PT1533380E - Produção de proteínas recombinantes numa célula humana compreendendo pelo menos uma proteína e1 de adenovírus - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Produção de proteínas recombinantes numa célula humana compreendendo pelo menos uma proteína El de adenovírus" 0 presente invento refere-se às concretizações caracterizadas nas reivindicações. Assim, refere-se ao campo da produção de proteínas recombinantes, mais particularmente à utilização de uma célula humana para a produção de proteínas. 0 presente invento refere-se ainda ao campo da produção de anticorpos monoclonais e mais em particular à utilização de uma célula humana para a produção de anticorpos monoclonais. 0 presente invento refere-se ainda ao campo da produção de proteínas virais. 0 presente invento é particularmente útil para a produção de vacinas para ajudar na protecção contra patogénios virais de vertebrados, em particular mamíferos e especialmente humanos. São aqui divulgados métodos e composições para a produção de proteínas recombinantes. 0 presente invento é particularmente útil para a produção de proteínas que requerem modificações pós-tradução ou peri-tradução tais como glicosilação e dobragem correcta. A expressão de proteínas recombinantes humanas em células heterólogas tem sido bem documentada. Tornaram-se disponíveis muitos sistemas de produção para proteínas recombinantes, variando de bactérias, leveduras e fungos a células de insecto, células vegetais e células de mamífero. No entanto, apesar destes desenvolvimentos, alguns sistemas de produção não são ainda óptimos ou são apenas adequados para a produção de classes específicas de proteínas. Por exemplo, as proteínas que requerem modificações pós- ou peri-tradução tais como glicosilação, γ-carboxilação ou γ-hidroxilação não podem ser produzidas em sistemas de produção procarióticos. Outro problema bem conhecido com sistemas de expressão procarióticos é a frequente dobragem incorrecta do produto a produzir, conduzindo mesmo em muitos casos a corpos de inclusão insolúveis. Os sistemas eucarióticos são uma melhoria na produção de, em particular, proteínas derivadas de eucariotas, mas os sistemas de produção disponíveis sofrem ainda de várias desvantagens. A hipermanosilação em, por exemplo, estirpes de 2 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ levedura afecta a capacidade das leveduras para expressarem correctamente glicoproteínas. A hipermanosilação conduz mesmo frequentemente a reacções imunitárias quando uma proteína terapêutica assim preparada é administrada a um doente. Para além disso, os sinais de secreção de levedura são diferentes dos sinais de mamífero conduzindo a um transporte mais problemático das proteínas de mamífero, incluindo polipéptidos humanos, para o meio extracelular, o que por sua vez resulta em problemas com a produção contínua e/ou isolamento.

As células de mamífero são amplamente utilizadas para a produção de tais proteínas devido à sua capacidade para efectuarem extensas modificações pós-tradução. A expressão de proteínas recombinantes em células de mamífero evoluiu dramaticamente ao longo dos últimos anos, resultando em muitos casos numa tecnologia de rotina. Em particular, as células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) tornaram-se num sistema de produção de rotina e conveniente para a criação de proteínas biofarmacêuticas e de proteínas para fins de diagnóstico. Várias características tornam a CHO muito adequada como célula hospedeira: os níveis de produção que podem ser alcançados nas células CHO são extremamente elevados; a linha celular proporciona um sistema de produção seguro, que está isento de partículas infecciosas ou semelhantes a vírus; as células CHO foram extensamente caracterizadas, embora a história da linha celular original seja vaga; as células CHO podem crescer em suspensão até densidades elevadas em biorreactores, utilizando meios de cultura isentos de soro; um mutante dhfr- de CHO (clone DG-44. Urlaub et al., 1983) foi desenvolvido para obter um sistema de selecção fácil através da introdução de um gene dhfr exógeno e a partir daí uma amplificação bem controlada do gene dhfr e do transgene utilizando metotrexato.

No entanto, glicoproteínas ou proteínas compreendendo pelo menos duas subunidades (diferentes) continuam a colocar problemas. A actividade biológica das proteínas glicosiladas pode ser profundamente influenciada pela natureza exacta do componente oligossacárido. 0 tipo de glicosilação pode também ter efeitos significativos na imunogenicidade, direccionamento e farmacocinética da glicoproteína. Em anos recentes, foram feitos grandes avanços nos factores celulares que determinam a glicosilação e foram clonadas muitas enzimas glicosil- 3 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ transferase. Isto resultou em investigação dirigida à engenharia metabólica da maquinaria de glicosilação (Fussenegger et al., 1999; Lee et al.r 1989; Vonach et al., 1998; Jenkins et al., 1998; Zang et al., 1998; Muchmore et al., 1989). Exemplos de tais estratégias estão descritos abaixo. As células CHO não têm uma enzima a-2,6-sialil-transferase funcional, resultando na adição exclusiva de ácidos siálicos a galactose através de ligações a-2,3. Sabe-se que a ausência de ligações a-2,6 pode aumentar a eliminação de uma forma proteica da corrente sanguínea. Para resolver este problema, foram modificadas células CHO para se parecerem com o perfil de glicanos humanos, através de co-transfecção das glicosil-transferases apropriadas. As células CHO são também incapazes de produzir oligossacáridos de Lewis*. Foram desenvolvidas linhas celulares de CHO que expressam N-acetil-D-glucosaminiltransferase humana e a-1,3-fucosil-transferase III. Em contraste, sabe-se que as células de roedor, incluindo as células CHO, produzem ácido CMP-N-acetilneuramínico-hidrolase que glicosila ácidos CMP-N-acetilneuramínicos (Jenkins et al., 1996), uma enzima que está ausente em humanos. As proteínas que possuem este tipo de glicosilação podem produzir uma forte resposta imunitária quando injectadas (Kawashima et al., 1993). A recente identificação do gene de roedor que codifica a enzima hidrolase irá muito provavelmente facilitar o desenvolvimento de células CHO que não tenham esta actividade e evitará este tipo de modificação de roedor. A arte ensina assim que é possível alterar o potencial de glicosilação de células hospedeiras de mamífero através da expressão de enzimas glicosil-transferase humanas. No entanto, embora as estruturas de glicanos derivadas de CHO nas proteínas recombinantes possam imitar as presentes nas suas equivalentes humanas naturais, verifica-se estas que estão ainda muito longe de serem idênticas. Outro potencial problema é que nem todas as enzimas de glicosilação foram clonadas e estão por isso disponíveis para engenharia metabólica. A administração terapêutica de proteínas que diferem das suas equivalentes humanas naturais pode resultar em activação do sistema imunitário do doente e causar respostas indesejáveis que podem afectar a eficácia do tratamento. 4 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Outros problemas da utilização de células não humanas podem surgir da dobragem incorrecta que ocorre durante ou após a tradução a qual poderia ser dependente da presença das diferentes proteínas de acompanhamento ("chaperone") disponíveis. Pode ocorrer dobragem aberrante, conduzindo a uma diminuição ou ausência de actividade biológica da proteína. Para além disso, a expressão simultânea de polipéptidos separados que formarão juntos proteínas constituídas pelas diferentes subunidades, tais como anticorpos monoclonais, nas abundâncias relativas correctas, é de grande importância. As células humanas serão melhor capazes de proporcionar todas as condições necessárias para que proteínas humanas sejam correctamente expressas e processadas. É assim claramente desejável ter métodos para produção de proteínas recombinantes humanas que envolvam uma célula humana que proporcione um processamento de tipo humano consistente como modificações pós-tradução e peri-tradução, tais como glicosilação, que de preferência são também adequados para produção em larga escala.

Assim o presente invento proporciona um método para produção de pelo menos uma substância proteinácea numa célula PER.C6, célula esta que não codifica uma proteína adenoviral estrutural do seu genoma nem uma sequência integrada nele, compreendendo o referido método proporcionar à referida célula um gene codificando uma substância proteinácea recombinante, a cultura da referida célula num meio adequado e a colheita de pelo menos uma substância proteinácea a partir da referida célula e/ou do referido meio. Uma substância proteinácea é uma substância compreendendo pelo menos dois aminoácidos ligados por uma ligação peptídica. A substância pode ainda compreender ou não uma ou mais outras moléculas fisicamente ligadas à referida porção de aminoácidos. Exemplos não limitantes de tais outras moléculas incluem moléculas de hidratos de carbono e/ou lípidos. Não deve estar presente um ácido nucleico codificando uma proteína estrutural de adenovírus por várias razões. Uma das razões é que a presença de uma proteína estrutural de adenovírus numa preparação de proteína produzida é altamente indesejável em muitas aplicações de tal proteína produzida. A remoção de tal proteína estrutural do produto é melhor alcançada evitando a sua ocorrência na preparação. Numa 5 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ concretização preferida, a substância proteinácea colhida da célula e a própria célula são derivadas da mesma espécie. Por exemplo, se se pretender que a proteína seja administrada a humanos é preferível que tanto a célula como a substância proteinácea colhida a partir da referida célula sejam de origem humana. Uma vantagem de uma célula humana é que a maioria das proteínas comercialmente mais atractivas são humanas. A substância proteinácea colhida a partir da referida célula pode ser qualquer substância proteinácea produzida pela referida célula. Numa concretização pelo menos uma da referida pelo menos uma substância proteinácea colhida é codificada pelo referido gene. Noutra concretização, é proporcionado à referida célula um gene para aumentar e/ou induzir a expressão de um ou mais genes presentes endogenamente numa célula. Por exemplo, proporcionando à referida célula um gene codificando uma proteína que é capaz de aumentar a expressão de uma substância proteinácea na referida célula.

Por um gene entenda-se um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico de interesse num formato que possa ser expresso, tal como uma cassete de expressão. 0 ácido nucleico de interesse pode ser expresso a partir do promotor natural ou um derivado deste ou de um promotor inteiramente heterólogo. 0 ácido nucleico de interesse pode compreender intrões ou não. Semelhantemente, pode ser um ADNc ou ácido nucleico semelhante a ADNc, 0 ácido nucleico de interesse pode codificar uma proteína. Alternativamente, o ácido nucleico de interesse pode codificar um ARN anti-sentido.

0 presente invento proporciona ainda um método para produção de pelo menos uma proteína recombinante humana numa célula, compreendendo proporcionar a uma célula PER.C6 humana, célula esta que não produz proteínas adenovirais estruturais, um ácido nucleico codificando a referida proteína recombinante humana, a cultura da referida célula num meio adequado e a colheita de pelo menos uma proteína recombinante humana a partir da referida célula e/ou do referido meio. Até ao presente invento, existiam poucas, se algumas, células humanas que se tivesse verificado serem adequadas para produzir proteínas recombinantes humanas de qualquer modo reprodutível e susceptível de aumento de escala. Verificámos agora que células PER.C6, que compreendam pelo menos sequências de EI 6 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ adenovirais de imortalização no seu genoma, são capazes de crescer (são imortalizadas pela presença de El), relativamente independentes de factores de crescimento exógenos. Para além disso, estas células são capazes de produzir proteínas recombinantes em quantidades significativas e são capazes de processar correctamente a proteína recombinante a produzir. Claro que estas células serão também capazes de produzir proteínas não humanas. As linhas celulares humanas que foram utilizadas para produzir proteínas recombinantes em qualquer quantidade significativa são frequentemente linhas celulares tumorais (transformadas). 0 facto da maioria das células humanas que foram utilizadas para produção de proteínas recombinantes serem derivadas de tumores adiciona um risco adicional ao trabalhar com estas linhas celulares em particular e resulta em procedimentos de isolamento muito rigorosos para a proteína recombinante para evitar material com actividade transformante ou tumorigénica em qualquer preparação da proteína ou outras. No método de acordo com o invento a referida célula é uma célula PER.C6, que é derivada de uma célula retinoblasto embrionário humano (HER) primária. Para ser capaz de crescer indefinidamente, uma célula primária necessita de ser imortalizada de algum modo, o que no presente invento foi alcançado através da introdução de El de Adenovírus. A arte não é clara sobre qual é a fronteira entre transformada e imortalizada. Aqui pretende-se que a diferença represente que as células imortalizadas crescem indefinidamente, enquanto que o fenótipo continua presente e as células transformadas crescem também indefinidamente mas apresentam também normalmente uma alteração dramática no fenótipo.

Para alcançar produção em larga escala (contínua) de proteínas recombinantes através de cultura celular é preferido na arte ter células capazes de crescer sem necessidade de ancoragem. As células do presente invento têm essa capacidade. A capacidade de crescimento independente de ancoragem é melhorada quando as células compreendem no seu genoma uma sequência codificando E2A ou um derivado ou análogo ou fragmento funcional desta, através da qual a referida sequência de codificação de E2A codifica de preferência uma E2A mutante sensível à temperatura, tal como tsl25. Para ter um sistema de produção limpo e seguro a partir do qual seja 7 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ fácil isolar a proteína recombinante desejada é preferido ter um método de acordo com o presente invento, através do qual a referida célula humana não compreende outras sequências adenovirais. A célula para os métodos e utilizações do presente invento é PER.C6 tal como depositada sob o número ECACC 96022940 ou uma derivada desta. PER.C6 comporta-se melhor no manuseamento que por exemplo células 293 humanas transformadas que foram também imortalizadas pela reqião El de Adenovírus. As células PER.C6 foram caracterizadas e foram documentadas muito extensamente, embora se comportem significativamente melhor no processo de aumento de escala, crescimento em suspensão e independência de factores de crescimento. Especialmente o facto das PER.C6 poderem ser postas em suspensão de um modo altamente reprodutível é algo que as torna muito adequadas para produção em larga escala. Para além disso, a linha celular PER.C6 foi caracterizada para crescimento em biorreactor no qual cresce até densidades muito elevadas.

As células PER.C6 de acordo com o presente invento têm a vantagem adicional de poderem ser cultivadas na ausência de soro derivado de animais ou humanos ou de componentes do soro derivado de animais ou humanos. Assim, o isolamento é mais fácil, enquanto que a segurança é aumentada devido à ausência de proteínas humanas ou animais adicionais na cultura e o sistema é de muita confiança (os meios sintéticos são os melhores em reprodutibilidade). Para além disso, a presença da região inicial IA (EIA) de Adenovírus adiciona outro nível de vantagens em comparação com linhas celulares (humanas) sem este gene específico: sabe-se que EIA como activador da transcrição aumenta a transcrição a partir do estimulador/promotor dos genes Iniciais Imediatos de

Citomegalovírus (Olive et al., 1990; Gorman et al., 1989). Quando a proteína recombinante a produzir está sob o controlo do estimulador/promotor de CMV os níveis de expressão aumentam nas referidas células e não em células sem EIA. Tal como o promotor de CMV também os promotores de ElA são mais activos em células que expressam um ou mais produtos ElA, que em células que não expressam tais produtos. Sabe-se que de facto o aumento da expressão de ElA é uma característica de vários outros promotores. Para o presente invento, tais promotores são considerados como sendo homólogos funcionais dos 8 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ promotores de EIA. O efeito de EIA pode ser mediado através da atracção de activadores da transcrição pelo promotor de EIA ou homólogo deste e/ou através da remoção/impedimento de ligação de repressores da transcrição ao promotor. A ligação de activadores e repressores a um promotor ocorre numa sequência de um modo dependente da sequência. Um derivado e/ou fragmento funcional de um promotor de ElA ou homólogo deste compreende por isso pelo menos a sequência de ligação a ácido nucleico de pelo menos um activador e/ou repressor regulado pela proteína EIA.

Outra vantagem das células do presente invento é que estas ancoram e expressam constitutivamente o gene de ElB de Adenovírus. ElB de Adenovírus é um inibidor bem conhecido da morte celular programada ou apoptose. Esta inibição ocorre através do produto ElB 55K pela sua ligação ao factor de transcrição p53 e subsequente inibição (Yew e Berk, 1992) . O outro produto da região de ElB, ElB 19K, pode impedir a apoptose através da ligação e deste modo inibição das proteínas de morte celular Bax e Bak, proteínas que estão ambas sob o controlo de p53 (White et al., 1992; Debbas e White, 1993; Han et al., 1996; Farrow et al., 1995). Estas características podem ser extremamente úteis para a expressão de proteínas recombinantes que, quando sobre-expressas, poderiam estar envolvidas na indução de apoptose através de uma via dependente de p53. 0 presente invento proporciona ainda a utilização de uma célula PER.C6 humana para a produção de uma proteína recombinante humana, célula esta que não produz proteínas adenovirais estruturais. 0 invento proporciona ainda uma utilização de acordo com o invento, em que a referida célula compreende ainda no seu genoma uma sequência codificando E2A ou um derivado ou análogo ou fragmento funcional desta, de preferência em que a referida E2A é sensível à temperatura. 0 presente invento proporciona também uma proteína recombinante humana obtenível através de um método de acordo com o presente invento ou através de uma utilização de acordo com o presente invento, possuindo a referida proteína recombinante humana um padrão de glicosilação humano diferente do da proteína equivalente humana natural isolada. 9 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Noutra concretização ο presente invento proporciona uma célula humana, célula esta que não produz proteínas adenovirais estruturais e possui um gene codificando uma proteina recombinante humana, que é uma célula humana que é derivada de PER.C6 tal como depositada sob o número ECACC 96022940.

Ainda noutra concretização o presente invento proporciona uma tal célula humana, PER.C6/E2A, que compreende ainda no seu genoma uma sequência codificando E2A ou um derivado ou análogo ou fragmento funcional desta, de preferência em que a referida E2A é sensivel à temperatura.

As proteínas a expressar nestas células e utilizando os métodos do presente invento são bem conhecidas dos peritos na arte. São de preferência proteínas humanas que de preferência sofrem algum tipo de processamento na natureza, tal como secreção, dobragem acompanhada e/ou transporte, co-síntese com outras subunidades, glicosilação, fosforilação. Exemplos típicos de utilização terapêutica ou de diagnóstico incluem anticorpos monoclonais que são constituídos por várias subunidades, Activador de Plasminogénio específico do tecido (tPA), factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF) e eritropoietina humana (EPO). A EPO é um produto típico que, especialmente in vivo, depende fortemente do seu padrão de glicosilação para a sua actividade e imunogenicidade. Até agora, podem ser obtidos níveis relativamente elevados de EPO através da utilização de células CHO que é diferentemente glicosilada quando comparada com a EPO purificada a partir de urina humana, embora igualmente activa na estimulação da produção de eritrócitos. No entanto, a diferente glicosilação de tal EPO conduz a problemas de imunogenicidade e problemas de semivida alterada num receptor. O presente invento divulga também uma nova linha celular humana imortalizada para este fim e as suas utilizações para produção. As células PER.C6 (WO 97/00326) foram criadas através de transfecção de células primárias de retina embrionária humana, utilizando um plasmídeo que continha as sequências de codificação de EIA e E1B de Adenovírus de 10 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ serótipo 5 (Ad5) (nucleótidos de Ad5 459-3510) sob o controlo do promotor da fosfoglicerato-quinase humana (PGK).

As seguintes características tornam PER.C6 particularmente útil como um hospedeiro para produção de proteínas recombinantes: 1. linha celular humana completamente caracterizada; 2. desenvolvida de acordo com as boas práticas laboratoriais ("GLP"); 3. pode ser posta a crescer como culturas de suspensão em meio definido isento de soro desprovido de quaisquer proteínas derivadas de humano ou de animais; 4. crescimento compatível com garrafas giratórias, balões de agitação, balões de centrifugação e biorreactores com tempos de duplicação de cerca de 35 h; 5. presença de EIA que causa uma regulação positiva da expressão de genes que estejam sob o controlo do estimulador/promotor de CMV; 6. presença de ElB que evita a apoptose dependente de p53 possivelmente estimulada pela sobre-expressão do transgene recombinante.

Numa concretização o presente invento proporciona um método do presente invento em que a referida célula é capaz de produzir 2 a 200 vezes mais proteína recombinante e/ou substância proteinácea que as linhas celulares de mamífero convencionais. De preferência, as referidas linhas celulares de mamífero convencionais são seleccionadas a partir do grupo que consiste em linhas celulares CHO, COS, Vero, HeLa, BHK e Sp-2 .

Num aspecto do presente invento, a substância proteinácea ou proteína é um anticorpo monoclonal. Os anticorpos, ou imunoglobulinas (Ig), são proteínas séricas que desempenham um papel central na resposta imunitária humoral, ligando-se a antigénios e inactivando-os ou desencadeando a resposta inflamatória que resulta na sua eliminação. Os anticorpos são capazes de interacções altamente específicas com uma grande variedade de ligandos, incluindo marcadores associados a tumores, proteínas de revestimento virai e glicoproteínas da superfície celular dos linfócitos. São, portanto, agentes potencialmente muito úteis para o diagnóstico e tratamento de doenças humanas. A tecnologia de anticorpos monoclonais recombinantes e de cadeia única está a abrir novas perspectivas para o desenvolvimento de novos agentes 11 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ terapêuticos e de diagnóstico. Anticorpos monoclonais de ratinho foram utilizados como agentes terapêuticos numa grande variedade de ensaios clinicos para tratar doenças infecciosas e cancro. 0 primeiro relato de um doente a ser tratado com um anticorpo monoclonal de murideo foi publicado em 1980 (Nadler et al., 1980). No entanto, os efeitos observados com estes agentes foram em geral bastante desapontantes (para revisões ver Lowder et al., 1986, Mellstedt et al.r 1991, Baldwin e Byers, 1986). Tradicionalmente, os anticorpos (imunoglobulinas) monoclonais recombinantes são produzidos em hibridomas de células B. Tais hibridomas são produzidos fundindo uma célula B produtora de imunoglobulina, inicialmente seleccionada quanto à sua especificidade, com uma célula de mieloma de ratinho imortalizando deste modo a célula B. A estratégia original de imortalização de células B foi desenvolvida em 1975 (Kõhler e Milstein). No entanto, as imunoglobulinas produzidas em tais hibridomas têm a

desvantagem de que são de origem em ratinho, resultando em fraca especificidade do anticorpo, baixa afinidade do anticorpo e numa grave resposta de anticorpo anti-ratinho do hospedeiro (HAMA, Shawler et al., 1985). Esta resposta HAMA pode conduzir a inflamação, febre e mesmo morte do doente.

Os anticorpos de ratinho têm uma baixa afinidade em humanos e por razões ainda desconhecidas têm uma semivida extremamente curta na circulação humana (19-42 horas) em comparação com os anticorpos humanos (21 dias, Frõdin et al., 1990). Isso, juntamente com a gravidade da resposta HAMA, incitou ao desenvolvimento de estratégias alternativas para criação de imunoglobulinas mais humanas ou completamente humanizadas (revisto por Owens e Young 1994, Sandhu 1992, Vaswani et al., 1998). Uma dessas estratégias faz uso das regiões constantes da imunoglobulina humana para substituir as suas equivalentes de murideo, resultando numa nova geração de anticorpos "quiméricos" e "humanizados". Esta abordagem é seguida uma vez a resposta HAMA é devida principalmente aos domínios constantes (Oi et al., 1983; Morrinson et al., 1984). Um exemplo de um tal anticorpo quimérico é CAMPATH-1H (Reichmann et al., 1988). O Ac CAMPATH-1H, utilizado no tratamento de linfoma de células B não de Hodgkin e artrite reumatóide refractária, é dirigido contra o antigénio humano CAMPATH-1 (CDw52) presente em todas as células linfóides e 12 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ monócitos mas não noutros tipos celulares (Hale et al., 1988, Isaacs et al., 1992). Outros exemplos são Rituxan (Rituximab) dirigido contra CD20 humano (Reff et al., 1994) e 15C5, um anticorpo quimérico criado contra o dimero do fragmento D humano (Vandamme et al., 1990, Bulens et al., 1991) utilizados em imagiologia de coágulos sanguíneos. No entanto, uma vez que esta nova geração de anticorpos quiméricos é ainda parcialmente de murideo, estes podem induzir uma resposta imunitária em humanos, embora não tão grave como a resposta HAMA contra anticorpos completamente de origem em ratinho.

Noutra abordagem mais sofisticada, séries de resíduos presentes nos domínios variáveis do anticorpo, mas aparentemente não essenciais para o reconhecimento do antigénio, são substituídos por trechos de aminoácidos mais do tipo humano, resultando numa segunda geração de anticorpos hiper-quiméricos (Vaswani et al., 1998). Um exemplo bem conhecido desta abordagem é Herceptina (Cárter et al., 1992), um anticorpo que é 95% humano, que é dirigido contra HER2 (um antigénio específico de tumores) e utilizado em doentes de tumores da mama.

Um modo mais preferido de substituir imunoglobulinas recombinantes de ratinho seria um que resultasse na criação de imunoglobulinas humanas. Importante, uma vez que não é ético imunizar humanos com materiais biológicos experimentais, não é subsequentemente praticável seleccionar células B específicas para imortalização tal como foi mostrado para células B de ratinho (Kõhler e Milstein, 1975) . Embora fossem seleccionadas células B de doentes quanto a anticorpos específicos contra antigénios de cancro, é tecnicamente mais difícil preparar imunoglobulinas humanas a partir de material humano em comparação com anticorpos de ratinho (Kohler e Milstein, 1975). Uma abordagem recombinante para produzir anticorpos completamente humanos tornou-se praticável com a utilização de bibliotecas de anticorpos apresentadas por fagos, expressando domínios variáveis de origem humana (McCafferty et al., 1990, Clarkson et al., 1991, Barbas et al., 1991, Garrard et al., 1991, Winter et al., 1994, Burton e Barbas, 1994). Estas regiões variáveis são seleccionadas pela sua afinidade específica para certos antigénios e são subsequentemente ligadas aos domínios constantes de imunoglobulinas humanas, 13 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ resultando em imunoglobulinas recombinantes humanas. Um exemplo desta última abordagem é o anticorpo Fv de cadeia simples 17-1A (Riethmuller et al., 1994) que foi convertido numa imunoglobulina intacta igGl capa humana designada UBS-54, dirigida contra a molécula EpCAM associada a tumores (Huls et al.r 1999).

Os sistemas de produção para criar imunoglobulinas recombinantes são diversos. As imunoglobulinas de ratinho utilizadas pela primeira vez em ensaios clínicos foram produzidas em grandes quantidades nas suas células B específicas parentais e fundidas com uma célula de mieloma de ratinho para imortalização. Uma desvantagem deste sistema é que as imunoglobulinas produzidas são inteiramente de origem em ratinho e produzem uma resposta imunitária dramática (resposta HAMA) no doente humano (tal como descrito acima).

Os anticorpos parcialmente humanizados ou humanos não possuem uma célula B parental que possa ser imortalizada e têm por isso de ser produzidos noutros sistemas como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de Rim de Hamster Bebé (BHK). É também possível utilizar células que sejam normalmente adequadas para produção de imunoglobulinas como células de mieloma humanas derivadas de tumores ou de ratinho. No entanto, os rendimentos de anticorpo obtidos em células de mieloma são em geral relativamente baixos (± 0,1 μg/ml) em comparação com os obtidos em células B originalmente identificadas e imortalizadas que produzem imunoglobulinas completamente de murídeo (+ 10 μg/ml, Sandhu, 1992).

Para ultrapassar estas e outras falhas, estão a ser desenvolvidos sistemas diferentes para produzir imunoglobulinas humanizadas ou humanas com rendimentos mais elevados.

Por exemplo, foi recentemente mostrado que podem ser produzidas estirpes transgénicas de ratinho que têm os genes de IgG de ratinho substituídos pelos seus equivalentes humanos (Bruggeman et al., 1991, Lonberg et al., 1994, Lonberg e Huszar, 1995, Jacobovits, 1995) . Cromossomas artificiais de levedura (YAC) contendo grandes fragmentos dos loci da cadeia pesada e leve (capa) de imunoglobulina (Ig) humana foram 14 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ introduzidos em ratinhos com Ig inactivada, resultando na produção de anticorpos humanos que se assemelham muito aos observados em humanos, incluindo o rearranjo génico, a montagem e o repertório (Mendez et al., 1997, Green et al.f 1994). Igualmente, Fishwild et al. (1996) construíram transgénicos de Ig humana para obter imunoglobulinas humanas utilizando subsequente tecnologia convencional de hibridoma. As células de hibridoma segregavam imunoglobulinas humanas com propriedades semelhantes às dos ratinhos de tipo selvagem incluindo os níveis de estabilidade, crescimento e secreção. Os anticorpos recombinantes produzidos a partir de tais estirpes transgénicas de ratinho não possuem quaisquer sequências de aminoácidos humanas.

Contudo, as imunoglobulinas humanas produzidas até agora têm a desvantagem de ser produzidas em células não humanas, resultando em modificações pós-tradução não humanas como glicosilação e/ou dobragem das subunidades. Todos os anticorpos são glicosilados em posições conservadas nas suas regiões constantes e a presença de hidratos de carbono pode ser crítica para as funções de eliminação do antigénio tais como activação do complemento. A estrutura do hidrato de carbono ligado pode afectar também a actividade do anticorpo. A glicosilação do anticorpo pode ser influenciada pela célula na qual este é produzido, pela conformação do anticorpo e pelas condições de cultura da célula. Por exemplo, anticorpos produzidos em células de ratinho possuem glicanos contendo o resíduo Gal alfal-3Gal, que está ausente em proteínas produzidas em células humanas (Borrebaeck et al., 1993, Borrebaeck, 1999). Um título muito elevado de anticorpos anti-Gal alfal-3Gal está presente em humanos (100 μρ/ηιΐ, Galili, 1993) causando uma rápida eliminação das proteínas (de murídeo) possuindo este resíduo nos seus glicanos.

Rapidamente se tornou aparente que para exercer um efeito, os doentes necessitam de ser tratados com doses muito elevadas de imunoglobulinas recombinantes durante períodos de tempo prolongados. Parece provável que as modificações pós-tradução em imunoglobulinas humanas ou humanizadas que não são produzidas em células humanas afectem fortemente a taxa de eliminação destes anticorpos da corrente sanguínea. 15 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ Não é claro o porquê das imunoglobulinas produzidas em células CHO necessitarem também de ser aplicadas em doses muito elevadas, uma vez que o residuo Gal alfal-3Gal não está presente nos glicanos em proteínas derivadas desta linha celular (Rother e Squinto, 1996). Por isso, é provável que outras modificações pós-tradução para além dos resíduos Gal alfal-3Gal estejam envolvidas em respostas imunitárias específicas em humanos contra imunoglobulinas completamente humanas ou humanizadas produzidas em tais células CHO. A arte ensina assim que é possível produzir anticorpos humanizados sem sequências proteicas derivadas de murídeo. No entanto, a actual geração de imunoglobulinas recombinantes difere ainda dos seus equivalentes humanos naturais, p. ex. em modificações pós-tradução tais como glicosilação e dobragem. Isto pode resultar em activação do sistema imunitário do doente e causar respostas indesejáveis que podem afectar a eficácia do tratamento. Assim, apesar do desenvolvimento de anticorpos quiméricos, os actuais sistemas de produção necessitam ainda de optimização para produzir anticorpos activos completamente humanos ou humanizados. É assim claramente desejável ter métodos para produção de anticorpos completamente humanos que se comportem concordantemente e que, adicionalmente, sejam produzidos a níveis mais elevados que os observados em células de mieloma humanas.

Assim, seria uma melhoria na arte proporcionar uma célula humana que produzisse um processamento proteico de tipo humano consistente como modificações pós-tradução e peri-tradução, tais como, mas não se limitando a, por exemplo glicosilação. Seria ainda vantajoso proporcionar um método para produção de uma célula de mamífero recombinante e imunoglobulinas de células de mamífero recombinantes em produção em larga escala. 0 presente invento proporciona por isso ainda um método para produzir pelo menos um domínio variável de uma imunoglobulina numa célula de mamífero recombinante, compreendendo proporcionar uma célula PER.C6 compreendendo ainda um ácido nucleico codificando a referida imunoglobulina, a cultura da referida célula num meio adequado e a colheita de 16 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ pelo menos um anticorpo monoclonal a partir da referida célula e/ou do referido meio.

Anteriormente foram encontradas poucas, se algumas, células humanas adequadas para produção de imunoglobulinas de qualquer modo reprodutível e susceptível de aumento de escala. As células do presente invento compreendem pelo menos uma proteína El adenoviral de imortalização e são capazes de crescer relativamente independentes de factores de crescimento exógenos.

Para além disso, estas células são capazes de produzir imunoglobulinas em quantidades significativas e são capazes de processar correctamente as imunoglobulinas geradas. 0 facto dos tipos celulares que foram utilizados para produção de imunoglobulinas serem derivados de tumores adiciona um risco extra ao trabalho com estas linhas celulares particulares e resulta em procedimentos de isolamento muito rigorosos para as imunoglobulinas para evitar actividade transformante ou material tumorigénico em quaisquer preparações. É por isso preferido empregar um método de acordo com o presente invento, pelo qual a referida célula é derivada de uma célula primária. Para ser capaz de crescer indefinidamente, uma célula primária necessita de ser imortalizada, o que no presente invento foi alcançado através da introdução de uma proteína El adenoviral. Para alcançar produção em larga escala (contínua) de imunoglobulinas através de cultura celular, é preferível ter células capazes de crescer sem a necessidade de ancoragem. As células do presente invento têm essa capacidade. A capacidade de crescer independentemente da ancoragem é melhorada quando as células compreendem no seu genoma uma sequência derivada de adenovírus codificando E2A (ou um derivado ou análogo ou fragmento funcional desta). Numa concretização preferida a sequência codificando E2A codifica uma E2A mutante sensível à temperatura, tal como tsl25. A referida célula pode, adicionalmente, compreender um ácido nucleico (p. ex., codificando tTa), que permite expressão regulada de um gene de interesse quando colocado sob o controlo de um promotor (p. ex., um promotor TetO). 0 ácido nucleico pode codificar uma cadeia pesada, uma cadeia pesada variável, uma cadeia leve e/ou uma cadeia leve 17 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ variável de uma imunoglobulina. Alternativamente, um ácido nucleico separado ou distinto pode codificar um ou mais domínios variáveis de uma Ig (ou um derivado, homólogo e/ou fragmento funcional desta), como um equivalente do primeiro ácido nucleico (descrito acima). Um ou mais ácidos nucleicos aqui descritos podem codificar um ScFv e pode ser humano ou humanizado. 0(s) ácido(s) nucleico (s) do presente invento é(são) de preferência colocado(s) sob o controlo de um promotor indutível (ou de um derivado funcional deste).

Para ter um sistema de produção limpo e seguro a partir do qual seja fácil isolar as imunoglobulinas desejadas, é preferido ter um método de acordo com o invento, em que a referida célula humana não inclui outras sequências adenovirais. A célula para os métodos e utilizações do invento é PER.C6 ou uma derivada desta tal como depositada sob o número ECACC 96022940. Verificou-se que PER.C6 era mais estável, particularmente no manuseamento, que, por exemplo, células 293 humanas transformadas imortalizadas através da região El adenoviral. As células PER.C6 foram extensivamente caracterizadas e documentadas, demonstrando um bom processo de escalonamento, crescimento em suspensão e independência de factores de crescimento.

Para além disso, as PER.C6 podem ser incorporadas numa suspensão de um modo altamente reprodutível, tornando-se particularmente adequadas para produção em larga escala. A este respeito, a linha celular PER.C6 foi caracterizada quanto a crescimento em biorreactor, onde pode crescer até densidades muito elevadas.

As células do presente invento, em particular PER.C6, podem ser vantajosamente cultivadas na ausência de soro derivado de animais ou de humanos ou de componentes séricos derivados de animais ou de humanos. Assim, o isolamento de anticorpos monoclonais é simplificado e a segurança é aumentada devido à ausência de proteínas humanas ou animais adicionais na cultura. A ausência de soro aumenta ainda a confiança no sistema uma vez a utilização de meios sintéticos tal como aqui contemplada, aumenta a reprodutibilidade. O invento proporciona ainda a utilização de uma célula PER.C6 recombinante para a produção de pelo menos um domínio variável 18 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ de uma imunoglobulina, célula esta que não produz proteínas adenovirais estruturais. 0 invento proporciona ainda uma utilização de acordo com o presente invento, em que a referida célula compreende ainda no seu genoma uma sequência codificando E2A (ou um derivado ou análogo ou fragmento funcional desta), de preferência em que a referida E2A é sensível à temperatura. Adicionalmente o presente invento proporciona um método de utilização do presente invento, em que a referida célula compreende ainda uma proteína de transactivação para a indução do referido promotor indutível. 0 invento proporciona também imunoglobulinas obteníveis através de um método de acordo com o presente invento ou através de uma utilização de acordo com o presente invento. As imunoglobulinas a expressar nas células do presente invento são conhecidas dos peritos na arte. Exemplos de imunoglobulinas recombinantes incluem, mas não se limitam a, Herceptina, Rituxano (Rituximab), UBS-54, CAMPATH-1H e 15C5. 0 presente invento proporciona ainda métodos para produção de pelo menos um domínio variável de uma imunoglobulina numa célula de PER.C6 recombinante utilizando a célula PER.C6 recombinante imortalizada do invento, cultivando a mesma num meio adequado e colhendo pelo menos um domínio variável de uma Ig seleccionada a partir da célula PER.C6 recombinante e/ou do meio. imunoglobulinas, domínios variáveis de imunoglobulinas ou derivados destes, podem ser utilizados para o tratamento terapêutico de mamíferos ou o fabrico de composições farmacêuticas.

Noutro aspecto o invento proporciona um método para produção de uma proteína virai que não uma proteína de adenovírus ou adenoviral para utilizar como uma vacina compreendendo proporcionar uma célula PER.C6 com um ácido nucleico codificando a referida proteína virai, a cultura da referida célula num meio adequado permitindo a expressão da referida proteína virai e a colheita da proteína virai a partir do referido meio e/ou célula. Até ao presente invento existiam poucas, se algumas células (humanas) que se tenham verificado adequadas para produzir proteínas virais para utilizar como vacinas de qualquer maneira reprodutível e 19 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ susceptível de aumento de escala e/ou com rendimentos suficientemente elevados e/ou facilmente purificável. Verificámos agora que células PER.C6, que compreendam no seu genoma sequências de El adenovirais, são capazes de produzir a proteína virai em quantidades significativas. A célula de acordo com o invento é derivada de uma célula HER primária humana que é imortalizada através de um produto génico do referido gene de El. Para ser capaz de crescer, uma célula primária necessita como é claro de ser imortalizada. Um bom exemplo de uma tal célula é uma derivada de um retinoblasto embrionário humano.

Em células de acordo com o presente invento é importante que as sequências do gene de El não se percam durante o ciclo celular. A referida sequência codificando pelo menos um produto génico do gene de El está presente no genoma da referida célula PER.C6 (humana). Por razões de cuidado com a segurança é melhor evitar sequências adenovirais desnecessárias nas células de acordo com o presente invento. É assim outra concretização do presente invento proporcionar células que não produzam proteínas estruturais adenovirais. No entanto, para alcançar produção de proteína virai em larga escala (contínua) através de cultura celular é preferido ter células capazes de crescer sem necessidade de ancoragem. As células do presente invento têm essa capacidade. Para ter um sistema de produção limpo e seguro a partir do qual seja fácil recuperar e, se desejável, purificar a proteína virai, é preferido ter um método de acordo com o presente invento, pelo qual a referida célula humana não compreende outras sequências adenovirais. A célula para os métodos e utilizações do presente invento é PER.C6 tal como depositada sob o número ECACC 96022940 ou uma derivada desta.

Assim o presente invento proporciona um método utilizando uma célula de acordo com o presente invento, em que a referida célula compreende ainda uma sequência codificando E2A ou um derivado ou análogo ou fragmento funcional desta, de preferência uma célula em que a referida sequência codificando E2A ou um derivado ou análogo ou fragmento funcional desta está presente no genoma da referida célula humana e de maior 20 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ preferência uma célula em que a referida sequência codificando E2A codifica uma E2A mutante sensível à temperatura.

Para além disso, tal como afirmado o presente invento proporciona também um método de acordo com o presente invento em que a referida célula (humana) é capaz de crescer em suspensão. O presente invento proporciona também um método em que a referida célula humana pode ser cultivada na ausência de soro. As células de acordo com o presente invento, em particular PER.C6, têm a vantagem adicional de poderem ser cultivadas na ausência de soro ou de componentes séricos. Assim o isolamento é fácil, a segurança é aumentada e a confiança no sistema é boa (os meios sintéticos são os melhores em reprodutibilidade). As células PER.C6 humanas do invento são capazes de modificações pós-tradução e peri-tradução e de montagem normais. Isto significa que são muito adequadas para preparação de proteína virais para utilizar em vacinas.

Assim o presente invento proporciona um método de acordo com o presente invento, em que a referida proteína virai compreende uma proteína que sofre modificação pós-tradução e/ou peri-tradução, especialmente em que as referidas modificações compreendem glicosilação. A vacina pode ser utilizada para a vacinação de humanos. No entanto, a vacina é também eficaz em animais. Nesta concretização a vacina é de preferência produzida de acordo com o presente invento em que a referida célula é derivada da mesma espécie da qual é derivada a proteína virai na vacina. Uma proteína virai pode ser a proteína virai inteira ou um equivalente funcional desta. Um equivalente funcional de uma proteína virai é pelo menos uma parte imunogénica da proteína virai. Um bom exemplo de uma vacina virai que tem sido um incómodo produzir de qualquer maneira de confiança é a da vacina da gripe. O presente invento proporciona um método de acordo com o presente invento em que as referidas proteínas virais compreendem pelo menos uma de uma neuraminidase e/ou uma hemaglutinina do vírus da gripe. Outras proteínas virais (subunidades) que podem ser produzidas nos métodos de acordo com o presente invento incluem proteínas de enterovírus, tais como rinovírus, aftovírus ou vírus da poliomielite, 21 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ herpesvírus, tais como o vírus de herpes simples, vírus da pseudo-raiva ou vírus de herpes bovino, ortomixovírus, tais como o vírus influenza, um paramixovírus, tal como o vírus da doença de Newcastle, vírus sincicial respiratório, vírus da papeira ou um vírus do sarampo, retrovírus, tal como o vírus da imunodeficiência humana ou um parvovírus ou um papovavírus, rotavírus ou um coronavírus, tal como o vírus de gastroenterite transmissível ou um flavivírus, tal como o vírus da encefalite transmitido pela carraça ou o vírus da febre-amarela, um togavírus, tal como o vírus da rubéola ou o vírus da encefalomielite equina oriental, ocidental ou venezuelana, um vírus causador de hepatite, tal como o vírus da hepatite A ou da hepatite B, um pestivírus, tal como o vírus da peste suína ou um rabdovírus, tal como o vírus da raiva. 0 invento proporciona também a utilização de uma célula PER.C6 humana, célula esta que não produz proteínas adenovirais estruturais, para a produção de pelo menos uma proteína virai para utilizar numa vacina. É claro que para uma tal utilização as células preferidas nos métodos de acordo com o presente invento são também as preferidas. 0 presente invento proporciona também os produtos resultantes dos métodos e utilizações de acordo com o presente invento, especialmente proteínas virais obteníveis de acordo com essas utilizações e/ou métodos, especialmente quando contidas numa composição farmacêutica compreendendo excipientes e nalguns formatos (subunidades) adjuvantes adequados. A dosagem e os modos de administração podem ser seleccionados através de testes clínicos normais na medida em que não estão ainda disponíveis através das vacinas já registadas.

Assim o presente invento proporciona também uma proteína virai para utilizar numa vacina obtenível através de um método ou através de uma utilização de acordo com o presente invento, sendo a referida proteína virai isenta de qualquer material proteináceo de mamífero não humano, e uma formulação farmacêutica compreendendo uma tal proteína virai.

Numa concretização preferida o presente invento proporciona vacinas da gripe obteníveis através de um método 22 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ de acordo com o presente invento ou através uma utilização de acordo com o presente invento.

EXEMPLOS

Para ilustrar o presente invento, são proporcionados os seguintes exemplos, que não se pretende que limitem o âmbito do presente invento. A molécula de Eritropoietina humana (EPO) contém quatro cadeias de hidratos de carbono. Três contêm ligações em N, a asparaginas, e uma contém uma ligação em 0, a um residuo de serina. A importância da glicosilação na actividade biológica da EPO foi bem documentada (Delorme et ai., 1992; Yamaguchi et al., 1991). 0 ADNc codificando a EPO humana foi clonado e expresso em células PER.C6 e células PER.C6/E2A, foi demonstrada a expressão e foi analisado o padrão de glicosilação.

Exemplo 1: Construção de vectores de expressão básicos. 0 plasmideo pcDNA3.1/Hygro(-) (Invitrogen) foi digerido com NruI e EcoRV, desfosforilado nos terminais 5' por Fosfatase Alcalina de Camarão (SAP, GIBCO Life Tech.) e o fragmento plasmidico sem o promotor e o iniciador inicial imediato de citomegalovirus (CMV) foi purificado do gel. 0 plasmideo pAdApt, contendo o estimulador/promotor de CMV inteiro (-735 a +95) a seguir às sequências derivadas de adenovirus sobrepostas para produzir Adenovírus recombinante, foi digerido com Avrll, preenchido com polimerase Klenow e digerido com Hpal; o fragmento contendo o estimulador e promotor de CMV foi purificado sobre gel de agarose. Este fragmento de estimulador e promotor de CMV foi ligado extremidade cega/extremidade cega ao fragmento NruI/EcoRV de pcDNA3.1/Hygro(-). 0 plasmideo resultante foi designado pcDNA2 000/Hyg(-). O plasmideo pcDNA2000/Hyg(-) foi digerido com Pmll e o plasmideo linearizado sem o gene marcador de resistência à higromicina foi purificado do gel e novamente ligado. O plasmideo resultante foi designado pcDNA2000. O plasmideo pcDNA2000 foi digerido com Pmll e desfosforilado por SAP em ambos os terminais. O plasmideo pIG-GC9 contendo o ADNc de DHFR humano de tipo selvagem (Havenga et al., 1998) foi 23 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ utilizado para obter o gene de DHFR de tipo selvagem através de reacção em cadeia da polimerase (PCR) com os locais Pmll não codificantes introduzidos a montante e a jusante do ADNc. Os iniciadores de PCR que foram utilizados foram DHFR up (SEQ ID NO: 1) : 5'-GAT CCA CGT GAG ATC TCC ACC ATG GTT GGT TCG CTA AAC TG-3' e DHFR DOWN (SEQ ID NO:2): 5'-GAT CCA CGT GAG ATC TTT AAT CAT TCT TCT CAT ATAC-3'. O produto de PCR foi digerido com Pmll e utilizado para ligação em pcDNA2000 (digerido com Pmll e desfosforilado por SAP) para obter pcDNA2000/DHFRwt (Fig. 1) . As sequências de tipo selvagem e os locais de clonagem utilizados correctamente foram confirmados através de sequenciação da cadeia dupla. Para além disso, foi utilizada uma versão mutante do gene DHFR humano (DHFRm) para alcançar uma resistência a metotrexato 10000 vezes superior em PER.C6 e PER.C6/E2A através de selecção de uma possível integração do transgene numa região genómica com elevada actividade de transcrição. Este mutante possui uma substituição de aminoácidos na posição 32 (fenilalanina para serina) e na posição 159 (leucina para prolina) introduzida pelo procedimento de PCR. Foi utilizada PCR no plasmídeo pIG-GC12 (Havenga et al., 1998) para obter a versão mutante do DHFR humano. A clonagem deste mutante é comparável com a de DHFR de tipo selvagem. O plasmídeo obtido com DHFR mutante foi designado pcDNA2000/DHFRm. pIPspAdaptô (Galapagos) foi digerido com as enzimas de restrição Agei e BamEl. O fragmento de poli-ligação resultante tem a seguinte sequência (SEQ ID NO:3): 5'-ACC GGT GAA TTC GGC GCG CCG TCG ACG ATA TCG ATC GGA CCG ACG CGT TCG CGA GCG GCC GCA ATT CGC TAG CGT TAA CGG ATC C-3'. Os locais de reconhecimento Agei e BamEl utilizados estão sublinhados. Este fragmento contém vários locais de reconhecimento por enzimas de restrição únicos e foi purificado em gel de agarose e ligado a um plasmídeo pcDNA2000/DHFRwt digerido com Agei/BamEl e purificado em gel de agarose. O vector resultante foi designado pcDNA2001/DHFRwt (Fig. 2).

pIPspAdapt7 (Galapagos) é digerido com as enzimas de restrição Agei e BamEl e tem a seguinte sequência (SEQ ID NO:4): 5'-ACC GGT GAA TTG CGG CCG CTC GCG AAC GCG TCG GTC CGT ATC GAT ATC GTC GAC GGC GCG CCG AAT TCG CTA GCG TTA ACG GAT CC-3'. Os locais de reconhecimento AgeI e BamEl utilizados 24 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ estão sublinhados. 0 fragmento de poli-ligação contém vários locais de reconhecimento por enzimas de restrição únicos (diferentes de pIPspAdapt6), é purificado em gel de agarose e ligado a um plasmídeo pcDNA2000/DHFRwt digerido com Agei/Bamttl e purificado em gel de agarose. Isto resulta em pcDNA2002/DHFRwt (Fig. 3). pcDNA2000/DHFRwt foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Pvull. Existem dois locais Pvuli presentes neste plasmídeo e a clonagem foi efectuada no local entre poli(A) de SV40 e ColEl, não no local Pvull a jusante de poli (A) de BGH. Uma mistura digerida num único local do plasmídeo foi desfosforilada com SAP e tornada de extremidades cegas com a enzima Klenow e purificada em gel de agarose. pcDNA2001/DHFRwt foi digerido com as enzimas de restrição Muni e Pvull e preenchido com Klenow e nucleótidos livres para ter ambas as extremidades cegas. 0 fragmento resultante contendo promotor de CMV-segmento de ligação-poli(A) de BGH foi isolado em gel e separado do vector. Este fragmento foi ligado no vector parcialmente digerido e desfosforilado e verificado quanto à sua orientação e local de inserção. 0 plasmídeo resultante foi designado pcDNAs3000/DHFRwt (Fig. 4).

Exemplo 2: Construção de vectores de expressão de EPO. 0 ADNc de EPO humano inteiro foi clonado, empregando os iniciadores oligonucleotídicos epo-START (SEQ id no:5): 5' aaa AAG GAT CCG CCA CCA TGG GGG TGC ACG AAT GTC CTG CCT G-3' e

EPO-STOP (SEQ ID NO:6): 5' AAA AAG GAT CCT CAT CTG TCC CCT GTC CTG CAG GCC TC-3' (Cambridge Bioscience Ltd) numa PCR sobre uma biblioteca de ADNc de fígado de adulto humano. 0 fragmento amplificado foi clonado em pUCl8 linearizado com BamHl. A sequência foi verificada através de sequenciação da cadeia dupla. Este plasmídeo, contendo o ADNc de EPO em pUC18 foi digerido com BamHl e a inserção de EPO foi purificada a partir de gel de agarose. Os plasmídeos pcDNA2000/DHFRwt e pcDNA2000/DHFRm foram linearizados com BamHl e desfosforilados na extremidade pendente 5' por SAP e os plasmídeos foram purificados a partir de gel de agarose. 0 fragmento de ADNc de EPO foi ligado nos locais BamHl de pcDNA2000/DHFRwt e pcDNA2000/DHFRm; os plasmídeos resultantes foram designados pEP02000/DHFRwt (Fig. 5) e pEP02000/DHFRm. 25 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Exemplo 3: Construção de vectores de expressão de UBS-54.

Os domínios constantes (CH-1, -2 e -3) da cadeia pesada do gene da imunoglobulina G1 humana (IgGl) incluindo as sequências de intrões e do dominio de união ("charneira") foram gerados por PCR utilizando um iniciador a montante e um a jusante. A sequência do iniciador a montante (CAMH-UP; SEQ ID NO:17) é 5'-GAT CGA TAT CGC TAG CAC CAA GGG CCC ATC GGT C~ 3', na qual os nucleótidos de ligação estão representados em itálico e os dois locais sequenciais de reconhecimento por enzimas de restrição (EcoRV e NheI) estão sublinhados. A sequência do iniciador a jusante (CAMH-DOWN; SEQ ID NO: 18) é: 5'-GAT CGT TTA AAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG-3' , na qual os nucleótidos de ligação estão representados em itálico e o local de reconhecimento pela enzima de restrição Pmel introduzido está sublinhado. A ordem na qual os domínios da cadeia pesada da IgGl humana foram arranjados é tal como se segue: CHl-intrão-Charneira-intrão-CH2-intrão-CH3. A PCR foi efectuada num plasmídeo (pCMgamma NEO Skappa Vgamma Cgamma hu) contendo a cadeia pesada de um anticorpo humanizado dirigido contra o dímero D do fibrinogénio humano (Vandamme et al., 1990). Este anticorpo foi designado 15C5 e a humanização foi efectuada com a introdução dos domínios constantes humanos incluindo as sequências de intrão (Bulens et al., 1991). A PCR resultou num produto de 1621 nucleótidos. Os locais NheI e Pmel foram introduzidos para fácil clonagem no segmento de poli-ligação de pcDNA2000/Hyg(-). O local NheI codificava dois aminoácidos (Ala e Ser), que são parte da região constante CHI, mas que não hibridaram com o ADN presente no molde (Crowe et al., 1992). O produto de PCR foi digerido com as enzimas de restrição NheI e Pmel, purificado em gel de agarose e ligado num pcDNA2000/Hygro(-) digerido com NheI e Pmel e purificado em gel de agarose. Isto resultou no plasmídeo pHC2000/Hyg(-) (Fig. 7), que pode ser utilizado para ligar os domínios constantes da cadeia pesada humana, incluindo intrões, a 26 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ qualquer região variável possivel de qualquer cadeia pesada de imunoglobulina identificada para humanização. 0 domínio constante da cadeia leve do gene da imunoglobulina humana (IgGl) foi gerado por PCR utilizando um iniciador a montante e um a jusante: A sequência do iniciador a montante (CAML-UP; SEQ ID NO: 19) é 5'-GAT CCG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT C-3', na qual os nucleótidos de ligação estão representados em itálico e um local de reconhecimento pela enzima de restrição SunI introduzido está sublinhado. A sequência do iniciador a jusante (CAML-DOWN; SEQ ID NO: 20) é 5'-GAT CGT TTA AAC CTA ACA CTC TCC CCT GTT G-3', na qual os nucleótidos de ligação estão em itálico e um local de reconhecimento pela enzima de restrição PmeI introduzido está sublinhado. A PCR foi efectuada num plasmídeo (pCMkappa DHFR13 15C5 kappa humanizado) possuindo a sequência sinal de murídeo e a região variável de murídeo da cadeia leve de 15C5 ligada ao domínio constante da cadeia leve da IgGl humana (Vandamme et al., 1990; Bulens et al., 1991). A PCR resultou num produto de 340 nucleótidos. Os locais SunI e PmeI foram introduzidos para clonagem no segmento de poli-ligação de pcDNA2001/DHFRwt. O local SunI codificava dois aminoácidos (Arg e Thr) dos quais o resíduo de treonina faz parte da região constante das cadeias leves da imunoglobulina humana, enquanto que o resíduo de arginina faz parte da região variável de CAMPATH-1H (Crowe et al., 1992). Isto permitiu subsequente clonagem a 3' no local SunI, que era único no plasmídeo. O produto de PCR foi digerido com as enzimas de restrição SunI e Pme I purificadas em agarose, ligado num pcDNA2001/DHFRwt digerido com Bamhl, PmeI e purificado em gel de agarose, que foi tornado de extremidades cegas através da enzima Klenow e nucleótidos livres. A ligação na orientação correcta resultou em perda do local BamEl na extremidade 5' e na conservação dos locais SunI e PmeI. O plasmídeo resultante foi designado pLC2001/DHFRwt (Fig. 8) que pode ser utilizado para ligar o domínio constante da cadeia leve humana a qualquer região variável possível de qualquer cadeia leve de imunoglobulina humana identificada para humanização. 27 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ pNUT-C gamma (Huls et al., 1999) contém os domínios constantes, intrões e região charneira da cadeia pesada da igGl humana (Huls et al., 1999) e recebeu a montante do primeiro domínio constante o domínio variável da cadeia gama do anticorpo monoclonal completamente humanizado UBS-54 antecedido pela seguinte sequência peptídica de comando (SEQ ID NO:21): MACPGFLWALVISTCLEFSM (sequência (SEQ ID NO:22): 5'-ATG GCA TGC CCT GGC TTC CTG TGG GCA CTT GTG ATC TCC ACC TGT CTT GAA TTT TCC ATG-3') · Isto resultou numa inserção de aproximadamente 2 kb de comprimento. A cadeia gama inteira foi amplificada por PCR utilizando um iniciador a montante (UBS-UP) e o iniciador a jusante CAMH-DOWN. A sequência de UBS-UP (SEQ ID NO:23) é tal como se segue: 5'-GAT CAC GCG TGC TAG CCA CCA TGG CAT GCC CTG GCT TC-3' na qual os locais MluI e NheI introduzidos estão sublinhados e a sequência de Kozak perfeita está em itálico. O produto de PCR resultante foi digerido com as enzimas de restrição NheI e PmeI, purificado em gel de agarose e ligado ao plasmídeo pcDNA2000/Hygro(-) que é também digerido com Nhel e PmeI, desfosforilado com tSAP e purificado em gel. 0 plasmídeo resultante foi designado pUBS-Heavy2000/Hyg(-) (Fig. 9). pNUT-C kappa contém o domínio constante da cadeia leve da capa de IgGl humana (Huls et al., 1999) e recebeu o domínio variável da cadeia capa do anticorpo monoclonal completamente humanizado UBS-54 antecedida pelo seguinte péptido de comando: MACPGFLWALVISTCLEFSM (sequência: 5'-ATG GCA TGC CCT GGC TTC CTG TGG GCA CTT GTG ATC TCC ACC TGT CTT GAA TTT TCC ATG-3', para detalhes sobre o plasmídeo ver UBiSys). Isto resultou numa inserção de aproximadamente 1,2 kb de comprimento. A inserção inteira foi amplificada por PCR utilizando o iniciador a montante UBS-UP e o iniciador a jusante CAML-DOWN, modificando deste modo o local de início da tradução. 0 produto de PCR resultante foi digerido com as enzimas de restrição NheI e PmeI, purificado em gel de agarose e ligado a pcDNA2001/DHFRwt que foi também digerido com Nhel e PmeI, desfosforilado por tSAP e purificado em gel, resultando em pUBS-Light2001/DHFRwt (Fig. 10). Para remover o intrão extra que se situa entre o domínio variável e o primeiro domínio constante que está presente em pNUT-Cgamma e para ligar o péptido sinal e o domínio variável aos domínios constantes de tipo selvagem da cadeia pesada da IgGl humana, sem vários polimorfismos presentes no domínio constante 28 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ carboxi-terminal em pNUT-Cgamma, é gerado um produto de PCR com o iniciador UBS-UP e o iniciador UBSHV-DOWN que tem a seguinte sequência (SEQ ID NO:24): 5'-GAT CGC TAG CTG TCG AGA CGG TGA CCA G-3', na qual o local Nhei introduzido está sublinhado e os nucleótidos de ligação estão em itálico. 0 produto de PCR resultante é digerido com a enzima de restrição Nhei, purificado em gel e ligado a um plasmideo pHC2000/Hyg(-) digerido com Nhei e desfosforilado com SAP que foi purificado em gel. 0 plasmideo com a inserção na orientação e enquadramento de leitura correctos é designado pUBS2-Heavy2000/Hyg(-) (Fig. 11). Para a remoção de um intrão extra que se situa entre o domínio variável e o domínio constante que está presente em pNUT-Ckappa e para ligar o péptido sinal e o domínio variável ao domínio constante de tipo selvagem da cadeia leve da IgGl humana, foi gerado um fragmento de PCR com o iniciador UBS-UP e o iniciador UBSLV-DOWN que tem a seguinte sequência (SEQ ID NO: 25): 5'-GAT CCG TAC GCT TGA TCT CCA CCT TGG TC-3', na qual o local SunI introduzido está sublinhado. Depois o produto de PCR resultante foi digerido com as enzimas de restrição MluI e SunI, purificado em gel e ligado a um plasmideo pLC2001/DHFRwt digerido com MluI e SunI que foi purificado em gel. O plasmideo resultante foi designado pUBS2-Light2001/DHFRwt (Fig. 12). 0 produto de PCR da cadeia pesada inteira de UBS-54 é digerido com as enzimas de restrição Nhei e PmeI e tornado de extremidades cegas com a enzima Klenow. Este fragmento é ligado ao plasmideo pcDNAs3000/DHFRwt que é digerido com a enzima de restrição Bstxi, tornado de extremidades cegas, desfosforilado por SAP e purificado em gel. 0 plasmideo com a inserção da cadeia pesada é designado pUBS-Heavy3000/DHFRwt. Subsequentemente, o produto de PCR da cadeia leve é digerido com as enzimas de restrição MluI e PmeI, tornado de extremidades cegas, purificado em gel e ligado a pUBS-Heavy3000/DHFRwt que é digerido com Hpal, desfosforilado por tSAP e purificado em gel. 0 vector resultante é designado pUBS-3000/DHFRwt (Fig. 13). 0 gene que codifica a cadeia pesada de UBS-54 sem um intrão entre o domínio variável e a primeira região constante e com uma região constante carboxi-terminal de tipo selvagem (2031 nucleótidos) é purificado em gel após digestão de pUBS2-2000/Hyg(-) com AcoRl e PmeI e tratamento com a enzima Klenow e nucleótidos livres para tornar as extremidades do local EcoRI cegas. Subsequentemente, a inserção é ligada a um 29 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ plasmídeo pcDNAs3000/DHFRwt que é digerido com BstxI, tornado de extremidades cegas, desfosforilado com SAP e purificado em gel. 0 plasmídeo resultante é designado pUBS2-Heavy3000/DHFRwt. pUBS2-Light2001/DHFRwt é então digerido com EcoRV e Pme I e a inserção de 755 nucleótidos contendo o péptido sinal ligado ao domínio variável da cadeia capa de UBS-54 e o domínio constante da cadeia capa da IgGl humana sem uma sequência de intrão é purificada em gel e ligada a pUBS2-Heavy3000/DHFRwt que é digerido com HpaI, desfosforilado com tSAP e purificado em gel. 0 plasmídeo resultante é designado pUBS2-3000/DHFRwt (Fig. 14). 0 plasmídeo pRc/CMV (Invitrogen) foi digerido com a enzima de restrição BstBI, tornado de extremidades cegas com a enzima Klenow e subsequentemente digerido com a enzima XmaI. 0 fragmento contendo o gene de resistência à Neomicina foi purificado em gel de agarose e ligado ao plasmídeo pUBS-Light2001/DHFRwt que foi digerido com as enzimas de restrição Xmal e PmlI, seguido de desfosforilação com SAP e purificado em gel para remover o ADNc de DHFR. 0 plasmídeo resultante foi designado pUBS-Light2001/Neo. 0 fragmento foi também ligado a um plasmídeo pcDNA2001/DHFRwt digerido com Xmal/Pmll e purificado em gel resultando em pcDNA2001/Neo. 0 produto de PCR do domínio variável de UBS-54 e o produto de PCR do domínio constante digerido e purificado foram utilizados numa ligação de três pontos com um pcDNA2001/Neo digerido com Mlul/Pmel.

Exemplo 4: Construção de vectores de expressão de CAMPATH-1H

Cambridge Bioscience Ltd. (UK) gera um fragmento de 396 nucleótidos contendo uma sequência de Kozak perfeita seguida pela sequência sinal e a região variável da cadeia leve de CAMPATH-1H publicada (Crowe et al.r 1992). Este fragmento contém, na extremidade 5', um local HindIII introduzido e único e, na extremidade 3', um local SunI introduzido e único e é clonado num vector vaivém apropriado. Este plasmídeo é digerido com HindIII e SunI e o fragmento da cadeia leve de CAMPATH-1H resultante é purificado em gel e ligado num pLC2001/DHFRwt digerido com HindIII/SunI e purificado em gel de agarose. 0 plasmídeo resultante é designado pCAMPATH-Light2001/DHFRwt. Cambridge Biosciences 30 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Ltd. (UK) gerou um fragmento de 438 nucleótidos contendo uma sequência de Kozak perfeita seguida pela sequência sinal e a região variável publicada da cadeia pesada de CAMPATH-1H (Crowe et al., 1992), clonado num vector de clonagem apropriado. Este produto contém um local de reconhecimento pela enzima de restrição HindiII único na extremidade 5' e um local de reconhecimento pela enzima de restrição Nhel único na extremidade 3'. Este plasmideo foi digerido com HindIII e Nhel e o fragmento da cadeia pesada de CAMPATH-lH resultante foi purificado em gel e ligado num pHC2000/Hyg(-) purificado e digerido com Hindi II/Nhel. O plasmideo resultante foi designado pCAMPATH-Heavy2000/Hyg(-).

Exemplo 5: Construção de vectores de expressão de 15C5 A cadeia pesada da versão humanizada do anticorpo monoclonal 15C5 dirigido contra o fragmento do dimero D da fibrina humana (Bulens et al., 1991; Vandamme et al., 1990) consistindo nos dominios constantes humanos incluindo sequências de intrões, a região charneira e as regiões variáveis precedidas pelo péptido sinal da cadeia leve capa de 15C5, é amplificada por PCR no plasmideo "pCMgamma Neo Skappa Vgamma Cgamma hu" como molde utilizando CAMH-DOWN como iniciador a jusante e 15C5-UP como iniciador a montante. 15C5-UP tem a seguinte sequência (SEQ ID NO:26): 5'-GA TCA CGC GTG CTA GCC ACC ATG GGT ACT CCT GCT CAG TTT CTT GGA ATC-3' , na qual os locais de reconhecimento pelas enzimas de restrição MluI e Nhel estão sublinhados e a sequência de Kozak perfeita está em itálico. Para introduzir correctamente um contexto de Kozak adequado, a adenina na posição +4 (a adenina no codão de inicio ATG é +1) é substituída por uma guanina resultando numa mutação de um aminoácido arginina num glicina. Para evitar dimerização dos iniciadores, a posição +6 da guanina é substituída por uma timina e a posição +9 da citosina é

substituída por timina. Esta última mutação deixa o resíduo de treonina intacto. O produto de PCR resultante foi digerido com as enzimas de restrição Nhel e PmeI, purificado em gel e ligado a um pcDNA2000/Hygro(-) digerido com Nhel e PmeI, que é desfosforilado por SAP e purificado em gel de agarose. O plasmideo resultante é designado pl5C5-Heavy2000/Hyg(-) . A cadeia leve da versão humanizada do anticorpo monoclonal 15C5 dirigido contra o fragmento do dimero D da fibrina humana 31 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ (Bulens et al., 1991; Vandamme et al., 1990) consistindo no domínio constante humano e regiões variáveis precedidos por um péptido sinal de 20 aminoácidos, é amplificada por PCR num pCMkappa DHFR13 15C5kappa hu como molde, utilizando CAML-DOWN como iniciador a jusante e 15C5-UP como iniciador a montante. O produto de PCR é digerido com as enzimas de restrição NheI e PmeI, purificado em gel e ligado a pcDNA2001/DHFRwt digerido com Nhel e PmeI, que é desfosforilado por SAP e purificado em gel de agarose. O plasmídeo resultante é designado pl5C5-Light2001/DHFRwt.

Exemplo 6: Estabelecimento dos níveis de selecção de metotrexato, higromicina e G418.

Foram semeadas PER.C6 e PER.C6/E2A a diferentes densidades. A concentração de partida de metotrexato (MTX) nestes estudos de sensibilidades variou entre 0 nM e 2500 nM. Foi determinada a concentração que foi logo letal para ambas as linhas celulares; quando as células foram semeadas a densidades de 100000 células por poço numa caixa de 6 poços, os poços ficaram ainda 100% confluentes a 10 nM, aproximadamente 90-100% confluentes a 25 nM, enquanto que a maioria das células foi morta à concentração de 50 nM e acima após 6 dias a 15 dias de incubação. Estes resultados estão resumidos na tabela 1. As células PER.C6 foram testadas quanto à sua resistência a uma combinação de Higromicina e G418 para seleccionar colónias estáveis que crescessem e que expressassem as cadeias pesada e leve para os respectivos anticorpos monoclonais recombinantes codificados por plasmídeos possuindo um gene de resistência à higromicina ou um gene de resistência à neomicina. Quando as células eram postas a crescer em meio normal contendo 100 μρ/ιηΐ de higromicina e 250 μρ/ιηΐ de G418 as células não transfectadas eram mortas e as colónias estáveis podiam aparecer (ver exemplo 7). São semeadas células CHO-dhfr ATCC:CRL9096 a diferentes densidades no seu respectivo meio de cultura. A concentração de partida de metotrexato nestes estudos de sensibilidade varia de aproximadamente 0,5 nM a 500 nM. A concentração, que é logo letal para a linha celular, é determinada e subsequentemente utilizada directamente após selecção de 32 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ crescimento em higromicina no caso de selecção da cadeia pesada de igG (hyg) e de selecção da cadeia leve (dhfr).

Exemplo 7: Transfecção de vectores de expressão de EPO para obter linhas celulares estáveis. Células e linhas celulares PER.C6 e PER.C6/E2A foram semeadas em 40 caixas de cultura de tecidos (10 cm de diâmetro) com aproximadamente 2-3 milhões de células/caixa e foram mantidas de um dia para o outro sob as suas respectivas condições (concentração de CO2 de 10% e temperatura, que é de 39°C para PER.C6/E2A e de 37°C para PER.C6). No dia seguinte, as transfecções foram todas efectuadas a 37°C utilizando Lipofectamina (Gibco). Após substituição com meio fresco (DMEM) após 4 horas, as células PER.C6/E2A foram novamente transferidas para 39°C, enquanto que as células PER.C6 foram mantidas as 37°C. Vinte caixas de cada linha celular foram transfectadas com 5 μρ de pEP02000/DHFRwt digerido com Seal e vinte caixas foram transfectadas com 5 μg de pEPO2000/DHFRm digerido com Seal todas de acordo com protocolos padrão. Outras 13 caixas serviram como controlos negativos para morte por metotrexato e a eficiência de transfecção foi de aproximadamente 50%. No dia seguinte, foi adicionado MTX às caixas em concentrações variando entre 100 e 1000 nM para DHFRwt e 50000 e 500000 nM para DHFRm dissolvido em meio contendo FBS dialisado. As células foram incubadas durante um período de 4-5 semanas. O meio de tecidos (incluindo MTX) foi mudado cada dois a três dias. As células foram monitorizadas diariamente quanto a morte, comparando entre controlos positivos e negativos. As colónias que cresceram foram apanhadas e subcultivadas. Não se conseguiram subcultivar clones positivos a partir dos transfectantes que receberam o gene de DHFR mutante muito provavelmente devido a efeitos tóxicos das elevadas concentrações de MTX que foram aplicadas. Das células PER.C6 e PER.C6/E2A que foram transfectadas com o gene de DHFR de tipo selvagem, apenas se pôde estabelecer linhas celulares nas primeiras passagens quando as células foram criadas em MTX 100 nM, embora aparecessem colónias em caixas com MTX 250 e 500 nM. Estes clones não eram viáveis durante a subcultura e foram descartados. 33 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Exemplo 8: Subcultura de células transfectadas.

De cada linha celular, aproximadamente 50 colónias seleccionadas que eram resistentes à concentração limiar de MTX foram subsequentemente postas a crescer em placas de 96 poços, 24 poços, 6 poços e balão T25 no seu respectivo meio mais MTX. Quando as células alcançaram o crescimento em balões de cultura de tecidos T25 pelo menos um frasco de cada clone foi congelado e armazenado e foi subsequentemente testado quanto a produção de EPO humana recombinante. Para isto, foi utilizado o estojo comercial de ELISA de R&D Systems (Quantikine IVD human EPO, Quantitative Colorimetric Sandwich ELISA, n.° de cat. DEP00) . Uma vez que os diferentes clones pareciam ter diferentes características de crescimento e curvas de crescimento, foi estabelecido um padrão para a produção de EPO tal como se segue: No dia 0 as células foram semeadas em balões de cultura de tecidos T25 em concentrações que variaram entre 0,5 e 1,5 milhões por balão. No dia 4 o sobrenadante foi tomado e utilizado no ELISA de EPO. A partir deste foi estabelecido o nível de produção como unidades ELISA por milhão de células semeadas por dia (U/lE6/dia). Vários destes clones são dados na tabela 2. A seguinte selecção de clones bons produtores foi baseada em expressão elevada, comportamento em cultura e viabilidade. Para permitir verificações da viabilidade a longo prazo, do crescimento em suspensão em garrafas rolantes e biorreactor durante períodos de tempo prolongados, foram congelados mais frascos dos clones melhores produtores e os segundos melhores produtores de cada linha celular foram seleccionados para mais investigações P8, P9, E17 e E55 em que "P" é de PER.C6 e "E" é de PER.C6/E2A. Estes clones são subcultivados e sujeitos a doses crescentes de metotrexato num período de tempo de dois meses. A concentração começa na concentração limiar e aumenta até aproximadamente 0,2 mM. Durante estes dois meses, são efectuadas regularmente experiências de ELISA de EPO para detectar um aumento na produção de EPO. À maior concentração de metotrexato, é seleccionado o melhor produtor estável e comparado com as quantidades do melhor clone de CHO e utilizado para banco celular (RL). De todos os outros clones

são congelados 5 frascos. O número de cópias de ADNc de EPO amplificadas é detectado através de "Southern blotting". 34 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Exemplo 9: Produção de EPO em biorreactores A linha celular de PER.C6 estável transfectada produtora de EPO com melhor desempenho, P9, foi trazida para suspensão e escalada até fermentadores de 1 a 2 litros. Para obter P9 em suspensão, as células aderentes foram lavadas com PBS e subsequentemente incubadas com meio JRH ExCell 525 para PER.C6 (JRH), após o que as células se soltam do frasco e formam a cultura em suspensão. As células foram mantidas a duas concentrações de MTX: 0 nM e 100 nM. Os niveis gerais de produção de EPO que foram alcançados a estas concentrações (em garrafas rolantes) foram respectivamente de 1500 e 5700 unidades por milhão de células semeadas por dia. Embora os menores rendimentos na ausência de MTX possam ser explicados pela remoção do ADN integrado, parece que existe um efeito de desligar do ADN integrado uma vez que as células que são mantidas a concentrações menores de MTX durante maiores períodos de tempo são capazes de alcançar os seus rendimentos anteriores quando são novamente transferidas para concentrações de MTX de 100 nM (ver exemplo 11).

As células P9 em suspensão cresceram normalmente com MTX 100 nM e foram utilizadas para inoculação de biorreactores. Foram testados dois cenários de biorreactor: Perfusão e culturas em lotes repetidos. A. Perfusão num biorreactor de 2 litros.

As células foram semeadas a uma concentração de 0,5xl06 células por ml e a perfusão foi iniciada no dia 3 após as células alcançarem um densidade de aproximadamente 2,3xl06 células por ml. A taxa de perfusão foi de 1 volume por 24 horas com uma sangria de aproximadamente 250 ml por

24 horas. Com este cenário, as células P9 mantiveram uma densidade constante de aproximadamente 5xl06 células por ml e uma viabilidade de quase 95% durante mais de um mês. A concentração de EPO foi determinada regularmente e é mostrada na Figura 15. No biorreactor de 2 litros perfundido as células P9 foram capazes de manter um nível de produção de aproximadamente 6000 unidades ELISA por ml. Com uma taxa de perfusão de 1 volume de trabalho por dia (1,5 a 1,6 litros), 35 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ isto significa que neste cenário de 2 litros as células P9 produziram aproximadamente lxlO7 unidades por dia por biorreactor de 2 litros na ausência de MTX. B. Lotes repetidos num biorreactor de 2 litros.

As células P9 em suspensão que foram criadas em garrafas rolantes foram utilizadas para inocular um biorreactor de 2 litros na ausência de mtx e foram deixadas a crescer até uma densidade de aproximadamente 1,5 milhões de células por ml após o que um terço da população foi removido (+ 1 litro por 2 a 3 dias) e a restante cultura foi diluída com meio fresco para alcançar novamente uma densidade de 0,5 milhões de células por ml. Este procedimento foi repetido durante 3 semanas e o volume de trabalho foi mantido a 1,6 litros. As concentrações de EPO no meio removido foram determinadas e são mostradas na Figura 16. A concentração média foi de aproximadamente 3000 unidades ELISA por ml. Com um período médio de 2 dias após o qual a população foi diluída, isto significa que neste cenário de 2 litros as células P9 produziram aproximadamente 1,5χ106 unidades por dia na ausência de MTX. C. Lotes repetidos num biorreactor de 1 litro com diferentes parâmetros de concentração de oxigénio dissolvido, temperatura e pH. Células P9 frescas em suspensão foram postas a crescer na presença de MTX 100 nM em garrafas rolantes e utilizadas para inoculação de 4 biorreactores de 1 1 até uma densidade de 0,3 milhões de células por ml em meio JRH ExCell 525. Os rendimentos de EPO foram determinados após 3, 5 e 7 dias. Os primeiros parâmetros que foram testados foram: Oxigénio dissolvido a 0,5%, 10%, 150% e como controlo positivo a 50% (%OD). OD a 50% é a condição à qual as células PER.C6 e P9 são normalmente mantidas. Noutro teste, as células P9 foram inoculadas e testadas quanto à produção de EPO a diferentes temperaturas (32°C, 34°C, 37°C e 39°C) nas quais 37°C é o parâmetro normal para PER.C6 e P9 e no terceiro teste as células P9 frescas foram inoculadas e testadas quanto à produção de EPO a diferentes parâmetros de pH (pH 6,5, pH 6,8, pH 7,0 e pH 7,3). As células per.C6 são normalmente mantidas a 36 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ ρΗ 7,3. Um resumo dos rendimentos de EPO (três dias após a sementeira) é mostrado na Figura 17. Aparentemente, as concentrações de EPO aumentam quando a temperatura aumenta de 32 para 39°C tal como foi também observado com as células PER.C6/E2A criadas a 39°C (Tabela 4), e OD a 50% é óptima para P9 no intervalo que foi aqui testado. A pH 6,5, as células não podem sobreviver uma vez que a viabilidade neste biorreactor caiu abaixo dos 80% após 7 dias. As amostras de EPO produzidas nestes cenários são verificadas quanto à glicosilação e carga em electroforese de 2D (ver também exemplo 17).

Exemplo 10: Amplificação do gene de DHFR

Foram utilizadas várias linhas celulares descritas no exemplo 8 numa experiência de amplificação para determinar a possibilidade de aumentar o número de genes de DHFR através do aumento da concentração de MTX num período de tempo de mais de dois meses. A concentração começou na concentração limiar (100 nM) e aumentou até 1800 nM com passos intermédios de 200 nM, 400 nM, 800 nM e 1200 nM. Durante este período, foram efectuadas regularmente experiências de ELISA de EPO para detectar as unidades por milhão de células semeadas por dia (Fig. 18). Foram congelados alguns frascos à maior concentração de MTX (1800 nM), alguns frascos foram congelados. Foram obtidos sedimentos celulares e o ADN foi extraído e subsequentemente digerido com BglII, uma vez que esta enzima corta à volta do gene de DHFR de tipo selvagem em pEP02000/DHFRwt (Fig. 5), logo uma banda distinta de DHFR desse tamanho seria distinguível das bandas de DHFR endógenas num "Southern blot". Este ADN foi corrido e transferido e a membrana foi hibridada com uma sonda de DHFR radioactiva e subsequentemente com uma sonda de El de adenovírus como controlo de fundo (Fig. 19) . As intensidades das bandas de hibridação foram medidas num "Phosphorimager" e corrigidas para os níveis do fundo. Estes resultados são mostrados na tabela 3. Aparentemente é possível obter amplificação do gene de dhfr em células PER.C6 embora neste caso apenas com o dhfr endógeno e não com o vector integrado. 37 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Exemplo 11: Estabilidade da expressão de EPO em linhas celulares estáveis várias linhas celulares mencionadas no exemplo 8 foram sujeitas a cultura de longo prazo na presença e ausência de MTX. As concentrações de EPO foram medidas regularmente nas quais foram semeadas 1,0 a 1,5χ106 células por balão T25 e deixadas durante 4 dias para calcular os niveis de produção de EPO por milhão de células semeadas por dia. Os resultados são mostrados na Figura 20. A partir destas conclui-se que existe uma expressão relativamente estável de EPO em células P9 quando as células são cultivadas na presença de MTX e que existe uma diminuição na produção de EPO na ausência de MTX. No entanto, quando as células P9 foram colocadas novamente em MTX 100 nM após terem sido cultivadas durante um período de tempo maior sem MTX, a EPO expressa alcançou o seu nivel original (+3000 unidades ELISA por milhão de células semeadas por dia), sugerindo que os plasmideos integrados são desligados mas estão integrados estavelmente e podem ser novamente ligados. Parece que há diferenças entre as linhas celulares P8 e P9 devido ao nivel de produção de P8 na presença de MTX estar a diminuir com o tempo ao longo de um elevado número de passagens (Fig. 20A), enquanto que a produção de P9 é estável durante pelo menos 62 passagens (Fig. 20B).

Exemplo 12: Expressão transiente de EPO recombinante em células aderentes e em suspensão após transfecções de ADN plasmidico

Os plasmideos pEP02000/DHFRwt, pEP02000/DHFRm e pAdApt.EPO do exemplo 2 são purificados a partir de E. coli em colunas e são transfectados utilizando Lipofectamina, electroporação, PEI ou outros métodos. As células PER.C6 ou PER.C6/E2A são contadas e semeadas em DMEM mais soro ou meio JRH ExCell 525 ou o meio apropriado para transfecção em suspensão. A transfecção é efectuada a 37°C até 16 horas dependendo do método de transfecção utilizado, de acordo com procedimentos conhecidos por um perito na arte. Subsequentemente as células são colocadas a diferentes 38 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ temperaturas e ο meio é substituído por meio fresco com ou sem soro. No caso em que é necessário obter meio que não tenha completamente nenhum componente sérico, o meio fresco sem soro é novamente removido após 3 horas e substituído novamente por meio sem componentes séricos. Para determinação da produção de EPO recombinante, são tomadas amostras a diferentes tempos. Os rendimentos de proteína recombinante são determinados utilizando um estojo de ELISA (R&D Systems) no qual 1 Unidade é aproximadamente iqual a 10 nq de proteína EPO recombinante produzida em CHO (100000 Unidades/mq). As células utilizadas nestas experiências crescem a diferentes taxas, devido à sua origem, características e temperatura. Por isso, a quantidade de EPO recombinante produzida é geralmente calculada em unidades de ELISA/106 células semeadas/dia, tendo em conta que os anti-soros utilizados no estojo de ELISA não discriminam entre EPO recombinante não glicosilada e altamente glicosilada. Geralmente, as amostras para estes cálculos são tomadas no dia 4 depois da substituição do meio após transfecção.

As células PER.C6/E2A, transfectadas a 37°C utilizando Lipofectamina e subsequentemente criadas a 39°C na presença de soro produziram tipicamente 3100 unidades/106 células/dia. Na ausência de componentes séricos sem qualquer refrescamento de meio sem soro estas células transfectadas com Lipofectamina produziram tipicamente 2600 unidades /106 células/dia. As células PER.C6, transfectadas a 37°C utilizando Lipofectamina e subsequentemente criadas a 37°C na presença de soro produziram tipicamente 750 unidades/106 células/dia e na ausência de soro 590 unidades/106 células/dia. Para comparação, os mesmos plasmídeos de expressão pEP02000/DHFRwt e pEPO2000/DHFRm, foram também aplicados para transfectar células de Ovário de Hamster Chinês (CHO, n° ECACC 85050302) utilizando procedimentos de Lipofectamina, PEI, Fosfato de Cálcio e outros métodos. Quando as células CHO foram transfectadas utilizando Lipofectamina e subsequentemente cultivadas em meio F12 de Ham na presença de soro, obteve-se um rendimento de 190 unidades/106 células/dia. Na ausência de soro foram produzidas 90 unidades/106 células/dia, embora se possam obter rendimentos maiores quando as transfecções se efectuam em DMEM. 39 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Placas diferentes contendo células PER.C6/E2A aderentes foram também transfectadas a 37°C com plasmídeo pEP02 0 00/DHFRwt e subsequentemente colocadas a 32°C, 34°C, 37°C ou 39°C para determinar a influência da temperatura na produção de EPO recombinante. Foi observado um nível de produção dependente da temperatura variando de 250 a 610 unidades/106 células semeadas/dia, calculado a partir de uma amostra do dia 4, sugerindo que a diferença entre os níveis de produção observados em PER.C6 e PER.C6/E2A é parcialmente devida às temperaturas de incubação (ver também Fig. 17). Uma vez que PER.C6/E2A cresce bem a 37°C, foram efectuados outros estudos a 37°C.

Placas diferentes contendo células PER.C6 e PER.C6/E2A aderentes foram transfectadas com pEP02000/DHFRwt, pEP02000/DHFRm e pAdApt.EPO utilizando Lipofectamina. Quatro horas após a transfecção o DMEM foi substituído por meio DMEM mais soro ou meio JRH sem soro e deixou-se acumular EPO no sobrenadante durante vários dias para determinar as concentrações que são produzidas nos diferentes meios. As células PER.C6 foram incubadas a 37°C, enquanto que as células PER.C6/E2A eram mantidas a 39°C. Foi calculada a média dos dados dos diferentes plasmídeos uma vez que estes contêm uma cassete de expressão semelhante. Calculados a partir de uma amostra do dia 6 foram obtidos os seguintes dados: PER.C6 criadas em DMEM produziram 400 unidades/106 células semeadas/dia e quando foram mantidas em meio JRH produziram 300 unidades/106 células semeadas/dia. PER.C6/E2A criadas em DMEM produziram 1800 unidades/106 células semeadas/dia e quando foram mantidas em JRH produziram 1100 unidades/106 células semeadas/dia. Novamente foi observada uma diferença clara nos níveis de produção entre PER.C6 e PER.C6/E2A, embora isto possa ser parcialmente devido a diferenças de temperatura (ver acima). Houve no entanto uma diferença significativa com as células PER.C6/E2A entre a concentração em DMEM vs. a concentração em meio JRH, embora este efeito se tenha perdido quase completamente nas células PER.C6.

Os dados de expressão de EPO obtidos neste sistema estão resumidos na tabela 4. PER.C6 e derivadas destas podem ser utilizadas para escalar o sistema de transfecções de ADN. De acordo com Wurm e Bernard (1999) podem ser efectuadas 40 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ transfecções em células em suspensão em cenários de Ι-ΙΟ litros nos quais se obtiveram rendimentos de 1-10 mg/1 (0,1-1 pg/célula/dia) de proteína recombinante utilizando electroporação. Isto é uma necessidade para um sistema no qual isto pode ser bem controlado e os rendimentos poderiam ser maiores, especialmente para pesquisa de um grande número de proteínas e de proteínas tóxicas que não podem ser produzidas num dispositivo estável. Com as transfecções de Lipofectamina nas melhores células PER.C6 na ausência de soro, alcançámos 590 unidades/milhão de células/dia (± 5,9 pg/célula/dia quando 1 unidade ELISA é aproximadamente 10 ng de EPO), enquanto que PER.C6/E2A alcançaram 31 pg/célula/dia (na presença de soro). O meio utilizado para as culturas em suspensão de PER.C6 e PER.C6/E2A (JRH ExCell 525) não suporta transfecções transientes de ADN eficientes utilizando componentes como PEI. Por isso o meio é ajustado para permitir a produção de EPO recombinante após transfecção de pEP02000/DHFRwt e pEP02000/DHFRm contendo um ADNc de EPO humano recombinante e pcDNA2 000/DHFRwt contendo outros ADNc codificando proteínas recombinantes.

Culturas em suspensão de 1 a 10 litros de PER.C6 e PER.C6/E2A a crescer em meio ajustado para suportar transfecções transientes de adn utilizando ADN plasmídico purificado, são utilizadas para electroporação ou outros métodos, efectuando a transfecção com os mesmos plasmídeos de expressão. Após várias horas o meio de transfecção é removido e substituído por meio fresco sem soro. A proteína recombinante é deixada a acumular no sobrenadante durante vários dias após o que o sobrenadante é colhido e todas as células são removidas. O sobrenadante é utilizado para processamento a jusante para purificar a proteína recombinante.

Exemplo 15: Purificação e análise de EPO recombinante.

Grandes lotes de células em crescimento são produzidos em biorreactores, a proteína EPO humana recombinante segregada é purificada de acordo com procedimentos conhecidos de um perito na arte. A proteína EPO humana recombinante purificada a partir de clones ou transfectantes estáveis de PER.C6 ou PER.C6/E2A é verificada quanto a glicosilação e dobragem 41 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ através de comparação com EPO comercialmente disponível e EPO purificada de origem humana (urina) utilizando métodos conhecidos de um perito na arte (ver exemplo 16 e 17) . As proteínas EPO purificadas e glicosiladas de PER.C6 e PER.C6/E2A são testadas quanto à actividade biológica em experiências in vivo e em baços de ratinho tal como descrito (Krystal (1983)) e em ensaios in vitro (ver exemplo 18).

Exemplo 16: Actividade da beta-galactósido-alfa-2,6-sialiltransferase em PER.C6.

Sabe-se que as células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) não contêm um gene para a beta-galactósido-alfa-2,6-sialiltransferase, resultando na ausência de ácidos siálicos com ligações alfa-2,6 nas extremidades terminais de oligossacáridos ligados em N e 0 das glicoproteínas endógenas e recombinantes produzidas nestas células CHO. Uma vez que o gene da 2,3-sialiltransferase está presente em células CHO, as proteínas que são produzidas nestas células são tipicamente do tipo de ligação 2,3. A EPO que foi purificada a partir de urina humana contém no entanto ácidos siálicos com ligações alfa 2,3 e alfa 2,6. Para determinar se as células PER.C6, sendo uma linha celular humana, são capazes de produzir EPO recombinante contendo ambas as ligações alfa 2,3 e alfa 2,6, foi efectuado um ensaio directo de neuraminidase na EPO recombinante produzida em células PER.C6 após transfecção com vectores de expressão de EPO. Como controlo, foram utilizadas amostras de Eprex comercialmente disponíveis, que foram derivadas de células CHO e que deviam conter apenas ligações de ácido siálico do tipo alfa 2,3. As neuraminidases que foram utilizadas foram do Vírus da Doença de Newcastle (NDV) que cliva especificamente os ácidos neuramínicos ligados em alfa 2,3 (ácidos siálicos) dos glicanos ligados em N e 0, e de Vibro cholerae (VC) que cliva inespecificamente todos os ácidos siálicos terminais ligados em N ou 0 (ligações alfa 2,3, alfa 2,6 e alfa 2,8). Ambas as neuraminidases eram de Boehringer e foram incubadas com as amostras de acordo com as linhas directrizes proporcionadas pelo fabricante. Os resultados são mostrados na Fig. 21A. Na pista 2 e 3 (tratamento com neuraminidase de NDV) é observada uma ligeira mudança em comparação com a pista 1 (EPO de PER.C6 não tratada). Quando esta amostra de EPO foi incubada com 42 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ neuraminidase derivada de VC, é observada uma banda que migra ainda mais depressa em comparação com as amostras tratadas com NDV. No entanto, com o Eprex comercialmente disponível apenas foi observada uma mudança quando foi aplicada neuraminidase derivada de NDV (pista 6 e 7 em comparação com a amostra não tratada da pista 5) e não quando foi utilizada neuraminidase de VC (pista 8).

Para ainda mostrar que de facto não estavam presentes ácidos siálicos do tipo de ligação alfa 2,6 em células CHO, mas que eles existem de facto em proteínas presentes na superfície celular das células PER.C6, foi executada a seguinte experiência: células CHO foram libertadas do suporte sólido utilizando tripsina-EDTA, enquanto que para PER.C6, foram utilizadas células em suspensão. Ambas as suspensões foram lavadas uma vez com Mem-FBS a 5% e incubadas neste meio durante lha 37°C. Após lavagem com PBS, as células foram ressuspensas até aproximadamente 106 células/ml em meio de ligação (solução salina tamponada com Tris, pH 7,5, bsa a 0,5% e 1 mM de cada um de MgCl2, MnCl2 e CaCl2) . Foram incubadas alíquotas das células durante 1 h à temperatura ambiente com lectinas marcadas com DIG, aglutinina de Sambucus nigra (SNA) e aglutinina de Maackia amurensis, que se liga especificamente a ligações de ácidos siálicos dos tipos alfa 2,6 Gal e alfa 2,3 Gal, respectivamente. As células de controlo foram incubadas sem lectinas. Após 1 hora, ambas as células tratadas com lectinas e de controlo foram lavadas com PBS e depois incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpo anti-DIG marcado com FITC (Boehringer Mannheim). Subsequentemente, as células foram lavadas com PBS e analisadas quanto à intensidade da fluorescência num aparelho FACsort (Becton Dickinson) . A análise de FACS é mostrada na Fig. 21B. Quando a lectina SNA é incubada com as células CHO não é observada nenhuma mudança em comparação com as células não tratadas, enquanto que quando esta lectina é incubada com células PER.C6, é observada uma clara mudança (campos a cheio) em comparação com as células não tratadas (campos vazios). Quando ambas as linhas celulares são incubadas com a lectina MAA ambas as linhas celulares dão uma mudança clara em comparação com as células não tratadas. 43 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ A partir destas digestões da EPO e dos resultados de FACS conclui-se que existe uma actividade de beta-galactósido-alfa-2,6-sialiltransferase presente nas células PER.C6 humanas que está ausente nas células CHO de hamster.

Exemplo 17: Determinação do teor de ácido siálico em EPO produzida por PER.C6

Os ácidos neuramínicos terminais (ou ácidos siálicos) que estão presentes nos glicanos ligados em N ou 0 da EPO protegem a proteína da eliminação da corrente sanguínea por enzimas no fígado. Para além disso, uma vez que estes ácidos siálicos estão carregados negativamente, pode distinguir-se entre diferentes formas de EPO dependendo da sua carga ou pi específico. Por isso, a EPO produzida nas células PER.C6 e CHO foi utilizada em electroforese bidimensional na qual a primeira dimensão separa a proteína pela carga (intervalo de pH 3-10) e a segunda dimensão separa ainda as proteínas pelo peso molecular.

Subsequentemente, as proteínas foram transferidas e detectadas num "Western blot" com um anticorpo anti-EPO. É também possível detectar a proteína EPO separada corando o gel utilizando azul de Coomassie ou métodos de coloração de prata e removendo subsequentemente diferentes pontos do gel e determinando a composição específica de glicanos das diferentes glicosilações ligadas em N ou O que estão presentes na proteína através de espectrometria de massa.

Na Fig. 22A são mostradas várias amostras de EPO que foram derivadas de sobrenadantes de P9. P9 é a linha celular PER.C6 que expressa estavelmente EPO humana recombinante (ver exemplo 8). Estas amostras foram comparadas com Eprex comercialmente disponível, que contém apenas formas de EPO ancorando aproximadamente 9 a 14 ácidos siálicos. Eprex devia portanto ter carga negativa e focar-se para o lado de pH 3 do gel. A Fig. 22B mostra uma comparação entre EPO derivada de P9 num cenário aderente no qual as células foram cultivadas em meio DMEM e EPO derivada de células CHO que foram transientemente transfectadas com o vector pEP02000/DHFRwt. 44 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Aparentemente as formas inferiores de EPO não podem ser detectadas nas amostras de CHO enquanto que todas as formas podem ser observadas na amostra de P9. 0 teor de ácido siálico é dado através da numeração das bandas que foram separadas na primeira dimensão de 1 a 14. Uma vez que o "Western blot" foi efectuado utilizando ECL e uma vez que é relativamente pouco claro se o anticorpo que foi utilizado para detectar as moléculas de EPO na membrana e uma vez que é desconhecido se a glicosilação pode inibir o reconhecimento pelo anticorpo ou a transferência para a nitrocelulose, não é possível determinar a percentagem de cada forma que está presente nestas misturas. No entanto, é possível determinar a presença das formas separadas das moléculas de EPO contendo ácido siálico. Pode concluir-se que PER.C6 é capaz de produzir toda a variedade das 14 isoformas de EPO humana recombinante contendo ácido siálico.

Exemplo 18: Funcionalidade in vitro de EPO produzida por PER.C6 A função da EPO recombinante in vitro é determinada através da sua semivida na corrente sanguínea. A remoção da EPO ocorre através de enzimas do fígado que se ligam aos resíduos de galactose nos glicanos que não estão protegidos por ácidos siálicos e pela remoção através do rim. Se esta filtração pelo rim é devida a má dobragem ou devida a sub ou má glicosilação é desconhecido. Para além disso, as moléculas de EPO que alcançam os seus alvos na medula óssea e se ligam ao receptor de EPO nas células progenitoras são também removidas da circulação. A ligação ao receptor de EPO e a sinalização a jusante depende grandemente de um estado de glicosilação correcto da molécula de EPO. Os ácidos siálicos podem inibir até certo ponto a ligação da EPO ao receptor de EPO resultando numa menor eficácia da proteína. No entanto, uma vez que os ácidos siálicos evitam a remoção da EPO, estes açúcares são essenciais para a sua função para proteger a proteína na sua viagem até ao receptor de EPO. Quando os ácidos siálicos são removidos da EPO in vitro, ocorre uma melhor ligação ao receptor, resultando numa sinalização a jusante mais forte. Isto significa que as funcionalidades in vivo e in vitro são significativamente diferentes, embora uma propriedade de ligação ao receptor de EPO correcta possa 45 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ ser verificada in vitro apesar da possibilidade de uma sub-sialilação causar uma menor semivida in vivo (Takeuchi et al., 1989) .

Foram descritos vários ensaios in vitro para a funcionalidade de EPO dos quais a estimulação da IL-3, GM-CSF e da linha celular humana dependente de EPO TF-1 são os mais vulgarmente utilizados. Deste modo, pode-se determinar o número de unidades in vitro por mg (Kitamura et al., 1989; Hammerling et al., 1996). Outros ensaios in vitro são a formação de colónias vermelhas sob uma camada de agarose de células da medula óssea que foram estimuladas a diferenciarem-se através de EPO, a incorporação de 59Fe no heme em células da medula óssea de ratinho em cultura (Krystal et al., 1981 e 1983; Takeuchi et al., 1989), em células da medula óssea de rato (Goldwasser et al., 1975) e o Radio-Imuno-Ensaio (RIA) no qual é determinado o reconhecimento de EPO por anti-soros. A EPO produzida em células PER.C6/E2A foi utilizada para estimular células TF-1 tal como se segue: As células foram semeadas em placas de 96 poços com uma densidade de cerca de 10000 células por poço em meio sem IL-3 ou GM-CSF, que são os factores de crescimento que podem estimular o crescimento indefinido destas células em cultura. Subsequentemente, é adicionado meio resultando em concentrações finais de 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 e 10 unidades por ml. Estas unidades foram determinadas através de ELISA, enquanto que as unidades do controlo positivo Eprex eram conhecidas (4000 unidades por ml) e foram diluídas até à mesma concentração. As células foram incubadas com estas amostras de EPO durante 4 dias, após os quais foi efectuado um ensaio MTS (Promega) para verificar as células viáveis através de medição da fluorescência a 490 nm (a fluorescência é detectável após transferência de MTS para formazano). A Figura 23 mostra a actividade de duas amostras derivadas de células PER.C6/E2A que foram transfectadas com um vector de expressão de EPO e subsequentemente incubadas a 37°C e 39°C durante 4 dias. Os resultados sugerem que as amostras obtidas a 39°C são mais activas que as amostras obtidas a 37°C o que poderia indicar que o teor de ácido siálico é sub-óptimo a temperaturas mais elevadas. É deste modo aqui mostrado que a EPO produzida por PER.C6 pode estimular células TF-1 num ensaio in vitro, sugerindo fortemente que a EPO que é 46 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ produzida nesta linha celular humana pode interagir com o receptor de EPO e estimular a diferenciação.

Exemplo 19: Produção de anticorpos monoclonais recombinantes de murideo e humanizados e humanos em PER.C6 e PER.C6/E2A.

A. Transfecções transientes de ADN ADNc codificando as cadeias pesada e leve de anticorpos monoclonais (mAb) de murideo, humanizados e humanos são clonados em dois sistemas diferentes: Um no qual as cadeias pesada e leve são integradas num único plasmideo (um plasmideo pcDNA2000/DHFRwt modificado) e o outro é um sistema no qual os ADNc das cadeias pesada e leve são clonados separadamente em dois plasmideos diferentes (ver exemplo 1, 3, 4 e 5) . Estes plasmideos podem possuir o mesmo marcador de selecção (como DHFR) ou podem possuir cada um o seu próprio marcador de selecção (um que contenha o gene de DHFR e um que contenha por exemplo o marcador de resistência a neo) . Para sistemas de expressão transiente não interessa quais os marcadores de selecção que estão presentes na estrutura do vector uma vez que não é efectuada selecção subsequente. Nos métodos vulgares e normais de transfecção utilizados na arte, são transfectadas quantidades iguais dos plasmideos. Uma desvantagem de integrar ambas as cadeias pesada e leve num único plasmideo é que os promotores que conduzem a expressão de ambos os ADNc podem influenciar cada um, resultando em níveis de expressão não iguais de ambas as subunidades, embora o número de cópias do ADNc de cada gene seja exactamente o mesmo.

Os plasmideos contendo os ADNc da cadeia pesada e leve de um anticorpo monoclonal de murideo e um humanizado são transfectados e após vários dias a concentração de anticorpo correctamente dobrado é determinada utilizando métodos conhecidos dos peritos na arte. Condições tais como temperatura e meio utilizado são verificadas para ambas as células PER.C6 e PER.C6/E2A. A funcionalidade do anticorpo recombinante produzido é controlada através da determinação da afinidade para o antigénio especificado. 47 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ C. Produção estável e amplificação do plasmideo integrado.

Os plasmideos de expressão possuindo as cadeias pesada e leve juntas e os plasmideos possuindo as cadeias pesada e leve separadamente são utilizados para transfectar células PER.C6 e PER.C6/E2A aderentes e CHO-dhfr. Subsequentemente as células são expostas a MTX e/ou higromicina e neomicina para seleccionar a integração dos diferentes plasmideos. Para além disso, é efectuada uma dupla selecção com G418 e higromicina para seleccionar a integração de plasmideos que possuam o gene de resistência à neomicina e à higromicina. É determinada a expressão de anticorpos monoclonais inteiros funcionais e os melhores clones a expressar são utilizados para estudos subsequentes incluindo estabilidade da integração, detecção do número de cópias, determinação dos níveis de ambas as subunidades e capacidade para amplificar após aumento da concentração de MTX após serem utilizadas as linhas celulares com melhor desempenho para produção de mAb em cenários maiores como biorreactores perfundidos e descontínuos (com alimentação) após o que é executada a optimização da quantidade e qualidade dos mAb.

Exemplo 20: Transfecção de vectores de expressão de mAb para obter linhas celulares estáveis. Células PER.C6 foram semeadas em DMEM mais FBS a 10% em 47 caixas de cultura de tecidos (10 cm de diâmetro) com aproximadamente 2,5xl06 células por caixa e mantidas de um dia para o outro sob as suas condições normais de cultura (concentração de C02 de 10% e 37°C) . No dia seguinte, foram efectuadas as co-transfecções em 39 caixas a 37°C utilizando Lipofectamina em protocolos padrão com 1 μρ de pUBS-Heavy2000/Hyg(-) digerido com Muni e purificado e 1 μρ de pUBS-Light2001/Neo digerido com Seal e purificado (ver exemplo 3) por caixa, enquanto que 2 caixas foram co-transfectadas como controlos com 1 μρ de pcDNA2000/Hyg(-) digerido com Muni e purificado e 1 μρ de pcDNA2001/Neo digerido com Seal e purificado. Como controlo da eficiência da transfecção, foram transfectadas 4 caixas com um vector de controlo LacZ, enquanto que 2 caixas não foram transfectadas e serviram como controlos negativos. 48 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Após 5 horas, as células foram lavadas duas vezes com DMEM e novamente alimentadas com meio fresco sem selecção. No dia seguinte, o meio foi substituído por meio fresco contendo diferentes reagentes de selecção: 33 caixas dos co-transfectantes das cadeias pesada e leve, 2 caixas que foram transfectadas com os vectores vazios e os 2 controlos negativos (sem transfecção) foram incubadas apenas com 50 μρ por ml de higromicina, 2 caixas dos co-transfectantes das cadeias pesada e leve e 2 caixas das caixas de eficiência da transfecção (vector LacZ) foram incubadas com apenas 500 μς por ml de G418, enquanto que 2 caixas da eficiência da transfecção não foram tratadas com meio de selecção mas utilizadas para determinação da eficiência da transfecção que foi de cerca de 40%. 2 caixas foram incubadas com uma combinação de 50 μρ por ml de higromicina e 250 μρ por ml de G418 e 2 caixas foram incubadas com 25 μρ por ml de higromicina e 500 μρ por ml de G418.

Uma vez que as células estavam a crescer demais quando eram apenas incubadas só com higromicina foi decidido que uma combinação de selecção de higromicina e G418 mataria imediatamente as células que integrassem apenas um tipo dos dois vectores que foram transfectados. Assim, 7 dias após a sementeira, todos os co-transfectantes foram incubados ainda com uma combinação de 100 μρ por ml de higromicina e 500 μρ por ml de G418. As células foram refrescadas 2 ou 3 dias com meio contendo as mesmas concentrações de agentes de selecção. 14 dias após a sementeira as concentrações foram ajustadas para 250 μρ por ml de G418 e 50 μρ por ml de higromicina. 22 dias após a sementeira tinha crescido um grande número de colónias até um ponto em que era possível seleccionar, apanhar e subcultivar. Aproximadamente 300 colónias individuais foram seleccionadas e apanhadas das caixas de 10 cm e subsequentemente postas a crescer através de placas de 96 poços e/ou 24 poços, através de placas de 6 poços para balões T25. Neste estádio, as células são congeladas (4 frascos por colónia subcultivada) e os níveis de produção do mAb UBS-54 recombinante são determinados no sobrenadante utilizando o ELISA descrito no exemplo 26. 49 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

As células CHO-dhfr são semeadas em DMEM mais FBS a 10% e incluindo hipoxantina e timidina em caixas de cultura de tecidos (10 cm de diâmetro) com aproximadamente 1 milhão de células por caixa e são mantidas de um dia para o outro sob condições normais e utilizadas para uma co-transfecção no dia seguinte com pUBS-Heavy2000/Hyg(-) e pUBS-Light2001/DHFRwt sob protocolos padrão utilizando Lipofectamina. O meio é substituído por meio fresco após algumas horas e dividido em diferentes densidades para permitir que as células se ajustem ao meio de selecção quando está a ocorrer integração estável sem um possível crescimento em demasia das células não transfectadas. As colónias são primeiro seleccionadas em higromicina e subsequentemente é adicionado MTX para seleccionar duplas integrações dos 2 plasmídeos nestas linhas celulares subcultivadas. São efectuadas transfecções tal como descrito para pUBS-Heavy2000/Hyg(-) e pUBS-Light2001/Neo com pUBS2-Heavy2000/Hyg(-) e pUBS2-Light2001/Neo em PER.C6 e PER.C6/E2A e a selecção é efectuada com subsequente incubação com higromicina seguida por G418 ou tal como descrito acima com uma combinação de ambos os reagentes de selecção. Células CHO-dhfr são transfectadas com pUBS2-Heavy2000/Hyg(-) e pUBS2-Light2001/DHFRwt tal como descrito para pUBS-Heavy2000/Hyg(-) e pUBS-Light2001/DHFRwt e a selecção é efectuada de um modo sequencial no qual as células são primeiro seleccionadas com higromicina após o que uma integração do vector da cadeia leve é controlada através de selecção em MTX.

Para além disso, células PER.C6 e PER.C6/E2A são também utilizadas para as transfecções com pUBS-3000/Hyg(-) e pUBS2-3000/Hyg(-), enquanto que as células CHO-dhfr são transfectadas com pUBS-3000/DHFRwt e pUBS2-3000/DHFRwt após o que é efectuada uma selecção e posterior amplificação dos plasmídeos integrados aumentando a concentração de MTX. No caso dos plasmídeos pcDNAs3000, espera-se um número igual de ARNm de ambas as cadeias pesada e leve, enquanto que no caso de dois vectores separados não é claro se é alcançado um equilíbrio correcto entre as duas subunidades da imunoglobulina. Estão também a ser efectuadas transfecções em PER.C6, PER.C6/E2A e CHO-dhfr com os vectores de expressão descritos no exemplo 4 e 5 para obter linhas celulares 50 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ estáveis que expressem o mAb IgGl humanizado CAMPATH-1H e o mAb IgGl humanizado 15C5, respectivamente.

Exemplo 21: Subcultura de células transfectadas.

Das células PER.C6 transfectadas com pUBS-Heavy2000/Hyg(-) e pUBS-Light2001/Neo, aproximadamente 300 colónias que estavam a crescer em meio contendo

Higromicina e G418 foram geralmente criadas subsequentemente em placas de 96 poços, 24 poços e 6 poços no seu respectivo meio mais os seus respectivos agentes de selecção. As células que eram capazes de crescer em placas de 24 poços, foram verificadas quanto à produção de mAb através da utilização do ELISA descrito no exemplo 26. Se as células fossem registadas positivamente, pelo menos um frasco de cada clone era congelado e armazenado e as células eram subsequentemente testadas e subcultivadas. A selecção de um clone bom produtor baseia-se na expressão elevada, comportamento da cultura e viabilidade. Para permitir verificações da viabilidade a longo prazo, amplificação dos plasmideos integrados e crescimento em suspensão durante periodos de tempo prolongados, os clones melhores produtores são congelados, dos quais vários dos melhores produtores de cada linha celular são seleccionados para trabalho posterior. Experiências semelhantes estão a ser efectuadas em células CHO-dhfr transfectadas com diferentes plasmideos e células PER.C6 e PER.C6/E2A que foram transfectadas com outras combinações de cadeias pesada e leve e outras combinações de marcadores de selecção.

Exemplo 22: Produção de mAb em biorreactores A linha celular melhor produtora de UBS-54 de PER.C6 é trazida para suspensão através de lavagem das células em PBS e depois cultura das células em meio JRH EcCell 525, primeiro em pequenos balões de cultura e subsequentemente em garrafas rolantes e escalada até f ermentadores de 1 a 2 litros. As células são mantidas em selecção de higromicina e G418 até ser provado que a integração dos vectores é estável ao longo de periodos de tempo mais longos. Isto é feito quando as células estão ainda na sua fase aderente ou quando as células estão em suspensão. 51 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

As células PER.C6 produtoras de mAb em crescimento em suspensão são geralmente cultivadas com higromicina e G418 e utilizadas para inoculação de biorreactores a partir de garrafas rolantes. Os rendimentos de produção, a funcionalidade e qualidade do mAb produzido são verificados após crescimento das células em biorreactores perfundidos e em cenários descontínuos com alimentação. A. Perfusão num biorreactor de 2 litros.

As células são semeadas em meio de suspensão na ausência de agentes de selecção a uma concentração de aproximadamente 0,5xl06 por ml e a perfusão é iniciada após vários dias quando a densidade celular atinge aproximadamente 2 a 3χ106 células por ml. A taxa de perfusão é geralmente de 1 volume por 24 horas com uma sangria de aproximadamente 250 ml por 24 horas. Neste cenário, as células ficam normalmente a uma densidade constante de aproximadamente 5xl06 células por ml e com uma viabilidade de quase 95% durante mais de um mês. Os níveis de produção do mAb são determinados regularmente. B. Biorreactor descontínuo com alimentação de 2 litros.

Numa corrida inicial, as células PER.C6 em suspensão produtoras de mAb que são criadas em garrafas rolantes são utilizadas para inocular um biorreactor de 2 litros na ausência de agentes de selecção até uma densidade de 0,3 a 0,5 milhões de células por ml num volume de trabalho de 300 a 500 ml e são deixadas a crescer até a viabilidade da cultura celular cair para 10%. Como padrão do período de vida da cultura é determinado em que dia após a inoculação a densidade das células viáveis cai abaixo de 0,5 milhões de células por ml. As células crescem normalmente até uma densidade de 2 a 3 milhões de células por ml após o que os componentes do meio se tornam limitantes e a viabilidade diminui. Para além disso, é determinada a quantidade dos componentes essenciais, tais como glucose e aminoácidos, no meio que está a ser consumida pelas células. A seguir a isso, é determinado quais os aminoácidos que estão a ser produzidos e quais os outros produtos que se estão a acumular na cultura. Dependendo disto, estão a ser produzidas amostras de alimentação concentradas que são adicionadas a momentos regulares para aumentar o 52 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ período de vida da cultura e aumentar deste modo a concentração do mAb no sobrenadante. Noutro cenário são desenvolvidas amostras de meio concentradas 10 χ que são adicionadas às células a momentos diferentes e que também aumentam a viabilidade das células durante um período de tempo mais longo, resultando finalmente numa maior concentração de mAb no sobrenadante.

Exemplo 23: Expressão transiente de anticorpos monoclonais recombinantes humanizados

As combinações correctas dos vectores contendo os genes das cadeias pesada e leve de UBS-54 foram utilizadas em experiências de transfecção transiente em células PER.C6. Para isto, não é importante qual o marcador de selecção que é introduzido na estrutura do plasmídeo, porque a expressão dura durante um curto período (2-3 dias). O método de transfecção é geralmente Lipofectamina, embora possam ser utilizados outros compostos lipídicos para uma transfecção eficiente. Os métodos transientes são extrapolados a partir dos cenários de balões T25 até biorreactores de pelo menos 10 litros. Foram semeadas aproximadamente 3,5 milhões de células PER.C6 e PER.C6/E2A no dia 1 num balão T25. No dia 2, as células foram transfectadas com, no máximo, 8 μρ de ADN plasmídico utilizando

Lipofectamina e refrescadas após 2-4 horas e deixadas durante 2 dias. Depois, o sobrenadante foi colhido e os títulos de anticorpo foram medidos num ELISA quantitativo para imunoglobulinas IgGl humanas (CLB, ver também exemplo 26) . Os níveis totais de anticorpo humano neste sistema são de aproximadamente 4,8 μρ/milhão de células semeadas para PER.C6 e 11,1 μρ/milhão de células semeadas para PER.C6/E2A. Para determinar quanto do anticorpo produzido está inteiro e montado a partir de duas cadeias pesadas e duas leves, bem como os níveis de expressão da cadeia pesada e/ou leve sozinhas e ligadas por pontes dissulfureto, são desenvolvidos ELISA de controlo que reconhecem as subunidades separadamente. São utilizadas diferentes combinações de anticorpos de captura e coloração que detectam todas subunidades de IgGl humana(humanizada). Os sobrenadantes das PER.C6 transfectantes (transfectadas com vectores de controlo ou pUBS-Heavy2000/Hyg(-) e pUBS-Light2001/DHFRwt) foram verificados quanto à produção de mAb inteiro (Fig. 24) . As amostras foram 53 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ tratadas com e sem DTT, através do qual se pode distinguir entre mAb inteiro (não reduzido) e cadeias pesada e leve separadamente (reduzido). Tal como esperado, a cadeia pesada é apenas segregada quando a cadeia leve é co-expressa e a maioria do anticorpo está inteiro.

Exemplo 24: Sistema de aumento de escala para transfecções transientes PER.C6 e derivadas destas são utilizadas para escalar o sistema de transfecções de ADN. De acordo com Wurm e Bernard (1999), as transfecções em células em suspensão podem ser efectuadas em cenários de 1-10 litros nos quais foram obtidos rendimentos de 1-10 mg/1 (0,1-1 pg/célula/dia) de proteína recombinante utilizando electroporação.

Existe a necessidade de um sistema no qual isto possa ser bem controlado e os rendimentos possam ser superiores, especialmente para pesquisa de um grande número de proteínas e de proteínas tóxicas que não possam ser produzidas num cenário estável. Para além disso, uma vez que linhas celulares tais como CHO são dificilmente fortemente afectadas por agentes indutores de apoptose como a Lipofectamina, a arte ensina que existe a necessidade de células que sejam resistentes a estes. Uma vez que PER.C6 é dificilmente afectada pelos métodos de transfecção parece que PER.C6 e derivadas desta são úteis para estes fins. Culturas em suspensão de 1 a 50 litros de PER.C6 e PER.C6/E2A a crescer em meio ajustado para suportar transfecções transientes de ADN utilizando ADN plasmídico purificado, são utilizadas para electroporação ou outros métodos, efectuando a transfecção com os mesmos plasmídeos de expressão. Após várias horas o meio de transfecção é removido e substituído por meio fresco sem soro. A proteína recombinante é deixada a acumular no sobrenadante durante vários dias após o que o sobrenadante é colhido e todas as células são removidas. O sobrenadante é utilizado para processamento a jusante para purificar a proteína recombinante. 54 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Exemplo 26: Desenvolvimento de um ELISA para determinação de mAb humanos

Placas Greiner microlon #655061 foram revestidas com um anticorpo monoclonal anti-capa de IgGl humana (Pharmingen #M032196 0.5) com 100 μΐ por poço numa concentração de 4 μρ por ml em PBS. A incubação foi efectuada de um dia para o outro a 4°C ou durante 90 minutos a 37°C. Depois, os poços foram lavados três vezes com Tween a 0,05%/PBS (400 μΐ por poço) e subsequentemente bloqueados com 100 μΐ de leite a 5% dissolvido em Tween a 0,05%/PBS por poço durante 30 minutos a 37°C e depois a placa foi lavada três vezes com 400 μΐ de Tween a 0,05%/PBS por poço. Como padrão, foi utilizado um anticorpo IgGl humano purificado (Sigma, #108H9265) diluído em leite a 0,5%/Tween a 0,05%/PBS em diluições variando de 50 a 400 ng por ml. Por poço foram incubados 100 μΐ de padrão durante lha 37°C. Depois, a placa foi lavada três vezes com 400 μΐ por poço de Tween a 0,05%/PBS. Como anticorpo secundário foi utilizado um anticorpo monoclonal de ratinho anti-IgGl humana marcado com biotina (Pharmingen #M045741) numa concentração de 2 ng por ml. Por poço foram adicionados 100 μΐ deste anticorpo e incubou-se durante lha 37°C e os poços foram lavados três vezes com 400 μΐ de Tween a 0,05%/PBS.

Subsequentemente, foi adicionado conjugado: 100 μΐ por poço de uma diluição 1:1000 de solução Estreptavidina-HRP (Pharmingen #M045975) e incubou-se durante lha 37°C e a placa foi novamente lavada três vezes com 400 μΐ por poço de Tween a 0,05%/PBS.

Foi dissolvido um comprimido de ABTS (Boehringer Mannheim, #600191-01) em 50 ml de tampão ABTS (Boehringer Mannheim, #60328501) e foram adicionados 100 μΐ desta solução a cada poço e incubou-se durante 1 h à ta ou a 37°C. Finalmente, foi medida a DO a 405 nm. Amostras do sobrenadante das células transfectadas com os vectores codificando mAb, foram geralmente dissolvidas e diluídas em leite a 0,5%/Tween a 0,05%/PBS. Se as amostras não se ajustassem na variação linear da curva padrão, eram utilizadas outras diluições. 55 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Exemplo 27: Produção de proteínas HA e NA de Influenza numa célula humana para vacinas de subunidades recombinantes

Sequências de adnc de genes codificando as proteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) de estirpes do vírus Influenza conhecidas e novas que surgem regularmente estão a ser determinadas e geradas por PCR com iniciadores para clonagem conveniente nos vectores pcDNA2000, pcDNA2001, pcDNA2002 e pcDNAs3000 (ver exemplo 1). Subsequentemente estes vectores de expressão resultantes estão a ser transfectados em PER.C6 e derivadas desta para expressão estável e transiente das proteínas recombinantes para resultar na produção de proteínas HA e NA recombinantes que são por isso produzidas de um modo completamente padronizado com células humanas sob condições estritas e bem definidas. As células são deixadas acumular estas proteínas recombinantes HA e NA durante um período de tempo padrão. Quando é utilizado o vector pcDNAs3000, é possível clonar ambos os ADNc simultaneamente e ter as células a produzir ambas as proteínas ao mesmo tempo. A partir de culturas separadas ou combinadas, as proteínas estão a ser purificadas seguindo técnicas padrão e os títulos finais de HA e NA estão a ser determinados por peritos na arte e as actividades das proteínas são verificadas. Depois, as proteínas recombinantes purificadas são utilizadas para estudos de vacinação e finalmente utilizadas para fins de vacinação em larga escala. 0 fragmento HAl do vírus da gripe suína

A/swine/Oedenrode/7C/96 (número de acesso Genbank AF092053) foi Obtido por PCR utilizando um iniciador directo com a seguinte sequência (SEQ ID NO:27): 5' ATT GGC GCG CCA CCA TGA AGA CTA TCA TTG CTT TGA GCT AC 3' e com um iniciador inverso com a seguinte sequência (SEQ ID NO:28): 5' GAT GCT AGC TCA TCT AGT TTG TTT TTC TGG TAT ATT CCG 3 ' . 0 produto de PCR contendo 1,0 kb resultante foi digerido com as enzimas de restrição Asei e Nhel e ligado com um vector pcDNA2001/DHFRwt digerido com Asei e Nhe I e purificado, resultando em pcDNA2001/DHFRwt-swHAl. Para além disso, o fragmento HA2 do mesmo vírus foi amplificado por PCR utilizando o mesmo iniciador directo tal como descrito para HAl e outro iniciador inverso com a seguinte sequência (SEQ ID NO:29): 5' GAT GCT AGC TCA GTC TTT GTA TCC TGA CTT CAG TTC AAC ACC 3'. O produto 56 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ de PCR ΗΑ2 de 1,6 kb resultante foi clonado de um modo idêntico ao descrito para HAl, resultando em pcDNA2001/DHFRwt-swHA2,

Exemplo 28: Integração de ADNc codificando enzimas de modificações pós-tradução.

Uma vez que os niveis de produção de proteína recombinante em PER.C6 e PER.C6/E2A transfectadas estavelmente e transientemente e infectadas são extremamente elevados e uma vez que um nível de expressão mais elevado é normalmente obtido após amplificação dependente de DHFR devido a aumento da concentração de MTX, poderia ocorrer uma "super-titulação" dos níveis endógenos de enzimas que estão envolvidas em modificações pós-tradução.

Por isso, ADNc codificando enzimas humanas envolvidas em diferentes tipos de modificações pós-tradução e processos como glicosilação, fosforilação, carboxilação, dobragem e tráfego estão a ser sobre-expressos em PER.C6 e PER.C6/E2A para permitir que seja produzido um produto recombinante mais funcional até níveis extremos em cenários pequenos e grandes. Foi mostrado que podem ser modificadas células CHO nas quais foi introduzida uma alfa-2,6-sialiltransferase para aumentar a expressão e bioactividade de tPA e da eritropoietina humana (Zhang et al., 1998, Minch et al.r 1995, Jenkins et al.r 1998). Outros genes como beta-1,4-galactosiltransferase foram também introduzidos em células de insecto e CHO para melhorar as estruturas de ramificação oligossacarídicas ligadas em N e para aumentar a concentração de ácidos siálicos nos resíduos terminais (Weikert et al., 1999; Hollister et al., 1998). As células PER.C6 são modificadas através de integração de ADNc codificando as proteínas alfa-2,3-sialiltransferase, alfa-2,6-sialiltransferase e beta-1,4-galactosiltransferase para aumentar mais o teor de ácido siálico das proteínas recombinantes produzidas nesta linha celular humana.

Exemplo 31: Criação de linhas celulares derivadas de PER.C6 sem uma proteína DHFR funcional

As células PER.C6 são utilizadas para desligar o gene de DHFR utilizando diferentes sistemas para obter linhas 57 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ celulares que podem ser utilizadas para amplificação do gene de DHFR integrado exógeno que está codificado nos vectores que são descritos nos exemplos 1 a 5 ou outros vectores que expressem dhfr. As células per.C6 são pesquisadas quanto à presença dos diferentes cromossomas e são seleccionadas quanto a um baixo número de cópias do cromossoma que possui o gene de DHFR humano. Subsequentemente, estas células são utilizadas em experiências de "knock-out" nas quais o enquadramento de leitura aberto do gene de dhfr é destruído e substituído por um marcador de selecção. Para obter uma linha celular de duplo "knock-out", ambos os alelos são removidos através de recombinação homóloga utilizando dois marcadores de selecção diferentes ou através de outros sistemas tal como por exemplo os descritos para células CHO (Urlaub et al.r 1983). São também aplicados outros sistemas nos quais a funcionalidade da proteína DHFR é reduzida ou completamente removida, por exemplo através da utilização de ARN anti-sentido ou através de híbridos de arn/adn, nos quais o gene não é removido ou desligado, mas os produtos a jusante do gene são perturbados na sua função.

Exemplo 32: Produção a longo prazo de proteínas recombinantes utilizando inibidores de proteases e da neuraminidase.

Os clones estáveis descritos no exemplo 8 são utilizados para expressão de longo prazo na presença e ausência de MTX, soro e inibidores de proteases. Quando células estáveis ou transfectadas são deixadas durante vários dias a acumular proteína EPO humana recombinante, observa-se uma curva achatada em vez de um aumento directo o que indica que a EPO acumulada é degradada com o tempo. Isto poderia ser um processo inactivo devido a factores externos como luz ou temperatura. Poderia também ser que proteases específicas que fossem produzidas pelas células viáveis ou que fossem libertadas após lise das células mortas digerissem a proteína EPO recombinante. Por isso é adicionada ao meio de cultura uma concentração crescente de CuS04 após a transfecção e nas células produtoras estáveis para detectar uma curva de produção mais estável. As células são cultivadas durante vários dias e a quantidade de EPO é determinada a diferentes momentos. CUSO4 é um conhecido inibidor da actividade 58 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ proteásica, que pode ser facilmente removido durante o processamento a jusante e a purificação de EPO. A concentração óptima de CuS04 é utilizada para produzir proteína EPO humana recombinante após expressão transiente após transfecção de ADN e infecções virais. Para além disso, a concentração óptima de CuS04 é também utilizada na produção de EPO nos clones estáveis. No caso da EPO em que a presença de ácidos siálicos terminais é importante para assegurar uma longa semivida em circulação da proteína recombinante, é necessário produzir EPO altamente sialilada. Uma vez que as células vivas produzem neuraminidases que podem ser segregadas após activação por factores de stress, é provável que a EPO produzida perca os seus ácidos siálicos devido a estes factores de stress e às neuraminidases produzidas. Para evitar o desprendimento dos ácidos siálicos, são adicionados inibidores da neuraminidase ao meio para resultar numa ligação prolongada dos ácidos siálicos à EPO que é produzida.

Exemplo 33: Expressão estável de proteínas recombinantes em células humanas utilizando o sistema amplificável de Glutamina-Sintetase. PER.C6 e derivadas desta estão a ser utilizadas para expressar estavelmente proteínas recombinantes utilizando o sistema de glutamina-sintetase (GS). Primeiro, estão a ser verificadas células quanto à sua capacidade para crescer em meio isento de glutamina. Se as células não podem crescer em meio isento de glutamina isto significa que estas células não expressam GS suficiente, resultando finalmente em morte das células. 0 gene de GS pode ser integrado em vectores de expressão como marcador de selecção (tal como é descrito para o gene de DHFR) e pode ser amplificado aumentando a concentração de metionina-sulfoximina (MSX) resultando em sobre-expressão da proteína recombinante de interesse, uma vez que todo o vector estavelmente integrado será co-amplifiçado tal como mostrado para DHFR. 0 sistema de expressão do gene de GS tornou-se praticável após um relatório de Sanders et al. (1984) e foi feita uma comparação entre o sistema de selecção de DHFR e GS por Cockett et al. (1990). A produção de mAb recombinantes utilizando GS foi primeiro descrita por Bebbington et al. (1992). 59 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ Ο gene de GS é clonado nas estruturas do vector descritas no exemplo 1 ou ADNc codificando as proteínas recombinantes e as cadeias pesada e leve dos mAb são clonados nos vectores disponíveis possuindo o gene de GS. Subsequentemente, estes vectores são transfectados para PER.C6 e seleccionados sob concentrações de MSX que permitirão o crescimento de células com integração estável dos vectores.

Exemplo 34: Produção da proteína gpl20 de HIV recombinante numa célula humana 0 ADNc codificando a proteína de envelope altamente glicosilada gpl20 do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é determinado e obtido por PCR utilizando iniciadores que ancoram uma sequência de Kozak perfeita no iniciador a montante para iniciação correcta da tradução e sequências de reconhecimento de restrição convenientes para clonagem nos vectores de expressão descritos no exemplo 1. Subsequentemente, este produto de PCR é sequenciado em ambas as cadeias para assegurar que não estão a ser introduzidos erros de PCR. O vector de expressão é transfectado para PER.C6, derivadas desta e células CHO-dhfr para obter linhas celulares produtoras estáveis. As diferenças na glicosilação entre a gpl20 produzida em CHO e PER.C6 estão a ser determinadas em experiências de electroforese 2d e subsequentemente em experiências de Espectrometria de Massa, uma vez que gpl20 é uma proteína fortemente glicosilada com principalmente oligossacáridos ligados em 0. A proteína recombinante é purificada por peritos na arte e subsequentemente utilizada para ensaios de funcionalidade e outros. A proteína purificada é utilizada para fins de vacinação para prevenir infecções por HIV.

Legendas das Figuras 1. pcDNA2 0 0 0/DHFRwt 2. pcDNA2 001/DHFRwt 3. pcDNA2002/DHFRwt 60 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ 4. pcDNAs3000/DHFRwt 5. pEPO2000/DHFRwt 7. pHC2000/Hyg(-) 8. pLC2001/DHFRwt 9. pUBS-Heavy2000/Hyg(-) 10. pUBS-LÍght2001/DHFRwt 11. pUBS2-Heavy2000/Hyg(-) 12. pUBS2-Light2001/DHFRwt 13. pUBS-3000/DHFRwt 14. pUBS2-3000/DHFRwt 15. Concentração de EPO num biorreactor de perfusão de 2 litros dada em unidades ELISA por ml. 6. Concentração de EPO num biorreactor descontínuo de lotes repetidos de 2 litros no qual as densidades celulares foram trazidas novamente até 0,5xl06 células por ml cada 2 a 3 dias. 16. Concentração de EPO de células P9 produtoras estáveis, três dias após inoculação com 0,3xl06 células por ml num cenário de biorreactor descontínuo de lotes repetidos de 4x1 litro com diferentes condições: Esquerda. Diferentes parâmetros para o Oxigénio Dissolvido. Meio. Diferentes temperaturas. Direita. Diferente pH constante. Os parâmetros padrão para células P9 são OD a 50%, 37°C e pH 7,3. Em cada ciclo foi efectuada uma corrida de controlo separada com estes parâmetros representada como a quarta barra em cada conjunto. 17. Produção de EPO após aumento da concentração de MTX nas linhas celulares derivadas de PER.C6 P8 e P9 calculada como unidades ELISA por milhão de células semeadas por dia. 61 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ 18. Amplificação do gene de DHFR após aumento da concentração de MTX. "Southern blot" de ADN digerido com BglII derivado de células PER.C6 normais (não criadas na presença de MTX) e de células P8 e P9 (cultivadas na presença de 100 nM, 800 nM e 1800 nM de MTX) . A membrana foi primeiro hibridada com uma sonda de DHFR radioactiva, subsequentemente removida e depois incubada com uma sonda de EI de adenovirus radioactiva como controlo interno. 19. Estabilidade da expressão de EPO recombinante de duas linhas celulares: P8(A) e P9(B). As células foram cultivadas na presença ou ausência de MTX durante aproximadamente 60 passagens num período de tempo de mais de 4 meses e a produção de EPO foi calculada como unidades ELISA por milhão de células por dia. 20. Actividade da beta-galactósido-alfa-2, 6-sialiltransferase em PER.C6 em comparação com células CHO. A. "Western blot" de EPO do sobrenadante de células PER.C6 que foram transfectadas com um plasmídeo de expressão de EPO (esquerda) e Eprex (direita). A EPO de PER.C6 foi corrida sem tratamento (pista 1), após tratamento com neuraminidase derivada de NDV em dois tampões separados (pistas 2 e 3) e após tratamento com neuraminidase derivada de VC (pista 4) . Foi também corrido Eprex sem tratamento (pista 5) e após tratamentos semelhantes com neuraminidases (pistas 5 a 8). B. Mudança na análise de FACS de células PER.C6 (painéis da direita) e CHO (painéis da esquerda) após tratamento com um anticorpo anti-DlG que reconhece duas lectinas ligadas a DIG que foram incubadas com as células (resultando nos campos escuros), que reconhecem especificamente ligações alfa-2,6 entre ácidos siálicos e galactoses (aglutinina de Sambucus nigra, painéis superiores) e ligações alfa-2,3 de ácidos siálicos-galactose (aglutinina de Maackia amurensis, painéis inferiores) em comparação com a análise de FACS com células não tratadas com lectina (campos vazios). 21. Análise de "Western" 2D da EPO recombinante produzida em diferentes cenários de cultura. A. Células P9, que expressam estavelmente EPO humana recombinante foram criadas em balões T175 em DMEM e em garrafas rolantes e 62 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ biorreactores em meio JRH ExCell 525, e foram separadas por electroforese 2D, transferidas para membrana e incubadas com H162, um anti-soro anti-EPO. As amostras contendo toda a variedade de EPO contendo ácidos siálicos (dos sobrenadantes de P9) foram comparadas com Eprex comercialmente disponível que contém apenas as formas superiores de EPO contendo ácido siálico (esquerda). B. EPO derivada de células P9 aderentes criadas em meio DMEM num cenário aderente em comparação com EPO derivada de células CHO transfectadas transientemente que foram também cultivadas em DMEM. Durante a cultura esteve presente FBS, mas foi removido antes da acumulação de EPO se iniciar. Os teores sugeridos de ácido siálico nestas amostras (1-14) estão indicados entre os dois “blots". 22. Ensaio in vitro da funcionalidade de EPO de PER.C6/E2A produzida a 37°C utilizando células TF-1 humanas em comparação com Eprex comercialmente disponível que é produzido em células CHO. 23. "Western blot” utilizando um anticorpo anti-cadeia pesada de IgGl humana em sobrenadantes de células PER.C6 que foram co-transfectadas com pUBS-Heavy2000/Hyg(-) e pUBS-Light2001/DHFRwt (pista 6) ou com os vectores separadamente (pistas 4 e 5) . Como controlo positivo foi carregado soro humano diluído (IgG, pista 1) e como controlos negativos foi transfectado um vector de expressão codificando LacZ (controlo, pista 3) e foi carregado um marcador (M, tamanhos não representados) (pista 2) . 0 painel superior é de um gel que foi carregado com amostras dos transfectantes que não foram tratados com DTT nos quais as pontes dissulfureto das cadeias pesada e leve se mantêm intactas e é detectado um mAb inteiro de aproximadamente 220 kD. O painel inferior mostra amostras dos mesmos transfectantes tratados com DTT nos quais as pontes dissulfureto são removidas resultando numa separação completa das cadeias pesada e leve. A membrana foi incubada com um anticorpo que reconhece cadeias pesadas de IgGl humana. A cadeia leve está corada devido ao reconhecimento de fundo pelo anticorpo secundário (policlonal) utilizado para o procedimento de "Western" ECL. 63 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

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Tabelas: Rendimentos de EPO recombinante

Tabela 1. Resumo da morte por metotrexato (MTX) de PER.C6 e PER. C6/E2A após 6 e 15 dias de incubação com diferentes concentrações de MTX. As células foram semeadas no dia 0 e as incubações com MTX começaram no dia 1 e continuaram durante 6 dias. Depois a confluência (%) foi registada e o meio foi substituído por meio fresco mais MTX e a incubação foi continuada durante mais 9 dias, após os quais a confluência (%) foi novamente registada (dia 15) . PER.C6 0 1 5 10 25 50 100 250 500 1000 2500 nM de MTX células lE5/poço placa de 6 poços dia 6 70 70 70 60 <5 <1 0,5 0 0 0 0 % de confluência dia 15 100 100 100 100 <10 <5 0 0 0 0 0 % de confluência PER.C6/E2A 0 1 5 10 25 50 100 250 500 1000 2500 nM de MTX células lE5/poço placa de 6 poços dia 6 100 100 100 100 <100 5 5 4 1 <1 <1 % de confluência dia 15 100 100 100 100 <10 <5 0 0 0 0 0 % de confluência

Tabela 2. Linhas celulares PER.C6 e PER.C6/E2A aderentes que expressam estavelmente EPO recombinante humana. As linhas celulares foram geradas através de integração estável e expressão de pEP02000/DHFR (figura 5) . Os níveis de produção foram determinados no sobrenadante, após crescimento de 4 dias num cenário de balão T25 na presença de MTX 100 nM.

Linhas celulares PER.C6 Unidades ELISA/ 1E6 células semeadas/dia P3 735 P5 0 P7 1733 P8 2522 P9 3839 P13 0 P15 0 P42 <1 73 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

Linhas celulares PER.C6/E2A Unidades ELISA/ 1E6 células semeadas/dia E17 325 E55 1600

Tabela 3. Taxa de amplificação do ADN de DHFR endógeno e integrado. As intensidades das bandas de hibridação nos "Southern blots" da figura 19 foram medidas num "phosphorimager" e corrigidas para os niveis de fundo para finalmente calcular as taxas de amplificação aproximadas dos genes de DHFR endógeno e integrado. P8 sonda EI dhfr integrado amplificação dhfr endógeno amplificação 100 nM 719624 3375 18649 800 nM 913578 2976 x 0,882 45283 x 2,428 1800 nM 831952 2950 x 0,874 81506 x 4,371 P9 sonda El dhfr integrado amplificação dhfr endógeno amplificação 100 nM 804142 16606 31161 1800 nM 842268 14430 x 0,869 69542 x 2,232

Tabela 4. Rendimentos de EPO em transfecções transientes de ADN. Os rendimentos por milhão de células semeadas foram determinados num ELISA de EPO nos sobrenadantes de células PER.C6, PER.C6/E2A e CHO que foram transfectadas com o vector de expressão pEP02000/DHFRwt na ausência ou presença de Soro Fetal Bovino a diferentes temperaturas de incubação, tal como descrito no exemplo 12.

Linha celular ± FBS Temperatura Rendimentos de EPO (unidades ELISA/1E6 células/dia) PER.C6/E2A + 39°C 3100 PER.C6/E2A - 39°C 2600 PER.C6 + 37°C 750 PER.C6 - 37°C 590 CHO + 37°C 190 CHO - 37°C 90 74 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Crucell Holland B.V.

Guus Hateboer,

Karina C.Verhulst,

Govert J.Schouten,

Alphonsus G.C.M Uytdehaag,

Abraham Bout, <120> Produção de proteína recombinante numa célula humana

<130> 0034 EP 01 DIV <140> PCT/NL00/00247 <141> 2001-10-12 <160> 29 <170> Patentln ver. 2.1

<210> 1 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador DHFR up < 4 0 0 > 1 gatccacgtg agatctccac catggttggt tcgctaaact g 41

<210> 2 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador DHFR down <400> 2 gatccacgtg agatctttaa tcattcttct catatac 37

<210> 3 <211> 85 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: fragmento poliligante < 4 0 0 > 3 accggtgaat tcggcgcgcc gtcgacgata tcgatcggac cgacgcgttc gcgagcggcc 60 gcaattcgct agcgttaacg gatcc 85

< 210 > 4 <211> 86 <212> ADN <213> Sequência artificial 75 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador <400> 4 accggtgaat tgcggccgct cgcgaacgcg tcggtccgta tcgatãtcgt cgacggcgcg 60 ccgaattcgc tagcgttaac ggatcc 86

<210> 5 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> Descrição de sequência artificial: iniciador oligonucleotidico EPO-START <400> 5

aaaaaggatc cgccaccatg ggggtgcacg aatgtcctgc ctg 43 <210> 6 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> Descrição de sequência artificial: iniciador oligonucleotidico EPO-STOP <400> 6 aaaaaggatc ctcatctgtc ccctgtcctg caggcctc 38

<210> 7 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador LTR-1 < 4 0 0 > 7 ctgtacgtac cagtgcactg gcctaggcat ggaaaaatac ataactg 47

<210> 8 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador LTR-2 < 4 0 0 > 8 gcggatcctt cgaaccatgg taagcttggt accgctagcg ttaaccgggc gactcagtca 60 atcg 64

<210> 9 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial 76 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: iniciador HSA1 < 4 0 0 > 9 gcgccaccat gggcagagcg atggtggc 28

<210> 10 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador HSA2 <400> 10 gttagatcta agcttgtcga catcgatcta ctaacagtag agatgtagaa 50

<210> 11 <211> 10 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido < 4 0 0 > 11 ttaagtcgac 9

<210> 12 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> Descrição de sequência artificial: ligante oligo contendo um local PacI < 4 0 0 > 12 aattgtctta attaaccgct taa 23

<210> 13 <211> 67 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador oligonucleotídico PLL-1 <400> 13 gccatcccta ggaagcttgg taccggtgaa ttcgctagcg ttaacggatc ctctagacga 60 gatctgg 67

<210> 14 <211> 67 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador oligonucleotídico PLL-2 77 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ < 4 Ο Ο > 14 ccagatctcg tctagaggat ccgttaacgc tagcgaattc accggtacca agcttcctag 60 ggatggc 67

<210> 15 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador CMVplus <400> 15 gatcggtacc actgcagtgg tcaatattgg ccattagcc 39

<210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: iniciador CMVminA <400> 16 gatcaagctt ccaatgcacc gttcccggc 29

< 210 > 17 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador CAMH-UP <400> 17 gatcgatatc gctagcacca agggcccatc ggtc 34

<210> 18 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador CAMH-DOWN <400> 18 gatcgtttaa actcatttac ccggagacag 30

<210> 19 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: iniciador CAML-UP <400> 19 gatccgtacg gtggctgcac catctgtc 28 78 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ <210> 20

< 211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: iniciador CAML-DOWN <400> 20 gabcgbbbaa accbaacacb cbccccbgbb g 31 < 210 > 21 <211> 20 <212> PRT < 213 > Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: sequência de comando < 4 0 0 > 21 Met 1 Ala cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu vai lie Ser Thr cys 5 10 15 Leu Glu Phe Ser Met 20 <210> 22 <211> 60 <212> ADN < 213 > Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: sequência de comando < 4 0 0 > 22 abggcabgcc cbggcbbccb gbgggcacbb gbgabcbcca ccbgbcbbga abbbbccabg 60

<210> 23 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador UBS-UP <400> 23 gabcacgcgb gcbagccacc abggcabgcc cbggcbbc 38

<210> 24 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador UBSHV-DOWN <400> 24 gabcgcbagc bgbcgagacg gbgaccag 28 79 ΕΡ 1 533 380/ΡΤ <210> 25 <211> 29

< 212 > ADN <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: iniciador UBSLV-DOWN <400> 25 gatccgtacg cttgatctcc accttggtc 29

<210> 26 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> Descrição de sequência artificial: iniciador 15C5-UP <400> 26 gatcacgcgt gctagccacc atgggtactc ctgctcagtt tcttggaatc 50

<210> 27 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: iniciador directo <400> 27 attggcgcgc caccatgaag actatcattg ctttgagcta c 41

<210> 28 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: iniciador inverso <400> 28 gatgctagct catctagttt gtttttctgg tatattccg 39

<210> 29 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: outro iniciador inverso <400> 29 gatgctagct cagtctttgt atcctgactt cagttcaaca cc 42

Lisboa, 2010-02-03

Claims (11)

1. ΕΡ 1 533 380/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Célula PER.C6 tal como depositada na ECACC sob o n.° 96022940, caracterizada por compreender adicionalmente, integrado no seu genoma, um ADNc que codifica alfa-2,3-sialiltransferase, alfa-2,6-sialiltransferase ou beta-1,4-galactosiltransferase.
2. 2. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ADNc codifica alfa-2,6-sialiltransferase.
3. 3. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ADNc codifica alfa-2,3-sialiltransferase.
4. 4. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida célula compreende adicionalmente pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante.
5. 5. Célula de acordo com a reivindicação 4, em que o pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante está sob o controlo de um promotor de CMV.
6. 6. Célula de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5, em que o pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante está integrado no genoma da referida célula.
7. 7. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-6, em que a proteína recombinante é uma proteína humana.
8. 8. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-7, em que a proteína recombinante é eritropoietina ou um seu derivado, homólogo ou fragmento funcional.
9. 9. Método para a produção de pelo menos uma proteína recombinante numa célula, compreendendo a cultura de uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-8 num meio adequado e a colheita da proteína recombinante a partir da referida célula e/ou do referido meio. ΕΡ 1 533 380/ΡΤ 2/2
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido meio adequado está isento de soro derivado de animais ou de seres humanos.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que a referida célula está em suspensão durante a referida cultura. Lisboa, 2010-02-03