverflateglykoproteiner. De er derfor potensielt meget nyttige midler for diagnose og behandling av sykdommer i mennesker. Rekombinant monoklonal og enkeltkjedet antistoff teknologi åpner nye perspektiver for utviklingen av nye terapeutiske og diagnostiske midler. Monoklonale antistoffer fra mus er blitt anvendt som terapeutiske midler i mange forskjellige kliniske forsøk for å behandle smittsomme sykdommer og kreft. Den første rapport om en pasient som ble behandlet med et murint monoklonalt antistoff ble publisert i 1980 (Nadler et al. 1980). Imidlertid har virkningene som ble iakttatt med disse midler, generelt vært ganske skuffende (for oversikter se Lowder et al. 1966, Mellstedt et al. 1991, Baldwin og Byers 1986). Tradisjonelt produseres rekombinante monoklonale antistoffer (immunoglobuliner) på B-celle-hybridoma. Slike hybridomaer produseres ved sammensmeltning av en immunoglobulin-produserende B-celle, initialt valgt på grunn av sin spesifisitet, til en murin myeloma-celle, og derved immortaliseres B-cellen. Den opprinnelige strategi med immortaliserende murine B-celler ble utviklet i 1975 (Kohler og Milstein). Imidlertid har immunoglobuliner produsert i slike hybridomaer den ulempe at de er av murin opprinnelse, og dette resulterer i dårlig antistoffspesifisitet, lav antistoffaffinitet og en streng anti-murin antistoffrespons hos verten (host anti-mouse antibody respons, HAMA, Shawler et al.

1985). Denne HAMA-respons kan føre til inflammasjon, feber og til og med at pasienten dør.

Murine antistoffer har en lav affinitet i mennesker og av hittil ukjente grunner har de en ekstremt kort halveringstid i menneskets kretsløp (19-42 timer) sammenlignet med humane antistoffer (21 dager, Frodin et al. 1990). Dette, sammen med intensiteten av HAMA-responsen, har tilskyndet utviklingen av alternative strategier for å fremstille flere humane eller fullstendig humaniserte immunoglobuliner (gjennomgått av Owens og Young 1994, Sandhu 1992, Vaswani et al. 1998).

En slik strategi benytter de konstante regioner i det humane immunoglobulin til å erstatte dets murine motparter, og dette resulterer i en ny generasjon av "ki-mære" og "humaniserte" antistoffer. Denne problem-løsning benyttes siden HAMA-responsen hovedsakelig skyldes de konstante domener (Oi et al, 1983; Morrison et al, 1984) . Et eksempel på et slikt chimerisk antistoff er CAMPATH-1H (Reichmann et al. 1988). CAMPATH-1H Ab, anvendt i behandlingen av ikke-Hodgkins 3-celle-lymfom og refraktær revmatoid artritt, er rettet mot det humane antigen CAMPATH-1 (CDw52) som er nærværende på alle lymfoide celler og monocytter, men ikke på andre celletyper (Hale et al. 1988, Isaacs et al. 1992). Andre eksempler er Rituxan (Rituximab) rettet mot humant

CD20 (Reff et al. 1994) og 15C5, et chimerisk antistoff

rettet mot human fragment-D-dimer (Vandamme et al. 1990, Bulens et al. 1991) anvendt i avbildning av blodkoagule-ring. Imidlertid, siden disse chimeriske nygenererte antistoffer fremdeles er delvis murine, kan de indusere en immunrespons i mennesker, riktignok ikke så alvorlig som HAMA-responsen, mot antistoffer av helt ut murin opprinnelse .

I en annen, mer sofistikert problemløsning erstattes flere forskjellige rester, som er nærværende i de varierende domener av antistoffet, men åpenbart ikke essensielle for antigengjenkjennelsen, med flere humanlignende avsnitt av aminosyrer, og dette resulterer i en andre generering av hyperkimære antistoffer (Vaswani et al. 1998). Et velkjent eksempel på denne problemløsning er Herceptin (Carter et al. 1992), et antistoff som er 95% humant, og som er rettet mot HER2 (et tumor-spesifikt antigen) og anvendes på brysttumorpasienter.

En mer foretrukket måte å erstatte murine rekombinante immunoglobuliner på ville være en metode som resulterer i generering av humane immunoglobuliner. Først og fremst, siden det er uetisk å immunisere mennesker med eksperimentelt biologisk materiale, er det ikke gjennom-førlig å senere velge spesifikke B-celler for immortalisering, som vist for murine B-celler (Kohler og Milstein 1975). Skjønt B-celler fra pasienter ble valgt for spesifikke antistoffer mot kreft-antigener, er det teknisk vanskeligere å fremstille humane immunoglobuliner fra humant material sammenlignet med murine antistoffer (Kohler og Milstein, 1975). En rekombinant mulighet for å produsere fullverdige menneskeantistoffer ble mulig ved å anvende bakteriofag-oppviste antistoffsamlinger, som uttrykker variable domener av menneskelig opprinnelse (McCafferty et al. 1990, Clarkson et al. 1991, Barbas et al. 1991, Garrard et al. 1991, Winter et al. 1994, Burton og Barbas, 1994). Disse variable regioner velges for sin spesifikke affinitet for visse antigener og bindes deretter til de konstante domener i humane immunoglobuliner, og dette resulterer i humane rekombinante immunoglobuliner. Et eksempel på denne sistnevnte prob-lemløsning er det enkeltkjedede Fv-antistoff 17-1A (Riethmuller et al. 1994) som ble omdannet til et intakt humant IgGl-kappa-immunoglobulin kalt UBS-54, rettet mot det tumorforbundne EpCAM-molekyl (Huls et al. 1999).

Produksjonssystemene for å fremstille rekombinante immunoglobuliner er mangfoldige. De murine immunoglobuliner som først ble anvendt i kliniske forsøk, ble produsert i store mengder i sin parentalspesifikke B-celle og fusjonert til en murin myelomacelle for immortalisering. En ulempe ved dette system er at de produserte immunoglobuliner er av helt murin opprinnelse og gir en dramatisk immunrespons (HAMA-respons) i et menneske (som beskrevet ovenfor).

Partielt humaniserte antistoffer eller humane antistoffer mangler en parental B-celle som kan immortaliseres og må derfor fremstilles i andre systemer, så som ovarieceller fra kinesiske hamster (CHO-celler) eller nyreceller fra hamsterunger (BHK-celler). Det er også mulig å anvende celler som normalt er egnet for immunoglobulinproduksjon, så som tumoravledede humane og murine myelomaceller. Imidlertid er antistoffutbyttet som oppnås i myelomaceller, generelt relativt lavt (+0,1 ug/ml) sammenlignet med det som oppnås i de opprinnelig identifiserte og immortaliserte B-celler som produserer helt murine immunoglobuliner (±10 ug/ml, Sandhu 1992).

For å omgå disse og andre mangler er forskjellige systemer under utvikling for å produsere humaniserte eller humane immunoglobuliner med høyere utbytte.

For eksempel ble det nylig vist at transgene musestammer kan fremstilles hvor de murine IgG gener er erstattet med deres humane motparter (Bruggeman et al., 1991, Lonberg et al., 1994, Lonberg og Huszar, 1995, Jacobovits, 1995). Kunstige gjærkromosomer (YACs) inneholdende store frag-menter av de humane tung- og lett-(kappa)-kjedede immunoglobulin(lg)-lokuser ble innført i Ig-inaktiverte mus, og dette resulterte i produksjon av menneskeantistoff som lignet meget det som forekommer i mennesker, inklusive omgrup-pering og sammensetning av genene og deres repertoar (Mendez et al 1997, Green et al. 1994). På lignende måte har Fishwild et al. (1996) konstruert humane Ig-genmodi-fikasjoner for å tilveiebringe humane immunoglobuliner ved anvendelse av påfølgende konvensjonell hybridomateknologi. Hybridomacellene utskilte immunoglobuliner med egenskaper som lignet villtypemusenes egenskaper, vedrørende stabili-tet, vekst og sekresjonsnivåer. Rekombinant antistoff produsert fra slike transgene musestammer bærer ingen ikke-humane aminosyresekvenser.

Ikke desto mindre har hittil produserte menneskeimmunoglo-buliner den ulempe at de produseres i ikke-menneskeceller, og dette resulterer i ikke-humane post-translasjonale modifikasjoner så som glykosylering og/eller folding av underenhetene. Alle antistoffer glykosyleres i reserverte stil-linger i sine konstante regioner, og nærvær av karbohydra-ter kan være kritisk for antigenklarerende funksjoner, så som komplementaktivering. Strukturen for det tilknyttede karbohydrat kan også påvirke antistoffaktiviteten. Anti-stoffets glykosylering kan påvirkes av cellen som det produseres i, oppbygningen av antistoffet og cellekulturens betingelser. For eksempel bærer antistoff produsert i muse-celler glykaner inneholdende Gal alphal-3Gal-resten, som er fraværende i protein produsert i menneskeceller (Borrebaeck et al. 1993, Borrebaeck. 1999). En meget høy titer av anti-Gal alphal-3Gal-antistoffer er nærværende i mennesker (100 ug/ml, Galili, 1993) og bevirker hurtig klarering av (murine) proteiner som bærer denne rest i sine glykaner.

Det ble fort klart at for å ha en innvirkning, trenger pasienter å bli behandlet med meget høye doser av rekombinante immunoglobuliner i lengre tidsperioder. Det er sannsynlig at post-translasjonale modifikasjoner på humane eller humaniserte immunoglobuliner, som ikke er produsert på menneskeceller, sterkt påvirker klareringshastigheten av disse antistoffer fra blodstrømmen.

Det er uklart hvorfor immunoglobuliner produsert på CHO-celler også trenger å anvendes i meget høye doser, siden Gal alphal-3Gal-resten ikke er nærværende i glykaner på proteiner avledet fra denne cellelinje (Rother og Squinto.

1996). Derfor er andre post-translasjonale modifikasjoner i tillegg til Gal alphal-3Gal-restene sannsynligvis involvert i spesifikke immunresponser i mennesker mot fullt ut humane eller humaniserte immunoglobuliner produsert på slike CHO-celler.

Faget lærer således at det er mulig å produsere humaniserte antistoffer uten murint avledede proteinsekvenser. Imidlertid atskiller den nåværende generering av rekombinante immunoglobuliner seg likevel fra sine naturlige humane motparter, f.eks. ved post-translasjonale modifikasjoner, så som glykosylering og folding. Dette kan resultere i aktivering av immunsystemet i pasienten og forårsake uønskede responser som kan påvirke effektiviteten av behandlingen. Således, til tross for utviklingen av chimeriske antistoffer, trenger de nåværende produksjonssystemer likevel opti-mering for å produsere fullverdige humane eller humaniserte aktive antistoffer.

Det er således klart ønskelig å ha metoder for å fremstille fullverdige menneskeantistoffer som oppfører seg deretter, og som i tillegg produseres i høyere utbytte enn iakttatt i humane myelomaceller.

Således ville det være en forbedring i faget å fremskaffe en menneskecelle som konsekvent produserer humanlignende protein som preparerer ensartede post-translasjonale og peri-translasjonale modifikasjoner, så som, men ikke be-grenset til, for eksempel glykosylering. Det ville videre være fordelaktig å fremskaffe en metode for å fremstille en rekombinant pattedyrcelle og immunoglobuliner fra rekombinante pattedyrceller for produksjon i stor skala.

Det kan ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilles minst ett variabelt domene av et immunoglobulin i en rekombinant PER.C6-celle, hvor cellen utstyres med en nukleinsyre som koder minst ett immortaliserende El-protein av et adenovirus eller et funksjonelt derivat, en homolog og/eller et fragment derav i sitt genom, og videre med en andre nukleinsyre som koder nevnte immunoglobulin, hvor nevnte celle dyrkes i et egnet medium og hvor det høstes minst ett monoklonalt antistoff fra nevnte celle og/eller nevnte medium.

Videre er slike celler i stand til å produsere immunoglobuliner i signifikante mengder og er i stand til korrekt å bearbeide de genererte immunoglobuliner. Det faktum at celletyper, som er blitt anvendt for immunoglobulinproduksjon, er tumoravledet, øker risikoen ved arbeidet med disse spesielle cellelinjer og resulterer i meget strenge isolasjonsprosedyrer for immunoglobulinene for å unngå å overføre aktivitet eller tumorfremkallende materiale i pre-paratene. Det er derfor foretrukket å anvende en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen, hvorved nevnte celle er PER-C6.

For å oppnå (kontinuerlig) fremstilling i stor skala av immunoglobuliner via en slik cellekultur, er det foretrukket å ha celler som er i stand til å vokse uten at det er nød-vendig med forankring. Cellene som anvendes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse har denne evne. Den forankringsuavhengige vekstevne forbedres når cellene omfatter en adenovirusavledet sekvens som koder E2A (eller et funksjonelt derivat eller en analog eller et fragment derav) i sitt genom. I en foretrukken utførelsesform koder den E2A-kodende sekvens en temperaturfølsom mutant E2A, så som tsl25. Nevnte celle kan i tillegg omfatte en nukleinsyre (f.eks. som koder tTa), som gir anledning til regulert ekspresjon av et gen av interesse når det bringes under kontroll av en promoter (f.eks. en TetO-promoter).

Nukleinsyren kan kode en tung kjede, en variabel tung kjede, en lett kjede og/eller en variabel lett kjede av et immunoglobulin. Alternativt kan en separat eller distinkt nukleinsyre kode et eller flere variable domener i et lg (eller et funksjonelt derivat, en homolog og/eller et fragment derav), som motpart til den første nukleinsyre (beskrevet ovenfor). En eller flere nukleinsyrer beskrevet heri kan kode et ScFv og kan være fra mennesker eller være humanisert. Nukleinsyren(e) i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse bringes fortrinnsvis under kontroll av en induserbar promoter (eller et funksjonelt derivat derav) .

For å oppnå et rent og sikkert produksjonssystem hvorfra det er lett å isolere de ønskede immunoglobuliner, er det foretrukket å ha en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen, hvorved nevnte PER.C6-celle ikke omfatter andre adenovirale sekvenser. Den mest foretrukne celle for fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er PER.C6 eller et derivat derav deponert under ECACC nr. 96022940. PER.C6 har vist seg å være mer stabil, spesielt ved håndtering, enn for eksempel transformerte humane 293-celler immortalisert av den adenovirale El-region. PER . C 6-cel lene er blitt grundig karakterisert og dokumentert og har oppvist gode egenskaper når det gjelder prosessoppskalering, suspensjonsvekst og vekstfaktoruavhengighet. Videre kan PER.C6 innlemmes i en suspensjon på meget reproduserbar måte, hvilket gjør den spesielt egnet for produksjon i stor skala. I denne henseende er PER.C6-cellelinjen blitt karakterisert for bioreaktorvekst, hvor den kan vokse til meget høye tettheter.

PER. C6-cellene kan med fordel dyrkes i fravær av dyre-eller menneskeavledet serum, eller dyre- eller menneskeavledede serumkomponenter. Således forenkles isolasjonen av monoklonale antistoffer, og sikkerheten forsterkes på grunn av fravær av ytterligere menneske- eller dyreproteiner i kulturen. Fravær av serum øker videre systemets pålitelighet, siden anvendelse av syntetiske medier som begrunnet heri, forsterker reproduserbarheten.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte hvor nevnte celle videre omfatter en sekvens som koder E2A (eller et funksjonelt derivat eller en analog eller et fragment derav) i sitt genom, fortrinnsvis hvor nevnte E2A er temperaturfølsom. I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte hvor nevnte celle videre omfatter et transak-tiverende protein for induksjon av nevnte induserer promoter.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan videre benyttees for å fremstille minst ett variabelt domene av et immunoglobulin i en PER.C6-celle ved å dyrke denne i et egnet medium, og å høste minst ett variabelt domene av et valgt lg fra cellen og/eller mediet. Immunoglobuliner, variable domener i immunoglobulinene, eller derivater derav, kan anvendes for terapeutisk behandling av pattedyr eller fremstilling av farmasøytiske sammensetninger.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille et virusprotein som ikke er et adenovirus eller et adenoviralt protein for anvendelse som vaksine, hvilke fremgangsmåte omfatter å utstyre en PER.C6-celle med minst én sekvens som koder minst ett genprodukt av El-genet eller et funksjonelt derivat derav av et adenovirus, å utstyre nevnte celle med en nukleinsyre som koder nevnte virale protein, å dyrke nevnte celle i et egnet medium som muliggjør ekspresjon av nevnte virale protein og å høste viralt protein fra nevnte medium og/eller nevnte celle. Før foreliggende oppfinnelse var der få, hvis noen i det hele tatt, (humane) celler som var funnet egnet til å produsere virusproteiner for anvendelse som vaksiner på en reproduserbar og oppskalerbar måte og/eller med tilstrekke-lig høyt utbytte og/eller som var lette å rense. Vi har nå funnet at PER.C6-celler som omfatter adenovirale El-sekvenser, fortrinnsvis i sitt genom, er i stand til å produsere det virale protein i signifikante mengder.

Den aktuelle PER.C6-celle avledes fra en human primær celle, fortrinnsvis en celle som er immortalisert av et genprodukt av nevnte El-gen. For å være i stand til å dyrke en slik primær celle trenger den naturligvis å immortaliseres.

I PER.C6-cellene er det viktig at El-gensekvensene ikke ta-pes under cellens syklus. Det er derfor foretrukket at

nevnte sekvens som koder minst ett genprodukt av El-genet,

er nærværende i genomet i nevnte (humane) celle. Av sikker-hetsgrunner må man helst unngå unødvendige adenovirale sekvenser i cellene i henhold til oppfinnelsen. Det er således en annen utførelsesform av oppfinnelsen å fremskaffe celler som ikke produserer adenovirale strukturelle proteiner.

Imidlertid, for å oppnå (kontinuerlig) virusproteinproduk-sjon i stor skala via cellekultur, er det foretrukket å ha slike celler som er i stand til å vokse uten å trenge forankring. PER.C6-cellene har denne evne. Å ha et rent og sikkert produksjonssystem hvorfra det er lett å utvinne og, hvis ønskelig, å rense virusproteinet, er det foretrukket å ha en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen, hvorved nevnte menneskecelle ikke omfatter andre adenovirale sekvenser. Den aktuelle celle for fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er PER.C6 deponert under ECACC nr. 96022940 eller et derivat derav.

Således tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte hvor det anvendes en PER.C6-celle, hvor nevnte celle videre omfatter en sekvens som koder E2A eller et funksjonelt derivat eller en analog eller et fragment derav, fortrinnsvis en slik celle hvor nevnte sekvens som koder E2A eller et funksjonelt derivat eller en analog eller et fragment derav, er nærværende i genomet av nevnte menneskecelle og mest foretrukket en celle hvor nevnte E2A-kodende sekvens koder en temperaturfølsom mutant E2A.

Nevnte (humane) PER.C6-celle er i stand til å vokse i suspensjon .

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte hvor nevnte PER.C6-celle kan dyrkes i fravær av serum. PER.C6-cellene har den ytterligere fordel at de kan dyrkes i fravær av serum eller serumkomponenter. Således er isolasjonen lett, sikkerheten er øket, og systemets pålitelighet er god (syntetiske medier er de beste når det gjelder reproduserbarhet) . PER.C6-cellene er i stand til normal post- og peri-translasjonale modifikasjoner og sammenstilling. Dette betyr at de er meget velegnet for å fremstille virusproteiner for anvendelse i vaksiner.

Således kan det ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremstilles et viralt protein hvor nevnte virale protein omfatter et protein som gjennomgår post-translasjonal og/eller peritranslasjonal modifikasjon, spesielt hvor nevnte modifikasjon omfatter glykosylering. Vaksinen som omfatter et slikt protein kan anvendes for vaksinasjon av mennesker. Imidlertid er vaksinen også effektiv i dyr. Proteinet i en slik vaksine er avledet fra en PER.C6-celle hvor nevnte celle er avledet fra den samme stamme som stam-mene det virale protein i vaksinen er avledet fra. Et virusprotein kan være hele det virale protein eller en funksjonell ekvivalent derav. En funksjonell ekvivalent av et virusprotein er minst én immunogen del av det virale protein. Et godt eksempel på en virusvaksine som har vært be-sværlig å produsere på en pålitelig måte, er influensa-vaksine. Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen hvor nevnte virusproteiner omfatter minst enten én influensavirus-neuraminidase og/eller et hemagglutinin. Andre virusproteiner (underenheter) som kan fremstilles i fremgangsmåtene i henhold til oppfinnelsen, omfatter proteiner fra enterovirus, så som rhinovirus, aftovirus, eller poliomyelittvirus, herpesvirus, så som herpes symplexvirus, pseudorabies-virus eller bovint herpes-virus, orthomyxovirus, så som influensavirus, et para-myxovirus, så som "newcastle disease"-virus, respiratorisk syncitio-virus, kusma-virus eller et meslinge-virus, retrovirus, så som human immundefisiensvirus eller et parvovirus eller et papovavirus, rotavirus eller et coronavirus, så som smittsomt gastroenteritisvirus eller et flavivirus, så som flåttbårent encefalittvirus eller gulfebervirus, et togavirus, så som rubellavirus eller østlig, vestlig eller venezuelansk heste-encefalomyelittvirus, et hepatitt-forårsakende virus, så som hepatitt A eller hepatitt B-virus, et pestivirus, så som svinekolera-virus eller et rhabdovirus, så som rabies-virus.

Produktene som er resultatet av fremgangsmåten i henhold

til oppfinnelsen, er spesielt virusproteiner som kan oppnås i henhold til disse fremgangsmåter, og kan særskilt innlemmes i en farmasøytisk sammensetning omfattende egnede eksi-pienser og i noen formater (under-enheter) adjuvanter. Do-seringen og administrasjonsmåtene kan utvelges ved normal klinisk testing, hvis dette ikke ennå er tilgjengelig via de allerede registrerte vaksiner.

Således tilveiebringer oppfinnelsen også en mulighet for fremstilling av et virusprotein som kan anvendes i en vaksine, hvor nevnte virusprotein er fritt for ethvert ikke-humant proteinaktig pattedyrsmateriale.

Således kan det lages influensavaksiner med proteiner som er fremstilt ved hjelp av en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen.

EKSEMPLER

For å illustrere oppfinnelsen tilveiebringes følgende eksempler. Det humane erytropoietin(EPO)-molekyl inneholder fire karbohydratkjeder. Tre inneholder N-bindinger til as-paraginer, og en inneholder en O-binding til en serinrest. Viktigheten av glykosylering i den biologiske aktivitet av EPO er veldokumentert (Delorme et al 1992; Yamaguchi et al 1991). cDNA som koder humant EPO, ble klonet og uttrykt i PER.C6-celler og PER.C6/E2A-celler, ekspresjonen ble vist, og glykosyleringmønsteret ble analysert.

Eksempel 1: Konstruksjon av grunnleggende ekspresjonsvektorer

Plasmid pcDNA3.1/Hygro(-) (Invitrogen) ble spaltet med Nrul og EcoRV, defosforylert ved 5'-terminiene ved hjelp av "Shrimp Alkaline Phosphatase" (SAP, GIBCO Life Tech.), og plasmidfragmentet som manglet den umiddelbare tidlige forsterker og promoter fra cytomegalovirus (CMV), ble renset fra gel. Plasmidet pAdApt, inneholdende den fulle lengde av CMV-forsterker/promoter (-735 til +95) nærmest overlappende Adeno-avledede sekvenser for å produsere rekombinant Adenovirus, ble spaltet med Avrll, fylt med Klenow-polymerase og spaltet med Hpal; fragmentet inneholdende CMV-forsterkeren og promoteren ble renset over agarosegel. Dette CMV-forsterker- og promoterfragment ble ligert buttende mot buttende til NruI/EcoRV-fragmentet fra pcDNA3,1/Hygro(-). Det resulterende plasmid ble betegnet pcDNA2000/Hyg(-).

Plasmidet pcDNA2000/Hyg(-) ble spaltet med Pmll, og det li-neariserte plasmid som manglet Hygromycin-resistens-markørgenet, ble renset fra gel og ligert på nytt. Det resulterende plasmid ble betegnet pcDNA2000. Plasmidet pcDNA2000 ble spaltet med Pmll og defosforylert med SAP ved begge termini. Plasmidet pIG-GC9 inneholdende den ville typen av humant DHFR cDNA (Havenga et al 1998) ble anvendt for å tilveiebringe den ville typen av DHFR-gen ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) med innførte, ikke-kodende Pmll-seter oppstrøms og nedstrøms for cDNA'et. PCR-primere som ble anvendt, var DHFR opp: 5'-GAT CCA CGT GAG ATC TCC ACC ATC GTT GGT TCG CTA AAC TG-3' og DHFR ned: 5'-GAT CCA CGT GAG ATC TTT AAT CAT TCT TCT CAT ATAC-3'. PCR-produktet ble spaltet med Pmll og anvendt for ligasjon i pcDNA2000 (spaltet med Pmll, og defosforylert ved hjelp av SAP) for å tilveiebringe pcDNA2000/DHFRwt (Fig 1). Villtypesekvenser og korrekte anvendte kloningsseter ble bekreftet ved hjelp av dobbeltstrenget sekvensering. Dessuten ble en mutant versjon av det humane DHFR-gen (DHFRm) anvendt for å oppnå en 10000 ganger høyere resistens mot metotrexat i PER.C6 og PER.C6/E2A ved å velge en mulig integrasjon av transgenet i en genomisk region med høy transkripsjonal aktivitet. Denne mutant har en aminosyresubstitusjon i posisjon 32 (fenyl-alanin til serin) og posisjon 159 (leucin til prolin) inn-ført ved PCR-prosedyren. PCR på plasmid pIG-CC12 (Havenga et al 1998) ble anvendt for å tilveiebringe den mutante versjon av humant DHFR. Kloning av denne mutant er sammen-lignbar med villtype-DHFR. Plasmidet oppnådd med mutant DHFR ble betegnet pcDNA2000/DHFRm.

pIPspAdapt 6 (Galapagos) ble spaltet med Agel- og BamHI-restriksjonsenzymer. Det resulterende polylinkerfragment har følgende sekvens: 5'- ACC GGT GAA TTC GGC GCG CCG TCG

ACG ATA TCG ATC GGA CCG ACG CGT TCG CGA GCG GCC GCA ATT CGC

TAG CGT TAA C GG ATC C -3'. De anvendte Agel- og BamHI-rekognisjonsseter er understreket. Dette fragment inneholder flere unike restriksjonsenzymrekognisjonsseter og ble renset over agarosegel og ligert til et Agel/BamHI-spaltet og agarosegelrenset pcDNA2000/DHFRwt-plasmid. Den resulterende vektor ble kalt pcDNA2001/DHFRwt (Fig 2)

pIPspAdapt7 (Galapagos) spaltes med Agel- og BamHI-restriksjonsenzymer og har følgende sekvens: 5'- ACC GGT

GAA TTG CGG CCG CTC GCG AAC GCG TCG GTC CGT ATC GAT ATC GTC GAC GGC GCG CCG AAT TCG CTA GCG TTA AC G GAT CC-3' . De anvendte Agel- og BamHI-rekognisjonsseter er understreket. Polylinkerfragmentet inneholder flere unike restriksjonsenzym-rekognisjonsseter (som atskiller seg fra pIPspAdapt6), som renses over agarosegel og ligeres til et Agel/BamHI-spaltet og agarosegel-renset pcDNA2000/DHFRwt. Dette resulterer i pcDNA2002/DHFRwt (Fig 3).

pcDNA2000/DHFRwt ble partielt spaltet med restriksjons-enzymet PvuII. Der er to PvuII-seter nærværende i dette plasmid, og kloning ble utført i setet mellom SV40 poly(A) og ColEl, ikke PvuII-setet nedstrøms for BGH poly(A). En enkelt sete-spaltet blanding av plasmid ble defosforylert med SAP og buttet med Klenow-enzym og renset over agarosegel. pcDNA2001/DHFRwt ble spaltet med MunI- og PvuII-restriksjonsenzymer og utfylt med Klenow og frie nukleotider for å ha begge ender buttet. Det resulterende CMV-promoter-linker-BGH poly(A)-inneholdende fragment ble isolert over gel og separert fra vektoren. Dette fragment ble ligert inn i den partielt spaltede og defosforylerte vektor og undersøkt med hensyn til orientering og innsetningssete. Det resulterende plasmid ble kalt pcDNAs3000/DHFRwt (Fig 4) .

Eksempel 2: Konstruksjon av EPO ekspresjonsvektorer

Det full-lengdede humane EPO cDNA ble klonet under anvendelse av oligonukleotidprimerne EPO-START:5' AAA AAG GAT

CCG CCA CCA TGG GGG TGC ACG AAT GTC CTG CCT G-3' og EPO-STOP:5'AAA AAG GAT CCT CAT CTG TCC CCT GTC CTG CAG GCC TC-3' (Cambridge Bioscience Ltd) i en PCR-reaksjon på en cDNA-samling fra et voksent menneskes lever. Det amplifiserte fragment ble klonet i pUC18 linearisert med BamHI. Sekvensen ble kontrollert ved hjelp av dobbeltstrenget sekvensering. Dette plasmid, inneholdende EPO cDNA i pUC18 ble spaltet med BamHI, og EPO-innsetningen ble renset fra agarosegel. Plasmidene pcDNA2000/DHFRwt og pcDNA2000/DHFRm ble linearisert med BamHI og defosforylert ved 5'-overhenget ved hjelp av SAP, og plasmidene ble foredlet fra agarosegel. EPO cDNA-fragmentet ble ligert inn i BamHI-setene i pcDNA2000/DHFRwt og pcDNA2000/DHFRm; de resulterende plasmider ble betegnet pEP02000/DHFRwt (Fig 5) og pEPO2000/DHFRm.

Plasmidet pMLPI.TK (beskrevet i WO 97/00326) er et eksempel på et adapterplasmid konstruert for anvendelse i kombinasjon med forbedrede innpakningscellelinjer så som PER.C6 (beskrevet i WO 97/00326 og US 08/892,873). Først ble et PCR-fragment generert fra pZipAMo+PyFlOl(N~)-templat DNA (beskrevet i PCT/NL96/00195) med følgende primere: LTR-1

(5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3') og LTR-2 (5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'). PCR-produktet ble deretter spaltet med BamHI og ligert inn i

pMLPlO (Levrero et al 1991) som ble spaltet med PvuII og BamHI, hvilket genererte vektoren pLTRlO. Denne vektor inneholder adenovirale sekvenser fra bp 1 opp til bp 454 etterfulgt av en promoter bestående av en del av Mo-MuLV LTR med sine ville forsterkersekvenser erstattet av forsterkeren fra et mutant polyoma-virus (PyFlOl). Promoter-fragmentet ble betegnet L420. Deretter ble det kodende område av det murine HSA-gen innsatt. pLTRlO ble spaltet med BstBI, etterfulgt av Klenow-behandling og spaltning med Ncol. HSA-genet ble oppnådd ved PCR-amplifikasjon på pUC18-HSA (Kay et al 1990) ved anvendelse av følgende primere: HSAI (5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3') og HSA2 (5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG

ATG TAG AA-3'). 269 bp PCR-fragmentet ble subklonet i en skyttelvektor ved anvendelse av Ncol- og Bglll-setene. Sekvensering bekreftet innlemmelse av den korrekte kodende sekvens av HSA-genet, men med en ekstra TAG-innsetning direkte etter TAG-stoppkodonet. Det kodende område i HSA-genet, inklusive TAG-duplikasjonen ble deretter skåret bort som et NcoI/Sall-fragment og klonet i et 3,5 kb NcoI/BstBI cut pLTRlO, hvilket resulterte i pLTR-HSA10. Dette plasmid ble spaltet med EcoRI og BamHI, hvoretter fragmentet inneholdende det venstre ITR, innpakningssignalet, L420-promoteren og HSA-genet, ble innsatt i vektoren pMLPI.TK spaltet med de samme enzymer, derved erstattende promoteren og gensekvensene, resulterende i det nye adapterplasmid pAd5/L420-HSA.

pAd5/L420-HSA-plasmidet ble spaltet med Avrll og Bglll etterfulgt av behandling med Klenow og ligert til et buttende 1570 bp-fragment fra pcDNAl/amp (Invitrogen) oppnådd ved spaltning med Hhal og Avrll etterfulgt av behandling med T4 DNA-polymerase. Dette adapterplasmid ble kalt pAd5/CLIP.

For å muliggjøre fjerning av vektorsekvenser fra den venstre ITR ble pAd5/L420-HSA partielt spaltet med EcoRI, og det lineære fragment ble isolert. En oligo av sekvensen 5' TTA AGT CGA C-3' ble smeltet til seg selv resulterende i en linker med et Sall-sete og EcoRI-overheng. Linkeren ble ligert til den partielt spaltede pAd5/L420-HSA-vektor, og kloner ble valgt som hadde linkeren innsatt i EcoRI-sete 23 bp oppstrøms for det venstre adenovirus ITR i pAd5/L420-HSA, resulterende i pAd5/L420-HSA.sal.

For å muliggjøre fjerning av vektorsekvenser fra den venstre ITR ble pAd5/CLIP også partielt spaltet med EcoRI, og det lineære fragment ble isolert. EccRI-linkeren 5' TTA ACT CGA C-3' ble ligert til den partielt spaltede pAd5/CLIP-vektor, og kloner ble valgt som hadde linkeren innsatt i EcoRI-sete 23 bp oppstrøms for det venstre adenovirus ITR resulterende i pAd5/CLIP.sal. Vektoren pAd5/L420-HSA ble også modifisert for å skape et Pacl-sete oppstrøms for den venstre ITR. Hertil ble pAd5/L420-HSA spaltet med EcoRI og ligert til en Pacl-linker (5'-AAT TGT C TT AAT TAA CCG CTT AA-3'). Ligasjonsblandingen ble spaltet med PacI og religert etter isolasjon av det lineære DNA fra agarosegel for å fjerne konkatameriserte linkere. Dette resulterte i adapterplasmid pAd5/L420-HSA.pac.

Dette plasmid ble spaltet med Avrll og Bglll. Vektorfragmentet ble ligert til et linker-oligonukleotid spaltet med de samme restriksjonsenzymer. Linkeren ble laget ved å tilfeste oligoer med følgende sekvens: PLL-1 (5'- GCC ATC CCT AGG AAG CTT GGT ACC GGT GAA TTC GCT AGC CTT AAC GGA TCC TCT AGA CGA GAT CTG G-3') og PLL-2 (5'- CCA GAT CTC GTC TAG AGG ATC CGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TAC CAA GCT TCC TAG

GGA TGG C-3'). De tilfestende linkere ble separat ligert

til det Avrll/Bglll-spaltede pAd5/L420-HSA.pac-fragment, resulterende i pAdMire.pac. Deretter ble et 0,7 kb Scal/BsrGI-fragment fra pAd5/CLIP.sal inneholdende sal-linkeren klonet inn i Scal/BsrGI-setene i pAdMire.pac-plasmidet etter fjerning av fragmentet inneholdende pac-linkeren. Dette resulterende plasmid ble kalt pAdMire.sal.

Plasmid pAd5/L420-HSA.pac ble spaltet med Avrll, og 5'-overhengende ender ble fylt i ved anvendelse av Klenow-enzym. En andre spaltning med Hindlll resulterte i fjerning av L420-promotersekvensene. Vektorfragmentet ble isolert og ligert separat til et PCR-fragment inneholdende CMV-promotersekvensen. Dette PCR-fragment ble oppnådd etter amplifikasjon av CMV-sekvenser fra pCMVLacI (Stratagene) med følgende primere: CMVplus (5'-GAT CGG TAC CAC TGC AGT GGT CAA TAT TGG CCA TTA GCC-3') og CMVminA (5'-GAT CAA GCT TCC AAT GCA CCG TTC CCG GC-3'). PCR-fragmentet ble først spaltet med Pstl hvoretter de 3'-overhengende ender ble fjernet ved behandling med T4 DNA-polymerase. Deretter ble DNA'et spaltet med Hindlll og ligert inn i den Avrll/Hindlll-spaltede pAd5/L420-HSA.pac-vektor. Det resulterende plasmid ble kalt pAd5/CMV-HSA.pac. Dette plasmid ble deretter spaltet med Hindlll og BamHI, og vektorfragmentet ble isolert og ligert til Hindlll/Bglll-polylinkersekvensen oppnådd etter spaltning av pAdMire.pac. Det resulterende plasmid ble kalt pAdApt.pac og inneholder nukleotidene -735 til +95 av den humane CMV-promoter/forsterker (Boshart M et al 1985) . Det full-lengdede humane EPO cDNA (Genbank-aksesjonsnummer: M11319) inneholdende en perfekt Kozak-sekvens for passende translasjon ble fjernet fra pUC18-ryggraden etter en BamHI-spaltning. CDNA-innsetningen ble renset over agarosegel og ligert inn i pAdApt.pac som også ble spaltet med BamHI, deretter defosforylert ved 5'- og 3'-innsetningssetene ved anvendelse av SAP og også renset over agarosegel for å fjerne den korte BamHI-BamHI-linkersekvens. Det oppnådde sirkulære plasmid ble kontrollert med Kpnl-, Ddel- og Ncol-restriksjonsspaltninger som alle gav bånd med de riktige størrelser. Videre ble orien-teringen og sekvensen bekreftet ved hjelp av dobbeltstrenget sekvensering. Det oppnådde plasmid med det humane EPO cDNA i den korrekte orientering ble kalt pAdApt.EPO (Fig 6) .

Eksempel 3: Konstruksjon av UDS- 54- ekspresjonsvektorer

De konstante domener (CH1, -2 og -3) av den tunge kjede av det humane immunoglobulin Gl(IgGl)-gen inklusive intronsekvenser og hengseldomene ("Hinge"-domene) ble generert ved PCR ved anvendelse av en oppstrøms- og en nedstrøms-primer. Sekvensen for oppstrømsprimeren (CAMH-UP) er 5'-GAT C GA TAT CGC TAG CAC CAA GGG CCC ATC GGT C-3', hvori the tilfestende nukleotider er angitt i kursiv, og to sekvensi-elle restriksjonsenzym-rekognisjonsseter (EcoRV og Nhel) er understreket.

Sekvensen for nedstrømsprimeren (CAMH-DOWN) is: 5'-GAT C GT TTA AAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG- 3 ' , hvori de tilfestende nukleotider er angitt i kursiv, og det innførte Pmel-restriksjonsenzym-rekognisjonssete er understreket.

Rekkefølgen som domene av den humane IgGl-tungkjede ble ar-rangert i, er som følger: CHl-intron-Hinge-intron-CH2-intron-CH3. PCR-prosedyren ble utført på et plasmid (pCMgamma NEO Skappa Vgamma Cgamma hu) inneholdende den tunge kjede av et humanisert antistoff rettet mot D-dimer fra human fibrinogen (Vandamme et al. 1990). Dette antistoff ble kalt 15C5, og humaniseringen ble utført med inn-føringen av de humane konstante domener inklusive intronsekvenser (Bulens et al. 1991).

PCR-prosedyren resulterte i et produkt på 1621 nukleotider. Nhel- og Pmel-setene ble innført for lett kloning i pcDNA2000/Hyg(-)polylinkeren. Nhel-setet kodet to aminosyrer (Ala og Ser), som er en del av det konstante område CH1, men som ikke hybridiserte til DNA'et nærværende i templaten (Crowe et al. 1992).

PCR-produktet ble spaltet med Nhel- og Pmel-restriksjonsenzymer, renset over agarosegel og ligert inn i et Nhel og Pmel-spaltet og agarosegel-renset pcDNA2000/Hygro(-). Dette resulterte i plasmid pHC2000/Hyg(-) (Fig 7), som kan anvendes for binding av de humane tungkjedede konstante domener, inklusive introner til enhver mulig variabel region av en identifisert immunogiobulin-tungkjede for humanisering.

Det konstante domene av den lette kjede av det humane immunoglobulin ( IgGl) -gen ble generert ved hjelp av PCR ved anvendelse av en oppstrøms- og en nedstrøms-primer: Sekvensen for oppstrømsprimeren (CAML-UP) er 5'-GAT C CG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT C-3', hvori de tilfestende nukleotider er angitt i kursiv, og et innført Sunl-restriksjonsenzym-rekognisjonssete er understreket.

Sekvensen for nedstrømsprimeren (CAML-DOWN) er 5'-GAT C GT TTA AAC CTA ACA CTC TCC CCT GTT G-3', hvori de tilfestende nukleotider er i kursiv, og et innført Pmel-restriksjonsenzym-rekognisjonssete er understreket.

PCR-prosedyren ble utført på et plasmid (pCMkappa DHFR13 15C5 kappa humanisert) som bærer den murine signalsekvens og det murine variable område av den lette kjede av 15C5 bundet til det konstante domene av den humane IgGl lettkjede (Vandamme et al. 1990; Bulens et al. 1991). PCR-prosedyren resulterte i et produkt på 340 nukleotider. SunT- og Pmel-setene ble innført for kloning i pcDNA2001/DHFRwt-polylinkeren. Sunl-setet kodet to aminosyrer (Arg og Thr) hvor treoninresten er en del av det konstante område av humane immunoglobulin-lettkjeder, mens argininresten er en del av det variable område av CAMPATH-1H (Crowe et al. 1992). Dette muliggjorde påfølgende 3'-kloning inn i Sunl-setet, som var unikt i plasmidet. PCR-produktet ble spaltet med SunI- og Pmel-restriksjonsenzymer renset over agarosegel, ligert inn i et BamHI, Pmel-spaltet og agarosegelrenset pcDNA2001/DHFRwt, som ble avbuttet med Klenow-enzym og frie nukleotider. Ligasjon i den korrekte orientering resulterte i tap av BamHI-setet ved 5'-enden og bevaring av SunI- og Pmel-setene. Det resulterende plasmid ble kalt pLC2001/DHFRwt (Fig 8), hvilket plasmid kan anvendes for binding av det humane lettkjedede konstante domene til ethvert mulig variabelt område av enhver identifisert immunoglobulin-lettkjede for humanisering.

pNUT-C gamma (Huls et al., 1999) inneholder de konstante domener, introner og hengselområde for den humane IgGl-tungkjede (Huls et al. 1999) og mottok oppstrøms for det

første konstante domene det variable domene av gamma-kjeden av helt ut humanisert monoklonalt antistoff UBS-54 som føl-ger etter følgende lederpeptidsekvens: MACPGFLWALVISTCLEFSM (sekvens: 5'- ATG GCA TGC CCT GGC TTC CTG TGG GCA CTT GTG

ATC TCC ACC TGT CTT GAA TTT TCC ATG -3'). Dette resulterte i en innsetning av tilnærmelsesvis 2 kb i lengde. Hele gamma-kjeden ble amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av en oppstrøms-primer (UBS-UP) og nedstrømsprimeren CAMH-DOWN. Sekvensen for UBS-UP er som følger: 5'-GAT C AC GCG TGC TAG CCA CCA TGG CAT GCC CTG GCT TC-3' hvori de innførte Mlul- og Nhel-seter er understreket, og den perfekte Kozak-sekvens er kursivert.

Det resulterende PCR-produkt ble spaltet med Nhel og Pmel-restriksjonsenzymer, renset over agarosegel og ligert til pcDNA2000/Hygro(-)-plasmidet som også spaltes med Nhel og Pmel, defosforyleres med tSAP og renses over gel. Det resulterende plasmid ble kalt pUBS-Heavy2000/Hyg(-) (Fig 9). pNUT-C kappa inneholder det konstante domene av den lette kjede av humant IgGl-kappa (Huls et al. 1999) og mottok det variable domene av fullt ut humanisert monoklonalt antistoff UPS-54-kappakjede som følger etter følgende lederpep-tid: MACPGFLWALVISTCLEFSM (sekvens: 5'- ATG GCA TGC CCT GGC

TTC CTG TGG GCA CTT GTG ATC TCC ACC TGT CTT GAA TTT TCC ATG

-3', vedrørende detaljer på plasmidet se UBiSys). Dette resulterte i en innsetning på omtrent 1,2 kb i lengde.

Hele innsetningen ble amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av oppstrømsprimeren UBS-UP og nedstrømsprimeren CAML-DOWN, hvorved translasjonsstartsetet ble modifisert. Det resulterende PCR-produkt ble spaltet med Nhel- og Pmel-restriksjonsenzymer, renset over agarosegel og ligert til pcDNA2001/DHFRwt som også ble spaltet med Nhel og Pmel, defosforylert ved tSAP og renset over gel, resulterende i pUBS-Light2001/DHFRwt (Fig 10). For å fjerne det ekstra intron som er lokalisert mellom det variable domene og det første konstante domene som er nærværende i pNUT-Cgamma og for å binde signalpeptidet og det variable domene til den ville typen av konstante domener i en human IgGl-tungkjede, som mangler et antall polymorfismer nærværende i det kar-boksyterminale konstante domene i pNUT-Cgamma, genereres et PCR-produkt med primer UBS-UP og primer UBSHV-DOWN som har følgende sekvens: 5'-GAT CG TAG CTG TCG AGA CGG TGA CCA G - 3', hvori det innførte Nhel-sete er understreket og de tilfestende nukleotider er kursivert. Det resulterende PCR-produkt spaltes med Nhel-restriksjonsenzym, renses over gel og ligeres til et Nhel-spaltet og SAP-defosforylert pHC2000/Hyg(-)-plasmid som ble renset over gel. Plasmidet med innsetningen i den korrekte orientering og leseramme kalles pUBS2-Heavy2000/Hyg(-) (Fig 11).

For fjerning av et ekstra intron som er lokalisert mellom det variable domene og det konstante domene som er nærværende i pNUT-Ckappa, og for å binde signalpeptidet og det variable domene til den ville typen av det konstante domene i en human IgGl-lettkjede, ble et PCR-produkt generert med primeren UBS-UP og primeren UBSLV-DOWN som har følgende sekvens: 5'- GAT C CG TAC GCT TGA TCT CCA CCT TGG TC -3', hvori det innførte Sunl-sete er understreket, og de tilfestende nukleotider er uthevet. Deretter ble det resulterende PCR-produkt spaltet med Mlul- og Sunl-restriksjonsenzymer, renset over gel og ligert til et Mlul-og Sunl-spaltet pLC2001/DHFRwt-plasmid som ble renset over gel. Det resulterende plasmid ble kalt pUBS2-Light2001/DHFRwt (Fig 12) .

PCR-produktet av den full-lengdede tunge kjede i UBS-54 spaltes med Nhel- og Pmel-restriksjonsenzymer og avbuttes med Klenow-enzym. Dette fragment ligeres til plasmidet pcDNAs3000/DHFRwt som spaltes med BstXI-restriksjonsenzym, avbuttes, defosforyleres ved hjelp av SAP og renses over gel. Plasmidet med tungkjedeinnsetningen kalles pUBS-Heavy3000/DHFRwt. Deretter spaltes PCR i den lette kjede med Mlul- og Pmel-restriksjonsenzymer, avbuttes, renses over gel og ligeres til pUBS-Heavy3000/DHFRwt som spaltes med Hpal, defosforyleres ved tSAP og renses over gel. Den resulterende vektor kalles pUBS-3000/DHFRwt (Fig 13). Genet som koder den tunge kjede UBS-54 uten et intron mellom det variable domene og det første konstante område, og med et vilt karboksyterminalt konstant område (2031 nukleotider), renses over gel etter spaltning av pUBS2-2000/Hyg(-) med EcoRI og Pmel og behandling med Klenow-enzym og frie nukleotider for å avbutte EcoRI-setet. Deretter ligeres innsetningen til et pcDNAs3000/DHFRwt-plasmid som spaltes med BstXI, avbuttes, defosforyleres med SAP og renses over gel. Det resulterende plasmid kalles pUBS2-Heavy3000/DHFRwt. pUBS2-Light2001/DHFRwt spaltes deretter med EcoRV og Pmel, og den 755 nukleotide innsetning inneholdende signalpeptidet bundet til det variable domene av kappakjeden av UBS-54 og det konstante domene av human IgGl-kappakjede uten en intron-sekvens renses over gel og ligeres til pUBS2-Heavy3000/DHFRwt som spaltes med Hpal, defosforyleres med tSAP og renses over gel. Det resulterende plasmid kalles pUBS2-3000/DHFRwt (Fig 14).

Plasmid pRc/CMV (Invitrogen) ble spaltet med BstBI-restriksjonsenzymer, avbuttet med Klenow-enzym og deretter spaltet med Xmal-enzym. Det Neomycin-resistensgenholdige fragment ble renset over agarosegel og ligert til pUBS-Light2001/DHFRwt-plasmid som ble spaltet med Xmal- og Pmll-restriksjonsenzymer, etterfulgt av defosforylering med SAP og rensing over gel for å fjerne DHFR cDNA. Det resulterende plasmid ble kalt pUBS-Light2001/Neo. Fragmentet ble også ligert til et Xmal/Pmll-spaltet og gelrenset pcDNA2001/DHFRwt-plasmid resulterende i pcDNA2001/Neo. PCR-produktet av det UBS-54-variable domene og det spaltede og rensede konstantdomeniske PCR-produkt ble anvendt i en tre-punkts ligasjon med et MluI/Pmel-spaltet pcDNA2001/Neo. Det resulterende plasmid ble kalt pUBS2-light2001/Neo.

Eksempel 4: Konstruksjon av CAMPATH- lH- ekspresjonsvektorer

Cambridge Bioscience Ltd. (UK) genererer et 396 nukleotid-fragment inneholdende en perfekt Kozak-sekvens etterfulgt av signalfrekvensen og det variable område av den publiserte CAMPATH-lH-lettkjede (Crowe et al. 1992). Dette fragment inneholder, på 5'-enden, et innført og unikt Hindlll-sete og, på 3'-enden, et innført og unikt Sunl-sete og er klonet inn i en passende skyttelvektor. Dette plasmid spaltes med Hindlll og SunI, og det resulterende CAMPATH-1H-lettkjede-fragment renses over gel og ligeres inn i et Hindlll/Sunl-spaltet og agarosegelrenset pLC2001/DHFRwt. Det resulterende plasmid kalles pCAMPATH-Li9ht2001/DHFRwt. Cambridge Bioscience Ltd. (UK) genererte et 438 nukleotid-fragment inneholdende en perfekt Kozak-sekvens etterfulgt av signalfrekvensen og det publiserte variable område av CAMPATH-lH-tungkjeden (Crowe et al. 1992), klonet inn i en passende klonende vektor. Dette produkt inneholder et unikt Hindlll-restriksjonsenzym-rekognisjonssete på 5'-enden og et unikt Nhel-restriksjonsenzym-rekognisjonssete på 3'-enden. Dette plasmid ble spaltet med Hindlll og Nhel, og det resulterende CAMPATH-lH-tungkjedefragment ble renset over gel og ligert inn i et renset og Hindlll/Nhel-spaltet pHC2000/Hyg(-). Det resulterende plasmid ble kalt pCAMPATH-Heavy2000/Hyg(-).

Eksempel 5: Konstruksjon av 15C5- ekspresjonsvektorer

Den tunge kjede av den humaniserte versjon av det monoklonale antistoff 15C5 rettet mot human fibrinfragmentisk D-dimer (Bulens et al. 1991; Vandamme et al. 1990) bestående av humane konstante domener inklusive intronsekvenser, hengselområde og variable regioner som følger etter signalpeptidet fra 15C5-kappa-lettkjeden, amplifiseres ved hjelp av PCR på plasmidet "pCMgamma NEO Skappa Vgamma Cgamma hu" som templat under anvendelse av CAMH-DOWN som nedstrøms-primer og 15C5-UP som oppstrømsprimer. 15C5-UP har følgende sekvens: 5'-GA TCA CGC GTG CTA GCC ACC A TG GGT ACT CCT GCT CAG TTT CTT GGA ATC -3', hvori de innførte Mlul- og Nhel-restriksjons-rekognisjonsseter er understreket og den perfekte Kozak-sekvens er kursivert. For på rett måte å inn-føre en adekvat Kozak-kontekst, erstattes adeninet ved posisjon +4 (adeninet i ATG-startkodonet er +1) med et guanin resulterende i en mutasjon fra et arginin inn i en glycin-aminosyre. For å forhindre primer-dimerisering, erstattes posisjon +6 av guaninet med et tymin, og posisjonen +9 av cytosinet erstattes med tymin. Sistnevnte mutasjon levner treoninresten intakt. Det resulterende PCR ble spaltet med Nhel- og Pmel-restriksjonsenzymer, renset over gel og ligert til et Nhel og Pmel-spaltet pcDNA2000/Hygro(-), som defosforyleres ved hjelp av SAP og renses over agarosegel. Det resulterende plasmid kalles plSC5-Heavy2000/Hyg(-). Den lette kjede av den humaniserte versjon av det monoklonale antistoff 15C5 rettet mot human fibrin fragmentisk D-dimer (Bulens et al. 1991; Vandamme et al. 1990) bestående av det humane konstante domene og de variable regioner som følger etter et 20 aminosyrers signalpeptid, amplifiseres ved hjelp av PCR på plasmidet pCMkappa DHFR13 15C5kappa hu som templat, under anvendelse av CAML-DOWN som nedstrøms-primer og 15C5-UP som oppstrømsprimer. Det resulterende PCR spaltes med Nhel- og Pmel-restriksjonsenzymer, renses over gel og ligeres til et Nhel- og Pmel-spaltet pcDNA2001/DHFRwt som defosforyleres ved hjelp av SAP og renses over agarosegel. Det resulterende plasmid kalles pl5C5-Light2001/DHFRwt.

Eksempel 6: Opprettelse av metotrexat- hygromycim og G418-seleksjonsnivåer

PER.C6 og PER.C6/E2A ble utsådd i forskjellige tettheter. Utgangskonsentrasjonen av methotrexate (MTX) i disse sensitivitetsstudier varierte mellom 0 nM og 2500nM. Konsentrasjonen som var akkurat dødelig for begge cellelinjer, ble bestemt; når cellene ble utsådd i tettheter av 100000 celler per brønn i en 6-brønners skål, var brønnene fremdeles 100% konfluente ved 10nM, tilnærmelsesvis 90-100% konfluente ved 25nm, mens de fleste celler ble drept ved konsentrasjoner på 50nM og høyere etter 6 til 15 dagers inkubasjon. Disse resultater er oppsummert i tabell 1. PER.C6-celler ble testet med hensyn til sin resistens mot en kombinasjon av Hygromycin og G418 for å velge utvoksende stabile kolonier som uttrykte både tunge og lette kjeder for de respektive rekombinante monoklonale antistoffer kodet av plasmider som bærer enten et hygromycin- eller et neomycin-resistent gen. Når cellene ble dyrket på normalt medium inneholdende 100 ug/ml hygromycin og 250 ug/ml G418, ble ikke-transfekterte celler drept, og stabile kolonier kunne fremkomme (se eksempel 7).

CHO-dhfr-cellene ATCC:CRL9096 utsåes i forskjellige tettheter i sitt respektive kulturmedium. Utgangskonsentrasjonen av metotrexat i disse sensitivitetsstudier varierer fra tilnærmelsesvis 0,5 nM til 500 nM. Konsentrasjonen, som er akkurat dødelig for cellelinjen, bestemmes, og anvendes deretter direkte etter vekstutvelgelse på hygromycin ved-rørende IgG-tungkjedeseleksjon (hyg) og lettkjede-seleksjon (dhfr).

Eksempel 7: Transfeksjon av EPO- ekspresjonsvektorer for å tilveiebringe stabile cellelinjer

Celler av cellelinjene PER.C6 og PER.C6/E2A ble utsådd i 40 vevskulturskåler (10 cm diameter) med tilnærmelsesvis 2-3 millioner celler/skål og ble holdt over natten under sine respektive betingelser (100% C02-konsentrasjon og temperatur, som er 39°C for PER.C6/E2A og 37°C for PER.C6). Neste dag ble alle transfeksjoner utført ved 37°C under anvendelse av Lipofectamine (Gibco). Etter erstatning med friskt (DMEM) medium etter 4 timer ble PER.C6/E2A-cellene overført til 39°C igjen, mens PER.C6-cellene ble holdt ved 37°C. Tyve skåler av hver cellelinje ble transfektert med 5 g Scal-spaltet pEP02000/DHFRwt og tyve skåler ble transfektert med 5 ug Scal-spaltet pEPO2000/DHFRm, alle i henhold til standard protokoller. Ytterligere 13 skåler tjente som negative kontroller for metotrexat-dreping og transfek-sjonseffektivitet som var tilnærmelsesvis 50%. Neste dag ble MTX tilsatt til skålene i konsentrasjoner varierende mellom 100 og 1000 nM for DHFRwt og 50000 og 500000nM for DHFRm oppløst i medium inneholdende dialysert FBS. Cellene ble inkubert over en periode på 4-5 uker. Vevsmedium (inklusive MTX) ble oppfrisket hver annen eller tredje dag. Cellene ble overvåket daglig med hensyn til død ved sammenligning mellom positive og negative kontroller. Utvoksende kolonier ble plukket ut og dyrket i underkulturer. Ingen positive kloner kunne dyrkes i underkulturer fra transfektantene som mottok det mutante DHFR-gen, sannsynligvis på grunn av toksiske virkninger av de høye konsentrasjoner av MTX som ble brukt. Fra PER.C6- og PER.C6/E2A-cellene som ble transfektert med den ville typen av DHFR-gen, kunne bare cellelinjer opprettes i de første passeringer når cellene ble dyrket på 100nM MTX, skjønt kolonier fremkom i skåler med 250 og 500 nM MTX. Disse kloner var ikke levedyktige under underkulturdyrking, og de ble kassert.

Eksempel 8: Underkulturdyrking av transfekterte celler

Fra hver cellelinje ble tilnærmelsesvis 50 utvalgte kolonier, som var resistente mot MTX-terskelkonsentrasjonen, dyrket i 96-brønners, 24-brønners, 6-brønners plater og T25-kolbe i sitt respektive medium plus MTX. Idet cellene oppnådde vekst i T25-vevskulturkolbene, ble minst én vial av hver klon frosset og lagret og ble deretter testet med hensyn til human rekombinant EPO-produksjon. Til dette ble det kommersielle ELISA-utstyr fra R&D Systems anvendt (Quantikine IVD human EPO, Quantitative Colorimetric Sand-wich ELISA, cat.# DEPOO). Siden de forskjellige kloner syn-tes å ha forskjellige vekstkarakteristikker og vekstkurver, ble en standard for EPO-produksjon fastlagt som følger: På dag 0 ble celler utsådd i T25-vevskulturkolber i konsentrasjoner varierende mellom 0,5 til 1,5 million per kolbe. På dag 4. ble supernatant tatt og anvendt i EPO ELISA. Fra dette ble produksjonsnivået fastlagt som ELISA-enheter per million utsådde celler per dag. (U/lE6/dag). Et antall av disse kloner er angitt i tabell 2.

Følgende seleksjon av gode produksjonskloner ble basert på høy ekspresjon, dyrkingsadferd og levedyktighet. For å mu-liggjøre kontroller med hensyn til langtidslevedyktighet, suspensjonvekst i rulleflasker og bioreaktor under lengre tidsperioder, ble flere vialer av de beste produksjonskloner frosset, og følgende beste produsenter av hver cellelinje ble valgt for videre undersøkelser: P8, P9, E17 og E55 hvori "P" står for PER.C6 og "E" står for PER.C6/E2A. Disse kloner dyrkes i underkulturer og utsettes for økende doser av metotrexat i en tidsperiode på to måneder. Konsentrasjonen starter ved terskelkonsentrasjonen og øker til tilnærmelsesvis 0,2 mM. Under disse to måneder utføres EPO ELISA-eksperimenter regelmessig for å påvise en økning i EPO-produksjon. Ved den høyeste metotrexat-konsentrasjon velges den mest stabile produsent og sammenlignes med meng-dene fra den beste CHO-klon og anvendes for celle-samlinger

(RL). Fra annenhver klon fryses 5 vialer. Antallet av amplifiserte EPO cDNA-kopier påvises ved "Southern blotting".

Eksempel 9: EPO- produksjon i bioreaktorer

Den beste EPO-produserende transfekterte stabile cellelinje av PER.C6, P9, ble brakt i suspensjon og oppskalert til 1-2 liters fermentorer. For å få P9 i suspensjon, ble festede celler vasket med PBS og deretter inkubert med JRH ExCell 525-medium for PER.C6 (JRH), hvoretter cellene løsner fra kolben og danner suspensjonskulturen. Cellene ble holdt ved to konsentrasjoner av MTX: 0 nM og 100 nM. Generelle pro-duksjonsnivåer av EPO som ble oppnådd ved disse konsentrasjoner (i rulleflasker) var henholdsvis 1500 og 5700 enheter per million utsådde celler per dag. Skjønt det lavere utbytte i fravær av MTX kan forklares ved fjerning av det integrerte DNA, later det til å være en produksjons-stanseffekt av det integrerte DNA, siden celler som holdes ved lavere konsentrasjoner av MTX i lengre tidsperioder, er i stand til å nå sitt tidligere utbytte når de overføres til 100 nM MTX-konsentrasjoner igjen (se eksempel 11).

Suspenderte P9-celler ble dyrket vanligvis med 100 nM MTX og anvendt for inokulering i bioreaktorer. To bioreaktor-anordninger ble testet: Perfusjonskultur og repeterende batch-kultur.

A. Perfusjon i en 2 liters bioreaktor

Celler ble utsådd i en konsentrasjon av 0,5 x 10<6> celler per ml, og perfusjonen ble startet på dag 3 etter at cellene nådde en tetthet på tilnærmelsesvis 2,3 x IO<6> celler per ml. Perfusjonshastigheten var 1 volum per 24 timer med en ustyrt avtapning på tilnærmelsesvis 250 ml per 24 timer. I denne innretning forble P9-cellene ved en konstant tetthet på tilnærmelsesvis 5 x IO<6> celler per ml og levedyktighet på nesten 95% i mer enn en måned. EPO-konsentrasjonen ble bestemt regelmessig og er vist på Figur 15. I den 2 liters perfuserte bioreaktor var P9-cellene i stand til å opprett-holde et produksjonsnivå på tilnærmelsesvis 6000 ELISA-enheter per ml. Med en perfusjonshastighet på 1 arbeidsvolum per dag (1,5 til 1,6 liter), betyr dette at i denne 2 liters anordning produserte P9-cellene tilnærmelsesvis 1 x IO<7> enheter per dag per 2 liters bioreaktor i fravær av

MTX.

B. Repeterende batch i en 2 liters bioreaktor

P9-suspensjonccellene som var dyrket i rulleflasker, ble anvendt til å inokulere en 2 liters bioreaktor i fravær av MTX og fikk vokse til en tetthet på tilnærmelsesvis 1,5 million celler per ml hvoretter en tredjedel av popula-sjonen ble fjernet (+ 1 liter per 2-3 dager), og den gjen-værende kultur ble fortynnet med friskt medium for å oppnå på nytt en tetthet av 0,5 million celler per ml. Denne prosedyre ble gjentatt i 3 uker, og arbeidsvolumet ble holdt ved 1,6 liter. EPO-konsentrasjonene i det fjernede medium ble bestemt og er vist i Figur 16. Den gjennomsnittlige konsentrasjon var tilnærmelsesvis 3000 ELISA-enheter per ml. Med en gjennomsnittlig periode på 2 dager hvoretter po-pulasjonen ble fortynnet, betyr dette at i denne 2 liters innretning produserte P9-cellene tilnærmelsesvis 1,5 x IO<6 >enheter per dag i fravær av MTX.

C. Repeterende batch i en 1 liters bioreaktor med forskjellige konsentrasjoner av oppløst oksygen, temperaturer og pH- innstillinger

Nyfremstilte P9-suspensjonsceller ble dyrket i nærvær av 100 nM MTX i rulleflasker og anvendt for inokulering i 4 x 1 liters bioreaktorer til en tetthet av 0,3 million celler per ml i JRH ExCell 525-medium. EPO-utbyttet ble bestemt etter 3, 5 og 7 dager. De første innstillinger som ble testet, var: 0,5%, 10%, 150% og som positiv kontroll 50% opp-løst oksygen (%DO). 50% DO er de betingelser som PER.C6- og P9-celler normalt holdes ved. I et annet produksjonsforløp ble P9-celler inokulert og testet med hensyn til EPO-produksjon ved forskjellige temperaturer (32 C, 34 C, 37 C og 39 C) hvor 37 C er den normale innstilling for PER.C6 og P9, og i den tredje produksjonsperiode ble friske P9-celler inokulert og testet med hensyn til EPO-produksjon ved forskjellige pH-innstillinger (pH 6,5, pH 6,8, pH 7,0 og pH 7,3). PER.C6-cellene holdes normalt ved pH 7,3. Et over-blikk over EPO-utbyttet (tre dager etter såing) er vist på Figur 17. Tydeligvis øker EPO-konsentrasjonen når temperaturen stiger fra 32 til 39 C hvilket også ble iakttatt med PER.C6/E2A-celler dyrket ved 39°C (Tabell 4), og 50% DO er optimal for P9 i området som ble testet her. Ved pH 6,5 kan cellene ikke overleve, siden levedyktigheten i denne bioreaktor sank til under 80% etter 7 dager. EPO-prøver produsert i disse innstillinger undersøkes med hensyn til glykosylering og ladning i 2D-elektroforese (se også eksempel 17) .

Eksempel 10: Amplifikasjon av DHFR- genet

Et antall cellelinjer beskrevet i eksempel 8 ble anvendt i et amplifikasjonseksperiment for å bestemme muligheten for å øke antallet av DHFR-gener ved å øke konsentrasjonen av MTX i en tidsperiode på mer enn to måneder. Konsentrasjonen startet ved terskelkonsentrasjonen (100 nM) og økte til 1800 nM med mellomliggende trinn på 200 nM, 400 nM, 800 nM og 1200 nM. Under denne periode ble EPO ELISA-eksperimenter utført regelmessig for å påvise enhetene per million utsådde celler per dag (Fig. 18). Ved den høyeste MTX-konsentrasjon (1800 nM) ble noen levende celler frosset. Celle-pellets ble oppnådd, og DNA ble ekstrahert og deretter spaltet med Bglll, siden dette enzymet skjærer rundt den ville typen av DHFR-genet i pEPO2000/DHFRwt (Fig. 5), slik at et distinkt DHFR-bånd av den størrelse vil kunne skjel-nes fra de endogene DHFR-bånd i et "Southern blot". Dette DNA ble produsert og blottet, og blottet ble hybridisert med en radioaktiv DHFR-probe og deretter med en adenoviral El-probe som bakgrunnskontroll (Fig. 19). Intensitetene av de hybridiserende bånd ble målt i en "phosphorimager" og korrigert med hensyn til bakgrunnsnivåene. Disse resultater er vist i tabell 3. Tydeligvis er det mulig å oppnå amplifikasjon av DHFR-genet i PER.C6-celler, riktignok i dette tilfelle bare med det endogene DHFR og ikke med den integrerte vektor.

Eksempel 11: Stabiliteten av EPO- ekspresjon i stabile cellelinjer

Et antall cellelinjer nevnt i eksempel 8 ble utsatt for langtidsdyrkning i nærvær og fravær av MTX. EPO-konsentrasjonene ble målt regelmessig hvor 1,0 til 1,5 x IO<6> celler per T25-kolbe ble utsådd og fikk stå 4 dager for å beregne produksjonsnivåene av EPO per million utsådde celler per dag. Resultatene er vist på Figur 20. Fra dette konkluderes at det er en relativt stabil ekspresjon av EPO i P9-celler når cellene dyrkes i nærvær av MTX, og at der er en minsk-ning i EPO-produksjon i fravær av MTX. Imidlertid, når P9-celler ble anbrakt på 100 nM MTX igjen etter å ha vært dyrket i en lengre tidsperiode uten MTX, nådde det uttrykte EPO sitt opprinnelige nivå (±3000 ELISA-enheter per million utsådde celler per dag), hvilket antyder at de integrerte plasmider utkobles, men er stabilt integrert og kan skrus på igjen. Det later til at der er forskjeller mellom cellelinjene P8 og P9,S fordi produksjonsnivået av P8 i nærvær av MTX avtar med tiden under et høyt antall passeringer (Fig. 20A), mens P9-produksjonen er stabil i minst 62 passeringer (Fig. 20B).

Eksempel 12: Transient ekspresjon av rekombinant EPO på festede og suspenderte celler etter plasmidiske DNA-transfeksj oner

pEPO2000/DHFRwt pEPO2000/DHFRm og pAdApt. EPO-plasmider fra eksempel 2 renses fra E. coli over kolonner, og transfekteres under anvendelse av Lipofectamine, elektroporasjon, PEI eller andre metoder. PER.C6- eller PER.C6/E2A-celler telles

og utsåes i DMEM pluss serum eller JRH ExCell 525-medium eller et passende medium for transfeksjon i suspensjon. Transfeksjonen utføres ved 37°C i opp til 16 timer, avhengig av den anvendte transfeksjonsmetode, i henhold til prosedyrer som er kjent av en person med utdannelse i faget. Deretter anbringes cellene ved forskjellige temperaturer, og mediet erstattes med friskt medium med eller uten serum. Hvis det er nødvendig å tilveiebringe medium som fullstendig mangler serumkomponenter, fjernes det friske medium, som mangler serum, igjen etter 3 timer og erstattes igjen med medium som mangler serumkomponenter. For bestemmelse av rekombinant EPO-produksjon tas prøver ved forskjellige tidspunkt. Utbyttet av rekombinant protein bestemmes under anvendelse av et ELISA-utstyr (R&D Systems) hvori 1 enhet tilsvarer tilnærmelsesvis 10 ng av rekombinant CHO-produsert EPO-protein (100,000 enheter/mg). Cellene anvendt i disse eksperimenter vokser ved forskjellige hastigheter på grunn av sin opprinnelse, karakteristika og temperatur. Derfor beregnes mengden av produsert rekombinant EPO vanligvis i ELISA-enheter/10<6> utsådde celler/dag, idet man tar med i beregningen at antisera anvendt i ELISA-utstyret ikke skjelner mellom ikke- og høy-glykosylert rekombinant EPO. Generelt tas prøver for disse beregninger på dag 4 etter erstatning av mediet etter trans feksjonen.

PER.C6/E2A-celler, transfektert ved 37 C under anvendelse av Lipofectamine og deretter dyrket ved 39°C i nærvær av serum produserte normalt 3100 enheter/10<6> celler/dag. I fravær av serumkomponenter uten enhver oppfriskning av medium som manglet serum, produserte disse Lipofectamine-transfekterte celler normalt 2600 enheter/10<6> celler/dag. PER.C6-celler, transfektert ved 37°C under anvendelse av Lipofectamine og deretter dyrket ved 37°C i nærvær av serum produserte normalt 750 enheter/10<6> celler/dag og i fravær av serum 590 enheter/10<6> celler/dag. Som sammenligning ble, de samme ekspresjonsplasmider, pEPO2000/DHFRwt og pEPO2000/DHFRm, også anvendt til å transfektere ovarieceller fra kinesiske hamstere (CHO, ECACC nr,85050302) under anvendelse av Lipofectamine, PEI, kalsiumfosfat-prosedyrer og andre metoder. Når CHO-celler ble transfektert under anvendelse av lipofectamine og deretter dyrket i Hams F12-medium i nærvær av serum, ble et utbytte på 190 enheter/10<6> celler/dag oppnådd. I fravær av serum ble 90 enheter/10<6> celler/dag produsert, skjønt høyere utbytte kan oppnås når transfeksjonene utføres i DMEM.

Forskjellige plater inneholdende festede PER.C6/E2A-celler ble også transfektert ved 37 C med pEPO2000/DHFRwt-plasmid og ble deretter anbrakt ved

32°C, 34°C, 37°C eller 39°C for å bestemme inflytelsen av temperaturen på den rekombinante EPO-produksjon. Et tem-peraturavhengig produksjonsnivå ble iakttatt, varierende fra 250 til 610 enheter/10<6> utsådde celler/dag, beregnet fra en dag 4-prøve, hvilket antyder at forskjellen mellom produksjonsnivåene iakttatt i PER.C6 og PER.C6/E2A delvis skyldes inkubasjonstemperaturene (se også Fig 17). Siden PER.C6/E2A vokser godt ved 37°C, ble videre studier utført ved 37 C.

Forskjellige plater inneholdende festede PER.C6- og PER.C6/E2A-celler ble transfektert med pEPO2000/DHFRwt, pEPO2000/DHFRm og pAdApt.EPO under anvendelse av Lipofectamine. Fire timer etter transfeksjonen ble DMEM erstattet med enten DMEM plus-serum eller JRH-medium som manglet serum, og EPO fikk akkumuleres i supernatanten i flere dager for å bestemme konsentrasjonene som produseres i de forskjellige medier. PER.C6-cellene ble inkubert ved 37°C, mens PER.C6/E2A-cellene ble holdt ved 39°C. Data fra de forskjellige plasmider ble tatt gjen-nomsnitt av, siden de inneholder en lignende ekspre-sjonskassett. Beregnet fra en dag 6-prøve ble følgende data oppnådd: PER.C6 dyrket i DMEM produserte 400 enheter/10<6> utsådde celler/dag, og når de ble holdt i JRH-medium produserte de 300 enheter/10<6> utsådde celler/dag. PER.C6/E2a dyrket i DMEM produserte 1800 enheter/10<6> utsådde celler/dag, og når de ble holdt i JRH produserte de 1100 enheter/10<6> utsådde celler/dag. Igjen ble en klar forskjell iakttatt i produksjonsnivåene mellom PER.C6 og PER.C6/E2A, skjønt dette kunne delvis skyldes tempera-turforskjeller (se ovenfor). Der var imidlertid en signifikant forskjell med PER.C6/E2A-cellene når det gjaldt konsentrasjonen i DMEM i forhold til konsentrasjonen i JRH-medium, skjønt denne virkning gikk nesten fullstendig tapt i PER.C6-cellene.

EPO-ekspresjonsdata oppnådd i dette system er oppsummert i tabell 4. PER.C6 og derivater derav kan anvendes for oppskalering av DNA-transfeksjonssystemet. I henhold til Wurm og Bernard (1999) kan transfeksjoner på suspensjonsceller utføres i 1-10 liter anordninger hvori utbyttet av 1-10 mg/l (0,1-1 pg/celle/dag) av rekombinant protein er blitt oppnådd under anvendelse av elektroporasjon. Det foreligger et behov for et system hvori dette kan lett reguleres, og utbyttet kan bli høyere, spesielt for avskjerming av et stort antall av proteiner og toksiske proteiner som ikke kan fremstilles i en stabil anordning. Med Lipofectamine-transfeksjonene på de beste PER.C6-celler i fravær av serum oppnådde vi 590 enheter/million celler/- dag (+/-5,9 pg/celle/dag når 1 ELISA-enhet er tilnærmelsesvis 10 ng EPO), mens PER.C6/E2A nådde 31 pg/celle/dag (i nærvær av serum). Mediet anvendt for suspensjonskulturer av PER.C6 og PER.C6/E2A (JRH ExCell 525) underbygger ikke ef-fektive transiente DNA-transfeksjoner under anvendelse av komponenter så som PEI. Derfor tilpasses mediet for å mu-liggjøre fremstilling av rekombinant EPO etter transfeksjon av pEP02000/DHFRwt og pEP02000/DHFRm inneholdende et rekombinant humant EPO cDNA, og pcDNA2000/DHFRwt inneholdende andre cDNA'er som koder rekombinante proteiner. 1 til 10 liters suspensjonskulturer av PER.C6 og PER.C6/E2A som vokser i justert medium for å understøtte transiente DNA-transfeksjoner under anvendelse av renset plasmid DNA, anvendes for elektroporasjon eller andre metoder, og ut-fører transfeksjon med de samme ekspresjonsplasmider. Etter flere timer fjernes transfeksjonsmediet og erstattes av friskt medium uten serum. Det rekombinante protein får akkumulere i supernatanten i flere dager hvoretter supernatanten høstes, og alle cellene fjernes. Supernatanten anvendes for nedstrøms bearbeidelse for å rense det rekombinante protein.

Eksempel 13: Generering av AdApt. EPO. rekombinante adenoviruser

pAdApt.EPO ble ko-transfektert med pWE/Ad.Af111-rITR.tetOE4, pWE/Ad.AflII-rITR.AE2A, pWE/Ad.AfIII-rlTR.AE2A.tetO-E4-kosmidene i de egnede cellelinjer under anvendelse av prosedyrer som er kjent for personer med utdannelse i faget. Deretter fikk cellene stå ved passende temperaturer i flere dager inntil full cpe ble iakttatt. Deretter ble cellene anvendt i flere fryse/tine-trinn for å befri alle viruser fra cellene, hvoretter cellerestene ble sentrifugert ned. For IGAd5/AdApt EP0.dE2A. ble supernatanten anvendt for å infisere celler etterfulgt av et agaroseovertrekk for plakkrensing under anvendelse av flere fortynninger. Etter et antall dager, da enkelte plakker var klart synlige i de høyeste fortynninger, ble ni plakker og en negativ kontroll (utplukkede celler mellom klar plakk, slik at de sannsynligvis ikke inneholdt virus) plukket ut og undersøkt med hensyn til EPO-produksjon på A549-celler. Alle plakk-utplukkede viruser var positive, og den negative kontroll produserte ikke rekombinant EPO. En positiv produsent ble anvendt for å infisere de egnede celler og for å propagere virus utgående fra en T-25-kolbe til en rulle-flaskeoppsetning. Supernatantene fra rulleflaskene ble anvendt for å rense viruset, hvoretter antallet av viruspartikler (vp-er) ble bestemt og sammenlignet med antallet av smittsomme enheter (IU-er) under anvendelse av prosedyrer som er kjent for personer med utdannelse i faget. Deretter ble vp/IU-forholdet bestemt.

Eksempel 14: Infeksjon av festede og suspenderte PER. C6-celler med IGAd5/ AdAptEPOdE2A

Rensede viruser fra eksempel 13 ble anvendt for transient ekspresjon av rekombinant EPO i PER.C6-celler og derivater derav. IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A-virus ble anvendt for å infisere PER.C6-celler, mens IG.Ad5/AdApt.EPO.tetOE4 og IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A.tetOE4-viruser kan anvendes for å infisere PER.C6/E2A-celler for å redusere muligheten for rep-likasjon og videre for å forhindre inhibisjon av produksjonen av rekombinante proteiner på grunn av replika-sjonsprosesser. Infeksjonene ble utført på festede celler samt på suspensjonsceller i passende medium under anvendelse av infeksjonsmultiplisitetsområder (moi-områder): 20, 200, 2000, 20000 vp/celle. Infeksjonene ble utført i 4 timer i forskjellige anordninger varierende fra 6-brønners plater til rulleflasker, hvoretter den virusholdige supernatant ble fjernet. Cellene ble vasket med PBS eller direkte oppfrisket med nytt medium. Deretter fikk cellene produsere rekombinant EPO i flere dager hvorved prøver ble tatt, og EPO-utbyttet ble bestemt. Også antallet av levedyktige celler sammenlignes med døde celler ble undersøkt. Mengden av EPO som ble produsert, ble igjen beregnet som ELISA-enheter per utsådde lE6-celler/dag, fordi de forskjellige cellelinjer har forskjellige vekstkarakteristikker på grunn av sitt passasjetall og miljømessige omstendigheter, så som temperatur og valgt trykk. Suspensjonsvoksende PER.C6-celler ble utsådd i 250 ml JRH ExCell 525-medium i rulleflasker (1 million celler per ml) og deretter infisert med renset IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A-virus med en moi-verdi på 200 vp/celle. Beregningen anvendt for vp-bestemmelsen var høy (vp/IU-forholdet i denne batch er 330, som indikerer en moi-verdi på 0,61 IU/celle). Således var ikke alle celler rammet av et smittsomt virus. En typisk fremstilling av rekombinant EPO i denne anordning fra en dag 6-prøve var 190 enheter/10<6> utsådde celler/dag, mens i en innretning hvori 50% av mediet inklusive levedyktige og døde celler ble erstattet av friskt medium, ble tilnærmelsesvis 240 enheter/10<6> celler/dag oppnådd. Oppfriskningen påvirket ikke levedyktigheten for de levedyktige celler, men det fjernede rekombinante protein kunne tilsettes til mengden som ble oppnådd ved slutten av eksperimentet, riktignok nærværende i et større volum. Et identisk eksperiment ble utført med den unntagelse at cellene ble infisert med en moi-verdi på 20 vp/celle, tilsvarende tilnærmelsesvis 0,06 smittsomme enheter/celle. Uten oppfriskning ble et utbytte på 70 ELISA-enheter/10<6> celler/dag oppnådd, mens i eksperimentet hvori 50% av mediet ble oppfrisket på dag 3, ble normalt 80 enheter/10<6> celler/dag målt. Dette indikerer at der er en doseresponseffekt når et økende antall av smittsomme enheter anvendes for infeksjon av PER.C6-celler.

Videre ble PER.C6-celler som vokste i DMEM, utsådd i 6-brønners plater og fikk stå over natten i 2 ml DMEM med serum for å festes. Den påfølgende dag ble cellene infisert med en ny batch av IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A-virus (vp/IU-forhold 560) med en moi-verdi på 200 vp/celler (0,35 smittsomme enheter/celle). Etter 4 timer ble viruset inneholdende medium fjernet og erstattet med friskt medium inklusive serum, og cellene fikk stå for å produsere rekombinant EPO i mer enn to uker under erstatning av mediet med friskt medium hver dag. Utbyttet av rekombinant EPO-produksjon beregnet fra en dag 4-prøve var 60 enheter/10<6> celler/dag. Ekspresjonsdata oppnådd i dette system er oppsummert i tabell 5.

På grunn av det faktum at en tTA-tetO-regulert ekspresjon av Early-region 4 i Adenovirus (E4) svekker replikasjons-evnen hos det rekombinante virus i fravær av aktivt E4, er det også mulig å anvende det eventuelle proteinproduksjons-potensial hos PER.C6/E2A samt dets parentale cellelinje PER.C6 til å produsere rekombinante proteiner, i en anordning hvori et rekombinant adenovirus bærer det humane EPO cDNA som transgen, og hvori E4-genet er under kontroll av et tet-operon. Da produseres meget lave nivåer av E4 mRNA, resulterende i meget lave, men påviselige nivåer av rekombinant og repliserende virus i cellelinjen PER.C6./E2A og ingen påviselige nivåer av dette virus i PER.C6-celler. For produksjon av rekombinant EPO på denne måte anvendes de to viruser IG.Ad5/AdApt.EPO.tetOE4 og IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A. tetOE4 for å infisere PER.C6-celler og derivater derav. Bundne og suspenderte celler infiseres med forskjellige moi-verdier av de rensede adenoviruser i små anordninger (6-brønners plater og T25-kolber) og store anordninger (rulleflasker og fermentorer). Prøver tas ved forskjellige tidspunkt, og EPO-nivåene bestemmes.

Siden viruser som slettes i El og E2A i den virale ryggrad, kan kompletteres i PER.C6/E2A-celler, men ikke i de opprinnelige PER.C6-celler, anvendes innretninger hvori en blanding av begge cellelinjer dyrkes i nærvær av IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A-virus. Viruset vil reprodusere i PER.C6/E2A, etterfulgt av oppløsning av de infiserte celler og en påfølgende infeksjon av PER.C6- eller PER.C6/E2A-celler. I motsetning til dette vil i PER.C6-celler viruset ikke reprodusere, og cellene vil ikke oppløses på grunn av produksjon av viruspartikler, men vil produsere rekombinant EPO som vil utskilles i supernatanten. Et stasjonært kultur-/replikasjons-/EPO-produksjonssystem settes opp, hvori friskt medium og friske PER.C6- og PER.C6/E2A-celler tilsettes i en konstant strøm, mens anvendt medium, døde celler og rester fjernes. Sammen med dette tas rekombinant EPO fra systemet og anvendes for rensing i en nedstrøms pro-sessprosedyre hvori viruspartikler fjernes.

Eksempel 15: Rensing og analyse av rekombinant EPO

Store batcher av voksende celler produseres i bioreaktorer, det utskilte rekombinante humane EPO-protein renses i henhold til prosedyrer som er kjent for en person med opplæring i faget. Det rensede rekombinante humane EPO-protein fra stabile PER.C6 og PER.C6/E2A-kloner eller transfektanter undersøkes med hensyn til glykosylering og folding ved å sammenligne med kommersielt tilgjengelig EPO og EPO foredlet fra menneskelig opprinnelse (urin) under anvendelse av fremgangsmåter kjent for en person med opplæring i faget (se eksempel 16 og 17). Rensede og glykosylerte EPO-proteiner fra PER.C6 og PER.C6/E2A testes med hensyn til biologisk aktivitet i eksperimenter in vivo og i musemilt som beskrevet (Krystal (1983), og i undersøkelser in vitro (se eksempel 18).

Eksempel 16: Aktivitet av beta- galaktosid- alfa- 2, 6-sialyltransferase i PER. C6

Det er kjent at ovarieceller fra kinesiske hamster (CHO-celler) ikke inneholder et gen for beta-galaktosid-alfa-2,6-sialyltransferase, resulterende i fravær av alfa-2,6-bundne sialsyrer ved de terminale ender av N- og O-bundne oligosakkarider av endogent og rekombinant glykoprotein produsert på disse CHO-celler. Siden alfa-2,3-sialyl-transferasegenet er nærværende i CHO-celler, er proteiner som produseres på disse celler, normalt fra den 2,3-bindende type. EPO som ble renset fra menneskeurin, inneholder imidlertid både alfa-2,3- og alfa-2,6-bundne sialsyrer. For å bestemme hvorvidt PER.C6-celler, som er en menneskecelleline, er i stand til å produsere rekombinant EPO inneholdende både alfa-2,3- og alfa-2,6-bindinger, ble en direkte neuraminidase-undersøkelse utført på rekombinant EPO produsert på PER.C6-celler etter transfeksjon med EPO-ekspresjonsvektorer. Som kontroll ble kommersielt tilgjengelige Eprex-prøver anvendt, som var avledet fra CHO-celler, og som bare skulle inneholde sialsyrebindinger av alfa-2,3-typen. Neuraminidasene som ble anvendt, var fra Newcastle Disease Virus (NDV) som spesifikt spalter alfa-2,3-bundne neuraminsyrer (sialsyrer) fra N- og O-bundne glykaner, og fra Vibro cholerae (VC) som ikke-spesifikt spalter alle terminale N- eller O-bundne sialsyrer (alfa-2,3, alfa-2,6 og alfa-2,8-bindinger). Begge neuraminidaser var fra Boehringer og ble inkubert med prøvene i henhold til retningslinjene gitt av produsenten. Resultatene er vist på Fig 21A. I spor 2 og 3 (behandling med NDV-neuraminidase) iakttas en liten forskyvning sammenlignet med spor 1 (ikke-behandlet PER.C6 EPO). Når denne EPO-prøve ble inkubert med VC-avledet neuraminidase, iakttas et enda raskere migrerende bånd sammenlignet med NDV-behandlede prøver. Imidlertid ble det med det kommersielt tilgjengelige Eprex bare iakttatt en forskyvning når NDV-avledet neuraminidase ble anvendt (spor 6 og 7 sammenlignet med ikke-behandlet prøve i spor 5) og ikke når VC-neuraminidase ble anvendt (spor 8).

For videre å vise at faktisk ingen sialsyrer av den alfa-2,6-bindende type er nærværende på CHO-celler, men at de faktisk foreligger i proteiner nærværende på celleover-flaten av PER.C6-celler, ble følgende eksperiment utført: CHO-celler ble frigitt fra den faste bærer under anvendelse av trypsin-EDTA, mens for PER.C6 ble suspensjonsceller anvendt. Begge suspensjoner ble vasket en gang med Mem-5% FBS og inkubert i dette medium i 1 h ved 37°C. Etter vasking med PBS ble cellene suspendert på nytt til tilnærmelsesvis IO<6> celler/ml i bindingsmedium (Tris-bufret saltvann, pH 7,5, 0,5%BSA, og ImM av MgCl2, MnCl2 og CaCl2) . Alikvoter av cellene ble inkubert i 1 h ved romtemperatur med DIG-merkede lektiner, "Sambucus nigra agglutinin (SNA)" og "Maackia amurensis agglutinin (MAA)", som spesifikt bindes til sialsyre-bindinger av alfa-2,6 Gal- henholdsvis alfa-2,3 Gal-typen. Kontrollcellene ble inkubert uten lektiner. Etter 1 time ble både de lektin-behandlede celler og kontrollcellene vasket med PBS og deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med FITC-merket anti-DIG-antistoff (Boehringer-Mannheim). Deretter ble cellene vasket med PBS og analysert med hensyn til fluorescensintensitet i et FAC-sort-apparat (Becton Dickinson). FAGS-analysen er vist på Fig 21B. Når SNA-lektinet inkuberes med CHO-celler, iakttas ingen forskyvning sammenlignet med ikke-behandlede celler, mens når dette lektin inkuberes med PER.C6-celler, iakttas en klar forskyvning (mørke felter) sammenlignet med ikke-behandlede celler (åpne felter). Når begge cellelinjer inkuberes med MAA-lektinet gir begge cellelinjer en klar forskyvning sammenlignet med ikke-behandlede celler.

Fra disse EPO-spaltninger og FACS-resultater konkluderes at det er en beta-galaktosid-alfa-2,6-sialyltransferase-aktivitet nærværende i humane PER.C6-celler, og denne aktivitet er fraværende i CHO-celler fra hamstere.

Eksempel 17: Bestemmelse av sialsyreinnhold i PER. C6-produsert EPO

De terminale neuraminsyrer (eller sialsyrer) som er nærværende på de N- og O-bundne glykaner av EPO, beskytter proteinet fra klarering fra blodstrømmen av enzymer i leve-ren. Videre, siden disse sialsyrer er negativt ladet, kan man skjelne mellom forskjellige EPO-former avhengig av deres ladning eller spesifikke pl. Derfor ble EPO produsert på PER.C6- og CHO-celler anvendt i 2-dimensjonal elektroforese hvori den første dimensjon separerer proteinet på ladning (pH-område 3-10) og den andre dimensjon separerer proteinene ytterligere på molekylvekt. Deretter ble proteinene blottet og påvist i et "western blot" med et anti-EPO-antistoff.

Det er også mulig å påvise det separerte EPO-protein ved å farve gelen under anvendelse av Coomassie-blått eller sølv-farvingsmetoder og deretter fjerne forskjellige flekker fra gelen og bestemme den spesifikke glykansammensetning for de forskjellige N- eller O-bundne glykosyleringer som er nærværende på proteinet, ved hjelp av massespektrometri.

På Fig 22A er et antall EPO-prøver vist, hvilke var avledet fra P9-supernatanter. P9 er PER.C6-cellelinjen som stabilt uttrykker rekombinant humant EPO (se eksempel 8). Disse prøver ble sammenlignet med kommersielt tilgjengelig Eprex, som inneholder bare EPO-former som har tilnærmelsesvis 9 til 14 sialsyrer. Eprex skulle derfor være negativt ladet og fokusere mot pH 3-siden av gelen. Fig 22B viser en sammenligning mellom EPO avledet fra P9 i en tilknyttet innretning hvori cellene ble dyrket på DMEM-medium og EPO avledet fra CHO-celler som var transient transfektert med pEPO2000/DHFRwt-vektoren. Tilsynelatende kan de lavere former av EPO ikke påvises i CHO-prøvene, mens alle former kan ses i P9-prøven. Sialsyreinnholdet er angitt ved numme-rering av båndene som ble separert i den første dimensjon fra 1 til 14. Siden "western blot" ble utført under anvendelse av ECL, og siden det er relativt uklart om antistoffet som ble anvendt for å påvise EPO-molekylene på blottet, og siden det er ukjent om glykosylering kan inhibere gjenkjennelsen av antistoffet eller overgang til nit-rocellulosen, er det ikke mulig å bestemme prosentandelen av hver form som er nærværende i disse blandinger. Imidlertid er det mulig å bestemme nærvær av de separate former av sialsyreholdige EPO-molekyler. Det kan konkluderes med at PER.C6 er i stand til å produsere hele raden av 14 sialsyreholdige isoformer av rekombinant humant EPO.

Eksempel 18: Funksjonalitet in vitro av PER. C6- produsert

EPO

Funksjonen av rekombinant EPO in vivo bestemmes av dets halveringstid i blodstrømmen. Fjerning av EPO finner sted ved hjelp av leverenzymer som bindes til galaktoserester i glykanene som ikke er beskyttet av sialsyrer og ved fjerning via nyrene. Hvorvidt denne filtrering av nyrene skyldes feilfolding eller under- eller feilglykosylering, er ukjent. Videre fjernes også EPO-molekyler som når sitt mål i benmargen og bindes til EPO-reseptoren på progenitor-celler fra sirkulasjonen. Binding til EPO-reseptoren og nedstrøms signalisering avhenger sterkt av en passende gly-kosyleringsstatus for EPO-molekylet. Sialsyrer kan til en viss grad inhibere bindingen av EPO til EPO-reseptoren resulterende i en lavere effektivitet av proteinet. Imidlertid, siden sialsyrene hindrer EPO i å fjernes, er disse sukkere essensielle for dets funksjon å beskytte proteinet på dets reise til EPO-reseptoren. Når sialsyrer fjernes fra EPO in vitro, opptrer en bedre binding til reseptoren, resulterende i en sterkere nedstrøms signalisering. Dette betyr at funksjonalitetene in vivo og in vitro er signifikant forskjellige, skjønt en passende EPO-reseptorbindende egen-skap kan kontrolleres in vitro til tross for muligheten for en undersialylering som forårsaker en kort halveringstid in vivo (Takeuchi et al. 1989) .

Flere undersøkelser in vitro med hensyn til EPO-funksjonalitet er blitt beskrevet, av hvilke stimuleringen av den IL3-, GM-CSF- og EPO-avhengige menneskecellelinje TF-1 er mest vanlig brukt. Herved kan man bestemme antallet av in vi tro- enheter per mg (Kitamura et al. 1989; Hammerling et al. 1996). Andre undersøkelser in vitro er dannelsen av røde kolonier under et agarose-lag av benmargceller som var stimulert til å differensiere ved EPO, innlemmelsen av <59>Fe inn i heme i dyrkede murine benmargceller (Krystal et al. 1981 og 1983; Takeuchi et al. 1989), i benmargceller fra rotter (Goldwasser et al. 1975) og radioimmunoundersøkelsen (RIA), hvori gjenkjennelsen av EPO med hensyn til antisera bestemmes.

EPO produsert på PER.C6/E2A-celler ble anvendt til å stimulere TF-l-celler som følger: Cellene ble utsådd i 96-brønners plater med en tetthet av omtrent 10000 celler per brønn i medium som manglet IL3 eller GM-CSF, hvilke er vekstfaktorene som kan stimulere endeløs vekst av disse celler i kultur. Deretter tilsettes medium resulterende i sluttkonsentrasjoner på 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 og 10 enheter per ml. Disse enheter ble bestemt ved hjelp av ELISA, mens enhetene for den positive kontroll Eprex var kjent (4000 enheter per ml) og ble fortynnet til denne konsentrasjon. Cellene ble inkubert med disse EPO-prøver i 4 dager, hvoretter en MTS-undersøkelse (Promega) ble utført for å teste forekomsten av levedyktige celler ved hjelp av fluo-rescensmåling ved 490 nm (fluorescensen er påviselige etter overføring av MTS i formazan). Figur 23 viser aktiviteten av to prøver avledet fra PER.C6/E2A-celler som var transfektert med en EPO-ekspresjonsvektor og deretter inkubert ved 37°C og 39°C i 4 dager. Resultatene antyder at prøver oppnådd ved 39 C er mer aktive enn prøver oppnådd ved 37°C, hvilket kanskje antyder at sialsyreinnholdet er sub-optimalt ved høyere temperaturer. Det er herved vist at PER.C6-produsert EPO kan stimulate TF-l-celler i en under-søkelse in vitro, hvilket sterkt antyder at EPO som produseres på denne menneskecellelinje kan samhandle med EPO-reseptoren og stimulere differensieringen.

Eksempel 19: Fremstilling av rekombinante murine og humaniserte og humane monoklonale antistoffer i PER. C6 og PER. C6/ E2A

A. Transiente DNA- transfeksjoner

cDNA-stoffer som koder tunge og lette kjeder av murine, humaniserte og humane monoklonale antistoffer (mAbs), klones i to forskjellige systemer: Ett hvori de tunge og lette kjeder integreres inn i et enkelt plasmid (et modifisert pcDNA2000/DHFRwt-plasmid), og det andre er et system hvori tung- og lettkjedede cDNA-stoffer klones separat inn i to forskjellige plasmider (se eksempel 1, 3, 4 og 5). Disse plasmider kan bære denne seleksjonsmarkør (så som DHFR), eller de bærer sin egen seleksjonsmarkør (en som inneholder DHFR-genet og en som inneholder for eksempel neo-resistensmarkøren). For transiente ekspresjonssystemer spiller det ingen rolle hvilke seleksjonsmarkører som er nærværende i vektorens ryggrad, siden ingen påfølgende seleksjon utføres. I de vanlige og regulære transfeksjons-metoder i faget transfekteres like mengder av plasmider. En ulempe ved å integrere både tung- og lettkjedede på et enkelt plasmid er at promoterene, som driver ekspresjonen av begge cDNA-stoffer, kan påvirke hverandre, resulterende i ikke-like ekspresjonsnivåer av begge underenheter, skjønt antallet av cDNA-kopier av hvert gen er nøyaktig det samme.

Plasmider inneholdende cDNA-stoffene av den tunge og lette kjede av et murint og et humanisert monoklonalt antistoff transfekteres, og etter flere dager bestemmes konsentrasjonen av korrekt foldet antistoff under anvendelse av fremgangsmåter kjent for personer med utdannelse i faget. Betingelsene, så som temperaturen og anvendt medium, testes for både PER.C6- og PER.C6/E2A-celler. Funksjonaliteten av de produserte rekombinante antistoff reguleres ved bestemmelse av affiniteten for det spesifiserte antigen.

B. Transiente virale infeksjoner

cDNA-stoffer som koder en tung og en lett kjede, klones i to forskjellige systemer: Et hvori de tunge og lette kjeder integreres i et enkelt adapterplasmid (et modifisert pAdApt.pac), og de andre er et system hvori tung- og lettkjedede cDNA-stoffer klones separat i to forskjellige adap-tere (hvert separat i pAdApt.pac). I det første system propageres viruser som bærer en El-delesjon (dEl) sammen med en E2A-delesjon (dE2A) eller begge delesjoner i sammenheng med en tetOE4-innføyning i den adenovirale ryggrad. I det andre system klones de tunge og lette kjeder separat i pAdApt.pac og propageres separat til viruser med denne adenovirale ryggrad. Disse viruser anvendes til å utføre enkelt-viseinfeksjoner eller ko-infeksjoner på festede og suspensjonsvoksende PER.C6- og PER.C6/E2A-celler. Etter flere dager tas prøver for å bestemme konsentrasjonen av full-lengdede rekombinante antistoffer, hvoretter funksjonaliteten av disse antistoffer bestemmes under anvendelse av det spesifiserte antigen i affinitetsstudier.

C. Stabil produksjon og amplifikasjon av det integrerte plasmid

Ekspresjonsplasmider som bærer den tunge og lette kjede sammen, og plasmider som bærer den tunge og lette kjede separat, anvendes til å transfektere festede PER.C6- og PER.C6/E2A- og CHO-dhfr-celler. Deretter eksponeres cellene for MTX og/eller hygromycin og neomycin for å utvelge integrasjon av de forskjellige plasmider. Videre utføres en dobbelt seleksjon med G418 og hygromycin for å utvelge integrasjon av plasmider som bærer neomycin- og hygromycin-resistensgenet. Ekspresjon av funksjonelle full-lengdede monoklonale antistoffer bestemmes, og best uttrykkende kloner anvendes for påfølgende studier, så som stabiliteten av integrasjonen, kopitall-påvisning, bestemmelse av nivåene av både under-enheter og evne til å amplifisere ved økning av MTX-konsentrasjonen etter at de best-ytende cellelinjer anvendes for mAb-produksjon i større anordninger, så som perfusert og (innmatende) batch-bioreaktorer, hvoretter op-timering av mengde og kvalitet av mAbs utføres.

Eksempel 20: Transfeksjon av mAb- ekspresjonsvektorer for å tilveiebringe stabile cellelinjer

PER.C6-celler ble utsådd i DMEM plus 10% FBS i 47 vevskulturskåler (10 cm diameter) med tilnærmelsesvis 2,5 x 10<6 >celler per skål og ble holdt over natten under sine normale dyrkningsbetingelser (10% CC>2-konsentrasjon og 37 C) . Den påfølgende dag ble ko-transfeksjoner utført i 39 skåler ved 37°C under anvendelse av Lipofectamine i standardiserte protokoller med 1 ug Munl-spaltet og renset pUBS-Heavy2000/Hyg(-) og 1 ug Scal-spaltet og renset pUBS-Light2001/Neo (se eksempel 3) per skål, mens 2 skåler ble ko-transfektert som kontroller med 1 ug Munl-spaltet og renset pcDNA2000/Hyg(-) og 1 ug Scal-spaltet og renset pcDNA2001/Neo. Som kontroll for transfeksjonseffektiviteten ble 4 skåler transfektert med en LacZ-kontrollvektor, mens 2 skåler ikke ble transfektert og tjente som negative kontroller .

Etter 5 timer ble cellene vasket to ganger med DMEM, og det ble tilført på nytt friskt medium uten seleksjon. Den på-følgende dag ble mediet erstattet av friskt medium inneholdende forskjellige seleksjonsreagenser: 33 skåler av tung- og lettkjedens ko-transfektanter, 2 skåler som ble transfektert med de tomme vektorer og de 2 negative kontroller (ingen transfeksjon) ble inkubert bare med 50 g per ml hygromycin, 2 skåler av tung- og lettkjedens ko-transf ektanter og 2 skåler av transfeksjonseffektivitets-skålene (LacZ-vektor) ble inkubert bare med 500 g per ml G418, mens 2 transfeksjonseffektivitetsskåler ikke ble behandlet med seleksjonsmedium, men anvendt for transfek-sjonsef f ektivitet som var omtrent 40%. 2 skåler ble inkubert med en kombinasjon av 50 ug per ml hygromycin og 250 ug per ml G418, og 2 skåler ble inkubert med 25 ug per ml hygromycin og 500 ug per ml G418.

Siden cellene vokste for fort når de bare ble inkubert med hygromycin alene, ble det bestemt at en kombinasjon av hygromycin og G418-seleksjon ville øyeblikkelig drepe cellene som integrerte bare én type av de to vektorer som var transfektert. Derfor ble, 7 dager etter utsåingen, alle ko-transf ektanter videre inkubert med en kombinasjon av 100 ug per ml hygromycin og 500 ug per ml G418. Cellene ble oppfrisket 2 eller 3 dager med medium inneholdende de samme konsentrasjoner av seleksjonsmidler. 14 dager etter utsåingen ble konsentrasjonene innstilt til 250 ug per ml G418 og 50 ug per ml hygromycin. 22 dager etter utsåingen hadde et stort antall kolonier vokst til et omfang hvor det var mulig å velge, plukke ut og dyrke i underkultur. Tilnærmelsesvis 300 seperate kolonier ble valgt og plukket ut fra de 10 cm skåler og deretter dyrket via 96-brønners plater og/eller 24-brønners plater over 6-brønners plater til T25-kolber. I dette stadium fryses cellene (4 små flasker per underkulturkoloni), og produksjonsnivåene av rekombinant UBS-54 mAb bestemmes i supernatanten under anvendelse av ELISA-prosedyren beskrevet i eksempel 26.

CHO-dhfr-cellene utsåes i DMEM plus 10% FBS inkluderende hypoxantin og tymidin i vevskulturskåler (10 cm diameter) med tilnærmelsesvis 1 million celler per skål og holdes over natten under normale betingelser og anvendes for en ko-transfeksjon neste dag med pUBS-Heavy2000/Hyg(-) og pUBS-Light2001/DHFRwt under standard protokoller under anvendelse av Lipofectamine. Mediet erstattes med friskt medium etter noen få timer og fortynnes til forskjellige tettheter for å få cellene til å tilpasse seg til selek-sjonsmediet når stabil integrasjon finner sted uten en mulig overvekst av ikke-transfekterte celler. Koloniene velges først med hensyn til hygromycinresistens, og deretter tilsettes MTX for å utvelge dobbelte integrasjoner av de 2 plasmider i disse cellelinjer dyrket i underkulturer.

Transfeksjoner som beskrevet for pUBS-Heavy2000/Hyg(-) og pUBS-Light2001/Neo utføres med pUBS2-Heavy2000/Hyg(-) og pUBS2-Light2001/Neo i PER.C6 og PER.C6/E2A og seleksjon ut-føres med enten påfølgende inkubasjon med hygromycin etterfulgt av G418 eller som beskrevet ovenfor med en kombinasjon av begge seleksjonsreagenser. CHO-dhfr-cellene transfekteres med pUBS2-Heavy2000/Hyg(-) og pUBS2-Light2001/DHFRwt som beskrevet for pUBS-Heavy2000/Hyg(-) og pUBS-Light2001/DHFRwt, og seleksjon utføres på sekvensiell måte, hvori cellene først selekteres med hygromycin hvoretter en integrasjon av lettkjedevektoren overvåkes ved seleksjon på MTX.

Videre anvendes PER.C6- og PER.C6/E2A-celler også for transfeksjoner med pUBS-3000/Hyg(-) og pUBS2-3000/Hyg(-), mens CHO-dhfr-celler transfekteres med pUBS-3000/DHFRwt og pUBS2-3000/DHFRwt, hvoretter en seleksjon og videre amplifikasjon av de integrerte plasmider utføres ved å øke MTX-konsentrasjonen. Vedrørende pcDNAs3000-plasmidene er et likt antall av mRNA av både tunge og lette kjeder forventet, mens vedrørende to seperate vektorer er det uklart om en riktig likevekt oppnås mellom de to under-enheter av immunoglobulinet. Transfeksjoner er også blitt utført på PER.C6, PER.C6/E2A og CHO-dhfr med ekspresjonsvektorer beskrevet i eksempel 4 og 5 for å tilveiebringe stabile cellelinjer som uttrykker det humaniserte IgGl mAb CAMPATH-1H henholdsvis det humaniserte IgGl mAb 15C5.

Eksempel 21: Underdyrking av transfekterte celler

Fra PER.C6-celler transfektert med pUBS-Heavy2000/Hyg (-) og pUBS-light2001/Neo ble tilnærmelsesvis 300 kolonier som vokste i medium inneholdende Hygromycin og G416, generelt dyrket i påfølgende 96-brønners, 24-brønners og 6-brønners plater i sitt respektive medium plus sine respektive selekterende midler. Celler som var i stand til å vokse i 24 brønners plater, ble undersøkt med hensyn til mAb-produksjon ved å anvende ELISA-prosedyren beskrevet i eksempel 26. Hvis cellene gav positivt utslag, ble minst én vial av hver klon frosset og lagret, og cellene ble deretter testet og dyrket i underkulturer. Seleksjonen av en god produk-sjonsklon er basert på høy ekspresjon, dyrkningsadferd og levedyktighet. For å muliggjøreundersøkelser med hensyn til langtidslevedyktighet, amplifikasjon av de integrerte plasmider og suspensjonsvekst under lengre tidsperioder, fryses de beste produksjonskloner, av hvilke et antall av de beste produsenter av hver cellelinje velges for videre bearbeidelse. Lignende eksperimenter utføres på CHO-dhfr-celler transfektert med forskjellige plasmider og PER.C6- og PER.C6/E2A-celler som ble transfektert med andre kombinasjoner av tunge og lette kjeder og andre kombinasjoner av seleksj onsmarkører.

Eksempel 22: mAb- produksjon i bioreaktorer

Den beste UBS-54-produserende transfekterte cellelinje av PER.C6 bringes i suspensjon ved å vaske cellene i PBS og deretter dyrke cellene i JRH ExCell 525-medium, først i små kulturkolber og deretter i rulleflasker og oppskalert til 1 til 2 liter fermentorer. Cellene holdes på hygromycin og G418-seleksjon til det er bevist at integrasjonen av vektorene er stabil over tidsperioder. Dette gjøres når cellene fremdeles er i sin festede fase, eller når cellene er i suspensj on.

Suspensjonsvoksende mAb-produserende PER.C6-celler dyrkes generelt med hygromycin og G418 og anvendes for inokulering av bioreaktorer fra rulleflasker. Produksjonsutbyttet, funksjonaliteten og kvaliteten på det produserte mAb testes etter vekst av cellene i perfuserte bioreaktorer og i "fed batch"-anordninger.

A. Perfusjon i en 2 liters bioreaktor

Celler utsåes i suspensjonsmedium i fravær av selekterende midler i en konsentrasjon av tilnærmelsesvis 0,5 x IO<6> celler per ml, og perfusjonen startes etter et antall dager når celletettheten når tilnærmelsesvis 2 til 3 x IO<6> celler per ml. Perfusjonshastigheten er generelt 1 volum per 24 timer med en ustyrt avtapning på tilnærmelsesvis 250 ml per 24 timer. I denne innstilling forblir cellene normalt ved en konstant tetthet på tilnærmelsesvis 5 x IO<6> celler per ml og en levedyktighet på nesten 95% i mer enn en måned. mAb-produksjonsnivåene bestemmes regelmessig.

B. " Fed batch" i en 2 liters bioreaktor

I en initiell produksjonsperiode anvendes mAb-produserende PER.C6 suspensjonsceller som er dyrket i rulleflasker, til å inokulere en 2 liters bioreaktor i fravær av selekterende midler til en tetthet av 0,3 til 0,5 million celler per ml i et arbeidsvolum på 300 til 500 ml og får vokse til levedyktigheten av cellekulturen synker til 10%. Som standard for en kulturs levetid bestemmes det på hvilken dag etter inokuleringen de levedyktige cellers tetthet synker under 0,5 million celler per ml. Cellene vokser normalt til en tetthet av 2 til 3 million celler per ml, hvoretter mediets komponenter blir begrensende, og levedyktigheten synker. Videre bestemmes det hvor meget av de essensielle komponenter, så som glukose og aminosyrer i mediet, forbrukes av cellene. Deretter bestemmes det hvilke aminosyrer som produseres, og hvilke andre produkter akkumuleres i kulturen. Avhengig av dette produseres konsentrerte innmatingsprøver som tilsettes ved regelmessige tidspunkt for å øke kultu-rens levetid og derved øke konsentrasjonen av mAb i supernatanten. I en annen anordning utvikles 10x konsentrerte mediumprøver som tilsettes til cellene ved forskjellige tidspunkt, og som også øker cellenes levedyktighet i en lengre tidsperiode, resulterende til slutt i en høyere konsentrasjon av mab i supernatanten.

Eksempel 23: Transient ekspresjon av humaniserte rekombinante monoklonale antistoffer

De korrekte kombinasjoner av de UBS-54 tung- og lettkjedede gener inneholdende vektorer ble anvendt i transiente trans-feksjonseksperimenter i PER.C6-celler. Til dette er det ikke viktig hvilken seleksjonsmarkør som innføres i plas-midets ryggrad, fordi ekspresjonen varer en kort periode (2-3 dager). Transfeksjonsmetoden er generelt Lipofectamine, skjønt andre kationiske lipidforbindelser for effektiv transfeksjon kan anvendes. Transiente metoder ekstra-poleres fra T25-kolbers anordninger til minst 10 liters bioreaktorer. Tilnærmelsesvis 3,5 million PER.C6- og PER.C6/E2A-celler ble utsådd på dag 1 i en T25-kolbe. På dag 2 ble cellene transfektert med høyst 8 ug plasmid-DNA under anvendelse av Lipofectamine og oppfrisket etter 2-4 timer, og de fikk stå i 2 dager. Deretter ble supernatanten høstet, og antistoff-titeren ble målt i en kvantitiv ELISA med hensyn til humane IgGl-immunoglobuliner (CLB, se også eksempel 26). Nivåene av totalt humant antistoff i dette system er tilnærmelsesvis 4,8 ug/million utsådde celler for PER.C6 og 11,1 ug/million utsådde celler for PER.C6/E2A. For å bestemme hvor meget av det produserte antistoff er av full størrelse og oppbygd fra to tunge og to lette kjeder, samt ekspresjonsnivåene av den tunge og/eller lette kjede alene og forbundet ved disulfidbroer, utvikles kontroll-ELISA-metoder som gjenkjenner underenhetene separat. Forskjellige oppfangende og farvende antistoffkombinasjoner anvendes, som alle påviser humane (humaniserte) IgGl-under-enheter. Supernatanter av PER.C6-transfektanter (transfektert med kontrollvektorer eller pUBS-Heavy2000/Hyg(-) og pUBS-Light2001/DHFRwt) ble undersøkt med hensyn til full-lengdet mAb-produksjon (Fig 24). Prøvene ble behandlet med og uten DTT, hvorved man kan skjelne mellom full-lengdet mAb (ikke-redusert) og tunge og lette kjeder separat (redusert) . Som forventet, avsondres den tunge kjede bare når den lette kjede er ko-uttrykt og mesteparten av antistoffet er av full lengde.

Eksempel 24: Oppskalert system for transiente transfeksjoner

PER.C6 og derivater derav anvendes for oppskalering av DNA-transfeksjonssystemet. I henhold til Wurm og Bernard

(1999) kan transfeksjoner på suspensjonsceller utføres i 1-10 liters anordninger hvori et utbytte på 1-10 mg/l (0,1-1 pg/celle/dag) av rekombinant protein er blitt oppnådd under anvendelse av elektroporasjon.

Det foreligger et behov for et system hvor dette kan lett reguleres, og utbyttet ville kunne bli høyere, spesielt for avskjerming av et stort antall av proteiner og toksiske proteiner som ikke kan fremstilles i en stabil anordning. Videre, siden cellelinjer så som CHO er sterkt påvirket av apoptose-induserende midler så som lipofectamine, er det kjent i faget at det foreligger et behov for celler som er resistente til dette. Siden PER.C6 knapt påvirkes av trans-feksjonsmetoder, later det til at PER.C6 og derivater derav er nyttige for disse formål. 1 til 50 liters suspensjonskulturer av PER.C6 og PER.C6/E2A som vokser i justert medium for å støtte transiente DNA-transfeksjoner under anvendelse av renset plasmid DNA, anvendes for elektroporasjon eller andre metoder og utfører transfeksjon med de samme ekspresjonsplasmider. Etter flere timer fjernes transfeksjonsmediet og erstattes med friskt medium uten serum. Det rekombinante protein får akkumulere i supernatanten i flere dager hvoretter supernatanten høstes, og alle cellene fjernes. Supernatanten anvendes for nedstrøms bearbeidelse for å rense det rekombinante protein.

Eksempel 25: Oppskalert system for virale infeksjoner

Tung- og lettkjedede cDNA-stoffer av antistoffene beskrevet i eksempel 3, 4 og 5 klones i rekombinante adenovirale adapterplasmider separat og i kombinasjon. Kombinasjonene lages for å sikre et likt ekspresjonsnivå for både tunge og lette kjeder av antistoffet som skal dannes. Når tunge og lette kjeder klones separat, produseres viruser og propageres separat, og infeksjonsevnen og konsentrasjonen av vi-ruspartiklene bestemmes og ko-infiseres til slutt inn i PER.C6 og derivater derav for å produsere rekombinant mAbs i supernatanten. Fremstillingen av adaptervektorer og rekombinante adenoviruser og fremstilling av mAbs er som beskrevet for rekombinant EPO (se eksemplene 13 og 14).

Eksempel 26: Utvikling av en ELISA- prosedyre for bestemmelse av humane mAbs

Greiners microlon-plater # 655061 ble belagt med et anti-humant IgGi-kappa-monoklonalt antistoff (Pharmingen #M032196 0.5) med 100 ul per brønn i en konsentrasjon av 4 ug per ml i PBS. Inkubasjon ble utført over natten ved 4°C eller i 90 minutter ved 37°C. Deretter ble brønnene vasket tre ganger med 0,05% Tween/PBS (400 ul per brønn) og deretter blokkert med 100 ul 5% melk oppløst i 0,05% Tween/PBS per brønn i 30 minutter ved 37°C, og deretter ble platen vasket tre ganger med 400 ul 0,05% Tween/PBS per brønn. Som standard ble et renset humant IgGi-antistoff anvendt (Sig-ma, #108H9265) fortynnet i 0,5% melk/0,05% Tween/PBS i fortynninger varierende fra 50 til 400 ng per ml. Per brønn ble 100 ul standard inkubert i 1 h ved 37°C. Deretter ble platen vasket tre ganger med 400 ul per brønn 0,05% Tween/PBS. Som det andre antistoff ble et biotin-merket murint monoklonalt anti-humant IgGi-antistoff anvendt (Pharmingen #M045741) i en konsentrasjon av 2 ng per ml. Per brønn ble 100 ul av dette antistoff tilsatt og inkubert i 1 h ved 37°C, og brønnene ble vasket tre ganger med 400 ul 0,05% Tween/PBS.

Deretter ble konjugat tilsatt: 100 ul per brønn av en 1:1000 fortynning av Streptavidin-HRP-løsning (Pharmingen 4M045975) og inkubert i 1 h ved 37 C, og platen ble igjen vasket tre ganger med 400 ul per brønn med 0,05% Tween/PBS.

En ABTS-tablett (Boehringer Mannheim #600191-01) ble oppløst i 50 ml ABTS-buffer (Boehringer Mannheim #60328501) , og 100 ul av denne løsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1 h ved RT eller 37 C. Til slutt ble OD-verdien målt ved 405 nm. Supernatantprøver fra celler transfektert med mAb som koder vektorer, ble generelt oppløst og fortynnet i 0,5% melk/ 0,05% Tween/ PBS. Hvis prøvene ikke passet med det lineære området

av standardkurven, ble andre fortynninger anvendt.

Eksempel 27: Fremstilling av influensa- HA- og NA- proteiner i en menneskecelle for rekombinante underenhets- vaksiner

cDNA-sekvenser av gener som koder haemagluttinin(HA)-og neuraminidase(NA)-proteiner av kjente og regelmessig opptredende nye influensavirus-stammer bestemmes og genereres ved hjelp av PCR med primere for bekvem kloning inn i pcDNA2000-, pcDNA2001-, pcDNA2002- og pcDNAs3000-vektorer (se eksempel 1). Deretter transfekteres disse

resulterende ekspresjonsvektorer inn i PER.C6 og derivater derav for stabil og transient ekspresjon av de rekombinante proteiner for å resultere i produksjon av rekombinante HA- og NA-proteiner som derfor produseres på helt standardisert måte med menneskeceller under strenge og veldefinerte betingelser. Cellene får akkumulere disse rekombinante HA- og NA- rekombinante proteiner i en standardisert tidsperiode. Når pcDNAs3000-vektoren anvendes, er det mulig å klone begge cDNA-

stoffer simultant og få cellene til å produsere begge proteiner samtidig. Fra seperate eller kombinerte kulturer renses proteinene etter standard teknikker, og endelige HA-og NA-titere bestemmes av personer med utdannelse i faget, og aktivitetene av proteinene undersøkes. Deretter anvendes de rensede rekombinante proteiner for vaksinasjonsstudier og anvendes til slutt for vaksinasjonsformål i stor skala.

HAl-fragmentet av svineinfluensaviruset A/swine/Oedenrode/- 7C/96 (Genbank aksesjonsnummer AF092053) ble oppnådd ved

PCR under anvendelse av en fremadrettet primer med følgende sekvens: 5' ATT GGC GCG CCA CCA TGA AGA CTA TCA TTG CTT TGA GCT AC 3', og med en bakoverrettet primer med følgende sekvens : 5' GAT GCT AGC TCA TCT AGT TTG TTT TTC TGG TAT ATT

CCG 3'. Det resulterende 1,0 kb inneholdende PCR-produkt ble spaltet med Ascl- og Nhel-restriksjonsenzymer og ligert med en Ascl- og Nhel-spaltet og renset pcDNA2001/DHFRwt-vektor, resulterende i pcDNA2001/DHFRwt-swHAl. Videre ble HA2-fragmentet av denne virus amplifisert ved hjelp av PCR under anvendelse av denne fremover-primer som beskrevet for HAI og en annen reversprimer med følgende sekvens: 5' GAT

GCT AGC TCA GTC TTT GTA TCC TGA CTT CAG TTC AAC ACC 3'. Det

resulterende 1,6 kb HA2 PCR-produkt ble klonet på identisk måte som beskrevet for HAI, resulterende i

pcDNA2001/DHFRwt-swHA2.

Eksempel 28: Integrasjon av cDNA- stoffer som koder post-transisjonelle modifiserende enzymer

Siden produksjonsnivåene av rekombinante proteiner i stabilt og transient transfektert og infisert PER.C6 og PER.C6/E2A er ekstremt høye, og siden et høyere ekspresjonsnivå vanligvis oppnås etter DHFR-avhengig amplifikasjon på grunn av økning av MTX-konsentrasjonen, vil en "ut-titrering" av de endogene nivåer av enzymer som er involvert i post-translasjonale modifikasjoner kunne opptre. Derfor overuttrykkes cDNA-stoffer som koder humane enzymer involvert i forskjellige sorter av post-translasjonale modifikasjoner og prosesser, så som glykosylering, fosforylering, karboksylering, folding og "trafikkering", i PER.C6 og PER.C6/E2A for å muliggjøre et mer funksjonelt rekombinant produkt som skal fremstilles i ekstreme nivåer i små og store anordninger. Det ble vist at det kan konst-rueres CHO-celler hvori en alfa-2,6-sialyltransferase var innført for å forsterke ekspresjonen og bioaktiviteten av tPA og humant erytropoietin (Zhang et al. 1998, Minch et al. 1995, Jenkins et al 1998). Andre gener så som beta 1,4-galaktosyltransferase ble også innført i insekt- og CHO-celler for å forbedre de N-bundne oligosakkaridforgrenings-strukturer og for å forsterke konsentrasjonen av sialsyrer ved de terminale rester (Weikert et al. 1999; Hollister et al 1998). PER.C6-celler modifiseres ved integrasjon av cDNA-stoffer som koder alfa-2,3-sialyltransferase-, alfa-2,6-sialyltransferase- og beta-1,4-galaktosyltransferase-proteiner for ytterligere å høyne sialsyreinnholdet i rekombinant protein produsert på denne menneskecellelinje.

Eksempel 29: Inhibisjon av apoptose ved overekspresjon av adenovirus E13 i CHO- dhfr- celler

Det er kjent at ovarieceller fra kinesiske hamstere, som overuttrykker rekombinante eksogene proteiner, er meget følsomme for apoptotiske signaler, resulterende i en generelt høyere mortalitet blant disse stabile produserende cellelinjer sammenlignet med den ville typen eller de opprinnelige celler hvorfra disse celler ble avledet. Videre dør CHO-celler av apoptotiske virkninger når midler så som Lipofectamine anvendes i transfeksjonsstudier. Således har CHO-celler en stor ulempe i produksjon av rekombinante proteiner i den forstand at cellene meget lett drepes av apoptose av forskjellige grunner. Siden det er kjent at E1B-genet av adenovirus har anti-apoptotiske virkninger (White et al. 1992, Yew og Berk 1992), transfekteres stabile CHO-dhfr-celler som uttrykker både tunge og lette kjeder av de beskrevne antistoffer (se eksempel 3, 4 og 5) med adenovirus E1B cDNA-stoffer for å fremkalle en stabil eller transient ekspresjon av ElB-roteinene for til slutt å sikre en lavere apoptotisk virkning i disse celler, og derved øke produksjonsraten av de rekombinante proteiner. Transient transfekterte celler og stabilt transfekterte celler sammenlignes med villtypen av CHO-dhfr-celler i FACS-analyser med hensyn til celledød på grunn av transfeksjonsmetoden eller på grunn av det faktum at de overuttrykker de rekombinante proteiner.

Stabile CHO-cellelinjer genereres hvori adenovirus E1B-proteinene er overuttrykket. Deretter sammenlignes den apoptotiske respons på grunn av virkninger av for eksempel Lipofectamine i disse stabile E12-produserende CHO-celler med den apoptotiske respons av de parentale celler som ikke mottok ElB-genet. Disse eksperimenter utføres under anvendelse av FACS-analyser og kommersielt tilgjengelig utstyr som kan bestemme graden av apoptose.

Eksempel 30: Inhibisjon av apoptose ved overekspresjon av adenovirus E1B i menneskeceller

PER.C6-celler og derivater derav uttrykker faktisk EIA- og El2-genene av adenovirus. Andre menneskeceller, så som A549-celler, anvendes til stabilt å overuttrykke adenovirus E1B for å bestemme de anti-apoptotiske virkninger av nærvær av adenovirus ElB-genet, som beskrevet for CHO-celler (se eksempel 29). De fleste celler reagerer faktisk på trans-feksjonsmidler så som Lipofectamine eller andre kationiske lipider resulterende i massiv apoptose, og resulterer til slutt i lave konsentrasjoner av de rekombinante proteiner som utskilles, helt enkelt på grunn av det faktum at bare få celler overlever behandlingen. Stabile ElB-overuttryk-kende celler sammenlignes med de parentale cellelinjer i sin reaksjon til overekspresjon av toksiske proteiner eller apoptose-induserende proteiner og deres respons til trans-feksjonsmidler, så som Lipofectamine.

Eksempel 31: Generering av PER. C6- avledede cellelinjer som mangler et funksjonelt DHFR- protein

PER.C6-celler anvendes til slå ut ("knock out") DHFR-genet under anvendelse av forskjellige systemer for å tilveiebringe cellelinjer som kan anvendes for amplifikasjon av det eksogene integrerte DHFR-gen som er kodet på vektorene som er beskrevet i eksemplene 1 til 5 eller andre DHFR-uttrykkende vektorer. PER.C6-celler avskjermes med hensyn til nærvær av de forskjellige kromosomer og velges med hensyn til et lavt kopitall av kromosomet som bærer det humane DHFR-gen. Deretter anvendes disse celler i "knock-out"-eksperimenter hvori den åpne leseramme av DHFR-genet sprenges og erstattes av en seleksjonsmarkør. For å tilveiebringe en dobbelt "knock-out"-cellelinje, fjernes begge alleler via homolog rekombinasjon under anvendelse av to forskjellige seleksjonsmarkører eller ved andre systemer, som for eksempel beskrevet for CHO-celler (Urlaub et al. 1983) .

Andre systemer anvendes også hvori funksjonaliteten av DHFR-proteinet senkes eller fullstendig fjernes, for eksempel ved anvendelse av anti-sense-RNA eller via RNA/DNA-hybrider, hvori genet ikke fjernes eller slås ut, men ned-strøms-produktene av genet er ute av balanse i sin funksjon .

Eksempel 32: Langtidsfremstilling av rekombinante proteiner under anvendelse av protease. og neuraminidase- inhibitorer

Stabile kloner beskrevet i eksempel 8 anvendes for lang-tidsekspresjon i nærvær og fravær av MTX, serum og protea-seinhibitorer. Når stabile eller transfekterte celler får stå et antall dager for å akkumulere rekombinant human EPO-protein, iakttas en utflatende kurve istedenfor en rett stigning, hvilket indikerer at det akkumulerte EPO degrade-res med tiden. Dette vil kunne være en inaktiv prosess på grunn av eksterne faktorer så som lys eller temperatur. Det vil også kunne være at spesifikke proteaser som produseres av de levedyktige celler eller som frigis ved oppløsning av døde celler, spalter det rekombinante EPO-protein. Derfor tilsettes en økende konsentrasjon av CuS04 til kulturmediet etter transfeksjonen og på de stabile produserende celler for å få en mer stabil produksjonskurve: Cellene dyrkes i flere dager, og mengden av EPO bestemmes ved forskjellige tidspunkt. CuS04 er en kjent inhibitor av proteaseaktivitet og kan lett fjernes under nedstrøms bearbeidelse og EPO-rensing. Den mest optimale konsentrasjon av CUSO4 anvendes til å produsere rekombinant humant EPO-protein etter transient ekspresjon etter DNA-transfeksjon og virusinfeksjoner. Videre anvendes den optimale konsentrasjon av CUSO4 også i fremstillingen av EPO på de stabile kloner. Vedrørende EPO hvori nærvær av terminale sialsyrer er viktig for å sikre en lang sirkulasjonshalveringstid av det rekombinante protein, er det nødvendig å produsere høyt sialylert EPO. Siden levende celler produserer neuraminidaser som kan utskilles etter aktivering av stressfaktorer, er det sannsynlig at produsert EPO taper sine sialsyrer på grunn av disse stressfaktorer og produserte neuraminidaser. For å forhindre avklipping av sialsyrer tilsettes neuraminidaseinhibitorer til mediet for å bevirke en forlenget binding av sialsyrer til EPO som produseres .

Eksempel 33: Stabil ekspresjon av rekombinante proteiner i menneskeceller under anvendelse av det amplifiserbare glutamin- syntetase- system

PER.C6 og derivater derav anvendes for stabilt å uttrykke rekombinante proteiner under anvendelse av glutamin-syntetase(GS)-systemet. Først testes cellene med hensyn til deres evne til å vokse i glutamin-fritt medium. Hvis cellene ikke kan vokse i glutamin-fritt medium, betyr dette at disse celler ikke uttrykker nok GS, og til slutt resulterer det i cellenes død. GS-genet kan integreres inn i ekspresjonsvektorer som en seleksjonsmarkør (som beskrevet for DHFR-genet) og kan amplifiseres ved å øke metionin-sulfoksimin(MSX)-konsentrasjonen resulterende i overekspresjon av det rekombinante protein av interesse, siden hele den stabilt integrerte vektor vil ko-amplifiseres, som vist for DHFR. GS-genekspresjonssystemet ble gjennomførlig etter en rapport av Sanders et al. (1984), og en sammenligning ble gjort mellom DHFR-seleksjonssystem og GS av Cockett et al. (1990). Fremstilling av rekombinant mAbs under anvendelse av GS ble først beskrevet av Bebbington et al.

(1992) .

GS-genet klones i vektorryggradene beskrevet i eksempel 1 eller cDNA-stoffer som koder rekombinante proteiner og tunge og lette kjeder av mAbs klones i de tilgjengelige vektorer som bærer GS-genet. Deretter transfekteres disse vektorer inn i PER.C6 og selekteres under MSX-konsentrasjoner som vil muliggjøre vekst av celler med stabil integrasjon av vektorene.

Eksempel 34: Fremstilling av rekombinant HIV gpl20- protein i en menneskecelle

cDNA som koder det høyt glykosylerte konvolutt-protein gpl20 fra humant immunodefisiensvirus (HIV) bestemmes og oppnåes ved PCR under anvendelse av primere som bærer en perfekt Kozak-sekvens i oppstrømsprimeren for passende translasjonsinitiering og bekvemme restriksjonsrekog-nisjonssekvenser for kloning i ekspresjonsvektorene beskrevet i eksempel 1. Deretter sekvenseres dette PCR-produkt på begge strenger for å sikre at ingen PCR-feil innføres.

Ekspresjonsvektoren transfekteres inn i PER.C6, derivater derav og CHO-dhfr-celler for å tilveiebringe stabilt produserende cellelinjer. Forskjellene i glykosylering mellom CHO-produsert og PER.C6-produsert gpl20 bestemmes i 2D-elektroforese-eksperimenter og deretter i massespektro-metriske eksperimenter, siden gpl20 er et strengt glykosylert protein med hovedsakelig O-bundne oligosakkarider. Det rekombinante protein renses av personer med utdannelse i faget og anvendes deretter for funksjonalitet og andre un-dersøkelser. Renset protein anvendes for vaksinasjonsformål for å forhindre HIV/infeksjoner.

Forklaringer til figurene

1 pcDNA2000/DHFRwt

2 pcDNA2001/DHFRwt

3 pcDNA2002/DHFRwt

4 pcDNAs3000/DHFRwt

5 pEPO2000/DHFRwt

6 pAdApt.EPO

7 pHC2000/Hyg(-)

8 pLC2001/DHFRwt

9 pUBS-Heavy2000/Hyg(-)

10 pUBS-Light2001/DHFRwt

11 pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)

12 pUBS2-Light2001/DHFRwt

13 pUBS-3000/DHFRwt

14 pUBS2-3000/DHFRwt

15 EPO-konsentrasjonen i en 2 liters perfusjonsbioreaktor gitt i ELISA-enheter per ml. 16 EPO-konsentrasjonen i en 2 liters repeterende batch-bioreaktor i hvilken celletetthetene ble bragd tilbake til 0,5xl0<6> celler per ml hver 2. eller 3. dag. 17. EPO-konsentrasjonen fra stabilt produserende P9-celler, tre dager etter inokulering med 0,3xl0<6> celler per ml i en 4x1 liters repeterende batch-bioreaktor-anordning med forskjellige betingelser: Til venstre. Forskjellige innstillinger for oppløst oksygen. Midten. Forskjellige temperaturer. Til høyre. Forskjellige konstante pH-verdier. Standardinnstillingene for P9-cellene er 50% DO, 37°C og pH 7,3. I hver produksjonsperiode ble en separat kontroll-produksjonsperiode med disse innstillinger utført, avbildet som den fjerde stolpe i hvert sett. 18. EPO-produksjonen ved økning i MTX-konsentrasjonen i de PER.C6-avledede cellelinjer P8 og P9, beregnet som ELISA-enheter per million utsådde celler per dag. 19. Amplifikasjonen av DHFR-genet ved økning i MTX-konsentrasjonen. "Southern blot" av Bglll-spaltet DNA avledet fra normale PER.C6-celler (ikke dyrket i nærvær av MTX) og fra P8- og P9-celler (dyrket i nærvær av 100 nM, 800 nM og 1800 nM MTX). Blottet ble først hybridisert med en radioaktiv DHFR-probe, deretter strippet og siden inkubert med en radioaktiv adenovirus El-probe som en indre kontroll. 20. Stabiliteten av rekombinant EPO-ekspresjon av to cellelinjer: P8(A) og P9(B). Cellene ble dyrket i nærvær eller fravær av MTX i tilnærmelsesvis 60 passeringer i en tidsperiode på mer enn 4 måneder, og EPO-produksjonen ble beregnet som ELISA-enheter per million utsådde celler per dag. 21. Aktiviteten av beta-galaktosid-alfa2,6-sialyl-tranferase i PER.C6 sammenlignet med CHO-celler. A. "Western blot" av EPO fra supernatanten av PER.C6-celler som var transfektert med et EPO-ekspresjonsplasmid (til venstre) og Eprex (til høyre). PER.C6-EPO ble produsert uten behandling (felt 1), etter behandling med NDV-avledet neuraminidase i to separate buffere (sporene 2 og 3) og etter behandling med VC-avledet neuraminidase (spor 4). Eprex ble også kjørt uten behandling (spor 5) og etter lignende be-handlinger med neuraminidaser (sporene 5 til 8). B. Forskyvning i FACS-analysen av PER.C6 (De høyre paneler) og CHO-celler (venstre paneler) etter behandling med et anti-DIG-antistoff som gjenkjenner DIG-bundne lektiner som var inkubert med cellene (resulterende i de mørke felter), som enten spesifikt gjenkjenner alfa2,6-bindinger mellom sialsyrer og galaktoser (Sambucus nigra agglutinin, øvre paneler) og alfa2,3 sialsyrer-galaktose-bindinger (Maackia amurensis agglutinin, lavere paneler) sammenlignet med en FAGS-analyse med ikke-lektin behandlede celler (åpne felter) . 22. 2D/western-analyse av rekombinant EPO produsert i forskjellige kulturanordninger A. P9-celler, stabilt uttrykkende rekombinant humant EPO ble dyrket i T175-kolber i DMEM og i rulleflasker og bioreaktorer i JRH ExCell 525-medium, og separert på 2D-elektroforese, blottet og inkubert med H162, et anti-EPO-antiserum. Prøver inneholdende hele raden av sialsyreholdig EPO (fra P9-supernatanter) ble sammenlignet med kommersielt tilgjengelig Eprex som inneholder bare de høyere sialsyreholdige EPO-former (venstre). B. EPO avledet fra bundne P9-celler dyrket i DMEM-medium i en tilknyttet anordning sammenlignet med EPO avledet fra transient transfekterte CHO-celler som også ble dyrket i DMEM. FBS var nærværende under dyrkingen, men ble fjernet før EPO-akkumuleringen ble initiert. De foreslåtte sialsyreinnhold i disse prøver (1-14) er antydet mellom de to blots. 23. Funksjonalitetsundersøkelse in vitro av PER.C6/E2A-EPO produsert ved 37°C under anvendelse av humane TF-l-celler sammenlignet med kommersielt tilgjengelig Eprex som produseres på CHO-celler. 24. "Western blot" under anvendelse av et anti-humant IgGl-tungkjedet antistoff på supernatanter fra PER.C6-celler som var ko-transfektert med pUBS-Heavy2000/Hyg(-) og pUBS-Light2001/DHFRwt (spor 6) eller med vektorene separat (sporene 4 og 5). Som positiv kontroll ble fortynnet humant serum innmatet (IgG, spor 1) og som negative kontroller ble en ekspresjonsvektor som koder LacZ, transfektert (kontroll, spor 3) og en markør (M, størrelsene ikke avbildet) innmatet (spor 2). Det øvre panel er fra en gel som ble innmatet med prøver fra transfektantene som ikke var behandlet med DTT, hvori de tung- og lettkjedede disulfidbroer forblir intakt, og en full mAb på tilnærmelsesvis 220 kD påvises. Det lavere panel viser prøver fra de samme transfektanter behandlet med DTT hvori disulfidbroene fjernes resulterende i en fullstendig separasjon av den tunge og lette kjede. Blottet ble inkubert med et antistoff som gjenkjenner humane IgGi-tungkjeder. Den lette kjede er far-vet på grunn av bakgrunnsgjenkjennelse av det andre (po-lyklonale) antistoff anvendt for ECL-western- prosedyren.

REFERANSER

Baldwin RW, Byers VS (1986) Monoclonal antibodies in cancer treatment. Lancet 1, 603-605.

Barbas CF, Kang AS, Lerner RA and Benkovic SJ (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: The gene III site. Proe Nati Acad Sei USA. 88, 7978

Bebbington CR, Renner G, Thomson S, Abrams D, Yarranton GT (1992) High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Bio/technology 10, 169-175. Borrebaeck CAK, Malmborg A-C and Ohlin M (1993) Does endogenous glycosylation prevent the use of mouse monoclonal antibodies as cancer therapeutics? Immunology Today 14, 477-479.

Borrebaeck CAK (1999) Human monoclonal antibodies: The emperor's new clothes? Nature Biotech. 17, 621.

Boshart W, Weber F, Jahn G, Dorsch-Hasler K, Fleckenstein B, Schaffner W (1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41, 521-530.

Bruggeman M, Spicer C, Buluwela L, Rosewell I, Barton S, Surani MA, Rabbits TH (1991) Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus. Eur J Immunol. 21, 1323-1326.

Bulens F., Vandamme A-M., Bernar H., Nelles L., Lijnen RH. and Coilen D (1991) Construction and characterization of a functional chimeric murine-human antibody directed against human fibrin fragment-D dimer. Eur J Biochem. 195, 235-242.

Burton DR and Barbas III CF (1994) Human antibodies from combinatorial libraries. Adv Immunol. 57, 191-280.

Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, Row-land AM, Kotts C, Carver ME and Shephard HM (1992) Humanization of an anti-pl85HER2 antibody for human cancer therapy. Proe Nati Acad Sei USA 89, 4285-4289.

Clarkson T, Hoogenboom HR, Griffiths A and Winter G (1991) Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 353, 624.

Cockett MI, Bebbington CR, Yarranton CT (1990) High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in chines hamster ovary cells using glutamine synthetase gene amplification. Bio/technology 8, 662-667.

Crowe JS., Hall VS., Smith-MA., Cooper HJ. and Tite JP (1992) Humanized monoclonal antibody CAMPATH-1H: myeloma cell expression of genomic constructs, nucleotide sequence of cDNA constructs and comparison of effector mechanisms of myelcma and Chinese hamster ovary cell-derived material. Clin Exp Immunol 87, 105-110.

Debbas M, White E (1993) Wild-type p53 mediates apoptosis by EIA, which is inhibited by E1B. Genes Dev. 7, 546-554.

Delorme E, Lorenzini T, Giffin J, Martin F, Jacobsen F, Boone T, Elliot S (1992) Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin. Biochemistry 31, 9871-9876.

Farrow SN, White JH, Martinou I, Raven T, Pun KT, Grinham CJ, Martinou JC, Brown R (1995) Cloning of a bcl-2 homologue by interaction with adenovirus E13 19K. Nature 374, 731-733. Fishwild DM, 0'Donnell SL, Bengoechea T, Hudson DV, Harding F, Bernhard SL, Jones D, Kay RM, Higgins KM, Schramm SR, Lonberg N (1996) High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice. Nat Biotechnol. 14, 845-851.

Fussenegger M, Bailey JE, Hauser H, Mueller PP (1999) Genetic optimization of recombinant glycoprotein production by mammalian cells. Trends Biotechn. 17, 35-42.

Frødin JE, Lefvert AK, Mellstedt H (1990) Pharmacokinetics of the mouse monoclonal antibody 17-1A in cancer patients re-ceiving various treatment Schedules. Cancer Res. 50, 4866-4871.

Galili U (1993) Interaction of the natural anti-Gal antibody with alpha-galactosyl epitopes: a major obstacle for xenotransplantation in humans. Immunol Today 14, 480-482. Garrard L, Yang M, 0'Connell M, Kelley R and Henner DJ (1991) Fab assembly and enrichment in a monovalent phage display system. BioTechnology 9, 1373.

Goldwasser E, Eliason JF, Sikkema D (1975) An assay for erythropoietin in vitro at the milliunit level. Endocrinology 97, 315-23.

Green LL, Hardy MC, Maynard-Currie CE, Tsuda H, Louie DM, Mendez MJ, Abderrahim H, Noguchi M, Smith DH, Zeng Y (1994) Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engi-neered with human lg heavy and light chain YACs. Nat Genet. 7, 13-21.

Gorman CM, Gies D, McCray G, Huang M (1989) The human cytomegalovirus major immediate early promoter can be trans-activated by adenovirus early proteins. Virology 171, 377-385.

Hale G, Dyer MJS, Clark MR, Phillips JM, Marcus R, Reichmann L, Winter G and Waldmann H (1988) Remission induction in non-Hodgkin lymphoma with reshaped human monoclonal antibody CAMPATH-1H. Lancet 2, 1394-1399.

Hammerling U, Kroon R, Wilhelmsen T, Sjodin L (1996) In vitro bioassay for human erythropoietin based on proliferative stimulation of an erythroid cell line and analysis of carbo-hydrate-dependent microheterogeneity. J Pharm Biomed An. 14, 1455-1469.

Han J, Sabbatini P, Perez D, Rao L, Modna D, White E (1996) The E1B 19K protein blocks apoptosis by interacting with and inhibiting the p53-inducible and death-promoting Bax protein. Genes Dev. 10, 461-477.

Havenga MJ, Werner AB, Valerio D, van Es HH (1998) Methotrexate selectable retroviral vectors for Gaucher disease. Gene Ther. 5, 1379-1388.

Hollister JR, Shaper JH, Jarvis DJ (1998) Stable expression of mammalian betal,4-galactosyltransferase extends the N-glycosylation pathway in insect cells. Glycobiology 8, 473-480 .

Huls GA., Heijnen IAFM., Cuomo ME., Koningsberger JC., Wieg-man L., Boel E., Van der Vuurst de Vries A-R., Loyson SAJ., Helfrich W., Van Berge Henegouwen GP., Van Meijer M., De Kruif J. and Logtenberg T (1999) A recombinant, fully human monoclonal antibody with antitumor activity constructed from phage-displayed antibody fragments. Nature Biotechnol. 17, 276-281.

Isaacs JD, Watts RA, Hazleman BL, Hale G, Keogan MT, Cobbold SP, Waldmann H (1992) Humanised monoclonal antibody therapy for rheumatoid arthritis. Lancet 340, 748-52.

Jacobovits A (1995) Production of fully human antibodies by transgenic mice. Curr Opin Biotechnol. 6, 561-566.

Jenkins N, Parekh RB, James DC (1996) Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat Biotechnol. 14, 975-81.

Jenkins N, Buckberry L, Marc A, Monaco L (1998) Genetic engineering of alpha 2,6-sialyltransferase in recombinant CHO cells. Biochem Soc Trans. 26, 5115.

Kawashima I, Ozawa H, Kotani M, Suzuki M, Kawano T, Gomibuchi M, Tai T (1993) Characterization of ganglioside expression in human melanoma cells: immunological and biochemical analysis. J Biochem (Tokyo) 114, 186-193.

Kay R, Takei F, Humphries RK (1990) Expression cloning of a cDNA encoding Ml/69. J Immunol. 145, 1952-1959.

Kitamura T, Tange T, Terasawa T, Chiba S, Kuwaki T, Miyagawa K, Piao Y-F, Miyazono K, Urabe A, Takaku F (1989) Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin. J Cell Physiol. 140, 323-334.

Kohler G and Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495.

Krystal, G, Eaves, AC, Eaves CJ (1981) A quantitative bioassay for erythropoietin, using mouse bone marrow. J Lab Clin Med. 97, 144-157.

Krystal G (1983) A simple microassay for erythropoietin based on 3H-thymidine incorporation into spleen cells from phenylhydra-zine treated mice. Exp Hematol. 11, 649-660.

Lee EU, Roth J, Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides cf Chinese hamster ovary cells by expression of beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J-Biol Chem. 264, 13848-13855. Levrero M, Barban V, Manteca S, Ballay A, Balsamo C, Avantaggiata ML, Na-toli G, Skellekens H, Tiollais P, Perricaudet M (1991) Defective and non-defective adencvirus vectors for expression foreign genes in vitro and in vivo. Gene 101, 195-202.

Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG (1994) Antigen-specific human antibodies from mice comprising four dis-tinct genetic modifications. Nature 368, 856-859.

Lonberg N, Huszar D (1995) Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol. 13, 65-93.

Lowder JN, Meeker TC, Levy R (1985) Monoclonal antibody therapy of lymphoid malignancy. Cancer Surv. 4, 359-375. McCafferty J, Griffiths AD, Winter G and Chiswell DJ (1990) Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348, 552.

Mellstedt H, Frodin JE, Masucci G, Ragnhammar P, Fagerberg J, Hjelm AL, Shetye J, Wersall P, Osterborg A (1991) The therapeutic use of monoclonal antibodies in colorectal carcinoma. Semin Oncol. 18, 462-477.

Mendez MJ, Green LL, Corvalan JR, Jia XC, Maynard-Currie CE, Yang XD, Gallo ML, Louie DM, Lee DV, Erickson KL, Luna J, Roy CM, Abderrahim H, Kirschenbaum F, Noguchi M, Smith DH, Fukushima A, Hales JF, Klapholz S, Finer MH, Davis CG, Zsebo KM, Jakobo-vits A (1997) Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nat Genet. 15, 146-156.

Minch SL, Kallio PT, Bailey JE (1995) Tissue plasminogen activa-tor coexpressed in Chinese hamster ovary cells with alpha (2,6)-sialyltransferase contains NeuAc alpha(2,6)Gal beta(1,4)Glc-N-AcR linkages. Biotechn Prog. 11, 348-351. Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT (1984) Chimeric human antibody mole-cules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proe Nati Acad Sei USA. 81,6851-6855.

Muchmore EA, Milewski M, Varki A, Diaz S (1989) Biosynthesis of N-glycolyneuraminic acid. The primary site of hydroxylation of N-acetylneuraminic acid is the cytosolic sugar nucleotide pool. J Biol Chem. 264, 20216-20223. Nadler L, Stashenko P, Hardy R, Kaplan W, Burton L, Kufe DW, Antman KH, Schlossman SF (1980) Se-rotherapy of a patient with a monoclonal antibody directed against a human lymphoma-associated antigen. Cancer Res. 40, 3147-3154.

Oi VT, Morrison SL, Herzenberg LA, Berg P (1983) Immunoglobulin gene expression in transformed lymphoid cells. Proe Nati Acad Sei US A. 1983 80, 825-829.

Olive DM, Al-Mulla W, Simsek M, Zarban S, al-Nakib W (1990) The human cytomegalovirus immediate early enhancer-promoter is re-sponsive to activation by the adenovirus-5 13S EIA gene. Arch Virol. 112, 67-80.

Owens RJ and Young RJ. (1994) The genetic engineering of monoclonal antibodies. J. Immunol Methods 168, 149-165.

Reff ME, Carner K, Chambers KS, Chinn PC, Leonard JE, Raab R, Newman RA, Hanna N and Anderson DR (1994) Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood 83, 435-445.

Reichmann L, Clark M, Waldmann H and Winter G (1988) Reshaping human antibodies for therapy. Nature 322, 323-327. Riethmuller G, Riethmuller G, Schneider-Gadicke E, Schlimok G, Schmiegel W, Raab R, Hoffken K, Gruber R, Pichlmaier H, Hirche H, Pichlmayr R, et al. (1994) Randomised trial of monoclonal antibody for ad-juvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. Lancet 343, 1177-1183.

Rother RP and Squinto SP (1996) The alpha-Galactosyl epitope: A sugar coating that makes viruses and cells unpalatable. Cell 86, 185-188.

Sanders PG, Wilson RH (1984) Amplification and cloning of the Chinese hamster glutamine synthetase gene. EMBO J. 3, 65-71. Sandhu JS (1992) Protein Engineering of antibodies. Critical Rev Biotechnology 12, 437-462.

Shawler DL, Bartholomew RM, Smith LM and Dillman RO (1985) Human immune response to multiple injections of murine monoclonal IgG. J Immunol. 135, 1530.

Takeuchi M, Inoue N, Strickland TW, Kubota M, Wada M, Shimizu R, Hoshi S, Kozutsumi H, Takasaki S, Kobata A (1989) Rela-tionship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Proe Nati Acad Sei USA. 86, 7819-7822.

Urlaub G, Kas E, Carothers AM, Chasin LA (1983) Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells. Cell 33, 405-412.

Vandamme A-M., Bulens F., Bernar H., Nelles L., Lijnen RH. and Coilen D (1990) Construction and characterization of a recombinant murine monoclonal antibody directed against human fibrin fragment-D dimer. Eur J Biochem. 192, 767-775. Vaswani SK and Hamilton RG (1998) Humanized antibodies as potential therapeutic drugs. Ann Allergy, Asthma and Immunol. 81, 105-115.

Vonach B, Hess B, Leist C (1998) Construction of a novel CHO cell line coexpressing human glucosyltransferases and fusion PSGL-l-immunoglobulin G. In: O.-W.Merten et al (eds), New de-velopments and new applications in animal cell technology, pp,181-183, Kluwer Academic Publishers.

Weikert S, Papac D, Briggs J, Cowfer D, Tom S, Gawlitzek M, Lof g ren J, Mehta S, Chisholm V, Modi N, Eppler S, Carroll K, Chamow S, Peers D, Berman P, Krummen L (1999) Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize sialic acid content of recombinant glycoproteins. Nature Biotechnology 17, 1116-1121.

White E, Sabbatini P, Debbas M, Wold WS, Kusher DI, Gooding LR (1992) The 19-<1>'ilodalton adenovirus E13 transforming protein inhibits programmed cell death and prevents cytolysis by tumor necrosis factor alpha. Mol Cell Biol. 12, 2570-2580.

Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE and Hoogenboom HR (1994) Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol. 12, 433-455.

Wurm F, Bernard A (1999) Large-scale transient expression in mammalian cells for recombinant protein production. Curr Opin Biotechnol. 10, 156-159.

Yamaguchi K, Akai K, Kawanishi G, Ueda M, Masuda S, Sasaki R

(1991) Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties. J Biol Chem. 266, 20434-20439.

Yew PR, Berk AJ (1992) Inhibition of p53 transactivation re-quired for transformation by adenovirus early IB protein. Nature 357, 82-85.

Zhang X, Lok SH, Kom OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta. 27, 441-452.

TABELLER: Utbyttene av rekombinant EPO

Tabell 1. Oversikt over metotrexat(MTX)-dreping av PER.C6 og PER.C6/E2A etter 6 og 15 dagers inkubasjon med forskjellige MTX-konsentrasjoner. Cellene ble utsådd på dag 0, og inkuba-sjonene med MTX begynte på dag 1 og fortsatte i 6 dager. Deretter ble konfluensen (%) bedømt, og mediet ble erstattet av friskt medium pluss MTX, og inkubasjonen fortsatte i ytterligere 9 dager, hvoretter konfluensen (%) ble bedømt igjen (dag 15).

Tabell 2. Bundne PER.C6- og PER.C6/E2A-cellelinjer som stabilt uttrykker rekombinant humant EPO. Cellelinjene ble generert ved stabil integrasjon og ekspresjon av pEPO2000/DHFRwt (figur 5). Produksjonsnivåene ble bestemt i supernatanten, etter vekst i 4 dager i en T25-kolbes anordning i nærvær av 100 nM MTX.

Tabell 3. Amplifikasjonsrate for endogent og integrert DHFR DNA. Intensitetene av de hybridiserende bånd i "Southern blots" fra figur 19 ble målt i en "phosphorimager" og korrigert med hensyn til bakgrunnsnivåene for til slutt å beregne de omtrentlige amplifikasjonrater av de endogene og de integrerte DHFR-gener.

Tabell 4. EPO-utbyttene i transiente DNA-transfeksjoner. Utbyttene per million utsådde celler ble bestemt med en EPO ELISA på supernatanter fra PER.C6-, PER.C6/E2A- og CHO-celler som var transfektert med pEPO2000/DHFRwt-ekspresjonsvektor i fravær eller nærvær av føtalt bovint serum (FBS) ved forskjellige inkubasjonstemperaturer, som beskrevet i eksempel 12.

Tabell 5. EPO-utbyttene oppnådd etter virusinfeksjoner. Utbyttet per million utsådde celler ble bestemt med en EPO ELISA-prosedyre på supernatanter fra PER.C6-celler som ble infisert med rekombinant IG.Ad5.AdAt.EPO.dE2A-adenovirus som beskrevet i eksempel 14. To forskjellige batcher av viruset ble anvendt med forskjellige vp/IU-forhold (330 og 560) i to forskjellige anordninger (rulleflaske-suspensjonskulturer og 6-brønners festede kulturer).

Claims

1. Fremgangsmåte for å fremstille minst ett rekombinant protein i en celle omfattende å fremskaffe en PER.C6-celle som deponert under ECACC nr. 96022940 eller et derivat derav, hvor fremgangsmåten omfatter å utstyre nevnte celle med et gen som koder for et rekombinant protein, dyrke nevnte celle i et egnet medium og innhøste det rekombinante protein fra nevnte celle og/eller medium, hvor nevnte rekombinante protein er kodet av en nukleinsyre som er integrert i genomet av nevnte celle.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nevnte celle foreligger i suspensjon under nevnte dyrkning.

3. Fremgangmsåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor nevnte egnede medium er fritt for dyre- eller human-avledet serum.

4 . Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor det rekombinante protein er et humant protein.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor det rekombinante protein omfatter minst ett variabelt domene av et immunoglobulin.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, hvor det rekombinante protein er et immunoglobulin.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, hvor det rekombinante protein er et monoklonalt antistoff.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, hvor det rekombinante protein er erytropoietin eller et funksjonelt derivat, homolog eller fragment derav.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, hvor det rekombinante protein er et viralt protein som er forskjellig fra adenoviralt protein.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor nevnte virale protein er valgt fra gruppen bestående av: en influensavirus-neuramidase og/eller et hemaglutinin; et enterovirus-protein; et herpesvirus-protein; et ortomyxovirusprotein; et retrovirus-, et parvovirus- eller et popavirus-protein; et rotavirus- eller et koronavirus-protein; et togavirus-protein, rubellavirus-protein eller et Eastern-, Western- eller Venezuelan ekvint encephalomyelittvirus-protein; et hepatitt-forårsakende virusprotein, et hepatitt-A-protein eller et hepatitt-B-virus-protein samt et pestivirusprotein så som svinekoleravirus-protein eller rhabdovirusprotein så som et rabiesvirus-protein.

11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor det rekombinante protein er kodet av en nukleinsure som står under kontroll av CMV-promoteren.

12. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor cellen ytterligere omfatter et integrert cDNA som koder for alfa-2,3-sialyltransferase, alfa-2,6-sialyltransferase eller beta-1,4-galaktocyltransferase.