MX2011000891A - Variantes estructurales de anticuerpos para caracteristicas terapeuticas mejoradas. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD2O humanizados, quiméricos o humanos, sustituidos o sus fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos o proteínas de fusión que comprenden los anticuerpos sustituidos o sus fragmentos de unión a antígeno. Los anticuerpos, las proteínas de fusión o los fragmentos son útiles para tratamiento de trastornos de célula B, tales como malignidad es de célula B y enfermedades autoinmunes, así como también GVHD, rechazo de trasplante de órganos y anemia hemolítica y crioglobulinemia. Las sustituciones de aminoácidos, particularmente la sustitución de un residuo de aspartato en la posición 101 de Kabat de VH de CDR3 (CDRH3), resulta en propiedades terapéuticas mejoradas, tales como regímenes de disociación disminuidos, actividad de CDC mejorada, apoptosis mejorada, debilitamiento de célula B y eficacia terapéutica mejorada a dosificaciones muy bajas. Veltuzumab, un anticuerpo anti-CD20 humanizado que incorpora tales variaciones de secuencias, exhibe eficacia terapéutica mejorada en comparación con anticuerpos similares de diferente secuencia de CDRH3, que permite el efecto terapéutico a dosificaciones tan bajas como 200 mg o menos, más preferiblemente 100 mg o menos, más preferiblemente 80 mg o menos, lo más preferible 30 mg o menos de anticuerpo desnudo cuando se administra i. v. o s. c.

Description

VARIANTES ESTRUCTU RALES DE ANTICU ERPOS PARA CARACTERISTICAS TERAPEUTICAS MEJORADAS Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U . C. 1 1 9(e) de la Solicitud de Patente Provisional de E . U . No. de Serie 61 //082.399, presentada el 21 de Julio de 2008.

Antecedentes de la Invención Campo de la Invención La presente invención se refiere a variantes estructurales de anticuerpos anti-CD20 y/o fragmentos de unión de antígeno de los mismos, que involucran de preferencia las secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de complementariedad (CDRs), con características terapéuticas mejoradas. En modalidades particulares, la variación estructural puede comprender cambios a la tercera secuencia de CDR de la cadena pesada de anticuerpo (CDRH3), por ejemplo sustitución de un residuo de aspartato por un residuo de asparagina en la posición 1 01 de Kabat. En otras modalidades particulares, la variación estructural puede comprender un residuo de arginina en la posición 94 de Kabat, que puede formar un puente de sal con un aspartato en la posición de 101 de Kabat. En todavía otras modalidades particulares, la variación estructural puede comprender un residuo de valina en la posición 1 02 de Kabat. Tales variantes estructurales pueden proporcionar eficacia mejorada para enfermedades relacionadas con la proliferación de células B , tales como leucemias, linfomas o enfermedades autoinmunes de célula B, así como también otras enfermedades autoinmunes que implican células B . En modalidades preferidas, la eficacia mejorada puede permitir la administración de dosificaciones bajas de anticuerpo anti-CD20 ó fragmento de unión de antígeno del mismo, tal como 80 mg o menos, más preferiblemente 50 mg o menos, lo más preferible 30 mg o menos, que puede administrarse dos o más veces con separación de aproximadamente una a tres semanas, o aún dos o más veces por semana.

El anticuerpo anti-CD20 puede ser un anticuerpo anti-CD20 quimérico o humano, humanizado, particularmente un anticuerpo monoclonal (MAb). Otras modalidades pueden involucrar conjugados de anticuerpos anti-CD20 quiméricos o humanos, humanizados, terapéuticos y/o de diagnóstico y métodos para tratar linfomas y leucemias de célula B y varias enfermedades autoinmunes, por ejemplo usando anticuerpos anti-CD20 quiméricos o humanos, humanizados. Aun otras modalidades pueden relacionarse con proteínas de fusión de anticuerpo o fragmentos de unión de las mismas que comprenden por lo menos un MAb anti-CD20 o fragmento de unión del mismo, en algunos casos en combinación con un segundo anticuerpo diferente, especialmente anticuerpo anti-CD20, de preferencia MAb anti-CD20, o fragmento de unión de antígeno del mismo. Los MAb's quiméricos o humanos, humanizados, sus fragmentos de unión de antígeno o proteínas de fusión de anticuerpo pueden administrarse solos, como un inmunoconjugado terapéutico o en combinación con uno o más agentes terapéuticos, con otros anticuerpos desnudos u otros inmunoconjugados. Otras modalidades aun se refieren a secuencias de ADN que codifican anticuerpos anti-CD20 quiméricos o humanos, humanizados y proteínas de fusión de anticuerpo, vectores y células huésped que contienen las secuencias de ADN y métodos para hacer los anticuerpos anti-CD20 quiméricos o humanos, humanizados.

Antecedentes de la Invención El sistema inmune de los vertebrados consiste de un número de órganos y tipos de células que han evolucionado para reconocer con precisión antígenos extraños, unirse específicamente a, y eliminar/destruir tales antígenos extraños. Los linfocitos, entre otros, son críticos para el sistema inmune. Los linfocitos se dividen en dos subpoblaciones mayores, células T y células B. Aunque son interdependientes, las células T son responsables en gran medida de la inmunidad mediada con células y las células B son responsables en gran medida de la producción de anticuerpos (inmunidad humoral).

En humanos, cada célula B puede producir un número enorme de moléculas de anticuerpos. Tal producción de anticuerpos cesa típicamente (o disminuye sustancialmente) cuando un antígeno extraño ha sido neutralizado. Ocasionalmente, sin embargo, la proliferación de una célula B en particular continuará inalterada y puede resultar en cánceres conocidos como linfomas o leucemias de célula B . Los linfomas de célula B , tal como el subtipo de célula B de linfoma de no Hodgkin , son contribuyentes significativos de la mortalidad por cáncer. La respuesta de las malignidades de célula B a varias formas de tratamiento es mixta. Por ejemplo, en casos en los cuales es posible el montaje cl ínico adecuado de linfoma de no Hodgkin , la terapia con radiación de campo puede proporcionar tratamiento satisfactorio. Aun así, aproximadamente una mitad de los pacientes mueren de esta enfermedad . Devesa et al , J. Nat. Cáncer Inst. 79:701 ( 1 987 ).

La mayoría de las leucemias linfocíticas crónicas son de linaje de célula B . Freed man , Hematol. Oncol. Clin. North Am. 4:405 ( 1 990). Este tipo de malignidad de célula B es la leucemia más común en el mundo occidental . Goodman et al , Leukemia and Lymphoma 22 : 1 ( 1 996). La historia natural de la leucemia linfocítica crónica cae en varias fases. En la fase temprana, la leucemia linfocítica crónica es una enfermedad indolente, caracterizada por la acumulación de células B malignas maduras funcionalmente incompetentes que tienen periodo de vida alargado. Eventualmente, el paso ligero de las células B malignas disminuye y los pacientes se vuelven crecientemente sintomáticos. Aunque el tratamiento puede proporcionar alivio sintomático , la supervivencia global de los pacientes solamente se afecta de manera mínima . Las etapas finales de la leucemia linfocítica crónica se caracterizan por anemia y/o trombocitopenia significativas. En este punto, la supervivencia media es menor a dos años. Foon et al . , Annals Int. Medicine 1 1 3:525 ( 1 990). Debido al régimen muy bajo de proliferación cel ular, la leucemia linfocítica crónica es resistente a tratamiento con fármacos citotóxicos. Las leucemias li nfocíticas tanto crónica como aguda, de origen en células B son blancos adecuados para las terapias descritas en la presente.

Los métodos tradicionales de tratamiento de malignidades de células B , incluyendo la quimioterapia y la radioterapia , tienen utilidad limitada debido a los efectos tóxicos secundarios. El uso de anticuerpos monoclonales para dirigir radionúclidos, toxinas u otros agentes terapéuticos ofrece la posi bilidad de que tales agentes puedan ser entregados selectivamente en los sitios del tumor, li mitando así la toxicidad a los tejidos normales. También , la presencia de antígenos de células B en estas malignidades de cél ulas B las hace blancos óptimos para terapia con anticuerpos de células B no conjugados, tal como contra marcadores CD 1 9, CD20, CD21 , CD23, y CD22 en células B . HLA-DR, CD30, CD37, CD40 , CD45, CD70 , CD79a y otros antígenos pueden servir como blancos o dianas u objetivos para células B normales y malignas, aunque se expresan también en otros tipos de células. Además, ciertos antígenos M UC1 , M UC2 , M UC3 y M UC4, de preferencia LIC1 , así como también factores de crecimiento como insulina (I LGF), receptor de factor de crecimiento como insulina, factor de inhibición de migración de macrófagos (M I F), se expresan también en malignidades hematopoyéticas diferentes, incluyendo tumores de células B que expresan CD20 y otros marcadores de células B. Aun otros blancos de antígenos, tales como aquellos asociados con el endotelio vascular de los tumores, incluyendo tenascin , receptor del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGFR) y factor de crecimiento de placenta (PIGF), así como también otras categorías de antígenos asociados con malignidades de células B, tales como productos de oncogén (cM ET, Kras, bcl-2, bcl-6), son blancos adecuados también para anticuerpos terapéuticos.

Las células B comprenden proteínas de la superficie de la célula que pueden ser utilizadas como marcadores para diferenciación e identificación . Uno de tales marcadores de células B humanas es el antígeno de diferenciación restringido por linfocitos B humanos, Bp35, aludido como CD20. El CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de células pre-B y permanece hasta la diferenciación celular en plasma. El CD20 se expresa tanto en células B normales como en células B malignas cuyo crecimiento anormal puede conducir a linfomas y leucemias de célula B. Los anticuerpos contra el antígeno CD20 han sido investigados para la terapia de linfomas y leucemias de célula B . Por ejemplo, un anticuerpo quimérico CD20, designado como "I DEC-c2B8" (rituximab), tiene actividad contra linfomas de célula B cuando se proporciona como anticuerpos conjugados en inyecciones repetidas de dosis que exceden de 500 mg por inyección. Maloney et al. , Blood 84:2457 ( 1 994); Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 : 353 ( 1 996). Aproximadamente 50% de pacientes no Hodgkin , que tienen la forma indolente de grado bajo, tratados con este régimen mostraron respuestas. Las respuestas terapéuticas se han obtenido también usando anticuerpo monoclonal de múrido anti-CD20 (tositumomab) B 1 etiquetado con 1 31 l cuando se proporciona como dosis repetidas con pretratamiento de anticuerpos no etiquetados que exceden 600 mg por inyección. Kaminski et al . , N. Engl. J. Med. 329:459 ( 1 993); Press et al . , N. Engl. J. Med. 329: 1 219 ( 1 993); Press et al , Lancet 346 : 336 ( 1 995 ). Sin embargo , estos anticuerpos, ya sea proporcionados como formas no conj ugadas o como formas radioetiquetadas, no han mostrado reg ímenes elevados de respuestas objetivas y durables en pacientes con la forma más prevalente y letal de linfoma de célula B , los tipos intermedios o agresivos. Por lo tanto , existe una necesidad de desarrollar una inmunoterapia para malignidades de célula B que alcance una respuesta terapéutica de d uración significativa .

Se han realizado estudios adicionales que apuntan al antígeno de superficie CD20 usando un anticuerpo monoclonal de múrido anti-CD20, 1 F5 , que se administró mediante infusión intravenosa conti nua a pacientes con linfoma de célula B . Se reportó que se requi rieron niveles extremadamente altos (>2 gramos) de 1 F5 para agotar las células de tumor circulantes y los resultados fueron descritos como siendo "transitorios" . "Press et al . , "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B- Cell Lymphomas". Blood 69/2 : 584-591 ( 1 987 ). Sin embargo, un problema potencial con este enfoque es que los anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo , anticuerpos monoclonales de múrido) carecen típicamente de funcionalidad efectora humana , es decir, son incapaces de mediar la lisis depend iente complementaria o lisar células humanas objetivo a través de toxicidad celular dependiente de anticuerpo o fagocitosis mediada por receptor Fe. Además , los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por el huésped humano como una proteína extraña y, por lo tanto, las inyecciones repetidas de tales anticuerpos extraños pueden conduci r a la inducción de respuestas inmunes que cond ucen a reacciones dañinas de hipersensibilidad . Para anticuerpos monoclonales con base en múrido, ésta se alude con frecuencia como una respuesta de Anticuerpo H umano Anti-Ratón ( HAMA).

Se prefiere el uso de anticuerpos quiméricos porque no provocan tan fuerte una respuesta HAMA como los anticuerpos de múrido. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos que comprenden porciones de dos o más especies diferentes. Por ejemplo, Liu , A. Y . et al , "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immunol. 1 39/1 0: 3521 -3526 ( 1 987), describen un anticuerpo quimérico de ratón/humano dirigido contra el antígeno CD20. Ver también , Publicación de PCT No. WO 88/04936. Un anticuerpo quimérico de ejemplo comprendería secuencias de región variable de ratón unidas a secuencias de región constante de anticuerpo humano .

El uso de anticuerpos humanizados es aun más preferido, con el fin de red ucir adicionalmente la posibilidad de inducir una reacción de HAMA. Como se discute más adelante, las técnicas para humanización de anticuerpos de múrido mediante el reemplazo del marco de múrido y secuencias de región constante con marco de anticuerpo humano correspondiente y secuencias de región constante son bien conocidas en la técnica y se han aplicado a numerosos anticuerpos anticáncer de múrido. La humanización de anticuerpos puede involucrar también la sustitución de uno o más resid uos de aminoácido de marco humano con los residuos correspondientes de las secuencias mad res de la región de marco de múrido .

Otro enfoque que ha mejorado la habilidad de los anticuerpos para ser efectivos en el tratamiento de trastornos de célula B ha sido conjugar un agente terapéutico, tal como un agente radiactivo o quimioterapéutico con el anticuerpo, de manera que el agente es ubicado en el sitio del tumor. Por ejemplo, el anticuerpo 1F5 antes referido y otros anticuerpos de célula B han sido etiquetados con 131l y fueron evaluados para biodistribución en dos pacientes. Ver Eary, J. F. et al., "Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. 31/8:1257-1268 (1990); ver también, Press, O. W. et al., "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody" J. Clin. Oncol. 7/8:1027-1038 (1989) (indicación de que un paciente tratado con 1F5 etiquetado con 131l alcanza una respuesta parcial); Goldenberg, D. M. et al., "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with 13 l-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J. Clin. Oncol. 9/4:548-564 (1991) (tres de ocho pacientes que reciben inyecciones múltiples reportaron haber desarrollado una respuesta de HAMA para este anticuerpo CD22 de múrido); Appelbaum, F. R. "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem. /Oncol. Clinics of N. Am. 5/5:1013-1025 (1991) (revisar artículo); Press, O. W. et al. "Radiolabeled- Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support." New England Journal of Medicine 329/17:1219-12223 (1993) (1 1l-labeled antt-CD20 antibody IF5 and B1-tositumomab); y Kaminski, M. G. et al "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with [131l] Anti-BI (Anti-CD20) Antibody" NEJM 329/7:459 (1993) (131l-labeled anti-CD20 antibody Bl); solicitud publicada PCT WO 92/07466 (anticuerpos conjugados con agentes quimioterapéuticos tales como doxorubicin o mitomicin). Sin embargo, estos enfoques no han eliminado los obstáculos asociados con el uso de anticuerpos de múrido, a pesar del hecho de que muchos pacientes con linfoma quienes han recibido qui mioterapia citotóxica agresiva previa están inmuno suprimidos, teniendo así reg ímenes de HAMA menores que los pacientes con linfoma quienes no han sido pretratados i ntensamente.

Las enfermedades autoinmunes son una clase de enfermedades asociadas con trastornos de las células B . Los ejemplos comprenden purpura trombocitopénica idiopática aguda , purpura trombocitopénica idiopática crónica , corea dermatomiositis de Sydenham , myasthenia gravis, lupus eritematoso sistémico, lupus nefritis, fiebre reumática, síndromes poliglandulares, penfigoide bulloso, diabetes mellitus tipo I , purpura Henoch-Schónlein , nefritis post-estreptococcal , eritema nodosum , arteritis de Takayasu , enfermedad de Addison , artritis reumatoide , esclerosis múltiple, sarcoidosis, colitis ulcerante, eritema multiforme, nefropatía IgA, poliarteritis nodosa, espondilitis anquilosante , síndrome de Good pasture, tromboangeitis obliterante, síndrome de Sjogren , ci rrosis biliar primaria, tiroiditis de Hashimoto, tirotoxicosis, escleroderma , hepatitis crónica activa , polimiositis/dermatomiositis, policond ritis, pénfigo vulgaris, granulomatosis de Wegener, nefropatía membranosa , esclerosis lateral amiotrófica , tabes dorsalis, arteritis/polimialgia de célula gigante, anemia perniciosa, glomerulonefritis rápidamente progresiva y alveolitis fibrosante. Los tratamientos más comunes los fármacos corticosteroides y citotóxicos, los cuales pueden ser muy tóxicos. Estos fármacos suprimen también el sistema inmune entero, lo que puede resultar en infección seria, y tiene efectos perjudiciales en la médula ósea, el h ígado y los ríñones. Existe una necesidad de métodos más efectivos para tratar enfermedades autoinmunes particularmente enfermedades autoinmunes Clase I I I . Existe una necesidad más para el desarrollo de anticuerpos más efectivos para el tratamiento de cáncer y/o enfermedades autoinmunes .

Otras enfermedades aun con desregulación inmunológica se tratan adecuadamente mediante las composiciones y métodos novedosos descritos en la presente , tales como las anemias hemol íticas, crioglobulinemias, hepatitis (particularmente hepatitis C), enfermedad de injerto-versus-huésped (GVHD) (particularmente después de trasplante alogénico de células mad re), alosensibilización (particularmente con trasplante de órgano). Ahora hay evidencia de que las células B están involucradas en estos estados patológicos, así que agotar las células B mediante terapias de anti-células B está ganado interés ( Roccatello et al, Clin Rev Allergy Immunol 2008, 34: 1 1 1 -1 1 7; Cutler et al , Blood 2006, 108:756-752 ; Vo et al , N Engl J Med 2008, 359:242-251 ; Vieira et al , Transplantation 2004;77: 542-548; Abdallah & Prak, Clin. Transpl 2006:427-37; Zaja et al, Bone Marrow Transplant, 2007, 40:273-77; Saadoun et al , Curr. Opin. Rheumatol. 2008 , 20:23-8; Antonelli et al , Clin. Exp. Rheumatol. 2008, 26:S39-47).

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona variantes estructurales de anticuerpos anti-CD20 y/o fragmentos de unión de antígeno de los mismos con características terapéuticas mejoradas. En modalidades particulares, la variación estructural puede comprender un residuo de aspartato en la posición 1 01 de Kabat, por ejemplo como una sustitución para un residuo de asparagina, en VH de CDR3 (CDRH3). En otras modalidades particulares, la variación estructural puede comprender un residuo de arginina en la posición 94 de Kabat, que puede formar un puente de sal con un aspartato en la posición 101 de Kabat. En todavía otras modalidades particulares, la variación estructural puede comprender un residuo de valina en la posición 1 02 de Kabat. El experto se dará cuenta de que las sustituciones posibles de aminoácidos que se pueden realizar no están limitadas los ejemplos particulares mencionados anteriormente y pueden comprender sustituciones en posiciones adicionales y/o diferentes de Kabat.

Las características terapéuticas mejoradas pueden tener una variedad de formas, tal como un régimen más lento de disociación a partir del antígeno objetivo, un incremento en citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o una reducción en EC5o en citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). En modalidades preferidas, las características pueden incluir la eficacia a una dosificación menor, de preferencia una dosificación de 80 mg o menos para un sujeto humano, más preferiblemente una dosificación de 50 mg o menos, lo más preferible una dosificación de 30 mg o menos. La dosificación puede administrarse dos o más veces. De preferencia, cuando se proporcionan administraciones múltiples, se pueden administrar aproximadamente con 1 a 3 semanas de separación . Pero en cierto establecimiento de la enfermedad , se prefiere una dosificación fraccionada, más frecuente, tal como, por ejemplo, dos veces a la semana durante 4 o más semanas en leucemia linfocítica crónica.

En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CD20 o fragmentos de unión de antígeno de los mismos pueden ser anticuerpos quiméricos o humanos, humanizados que se unen a un marcador de célula B humana, tales como anticuerpos anti-CD20, para uso en el tratamiento y diagnosis de trastornos de célula B , tales como malignidades de células B y enfermedades autoinmunes, así como también otras enfermedades que involucran a las células B , tales como GVH D, anemia hemol ítica, crioglobulinemia, alosensibilización y en rechazo de trasplante de órganos, así como también ciertas enfermedades virales, tal como hepatitis C. Los anticuerpos anti-CD20 quiméricos o humanos, humanizados, se pueden usar para métodos de tratamiento de sujetos mam íferos, tales como humanos o animales domésticos, como anticuerpos desnudos ya sea solos o en combinación con uno o más agentes terapéuticos, como inmunoconjugados etiquetados con uno o más agentes terapéuticos y/o de diagnóstico, como una proteína de fusión de anticuerpo, en métodos de pre-selección de objetivo con constructos seleccionares como objetivos que están conjugados con uno o más agentes terapéuticos o de diagnosis, o como una terapia multimodal con otros anticuerpos, otros agentes terapéuticos o immunomoduladores. Los anticuerpos anti-CD20 quiméricos o humanos, humanizados, se pueden usar también como un agente solo de formación de imagen de diagnóstico, en combinación con otros agentes de formación de imagen de diagnóstico y/o en conjunto con aplicaciones terapéuticas.

El experto se dará cuenta que los métodos y composiciones descritos para variaciones de secuencias con características terapéuticas mejoradas no están limitados a anticuerpos anti y pueden aplicarse a anticuerpos contra otros antígenos asociados con tumores o antígenos asociados con enfermedades autoinmunes y otras inmunes, incluyendo, pero no limitadas a, anhidrasa carbónica IX, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-d, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM6, B7, ED-B fibronectina, Factor H, FHL-1, Flt-1, Flt-3, receptor de folato, GROB, HMGB-1, factor inducible por hipoxia (HIF), HM1.24, factor-1 de crecimiento parecido a la insulina (ILGF-1), ILGF-1R, IFN-Y, IFN-a, IFN-ß, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, UC1 , MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, NCA-95, NCA-90, la, HLA-DR, tenascin, Le(y), RANTES, T101, TAC, antígeno Tn, antígenos Thomson-Friedenreich, antígenos de necrosis de tumor, TNF-a, receptores TRAIL (R1 y R2), VEGFR, EGFR, PIGF, factores de complemento C3, C3a, C3b, C5a, C5, y productos de oncogén, incluyendo bcl-2, bcl-6, Kras y cMET.

Otras modalidades pueden estar dirigidas a MAbs anti-CD20 o fragmentos de unión de antígenos de los mismos que contienen CDRs de múrido específicos o una combinación de CDRs de múrido a partir de más de un MAb anti-CD20 de múrido o quimérico. Estos MAbs pueden ser MAbs anti-CD20 quiméricos o humanos, humanizados. Las secuencias de CDR pueden incluir, pero no están limitadas a, secuencias CDR de cadena ligera CDRLI (RASSSVSYI H , SEQ I D NO: 1 ), CDRL2 (ATSN LAS, SEQ ID NO:2) y CDRL3 (QQWTSN PPT, SEQ I D NO:3) y secuencias CDR cadena pesada CDRH 1 (SYN MH , SEQ I D NO:4), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG, SEQ I D NO:5) y CDRH3 (STYYGGDWYFDV, SEQ I D NO:6).

Varias modalidades pueden involucrar anticuerpos biespecíficos o proteínas de fusión de anticuerpo que comprenden por lo menos dos MAbs anti-CD20 o fragmentos de unión de antígeno de los mismos o un primer MAb que comprende un MAb anti-CD20 o un fragmento de unión de antígeno del mismo y un segundo MAb. El segundo MAb puede unirse a un antígeno asociado con tumor, tal como aquellos enlistados anteriormente, o un hapten , por ejemplo un conjugado como objetivo posible.

Otras modalidades pueden involucrar conjugados terapéuticos o de diagnóstico de MAbs anti-CD20 o fragmentos de unión de antígeno de los mismos o proteínas de fusión de anticuerpo, unidos a por lo menos un agente terapéutico o por lo menos un agente de diagnóstico. Los anticuerpos y las proteínas de fusión con múltiples agentes terapéuticos del mismo tipo o diferente están abarcados también. En modalidades alternativas, los anticuerpos anti-CD20 , fragmentos de unión de antígeno o proteínas de fusión se pueden usar en métodos de preselección de objetivo, terapéuticos o de diagnóstico, por ejemplo usando anticuerpos biespecíficos con un brazo que se une específicamente a una célula , enfermedad , tejido o patógeno (por ejemplo, antígeno objetivo asociado con la hepatitis C) y un segundo brazo que se une a un conjugado que se puede seleccionar como objetivo unido a uno o más agentes de diagnóstico o terapéuticos. Los métodos de preselección de objetivo con anticuerpos biespecíficos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, las Patentes de E . U . Nos. 7 ,300 ,644; 7, 1 38, 1 03; 7 ,074,405; 7 ,052 ,872; 6,962 , 702; 6,458,933, cuya sección de ejemplos de cada una se incorpora en la presente por referencia).

Modalidades alternativas pueden involucrar métodos para usar los MAb's anti-CD20 o fragmentos de unión de antígeno de los mismos o proteína de fusión de anticuerpo para terapia, ya sea solos, en combinación con uno o más otros agentes terapéuticos, por ejemplo como el componente de anticuerpo de un inmunoconjugado terapéutico con uno o más agentes terapéuticos o como un anticuerpo desnudo, fragmento de unión de antígeno o proteína de fusión administrado solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. El uso para métodos de diagnóstico en combinación con uno o más agentes de diagnóstico está contemplado también. En modalidades preferidas, la enfermedad a ser diagnosticada o tratada es una enfermedad inmune mediada con células B enfermedad autoinmune, linfoma o leucemia de célula B . Enfermedad inmune mediada por célula B se refiere a una subclase de enfermedad autoinmune, así como también las otras enfermedades inmunes antes discutidas (por ejemplo, GVH D, crioglobulinemia, anemia hemolítica, alosensibilización , rechazo de 5 órgano de trasplante) en las cuales el estado de enfermedad es mediado principalmente por la producción de anticuerpos, en lugar de por linfocitos autorreactivos, o por una combinación de inmunidad de células B y T.

Breve Descripción de las Figuras 10 Figura 1 . Secuencias de cA20 de cadena ligera variable (cA20Vk) y de cadena pesada variable (cA20VH ), un anticuerpo anti-CD20 quimérico. Las secuencias de región CDR se muestran en negritas y subrayadas. Los residuos de aminoácidos y los nucleótidos están numerados secuencialmente y se usa el mismo sistema de numeración 15 para secuencias humanizadas V mostradas en la Figura 2. La región variable de cadena ligera se muestra en la Figura 1 A (SEQ ID NOS 7 y 8) y la región variable de cadena pesada se muestra en la Figura 1 B (SEQ I D NOS 9 y 1 0). Se usó el esquema de numeración de Kabat para residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos 20 numerados mediante una letra representan el residuo de inserción de acuerdo con Kabat, y tienen el mismo número que el del residuo previo.

Figura 2. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de hA20Vk ! de cadena ligera hA20 (Figura 2A) (SEQ I D NOS 1 1 y 1 2), y hA20VHI ! de cadena pesada (Figura 2B ) (SEQ I D NOS 1 3 y 1 4), así como 25 también las secuencias de los vectores de escalonamiento de flancos I adyacentes del VKpBR2 (Figura 2A) y VHpBS2 (Figura 2B), respectivamente. Las frecuencias no trasladadas de nucleótidos se muestran en minúsculas. Los sitios de restricción usados para subclonar están subrayados e indicados. La secuencia de péptidos de señal de secreción está indicada mediante un doble subrayado.

Figura 3. Comparación de las secuencias de región variable de cA20 (SEQ ID NOS 8 y 10), rituximab (de múrido C2B8, SEQ ID NOS1 5 y 16). Los puntos indican homolog ía con cA20. Secuencias de CDR están en caja. Se muestran las secuencias de región variable de cadena pesada (Figura 3A) y de cadena ligera (Figura 3B ).

Figura 4. Análisis de Scatchard - se determinaron las características de unión de veltuzumab y rituximab mediante unión de MAbs etiquetados con 1 25l para células Raji . Se determinaron unión de saturación de superficie de célula directa y análisis de gráfica de Scatchard ( recuad ro) - veltuzumab de triángulos cerrados; se determi naron círculos rituximab Bma x y Kd mediante análisis de regresión no lineal usando un modelo de unión de un sitio con software Prism . Estos resultados son representativos de uno de tres experimentos repetidos.

Figura 5. Comparación de reg ímenes de disociación de veltuzumab y rituxi mab de células vivas. Se tiñeron células Daud i (A), Ramos (B) y Raji (C-E) con rituximab etiquetado con PE (triángulo cerrado), veltuzumab (cuadro cerrado), cA20 (triángulo cerrado invertido ), DIOI N (círculo cerrado), 1 F5 (círculo abierto) o B 1 tositumomab) (cuadro abierto). Los MAbs etiquetados se incubaron a 37°C con (A-D) o sin (E) exceso de veltuzumab Fab'-N EM y las cél ulas se analizaron mediante citometría de flujo con el tiempo. El fuera de régi men se determinó mediante regresión no lineal (una degradación exponencial de fase) y se generaron valores P mediante prueba F usando software G raphPad Prism .

Figura 6. Efectos de veltuzumab y rituximab en proliferación de l íneas de células de linfoma de no Hodgkin . Se evaluaron efectos antiproliferantes mediante ensayos de citotoxicidad MTT. Se cultivaron células con el MAbs con o sin un segundo anticuerpo para entrelazamiento . Barras blancas, no segundo anticuerpo ; barras grises con segundo anticuerpo GAH ; barras de error, S D.

Figura 7. Agotamiento in vitro de células B de donadores de sangre saludables. Se evaluó in vitro el efecto de veltuzumab en linfocitos sanguíneos periféricos de voluntarios saludables usando citometría de flujo. Se muestra dismi nución en el porcentaje de células CD 1 9+ presentes en el portal de li nfocitos después de dos d ías de incubación de sangre entera heparinizada de voluntarios sal udables con veltuzumab. Cada l ínea representa un donador de sangre diferente. Barras de error, S D.

Figura 8. Curvas de supervivencia para veltuzumab en un modelo xenográfico de linfoma de Burkitt que compara administración intraperitoneal versus subcutánea. A ratones C.B . 1 7 SCID se les administró células Daudi 1 .5 x 1 07 i . v. en el d ía 0. La terapia con veltuzumab empezó el d ía 1 con ratones que reciben ya sea una sola inyección i . p. o una sola inyección s. c. de veltuzumab. Las dosis administradas fueron 60, 20 o 5 g de veltuzumab. Ratones de control recibieron una inyección i. p. de salina o 60 pg IgG hMN-14 (labetuzumab, anticuerpo igualado de isótopo anti-CEACAM5).

Figura 9. Se determinó la dosis mínima efectiva de veltuzumab en un modelo xenográfico diseminado de linfoma de Burkitt. A ratones C.B. 17 SCID se les administró células Daudi 1.5 x 107 i. v. en el día 0. La terapia con veltuzumab empezó el día 1 con ratones que reciben una sola inyección i. p. de veltuzumab. Las dosis administradas fueron 0.5, 0.25, 0.1 o 0.05 g de veltuzumab. Ratones de control recibieron una i. p. de 200 pL de salina.

Figura 10. Curvas representativas de supervivencia de ratones que tienen linfoma celular folicular diseminado tratado con dosis decrecientes de veltuzumab. A ratones C.B. 17 SCID se les administró células WSU-FSCCL 2.5 x 108 i. v. en el día 0. En el día 5 los ratones recibieron una sola inyección i. p. de veltuzumab a una dosis de 35, 3.5, 0.35 o 0.035 pg. Los ratones de control salina solamente.

Figura 11. Se evaluó el efecto de agotamiento de células NK en actividad anti-linfoma en ratones SCID. Ratones C.B. 17 SCID se les agotó NK y neutrofilos como se describe en la sección de Métodos y se inyectaron con células Raji 1 x 106 i. v. La terapia con veltuzumab empezó el día 3 con ratones que reciben 200 pg i. v. de veltuzumab en los días 3, 5, 7 y 11. Los ratones de control recibieron 100 pL de salina.

Figura 12. Se administró veltuzumab en suero farmacocinético (150 pg) a ratones Swiss-Webster simples vía i. p. o por ruta s. c. Los animales fueron sangrados en un periodo de 1 4 d ías y el suero se ensayó para concentraciones de veltuzumab como se describe en el Ejemplo 1 1 (N=6).

Figura 1 3. Veltuzumab es más efectivo que rituximab para controlar el crecimiento in vivo de linfoma en ratones SCI D. Los ratones SCI D fueron inoculados con células Raji mediante inyección en la vena de la cola . En los d ías +5, + 1 0, + 1 5 y +20, los ratones recibieron rituximab o veltuzumab (hA20) en dosis de 1 0 mg/kg/dosis. El tratamiento con resultó en un tiempo de supervivencia acumulativo significativamente más largo en comparación con el tratamiento con una dosificación idéntica de rituximab (P = 0.005).

Figura 1 4. Estimados Kaplan-Meier de duración de respuesta (DR) y tiempo de progresión (TTP) para 24 respondedores de linfoma folicular en estudios humanos de efectos de veltuzumab en linfoma no Hodgkin .

Figura 1 5. Niveles de células B para pacientes de N HL tratados con veltuzumab en diferentes grupos de dosis medidas en l ínea de base, antes de las infusiones 2, 3 y 4, a 4 y 1 2 semanas más tarde, después en intervalos de 3 meses durante hasta 12 meses después de la última infusión .

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Como se usa en la presente, un anticuerpo se refiere a una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, que ocurre naturalmente o se forma mediante procesos recombinatorios de fragmentos de genes normales de inmunoglobulina) (por ejemplo, un anticuerpo de IgG) o una porción de unión de antígeno, immunológicamente activa, de una molécula de inmunoglobulina , como un fragmento de anticuerpo .

Un fragmento de anticuerpo es una porción de un anticuerpo tal como F(ab' )2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv y los similares. I ndependientemente de la estructura , un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antigeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-CD20 se une a CD20. El término "fragmento de anticuerpo" incluye también fragmentos aislados que consisten de regiones variables, tales como los fragmentos "Fv" que consiste en de las regiones variables de las moléculas de polipéptido de cadena sencilla recombi nante, de cadenas pesadas y ligeras, en las cuales las regiones variables ligera y pesada están conectadas mediante un vinculador de péptido ("proteínas scFv") y unidades m ínimas de reconocimiento que consisten de los residuos de ami noácidos que mimetizan la región hipervariable . Como se usa en la presente, el término "fragmento de anticuerpo" no incluye porciones de anticuerpos sin actividad de unión a antígeno, tales como fragmentos Fe.

Un anticuerpo desnudo se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que no está conj ugado con un agente terapéutico . La porción Fe de la molécula de anticuerpo puede proporcionar funciones efectoras, tales como fijación de complemento y ADCC (citotoxicidad de la célula dependiente del anticuerpo), que ponen mecanismos en acción que pueden resultar en la lisis de la célula. Sin embargo, es posible que la porción Fe no sea requerida para función terapéutica, con otros mecanismos, tal como la apoptosis, que entran en juego. Los anticuerpos desnudos pueden incluir anticuerpos policlonales y monoclonales, así como también anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos.

Un agente terapéutico es una molécula o átomo que se administra por separado, concurrentemente o secuencialmente con una porción de anticuerpo o conjugado con una porción de anticuerpo, es decir, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o un subfragmento , y es útil en el tratamiento de una enfermedad . Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, fármacos, toxinas, nucleasas, hormonas, inmunomoduladores, quelantes , compuestos de boro, agentes fotoactivos, oligonucleótidos (por ejemplo , oligonucleótidos antisentido o ¡ARN ) y radioi sótopos.

Un agente de diagnóstico es una molécula o átomo detectable que se puede conjugar con un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, constructo seleccionable como objetivo u otra porción para entregar a una célula , tejido , patógeno u otro objetivo asociado con una enfermedad o condición médica . Los agentes de diagnóstico útiles incluyen , pero no están limitados a , radioisótopos, ultrasonido, colorantes (tal como con el complejo de biotina-estreptavidin), agentes de contraste, compuestos o moléculas fluorescentes y agentes de potenciación (por ejemplo, iones paramagnéticos para formación de imágenes por resonancia magnética).

Un inmunoconjugado es un conjugado de un componente de anticuerpo con por lo menos un agente terapéutico o de diagnóstico. Un componente de anticuerpo puede conjugarse con múltiples agentes terapéuticos o de diagnóstico para formar un inmunoconjugado.

El término proteína de fusión de anticuerpo se puede referir a una molécula de unión de antígeno producida de manera recombinante en la cual están vinculados uno o más de los segmentos de anticuerpo o de fragmento de anticuerpo de cadena sencilla igual o diferente con las mismas especificaciones o diferentes. La valencia de la proteína de fusión indica cuántos brazos o sitios de unión tiene la proteína de fusión para un solo antígeno o epitope; es decir, monovalente, divalente, trivalente o multivalente. La multivalencia de la proteína de fusión de anticuerpo significa que puede aprovechar las interacciones múltiples al unirse a un antígeno, incrementando así la avidez de unión con el antígeno. La especificidad indica cuantos antígenos o epitopes diferentes es capaz de unir una proteína de fusión de anticuerpo; es decir, monoespecífica, biespecífica, triespecifica, multiespecífica. Usando estas definiciones, un anticuerpo natural , por ejemplo, un IgG es divalente porque tiene dos brazos de unión, pero es monoespecífico porque se une a un tipo de epitope. Las proteínas de fusión, monoespecíficas, multivalentes, tienen más de un sitio de unión para un epitope, pero solamente se unen con un epitope. La proteína de fusión puede comprender un solo componente de anticuerpo, una combinación multivalente o multiespecífica de diferentes componentes de anticuerpo o múltiples copias del mismo componente de anticuerpo. La proteína de fusión puede comprender adicionalmente un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo y un agente terapéutico. Ejemplos de agentes terapéuticos adecuados para tales proteínas de fusión incluyen inmunomoduladores ("proteína de fusión de anticuerpo-inmunomoduladores") y toxinas ("proteína de fusión de toxina-anticuerpo"). Una toxina preferida comprende una ribonucleasa (RNasa), de preferencia una RNasa recombinante. Otra proteína de fusión inmunomoduladora preferida es una inmunocitocina, tal como fusionar un interferón con un anticuerpo específico o anticuerpo multivalente o anticuerpo multiespecífico como se describe en la presente.

Un anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo que puede unirse simultáneamente a por lo menos dos objetivos que son de estructuras diferentes, por ejemplo, dos antígenos diferentes, dos epitopes diferentes en el mismo antígeno, o un hapten y/o un antígeno o epitope. Una especificidad puede ser para un antígeno o epitope de célula B , célula T, mieloide. plasma o célula mástil . Otra especificidad puede ser para un antígeno diferente en el mismo tipo de célula, tales como CD20, CD 1 9, CD21 , CD23, CD37, CD45, CD70, CD79a, CD80, HLA-DR, CD74 , M UC1 o CD22 en células B. Los anticuerpos multivalentes, multiespecíficos son constructos que tienen más de un sitio de unión , y los sitios de unión son de especificidad diferente.

Un anticuerpo específico es un anticuerpo que puede unirse simultáneamente a dos objetivos que son de estructura d iferente. En modalidades preferidas, anticuerpos biespecíficos (bsAb) y fragmentos de anticuerpos biespecíficos (bsFab) tienen por lo menos un brazo que se une específicamente a, por ejemplo, un antígeno o epitope de célula B, una célula T, mieloide, plasma, o célula mástil y por lo menos un brazo que se une específicamente a un conjugado seieccionable como objetivo que lleva un agente terapéutico o de diagnóstico.

Anticuerpos Anti-CD20 Mejorados Los avances en la terapia médica durante los últimos diez años han testificado la introducción de 9 anticuerpos para el tratamiento de diversos cánceres (Sharkey y Goldenberg, CA Cáncer J Clin. 2006, 56:226-243). La mayoría de estos nuevos terapéuticos biológicos se usan en combinación con fármacos citotóxicos convencionales, que indican que los anticuerpos requieren medidas adicionales para mejorar su eficacia {Id.). Esto se ejemplifica mejor con rituximab, el anticuerpo monoclonal (MAb) anti-CD20 quimérico de primera generación que fue aprobado inicialmente como una monoterapia para el tratamiento de linfoma no Hodgkin (NHL) (Castillo et al., Exp Hematol. 2008, 36:755-768). El rituximab es bien conocido en la técnica y está disponible comercialmente de Biogen/IDEC and Genentech (ver, por ejemplo, las Patentes de E. U. Nos. 5,736,137; 5,776,456; 6,399,061; 6,455,043; 6,846,476). Con base en este suceso, están en curso esfuerzos para introducir anticuerpos anti-CD20 mejorados (Stein et al, Clin Cáncer Res. 2004, 10:2868-78; Teeling et al, Blood. 2004, 104:1793-1800; Vugmeyster et al, J Immunother.2005, 28:212- 219, Umana et al, Ann Oncol. 2008, 19 (Suppl 7), resumen 98; Forero et al, Proc 99'" Ann Meeting of the Am Assoc Cáncer Res, 2008, resumen LB-70; Glennie et al, Mol Immunol.2007, 44:3823-37).

La mayoría de estos nuevos Abs anti-CD20 están destinados a reducir los componentes de múrido mientras que aumentan las funciones mediadas por complemento FcyR (Glennie et al, Mol Immunol. 2007, 44:3823-37; Maloney, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007-.226-232; Martin et al., Semin Hematol. 2008, 45:126-132). Uno de los primeros MAbs de segunda generación desarrollados para aliviar las reacciones relacionadas con la infusión experimentadas con el rituximab es el MAb hA20 denominado ahora veltuzumab (e.g., Qu et al., Blood 2008, 111:2211-19; Stein et al., Clin Cáncer Res. 2004, 10:2868-78; Patente de E. U. No. 7,151,164, cuya sección de ejemplos se incorpora en la presente por referencia). El veltuzumab tiene un tiempo de infusión más corto que el rituximab mientras que indica un régimen mayor de respuesta completa (CR) del que se ha reportado para rituximab (Morschhauser et al, Proc Am Soc Clin Oncol, J Clin Oncol. 2007, 25(18S):449s; Goldenberg et al, Proc Amer Soc Clin Oncol, J. Clin. Oncol. 2008, 26( 5S): 142s). Como se describe en los Ejemplos más adelante, el veltuzumab se manipuló de manera recombinante usando las regiones del marco de estructura del MAb anti-CD20 humanizado, el epratuzumab o hl_L2 (ver, por ejemplo, Leung et al, Mol Immunol. 1995, 32:1413-1427; Patentes de E. U. Nos. 6,306,393; 6,183,774 y 7,074,403, cuya sección de ejemplos de cada una se incorpora en la presente por referencia), mientras que tienen CDRs de cadena ligera idénticos, CDR1 y CDR2 de cadena pesada idénticos, pero un constructo CDR3-VH (CDRH3) diferente, en comparación con rituximab , como se muestra en la Tabla 1 más adelante.

Como se discute en los Ejemplos más adelante , como resultado de las diferencias en secuencia , el veltuzumab tiene características únicas en términos de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) significativamente mejorada en la l ínea de células Daudi , fuera de reg ímenes más lentos en las tres l íneas de células de linfoma ensayadas, en comparación con rituximab y actividad anti-cél ula B potente en monos cinomolgus y efectos terapéuticos en modelos de múrido en linfoma humano, así como también significativamente mejor control de xenoinjertos de linfoma Raji en ratones en comparación con rituximab, corroborando así la actividad observada a dosis muy bajas. Ver, Goldenberg et al , 2009 , "Properties and structure-function relationships of veltuzumab (hA20), a humanized anti-CD20 monoclonal antibody", Blood 1 1 3: 1 062-70. Sorprendentemente, como se descri be en los ejemplos más adelante, estas diferencias funcionales entre veltuzumab y rituximab están relacionadas con un solo cambio de aminoácidos no conservadores en la tercera región determinante de complementaridad de cadena pesada (CDRH3) (Kabat residuo 1 01 ) de rituxi mab. Tal cambio no conservador no sería considerado por alguien experto en la técnica debido a la carencia de una oportunidad razonable o la oportunidad reducida de éxito para mejorar el anticuerpo en las características designadas.

En varias modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos anti-CD20 quiméricos o humanos, humanizados, y proteínas de fusión de anticuerpo de los mismos, útiles para el tratamiento de sujetos mamíferos, humanos y animales domésticos, solos, como un conjugado o administrados en combinación con otros agentes terapéuticos, incluyendo anticuerpos desnudos y otros conjugados de anticuerpos terapéuticos.

En modalidades preferidas, los MAbs anti-CD20 del instante o fragmentos de unión de antígeno de los mismos comprenden un residuo de aspartato en la posición 101 de Kabat, un residuo de arginina en la posición 94 de Kabat y un residuo de valina en la posición 102 de Kabat de CDR3's VH. Más preferiblemente, los anticuerpos anti-CD20 y fragmentos de unión de antígeno de los mismos comprenden las secuencias CDR de veltuzumab, que comprenden secuencias de CDR de cadena ligera CDRL1 (RASSSVSYIH, SEQ ID NO:1), CDRL2 (ATSNLAS, SEQ ID NO:2) y CDRL3 (QQWTSNPPT, SEQ ID NO:3) y secuencias CDR de cadena pesada CDRH1 (SYNMH, SEQ ID NO:4), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG, SEQ ID NO:5) y CDRH3 (STYYGGD WYFDV, SEQ ID NO:6). En las modalidades más preferidas, el anticuerpo anti-CD20 es veltuzumab.

El MAb anti-CD20 humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo puede comprender los CDRs de un MAb anti-CD20 de múrido (o secuencias derivadas de los CDRs de un anticuerpo anti-CD20 de múrido) y las regiones de marco (FR) y constante de las regiones variables de cadena ligera y pesada de uno o más anticuerpos humanos, mientras que retiene las características de selección de objetivo de la célula B , linfoma de célula y leucemia de célula B del MAb anti-CD20 pad re de múrido. El MAb anti-CD20 humanizado o su fragmento de unión de antígeno puede comprender además por lo menos un aminoácido de las FRs correspondientes del MAb padre de múrido. Específicamente, el MAb anti-CD20 humanizado o su fragmento de unión de antígeno puede contener por lo menos un residuo de aminoácido que corresponde a los aminoácidos 1 , 5, 27 , 30, 38 , 48 , 67 , 68 , 70, 95, 1 1 5 o 1 1 6 de la región variable de cadena pesada mostrada en la Figura 2B (hA20VH I , SEQ I D NO: 1 4) y/o por lo menos un residuo de aminoácido que corresponde a los residuos de aminoácido 4, 21 , 35, 38, 45, 46, 59 , 99, 1 04 o 1 06 de la región variable de cadena ligera mostrada en la Figura 2A (hA20Vk, SEQ I D NO: 1 2 ). Los resid uos de aminoácido de marco de múrido pueden ser sustituidos en las regiones de FR humanas de las cadenas variables ligera y pesada si es necesario mantener la unión apropiada o aumentar la unión a antígeno de CD20. Más preferiblemente, el MAb anti-CD20 humanizado o su fragmento de unión de antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de hA20Vk (S EQ I D NO: 1 2) y hA2VHI (SEQ I D NO: 1 4).

Los MAbs anti-CD20 quiméricos o sus fragmentos de unión de antígeno pueden comprender las secuencias de región variable de u n anticuerpo anti-CD20 de múrido (o derivado de un anticuerpo anti-CD20 de múrido), unido a secuencias de región constante de anticuerpo humano. En modalidades preferidas, las regiones variables de cadena ligera y pesada de un MAb anti-CD20 quimérico comprenden las secuencias CDR de cA20Vk (SEQ ID NO: 8) y CA20VH (SEQ ID NO: 10), mostradas en las Figuras 1A y 1B. Más preferiblemente, el MAb anti-CD20 quimérico o su fragmento de unión de antígeno comprende las secuencias de región variable de cadena ligera y pesada de cA20Vk (SEQ ID NO: 8) y CA20VH (SEQ ID NO: 10).

Ciertas modalidades pueden involucrar un MAb anti-CD20 humano o su fragmento de unión de antígeno, que tiene sustancialmente la célula B, y las características que establece el objetivo de linfoma y leucemia de célula B y de unión de célula de un MAb anti-CD20 de múrido, en donde los CDRs son como se estableció antes para los MAbs anti-CD20 quiméricos y humanizados, como se muestra en las Figuras 1 y 2.

Otras modalidades pueden abarcar proteínas de fusión de anticuerpo o sus fragmentos de unión de antígeno que comprenden por lo menos un MAb anti-CD20 o sus fragmentos de unión de antígeno, como se describió antes. La proteína de fusión de anticuerpo o su fragmento de unión de antígeno pretende abarcar también una proteína de fusión de anticuerpo o su fragmento de unión de antígeno que comprende por lo menos un primer MAb anti-CD20 o su fragmento de unión de antígeno, como se describió antes, y por lo menos un segundo MAb o su fragmento de unión de antígeno antes descrito. Más preferiblemente, este segundo MAb es un MAb reactivo con B7, CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD70, CD74, CD80, CD95, CD126, CD133, CD138, CD154, CEACAM6, ED-B fibronectina, Factor H, FHL-1, Flt-1, Flt-3, receptor de folato, GROB, HMGB-1, factor inducible por hipoxia (HIF), HM1.24, factor-1 de crecimiento similar a insulina (ILGF-1), receptor de factor-1 de crecimiento similar a insulina (ILGF-1R), IFN-?, IFN-a, IFN-ß, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, la, H 1.24, HLA-DR, tenascin, T101, TAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, VEGFR, EGFR, PIGF, factor de complemento C5, y un producto oncogén (por ejemplo, Kras, cMET, bcl-2, bcl-6) o una combinación de los mismos, y aun un MAb anti-CD20 que es diferente al MAb anti-CD20 descrito en la presente.

El anticuerpo anti-CD20 quimérico o humano, humanizado puede tener afinidad aumentada de unión con el epitope, así como también actividad antitumoral y anti-célula B, como resultado de la mutación y manipulación de CDR del CDR y otras secuencias en la región variable para obtener un agente terapéutico superior para el tratamiento de trastornos de célula B, incluyendo linfomas y leucemias de célula B y enfermedades autoinmunes y también otras enfermedades que involucran células B (GVHD, anemia hemolítica, rechazo de trasplante de órganos).

Sustituciones de Aminoácidos Puede ser deseable también modificar las secuencias de aminoácidos para mejorar la función efectora, por ejemplo, para aumentar la citotoxicidad dependiente de célula, dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos o la introducción de cisteína en la región Fe, mejorando así la capacidad de internalización y/o aniquilación incrementada de células dependiente de complemento y ADCC. Ver Carón et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1991) y Shopes, Br. J. Immunol. 148:29 8-2022 (1992), incorporados en la presente por referencia. Se puede preparar una proteína de fusión de anticuerpo que tiene regiones Fe duales con lisis de complemento y capacidades de ADCC aumentadas.

Se han reportado cambios a la región Fe para aumentar la función efectora u otra característica funcional de anticuerpo (ver, por ejemplo, Lazar et al., Proc. Nati. Acad. ScL USA 2006, 103:4005-10; Stavenhagen et al, Cáncer Res. 2007, 67:8882-90; Hinton et al, J. Immunol. 2006, 176:346-56; Idusogie et al., J. Immunol. 2001, 166:2571-75) y se puede utilizar cualquier sustitución conocida de aminoácidos en la región Fe en los métodos y composiciones reivindicados. Por ejemplo, se reportó el reemplazo de un residuo de serina con un residuo de aspartato en la posición 239 de Kabat para aumentar la actividad de ADCC (Lazar et al, ibid, 2006). La sustitución de fenilalanina 243 con leucina, arginina 292 con prolina, tirosina 300 con leucina, valina 305 con isoleucina y prolina 396 con leucina pareció también optimizar la actividad de ADCC (Stagenhagen et al., 20007). El reemplazo de treonina 250 con glutamina y metionina 428 con leucina resultó en un incremento aparente en la vida media en suero (Hinton et al., ibid., 2006). La sustitución de lisina 326 con triptofano y glutamato 333 con serina pareció incrementar la actividad de CDC ( Idusogie et al. , ibid . , 2001 ). Estas y otras modificaciones conocidas para aumentar la función fisiológica de anticuerpos se pueden combinar con cambios a la secuencia de región variable, descritos en la presente, para producir anticuerpos anti-CD20 de características terapéuticas mejoradas.

En ciertas modalidades, los métodos y composiciones descritos pueden involucrar la producción y el uso de anticuerpos o sus fragmentos de unión de antígeno con uno o más residuos de aminoácidos sustituidos. Como se discute más adelante, los métodos para hacer anticuerpos monoclonales contra virtualmente cualquier antígeno objetivo son bien conocidos en la técnica. Típicamente, éstos resultan en la producción de anticuerpos de múrido contra un antígeno objetivo . Como es bien sabido en la técnica, la especificidad de unión de antígeno de anticuerpos monoclonales de múrido se determina grandemente mediante las secuencias de región de determinación de complementaridad (CDR) hipervariable. Los anticuerpos de múrido comprenden generalmente 6 secuencias, 3 en la cadena ligera de anticuerpo y 3 en la cadena pesada. Como se describe en detalle más adelante, las versiones quiméricas humanizada o humana de anticuerpos de múrido pueden construirse mediante técnicas tales como injerto de CDR, donde las secuencias CDR de múrido se insertan en , por ejemplo, secuencias de región de marco y constante de anticuerpo humano, o mediante la unión de las secuencias enteras de región variable de múrido a secuencias de región constante de anticuerpo humano. En modalidades alternativas, las secuencias de región variable de un anticuerpo pueden construirse, por ejemplo, mediante síntesis química y ensamblado de oligonucleótidos que codifican las regiones variables enteras de cadena ligera y pesada de un anticuerpo.

En varias modalidades, las características estructural, física y/o terapéutica de anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos pueden optimizarse mediante el reemplazo de uno o más residuos de aminoácido.

El experto estará consciente de que, en general, las sustituciones de aminoácidos involucran típicamente el reemplazo de un aminoácido con otro aminoácido de propiedades relativamente similares (es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos). Las propiedades de los varios aminoácidos y el efecto de la sustitución de aminoácidos en la estructura y función de la proteína han sido el sujeto de estudio y conocimiento extensivo en la técnica.

Por ejemplo, se puede considerar el índice hidropático de aminoácidos ((Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol, 157:105-132). El carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye con la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas. Cada aminoácido ha sido asignado con un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y carga (Kyte & Doolittle, 1982), estas son: isoleucina (+4.5); valina (); leucina ( + 3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (- 3.2) ; glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9) y arginina (-4.5). Al hacer las sustituciones conservadoras, se prefiere el uso de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de + 2, dentro de + 1 son más preferidos y dentro de + 0.5 son aún más preferidos.

La sustitución de aminoácidos puede tomar en cuenta también la característica hidrofílica del residuo de aminoácido (por ejemplo, Patente de E. U . No. 4,554, 1 01 ). Los valores de la característica hidrofílica han sido asignados a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0); glutamato (+3.0); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5. ±.1 ); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1 .0); metionina (- 1 .3) ; valina (-1 .5); leucina (-1 .8); isoleucina (-1 .8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptofano (-3.4). Se prefiere el reemplazo de aminoácidos con otros de carácter hidrofílico similar, pero no es requisito.

Otras consideraciones incluyen el tamaño de la cadena lateral del aminoácido. Por ejemplo, generalmente no sería preferible reemplazar un aminoácido con una cadena lateral compacta, tal como glicina o serina, con un aminoácido con una cadena lateral voluminosa , por ejemplo, triptofano, tirosina. El efecto de varios residuos de aminoácidos sobre la estructura de proteína secundaria es también una consideración. A través del estudio empírico, se ha determinado el efecto de diferentes residuos de aminoácidos sobre la tendencia de dominios de la proteína para adoptar una estructura secundaria alfa- helicoidal, beta-lámina o vuelta inversa y se conoce en la técnica (ver, por ejemplo, Chou & Fasman, 1974, Biochemistry, 13:222-245; 1978, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276; 1979, Biophys. J., 26:367-384).

Con base en tales consideraciones y el estudio empírico extensivo, se han construido tablas de sustituciones de aminoácidos conservadoras y se conocen en la técnica. Por ejemplo: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Alternativamente: Ala (A) leu, ile, val; Arg (R) gin, asn, lys; Asn (N) his, asp, lys, arg, gin; Asp (D) asn, glu; Cys (C) ala, ser; Gin (Q) glu, asn; Glu (E) gin, asp; Gly (G) ala; His (H) asn, gin, lys, arg; He (I) val, met, ala, phe, leu; Leu (L) val, met, ala, phe, ile; Lys (K) gin, asn, arg; Met (M) phe, ile, leu; Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr; Pro (P) ala; Ser (S), thr; Thr (T) ser; Trp (W) phe, tyr; Tyr (Y) trp, phe, thr, ser; Val (V) ile, leu, met, phe, ala.

Otras consideraciones para sustituciones de aminoácidos incluyen cuando el residuo está ubicado o no en el interior de una proteína o es expuesto por solvente. Para residuos de CDR, se asumiría normalmente que el residuo en el anticuerpo libre se exponga por solvente. Para residuos interiores, las sustituciones conservadoras incluirían: Asp y Asn; Ser y Thr; Ser y Ala; Thr y Ala; Ala y Gly; He y Val; Val y Leu; Leu y Me; Leu y Met; Phe y Tyr; Tyr y Trp. (Ver, por ejemplo, sitio en lal red PROWL en rockefeller.edu). Para residuos expuestos por solventes, las sustituciones conservadoras incluirían: Asp y Asn; Asp y Glu; Glu y Gin; Glu y Ala; Gly y Asn; Ala y Pro; Ala y Gly; Ala y Ser; Ala y Lys; Ser y Thr; Lys y Arg; Val y Leu; Leu y He; He y Val ; Phe y Tyr. ( Id. )- Se han construido varas matrices para ayudar en la selección de sustituciones de aminoácidos, tal como la matriz de registro PAM250, matriz Dayhoff, matriz Grantham , matriz McLachlan, matriz Doolittle, matriz Henikoff, matriz Miyata, matriz Fitch , matriz Jones, matriz Rao, matriz Levin y matriz Risler ( Idem ).

Al determinar las sustituciones de aminoácidos, se puede considerar también la existencia de enlaces intermoleculares o intramoleculares , tal como la formación de enlaces iónicos (puentes de sal ) entre residuos cargados positivamente (por ejemplo, His, Arg , Lys) y residuos cargados negativamente (por ejemplo , Asp , Glu ) o enlaces de disulfuro entre residuos de cisteína vecinos.

Preparación de Anticuerpos Monoclonales que Incluyen Anticuerpos Qu iméricos. H umanizados o H umanos Las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales contra virtualmente cualquier antígeno objetivo son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Kohler and Milstein , Nature 256 : 495 (1 975), y Coligan et al . (eds. ), CU RRENT PROTOCOLS I N I M MU NOLOGY, VOL. 1 , páginas 2.5.1 -2.6.7 (John Wiley & Sons 1 991 ). Brevemente, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener inyectando ratones con una composición que comprende un antígeno , remover el bazo para obtener linfocitos B , fusionar los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas , clonar los hibridomas, seleccionar clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivar los clones que producen anticuerpos para el antígeno y aislar los anticuerpos de los cultivos de hibridoma.

Los MAbs pueden aislarse y purificarse de cultivos de hibridoma mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento i ncluyen cromatografía por afinidad con Protein-A-Sepharose, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía por i ntercambio de iones. Ver, por ejemplo , Coligan en páginas 2.7. 1 -2.7. 1 2 y páginas 2.9.1 -2.9.3. Ver también Baines et al , "Purification of I mmunoglobulin G (IgG )," en ETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY , VOL. 1 0, páginas 79-1 04 (The Humana Press, I nc. 1 992).

Después del surgimiento inicial de anticuerpos para el inmunogén , los anticuerpos pueden ser secuenciados y preparados subsiguientemente mediante técnicas recombinantes. La humanización o quimerización de anticuerpos de múrido y fragmentos de anticuerpos son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, se producen anticuerpos monoclonales humanizados mediante la transferencia de regiones determinantes complementarias de ratón de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobuli na de ratón en un domi nio variable humano, y después, sustituir los resid uos humanos en las regiones del marco de las contrapartes de múrido . El uso de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos monoclonales humanizados obvian los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de regiones constantes de múrido .

Anticuerpos Qui méricos Un anticuerpo quimérico es una proteína recombinante en la cual las regiones variables de un anticuerpo humano han sido reemplazadas por las regiones variables de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, incluyendo las regiones determinantes de complementaridad (CDRs) del anticuerpo de ratón. Los anticuerpos quiméricos exhiben inmunogenicidad disminuida y estabilidad incrementada cuando se administran a un sujeto. Las técnicas generales para clonar dominios 5 variables de inmunoglobulina de múrido se describen, por ejemplo, en Orlandi et al, Proc. Nat. Acad. ScL USA 86: 3833 (1989). Las técnicas para construir anticuerpos quiméricos son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Como un ejemplo, Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994), produjeron una quimera LL2 combinando secuencias de 10 ADN que codifican los dominios VK y VH de LL2 de múrido, un anticuerpo monoclonal anti-CD22, con dominios de la región constante K y IgG! humanos respectivos.

Anticuerpos Humanizados Las técnicas para producir MAbs humanizados son bien 15 conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Jones et al, Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al, Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al, Science 239: 1534 (1988), Cárter et al, Proc. Nat. Acad. ScL USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992), y Singer et al, J. Immun. 150: 2844 (1993)). Un anticuerpo monoclonal quimérico o de 20 múrido puede humanizarse transfiriendo las CDRs de ratón de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón a los dominios variables correspondientes de un anticuerpo humano. Las regiones de marco de ratón (FR) en el anticuerpo monoclonal quimérico ¦ se reemplazan también con secuencias FR humanas. Como transferir ¡ 25 simplemente CDRs de ratón a FRs humanas resulta con frecuencia en i í una reducción y hasta una pérdida de afinidad de anticuerpo, se pod ría requerir modificación adicional con el fin de restaurar la afinidad origi nal del anticuerpo de múrido . Esto se puede realizar mediante el reemplazo de uno o más residuos humanos en las regiones FR con sus contrapartes de múrido para obtener un anticuerpo que tiene buena afinidad de unión con su epitope . Ver, por ejemplo , Tempest et al, Biotechnology 9:266 ( 1 991 ) y Verhoeyen et al , Science 239 : 1 534 ( 1 988). La afinidad de anticuerpos humanizados para un objetivo puede ser incrementada también mediante modificación seleccionada de las secuencias deCDR (WO0029584A1 ).

Anticuerpos Humanos Los métodos para producir anticuerpos completamente humanos usando enfoques combinatorios o animales transgénicos con sitios de inmunoglobulina humana son conocidos en la técnica (por ejemplo, Mancini et al , 2004, New Microbio!. 27:31 5-28; Con rad y Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8: 1 1 7-26 ; Brekke y Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol. 3:544-50 ). Se puede construir también un anticuerpo completamente humano por métodos de transfección genética o cromosómicos, asi como también tecnolog ía de despliegue de fagos, todo la cual es conocido en la técnica . Ver, por ejemplo, McCafferty et al , Nature 348 : 552-553 ( 1 990). Se espera que tales anticuerpos completamente humanos exhiban aun menos efectos secundarios que los anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos y funcionen in vivo como anticuerpos humanos esencialmente endógenos. En ciertas modalidades, los métodos y procedimientos reivindicados pueden utilizar anticuerpos humanos producidos mediante tales técnicas.

En una alternativa , la técnica de despliegue de fagos puede usarse para generar anticuerpos humanos (por ejemplo , Dantas-Barbosa et al . , 2005 , Genet. Mol. Res. 4: 1 26-40). Los anticuerpos humanos pueden generarse a partir de humanos normales o de humanos que exhiben un estado de enfermedad particular, tal como cáncer (Dantas-Barbosa et al . , 2005). La ventaja de construir anticuerpos humanos a partir de i ndividuos enfermos es que el repertorio de anticuerpos circulantes puede ser incl inado hacia anticuerpos contra antígenos asociados a enfermedades.

En un ejemplo no limitante de esta metodología , Dantas-Barbosa et al . (2005) construyeron una biblioteca de despliegue de fagos de fragmentos de anticuerpo Fab humano de pacientes con osteosarcoma. Generalmente, se obtiene ARN total de linfocitos de sangre circulante ( Id ). Se clonó Fab recombinante a partir de repertorios de anticuerpos de cadena µ , ? y K y se insertó en una biblioteca de despliegue de fagos ( Id ). ARNs se convirtieron a cADNs y se usaron para hacer bibliotecas de cADN de Fab usando cebadores específicos contra las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera (Marks et al . , 1 991 , J. Mol. Biol. 222 :581 -97). La construcción de la biblioteca se realizó de acuerdo con Andris-Widhopf et al . (2000, en : Phage Display Laboratory Manual , Barbas et al . (eds), 1 a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pp. 9.1 a 9.22). los fragmentos finales de Fab se digirieron con endonuclesas de restricción y se insertaron en el genoma del bacteriófago para hacer la biblioteca de despliegue de fagos. Tales bibliotecas pueden ser clasificadas mediante métodos normales de despliegue de fagos, como se conoce en la técnica. El despliegue de fagos se puede realizar en una variedad de formatos, para su revisión, ver por ejemplo, Johnson y Chiswell, Current Opinión in Structural Biology 3:5564-571 (1993). También se puede generar anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitro. Ver patentes de E. U. Nos. 5,567,610 y 5,229,275, cuya sección de ejemplos de las cuales se incorpora en la presente por referencia. El experto tomará en cuenta que estas técnicas son ejemplares y se puede utilizar cualquier método conocido para hacer y clasificar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos humanos.

En otra alternativa, animales transgénicos que habían sido manipulados genéticamente para producir anticuerpos humanos se pueden usar para generar anticuerpos contra esencialmente cualquier objetivo inmunogénico, usando protocolos normales de inmunización. Métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen por Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al, Nature 368:856 (1994), y Taylor et al, Int. Immun. 6:519 (1994). Un ejemplo no limitante de tal sistema es el XenoMouse® (por ejemplo, Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23, incorporado en la presente por referencia) de Abgenix (Fremont, CA). En el XenoMouse® y animales similares, los genes del anticuerpo de ratón han sido inactivados y reemplazados por genes funcionales de anticuerpos humanos, mientras que el resto del sistema inmune de ratón permanece intacto .

El XenoMouse® se transformó con YACs configurados en l ínea de germen (cromosomas artificiales de levadura) que contienen porciones del humano del IgG humano y sitios Igkappa , que incluyen la mayoría de las secuencias de región variable , junto con genes accesorios y secuencias reguladoras. El repertorio de región variable humano se puede usar para generar células B que prod ucen anticuerpos, que pueden ser procesadas en hibridomas mediante técnicas conocidas. Un XenoMouse® inmunizado con un antígeno objetivo producirá anticuerpos humanos mediante la respuesta inmune normal , los cuales pueden ser cosechados y/o producidos mediante técnicas normales, como se discutió antes. U na variedad de cepas de XenoMouse® está disponible, cada una de las cuales es capaz de prod ucir una clase diferente de anticuerpo. Los anticuerpos humanos producidos transgénicamente han mostrado que tienen potencial terapéutico, mientras que retienen las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos humanos normales (Green et al . , 1 999). El experto se dará cuenta que las composiciones y métodos reivindicados no están limitados al uso del sistema de XenoMouse®, sino que pueden utilizar cualquier animal transgénico que ha sido manipulado genéticamente para produci r anticuerpos humanos.

Producción de Fragmentos de Anticuerpos Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epitopes específicos pueden ser generados mediante técnicas conocidas. Los fragmentos de anticuerpos son porciones de unión de antígeno de un anticuerpo, tales como F(ab')2, Fab', F(ab)2, Fab, Fv, scFv y los similares. Los fragmentos de F(ab')2 pueden ser producidos mediante digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos de Fab' pueden ser generados reduciendo los puentes de disulfuro de los fragmentos de F(ab')2. Alternativamente, se pueden construir bibliotecas de expresión de Fab' (Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281) para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos de Fab' monoclonales con la especificidad deseada.

Una molécula Fv de cadena sencilla (scFv) comprende un dominio VL y un dominio VH. Los dominios VL y VH se asocian para formar un sitio de unión objetivo. Estos dos dominios se enlazan covalentemente además mediante un vinculador (L) de péptido. Métodos para hacer moléculas scFv y diseñar vinculadores de péptido adecuados se describen en la Patente de E. U. No. 4,704,692, Patente de E. U. No. 4,946,778, R. Raag y M. Whitlow, "Single Chain Fvs." FASEB Vol 9:73-80 (1995) y R.E. Bird y B.W. Walker, "Single Chain Antibody Variable Regions" TIBTECH, Vol 9: 132-137 (1991), incorporadas en la presente por referencia.

Se puede preparar un fragmento de anticuerpo mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo de longitud completa o mediante expresión en E. coli u otro huésped del ADN que codifique para el fragmento. Se puede obtener un fragmento de anticuerpo mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos de longitud completa por métodos convencionales. Por ejemplo, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos de Fab monovalentes y un fragmento Fe. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Patentes de E. U. Nos. 4,036,945 y 4,331,647 y referencias contenidas en las mismas, dichas patentes se incorporan en la presente por referencia. También, ver Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman et al, en METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, página 422 (Academic Press 1967), y Coligan en páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10 -2.10.4.

Anticuerpos Biespecíf icos y ultiespecif icos Los anticuerpos biespecíficos son útiles en un número de aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico con sitios de unión para un antígeno de superficie de célula de tumor y para un receptor de superficie de célula T puede dirigir la lisis de células específicas de tumor por células T. los anticuerpos biespecíficos que reconocen gliomas y el epitope CD3 en células T han sido usados exitosamente en el tratamiento de tumores cerebrales en pacientes humanos (Nitta, et al., Lancet 1990; 355:368-371). Métodos de preselección de objetivos con anticuerpos biespecíficos que comprenden por lo menos un sitio de unión para un antígeno asociado con tumor (TAA) u otra enfermedad objetivo, así como también un sitio de unión para un constructo seíeccionable como objetivo conjugado con agentes terapéuticos o de diagnóstico son bien conocidos también en la técnica (ver, por ejemplo, Patentes de E. U. Nos. 7,300,644; 7,138,103; 7,074,405; 7,052,872; 6,962,702; 6,458,933, cuya sección de ejemplos de cada una se incorpora en la presente por referencia.

Pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos que comprenden las secuencias de región variable de unión de antígeno de cualquier anticuerpo anti-TAA conocido, incluyendo, pero no limitados a, hPAM4 (U.S. Patente No.7,282,567), hA20 (U.S. Patente No. 7,251,164), hA19 (U.S. Patente No. 7,109,304), MM U31 (U.S. Patente No. 7,300,655), hLL1 (U.S. Patente No. 7,312,318,), hLL2 (U.S. Patente No. 7,074,403), hMu-9 (U.S. Patente No. 7,387,773), hl_243 (U.S. Solicitud de Patente No. 11/368,296), hMN-14 (U.S. Patente No. 6,676,924), hRS7 (U.S. Patente No. 7,238,785), hMN-3 (U.S. Solicitud de Patente No. de Serie 10/672,278) y hR1 (U.S. Solicitud de Patente Provisional No. de Serie 61/145,896, presentada 1/20/09), la sección de ejemplos de cada patente o solicitud citada incorporada en la presente por referencia.

Otros anticuerpos de uso pueden obtenerse comercialmente de una amplia variedad de fuentes conocidas. Por ejemplo, una variedad de lineas de hibridomas que secretan anticuerpos está disponible de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Un gran número de anticuerpos contra varias enfermedades objetivo, incluyendo, pero no limitados a, antígenos asociados con tumores, han sido depositados en ATCC y/o han publicado secuencias de región variable y están disponibles para uso en los métodos y composiciones reivindicados. Ver, por ejemplo, U.S. Patentes Nos. 7,312,318; 7,282,567; 7,151,164; 7,074,403; 7,060,802; 7,056,509; 7,049,060; 7,045,132; 7,041,803; 7,041,802; 7,041,293; 7,038,018; 7,037,498; 7,012,133; 7,001,598; 6,998,468; 6,994,976; 6,994,852; 6,989,241; 6,974,863; 6,965,018; 6,964,854; 6,962,981; 6,962,813 6,956,107; 6,951,924; 6,949,244; 6,946,129; 6,943,020; 6,939,547 6,921 ,645; 6,921,645; 6,921,533; 6,919,433; 6,919,078; 6,916,475 6,905,681 ; 6,899,879; 6,893,625; 6,887,468; 6,887,466; 6,884,594 6,881 ,405; 6,878,812; 6,875,580; 6,872,568; 6,867,006; 6,864,062 6,861,511; 6,861,227; 6,861,226; 6,838,282; 6,835,549; 6,835,370 6,824,780; 6,824,778; 6,812,206; 6,793,924; 6,783,758; 6,770,450 6,767,711; 6,764,688; 6,764,681; 6,764,679; 6,743,898; 6,733,981 6,730,307; 6,720,15; 6,716,966; 6,709,653; 6,693,176; 6,692,908 6,689,607; 6,689,362; 6,689,355; 6,682,737; 6,682,736; 6,682,734 6,673,344; 6,653,104; 6,652,852; 6,635,482; 6,630,144; 6,610,833 6,610,294; 6,605,441; 6,605,279; 6,596,852; 6,592,868; 6,576,745 6,572;856; 6,566,076; 6,562,618; 6,545,130; 6,544,749; 6,534,058 6,528,625; 6,528,269; 6,521,227; 6,518,404; 6,511,665; 6,491,915 6,488,930; 6,482,598; 6,482,408; 6,479,247; 6,468,531; 6,468,529 6,465,173; 6,461,823; 6,458,356; 6,455,044; 6,455,040, 6,451,310 6,444,206" 6,441,143; 6,432,404; 6,432,402; 6,419,928; 6,413,726 6,406,694; 6,403,770; 6,403,091; 6,395,276; 6,395,274; 6,387,350 6,383,759; 6,383,484; 6,376,654; 6,372,215; 6,359,126; 6,355,481 6,355,444; 6,355,245; 6,355,244; 6,346,246; 6,344,198; 6,340,571 6,340,459; 6,331,175; 6,306,393; 6,254,868; 6,187,287; 6,183,744 6,129,914; 6,120,767; 6,096,289; 6,077,499; 5,922,302; 5,874,540 5,814,440; 5,798,229; 5,789,554; 5,776,456; 5,736,119; 5,716,595 5,677,136; 5,587,459; 5,443,953, 5,525,338, la sección de ejemplo de cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. Estos son ejemplos solamente y se conoce en la técnica una amplia variedad de otros anticuerpos y sus hibridomas. El experto se dará cuenta que se pueden obtener secuencias de anticuerpos o hibridomas que secretan anticuerpos contra casi cualquier antígeno asociado con enfermedad mediante una simple búsqueda en las bases de datos ATCC, NCBI y/o USPTO para anticuerpos contra un objetivo seleccionado asociado con enfermedad de interés. Los dominios de unión de antígeno de los anticuerpos clonados pueden ser amplificados, escindidos, ligados en un vector de expresión, transfectados en una célula huésped adaptada y usados para producción de proteínas, usando técnicas normales bien conocidas en la técnica.

Se conocen numerosos métodos para producir anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, como se describe, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de E. U. No. 20050002945, presentada el 11 de febrero de 2004, cuya sección de ejemplos se incorpora en la presente por referencia. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante el método de quadroma, que involucra la fusión de dos hibridomas diferentes, que produce, cada uno, un anticuerpo monoclonal que reconoce un sitio antigénico diferente (Milstein y Cuello, Nature, 1983; 305:537-540).

Otro método para producir anticuerpos biespecíficos usa entrelazadores heterobifuncionales para atar químicamente dos anticuerpos monoclonales diferentes (Staerz, et al., Nature 1985; 314:628-631; Pérez, et al, Nature 1985; 3 6:354-356). Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir también mediante reducción de cada uno de los dos anticuerpos monoclonales parentales a las medias moléculas respectivas, las cuales se mezclan después y se permite que se reoxiden para obtener la estructura h íbrida (Staerz y Bevan , Proc Nati Acad Sci USA 1 986; 83: 1 453-1 457). Otra alternativa involucra entrelazar qu ímicamente dos o tres fragmentos de Fab' purificados por separado usando vinculadores apropiados (ver, por ejemplo , la Solicitud de Patente Europea 0453082).

Otros métodos i ncluyen mejorar la eficiencia de generación de híbridomas h íbridos mediante transferencia de genes de disti ntos marcadores de lanzamiento derivados de retrovirus en hibridomas parentales respectivos, los cuales se fusionan subsiguientemente ( DeMonte , et al . , Proc Nati Acad Sci USA 1 990 , 87:2941 -2945); o transfeccion dé una l ínea de células de hibridoma con plásmidos de expresión que contienen los genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo diferente.

Los dominios afines VH y VL pueden unirse con un péptido de unión de composición y longitud apropiadas (que consiste usualmente de más de 1 2 residuos de aminoácidos) para formar un Fv de cadena sencilla (scFv) con actividad de aglutinación . Métodos para fabricar scFvs se descri ben en la Patente de E . U . No. 4,946, 778 y la Patente de E . U . No. 5 , 1 32,405 cuya sección de ejemplos de cada una se incorpora en la presente por referencia. La reducción de la longitud del péptido de unión hasta menos de 12 residuos de aminoácidos evita el apareamiento de los domi nios VH y VL en la misma cadena y fuerza el apareamiento de los dominios VH y VL con dominios complementarios en otras cadenas, resultando en la formación de multímeros funcionales. Las cadenas de polipéptido de dominios VH y VL que están unidos con vinculadores entre residuos de aminoácidos 3 y 12 forman predominantemente dímeros (llamados diacuerpos). Con vinculado les entre residuos 0 y 2 de aminoácidos se favorecen los trímeros (llamados triacuerpos) y tetrámeros (llamados tetracuerpos), pero los patrones exactos de oligomerización parecen depender de la composición así como también de la orientación de los dominios V (VH-vinculador-VL o VL-vinculador-VH), además de la longitud del vinculador.

Estas técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos o biespecificos exhiben varias dificultades en términos de bajo rendimiento, necesidad de purificación, baja estabilidad o mano de obra intensiva de la técnica. Más recientemente, se ha utilizado una técnica conocida como "dock and lock" (DNL) para producir combinaciones de virtualmente cualesquiera anticuerpos deseados, fragmentos de anticuerpos y otras moléculas efectoras (ver, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitudes de Patente de E. U. Nos.20060228357 (ahora U.S. Patente 7,550,143 otorgada); 20060228300 (ahora U.S. Patente 7,521,056 otorgada); 20070086942 (ahora U.S. Patent 7,534,866 otorgada); 20070140966 (ahora U.S. Patente 7,527,787 otorgada); 20070264265 y 20090060862 y USSN 12/418,877, presentada el 8 de Abril de 2009, cuya sección de ejemplos de cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia). La técnica utiliza dominios complementarios de unión de proteína , aludidos como dominios de anclaje y dominios de dimerización y docking , que se unen entre ellos y permiten el ensamblado de estructu ras complejas, que varían desde d ímeros, trímeros, tetrámeros, quintámeros y hexámeros. Estos forman complejos estables en alto rendimiento sin requeri r de purificación extensiva . Las técnicas DN L permiten el ensamblado de anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos, ya sea como porciones de anticuerpo desnudo o en combi nación con un amplio rango de otras moléculas efectoras tales como inmunomoduladores, enzimas, agentes quimioterapéuticos, quemoquinas, citoquinas, agentes de diagnóstico, agentes terapéuticos, radionúclidos, agentes de formación de imagen , agentes anti-angiogénicos , factores de crecimiento , oligonucleótidos, hormonas, péptidos, toxinas, agentes pro-apotóticos , o una combinación de los mismos. Se puede utilizar cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica para hacer anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos en la práctica de los métodos actualmente reivindicados.

Pre-selección de Objetivos Los anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos se pueden utilizar en técnicas de pre-selección de objetivos. La pre-selección de objetivo es un proceso de pasos múltiples desarrollado originalmente para resolver el despeje lento de sangre de anticuerpos de selección de objetivo directamente, que contribuyen a la toxicidad indeseada de los tejidos normales tal como la médula espinal . Con la pre-selección de objetivos, un radionúclido u otro agente terapéutico se une a una pequeña molécula de entrega (constructo seleccionable como objetivo conjugado seleccionable como objetivo) que es despejada en minutos de la sangre. Un anticuerpo biespecífico o multiespecífico de pre-selección de objetivo, que tiene sitios de unión para el constructo seleccionable como objetivo así como para antígeno objetivo, se administra primero, se deja que el anticuerpo libre salga de circulación y después se administra el constructo seleccionable como objetivo.

Los métodos de pre-selección de objetivos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Goodwin et al, U.S. Pat. No.4,863,713; Goodwin et al, J. Nucí. Med.29:226, 1988; Hnatowich et al, J. Nucí. Med.28:1294, 1987; Oehr et al, J. Nucí. Med.29:728, 1988; Klibanov et al, J. Nucí. Med. 29:1951, 1988; Sinitsyn et al, J. Nucí.

Med. 30:66, 1989; Kalofonos et al, J. Nucí. Med. 31:1791, 1990; Schechter et al, Int. J. Cáncer 48:167, 1991; Paganelli et al, Cáncer Res. 51:5960, 1991; Paganelli et al, Nucí. Med. Commun. 12:211, 1991; U.S. Pat. No. 5,256,395; Stickney et al, Cáncer Res. 51:6650, 1991; Yuan et al., Cáncer Res. 51:3119, 1991; U.S. Pat. No. 6,077,499; U.S.

Ser. No. 09/597,580; U.S. Ser. No. 10/361,026; U.S. Ser. No. 09/337,756; U.S. Ser. No. 09/823,746; U.S. Ser. No. 10/116,116; U.S. Ser. No. 09/382,186; U.S. Ser. No. 10/150,654; U.S. Pat. No. 6,090,381; U.S. Pat. No. 6,472,511; U.S. Ser. No. 10/114,315; U.S.

Solicitud Provisional No. 60/386,411; U.S. Solicitud Provisional No. 60/345,641; U.S. Solicitud Provisional No. 60/3328,835; U.S. Solicitud Provisional No. 60/426,379; U.S. Ser. No. 09/823,746; U.S. Ser. No. 09/337,756; U.S. Solicitud Provisional No. 60/342,103; y U.S. Patente No . 6,962 ,702.

Un método de pre-selección de objetivo para tratar o diagnosticar una enfermedad o un trastorno en un sujeto se puede proporcionar mediante: ( 1 ) administrar al sujeto un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno; (2 ) administrar opcionalmente al sujeto una composición de desalojo y permitir que la composición desaloje el anticuerpo de la circulación ; y (3) administrar al sujeto el constructo seleccionable como objetivo, que contiene uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico quelados o unidos qu ímicamente. La técnica se puede utilizar también para terapia de pro-fármaco de enzima dependiente de anticuerpos (ADE PT) mediante la administración de un conjugado de enzima a un constructo seleccionable como objetivo, seguido por un pro-fármaco que se convierte en forma activa mediante la enzima .

Agentes Terapéuticos y de Diagnóstico En ciertas modalidades, los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno o proteínas de fusión descritos en la presente pueden administrarse solos, como un anticuerpo "desnudo", sus fragmentos de unión a antígeno o proteína de fusión . En modalidades alternativas, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o proteína de fusión puede administrarse antes, concurrentemente con , o después de por lo menos otro agente terapéutico. En otras alternativas, un anticuerpo, su fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión puede unirse covalente o no covalentemente a por lo menos un agente terapéutico y/o de diagnóstico para formar un inmunoconjugado.

Los agentes de diagnóstico se seleccionan de preferencia del grupo que consiste de un radionúclido, un agente radiológico de contraste, un ion paramagnético, un metal, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, un agente de ultrasonido de contraste y un agente fotoactivo. Tales agentes de diagnóstico son bien conocidos y se puede usar cualquiera de tales agentes de diagnóstico. Ejemplos no limitantes de agentes de diagnóstico pueden incluir un radionúclido tal como 110ln, 1l1ln, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120l, 123l, 124l, 25l, 131|, 154- 58Gd, 32P, 1C, 13N, 50, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, u otros gamma-, beta-, o positrón-emisores. Los iones paramagnéticos de uso pueden incluir cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) o erbio (III). Agentes de metal de contraste pueden incluir lantano (III), oro (III), plomo (II) o bismuto (III). Los agentes de ultrasonido de contraste pueden comprender liposomas, tales como liposomas llenos con gas. Los agentes radiopacos de diagnóstico pueden ser seleccionados de compuestos de bario, compuestos de galio y compuestos de talio. Se conoce en la técnica una amplia variedad de etiquetas fluorescentes, que incluyen, pero no están limitadas a, isocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeriterina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. Las etiquetas quimioluminescentes de uso pueden incluir luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio o un éster de oxalato.

Los agentes terapéuticos se selecciona de preferencia del grupo que consiste de un radionúclido, un inmunomodulador, un agente anti-angiogénico, una citoquina, una quemoquina, un factor de crecimiento, una hormona, un fármaco, un profármaco, una enzima, un oligonucleótido, un ARN interferente, un agente pro-apoptótico, un agente terapéutico fotoactivo, un agente citotóxico, que puede ser un agente quimioterapéutico o una toxina, un segundo anticuerpo o fragmento del mismo y una combinación de los mismos. Los fármacos de uso pueden tener una propiedad farmacéutica seleccionada del grupo que consiste de agentes antimitóticos, antiquinasa, alquilantes, antimetabolito, antibiótico, alcaloide, anti-angiogénico, proapoptótico, y combinaciones de los mismos.

Fármacos de uso de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, 5-fluorouracil, aplidin, azaribina, anastrozol, antraciclinas, bendamustina, bleomicina, bortezomib, briostatin-1 , busulfan, caliqueamicina, camptotecina, carboplatin, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatin (CDDP), inhibidores Cox-2, irinotecan (CPT-11), SN-38, carboplatin, cladribina, camptotecanos, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, daunorubicin, doxorubicin, 2-pirrolinodoxorubicina (2P-DOX), ciano-morfolino doxorubicin, doxorubicin glucuronida, epirubicin glucuronida, estramustina, epidofillotoxin, agentes de unión a receptor de estrógeno, etoposida (VP16), etoposida glucuronida, fosfato de etoposida, floxuridina (FUdR), 3',5'-0-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, inhibidores de farnesil-protein transferasa, gemcitabina, hidroxiurea, idarubicin, ifosfamide, L-asparaginasa, lenolidamida, leucovorin, lomustina, mecloretamina, melfalan, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotane, navelbina, nitrosurea, plicomicina, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, PSI-341, raloxifen, semustina, estreptozocina, tamoxifen, taxol, temazolomida (una forma acuosa de DTIC), transplatinum, talidomida, tioguanina, tiotepa, teniposida, topotecan, mostaza uracil, vinorelbina, vinblastina, vincristina y vinca alcaloides.

Las toxinas de uso pueden incluir ricino, abrin, alfa toxina, saporina, ribonucleasa (RNase), por ejemplo, onconasa, DNasa I, Estafilococcal enterotoxina-A, proteína antiviral de fitolaca, gelonina, toxina de difteria, Pseudomonas exotoxin, y Pseudomonas endotoxin.

Los inmunomoduladores se pueden seleccionar de una citocina, un factor de crecimiento de célula madre, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonia (CSF), un interferón (IF), eritropoyetina, trombopoyetina y una combinación de los mismos. Específicamente útiles son las linfotoxinas tal como factor de necrosis (TNF), factores hematopoyéticos tal como interleucina (IL), factor estimulante de colonia tal como factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) o factor estimulante de colonia de granulocitos macrófagos (GM-CSF), interferón tal como interferones-a, -ß o -?, y factor de crecimiento de célula madre tal como el designado "factor S1".

Incluidas entre las citocinas están las hormonas de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana N-metionil y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteína tales como la hormona estimulante de folículo (FSH), hormona estimulante de tiroides (TSH) y hormona luteinizante ((LH); factor de crecimiento hepático; prostaglandina, factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno de placenta, proteína OB; factor-a y -ß de necrosis de tumor; sustancia inhibidora mullerian; péptico asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento de nervios tal como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-a y TGF-ß; factor-I y -II de crecimiento similar a insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón-a, -ß y -?; factores de crecimiento estimuladores de colonias (CSFs) tal como CSF-macrófago (M-CSF); interleucinas (ILs) tales como IL-1, I L-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, I L- 1 , IL-12; I L-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, LIF, paquete-ligando o FLT-3, Flt-1, angiostatina, trombospondina, endostatina, factor de necrosis de tumor (TNF, tal como TNF-a) y LT. Como se usa en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

Quemoquinas de uso incluyen RANTES, MCAF, ????-alfa, MIPI-Beta e IP-10.

Isótopos radioactivos útiles para tratar tejido enfermo incluyen, pero no están limitados a, 111ln, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 67Cu, 90Y, 125l, 1311, 32P, 33P, 7Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, "Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194lr, 198Au, 199Au, and 211Pb. El radionúclido terapéutico tiene de preferencia una energía de descomposición o degradación en el rango de 20 a 6,000 keV para un emisor alfa. Las energías máximas de degradación de núclidos emisores de partículas beta son de preferencia de 20 a 5,000 keV, más preferiblemente de 100 a 4,000 keV y lo más preferible de <100 keV. Se prefieren también radionúclidos que se degradan sustancialmente con partículas de emisión Auger. Por ejemplo, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, ln-111, Sb-119, 1-125, Ho-161, Os-189m e lr-192. Las energías de degradación de núclidos emisores de partículas beta son de preferencia <1,000 keV, más preferiblemente <100 keV y lo más preferible <70 keV. También preferidos son radionúclidos que se degradan sustancialmente con generación de partículas alfa. Tales radionúclidos incluyen, pero no están limitados a: Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 y Fm-255.

Las energías de radionúclidos emisores de partículas alfa son de preferencia de 2,000 a 10,000 keV, más preferiblemente de 3,000 a 8,000 keV y lo más preferible de 4,000 a 7,000 keV. Radioisótopos de uso con potencial adicional incluyen 11C, 13N, 150, 75Br, 198Au, 22 Ac, 126l, 133l, 77Br, 113mln, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 25mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 97Pt, 09Pd, 105Rh, 142Pr, 43Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201TI, 225Ac, 76Br, 169Yb, y los similares. Algunos núclides de diagnóstico útiles pueden incluir 124l, 12 l, 131l, 18F, 52Fe, 62Cu, 6 Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr, 94Tc, 94mTc, 99mTc, o 111ln.

Los agentes terapéuticos pueden incluir un agente fotoactivo o colorante. Se han usado composiciones fluorescentes, tales como fluorocromo y otros cromógenos, o colorantes, tales como porfirinas sensibles a la luz visible, para detectar y tratar lesiones dirigiendo luz adecuada a la lesión. En terapia, esto se ha denominado fotorradiación, fototerapia o terapia fotodinámica. Ver, Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Librería Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain (1986), 22:430. Además, se han acoplado anticuerpos monoclonales con colorantes fotoactivados para lograr la fototerapia. Ver Mew et al., J. Immunol. (1983), 130:1473; idem., Cáncer Res. (1985), 45:4380; Oseroff et al, Proc. Nati. Acad. ScL USA (1986), 83:8744; idem., Photochem. Photobiol. (1987), 46:83; Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. (1989), 288:471; Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. (1989), 9:422; Pelegrin et al., Cáncer (1991), 67:2529.

Las hormonas corticosteroides pueden incrementar la efectividad de otros agentes de quimioterapia y, en consecuencia, se usan frecuentemente en tratamientos de combinación . La prednisona y la dexametasona son ejemplos de hormonas corticosteroides.

En ciertas modalidades, los agentes anti-angiogénicos, tales como angiostatina , baculostatina, canstatina, maspima, anticuerpos anti-VEGF, péptidos y anticuerpos anti-PIG F, anticuerpos de factor de crecimiento anti-vascular, anticuerpos anti-Flk-1 , anticuerpos y péptidos anti-Fit-1 , anticuerpos anti-Kras, anticuerpos anti-cMET, anticuerpos anti-MI F (factor de inhibición de migración de macrófagos), péptidos de laminina, péptidos de fibronectina, inhibidores de activador de plasminógeno, inhibidores de inhibidores de metaloproteinasa de tejido, interferones, interleucina-1 2, I P-10 , Gro-ß, trombospondi na, 2-metoxioestradiol , proteína relacionada con proliferi na, carboxiamidotriazol , CM 1 01 , Marimastat, polisulfato de pentosano, angiopoyetina-2 , interferón-alfa , herbimicina A, PN U 1 451 56E, fragmento de prolactina 1 6K, Linomida , talidomida, pentoxifilina, genisteína, TN P-470, endostatina, paclitaxel , accutin , angiostatina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1 470 , factor 4 de plaquetas o minociclina pueden ser de uso.

Otros agentes terapéuticos útiles comprenden oligonucleótidos, especialmente oligonucleótidos antisentido que se dirigen de preferencia contra oncogenes y productos de oncogén de malignidades de célula B , tal como bcl-2. Oligonucleótidos antisentido preferidos incluye en aquellos conocidos como siARN o ARNi .

Inmu nocon j uqados Cualquiera de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno o proteínas de fusión de anticuerpo descritos en la presente se pueden conjugar con uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico. Los agentes terapéuticos no necesitan ser los mismos, sino pueden ser diferentes, por ejemplo, un fármaco y un radioisótopo. Por ejemplo, 131l puede incorporarse en una tirosina de un anticuerpo o proteína de fusión y un fármaco unido a un grupo amíno épsilon de un residuo de Usina. Los agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden estar unidos también, por ejemplo a grupos SH reducidos y/o a cadenas laterales de carbohidrato. Muchos métodos para hacer conjugados, covalentes o no covalentes, de agentes terapéuticos o de diagnóstico con anticuerpos o proteínas de fusión se conocen en la técnica y cualquiera de tales métodos conocidos puede ser utilizado.

Un agente terapéutico o de diagnóstico puede unirse a la región de bisagra de un componente de anticuerpo reducido vía la formación de enlace de disulfuro. Alternativamente, tales agentes pueden unirse usando un vinculador cruzado heterobifuncional, tal como iV-succinil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). Yu et al, Int. J. Cáncer 56: 244 (1994). Las técnicas generales para tal conjugación son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al, "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995). Alternativamente, el agente terapéutico o de diagnóstico puede conjugarse vía una porción de carbohidrato en la región de Fe del anticuerpo. El grupo carbohidrato puede usarse para incrementar la carga del mismo agente que está unido a un grupo tiol, o la porción de carbohidrato puede usarse para unirse a un agente terapéutico o de diagnóstico o diferente.

Los métodos para conjugar péptidos con componentes de anticuerpos vía una porción de carbohidrato de anticuerpo son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Shih et al., Int. J. Cáncer 41 : 832 (1988); Shih et al., Int. J. Cáncer 46: 1101 (1990); y Shih et al., U.S. Patente No. 5,057,313, incorporados en la presente por referencia. El método general involucra hacer reaccionar un componente de anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidada con un polímero portador que tiene por lo menos una función amina libre. Esta reacción resulta en un enlace de base de Schiff inicial (imina), que puede estabilizarse mediante reducción a una amina secundaria para formar el conjugado final.

La región Fe puede estar ausente si el anticuerpo usado como el componente de anticuerpo del inmunoconjugado es un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. Sin embargo, es posible introducir una porción de carbohidrato en la región variable de cadena ligera de un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. Ver, por ejemplo, Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 ( 1 995); Hansen et al, U .S . Patente No . 5,443,953 ( 1 995), Leung et al , U . S . Patente No . 6 ,254,868, cada una incorporada en la presente por referencia . La porción de carbohidrato manipulada se usa para unir el agente terapéutico o de diagnóstico.

En algunas modalidades, se puede unir un agente quelante a un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o proteína de fusión a un constructo seleccionabie como objetivo y usar para quelar un agente terapéutico o de diagnóstico , tal como un radionúclido. Quelantes de ejemplo incluyen , pero no están limitados a , DTPA (tal como Mx-DTPA), DOTA, TETA, N ETA o NOTA. Los métodos de conjugación y uso de agentes quelantes para uni r metales u otros ligandos a proteínas son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo , la Solicitud de Patente de E . U . No. de Serie 1 2/1 1 2 ,289, cuya sección de ejemplos se incorpora en la presente por referencia) .

En ciertas modalidades, metales radiactivos o iones paramagnéticos pueden unirse a proteínas o péptidos mediante reacción con un reactivo que tiene una cola larga , a la cual se puede unir una multiplicidad de grupos quelantes para unir iones. Tal cola puede ser un pol ímero tal como una polilisina, un polisacárido, u otras cadenas derivadas o que se pueden derivar que tienen grupos colgantes a los cuales se pueden unir grupos quelantes tal como, por ejemplo, ácido etilendiamintetraacético ( EDTA), ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA), porfirinas, poliaminas, éteres de corona, bis-tiosemicarbazonas, polioximas y grupos similares conocidos por ser útiles para este propósito.

Los quelantes pueden enlazarse directamente a anticuerpos o péptidos, por ejemplo, como se describe en la patente de E. U. 4,824,659, incorporada en la presente por referencia. Combinaciones de metal-quelante particularmente útiles incluyen 2-bencil-DTPA y su monometilo y análogos de ciclohexilo, usados con isótopos de diagnóstico en el rango de energía general de 60 a 4,000 keV, tales como 125l, 131l, 123l, 124l, 62Cu, 64Cu, 18F, 111ln, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 94mTc, 11C, 3N, 150, 76Br para radio-imagen. Los mismos quelantes, cuando forman complejos con metales no radiactivos, tales como manganeso, hierro y gadolinio son útiles para MRI. Los quelantes macrocíclicos tales como NOTA, DOTA y TETA son de uso con una variedad de metales y radiometales, más particularmente con radionúclidos de galio, itrio y cobre, respectivamente. Tales complejos de metal-quelado se pueden hacer muy estables haciendo a la medida el tamaño del anillo para el metal de interés. Se abarcan otros quelados, tipo anillo, tales como poliéteres macrocíclicos, los cuales son de interés para unir de manera estable núclidos, tal como 223Ra para RAIT.

Más recientemente se han descrito métodos de etiquetación con 18F de uso en técnicas de escaneo de PET, por ejemplo mediante reacción de F-18 con un metal u otro átomo, tal como aluminio. El conjugado de 18F-AI puede convertirse en complejo con grupos quelantes, tales como DOTA, NOTA o NETA, que se unen directamente a anticuerpos o se usan para etiquetar constructos seleccionables como objetivo en métodos de preselección de objetivos. Tales técnicas de etiquetación con F-18 se describen en la Solicitud de Patente de E.

U. No. de Serie 12/112,289, cuya sección de ejemplos se incorpora en la presente por referencia.

Métodos de Tratamiento Terapéutico Varias modalidades involucran métodos para tratar enfermedades de células de linfoma o leucemia de célula B o una enfermedad autoinmune en un sujeto, tal como un mamífero, incluyendo humanos, mascotas domésticas o de compañía, tales como perros y gatos, que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o proteína de fusión. En modalidades preferidas, el anticuerpo o sus fragmentos de unión a antígeno es un MAb anti-CD20. En ciertas modalidades, la terapia puede utilizar un "anticuerpo desnudo" que no tiene un agente terapéutico unido al mismo.

La administración de un anticuerpo anti-CD20 "desnudo" puede ser suplementada mediante la administración concurrente o secuencialmente de una cantidad terapéuticamente efectiva de otro "anticuerpo desnudo" que se une a o es reactivo con otro antígeno en la superficie de la célula objetivo. MAbs adicionales preferidos comprenden por lo menos un MAb quimérico o humano, humanizado seleccionado del grupo que consiste de un MAb reactivo con CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21 , CD22, CD23, CD25, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD95, CD126, CD133, CD138, CD154, CEACAM6, B7, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, la, HM1.24, HLA-DR, tenascina, Flt-1, Flt-3, VEGFR, PIGF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, tenascina, MIF, factor de complemento C5, un oncogén, producto de oncogén, bcl-2, bcl-6, Kras, c ET, o una combinación de los mismos.

Tanto la terapia con anti-CD20 desnudo solo como en combinación con otros MAbs desnudos pueden complementarse adicionalmente con la administración, concurrente o secuencialmente, de por lo menos un agente terapéutico, como se discutió antes. Las terapias multimodales pueden incluir la terapia con anticuerpos anti-CD20 desnudos complementadas con la administración de anticuerpos anti-CD22, anti-CD19, anti-CD21, anti-CD74, anti-CD80, anti-CD23, anti-CD45, o HLA-DR (incluyendo la cadena invariante) en la forma de anticuerpos desnudos, proteínas de fusión o como inmunoconjugados. Los inmunoconjugados pueden comprender un anticuerpo o fragmento de unión a arrtígeno del mismo, conjugado con uno o más de cualquier agente terapéutico y/o de diagnóstico como se discutió antes. Los anticuerpos anti-CD20 desnudos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden suplementarse también con anticuerpos desnudos contra un antígeno MUC1 que se expresa en ciertas células B. Varios anticuerpos de uso, tales como anticuerpos anti-CD19 y anti-CD22, son conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. Ver, por ejemplo, Ghetie et al., Cáncer Res. 48:2610 (1988); Hekman et al., Cáncer Immunol. Immunother. 32:364 (1991); Longo, Curr. Opin. Oncol. 8:353 (1996), U.S. Patentes Nos. 5,798,554; 6,187,287; 6,306,393; 6,676,924; 7,109,304; 7,151,164; 7,230,084; 7,230,085; 7,238,785; 7,238,786; 7,282,567; 7,300,655; 7,312,318; y U.S. Publicaciones de Solicitudes de Patente Nos. 20080131363; 20080089838; 20070172920; 20060193865; 20060210475; 20080138333; y 20080146784, la sección de ejemplos de cada una de las patentes o solicitudes de patentes antes enlistadas incorporadas en la presente por referencia.

En otra forma de terapia multimodal, los sujetos reciben anticuerpos antiCD20 desnudos y/o inmunoconjugados, en conjunto con quimioterapia normal de cáncer. Por ejemplo, "CVB" (ciclofosfamida de 1.5 g/m2, etoposida de 200-400 mg/m2, y carmustina de 150-200 mg/m2) es un régimen usado para tratar linfoma de no Hodgkin. Patti et al., Eur. J. Haematol. 51: 18 (1993). Otra combinación adecuada de regímenes quimioterapéuticos es bien conocida por aquellos de pericia en la técnica. Ver, por ejemplo, Freedman et al., "Non-Hodgkin's Lymphomas," en CANCER MEDICINE, VOLUME 2, 3a Edición, Holland et al. (eds.), páginas 2028-2068 (Lea & Febiger 1993). Como una ilustración, regímenes quimioterapéuticos de primera generación para tratamiento de linfoma de no Hodgkin (NLH) de grado intermedio que incluyen C-MOPP (ciclofosfamida, vincristin, procarbazina y prednisona) y CHOP (ciclofosfamida, doxorubicin, vincristin, y prednisona). Un régimen quimioterapéutico de segunda generación útil es m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorubicin, ciclofosfamida, vincristin, dexametasona y leucovorin), mientras que un régimen adecuado de tercera generación es MACOP-B (metotrexato, doxorubicin, ciclofosfamida, vincristin, prednisona, bleomicina y leucovorin). Fármacos útiles adicionales incluyen butirato de fenilo, bendamustina, y briostatin-1. En una terapia multimodal preferida, tanto los fármacos quimioterapéuticos como las citoquinas se coadministran con un anticuerpo, inmunoconjugado o proteína de fusión, que comprende de preferencia un anticuerpo anti-CD20 o fragmento de unión a antígeno del mismo. Generalmente, la co-administración se refiere a la administración simultánea de dos o más agentes, tal como un anticuerpo y un agente terapéutico. Las citoquinas, fármacos quimioterapéuticos y anticuerpo o inmunoconjugado pueden administrarse en cualquier orden, o juntos.

Los inmunoconjugados o anticuerpos desnudos se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticas útiles, por lo que el inmunoconjugado o anticuerpo desnudo se combina en una mezcla con un excipiente farmacéuticamente adecuado. La salina con búfer de fosfato, estéril, es un ejemplo de un excipiente farmacéuticamente adecuado. Otros excipientes adecuados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5a Edición (Lea & Febiger 1990), y Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición (Mack Publishing Company 1990) y ediciones revisadas de los mismos.

El inmunoconjugado o anticuerpo desnudo se puede formular para vía de administración intravenosa, por ejemplo, inyección de bolo o infusión continua. De preferencia, el anticuerpo es infundido en un periodo de menos de aproximadamente 4 horas, y más preferiblemente, en un periodo de menos que aproximadamente 3 horas. Por ejemplo, los primeros 25 a 50 mg podrían ser infundidos en 30 minutos , de preferencia 1 5 minutos y el resto infundido en las siguientes 2 a 3 horas. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en contenedores de múltiples dosis, con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos , y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión , estabilización y/o dispersión . Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un veh ículo adecuado , por ejemplo, agua estéril , libre de pi rógenos, antes de su uso.

Se pueden emplear métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción del conjugado o anticuerpo desnudo terapéutico o de diagnóstico. Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada mediante el uso de pol ímeros para hacer complejo o absorber el inmunoconjugado o anticuerpo desnudo. Por ejemplo , los pol ímeros bio compatibles influyen matrices de poli(acetato de etileno-co-vinilo ) y matrices de un copol ímero de polianhídrido de un dímero de ácido esteárico y ácido sebásico. Sherwood et al . , Bio/Technology 1 0: 1 446 (1 992 ). El régimen de li beración de un inmunoconjugado o anticuerpo de tal matriz depende del peso molecular del inmunoconjugado o anticuerpo, la cantidad de inmunoconjugado, anticuerpo dentro de la matriz y el tamaño de las partículas despensas. Saltzman et al . , Biophys. J . 55: 1 63 ( 1 989); Sherwood et al . , supra . Otras formas de dosificación sólida se describen en Ansel et al . , PHARMACEUTICAL DOSAG E FORMS AN D DRUG DELIVE RY SYSTEMS, 5a Edición (Lea & Febiger 1 990 ), y Gennaro (ed . ), REM I NGTON'S PHARMACEUT ICAL SCI EN CES , 1 8a Edición (Mack Pubiishing Company 1990), y ediciones revisadas de los mismos.

El inmunoconjugado, proteínas de fusión de anticuerpo , o anticuerpo desnudo se pueden administrar también a un mam ífero de manera subcutánea o aun medíante otras rutas parenterales. Además, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante bolos sencillos o múltiples. De preferencia, el anticuerpo es ¡nfundido en un periodo menor que aproximadamente 4 horas , y más preferiblemente, en un periodo menor que aproximadamente 3 horas. Esto se realiza de preferencia mediante infusión , lentamente al principio. Por ejemplo , una dosis de 25 a 50 mg es infundida en 1 5 a 30 minutos y el resto de la dosis es infundida en un periodo de hasta 2 a 3 horas.

Generalmente, la dosificación de un inmunoconjugado , proteína de fusión o anticuerpo desnudo administrado para humanos variará dependiendo de tales factores como la edad , el peso, la altura , el sexo, la condición médica general e historia médica previa del paciente. Con anticuerpos terapéuticos de menor eficacia que veltuzumab , puede ser deseable proporcionar al recipiente una dosificación de inmunoconj ugado, proteína de fusión de anticuerpo o anticuerpo desnudo que está en el rango desde aproximadamente 1 mg/kg a 20 mg/kg como una sola infusión intravenosa , aunque se puede admi nistrar una dosificación menor o mayor según lo dicten las circunstancias. Las dosificaciones pueden variar desde 1 a 20 , 5 a 1 0, 2 a 1 0 , 1 0 a 20 , 5 a 1 5, 1 a 1 0, 1 a 5 , 2 a 5 mg/kg o cualquier rango entre 1 y 20 mg/kg . La dosificación se puede repetir según se necesite, por ejemplo, una vez por semana durante 4 a 1 0 semanas, una vez por semana durante 8 semanas, una vez por semana durante 4 semanas, o dos veces o tres veces por semana durante 2 a 8 semanas. Se puede dar también menos frecuentemente , tal como cada tercera semana durante varios meses, o mensualmente o trimestralmente durante muchos meses, según se necesite en una terapia de mantenimiento.

Alternativamente, un anticuerpo tal como un MAb anti-CD20 desnudo, se puede administrar como una dosificación cada 2 o 3 semanas, repetida para un total de por lo menos 3 dosificaciones. O, los anticuerpos se pueden administrar una vez por semana durante 4 a 8 semanas. Si se disminuye la dosificación hasta aproximadamente 200 a 300 mg/m2 (340 mg por dosificación para un paciente de 1 .7-m2, o 4.9 mg/kg para un paciente de 70 kg) o menos, se puede administrar una vez por semana durante 4 a 8 semanas. Alternativamente, el programa de dosificación se puede disminuir, a saber cada 2 o 3 semanas durante 2 a 3 meses. El programa de dosificación se puede repetir opcionalmente en otros en intervalos y la dosificación se puede dar a través de varias rutas parenterales, con el ajuste apropiado de la dosis y el programa .

En una modalidad de ejemplo, N HL o una enfermedad autoinmune puede tratarse con 4 infusiones semanales de un anticuerpo anti-CD20 humanizado a una dosis de 1 00 a 400 mg/m por semana durante 4 semanas consecutivas (i . v. (por vía i ntravenosa) durante 2 a 6 horas), repetidas según se necesite durante los siguientes meses/años. Alternativamente, el anticuerpo anti-CD20 humanizado se puede administrar a una dosis de 1 00 a 300 mg/m2 cada tercera semana o cada tres semanas , de 4 a 8 i nyecciones. En otra alternativa , N H L puede tratarse con 4 infusiones por semana como anteriormente, o inyecciones menos frecuentemente como antes, pero combinada con epratuzumab (anticuerpo anti-CD20 humanizado) en los mismos d ías, a una dosis de 360 mg/m2, dada como infusión i . v. (de manera intravenosa ) durante 1 hora , ya sea antes , durante o después de la i nfusión de anticuerpo anti-CD20 monoclonal . O, los anticuerpos usados en terapia de combinación pueden ser infundidos también en secuencias alternativas, de manera que son alternados en diferentes semanas, lo que resulta en que cada uno se administra cada tercera semana para una secuencia total de inyecciones para cada uno de 4 a 8 o más dosis. Estos programas de dosificación se pueden repetir entonces en intervalos diferentes, tal como cada 3 a 6 meses, dependiendo del estado cl ínico del paciente y la respuesta a cada régi men de terapia . En una alternativa más, N H L se puede tratar con 4 infusiones por semana , o infusiones menos frecuentes, de un anticuerpo anti-CD20 , combinado con una o más inyecciones de MAb CD22 radioetiquetado con un isótopo radioactivo tal como itrio 90 (a una dosis total de Y-90 de entre 5 y 35 mCi/por metro cuadrado como una o más inyecciones en un periodo de semanas o meses). U .S. Serial No. 09/590 ,284 incorporada en la presente por referencia , describe la inmunoterapia de trastornos autoinmunes usando u n anticuerpo anti-CD22.

En modalidades preferidas, un anticuerpo anti-CD20 desnudo o conjugado que ha sido manipulado para ser particularmente eficaz, tal como veltuzumab, puede ser administrado en dosis muy bajas para tratamiento de enfermedades tales como enfermedades de célula B , tales como linfomas o leucemias de célula B , lupus eritematoso sistémico , linfoma folicular, linfoma no-Hodgkin o purpura trombocitopénica inmune, o pénfigo vulgaris, asi como también enfermedades i nmunes tales como GVH D, anemia hemol ítica, crioglobulinemia, alosensibilización, y rechazo de trasplante de órganos. Como se describe en los siguientes ejemplos, dosis tan bajas como 80 mg o menos de veltuzumab , más preferiblemente 50 mg o menos, lo más preferible 30 mg o menos, pueden ser eficaces cuando se administran a un sujeto humano . Tales dosificaciones pueden administrarse de preferencia dos o más veces al sujeto en intervalos de aproximadamente una a tres semanas, y se pueden dar aun en más de una vez por semana, por ejemplo, dos o tres veces por semana , tal como en una dosificación en fracciones que puede contin uar por varias semanas (que puede ser preferido en ciertas enfermedades , tales como, por ejemplo, leucemia Mnfocítica crónica ). De manera sorprendente, se ha encontrado que tales dosis bajas de anticuerpos ant¡-CD20 altamente eficaces, tal como veltuzumab, son efectivas para ' agotar las células B circulantes y/o para i nhibi r el crecimiento de ' tumores relacionados con células B . La ad ministración de anticuerpos i anti-CD20 de baja dosificación de preferencia es mediante entrega 5 intravenosa o subcutánea .

Como se describe en los ejemplos más adelante, se ha encontrado que los protocolos preferidos para administración de dosis bajas de veltuzumab funcionan bien en la práctica de los métodos reivindicados y pueden ser utilizados. Por ejemplo , en un sistema de 10 linfoma de Burkitt en modelo de ratón , una sola inyección i . p. (intraperitoneal ) o s. c. (subcutánea) de tan poco como 5 pg de veltuzumab por 20 gm de ratón produjo una disminución significativa de mortalidad en comparación con los controles (Ejemplo 1 3).

Extrapolando a un humano de 70 kg , la dosificación de 5 pg sería I 15 equivalente a una sola inyección de 1 7.5 mg de veltuzumab . Una dosificación mayor para ratón de 20 pg de veltuzumab (equivalente a 70 mg para un individuo de 70 kg), admi nistrada como una sola inyección i . p . o s. c , resultó en un incremento de cuatro veces del tiempo de supervivencia media ( Ejemplo 1 3). Las dosificaciones para 20 ratón tan bajas como 0.05 pg en una dosis (equivalente a 0.1 75 mg para un individuo de 70 kg) resultó aun en una mejoría significativa en supervivencia con relación a los controles , con un incremento de dos veces en el tiempo de supervivencia media . Aunque tales dosificaciones bajas pueden producir mejorías significativas con 25 relación a los controles, el tratamiento efectivo de enfermedades relacionadas con células B puede utilizar dosificaciones algo mayores para mejores efectos terapéuticos. Ejemplos no limitantes incluyen la administración de 80 mg i. v. de veltuzumab en 2 dosis a un intervalo de dos semanas (Ejemplo 15), 4 dosis de 138 mg una vez por semana (80 mg/m2) i. v. de veltuzumab (Ejemplo 15), 4 dosis de 80 mg de veltuzumab administradas s. c. en intervalos de dos semanas (Ejemplo 15) , 4 dosis por semana de 80 mg/m2 i. v. de veltuzumab (Ejemplo 15), 2 dosis de 10 mg de veltuzumab s. c. en intervalos de dos semanas (Ejemplo 17), dosis de 40 mg de veltuzumab s. c. dos veces por semana durante 6 semanas (Ejemplo 18), 2 dosis de 40 mg de veltuzumab s. c.2 semanas de separación (Ejemplo 19), 3 dosis de 120 mg de veltuzumab s. c. por semana (Ejemplo 20), una inyección inicial i. v. de 15 mg de veltuzumab seguida por 40 mg s. c. por semana durante 3 semanas (Ejemplo 21), 4 inyecciones s. c. de 40 mg de veltuzumab en los días cero, 8, 12 y 21 (Ejemplo 22) y 4 inyecciones s. c. de 80 mg de veltuzumab con separación de dos semanas (Ejemplo 16) . Vale la pena notar que en el último caso (Ejemplo 16), una sola inyección de s. c. de 80 mg de veltuzumab produjo una regresión significativa de una masa de tumor de cuello y el agotamiento rápido de células B circulantes. El Ejemplo 24 muestra que 4 dosis de veltuzumab una vez por semana tan bajas como 80 mg/m2 resultaron en respuestas completas en por lo menos algunos pacientes humanos con NHL.

El experto se dará cuenta que las dosificaciones descritas de veltuzumab son de ejemplo solamente y que se pueden utilizar otras dosificaciones no limitantes en la práctica de los métodos reivindicados, tales como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg de veltuzumab ( dosis total) o 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg/m de veltuzumab, administradas i. v. o más preferiblemente s. c. Los rangos potenciales útiles de ciertas modalidades In, se puede proporcionar veltuzumab en la forma de jeringas prellenadas o plumas de autoinyección, formuladas para s. c. o i. v. u otra inyección parenteral, en una dosificación de 10 a 180, 10 a 100 mg, 20 a 80 mg, 30 a 60 mg, 40 a 50 mg u otro rango cualquiera de dosificaciones.

Rangos de ejemplo de baja dosificación de veltuzumab para administración s. c, i. v. o i. p. pueden ser de menos de 1 mg, 1 a 2 mg, 1 a 5 mg, 1 a 10 mg, 1 a 20 mg, 1 a 50 mg, 1 a 75 mg, 1 a 100 mg, 2 a 5 mg, 2 a 10 mg, 2 a 20 mg, 2 a 50 mg, 2 a 75 mg, 2 a 100 mg, 5 a 10 mg, 5 a 20 mg, 5 a 30 mg, 5 a 40 mg, 5 a 50 mg, 5 a 60 mg, 5 a 75 mg, 5 a 100 mg, 10 a 20 mg, 10 a 30 mg, 10 a 40 mg, 10 a 50 mg, 10 a 60 mg, 10 a 75 mg, 10 a 100 mg, 20 a 30 mg, 20 a 40 mg, 20 a 50 mg, 20 a 60 mg, 20 a 75 mg, 20 a 100 mg, 25 a 40 mg, 25 a 50 mg, 25 a 60 mg, 25 a 75 mg, 25 a 100 mg, 30 a 40 mg, 30 a 50 mg, 30 a 60 mg, 30 a 75 mg, 30 a 100 mg, 40 a 50 mg, 40 a 60 mg, 40 a 75 mg, 40 a 100 mg, 50 a 60 mg, 50 a 75 mg, 50 a 100 mg, 60 a 70 mg, 60 a 80 mg, 60 a 90 mg, 60 a 100 mg o 75 a 100 mg. Alternativamente, se pueden administrar los mismos rangos en mg/m2 a un sujeto humano. Como se discute en los ejemplos más adelante, tales bajas dosificaciones de veltuzumab han mostrado ser efectivas por lo menos en sistemas de modelo animal y algunos sujetos humanos de ejemplo con leucemias o linfomas relacionadas con células B o enfermedades autoinmunes u otras enfermedades inmunes.

Las composiciones descritas en la presente son particularmente útiles para el tratamiento de varias enfermedades autoinmunes así como también formas indolentes de linfomas de cél ula B , formas agresivas de linfomas de célula B , leucemias linfáticas crónicas, leucemias linfáticas agudas, y macro globulinemia de Waldenstrom , así como también GVH D , crioglobul inemia , anemia hemol ítica, alosensibilización , y rechazo de trasplante de órganos. Por ejemplo, los componentes e inmunoconjugados del anticuerpo anti-CD20 humanizado se pueden usar para tratar ambas formas indolente y agresiva de linfoma no Hodgkin , varias enfermedades autoinmunes (por ejemplo , artritis reumatoide , síndrome de Sjogren , pénfigo vulgaris, púrpura trombocitopénica inmune) y varias otras enfermedades inmunes (rechazo de trasplante de órganos y anemia hemol ítica inmune).

Como se discute supra, los anticuerpos se pueden usar para tratar linfoma y leucemia de célula B y otras enfermedades o trastornos de célula B . Ejemplos de tipos de cánceres que pueden seleccionarse como objetivos i ncluyen leucemia linfoblástica aguda , leucemia linfocítica crónica , linfoma de Hodgkin , linfoma de no Hodgkin y mieloma múltiple.

Los anticuerpos anti-CD20 se pueden usar para tratar enfermedades autoinmunes relacionadas con células B , incluyendo enfermedades autoinmunes de Clase I I I tales como trombocitopenias inmuno-mediadas (purpura trombocitopénica idiopática aguda y purpura trombocitopénica idiopática crónica) , dermatomiositis , síndrome de Sjogren , esclerosis múltiple, corea de Sydenham , miastenia grave, l upus eritematoso sistémico, lupus nefritis, fiebre reumática , artritis reumatoide, sínd romes poligland ulares, penfigoide bulloso, diabetes mellitus, púrpura de Henoch-Schónlein , nefritis post-estreptocócica, eritema nodoso , arteritis de Takayasu , enfermedad de Addison, sarcoidosis, colitis ulcerante, eritema multiforme , nefropatía IgA, poliarteritis nodosa, espondilitis anquilosante, síndrome de Goodpasture , tromboangitis obliterans, cirrosis biliar primaria, tiroiditis de Hashimoto, tirotoxicosis, escleroderma , hepatitis crónica activa, polimiositis/dermatomiositis, policondritis, pénfigo vulgaris, granulomatosis de Wegener, nefropatía membranosa , esclerosis amiotrófica lateral, tabes dorsal , arteritis/polimialgia de célula gigante, anemia perniciosa, glomerulonefritis rápidamente progresiva y alveolitis fibrosa .

Los anticuerpos anti-CD20 pueden ind ucir también apoptosis en células que expresan el antígeno CD20. Por ejemplo, se demostró que la apoptosis podría ser inducida usando células de linfoide que tienen receptores de Fe reactivos con IgG-Fc de Mabs CD20 que están entrelazados . Ver, Shan et al , Cáncer Immunol. Immunother. 48( 1 2 ):673-683 (2000). Además, se reportó que los agregados de un MAb CD20 quimérico, es decir, homopol ímeros, indujeron la apoptosis. Ver Ghetie et al , Blood 97(5): 1392-1 398 (2000) y Ghetie et al , Proc.

Nati. Acad. Sci USA 94(1 4): 7509-751 4 ( 1997).

Paq uetes Varias modalidades pueden involucrar paquetes que contienen componentes adecuados para tratar o diagnosticar tejidos enfermos en un paciente. Paquetes de ejemplo pueden contener por lo menos un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión como se describe en la presente. Si la composición que contiene los componentes para administración no está formulada para entrega vía el canal alimentario, tal como mediante entrega oral, se puede inclui r un dispositivo capaz de entregar los componentes del paquete a través de alguna otra ruta . Un tipo de dispositivo, para aplicaciones tal como entrega parenteral , es una jeringa que se usa para inyectar la composición al cuerpo de un sujeto. Se pueden usar también dispositivos para inhalación. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD20 o fragmentos de unión a antígeno del mismo, tal como veltuzumab, se puede proporcionar en la forma de una jeringa prellenada o pluma de autoinyección que contiene una formulación l íquida, estéril o preparación liofilizada de anticuerpo (por ejemplo, Kivitz et al , Clin. Ther. 2006, 28 : 1 61 9-29).

Los componentes del paquete pueden estar empacados conjuntamente o por separado en dos o más contenedores. En algunas modalidades, los contenedores pueden ser frascos que contienen formulaciones liofilizadas, estériles, de una composición que es adecuada para reconstitución . Un paquete puede contener también uno o más búferes adecuados para la reconstitución y/o dilución de otros reactivos. Otros contenedores que se pueden usar se incluyen, pero no están limitados a, una bolsa, una charola, una caja, un tubo o los similares. Los componentes del paquete pueden estar empacados y mantenidos de manera estéril dentro de los contenedores. Otro componente que puede incluirse es las instrucciones para una persona que usa un paquete para su aplicación.

Vectores de Expresión Otras modalidades aun pueden involucrar secuencias de ADN que comprenden un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, proteína de fusión o anticuerpo biespecífico. Secuencias de ejemplo que pueden estar codificadas o expresadas incluyen un anti-CD20 o fragmento de unión a antígeno del mismo, una proteína de fusión que comprende por ló menos un anticuerpo anti-CD20 o fragmentos de unión a antígeno del mismo, una proteína de fusión que comprende por lo menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y por lo menos un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. El primer y el segundo anticuerpos pueden comprender un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo contra un tumor o antígeno asociado con células B tales como B7, CD4, CD5, CD8 CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD95, CD126, CD133, CD138, CD154, CEACAM6, ED-B fibronectina, IL-2, IL-6, IL-25, UC1, MUC2, MUC3, MUC4, MIF, NCA-66, la, HM1.24, HLA-DR, tenascin, T101, TAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, VEGFR, EGFR, PIGF , I LG F, I LG F-1 R, Flt-1 , Flt-3, tenascin , factor C5 de complemento , un producto de oncogén, Kras, cM ET, bcl-2, bcl-6, y/o un hapten en un constructo que se puede seleccionar como objetivo .

Varias modalidades se refieren a vectores de expresión que comprenden secuencias que codifican ADN . Los vectores pueden contener secuencias que codifican regiones constantes de cadena ligera y pesada y la región de bisagra de una inmunoglobulina humana a la cual se pueden unir secuencias de región variable quimérica, humanizada o humana . Los vectores pueden contener adicionalmente promotores que expresan MAbs en una célula huésped seleccionada, incrementadores de inmunoglobulina y secuencias de señal o líderes. Los vectores que son particularmente útiles son pd HL2 o GS . M ás preferiblemente, las regiones constantes de cadena ligera y pesada y la región de bisagra pueden ser de una inmunoglobulina de mieloma humana EU , donde opcionalmente por lo menos uno del aminoácido en las posiciones de alotipo esta cambiado con aquel encontrado en un alotipo lgG 1 diferente, y en donde opcionalmente el aminoácido 253 de la cadena pesada E U con base en el sistema numérico EU puede ser remplazado con alanina. Ver Edelman et al , Proc. Nati. Acad. Sci USA 63: 78-85 ( 1 969).

También se incluye un método de expresión de anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno o proteínas de fusión . El experto se dará cuenta de que los métodos de constructos de expresión manipulados genéticamente y la inserción en células huésped para expresar proteínas manipuladas son bien conocidos en la técnica y una materia de experimentación de rutina. Las células huésped y los métodos de expresión de anticuerpos clonados o fragmentos de unión a antígeno se han descrito, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente Nos. de Serie 11/187,863, presentada el 7/25/05; 11/253,666, presentada el 10/20/05 y 11/487,215, presentada el 7/14/06, cuya sección de ejemplos de cada una se incorpora en la presente por referencia.

Técnicas Generales Para Construcción de Anticuerpos Anti-CD20 Las secuencias V« (cadena ligera variable) y VH (cadena pesada variable) para anticuerpos anti-CD20 pueden obtenerse mediante una variedad de procedimientos de clonación, tales como RT-PCR, 5'-RACE y clasificación de biblioteca de ADN. Específicamente, los genes V de un MAb anti-CD20 de una célula que expresa un MAb anti-CD20 de múrido se puede clonar mediante amplificación y secuenciado de PCR. Para confirmar su autenticidad, los genes clonados VL y VH se pueden expresar en cultivos de células como un Ab quimérico como se describe por Orlandi et al, (Proc. Nati. Acad. ScL, USA, 86: 3833 (1989)). Con base en las secuencias de genes V, se puede designar y construir entonces un MAb anti-CD20 humanizado como se describe por Leung et al. (Mol. Immunol., 32: 1413 (1995)).

Se puede preparar cADN a partir de cualquier línea de hibridoma o línea celular transfectada conocida que produzca un MAb anti-CD20 de múrido mediante técnicas generales de clonación molecular (Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2a Ed (1989)). La secuencia VK para el MAb puede amplificarse usando los cebadores VKIBACK y VKIFOR (Orlandi et al., 1989) o el grupo extendido de cebadores descrito por Leung et al. (BioTechniques, 15: 286 (1993)). Las secuencias de VH pueden amplificarse usando el par cebador VH1 BACK/VH1 FOR (Orlandi et al, 1989) o los cebadores que templan a región constante de IgG de múrido descrito por Leung et al. (Hybridoma, 13:469 (1994)).

Mezclas de reacción de PCR que contienen 10 µ? del primer producto de hebra de cADN, 10 µ? de búfer de PCR 10X [500 mM KCI, 100 mM Tris-HCI (pH 8.3), 15 mM MgCI2, y gelatina 0.01% (w/v)] (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 250 µ? de cada dNTP, 200 nM de los cebadores, y 5 unidades de polimerasa Taq ADN (Perkin Elmer Cetus) se pueden sujetar a 30 ciclos de PCR. Cada ciclo de PCR consiste de preferencia de desnaturalización a 94°C durante 1 minuto, templado a 50°C durante 1.5 minutos y polimerización a 72°C durante 1.5 minutos. Los fragmentos de VK y VH amplificados pueden ser purificados en agarosa 2% (BioRad, Richmond, CA). Los genes V humanizados pueden ser construidos mediante una combinación de síntesis de oligonucleótidos largos y amplificación de PCR como se describe por Leung et al. (Mol. Immunol, 32: 1413 (1995)).

Los productos de la PCR para VK pueden ser subclonados en un vector de graduación, tal como un vector de graduación con base en pBR327, VKpBR, que contiene un promotor Ig, una secuencia de péptido de señal y sitios de restricción convenientes para facilitar la ligación en-marco de los productos de VK de PCR. Los productos de la PCR para VH pueden ser subclonados en un vector de graduación similar, tal como VHpBS con base en pBluescript. Los clones individuales que contienen los productos de PCR respectivos pueden ser secuenciados mediante, por ejemplo, el método de Sanger et al {Proc. Nati. Aca . ScL, USA, 74: 5463 (1977)).

Los casetes de expresión que contienen las secuencias VK y VH, junto con el promotor y secuencias de señal de péptido pueden ser escindidos de VKpBR y VHpBS, respectivamente, mediante digestión doble de restricción como fragmentos HindIII-BamHI. Los casetes de expresión de VK y VH pueden ser ligados a vectores de expresión apropiados, tales como pKh y pGlg, respectivamente (Leung et al, Hybridoma, 13:469 (1994)). Los vectores de expresión pueden ser co-transfectados a una célula apropiada, por ejemplo, mieloma Sp2/0-Ag14 (ATCC, VA), colonias seleccionadas para resistencia de higromicina y fluidos sobrenadantes monitoreados para producción de un MAb anti-CD20 quimérico, humanizado o humano, por ejemplo, un ensayo ELISA. Alternativamente, los casetes de expresión VK y VH pueden ser ensamblados en los vectores de graduación modificados, VKpBR2 y VHpBS2, extirpados como fragmentos Xbal/BamHI y Xhol/BamHI, respectivamente, y subclonados en un solo vector de expresión, tal como pdHL2, como se describe por Gilíes et al (J. Immunol. Methods 125:191 (1989) y mostrado también en Losman et al, Cáncer, 80:2660 (1997)). Otro vector que es útil es el vector GS, como se describe en Barnes et al, Cytotechnology 32:109-123 (2000). Otros sistemas de expresión apropiados para mamíferos se describen en Werner et al, Arzneim.-Forsch./Drug Res. 48(11), Nr. 8, 870-880 ( 1 998 ).

La co-transfección y ensayo para clones que secretan anticuerpos mediante EL ISA se pueden llevar a cabo como sigue. Se pueden usar aproximadamente 1 0 pg de VKppHk (vector de expresión de cadena ligera ) y 20 pg de VhpGlg (vector de expresión de cadena pesada) para la transfección de 5 x 1 06 células de mieloma S P2/0mediante electroporación (BioRad , Richmond , CA) de acuerdo con Co et al , J. Immunol, 1 48: 1 1 49 ( 1 992). Después de la transfección, se pueden hacer crecer células en placas de microtitulación de 96 pozos en medio HSFM completo (Life Technologies, I nc. , Grand Island , NY) a 37°C , 5% C02. El proceso de selección se puede iniciar después de dos d ías mediante la adición de medio de higromici na de selección (Calbiochem , San Diego , CA) a una concentración final de 500 unidades/ml de higromicina. Las colonias surgen típicamente de 2 a 3 semanas después de la electroporación. Los cultivos se pueden expandir entonces para análisis posterior. Clones de transfectoma que son positivos para la secreción de cadena pesada quimérica, humanizada o humana pueden ser identificados mediante el ensayo ELI SA.

Los anticuerpos pueden aislarse a partir de medios de cultivo de células como sigue. Se adaptan cultivos de transfectoma a medio libre de suero. Para producción de anticuerpo quimérico se hacen crecer células como un cultivo de 500 mi en botellas de rodil lo usando HSFM . Los cultivos son centrifugados y se filtra el sobrenadante a través de membrana de 0.2 µ . El medio filtrado se pasa a través de una columna de proteína A ( 1 x 3 cm) a un régimen de flujo de 1 ml/min . La resi na se lava después con aproximadamente 1 0 volúmenes de columna de PBS y el anticuerpo de unión a proteína A se eluye de la columna con búfer de glicina 0.1 M (pH 3.5) que contiene EDTA 1 0 mM . Se toman fracciones de 1 .0 mi en tubos que contienen 1 0 µ? de Tris 3 M (pH 8.6) y se determina la concentración a partir de la absorbancia a 280/260 nm. Las fracciones pico se reúnen , se dializan contra PBS y se concentra el anticuerpo, por ejemplo, con el Centricon 30 (Amicon, Beverly, MA). Se determina la concentración del anticuerpo mediante EL ISA y se ajusta su concentración a aproximadamente 1 mg/ml usando PBS . Se agrega convenientemente azida de sodio, 0.01 % (p/v), a la muestra como conservador.

Ejem plos Ejemplo 1. Construcción de anticuerpos anti-CD20 qu iméricos y h uman izados La construcción de anticuerpos anti-CD20 quiméricos (cA20) y humanizados (hA20, veltuzumab) se realizó como se decribe en la Patente de E . U . No. 7, 1 51 , 1 64, cuya sección de ejemplos se incorpora en la presente por referencia. (Ver también , Stein et al , Clin Cáncer Res 2004; 10: 2868-2878). Las secuencias de cA20 y hA20 de ADN y aminoácidos de región variable se describen , respectivamente, en la Figu ra 1 y la Figura 2.

Las secuencias de CDR de cA20 y hA20 son idénticas a aquellas de rituximab ( ab C2B8 parental de múrido), con la excepción del tercer CDR de la cadena pesada (CDRH3). Por conveniencia , las secuencias de CDR de cadena pesada se aluden como CDRH 1 -H3 y las CDRs de cadena ligera como CDRL 1 -L3. Fuera de las secuencias CDRH3 para anticuerpos anti-CD20, solamente C2B8 y el rituximab correspondiente tienen un residuo de asparagina en la posición 1 01 de Kabat.

Las secuencias de región de marco de veltuzumab (hA20) se construyeron usando las mismas regiones de marco ( FRs) del donador de I gG humana como el anticuerpo anti-CD20 humanizado epratuzumab (Leung et al , Mol Immunol 1 995; 32 : 141 3-1427). Específicamente, se seleccionaron FR1 , FR2 y FR3 del anticuerpo E U humano y FR4 del anticuerpo N EWM humano para la cadena pesada y las F Rs del anticuerpo REI humano para la cadena ligera del anticuerpo hA20 humanizado. Como se describe en la Patente de E . U . No. 7, 1 51 , 1 64, se retuvieron residuos clave de múrido en las FRs para mantener la especificidad y afinidad de unión de veltuzumab para CD20 similar a aquellos del anticuerpo parental de múrido. La cadena pesada de hA20 (hA20VH I ) contiene nueve cambios de los marcos EU humanos, mientras que la cadena ligera de hA20 (hA20V«) contiene siete cambios de aminoácido del marco REI ( Patente de E . U . No. 7, 1 51 , 1 64).

Una comparación de las secuencias de región variable de cA20, hA20 y rituximab (de C2B8) se muestra en la Figura 3. Como se indica en la Figura 3A y 3B, cA20 difiere de veltuzumab (hA20) en las regiones variables de marco , pero tiene CDRs idénticas al veltuzumab. Las secuencias de región variable de cA20 son idénticas a aquellas de rituximab (c2B8), con la excepción de tres residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal de la cadena variable, mientras que las secuencias de región de marco de rituximab y veltuzumab difieren por 18 residuos en la cadena ligera y 14 residuos en la cadena pesada. Las secuencias de CDR de rituximab difieren de aquellas de veltuzumab (hA20) y cA20 solamente en la posición 101 de Kabat del VH de CDR3.

Como se describe en los siguientes Ejemplos, veltuzumab y rituximab difieren significativamente con respecto al régimen de disociación de células positivas de linfoma de CD20 y en ciertas características terapéuticas in vivo e in vitro. Para determinar si estos cambios en características eran atribuibles o no a las diferencias en secuencia de marco o la sustitución de Asp para Asn en la posición 101 de Kabat de VH de CDR3, un muíante de veltuzumab, designado D101N, se manipuló con un cambio de aminoácido sencillo no conservador de ácido aspártico a asparagina en la posición 101 en CDRH3. Así, D101N tiene las mismas CDRs que el rituximab, pero idénticas FRs con veltuzumab. Detalles adicionales de la construcción de D101N se proporcionan más adelante. La Tabla 1 compara las secuencias de CDRH3 de veltuzumab, cA20, D101N, rituximab y 1F5, todos los cuales tienen secuencias CDRH1 y CDRH2 idénticas.

Tabla 1. Comparación de CDRH31 D101N - N - cA20 Rituximab N 1F5 H G S N Y V D Y Residuos marcados como ¦ son idénticos a aquellos de veltuzumab en la misma posición.

Ejemplo 2. Construcción de Variante de Secuencia de D101N de Veltuzumab Todas las endonucleasas y otras enzimas de restricción fueron compradas de New England Biolabs (Beverly, MA). Los oligonucleótidos se sintetizaron por Sigma (Haverhill, UK). Las reacciones de PCR se realizaron usando polimerasa Amplitaq (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un sistema 9600 GeneAmp PCR de Perkin Elmer (Wellesley, MA). Dos vectores de reacciones de PCR usando hA20-pdHL2 (ver Patente de E. U. No. 7,151,164) como una plantilla y los pares de cebadores de oligonucleótido de 5' D101N (cggtgactggtacttcaatgtctggggccaaggcaccacg SEQ ID NO: 17) y 3' Hind3 (aaagcttgcggccgcgatcc SEQ ID NO: 18) o 3' D101N (cgtggtgccttggccccagacattgaag taccagtcaccg SEQ ID NO: 19) y 5' Xhol (cctcgagcacacaggacctc SEQ ID NO:20) produjeron amplímeros de 210 bp o 510 bp, respectivamente. Una tercera reacción de PCR usando una mezcla de los productos de 210 bp y 510 bp como plantilla y los cebadores 5' Xhol y 3' Hind3 produjo un amplímero de 680 bp, que fue aislado con gel y clonado en el vector de clonación pGemT de PCR (Promega, Madison, Wl). La secuencia del amplímero se confirmó mediante secuenciado automatizado de ADN. El fragmento de 680 bp se extirpó del vector pGemT con enzimas de restricción Xhol y Hind III y se ligó al vector hA20-pdHL2, el cual se separó mediante digestión con las mismas enzimas. La secuencia del vector de final, D101N-hA20-pdHL2, se confirmó mediante secuenciado automatizado de ADN.

Ejemplo 3. Análisis de Scatchard de unión de anticuerpos anti-CD20 Líneas de Células En los siguientes Ejemplos, el hibridoma 1F5 de múrido y las líneas de linfoma Burkitt humano, Daudi, Raji y Ramos, se compraron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las líneas de células de linfoma no Burkitt usadas fueron: SU-DHL-6 de Dr. Alan Epstein (University of Southern California, Los Angeles, CA), y WSU-FSCCL de Dr. Mitchell Smith (Fox Chase Cáncer Center, Philadelphia, PA). Las células se hicieron crecer como cultivos en suspensión en DMEM (Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD), suplementados con suero de bovino fetal 10%, penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 Mg/ml) y L-glutamina (2 mM).

Análisis Scatchard El número máximo de sitios de unión por célula Raji y las constantes de disociación aparente de veltuzumab y rituximab se determinaron mediante análisis de regresión no lineal de los datos de unión de saturación obtenidos con las muestras de radio-yodado y las I cél ulas Raji , usando software Prism (Software I nc. , San Diego , CA).

• Células Raji (5 x 1 05) se incubaron con Mabs radio-yodados en un ; volumen de ensayo de 225 µ? , usando medio de cultivo de tejido como j 5 diluyente, durante 1 hora a 37°C a temperatura ambiente . Las células se lavaron después dos veces con PBS que conten ía suero de caballo 1 % y se contaron gránulos de células en un contador gama . Se titularon los MAbs a una dilución serial de 2: 3 iniciando con aproximadamente 2 x 1 06 cpm/2 pg de Mab/tubo, corrida por triplicado. 10 Se midió la unión no específica incluyendo MAb replicado no etiquetado. La inmunorreactividad de los MAbs radioetiquetados, medida mediante la unión a anticuerpos anti-idiotipo , fue de 90% o ! mayor. i Los resultados mostrados en la Figura 4 demuestran que tanto el i 15 número de sitios de unión por célula como las constantes de equilibrio de disociación (funcional Kd) fueron similares para el veltuzumab y el rituximab. El número de sitios de unión por célula Raji se calculó para variar desde 2.0 x 1 0 - 4.2 x 1 05 para veltuzumab versus 1 .8 x 1 05 - 3.6 x 1 05 para rituximab. En ensayos de replicado, los valores de la 20 constante de disociación aparente varían de 6.23 a 1 2.02 nM para veltuzumab versus 6.70 a 8.63 nM para rituximab . Estos valores son ! similares a aquellos reportados previamente por nosotros mismos y ¡ otros, así como también en la i nformación de prescripción para rituximab (Melhus et al . , Cáncer Biother. Radiopharm. , 22 : 469-479 , ¡ 25 2007 ; Stein et al . , Clin. Cáncer Res. , 10: 2868- 2878 , 2004).

I Ejemplo 4. Ensayo de Unión de Superficie de Célula Competitivo Estudios de especificidad y afinidad de unión-(antígeno) Ag de los Abs anti-CD20 cA20, hA20 y c1F5, purificados mediante cromatografía de afinidad en una columna de Proteína A fueron evaluados mediante un ensayo de unión competitivo de superficie celular con 2B8 de múrido y rituximab (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, CA). Una cantidad constante (100,000 cpm, -10 pCi/pg) de m2B8 etiquetado con 5l o rituximab se incubó con células Raji en la presencia de concentraciones variantes (0.2 - 700 nM) de Abs competitivos (cA20, hA20, m2B8, c1F5 o rituximab) a 4°C durante 1 a 2 horas. Se removieron Abs no unidos mediante lavado de las células con PBS. Se determinó la radioactividad asociada con las células después del lavado. Los resultados (no mostrados) demostraron que cA20, hA20 y c1F5 compitieron todos por unirse a CD20 con rituximab (c2B8) y múrido 2B8.

Ejemplo 5. Comparación de disociación o fuera de regímenes Los regímenes de disociación de veltuzumab, rituximab, cA20, D101N, 1F5 y tositumomab (anti-CD20, BEXXAR®, GlaxoSmithKIine) se compararon por citometría de flujo usando células Daudi, Raji y Ramos (Figura 5). Cada Mab se etiquetó con ficoeritrina (PE) usando un paquete de etiquetación de IgG humana Zenon R-Phycoerythrin siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante (Invitrogen, Molecular Probes, Z-25455). Células (Daudi, Raji, o Ramos) en 0.5 mL de CM (medios RPMI 1640 libres de rojo fenol suplementados con FBS 10%) a 1 x 106 células/mL se incubaron con 0.5 ig de cada MAb se etiquetaron con PE a temperatura ambiente durante 30 minutos, se granularon a 400 x g, se lavaron dos veces con CM, se resuspendieron en 1.5 mL de CM, y se dividieron en dos alícuotas de 0.75 mL. Para evitar la reaglutinación, se agregó Fab'-veltuzumab bloqueado con N-etil-maleimida (NEM) a cada replicado (concentración final 1 mg/mL) y se midió inmediatamente la intensidad media de la fluorescencia (MFI) para determinar la aglutinación máxima (T = 0) usando un software Guava PCA y Guava Express (Guava Technologies, Inc., Hayward, CA). Se tomaron medidas después en intervalos de 30 minutos. El porcentaje máximo de unión, que es el cociente de la MFI a T = X dividida entre aquella a T = 0, se gráfico contra el tiempo, y los resultados se analizaron con software Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) para dar la vida media o fuera de regímenes.

Los regímenes de disociación de veltuzumab, rituximab y cA20 de células Daudi (Figura 5A), Ramos (Figura 5B) y Raji (Figura 5C) se compararon en la presencia de exceso de veltuzumab-Fab'-NEM a 37°C. se realizaron mediciones adicionales para comparar la disociación de veltuzumab, rituximab y D101N de células Raji (Figura 5D) bajo condiciones similares. Para cada línea de célula ensayada, la vida media de veltuzumab en promedio fue 2.7 (±0.3) veces más largo que aquel de rituximab (P<0.0001), pero indistinguible de aquel de cA20 (P>0.2). En contraste, el D101N mutante se disocia de las células Raji con un fuera de régimen de dos y seis veces más rápido que el rituximab y veltuzumab, respectivamente. Estos resultados indican que el cambio de ASn101 a Asp10i es responsable de la disociación más lenta de veltuzumab. Comparamos la disociación de veltuzumab, rituximab, D101N, 1F5 y tositumomab de células Raji (Figura 5E) en la ausencia del veltuzumab-Fab'-NEM competente y se encontró que veltuzumab tiene la vida media más larga (281 min), seguido por 1F5 (195 minutos), rituximab (94 minutos), tositumomab (50 minutos) y D101N (42 minutos).

Ejemplo 6. Inhibición de Proliferación de Células In Vitro Mediante Ensayo MTT El ensayo de citotoxicidad in vitro se basó en el método de Mosmann (J Immunol Methods, 65: 55-63, 1983). Brevemente, las líneas celulares se colocaron en placas a 1 a 2 x 104 células/pozo (100 µ?) en placas de 96 pozos, a los cuales se agregaron anticuerpos (100 µ?). Después de incubación durante 4 días a 37°C en una incubadora humidificada con C02 (5%), se agregaron 25 µ? de MTT de 5.0 mg/ml [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio], y las células se incubaron durante 4 horas adicionales a 37°C. Después se centrifugaron las placas y se removieron los sobrenadantes. Se disolvieron gránulos usando 100 µ? de DMSO/pozo y se midió la densidad óptica a 570 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Debido a que se reportó previamente que rituximab y veltuzumab sin etiquetar requieren el entrelazamiento para actividad citotóxica (Stein et al., Blood, 104: 3705-3711, 2004), se agregó IgG de cabra anti-humana (GAH) a algunos de los pozos. Se usaron veltuzumab y rituximab a una concentración final de 5 µg/ml y se usó GAH a 20 pg/ml . Todas las pruebas se real izaron en 4 replicados.

Se examinó la habilidad de veltuzumab y rituximab para inhibir la proliferación usando ensayos de citotoxicidad MTT en cuatro l íneas de células de linfoma, SU-DH L-6, Daudi , Raji , y WSU-FSCCL, las cuales difieren en sus niveles de expresión de CD20 (Stein et al . , Clin Cáncer Res, 1 0: 2868-2878, 2004). Aunque la sensibilidad para ambos MAbs se correlacionaron con la expresión de CD20 (S U-DHL-6 > Raji > Daudi > WSU-FSCCL), no se observaron diferencias significativas en potencia entre veltuzumab y rituximab dentro de una l ínea celular (Figura 6). El entrelazamiento con un segundo anticuerpo (GAH , IgG anti-humana de cabra) incrementó la eficacia de veltuzumab y rituximab en células Raji y Daudi , dos l íneas de células con niveles intermedios de expresión de CD20 y sensibilidad para aniquilar mediante MAbs anti-CD20 (Figura 6). La inhibición de proliferación de líneas de células en cualquier extremo de sensibil idad de anti-CD20 (por ejemplo, SU-DH L-6, que es muy sensi ble, y WSU-FSCCL, que es muy insensible) no se beneficia por la adición de un segundo anticuerpo ( Figura 6).

Ejemplo 7. Agotamiento de Células B y T In Vitro Los efectos de veltuzumab en linfocitos de sangre periférica humana de voluntarios saludables se evaluaron in vitro usando citometría de flujo. Se incubaron al ícuotas de sangre entera con veltuzumab durante dos días seguido por análisis de células B (CD1 9+ ) y células T (CD3+) mediante FACS . Los controles incluyeron no anticuerpo y un MAb humanizado de control negativo (anticuerpo monoclonal anti-CEACAM5, hMN-14). La incubación de sangre entera con veltuzumab condujo a disminuciones significativas en el número de células B, pero no de células T (Figura 7). Las disminuciones de células B variaron de 26 a 80% usando 5 pg/ml y de 11 a 61% usando 1 Mg/ml (valores P vs. Células no tratadas <0.05 con 1 g/ml [6.7 nM] para donadores de sangre 3/3 y 5 pglm\ [33.3 nM] para donadores de sangre 5/5). Debido a que se usó sangre entera en las mezclas de incubación, las disminuciones observadas en los conteos de células podrían deberse a CDC o ADCC, así como señalización directa.

Ejemplo 8. Ensayos de Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC) Se usó el método fluorométrico para evaluar y comparar la actividad de CDC de veltuzumab vs. rituximab. Se sembraron células Daudi, Raji o Ramos (1 x 106/mL) (50 µ?_ por pozo) en placas negras de 96 pozos (Nunc) y se incubaron durante 3 horas a 37°C y C02 5% con cada MAb de prueba (0.001 a 10 pg/ml_)en la presencia de complemento humano (Quidel Corp., San Diego, CA) a una dilución final de 1/20. Se agregó el colorante indicador, AlamarBIue (BioSource, Camarillo, CA) y se continuó la incubación durante una noche. Se cuantificaron células viables midiendo la intensidad de la fluorescencia con excitación a 530 nM y emisión a 590 nM usando BioTek Synergy™ HT Multi-Detection Microplate Reader y KC4 Signature Software (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT).

Las curvas de respuesta a las dosis generadas a partir de la media de 6 determinaciones de replicados se analizaron usando software Prism para obtener valores de EC50. En el caso de células Daudi , para llevar la cuenta de las variaciones día con d ía en el ensayo, así como también aumentar la precisión de los estimados de EC50, los experimentos usaron un diseño multifactorial , donde el ensayo para cada anticuerpo se realizó en triplicado cada d ía, y se repitió en tres d ías diferentes para un total de 9 ensayos por anticuerpo. Las muestras incluyeron 3 lotes diferentes de veltuzumab y uno de rituximab. El análisis estadístico de los datos de EC50 se basó en análisis de dos sentidos de modelo de variancia (ANOVA) con tipo de d ía y anticuerpo como factores. Se utilizó el procedimiento de comparación múltiple de Dunnett para realizar las 3 comparaciones de los 4 constructos con un régimen de error experimental global de 0.05.

Con Daudi como las células objetivo para CDC, observamos consistentemente un valor inferior de EC50 para veltuzumab (Tabla 2) cuando se comparó con rituximab. Mediciones adicionales que tratan cualquier efecto de variación d ía con d ía así como también cualesquiera diferencias en patrones de EC50 entre los anticuerpos a través de diferentes días indicaron que la diferencia media en EC50 observada entre rituximab y cada uno de los tres lotes de veltuzumab fue consistentemente significativa en términos estadísticos (P<0.0001 ). Sin embargo, no se observaron diferencias entre veltuzumab y rituximab con resultados de CDC en las otras dos l íneas de células, Raji y Ramos.

Tabla 2. Comparación de Veltuzumab Versus Rituximab: Resumen de Resultados de CDC (EC50) en la Línea de Células Daudi.

I 10 111 Con base en modelo ANOVA de 2 sentidos ajustado para comparaciones múltiples usando el método Dunnett.

Ejemplo 9. Ensayos de Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo. 15 Se midió la inducción de ADCC usando células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y células Daudi como efector y objetivo, respectivamente. Se incubaron células Daudi con cada anticuerpo de prueba en triplicado a 5 µ?/ml durante 30 minutos a 37°C y C02 5%. Se agregaron entonces células mononucleares de sangre periférica 20 aislada recientemente (PBMCs) obtenidas de voluntarios saludables a una proporción óptima de efector-a-objetivo de 50:1. Después de incubación de cuatro horas, se evaluó la lisis de células mediante CytoTox-One (Promega, Madison, Wl). La ADCC se determinó para MAb + células efectoras, MAb + células objetivo y MAb + células 25 objetivo + células efectoras. Se procesaron también pozos de control i que conten ían MAb solo y cél ulas objetivo solas.

Para evaluar los resultados, se restó el valor medio de fondo obtenido de pozos con medio solo a partir de otros pozos y se calculó el % de lisis usando la siguiente ecuación en la cual M ET representa los pozos que contienen MAb , células efectoras y objetivo; ET es los pozos que contienen células efectoras y objetivo; T , pozos que contienen células objetivo solamente; y Max es pozos que contienen células objetivo y búfer de lisis: MET - ET % Lisis = x 100.

Max - T.

El nivel de actividad de ADCC de cinco lotes de veltuzumab se comparó con aquellos de rituximab y un MAb de control negativo (hM N- 14) midiendo la citolisis de la l ínea de células Daudi que expresan CD20. La función de la célula efectora fue proporcionada por PBMCs aisladas recientemente de dos donadores voluntarios de sangre. Los resultados indicaron que rituximab y cada uno de los cinco lotes de veltuzumab produjeron niveles estadísticamente similares (P = 0.1 2) de ADCC (40-45% de lisis) (datos no mostrados). Rituximab y veltuzumab mostraron ambos niveles significativamente más altos de ADCC (P<0.0001 ) en comparación con el MAb control (9.9% lisis, labetuzumab anti-CEA hmanizado).

Ejemplo 10. Efectos de célu la aniqu iladora natural y agotamiento de neutrófilo en terapia.

El agotamiento de células NK y neutrófilos se realizó como se describió previamente (Hernandez-llizaliturri et. al . , Clin Cáncer Res 9.5810-12, 2003). Brevemente, cada rato le recibió 100 µ?_ i. p. de ascitis anti-ratón Gr-1 (proporcionado por el Dr. FJ. Hernandez-llizaliturri, Roswell Park Cáncer Institute, Buffalo, NY) y 100 pg de anticuerpo receptor IL-2 anti-ratón (??ß-1, BD PharMingen, Inc., San José, CA) un día antes de inocular 1 x 106 células Raji, seguido por dos o más inyecciones i. p. de ascitis anti-ratón Gr-1 en los días 6 y 13. El agotamiento se confirmó mediante análisis de FACS de muestras de sangre tomadas de 1 ratón agotado y 1 no agotado en los días 3 y 13. Se administró i. v. veltuzumab (200 pg) o salina en los días 3, 5, 7 y 11.

El papel de las células efectoras sobre la inhibición de veltuzumab de tumor de Raji hecho crecer in vivo se examinó (Figura 11). En esos animales agotados de NK y neutrófilos, no hubo diferencia entre ratones de control con salina y los tratados, ambos teniendo el mismo ST (16.4 + 1.3 días). En contraste, en los ratones no agotados, los ratones tratados con veltuzumab tuvieron un MST significativamente mejorado sobre los controles de salina (38.6 ± 7.3 vs. 18.4 + 0.9 días; P<0.0035).

Ejemplo 11. Análisis de farmacocinética de suero en ratones después de i. p. o administración s. c.

Doce ratones Swiss-Webster, hembra, naf've de 9 semanas de edad (Taconic Farms; Germantown, NY) fueron pesados antes de inyección y seis agrupados en una jaula de manera que la media y las desviaciones estándar entre los dos grupos de ratones no fueran significativamente diferentes. Se administró veltuzumab, 1 mmol (150 g ), como una inyección de 200 µ?_ ya sea i . p. o s. c. Se tomaron muestras de suero mediante sangrado retro-orbital a las 0.5, 1 , 4, 6, 24 , 48, 1 20 , 1 68 y 336 horas y se almacenaron en congelamiento hasta análisis para veltuzumab .

Se usó un ELI SA de captura para cuantificar la cantidad de veltuzumab en las muestras de suero. Se recubrió una placa de ensayo de 96 pozos (N unc Maxisorp Certified Flat-Bottom I mmuno Modular con/marco ; NalgeNunc International Corp. , Rochester, NY) con un anticuerpo monoclonal idiotipo anti-veltuzumab de rata , WR2 ( 1 00 a 1 .56 ng/mL). Se diluyeron apropiadamente muestras de suero de múrido y, conjuntamente con los estándares, se pipetearon a pozos por triplicado. Se detectó el veltuzumab unido con un anticuerpo policlonal anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa (Jackson I mmunoResearch Laboratories, Inc. , West Grove, PA) y las placas se desarrollaron usando una solución de OPD (dihidrocloruro de o-fenilendiamina, Sigma- Ald rich , St. Louis , MO). Las placas se incubaron en la oscuridad hasta que se desarrolló el color en los pozos curvos estándar (-20 minutos). En este momento , se agregó ácido sulfúrico 4 N a los pozos para detener la reacción y las placas se leyeron en un lector de placas a OD490 nm .

Usando software Prism (GraphPad Software, Inc. ), se calculó la concentración de veltuzumab en las muestras de suero de ratón con base en la curva estándar. Para asegurar la precisión, cada muestra se corrió múltiples veces y se usó el valor medio de todas estas corridas en el análisis de PK. Las concentraciones en plasma que se determinaron a partir del ensayo anterior se convirtieron a nmol/mL y se analizaron usando el paquete de software WinNonLin PK (v5.1 , Pharsight Corp . , Mountain View, CA). Se realizó un análisis no compartimental en ambos datos de i . p. y s. c. (que representa el modelo de mejor aj uste).

Aunque las concentraciones de suero y desalojo de veltuzumab fueron muy similares entre esos animales inyectados i . p. versus s. c. (Figura 1 2), varios de sus parámetros respectivos de PK fueron significativamente diferentes (Tablas 3 y 4). En términos de concentraciones máximas de suero (Cmax) y el tiempo para Cmax (Tmax), no hubieron diferencias significativas entre las rutas de inyección. Esto fue cierto también para comparaciones entre valores de desalojo (Cl ) y el área bajo la curva (AUC). Sin embargo, se observaron diferencias notables en la vida media terminal (T1 /2) y tiempo medio de residencia (M RT), con la ruta i . p. que da valores de rendimiento significativamente más altos para cada uno (P=0.031 6 y P=0.0357, respectivamente).

Tabla 3. Farmacocinética de hA20 con Inyección Intraperitoneal Suero PK de Ratón Individual de hA20 IgG Administrado Como una Sola Inyección Intraperitoneal Animal Dosis Cpnax Tmax T-1/2 AUCo?- Cl MRTo_.» No. Inyectada (pmol/ (h) (h) (h*pmol/ (mL/h) (h) (pmoles) ml_) ml_) 1 1000 143.7 24 308.5 86,170 0.01 16 540.8 2 1000 173.9 24 225.9 54,204 0.0184 379.2 3 1000 229.8 24 846.1 214,007 0.0047 1219.5 4 1000 246.5 24 562.8 149,725 0.0067 840.1 5 1000 76.5 24 292.8 28,628 0.0349 439.6 6 1000 296.7 24 333.0 107,101 0.0093 500.8 Media 195 (79) 428 106,639 0.0143 653 (Stdv) (235) (67,288) (0.01 12) (320) Los ratones Swiss-Webster libres de tumores usados en nuestro estudio de PK pesaron un promedio de 30 g . El vol umen de sangre entera en ratones se estima con base en su peso y usa un rango de 5.5 a 7% del peso corporal como mL de sangre entera . Si usamos un promedio de 6.25% , nuestros ratones tendrían aproximadamente 1 .9 mL de sangre entera de la cual 50% es suero o 0.95 mL . I nyectamos 1 50 pg en estos ratones Lp, de manera que si todo termina en la sangre tendríamos una concentración de suero de aproximadamente 1 58 pg/m L. Encontramos que después de inyectar 1 50 pg de veltuzumab en estos ratones de 30 g, logramos una Cmax de 30 pg/mL de suero o 5.3 veces menos que lo que se podría esperar como máximo.

Tabla 4. Farmacocinética de hA20 con Inyección Subcutánea 2 1000 256.1 24 173.4 55,139 0.0181 265.4 3 1000 172.7 24 244.9 66,351 0.0151 355.9 4 1000 204.1 24 189.7 58,214 0.0172 278.4 5 1000 195.5 24 162.5 41 ,018 0.0244 247.9 6 1000 162.6 24 185.0 43,580 0.0229 280.3 Media 0203 187 51 ,673 0.0199 282 (Stdv) (35) (30) (9,844) (0.0037) (38) Usando las observaciones anteriores, inyectamos 50 ng (0.05 pg) en ratones SCI D de ~20 g para nuestra dosis más baja para terapia. Con base en su peso, deberían tener aproximadamente 1 .1 4 mL de volumen de sangre entera, de la cual 0.57 mL es suero. Si todos los 50 ng están en la sangre, habría una concentración de suero de 87.7 ng/mL. Dada la misma cinética que se observa en estudios de PK de ratón normal , estimamos una concentración Cmax de aproximadamente 1 6.5 ng/mL de veltuzumab en el suero (87.7 ng/mL divididos entre 5.3). Esto no toma en cuenta la presencia de células Daudi que pueden ser un pozo de antígeno en estos ratones y así baja la concentración de suero.

Ejemplo 12. Tolerancia y toxicocinética en monos cinomolgus.

Se condujo un estudio exploratorio de dosis sencilla y repetida de inyecciones intravenosa y s. c. de veltuzumab en monos cinomolgus (Macaca fascicularis) en SNBL USA, Ltd . (Everett, WA). A 1 6 monos machos y 1 6 hembras, con peso entre 2.5 y 6.6 kg (3 a 7 años de edad ) se les dio dosis i . v. y s. c. de 0, 0.67, 33.5 y 67 mg/kg (que corresponden a dosis de 80, 375 y 800 mg/m2, respectivamente, en humanos) ya sea una vez o tres veces (con separación de 2 semanas). Los monos se examinaron regularmente, con muestreo de sangre tomado para titulación de MAb y pruebas de PK, química sanguínea, coagulación y hematolog ía , así como urinálisis, y después evaluación post-mortem del estado de tejido linfoide en el bazo, nodos linfáticos mandibular y mesentérico.

El veltuzumab administrado i. v. o s. c. como una sola dosis o múltiples dosis fue bien tolerado, sin notar anormalidades de pruebas de laboratorio clínicas o persistentes diferentes al agotamiento de células Ben los órganos circulatorio y linfático. Los cambios post-mortem en los animales que recibieron todas las dosis incluyeron agotamiento linfoide folicular del bazo, nodos linfáticos mandibulares y mesentéricos en todas lás dosis (datos no mostrados). Se notaron las disminuciones transitorias de células sanguíneas blancas, neutrófilos, linfocitos y basófilos, pero se observó solamente una reducción rápida y persistente en el número de células B de sangre periférica (no mostrada). Estos efectos ocurrieron a los dos días de la dosificación por cualquier ruta y se presentaron a dosis de 6.7 mg/kg o más. Los animales se recuperaron en 28 días cuando se trataron una vez o en 56 cuando recibieron 3 dosis. Los análisis farmacológicos (datos no mostrados) indicaron que la vida media se estimó a los 5 u 8 días después de inyección i . v. o de 6 a 13 d ías siguiendo con la administración s. c. y el Tmax para ambas rutas varió de 2 a 5 d ías. Cmax después de inyección i. v. fue lineal y no mostró acumulación y AUCo-27 d í a s fue mayor para administración i . v. que para la ruta s. c. (no mostrado). Esto está relacionado probablemente con el periodo más largo requerido para que el MAb entre a la corriente sanguínea vía la ruta s. c. con un régimen similar de desalojo. Los valores de AUC de dosis normalizados mostraron acumulación de veltuzumab después de infusión i . v. o administración s. c. en todos los niveles de dosis, pero el volumen medio de distribución fue mayor después de la administración s. c. que después de la infusión i . v. en todos los niveles de dosis (no mostrado). Estos resultados indican que a la dosis sencilla más baja de 6.7 mg/kg (equivalente a 80 mg/m2 en humanos), ocurre el agotamiento rápido de células B periféricas y esplénicas cuando el veltuzumab se da ya sea por rutas i . v. como por s. c. en esta dosis baja.

Ejemplo 13. Eficacia in vivo de veltuzumab en modelos de ratón .

Estos estudios se realizaron en ratones CB .1 7 homocigóticos con inmunodeficiencia combinada severa (SCI D) de aproximadamente 20 gramos (7 semanas de edad cuando se recibieron de Taconic, Germantown , NY). Para el modelo de Daudi (linfoma de Burkitt), los ratones se inocularon i . v. en el día 0 con 1 .5 x 1 07 células, se pesaron y se asignaron aleatoriamente a seis grupos de tratamiento y dos de control (8 por grupo). En el d ía 1 , los ratones en un grupo de tratamiento recibieron una sola dosis de veltuzumab (5, 20 o 60 pg) s. c. o i . p. , y aquellos en el grupo de control recibieron o salina (200 m l_) o 60 pg de un anticuerpo monoclonal anti-CEACAM5 igualado con isotipo de selección de objetivo no Daudi , hMN-14 IgG (labetuzumab, I mmunomedics, Inc. , Morris Plains, NJ).

Además de este estudio, se realizó un experimento con dosis mínima efectiva en el mismo modelo de Daudi . Grupos de ratones recibieron una sola dosis de veltuzumab (0.5, 0.25, 0.1 , o 0.05 µ?) i. p con salina dada a los controles. En el modelo de linfoma de célula folicular WSU-FSCCL, cada ratón en grupos de 1 5 se inoculó con 2.5 x 106 células i . v. y 5 d ías más tarde recibieron una sola dosis de veltuzumab (0.035, 0.35, 3.5, o 35 pg) i . p. Los animales se monitorearon diariamente y se sacrificaron humanamente cuando se desarrolló parálisis hind-limb, cuando estaban moribundos, o si perd ían más de 20% del peso corporal inicial . Las curvas de supervivencia se analizaron usando gráficas de Kaplan-Meier (análisis de log-rank), usando el paquete de software Prism (v4.03) (GraphPad Software, Inc. ).

Terapia intraperitoneal versus subcutánea de xenografos de linfoma de Burkitt.

Ratones que tienen la enfermedad diseminada se trataron con inyecciones únicas i. p. o s. c. de veltuzumab. Las tres dosis de veltuzumab, independientemente de sí fueron administradas i . p. o s. c , Aumentaron significativamente la supervivencia de ratones en comparación con los grupos de control de salina labetuzumab (Figura 8, P=0.0001 ). Comparaciones entre dosis iguales administradas i . p. y s. c. no dieron diferencias significativas (Figura 8). Aunque los ratones de control sucumbieron a la enfermedad (parálisis de hind-limb) en el día 28, los tiempos de supervivencia media (MSTs) de los dos grupos de 60 pg fueron de 1 01 .9 ± 26.8 y 1 1 4.6 ± 21 .8 días para i . p. y s. c , respectivamente, con 4/8 y 6/8 ratones aún vivos cuando terminó el estudio el d ía 1 26. Se obtuvieron resultados similares para los animales que recibieron 20 pg, con los MSTs de 1 1 6.4 + 1 4.0 (i . p. ) y 1 08.4 + 26.2 (s. c. ) d ías, y 5/8 ratones vivos al final del estudio en ambos grupos. Solamente a la dosis más baja (5 pg) hubo un régimen de mortalidad >50% observado (3/8 y 1 /8 ratones estaban vivos aun al final del estudio en cada grupo i . v./s. c ), pero estos ratones ten ían aun un incremento de >3.2 veces en los MSTs (91 .1 ± 30.9 y 91 .6 ± 22.5 días para i . p. y s. c, respectivamente) en comparación con los controles.

Dosis mínima efectiva de veltuzumab en xenografos de linfoma de Daudi Burkitt.

Puesto que una sola dosis de 5 pg veltuzumab probó ser potente en el modelo Daudi de linfoma de Burkitt diseminado, se examinaron entonces dosis aun menores (0.5, 0.25, 0.1 y 0.05 pg ) en este mismo modelo de enfermedad . Notablemente, las cuatro dosis mejoraron la supervivencia significativamente (P<0.0001 ) cuando se comparó con ratones de control de salina (Figura 9). Por ejemplo, los ratones que recibieron una sola dosis de 0.5 pg tuvieron una mejoría de 3 veces en el MST comparado con los controles (69.5 ± 23.9 vs. 21 .4 ± 1 .1 días). Aún la dosis más baja probada de 0.05 pg (50 ng) aumentó el MST (50 ± 8 d ías) en más de dos veces sobre los controles.

Dosis mínima efectiva de veltuzumab en xenografos de linfoma de células foliculares.

En un modelo diseminado de linfoma de células foliculares, xenografos WSU-FSCCL , grupos de ratones fueron administrados con inyecciones i . p. sencillas de veltuzumab ( Figura 1 0). Cada grupo recibió una dilución de 1 0 veces que varía desde una alta de 35 pg hasta una baja de 0.035 pg (35, 3.5, 0.35, y 0.035 pg) . La terapia no empezó hasta 5 días después de la administración de las células WSU-FSCCL. Las cuatro dosis aumentaron significativamente la supervivencia de los ratones cuando se comparó con el control de salina ( Figura 1 0, MST de control = 28 d ías; P = 0.0001 ). El MST de los ratones administrados con la dosis de 35 pg (44.3 ± 4.9 días) no fue significativamente diferente de aquel del grupo de 3.5 pg (39.5 ± 4.6 d ías), pero fue significativamente más largo (P<0.021 ) que aquel de los grupos de 0.35 y 0.035 pg (35 ng) (40.5 ± 1 .6 días y 33.3 ± 2.1 días, respectivamente). Sin embargo, todos los ratones, excepto uno en el grupo de 3.5 pg, sucumbió a la progresión de la enfermedad por el día 61 .

Ejemplo 14. Veltuzumab muestra eficacia mejorada in vivo comparado con rituximab en u n sistema de modelo de ratón .

Ratones SCI D fueron inoculados con células (Raji ) de linfoma humano de Burkitt mediante inyección en la vena de la cola. A los 5, 10, 1 5 y 20 días después de la inoculación, los ratones recibieron ya sea rituximab o veltuzumab (hA20) de 10 mg/kg/dosis. Los resultados de supervivencia acumulada se muestran en la Figura 1 3.

Como se muestra en la Figura 1 3, los ratones SCI D inyectados con células Raji de linfoma y tratados con veltuzumab (hA20) mostraron una mejoría significativa (P = 0.005) en supervivencia acumulada en comparación con ratones tratados con una dosis idéntica de rituximab. En este estudio, se utilizó el tiempo para la parálisis de limb como un punto final subrogado para supervivencia. La Figura 1 3 muestra que en más de 90 d ías después de la inoculación , los ratones SCI D con linfoma de Raji que habían sido tratados con veltuzumab exhibieron un régimen de supervivencia de aproximadamente 80% , mientras que ratones equivalentes tratados con rituximab exhibieron un régimen de supervivencia cercano a cero. La parte inferior de la Figura 1 3 muestra que la supervivencia media acumulada estimada fue de 22.1 días para los ratones de control , 47.9 d ías para los ratones tratados con rituximab y todavía no obtenido para ratones tratados con veltuzumab.

Estos resultados demuestran que el reemplazo de asparagina en 1 01 de Kabat con aspartato en la secuencia de CDRH3 produce una mejoría significativa en la eficacia in vivo en un sistema de modelo de ratón usando células humanas de linfoma de Burkitt.

Ejemplo 15. Tratamiento con veltuzumab de dosis baja.

Púrpura Trombocitopénica Idiopática Una mujer de 39 años de edad con 6 meses de historial de ITP había recibido esteroides como norma de cuidado sin mejoría satisfactoria de los niveles de plaquetas. Recibió dos dosis de 80 mg/m2 de veltuzumab administradas intravenosamente con dos semanas de separación. A' pesar de la baja dosis, sus niveles de células B se agotaron después de la primera dosis, y sus niveles de anticuerpos en suero aumentaron hasta 10 pg/mL después de la primera dosis, alcanzando 19 pg/mL después de la segunda dosis, y después despejar lentamente, pero aún mesurable (1 pg/mL) ocho semanas más tarde. Muy importantemente, sus niveles de plaquetas aumentaron rápidamente desde 24,000/mm3 al comienzo del estudio hasta límites normales (>150,000/mm3) a los cuatro días después de la primera dosis. Esta respuesta completa se continúa actualmente y sus plaquetas son aún de >150,000/mm3 en la última evaluación 18 semanas después del tratamiento. De manera interesante, el paciente sufrió también de colitis ulcerante, y dejó la terapia para esta condición durante la prueba con veltuzumab. Durante la terapia con veltuzumab, todos los signos y síntomas de colitis ulcerante se abatieron durante las 18 semanas corrientes que siguieron, lo cual parece ser un efecto colateral de esta terapia de células B.

Linfoma de Zona Marginal Una mujer de 79 años de edad con linfoma de zona marginal se diagnosticó inicialmente 12 años antes y se trató a previamente con CHOP y después CVP, pero no rituximab. Presentaba la etapa IV de la enfermedad incluyendo 2 nodos linfáticos iliacos agrandados e involucramiento de médula espinal. Recibió 4 dosis de 138 mg (80 mg/m2) una vez por semana de veltuzumab administradas intravenosamente. Los niveles de células B se agotaron después de la primera dosis, y los niveles de anticuerpos en suero aumentaron con las dosis sucesivas, alcanzando 120 pg/ml después de la última dosis y después despejando lentamente con valores aun mensurables (5 pg/ml) en la última evaluación, 12 semanas más tarde. Lo más importante, él paciente tuvo una excelente respuesta al tratamiento, con regresión de los nodos linfáticos iliacos al tamaño normal en una exploración de CT y una biopsia negativa de médula espinal. La respuesta se continúa actualmente en la última evaluación , 1 5 meses después del tratamiento.

Linfoma Folicular Una mujer de 42 años de edad con una historia de 1 5 años de linfoma folicular había recibido múltiples regímenes de tratamiento anteriores, incluyendo veltuzumab intravenoso para el cual había alcanzado una respuesta en el mes 9. Recibió 80 mg veltuzumab inyectado de manera subcutánea cada dos semanas para un total de 4 dosis. A pesar de la baja dosis administrada por esta ruta, los niveles de células B se agotaron después de la primera dosis. Los niveles de anticuerpos en suero medidos en varios días después de la dosis inicial mostraron niveles crecientes lentamente hasta 1 0 pg/ml , lo cual es comparable con niveles obtenidos con administración intravenosa . En las siguientes 4 semanas después del último tratamiento, el examen del paciente reveló evidencia de nodos linfáticos muy agrandados con la regresión de la enfermedad, y 4 semanas más tarde, el examen repetido, incluyendo exploraciones de tomografía por computadora, mostraron que la suma de todas las dimensiones de los nodos linfáticos involucrados se redujeron en más de 50% en comparación con las dimensiones acumuladas de estos nodos en la l ínea de base, indicando que el paciente tuvo en este punto una respuesta parcial.

Están pendientes evaluaciones posteriores para este paciente reciente, pero la demostración de buena biod i sponibilidad y la evidencia de actividad con agotamiento de células B así como también la reducción de 50% de la enfermedad prueba q ue la ruta s. c. fue efectiva .

Linfoma Folicular Un hombre de 41 años de edad con l infoma folicular etapa IV, grado 3 , se diagnosticó inicialmente 8 años antes y había sido tratado previamente con q uimioterapia CHOP, pero no rituximab . Recibió 4 dosis una vez por semana de 80 mg/m2 de veltuzumab administradas por vía intravenosa . Los niveles de células B se agotaron después de la primera dosis, y los niveles de anticuerpos en suero aumentaron con dosis sucesivas, alcanzando 86 pg/mL después de la última dosis y desalojando lentamente después con valores aun mensurables (4 pg/mg) en la últi ma evaluación , 1 2 semanas más tarde . Lo más importante , desapareció completamente toda la enfermedad incluyendo una lesión de cuero cabelludo de 3.6 cm que estaba presente al inicio del estudio . La respuesta completa continuo hasta 9 meses después del tratamiento , en cuyo momento se vio una nueva lesión mediante formación de imagen FDG-PET. Este paciente mostró también que la dosis baja de veltuzumab fue potente, induciendo u na respuesta completa en este paciente, i ncluyendo la ablación de cél ulas B ci rculantes después de solamente una única admi nistración de 80 mg/m de veltuzumab .

Ejemplo 16. Terapia de Linfoma Folicular de Célula Grande AF es un hombre blanco de 63 años de edad con l infoma fol icular I de célula delante de no Hodgkin Grado 3, que probó ser CD20+ mediante biopsia de nodo linfático en Enero de 2004. Su etapa de ; diagnosis fue de etapa 3, pero ahora presenta etapa 2. Su terapia anterior en 1992 incluyó doxorubicin, vincristine, ciclofosfamida en 5 dosis elevada, lo cual resultó en una remisión de 24 meses. En 1996, ' recibió un régimen de ICE (ifosfamide, carboplatin y etoposide), y también terapia de células madre, seguido por radiación de consolidación a una masa retroperitoneal. Respondió durante 88 meses. Recientemente presentó anormalidades de química de suero o 10 inmunoglobulina en suero sin síntomas B, CBC no significativa, 687 células CD3-T7pl_, 32 células CD19-B/pl_ y nodo supraclavicular agrandado de 10 x 8 cm, masas axilares izquierda y derecha de 2.0 y 2.8 cm de diámetro, y una masa lateral de cuello de 2 a 3 cm. Al paciente se le dieron cuatro inyecciones s. c. de 80 mg de veltuzumab, 15 con dos semanas de separación. No hubo reacciones significativamente adversas o asuntos de seguridad, solamente reacciones eritematosas transitorias menores y molestias en los sitios de inyección. A los cuatro días después de la primera inyección, células CD19+B en la sangre fueron medidas como 0, de manera que 20 fueron completamente eliminadas. La masa grande del cuello del paciente se encogió, según se midió mediante palpación, en 50% cuatro días después de la primera inyección, e indicó que se sentía j mejor. Están pendientes las exploraciones CT en otras cuatro semanas. Aparentemente, el paciente tuvo un agotamiento rápido de 25 células B circulantes y una regresión significativa de su masa del cuello después de una sola inyección s. c. de 80 mg de veltuzumab.

Este resultado sorprendente muestra que una sola inyección s. c. de 80 mg de veltuzumab de anticuerpo humanizado anti-CD20 CDRH3 (Kabat 101 ) es capaz de extirpar células B periféricas y encoger significativamente una masa aparente de tumor de células B . Este es el primer reporte de tal inyección s. c. de dosis baja de veltuzumab que produce tal efecto profundo en células B circulantes y sésiles, así como también masas N HL.

Ejemplo 17. Síndrome de Evans MT es una mujer asiática de 3 años de edad que desde la edad de 1 1 meses de autocuerpos y pancitopenia hematológica múltiple. A la edad de 1 1 meses presentó diarrea , manchas rojas en sus piernas, sangre en las deposiciones, petequia y púrpura difusas en cabeza, cuello, tronco y extremidades, adenopatía cervical , incluyendo varios nodos axilares de 1 cm, bazo ligeramente agrandado, fatiga excesiva, falta de apetito, moretones y estallidos en frotis de sangre periférica, régimen sed aumentado ( 1 1 6 mm/h), D-dimer elevado, y aspirado de médula espinal que muestra una médula hipercelular (>90 % celular), precursores de mieloide y megacariocito que son abundantes (nivel de mielocito/metamielocito de detención de maduración, pero neutrófilos maduros vistos). Los precursores de células rojas mostraron también alguna detención de maduración, pero no anormalidades citogenéticas. Los estudios en laboratorio indicaron también elevaciones en inmunoglobulinas IgA, IgG e IgM y un aumento en células CD 1 9+B circulantes (48%). Hubo también evidencia de un anticuerpo de neutrófilo fuerte positivo y un anticuerpo de plaqueta fuerte positivo, • con especificidad l l b/l l la. Al paciente se le dieron primero esteroides, pero tuvo una respuesta eficiente o nula inicial . Por lo tanto, se le dieron dos cursos de rituximab. En el primer curso, recibió cuatro 5 dosis por semana y el conteo de plaquetas se estabilizó, pero continuo siendo anémica y neutropénica. Sus linfocitos CD20 y CD 1 9 disminuyeron , pero después de solamente 5 a 6 semanas, éstos aumentaron dramáticamente. Un segundo curso de rituximab involucró tres dosis por semana, y en más de varias semanas, su conteo de 10 plaquetas, hemoglobina y neutrófilos absolutos se normalizó y después de 2 a 3 meses, se resolvieron las células rojas y anticuerpos de plaquetas. Esta remisión a rituximab duró 9 meses, pero después se notó trombocitopenia en CBC de rutina, y se detectaron otra vez célula roja , neutrófilo y anticuerpo de plaqueta. Se le dio entonces al ! 15 paciente prednisone e inmunoglobulina intravenosa y mostró una respuesta parcial .

Después se le dio un tercer curso de rituximab, 2 dosis por semana, y resultaron dos episodios de anafilaxia, que requirieron manejo médico agresivo. El paciente mostró una respuesta transitoria, 20 2 a 3 meses, pero volvieron a ocurrir la pancitopenia y anticuerpos hematológicos. La paciente tiene desde las transfusiones para su anemia, anticuerpos de célula roja y anemia que son su problema más significativo, con episodios intermitentes de trombocitopenia; no respondió a esteroides o inmunoglobulina intravenosa. 25 Puesto que la siguiente opción es la esplenectomía o un curso de I quimioterapia citotóxica, se le dio un régimen experimental de veltuzumab, que consiste de 10 mg de manera subcutánea, repetido a una dosis de 10 mg de veltuzumab por vía subcutánea dos semanas más tarde. Antes de la segunda dosis, se encontró el agotamiento de células B CD19 positivas circulantes, y se observó mejoría en sus conteos de células rojas y plaquetas. Dos semanas después de la segunda inyección s. c. de veltuzumab, la condición general del paciente mostró mejoría, sus anticuerpos de célula roja, neutrófilos y plaquetas son difícilmente mensurables, y todas las anormalidades hematológicas presentaron una mejoría significativa, con conteos de plaquetas, neutrófilos y RBC que están en el extremo inferior de los rangos normales. A dos meses después de la terapia, el paciente continúa estando en remisión . Sin evidencia de alguna anafilaxia en ningún momento durante la terapia con veltuzumab, lo que indica que no hay reactividad cruzada inmune con rituximab, y que dosis muy pequeñas subcutáneas de veltuzumab son terapéuticas en este paciente con síndrome de Evans.

Ejemplo 18. Leucemia Linfocítica Crónica RT es una mujer de 47 años de edad con tres años de historia de leucemia de linfocítica crónica, ahora con recaída después de un curso de alemtuzumab (CAM PATH®), pero la historia previa muestra que tuvo respuestas de varias duraciones al clorambucil y otros fármacos citotóxicos. Ahora presenta evidencia de CLL en su médula espinal y también un conteo de linfocitos periféricos elevado con estallidos prominentes de 58,000/cmm . Recibe inyecciones subcutáneas de 40 mg de veltuzumab dos veces por semana durante seis semanas y, después de la segunda inyección, el conteo de linfocitos periféricos cae en 55%. Dos semanas después de la cuarta inyección s. c , sus conteos de sangre periférica están ligeramente arriba del rango normal , pero, lo más importante, la aspiración de médula espinal muestra una respuesta parcial definida buena, y el cuadro clínico de fatiga , petequia y nodos cervicales difusos agrandados y otros linfáticos mejoraron dramáticamente.

Ejemplo 19. Púrpura Trombocitopénica Inmune (ITP) RH es un hombre de 66 años de edad con una historia de ITP de 1 .5 años, cuatro terapias anteriores, sin esplenectomía, y que presenta 26,000 plaquetas/cmm en la línea de base. Se le dan dos dosis de 40 mg de veltuzumab de manera subcutánea, con dos semanas de separación . Antes de la segunda inyección , la medición de sus linfocitos CD1 9+ en sangre muestra una reducción de >90% . Dos semanas después de la segunda inyección de veltuzumab, su conteo de plaquetas muestra una duplicación, que aumenta hasta 70,000 por la quinta semana después de la terapia, que se mantiene hasta la semana 1 1 , cuando el conteo de plaquetas cae otra vez a conteos de <5,000/cmm. El paciente se vuelve a tratar entonces dos veces con 30 mg de veltuzumab s. c , otra vez con dos semanas de separación. Cuatro días después de la segunda inyección , el conteo de plaquetas llega hasta 28,000/cmm, y después hasta 42,000/cmm en la semana 3 después de la terapia. Después de seis semanas de la terapia, el conteo de plaquetas mejora significativamente hasta 67 ,000/cmm y se considera que el paciente tiene una buena respuesta parcial , sin evidencia de sangrado o petequia durante la terapia con veltuzumab y regresa a su actividad y trabajo de tiempo completo.

Ejemplo 20. Artritis Reumatoide FH es una mujer de 37 años de edad quien desarrolla gradualmente articulaciones dolorosas, particularmente sus muñecas, durante tres meses, con dolor y rigidez temprano en las mañanas de aproximadamente 40 minutos. En el examen , ambas de sus muñecas y las articulaciones metacarpofalángicas de ambas de sus muñecas están hinchadas y molestas, pero no deformes; no hay lesiones en nódulos o vascul íticas. Tiene una proteína reactiva C elevada (CRP) de 30/I , pero de cualquier forma sin hallazgos normales de laboratorio, pero con un factor reumatoide positivo y anticuerpos antinucleares. Claramente está en el comienzo de RA y se trata primero con ibuprofén . Sin embargo, a pesar de alguna mejoría sintomática inicial , persisten el dolor, la rigidez y la hinchazón de las manos, y dos meses más tarde, sus rodillas son afectadas de manera similar. Seis meses después de la presentación inicial , desarrolla tres nódulos subcutáneos en el codo izquierdo, pequeños, sin dolor e inmóviles, pero no molestos. Los rayos X de las manos muestran erosiones de hueso en las cabezas metacarpianas, otra vez un CRP elevado (53 mg/l ). Ahora se le dan 120 mg de veltuzumab de manera subcutánea en tres inyecciones por semana. Su primera evidencia de mejoría ocurre después de la segunda inyección, cuando nota que su dolor y su rigidez de las articulaciones por la mañana se reducen a aproximadamente 1 5 minutos, y en dos semanas después de la tercera ' inyección , experimenta una movilidad mejorada, sus articulaciones ' parecen tener una hinchazón reducida, y sus niveles de CRP caen Í hasta 1 5 mg/1 , ligeramente por arriba del rango normal . Sus síntomas 5 y signos de RA son marcadamente mejores para las siguientes 8 semanas de seguimiento. No se requiere terapia con metotrexato o esteroides durante el tratamiento con veltuzumab o para los dos meses posteriores.

Ejemplo 21 . Síndrome de Sjogren con Artritis 10 K. S . Es una mujer de 41 años de edad quien es referida a una cirugía oral para evaluación de una boca seca. Excepto por un régimen de sedimentación elevado (ESR, 60 mm/h), no tiene anormalidades notables en laboratorio. Desarrolla una conjuntivitis moderada y ojos con dolor dos meses más tarde. Su factor reumatoide 15 se vuelve positivo, sus proteínas totales en suero se elevan ( 1 00 g/l), i como también su nivel de IgG (30 g/l). La prueba de Schirmer es marcadamente anormal (solamente 3 mm de la faja de filtro en el ojo derecho y 1 mm de aquella en el ojo izquierdo se humedecen). Es tratada con gotas para ojos de metilcelulosa para evitar la ulceración 20 de córnea , y en el siguiente año muestra una elevación estable del título del factor reumatoide y anticuerpos antinucleares, y desarrolla también evidencia de cambios poliartríticos en sus manos y sus muñecas. Se considera que tiene un síndrome de Sjogren modelado y recibe fármacos no esteroides antiinflamatorios (NSAI Ds) para la 25 artritis, pero éstos no tienen efecto en el complejo sicca . Se le da un curso de veltuzumab, comenzando con una infusión intravenosa de 1 5 mg, seguido por, después de una semana , tres inyecciones más subcutáneas de 40 mg de veltuzumab por semana . Dos semanas después de completar este curso de terapia, sus síntomas y signos de 5 poliartritis muestran una mejoría considerable, pero el efecto más dramático es la mejoría de su salivación, confirmada mediante una prueba de Schirmer mejorada. El paciente tiene ahora una boca seca solamente mínima sin conjuntivitis o dolor de ojos, y esta remisión se mantuvo durante cuatro meses. 10 Ejemplo 22. Desensibilización Durante Trasplante Renal SW es una mujer de 56 años de edad, 55 kg, con cinco nacimientos vivos previos y con enfermedad renal en etapa terminal y j está esperando un trasplante para reemplazar su riñon izquierdo. Está altamente sensibilizada de HLA, mostrando títulos elevados de ' 15 anticuerpos anti-HLA. Está bajo hemodiálisis regula. Con el fin de tener el trasplante renal , requiere desensibilización a los anticuerpos anti-HLA y, por lo tanto, se le administra una dosis intravenosa de 1 20 g de globulina humana policlonal inmune (formulación 1 0%), seguido por, 4 d ías más tarde, una inyección s. c. de 40 mg de veltuzumab. La 20 inyección s. c. de veltuzumab se repite los días 8, 1 2 y otra vez el día 21 . Después de la primera inyección, las células CD 19+B de sangre desaparecen totalmente, y 8 semanas después de la cuarta inyección de veltuzumab, permanecieron debilitadas.

Antes de recibir la globulina inmune intravenosa, se le dieron 40 25 mg intravenosamente de metilprednisolona, 650 mg de acetaminofén oral y 50 mg de difenilhidramina. No se da medicación previa antes de las inyecciones subsiguientes de veltuzumab. Siguiendo este curso de i terapia antes del trasplante, el nivel de anticuerpo reactivo de panel se reduce significativamente y la igualación cruzada de flujo citométrico ! 5 de células T muestra una caída de 50% antes del trasplante. Tres meses más tarde, la paciente recibe un trasplante de riñon de un donador fallecido y una terapia de inducción inmediatamente después (30 mg de alemtuzumab s. c. ) y después se da terapia inmunosupresora que consiste de prednisona, micofenolato mofetil y 10 tacrolimus, disminuida en el siguiente año, así como también antibióticos profilácticos. No tubo episodio de rechazo según supervisó el año después del trasplante y sus funciones renales se normalizaron. Este parece ser un caso exitoso de desensibilización de un paciente en necesidad de un trasplante renal muy efectivamente, lo que resulta en 15 un trasplante exitoso.

Ejemplo 23. Relaciones de función-estructura y características terapéuticas en anticuerpos anti-CD20.

, Los enfoques para mejorar en rituximab, el primer MAb anti-CD20 quimérico introducido en terapia de enfermedad de linfoma y ! 20 autoinmune, incluyen reducir el componente de múrido mediante el injerto de CDR (humanización) y hacer MAbs completamente humanos a partir de ratones transgénicos, apuntando a un epitope CD20 diferente, y aumentar la actividad de CDC o ADCC mediante la alteración de estructuras Fe (Forero et al , Proc 99lh Ann Meeting of the ! 25 Am Assoc Cáncer Res, 2008, resumen LB-70; Glennie et al . , Mol I ! ¡ Immunol. 2007, 44:3823-37). Sin embargo, no se sabe aún cuál de estas modificaciones y resultará en un MAb anti-CD20 más potente, según se mide mediante debilitamiento de células B , control de autoinmunidad , o respuestas de linfoma en pacientes, especialmente 5 cuando son refractarias o resistentes al rituximab.

A la fecha , el rituximab induce respuestas objetivas, principalmente respuestas parciales, en aproximadamente la mitad de los pacientes con linfoma folicular (Castillo et al . , Exp Hematol. 2008, 36:755-768), aunque tanto la dosis terapéutica como el programa 10 óptimos permanecen aún indefinidos. A pesar del uso de rituximab en virtualmente todos los pacientes de N HL durante la década pasada, sus mecanismos de acción , así como también aquellos de otros MAbs anti- CD20, ya sea en sistemas de modelo o pacientes, permanecen en debate entre numerosos estudios que demuestran la muerte de células 15 mediada por CDC, ADCC y señalización directa con efectos apoptóticos. (Glennie et al , Mol Immunol. 2007, 44:3823-37; Maloney, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007:226-232; Martin et al , Semin Hematol. 2008;45: 1 26-1 32).

Debido a nuestras observaciones de que el rituximab combinado 20 con epratuzumab mostró evidencia de respuestas mejoradas en i pacientes de N HL, sin incremento de efectos secundarios sobre , aquellos que resultan de la monoterapia con rituximab (Goldenberg, Expert Rev Anticancer Ther. 2006, 6:1 341 -1353; Leonard et al . , J Clin Oncol. 2005, 23:5044-5051 ; Strauss et al , J Clin Oncol. 2006, 24:3880- 25 3886) nuestro propósito original fue construir un MAb anti-CD20 humanizado que pudiera combinarse con epratuzumab , pero que sería más tolerable para infusiones rápidas debido a que tienen las FRs de epratuzumab. El primer estudio de caracterización de veltuzumab reportó similitudes con el rituximab en términos unión, afinidad , ADCC, CDC, de epitope e inhibición de crecimiento de células in vitro (Stein et al . , Clin Cáncer Res. 2004, 1 0:2868-78). Después de tratar pacientes con N HL indolente, se confirmó la tolerancia mejorada anticipada y el perfil de infusión , pero también se encontró un alto régimen de respuestas completas (CR/CRu). La prueba en Fase l/l l en 82 pacientes con NHL indolente demostró regímenes de respuesta completa para todas las dosis probadas (27% para todos los pacientes con linfoma folicular para dosis entre 80 y 750 mg/m2 una vez a la semana x 4 semanas) (Morschhauser et al , Proc Am Soc Clin Oncol, J Clin Oncol. 2007 , 25(1 8S):449s, Resumen 8032; Goldenberg et al , Proc Amer Soc Clin Oncol, J. Clin. Oncol. 2008, 26( 1 5S): 1 42s, Resumen . 3043; Morschhauser et al , J Clin Oncol 2009 Jul 1 0;27(20):3346-53. Epub 2009 May 18) excedió aquellos reportados para uso repetido de rituximab a su dosis convencional en pacientes comparables (Davis et al , J Clin Oncol . 2000, 1 8.31 35-3143). Estos hallazgos nos apuraron a reevaluar las propiedades funcionales de veltuzumab en comparación con el rituximab.

Estudios en monos cinomolgus (Ejemplo 12) han confirmado los efectos de varias dosis i . v. y s. c , y encontramos que una sola dosis tan baja como el equivalente de 80 mg/m2 en humanos, dada por cualquier ruta , es suficientemente potente para inducir el debilitamiento de células B de sangre periférica y órgano linfático. Además, la supervivencia aumentada y aun la cura se demostraron en ratones que llevan xenografos de linfoma CD20+ después de una dosis i . p. o s. c. sencilla, tan baja como 0.05 pg . En estos estudios con ratón , se observó una respuesta a la dosis, pero no se notó una diferencia significativa entre las rutas i . v. o s. c.

Aunque MAbs anti-CD20 diferentes han mostrado algunas variaciones en propiedades funcionales y especificidades de epitope, que median diferentes efectos de CDC y aniquilación celular (Nishida et al , Int J Oncol. 2007, 31 :29-40), virtualmente todos reconocen el rizo grande, extracelular o bloque cruzado completamente entre ellos (Polyak et al . , J Immunol. 1 998, 1 61 :3242-3248; Polyak y Deans, 2002, 99:3256-3262 ; Perosa et al, 8/ooof 2006, 107: 1070-1 077) excepto ofatumumab, el cual se reporta que se une a un epitope novedoso de CD20 (Teeling et al. , J Immunol. 2006, 1 77:362-371 ). La unión de bloques cruzados de veltuzumab mediante el rituximab (Stein et al . , CHn Cáncer Res. 2004, 1 0:2868-78), que sugiere que el mismo epitope es reconocido por ambos MAbs o que se une a un epitope adyacente podría resultar en un obstáculo estérico.

En los ejemplos anteriores, los parámetros de unión y disociación de veltuzumab y rituximab se compararon mediante análisis de Scatchard (Ejemplo 3) y mediciones fuera de régimen (Ejemplo 5). El análisis de Scatchard confirmó que veltuzumab y rituximab tienen afinidad similar por CD20 de la superficie celular y número de sitios de unión por célula (Ejemplo 3). De manera sorprendente, se encontraron diferencias estad ísticamente significativas entre veltuzumab o cA20 vs. rituximab o D1 01 N en un fuera del régimen más lento (es decir, retención más larga de superficie celular) en las tres l íneas ensayadas de células de linfoma humano (Ejemplo 5), y una muerte mayor de células mediada por CDC en células Daudi de linfoma por veltuzumab (Ejemplo 8), en comparación con rituximab o D101 N . Ya sea medido en la presencia o ausencia de un aglutinador competente, veltuzumab y cA20, ambos conteniendo Aspioi en lugar de Asn1 0 i en CDR3-VH, dieron regímenes significativamente más lentos (P<0.0001 ) (-2.5 veces) que rituximab o D1 01 N (Ejemplo 5).

La demostración de la actividad de CDC para veltuzumab en Daudi que es significativamente más que rituximab o D 1 01 N es también intrigante, puesto que la porción Fe de veltuzumab se deriva de aquella de epratuzumab, que no muestra las funciones de CDC (Carnahan et al . , Mol Immunol. 2007, 44: 1 331 -41 ). Esto sugiere que la internalización rápida de epratuzumab puede evitarse de residir en la superficie de la célula el tiempo suficiente para formar los complejos de ataque de membrana. Los resultados anteriores sugieren también que la diferencia de fuera de régimen entre veltuzumab y rituximab no está relacionada con CDC aumentado observado en células Daudi , como primer postulado para ofatumumab (Teeling et al. , Blood 2004, 1 04: 1 793-1 800), puesto que esta diferencia no se observó para CDC en las otras dos líneas de células que mostraron también un fuera de régimen significativamente más lento con veltuzumab en comparación con rituximab (Ejemplos 5 y 8). Ya que estos resultados con veltuzumab involucran evidentemente un epitope diferente seleccionado como objetivo de CD20 que ofatumumab, no parece que tales cambios fuera de régimen sean debidos a la posición del epitope, como se postula por Teeling et al. (2004). Sin embargo, parece que tales cambios fuera de régimen , como lo sugiere Teeling et al. (2004) para ofatumumab y reportados en la presente para veltuzumab, pueden explicar por qué un anticuerpo anti-CD20 dado funciona a concentraciones menores que otros MAbs (por ejemplo, rituximab), tal como hemos encontrado con veltuzumab (Ejemplos 1 2 y 1 3). Si CDC juega un papel o no permanece desconocido.

Es improbable que estas diferencias estén relacionadas con veltuzumab que tienen las FRs de epratuzumab. Las cadenas HV y VK de cA20 son diferentes de aquellas de rituximab en seis posiciones, excepto para el residuo 101 en CDRH3, los cinco de residuos restantes (dos en FR4-VH y tres en FR1 -VK) es improbable que sean responsables de los fuera de regímenes diferenciales. Du et al . (Mol Immunol. 2008, 45:2861 -2868) reportaron una interacción más débil de los CDRs de otro MAb anti-CD20, c2H7, en comparación con rituximab, que sugiere que los aminoácidos de 2H7 en las posiciones equivalentes en CDRH3 tienen cadenas laterales más voluminosas, lo que resulta en una bolsa más amplia para acomodar el péptido CD20. El hecho de que cA20 y veltuzumab tengan virtualmente la misma afinidad y fuera de régimen , mientras que cA20 tiene FRs más similares a rituximab que a veltuzumab, enfatiza el papel más crítico de CDRs que las FRs en la interacción con CD20. Así, la diferencia significativa observada en el fuera de régimen entre veltuzumab/cA20 y rituximab/D101 N se debe aparentemente a la diferencia sencilla de aminoácidos en CDRH3, y no a las diferencias más extensas en las FRs entre veltuzumab y rituximab. En consecuencia, creemos que este es el primer cambio sencillo de aminoácido en un CDR que ha mostrado causar un efecto funcional, lo que resulta en un anticuerpo más potente.

Las diferencias in vitro de fuera de régimen y CDC descritas en la presente son comparables con los hallazgos con otro MAb anti-CD20, ofatumumab, el cual se reportó que se une a un epitope diferente a rituximab (Teeling et al, J Immunol. 2006, 177:362-371) y se reivindica como terapéuticamente más activo que rituximab in vitro (Teeling et al., Blood 2004, 104:1793-1800). Sin embargo, esto no es consistente con las dosis relativamente altas de ofatumumab seleccionadas para estudios clínicos, que requieren también de tiempos largos de infusión como rituximab (Coiffier et al, Blood 2008, 111:1094-1100; Hagenbeek et al, Blood 2008, 111:548609), o la dosis más baja de 0.5 mg/kg (10 pg/ratón) (ratón) mostrada que elicita la inhibición de crecimiento en xenografos de linfoma (Bleeker et al, Brit. J. Haematol. 2007, 140:303-312).

Otro MAb anti-CD20 humano aun recientemente desarrollado, G101, que tiene propiedades de un MAb anti-CD20 Tipo II (Umana et al, Ann Oncol. 2008, 19 (Suppl 7), resumen 98), ha mostrado que es más potente in vitro y en modelos animales que rituximab, cuando se les dio a los ratones dosis repetidas de 10 a 30 mg/kg (Id.). Esto se traslada a cada dosis de aplicaciones repetidas que son de entre 200 y 600 pg en un ratón de 20 g, cuando son por lo menos de 4,000 a 12,000 veces más altas que las dosis sencillas de 0.05 a 0.35 pg de veltuzumab que muestran alta actividad anti-crecimiento en los xenografos de linfoma probados (Ejemplos 11 y 13). El debilitamiento de células NK de múrido y neutrófilos evitaron estos efectos de veltuzumab (Ejemplo 10), enfatizando el papel de ADCC in vivo, como se mostró previamente para rituximab (Hernández-llizaliturri et al, Clin Cáncer Res.2003;9:5866-73).

Estos estudios in vitro de ratón, mono y otros en humanos indican (i) que veltuzumab es activo a una fracción de la dosis clínica convencional de rituximab o de la dosis mínima terapéutica de dos de los otros MAbs anti-CD20 se segunda generación en modelos preclínicos, (ii) que estas dos diferencias distintivas en actividad vs. rituximab involucran funciones de CDC y fuera de régimen, y (iii) que el fuera de régimen inferiOor parece estar relacionado con una sola mutación de aminoácido en el residuo 101 de Kabat en CDRH3.

Ejemplo 24. Veltuzumab a baja dosis en linfoma de no Hodgkin (NHL) recurrente Resumen Un total de 82 pacientes (34 hombres, 48 mujeres; edades 33 a 85) recibieron cuatro dosis una vez por semana de 80 a 750 mg/m2 de veltuzumab, con el evaluaciones de estudio continuadas durante 12 semanas y hasta la progresión de la enfermedad. Tenían folicular (FL, N = 55) u otros (N = 27) NHL de célula B, estaban predominantemente en la etapa lll/IV a la entrada del estudio, y habían recibido de 1 a 7 regímenes anteriores de tratamiento (media, 1.5), la mayoría (89%) I incluyendo por lo menos un régimen que contiene rituximab. i El veltuzumab fue generalmente bien tolerado, con eventos adversos relacionados con el fármaco que son transitorios (Grado 1-2), i 5 y con tiempos de infusión más cortos (típicamente 2 h inicialmente y 1 h subsiguientemente) a dosis inferiores. En linfoma folicular, 24/55 pacientes tuvieron respuestas objetivas (OR, 44%), con 15 (27%) respuestas completas (CR/CRu) que ocurren aun después de 2 a 5 regímenes con rituximab, con prognosis menos favorable (LDH elevado, 10 tumores >5cm, FLIPI>2) y en todos los niveles de dosis. En otra NHL de célula B, 5/6 pacientes con linfoma de zona marginal tuvieron ORs (83%) incluyendo 2 CR/CRu's (33%), uno a 80 mg/m2 mientras que 3/7 pacientes con linfoma de célula B grande difuso tuvieron respuestas parciales (43%), incluyendo uno a 80 mg/m2. Aún a 80 mg/m2, las 15 células B estaban debilitadas después de la primera infusión, y los niveles medios de suero de anticuerpo excedió valores (25 pg/mL) considerados importantes para la terapia anti-CD20 (con niveles mayores aparentes en respondedores a esta dosis), con desalojo de suero después del tratamiento similar a o inferior que rituximab 20 Antecedentes El anticuerpo (MAb) monoclonal quimérico anti-CD20, rituximab (Rituxan®; Genentech, South San Francisco, CA; Biogen Idee Pharmaceuticals, San Diego, CA), fue aprobado hace más de una década para el tratamiento de linfoma de célula B, CD20 positivo de 25 bajo grado o folicular, de recaída o refractario. En la prueba de pivote en esta población, se administró una dosis de 375 mg/m2 una vez por semana durante cuatro semanas consecutivas que resultó en un régimen de respuesta global de 48% (6% de respuestas completas). (McLaughlin et al, J Clin Oncol 16:2825-2833, 1998). Extendiendo este éxito inicial, el rituximab se ha adoptado ampliamente para uso en malignidades de célula B (Traulle & Coiffier, Future Oncol 1:297-306, 2005; Marcus & Hagenbeek, Eur J Haematol Suppl 67:5-14, 2007; Cheung et al, Cáncer Treat Rev 33: 161-176, 2007), principalmente en combinación con quimioterapia (por ejemplo, Czuczman et al., J Clin Oncol 22:4711-4716, 2004; Coiffier et al, N Engl J ed 346:235-242, 2002), así como también en trastornos autoinmunes (Chambers & Isenberg, Lupus 14:210-214, 2005; Silverman, Front Biosci 12:2194-2206, 2007; Cohén et al, Arthritis Rheum 54:2793-2806, 2006; Hauser et al, N Engl J Med 358:676-688, 2008). Se han construido anticuerpos anti-CD20 de segunda generación con el fin de incrementar la eficacia, disminuir la toxicidad (principalmente de reacciones de infusión) o inmunogenicidad, y permitir administraciones más rápidas (Dórner & Burmester, Curr Opin Rheumatol 20:263-268, 2008; Martin et al, Semin Hematol 45:126-132, 2008; Genovese et al, Arthritis & Rheumatism 54:S66, 2006; Morschhauser et al, Blood 110:199a, 2007; Hagenbeek et al, Blood 1 :5486-5495, 2008; Coiffier et al, Blood 11 :1094-1100, 2008).

El veltuzumab (hA20) es una CDR (región determinante de complementaridad)-injertada, MAb anti-CD20 IgG-kappa, humanizado que fue construido con CDRs de cadena ligera y CDR1 y CDR2 de cadena pesada idénticas a rituximab, pero un constructo de cadena pesada de región variable de CDR3 y con las regiones del marco de estantes tomadas de epratuzumab, un MAb anti-CD20, humanizado (Goldenberg et al , Proc Am Soc Clin Oncol 22:595, 2003; Goldenberg et al , ProcAm Soc Clin Oncol 26: 1 42s, 2008; Ejemplo 1 ). Estos cambios resultaron en diferencias importantes en comparación con rituximab, tales como regímenes significativamente más lentos en las tres líneas ensayadas de células de linfoma humano (Ejemplo 5) y una citotoxicidad dependiente de complemento significativamente incrementada en una de estas l íneas de células (Ejemplo 8), mientras que no se observaron in vitro diferencias significativas en inhibición directa de proliferación, apoptosis, o citotoxicidad mediada por anticuerpo (Ejemplos 6 y 9; Goldenberg et al , Proc Am Soc Clin Oncol 22:595, 2003; Stein et al , Clin Cáncer Res 10:2868-2878, 2004; Goldenberg et al, Proc Am Soc Clin Oncol 26: 1 42s, 2008). Además, estudios en monos cinomolgus normales (Ejemplo 1 2) y en ratones que tienen xenografos de linfoma humano (Ejemplo 1 3) encontraron que dosis muy bajas de veltuzumab dadas no solamente por vía intravenosa, sino también de manera subcutánea, fueron muy efectivas en debilitar las células B y controlar el crecimiento del tumor, respectivamente, aún curar un número significativo de ratones (Ejemplos 1 3 y 14; Goldenberg et al , Proc Am Soc Clin Oncol 26 : 1 42s, 2008).

La primera prueba cl ínica de veltuzumab fue en un paciente joven con lupus eritematoso sistémico (SLE) con citopenias que amenazan la vida que se habían vuelto refractarias a medicaciones de salvamento normales y no respond ían ya a rituximab (Tahir et al, Rheumatology 44:561 -562, 2005). El veltuzumab fue capaz de debilitar los niveles de células B periféricas aun en el frente de niveles de suero extremadamente altos de anticuerpos anti-rituximab (HACA 43,000 ng/mL; normal <5 ng/mL), y el paciente responde rápidamente.

Puesto que la mayoría de la experiencia con rituximab es en linfoma de no-Hodgkin (N HL), el presente ejemplo se realizó para caracterizar la seguridad, la tolerancia, farmacocinética, farmacodinámica, inmunogenicidad básicas, y eficacia preliminar de veltuzumab en esta población, particularmente linfoma folicular o de bajo grado (Morschhauser et al , Blood 106:683a, 2005; Morschhauser et al , Blood 1 08:769a, 2006; Morschhauser et al. , Proc Am Soc Clin Oncol 25, 449, 2007). Los resultados completos de prueba, incluyendo seguimiento con los últimos pacientes integrados ahora por lo menos seis meses más allá del tratamiento, y con varios de los primeros pacientes que continúan en remisión ahora durante más de tres, años, se proporcionan más adelante.

Métodos Un estudio de multicentro fase l/l l , de etiqueta abierta, de brazo sencillo, de veltuzumab administrado mediante infusión intravenosa a pacientes con NHL refractario o recurrente se condujo para evaluar la seguridad y efectividad de veltuzumab en pacientes con N H L refractario o recurrente. Los puntos finales del estudio fueron seguridad , eficacia (regímenes de respuesta objetivos y completos, duración de respuesta, tiempo para la progresión), farmacocinética, farmacodinámica e inmunogenicidad.

Todos los pacientes recibieron dosis una vez por semana durante cuatro semanas consecutivas. La porción inicial del estudio enroló seguidores tratados con niveles de dosis crecientes desde 10 mg/m2 hasta 750 mg/m2, es decir, hasta dos veces la dosis dada usualmente con rituximab. En la segunda porción del estudio, pacientes adicionales se recibieron veltuzumab a 375 mg/m2 y por debajo (Morschhauser et al . , Blood 1 06:683a, 2005). Se hizo aparente que las respuestas objetivas (respuestas completas crecientes) ocurrieron a todos los niveles de dosis sin respuesta obvia de dosis (Morschhauser et al . , Blood 1 08:769a, 2006), consistentes con las observaciones en estudios en animales de que las bajas dosis de este anticuerpo pueden ser efectivas (Ejemplo 13). Puesto que dosis aun menores de veltuzumab (incluyendo 60 mg/m2) habían mostrado ser promisorias en varios otros pacientes con actividad moderada de SLE (Ejemplo 1 5), el protocolo fue enmendado y los pacientes finales enrolados en el estudio fueron tratados con el nivel inferior de dosis de 80 mg/m2 (Morschhauser et al , Proc Am Soc Clin Oncol 25, 449, 2007).

Población de pacientes - A ser elegible, adultos con NHL de célula B CD20+B mediante criterio WHO deben haber fallado por lo menos un régimen de quimioterapia estándar anterior o tratamiento con rituximab para NHL y tener enfermedad mensurable con por lo menos una lesión >1 .5 cm mediante CT, pero no masa > 10 cm . Los pacientes deben estar por lo menos 1 2 meses más allá de cualquier rituximab, sin progresión durante o en los seis meses de tratamiento con rituximab, NCI CTC Grado 3 o 4 de toxicidad para rituximab, o positivamente HACA conocida. La capacidad para ser elegido requirió también hemoglobina >10 g/dL, ANC >1.5 x 109/L, platelets >100 x 109/L (todas sin soporte de transfusión), creatinina y bilirrubina <1.5 x límite superior institucional de status de desempeño normal (IULN), AST y ALT <2.5 x IULN, 0-1 ECOG o KPS >70, expectativa de vida >6 meses, 12 semanas más allá de cualquier trasplante de célula madre autóloga y cuatro semanas más allá de quimioterapia, otros tratamientos experimentales, o cualquier terapia con radiación para la lesión índice. Pacientes con linfoma primario CNS, linfoma HIV, linfoma transformado, metástasis sintomática CNS o meningitis carcinomatosa, efusión pleural con citología positiva para linfoma, radio-inmunoterapia anterior, o terapia anterior con otros anticuerpos monoclonales humanos o humanizados (a menos que HAHA haya probado ser negativa) no fueron elegibles. Otros criterios de extrusión fueron HIV, hepatitis B o C positivamente conocidas, enfermedad autoinmune conocida o presencia de fenómenos autoinmunes, infección o uso de antibióticos dentro de cinco días, corticosteroides dentro de dos semanas, otro cáncer dentro de cinco años (excepto cáncer de piel de no melanoma o carcinoma cervical in situ), y otras condiciones que probablemente interfieren con la interpretación o los procedimientos del estudio. Las mujeres con potencial de embarazo deben tener una prueba de embarazo negativa, y pacientes de potencial de embarazo deben practicar control de natalidad durante por lo menos 12 de semanas después del tratamiento.

Tratamiento - Se dio veltuzumab en una base semanal durante cuatro semanas consecutivas. Todos los pacientes fueron medicados previamente cada semana con un antihistamínico y un antipirético, pero 5 no se dieron esteroides de manera rutinaria. Durante la instalación de dosis, los seguidores de 3 a 6 pacientes recibieron veltuzumab en niveles crecientes de dosis de 120, 200, 375 y 750 mg/m2, mientras que los pacientes subsiguientes recibieron veltuzumab en 80, 120, 200 o 375 mg/m2. Para pacientes que permanecieron estables en la 10 ausencia de reacciones de infusión, las directrices para infusiones de veltuzumab permitieron que avanzara el régimen cada 15 a 30 min en incrementos de 50 mg/m2 para la primera infusión y de 100 a 200 mg/m2 para infusiones subsiguientes. De cualquier manera, las j acciones recomendadas se incluyeron hacer lento el régimen de 15 infusión para toxicidad moderada; interrumpir la infusión para toxicidad ? i moderada durante por lo menos 15 minutos o hasta que los síntomas | se resuelvan y entonces reasumir el régimen de infusión detenido, sí el paciente está estable; y descontinuar permanentemente la infección para toxicidad más seria. 20 Recolección de Datos - Escaneos CT (cuello, pecho, abdomen, pelvis, oreos sitios de enfermedad conocidos) y exámenes físicos se obtuvieron en la línea de base y 4 semanas después de la última infusión. Los pacientes sin la progresión de la enfermedad continuaron los escaneos CT y exámenes médicos a las 12 semanas y después 25 cada 3 meses hasta la ocurrencia de la progresión de la enfermedad.

Se requirió biopsia de médula espinal en la línea de base y en aquellos pacientes con infiltración de médula espinal solamente si necesitan confirmar una respuesta completa. Durante las infusiones, los pacientes se monitorearon para reacciones adversas, con signos vitales obtenidos cada 1 5 minutos hasta la terminación completa y después 30 y 60 minutos más tarde. Continuaron siendo monitoreados para eventos adversos en evaluaciones 4 y 1 2 semanas después de la última infusión y después cada 3 meses hasta la resolución de cualesquiera anormalidades relacionadas con el tratamiento u otros cambios que garanticen seguimiento adicional . Se obtuvieron muestras de sangre para laboratorios de seguridad de rutina (química de suero, hematología) y exámenes físicos antes de cada infusión , 4 y 1 2 semanas después de la última infusión y después cada 3 meses en evaluaciones de seguimiento hasta progresión de la enfermedad.

Las muestras de sangre para conteo de células B (CD19+) se obtuvieron antes de cada infusión, a la semana 1 , 4, 8 y 1 2 después de la última infusión y durante el seguimiento cada 3 meses hasta que los niveles decrecidos regresaron a la línea de base. Urinálisis, muestras de sangre para niveles de células T (CD1 9+ ) e inmunoglobulinas en suero se determinaron en la línea de base, antes de la última infusión, 4 y 1 2 semanas después de la última infusión y después durante el seguimiento cada 3 meses hasta resolución de cualesquiera anormalidades relacionadas con el tratamiento. Se obtuvieron muestras de sangre para niveles de suero de veltuzumab antes de y 30 minutos después de cada infusión, a las 24, 48, 72 y 96 horas después de la primera y la última infusiones, y después en las semanas 1 , 2, 3, 4, 8 y 1 2 después de la última infusión . Se obtuvieron muestras de sangre para inmunogenicidad (HAHA; anticuerpos anti-veltuzumab humanizados) en la l ínea de base, 4 y 1 2 semanas después de la última infusión y después durante el seguimiento si es positiva a las 1 2 semanas.

Evaluaciones de Estudios - Se determinaron las respuestas al tratamiento usando criterios internacionales de taller (Cheson et al . , J Clin Oncol . 1999, 1 7: 1244-1 253), con cada mejor respuesta del paciente clasificada como ya sea respuesta completa (CR), respuesta completa no confirmada (CRu), respueta parcial (PR), enfermedad estable o enfermedad progresiva. Los eventos adversos (AEs) fueron clasificados de acuerdo con clase de órgano y término preferidos del sistema Med DRA. Graduación de toxicidad de AEs y laboratorios utilizaron Criterios de Toxicidad Común (CTC) del Instituto Nacional de Cáncer (NCI ), versión 3.0. La toxicidad limitante de dosis (DLT) se definió como cualquier toxicidad Grado 3 o 4 relacionada con el tratamiento o los siguientes eventos Grado 2: reacción autoinmune, broncoespasmo asintomático, o urticaria generalizada. Todos los valores de laboratorio fueron determinados localmente, excepto para niveles de suero de veltuzumab y determinaciones de HAHA, que fueron realizadas por el patrocinador usando una prueba ELISA. La farmacocinética que sigue a la última infusión se evaluó con un modelo sencillo de compartimiento usando WinNonLin 2.1 (Pharsight Corporation , Mountain View, CA).

Análisis Estadístico - Se usaron estadísticas descriptivas para resumir datos demográficos, de seguridad y de laboratorio y regímenes de respuestas al tratamiento, incluyendo intervalos de confianza 95% exactos donde se indica. Supervivencia libre de progresión (PFS), definida como la duración desde el primer día de la administración del fármaco del estudio hasta el día de progresión de la enfermedad (con base en evidencia física o radiológica (CT), muerte, o último contacto, lo que ocurra primero, se resolvió usando estadística descriptiva así como también estadística con base en el método de producto-límite de Kaplan-Meier. Los pacientes fueron considerados como censurados sí nunca experimentaron progresión de enfermedad o muerte. Duración de respuesta, definida como la duración desde el primer día del comienzo de una respuesta objetiva (OR), es decir, CR, CRu o PR, hasta el día de la progresión de la enfermedad, muerte, o último contacto, lo que ocurra primero, se resumió usando métodos similares.

Resultados Características del Paciente - Se reclutaron un total de 82 pacientes (34 hombres, 48 mujeres, edad media 64 años). Tuvieron una media de 5 años desde la diagnosis inicial y 1.8 años desde el último tratamiento. La mayoría de los pacientes estaban en buen estado de desempeño (83% ECOG 0) a la entrada del estudio, pero con enfermedad difundida (79% Etapa lll/IV) y con 17 pacientes (21%) que tienen LDH elevado, y 30 (40%) que tienen por lo menos una masa >5cm de tumor. Todos los pacientes recibieron por lo menos un régimen de tratamiento anterior (rango, 1 a 7) y la mayoría de los pacientes (89%) habían recibido por lo menos un régimen anterior que contenía rituximab. Con base en la clasificación WHO (Harris & Ferry, 2001), 55 pacientes tenían linfoma folicular (FCL), mientras que 27 pacientes tenían linfomas no foliculares: linfoma de célula B grande y difusa (DLBCL, N=7), linfoma de célula en manto (MCL, N=7), linfoma linfocítico pequeño (SLL, N=6), linfoma de zona marginal (MZL, N=2) [(incluyendo nodal MZL (N=2) y extranodal MZL de tejido linfoide asociado con mucosa (MALT, N=4)] y linfoma linfoplasmacitoide (N=2). Se usaron criterios publicados para asignar registros FLIPI e IPI para riesgo de producción deficiente para pacientes con linfoma folicular y no folicular, respectivamente (Solal-Celigny et al., Blood 104:1258-1265, 2004). Se les unieron las características demográficas y de pacientes en la Tabla 5.

Tabla 5. Información Demográfica y de Línea de Base.

Años de diagnosis, media (rango) 5.1 (1.2-31.5) 5.1 (1.6-31.5) 5.1 (1.2-15.3) Regímenes previos al tratamiento Número, media (rango) 1.5 (1 -7) 2 (1-7) 1 (1 -5) Conteniendo rituximab: 0, 1 ,=2 9, 49, 24 7, 31 , 17 2, 18, 7 Último tratamiento Años desde, media (rango) 1.8 (0.1-11 ) 1.9 (0.1-8) 1 .6 (0.1 -1 1 ) Respuesta (si/no) 76/6 53/2 23/4 Duración de (mes), media (rango) 18.0 (2-143) 18.0 (2-79) 19.0 (2-143) LDH elevado 17 13 4 Enfermedad voluminosa >5 cm 30 24 6 FLIPI Bajo (0-1 ) 20 Intermedio (2-3) 31 Alto (4-5) 4 IPI Bajo (0-1 ) 9 Bajo/intermedio (2) 12 Alto/intermedio (3) 5 Alto (4-5) 1 Nivel de dosis de veltuzumab 80 mg/m2 14 9 5 120 mg/m2 21 17 4 200 mg/m2 18 13 5 375 mg/m2 26 14 12 750 mg/m2 3 2 1 1 Incluye grados foliculares 1 (N=31 ), 2(N=18) y 3(N=4). No se asignaron grados para 12 pacientes. 2 Incluye linfoma de célula B grande difusa (N=7), linfoma de célula manto (N=7), linfoma de zona marginal (N=6), linfoma linfocitico pequeño (N=5), y linfoma linfoplasmacitoide (N=2).

Admi nistración de Fármacos - De los 82 pacientes, 78 recibieron 4 infusiones, mientras que 3 pacientes con progresión temprana de la enfermedad se retiraron después de completar 2-3 infusiones de veltuzumab, y un paciente con SLL con urticaria y resfriado en rituximab anterior se retiró después de reacciones Grado 1 -2 similares a la primera infusión de veltuzumab. Las dosis se administraron de cualquier manera como se prescribieron, con base en el área superficial del cuerpo del paciente y nivel de dosis, excepto para 3 pacientes que se les dio 1 o 2 de las 4 infusiones en dosis reducidas debido a reacciones alérgicas, y un paciente a quien se le administró inadvertidamente una infusión en el siguiente nivel de dosis mayor. Los momentos de la infusión están resumidos en la Tabla 6 para todas las dosis dadas.

Tabla 6. Tiempos Medios de Infusión (horas).* * Tiempos medios (rango) en horas desde inicio de infusión hasta terminación de infusión.

Respuesta al Tratamiento - No fue posible evaluar para eficacia al único paciente que se retiró en la primera infusión. De los 81 pacientes evaluados, 23 tenían progresión de enfermedad en o antes de la primera evaluación programada 4 semanas después del tratamiento y no experimentaron evaluaciones adicionales de respuesta. De cualquier modo, la mejor respuesta en cada paciente antes de la progresión de la enfermedad incluyó 10 con CR, 7 con CRu, 16 con PR y 25 con enfermedad estable.

Calculando las respuestas objetivas (OR = CR + CRu + PR), los regímenes globales de OR y CR/CRu fueron 40.7% (33/81) y 21.0% (17/81), respectivamente. En linfoma folicular, los regímenes de OR y CR/CRu fueron de 44% (24/55) y 27% (15/55), respectivamente, con ambos ORs y CR/CRu's que ocurren aun después de 2 a 5 regímenes de rituximab, entre pacientes de folicular con prognosis menos favorable (FLIPI >2, LDH elevado, enfermedad voluminosa >5 cm) y en todos los niveles de dosis incluyendo 80 mg/m2. Entre los otros linfomas no funiculares, los regímenes globales de OR y CR/CRu fueron de fueron de 35% (9/26) y 27% (7/26), respectivamente. Esto incluyó 5/6 pacientes de MZL con ORs (83%), incluyendo 2 CR/CRu's (33%), uno en 80 mg/m2 y respuestas parciales en 3/7 pacientes (43%) y 1/7 pacientes de MCL (14%). La Tabla 7 resume estos resultados.

Tabla 7. Respuestas Objetivas al Tratamiento.* 750 100% (2/2) 100% (2/2) FLIPI: 0-1 55.0% (11/20) 40.0% (8/20) =2 37.1 % (13/35) 20.0% (7/35) Rituximab previo: 0 57.1 % (4/7) 42.9% (3/7) 1 45.2% (14/31) 22.6% (7/31) 2-5 35.3% (6/17) 29.4% (5/17) LHD elevado: Si 23.1% (3/13) 15.4% (2/13) No 50.0% (21/42) 31.0% (13/42) Enfermedad voluminosa (>5 cm): Si 25.0% (6/24) 8.3% (2/24) No 58.1 % (18/31 ) 41.9% (13/31 ) No folicular (N=26) 34.6% (9/26) 26.9% (7/26) Linfoma zona marginal1 83.3% (5/6) 33.3% (2/6) Linfoma célula B grande difusa2 42.9% (3/7) 0.0% (0/7) Linfoma célula manto3 14.3% (1/7) 0.0% (0/7) Linfoma linfocítico pequeño4 0.0% (0/4) 0.0% (0/4) Linfoma linfoplasmacitoide5 0.0% (0/2) 0.0% (0/2) * Mejor respuesta antes de progresión de la enfermedad con base en criterios Cheson (OR=CR+CRu+PR, CR = respuesta completa, CRu = sin confirmar CR, PR = respuesta parcial, SD = enfermedad estable, POD = progresión de enfermedad) 1 MZL: 1 CR (80 mg/m2), 1 CRu (375 mg/m2), 3 PR (80 mg/m2, 2 x 200 mg/m2), 1 SD (120 mg/m2) 2 DLBCL: 3 PR (80 mg/m2, 2 x 375 mg/m2), 4 POD (80 mg/m2, 2 x 120 mg/m2, 200 mg/m2) 3 MCCL: 1 PR (375 mg/m2), 3 SD (200 mg/m2, 375 mg/m2, 750 mg/m2), 3 POD (120 mg/m2, 2 x 375 mg/m2) 4 SLL: 2 SD (375 mg/m2), 2 POD (80 mg/m2, 375 mg/m2); 5 LPL: 2 SD (200 mg/m2, 375 mg/m2) Para todos los 55 pacientes de folicular, con base en estimados de Kaplan-Meier, el TTP medio fue de 6.7 meses (95% , Cl : 3.7 - 9.3 mo) y el tiempo medio desde la primera infusión al comienzo de una OR (TTR) fue de 3.3 meses (95% , Cl : 1 .7 - 3.7 mo). Los 24 pacientes con una OR tuvieron una DR media de 1 0.2 meses (95%, Cl : 6.0 - 22.6 mo) y TTP medio de 1 5.2 mo (95% Cl : 9.5 - 28.2 mo). Curvas de DR y de TTP de Kaplan-Meier para los 24 respondedores se presentan en la Figura 1 5. Para los 1 5 pacientes de folicular que alcanzaron CR/CRu, los DR y TTP medios estimados de Kaplan-Meier fueron de 1 9.7 meses (95% , Cl : 8.7 - 32.5 mo) y 24.2 meses (95%, Cl : 1 3.8 - 34.3 mos), respectivamente, incluyendo 5 pacientes que continúan aún respuestas de vida larga de 1 5.9 a 37.6 meses a partir de la fecha de la primera infusión . Aunque los tamaños de las muestras son pequeños, no hubo disminución en la durabilidad de respuestas completas en dosis menores, y el único paciente folicular con una respuesta completa a 80 mg/m2 está aún en remisión 1 5.9 meses después de la primera infusión . Entre las histologías no foliculares, las 2 respuestas completas que ocurrieron (una a 80 mg/m2), así como también una respuesta estable de larga vida (todas en linfoma de zona marginal), continuaban aun 1 5 a 24 meses después del tratamiento.

Eventos Adversos - 78 pacientes tuvieron uno o más eventos adversos durante el estudio. De 48 pacientes con eventos considerados por lo menos posiblemente relacionados con el tratamiento, solamente un paciente tuvo un evento Grado 3, hipoglobulinemia que se desarrolló durante remisión a largo plazo > 1 año después del tratamiento. De cualquier forma, todos los eventos considerados por lo menos posiblemente relacionados con el tratamiento fueron de suaves a moderados (Grados 1 a 2), la mayoría de los cuales fueron reacciones de infusión que ocurrieron predomi nantemente en la primera infusión, con < 1 1 pacientes que tienen tales eventos en cada una de las i nfusiones subsiguientes. La Tabla 8 resume los eventos más frecuentes.

Diez pacientes tuvieron eventos adversos serios, ninguno de los cuales se consideró aún posiblemente relacionado con el tratamiento, incluyendo fibrilación atrial preexistente y eventos que ocurren du rante el periodo de tratamiento (trauma , celulitis , sepsis), con el periodo de evaluación posterior al tratamiento de 1 2 semanas (status de desempeño disminuido, dolor de espalda , hallazgo incidental de malformación A-V) o du rante el segu i miento a largo plazo (tumor de vejiga , embolismo pul monar, infección fúngica urinaria).

Tabla 8. Eventos Adversos Que Ocurren en >5% de Pacientes.

Arralgia 9% (0%) 2% (0%) Diarrea 7% (0%) 5% (0%) Nausea 7% (0%) 5% (0%) Congestión nasal 7% (0%) 4% (0%) Edema periférico 6% (0%) 2% (0%) Dolor de espalda 6%(1%) 1%(0%) Mialgia 6% (0%) 2% (0%) Mareo 6% (0%) 4% (0%) Dolor de faringe 6% (0%) 4% (0%) Hipertensión 5% (0%) 2% (0%) Urticaria 5% (0%) 1%(0%) Constipación 5% (0%) 1%(0%) Anemia 5% (2%) 0% (0%) Dieciocho pacientes (22%) tuvieron una o más infecciones.

Ninguna de las 4 infecciones de Grado 3 a 4 fueron consideradas relacionadas con el tratamiento, incluyendo 3 infecciones (sepsis, celulitis, infección fúngica urinaria) que requieran antibióticos IV y una infección (no especificada de alguna forma) tratada con múltiples antibióticos orales. De cualquier forma, todas las infecciones fueron eventos Grado 1-2 tratadas con medicamentos orales, que involucran predominantemente el tracto respiratorio, el tracto urinario o los senos.

Laboratorios de Seguridad - Se obtuvieron muestras de sangre para hematología químicas de suero antes de cada infusión, 4 y 12 semanas después de la última infusión y después cada 3 meses según fue necesario en evaluaciones de seguimiento. No ocurrió patrón anormal de cambios en laboratorios de seguridad estándar y pocos pacientes tuvieron aumentos en grados de toxicidad después del tratamiento (Tabla 9).

Tabla 9. Cambios de Laboratorios de Seguridad : Pacientes Con Incrementos en CTC v 3.0 Grados de Toxicidad a Partir de la Línea de Base (N=82).

* Eventos Grado 3: 3 pacientes tuvieron laboratorios anormales (creatinina grado 2, ANC grado 2, hemoglobina grado 1 ) en el comienzo del estudio que se volvieron Grado 3 en la semana 12, mientras que otro paciente mantuvo niveles normales de WBC y ANC hasta la semana 1 2.

Farmacocinética - Un total de 72 pacientes que completaron todas las 4 infusiones recibieron todas las dosis de veltuzumab en la dosis pretendida, tuvieron muestras de suero recolectadas después de la primera y la última infusiones, y tuvieron resultados de ensayo ELISA negativos antes de recibir veltuzumab (un paciente fue excluido debido a un factor de suero interferente aparente de causa desconocida) fueron incluidos en el análisis de farmacocinética. La Tabla 10 resume los niveles medios de suero antes de 30 minutos después de cada infusión. En todas las dosis, los niveles medios de picos en la primera infusión excedieron el valor de 25 pg/mL considerado importante para mantener la eficacia con rituximab (Berinstein et al, Ann Oncol 9: 995-1001, 1998; Gordon et al, J Clin Oncol 23:1096-1102, 2005; Cartron et al, Crit Rev in Oncol Hematol 62:43-52, 2007). El anticuerpo se acumuló con los números de infusión en todas las dosis, y aún a 80 mg/m2, los niveles de suero a través de la media excedieron el valor de 25 pg/mL por la última infusión. Se programó la recolección de suero post-tratamiento 30 minutos después de la última infusión, 1, 2, 3 y 4 días más tarde, y a las semanas 1, 2, 3, 4, 8 y 12.

Tabla 10. Niveles de Suero Veltuzumab (Media ± SD): Resultados Pre y Post-lnfusión ( g/ 80 mg/m2 120 mg/m2 200 mg/m2 375 mg/m2 750 mg/m2 (N=12) (N=19) (N=14) (N=24) (N=3) Infusión 1 Pre 1.3 ± 1.5 0.3 ±0.5 0.3 ±0.6 0.1 ±0.3 0.7 ± 0.5 Post 39 ±9 59 ±13 94 ±22 194 ±35 474 ± 33 Infusión 2 Pre 11 ±5 18 ± 11 28 ± 18 75 ±45 222 ± 158 Post 48 ±15 86 ±31 125 ±44 276 ± 90 632 ± 99 Infusión 3 Pre 20 ± 7 0.3 ± 0.5 0.3 ± 0.6 0.1 ± 0.3 0.7 ± 0.5 Post 39 ± 9 59 ± 13 94 ± 22 194 ± 35 474 ± 33 Infusión 4 Pre 27 ± 11 43 ± 26 72 ± 41 173 ± 69 495 ± 64 Post 68 ± 25 100 ± 37 170 ± 67 404 ± 105 996 ± 66 Un modelo de compartimiento sencillo (mono-exponencial) se ajustó para todos los datos disponibles de nivel de suero posttratamiento en cada uno de los 72 pacientes. La Tabla 1 1 resume los parámetros farmacocinéticos determinados por ajuste que muestran que la Cmax y AUC aumentaron con el nivel de dosis, mientras que los valores de desalojo (CL) mostraron un patrón no consistente de dependencia de dosis. Lo más importante, los valores medios de T1 2 parecen compatibles en todas las dosis, y aún a 80 mg/m2, el anticuerpo permaneció en circulación con una vida media promedio de 20 días. Aunque no se realizó una comparación formal , no hubo diferencias mayores en picos medios y farmacocinética a través o posttratamiento para los 50 pacientes foliculares en comparación con los 22 otros pacientes no foliculares (datos no mostrados).

Tabla 1 1 . Niveles de suero de veltuzumab (media ± SD): farmacocinética después de la 4a infusión .

Ti/2 (d) 19.7 ± 9.4 14.7± 7.7 18.4± 9.8 13.3 ± 4.1 16.1 ± 1.4 AUCo-.- 1487±646 1952±1204 4188±2286 7191 ±3262 20647±3313 (d x pg/mL) CL 67 ± 33 108 ± 103 230 ± 604 72 ± 52 37 ± 7 (mL/d/m2) Similar a lo que se ha reportado con rituximab (Berinstein et al . , Ann Oncol 9:995-1 001 , 1 998; Gordon et al , J Clin Oncol 23: 1 096-1 1 02, 2005; Cartron et al , Crit Rev in Oncol Hematol 62:43-52, 2007), tanto la media como pico medio y niveles de suero en cada infusión fueron generalmente mayores entre pacientes con respuestas objetivas que en no respondedores, y a pesar del pequeño número de pacientes, aun para aquellos pacientes tratados con la dosis más baja de 80 mg/m2. Los resultados de pre y post-infusión media se resumen en la Tabla 12 para todos los pacientes foliculares con datos disponibles.

Tabla 12. Niveles de Suero de Veltuzumab Durante el Tratamiento Para Respondedores y No Respondedores de Linfoma Folicular. 4 Si 20 93.0 16 201.0 No 21 43.0 16 85.4 Célula B y Otros Cambios Inmunológicos - Los niveles de células B en sangre periférica (CD 19+) se iban a determinar en la línea de base, antes de cada infusión, en las 4 semanas siguientes a la última infusión, y después en intervalos de 3 meses hasta recuperación a la línea de base. Al inicio del estudio, 68 pacientes tenían niveles de células B de sangre periférica bajo o bajo-normal (1-256 células/pl, media 60), 9 pacientes (incluyendo los 5 pacientes de SLL) tenían niveles elevados (572-14,712 células/µ?, media 1,782) y 5 pacientes no tenían niveles de línea de base determinados.

La Figura 15 gráfica el curso de los niveles de células B para todos los pacientes quienes tenían niveles de células B no elevados en la línea de base y por lo menos una muestra obtenida durante el tratamiento. En laboratorios donde se reportaron los niveles de células B como porcentaje de linfocitos totales, disminuciones por debajo del límite inferior de cuantificación (típicamente 1%) no podrían determinarse y para análisis se establecieron conservadoramente en el límite antes de convertir los resultados a conteos de células absolutos. Como tal, la extensión real del debilitamiento de células B es probablemente más completa, pero no obstante, los resultados parecen comparables para todos los niveles de dosis, incluyendo el nivel más bajo de dosis de 80 mg/m2.

Las células B permanecieron generalmente debilitadas hasta el comienzo de 6 meses de recuperación después de la última infusión, con valores disminuidos que regresan después hacia la l ínea de base por los meses 9-1 2 y no hay evidencia de que el debilitamiento de células B es menos durable a niveles menores de dosis, aunque los datos a largo plazo están limitados todavía para pacientes tratados con el nivel de dosis más reciente de 80 mg/m2.

Los pocos pacientes con niveles elevados de células B al inicio del estudio no fueron incluidos en la Figura 14 para claridad . A pesar de los valores de línea de base grandemente incrementados, particularmente para los pacientes de SLL, sus niveles de células B fueron disminuidos también sustancialmente con el tratamiento (media de 96% de disminución) incluyendo una disminución de 94% en un paciente tratado con 80 mg/m2. Sin embargo, estas respuestas fueron principalmente de corta vida, más al principio para regresar hacia valores elevados de línea de base a las 12 semanas después de la última infusión.

Los niveles cuantitativos de inmunoglobulina en suero y células T iban a obtenerse a partir de muestras de sangre evaluadas en la línea de base, antes de la última infusión , 4 y 12 semanas más tarde, y después cada 3 meses para pacientes que permanecen en seguimiento. No hubo patrones consistentes de disminuciones clínicamente significativas durante las 12 semanas del periodo de estudio o en subconjuntos más pequeños de pacientes seguidos hasta un año después de la última infusión, con cambios medios a partir de la línea de base que son pequeños en la mayoría de los puntos de tiempo (típicamente <5% para IgA e IgG, < 5% para células T, <20% para IgM).

Inmunogenicidad (HAHA) - Setenta pacientes tenían por lo menos una muestra de suero post-tratamiento a las 4 semanas (N = 58), 12 semanas (N = 53), 6 meses (N=8) o un año (N=2) después de la última infusión analizada para HAHA mediante ensayo de ELISA. Un paciente de SLL con exposición previa a rituximab fue negativo a la entrada del estudio, pero desarrolló títulos elevados (3,380 ng/mL) 4 semanas después del tratamiento sin ninguna consecuencia clínica aparente. Todas las otras muestras fueron negativas (<50 ng/mL).

Discusión A pesar de la evidencia de muerte de células mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y señalización directa con efectos de apoptosis, los mecanismos de acción clínicamente relevantes de inmunoterapia anti-CD20 en malignidades de célula B o varios trastornos autoinmunes permanecen inciertos (Glennie et al, Mol Immunol 44:3823-3837, 2007). Como tal, las pruebas clínicas de anticuerpos anti-CD20 de segunda generación permanecen necesarias y la mayoría de estas se han enfocado en dosis de anticuerpos cercanas a o mayores que aquellas dadas típicamente con rituximab (Morschhauser et al, Blood 110: 199a, 2007; Hagenbeek et al, Blood 111:5486-5495, 2008; Coiffier et al, Blood 111:1094-1100, 2008). Sin embargo, varias líneas de cuestiones, incluyendo estudios en animales (Ejemplo 15) así como también estudios independientes de efectos de recorte en CLL (Kennedy et al , J I mmunol 1 72:3280-3288, 2004; Williams et al , J Immunol 1 77:7435-7443, 2006), han sugerido que las dosis menores que la dosis típica de 375 mg/m2 usada con rituximab deben ser exploradas. Los resultados recientes demuestran que por lo menos con veltuzumab, dosis mucho menores que 375 mg/m2 son eficaces, con respecto a las respuestas clínicas y la habilidad para debilitar células B de sangre periférica.

La mayoría de los pacientes en este estudio tubo linfoma folicular para el cual el veltuzumab tuvo una respuesta objetiva global de 44%, entre el régimen de 48% reportado con rituximab en la prueba pivotante inicial de pacientes de rituximab-naíve (McLaughlin et al , J Clin Oncol 1 6:2825-2833, 1 998) o 40% en paz tiene pacientes quienes respondieron a previamente al rituximab (puesto que muchos pacientes aquí tuvieron exposición previa a uno o más regímenes que contienen rituximab) (Davis et al , J Clin Oncol 1 8:31 35-3143, 2000). De manera similar, el régimen de respuestas completas, ya sea 27% CR/CRu o 16% para CRs solas, excedieron los regímenes de respuestas completas de 16% y 1 1 % reportados en esos grupos, aunque se usaron diferentes criterios en los estudios anteriores.

Es importante que las respuestas de veltuzumab, incluyendo respuestas completas, ocurrieron en pacientes quienes habían recibido múltiples regímenes de rituximab antes así como también en pacientes considerados generalmente en riesgo para producción menos favorable (registros mayores de FLI PI , LDH elevado, masa de tumor >5 cm). Los regímenes de respuesta más altos ocurrieron en el pequeño número de pacientes de rituximab-na íve, que alcanzaron 57% de ORs y 43% de CR/CRu's.

La DR media de 1 0.2 meses encontrada para todos los respondedores de FL en este estudio es comparable con la DR de 1 1 .2 meses reportada en pacientes con N HL indolente, de recaída/refractaria, después de una primera aplicación de rituximab (McLaughlin et al , J Clin Oncol 1 6:2825-2833, 1 998). Aunque se reportó una DR media de 1 5.0 meses más larga en pacientes retratados con rituximab, todos ellos habían logrado una respuesta objetiva al rituximab anterior que dura por lo menos 6 meses (Davis et al . , J CHn Oncol 1 8:31 35-3143, 2000). En contraste, los pacientes en este estudio no pudieron haber progresado dentro de los 6 meses de rituximab, pero no se requirió una respuesta objetiva. Como tal, probablemente pueden ser más refractarias y requerir más tiempo para que el veltuzumab sea efectivo, consistente con el tiempo medio de comienzo de respuesta de 3.3 meses en este estudio comparado con 1 .6 meses en ambos estudios con rituximab (McLaughlin et al . , 1 998; Davis et al . , 2000) y consistente también con el TTP de media relativamente larga para respondedores de 1 5.2 meses visto en este estudio.

Como se discutió antes, parece también que hay un número más grande de respuestas completas con veltuzumab en comparación con estos otros estudios. Esto es particularmente importante porque los pacientes con CR/CRu 's en este estudio tuvieron generalmente respuestas durables con DR media y PFS que son actualmente de 1 9.7 y 24.2 meses, respectivamente, ambos de los cuales pueden aumentar más puesto que 5 pacientes continúan aun con respuestas de larga vida ( 1 5.9 - 37.6 meses). Así, a pesar de los niveles bajos de dosis estudiados aquí, los resultados de eficacia con veltuzumab parecen favorables en comparación con rituximab cuando se da una vez a la semana durante 4 semanas.

Entre las histologías no foliculares, el veltuzumab alcanzó un régimen de respuesta objetiva global de 35% con 27% de CR/CRu 's. El veltuzumab funcionó particularmente bien en linfoma de zona marginal , con ORs en 5/6 pacientes (83%) que tienen MALT extranodal o enfermedad de tipo nodal , incluyendo 3 respuestas a largo plazo ( 1 5 a 24 meses), una a un nivel de dosis de solamente 80 mg/m2. Así, consistente con respuestas favorables reportadas previamente con rituximab (Tsimberidou et al , Cáncer 107:1 25-1 35, 2006; Conconi et al, Blood 1 02:2741 -2745, 2003), veltuzumab muestra actividad promisoria para uso en linfoma de zona marginal .

En DLBCL, no ocurrieron respuestas completas, pero 3/7 pacientes lograron una respuesta parcial, incluyendo un paciente tratado con 80 mg/m2. El régimen de OR resultante de 43% obtenido aquí con 4 dosis semanales de veltuzumab es comparable con el régimen de 37% reportado en DLBCL con 8 dosis semanales de rituximab (Coiffier et al, Blood 92: 1 927-1932 , 1 998). Estos hallazgos de actividad promisoria sugieren que el veltuzumab puede ser útil en combinación con quimioterapia en esta población, similar a lo que se ha encontrado con rituximab (Czuczman et al . , J Clin Oncol 22:471 1 - 4716, 2004; Coiffier et al , N Engl J Med 346:235-242 , 2002; Habermann «. et al , J Clin Oncol 24:3121 -31 27, 2006), que es aprobado para uso en DLBCL en combinación con CHOP.

Solamente uno de siete pacientes con linfoma de célula de manto tuvo una respuesta objetiva, una respuesta parcial de corta vida en un paciente tratado con veltuzumab a 1 20 mg/m2. Esto es consistente con los reg ímenes modestos de respuesta, y respuestas predominantemente parciales, reportadas con rituximab de un solo agente en esta enfermedad (Igarashi et al , Ann Oncol 1 3:928-943, 2002; Foran et al , J Clin Oncol 1 8:31 7-324, 2000). Los pacientes con linfoma linfocítica pequeña de recaída son conocidos por ser relativamente refractarios al rituximab de un solo agente (McLaughlin et al , 1 998; Foran et al, J Clin Oncol 1 8:317-324, 2000) y ninguno de los pocos pacientes en este estudio tuvo una respuesta objetiva.

Sin embargo, el veltuzumab tuvo otra evidencia de actividad en SLL, puesto que todos los pacientes tuvieron niveles elevados de células B en inicio del estudio (3 arriba de 1 0,000/mm3) los cuales disminuyeron después de la primera infusión de veltuzumab y permanecieron disminuidos durante por lo menos 4 semanas después de la última infusión , y esto incluye un paciente tratado con 80 mg/m2 con niveles iniciales de > 1 0,000/mm3 disminuidos subsiguientemente en 94% . Dos estudios de rituximab en pacientes con macro globulinemia de Waldenstrom e immunocitoma reportaron regímenes de respuesta solamente modestos con respuestas no completas (Foran et al, J Clin Oncol 18:317-324, 2000; Gertz et al, Leuk Lymphoma 45:2047-2055, 2004) y entonces no es sorprendente que ninguno de los dos pacientes en este estudio con linfoma linfoplasmacítico tuvieron una respuesta objetiva.

Con relación a la farmacocinética de veltuzumab, a 375 mg/m2 el pico medio y niveles de anticuerpos en suero alcanzados con veltuzumab fueron comparables con valores reportados para rituximab (Berinstein et al , Ann Oncol 9: 995-1 001 , 1998). Aún a 80 mg/m2, el debilitamiento de células B ocurrió después de la primera infusión , los niveles de suero de anticuerpo después de la primera infusión excedieron el valor de 25 Mg/mL asociado con la eficacia mantenida (Berinstein et al , 1 998; Gordon et al , 2005; Cartron et al 2007) y continuaron creciendo con cada infusión sucesiva, y el veltuzumab permaneció en circulación después de la última infusión con una vida media comparable con o por lo menos tan larga como se reporta en estudios de rituximab (Berinstein et al , 1998; Cartron et al 2007).

Encontramos la misma relación de niveles mayores de suero en respondedores reportados con rituximab (Berinstein et al, 1998; Gordon et al , 2005; Cartron et al , 2007) y aunque los números fueron pequeños, esta tendencia fue vista aun para pacientes solamente tratados con la dosis más baja de 80 mg/m2. Estos hallazgos de farmacocinética y farmacodinámica sugieren que las dosis menores de veltuzumab fueron adecuadas para superar el pozo antigénico, soportando así la demostración de la actividad clínica que ocurrió en todos los niveles de dosis en este estudio, incluyendo 80 mg/m2.

Un beneficio más de usar dosis menores es el tiempo disminuido de infusión. Con veltuzumab, los tiempos medios de la primera infusión fueron de 4.7 horas a 750 mg/m2, 3.1 horas a 375 mg/m2, y 1 .8 a 2.4 horas a dosis menores, mientras que los tiempos medios para infusiones subsiguientes fueron de 2.1 a 2.6 horas a 375 o 750 mg/m2, y 1 .2 a 1 .5 horas a dosis menores. En estos tiempos de infusión más cortos, no hubo reacciones serias de infusión o incrementos en la frecuencia de las reacciones de infusión más comunes. Esto es importante porque el protocolo limitó el régimen de infusiones en este primer estudio, de manera que aún administraciones más rápidas son probablemente posibles con este agente. El veltuzumab no tuvo tampoco impacto cl ínico en laboratorios estándar de seguridad , niveles de células T o inmunoglobulinas en suero. Solamente ocurrió un caso de respuesta HAHA de significancia clínica incierta; de cualquier manera , no hubo evidencia de inmunogenicidad de veltuzumab.

El primer estudio cl ínico de rituximab evaluó dosis sencillas de 1 0 a 500 mg/m2, con varias respuestas parciales logradas a dosis de 1 00 mg/m2 y más (Maloney et al, Blood 84: 2457-2466, 1 994). En el siguiente estudio de rituximab, solamente se dieron dosis de 125 mg/m2 y más grandes una vez por semana durante 4 semanas, y ahora se seleccionó la dosis estándar de 375 mg/m2 en ese punto para desarrollo posterior, aparentemente sobre la base de logística en lugar de consideraciones científicas, puesto que los reg ímenes actuales de respuesta (todas respuestas parciales) fueron idénticos en cada nivel de dosis probado (Maloney et al , J CHn Oncol 1 5:3266-3274, 1 997). Un mejor entendimiento de la farmacocinética y factores que influencian la respuesta del paciente es necesario claramente para optimizar la dosificación (Cartron et al, Crit Rev in Oncol Hematol 62:43-52, 2007), pero después de la aprobación inicial de rituximab, se acercaron dosis de 375 mg/m2 y aún mayores para uso clínico con anticuerpos anti-CD20 sin evaluación crítica, o consideración de niveles inferiores. Sin embargo, la evidencia reciente de "rasurado" en leucemia linfocítica crónica ha conducido a otros a sugerir que las bajas dosis pueden ser efectivas en esa enfermedad (Kennedy et al., J Immunol 172:3280-3288, 2004; Williams et al, J Immunol 177:7435-7443, 2006). Se podría esperar también que las dosis bajas son efectivas contra cargas menores de tumor CD20, tales como pacientes de linfoma con enfermedad de volumen pequeño o que experimentan terapia de mantenimiento, o en enfermedades autoinmunes mediadas por células B donde puede haber mucho menos de un pozo de CD20 que en las enfermedades malignas, y donde subyace la supresión de células B agresivas puede ser no necesario ni deseable.

En resumen, este ejemplo demostró que el veltuzumab no solamente es bien tolerado, sino que también las dosis bajas son activas, con debilitamiento de células B y respuestas completas que ocurren en todas las dosis evaluadas, incluyendo 80 mg/m2. Las dos Cys más bajas son importantes también debido a la oportunidad de entrega de veltuzumab mediante inyección subcutánea usando una formulación de anticuerpos más concentrada, como se ha mostrado en modelos de animales (Ejemplo 15).

Ejemplo 25. Variantes de hA20.

Nomenclatura Nombre H-CDR3 Fe Notas Alterno 101 102 239 332 v-mab Veltuzu- D V S I Fuera de régimen más mab lento V102Y Y Variante CDR de v- Ej. 25A mab con propiedades in vitro e in vivo similares o equivalentes YDE Y D E Variante Fe de V102Y Ej. 25B con ADCC aumentado v-mab-DE D E Variante Fe de v-mab Ej. con ADCC aumentado 25C D101 N Variante CDR de v- mab con fuera de régimen más rápido El residuo de aminoácido idéntico a aquel de v-mab en la posición correspondiente está indicado con · Materiales y métodos La PCR se realizó de acuerdo con el protocolo estándar de PCR. El secuenciado de ADN se realizó mediante Seq Wright (Houston, TX). Las enzimas de recepción se compraron de New England Biolabs. Los cebadores se hicieron a través de Fisher Scientific.

A. Variante V102Y V1 02Y es la variante de hA20 con un cambio de aminoácido de Val a Tyr en la posición 1 02 (numeración de Rabat) en la CDR3 de VH . V102Y mutante: -> STYYGGDWYFDY102 (Val ->Tyr) VH-CDR3 VH-CDR3 Entonces, CDRH3 en V102Y es STYYGGDWYFDY (SEQ I D NO:21 ) Construcción de vector y esq uema de clonado Se usaron cuatro cebadores: 5' V 102 Y primer (40 meros) CGGTGACTGGTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCACG (SEQ ID NO:22) 3' V102Y primer (40 meros) CGTGGTGCCTTGGCCCCAGTAATCGAAGTACCAGTCACCG (SEQ ID NO:23 5' Xho I primer (20 meros) CCTCGAGCACACAGGACCTC (SEQ ID NO:24) 3 ' Hind III primer (20 meros) AAAGCTTGCGGCCGCGATCC (SEQ ID NO:25) El esquema de clonado fue como sigue: DNA témplate: hA20-IgG-pdHL2 5' Xho I primer & 3' V102Y primer PCR product #1: 510 bp DNA témplate: hA20-lgG-pdHL2 .y V I 02 Y Primer & 3* Hind ?? primer PCR product #2: 210 bp El producto #1 y #2 de PCR se purificaron a partir de gel, mezclado en cantidades molares iguales como plantillay PCR con 5'Xho I & 3' Hind I I I como cebadores para generar producto #3 de PCR (680 bp) que fue clonado en pGEMT y confirmado con digestión Xhol y Hind I I I , seguido por secuenciado. El producto #3 de ligación de PCR con el fragmento restringido Xho/Hind I I I de hA20-lgG-pd HL2 completó el vector de expresión para V102Y, designado como V102Y.hA20-lgG-pdHL2).

Transfección y purificación de proteínas V1 02y-hA20-pdHL2 (30 pg ) se hizo lineal mediante digestión con Sal I, seguido por fenol, extracción con cloroformo y precipitado con etanol 100% y acetato de amonio. El gran uno de ADN se resuspendió en búfer de electroporación (20 mM HEPES, pH 7.0; 137 mM NaCI, 5mM KCI, 0.7 mM Na2HP04l y 6 mM Dextrosa) después se mezcló con 2.8 x 106 células SpESF y electroporación con el electroporador GenePulser Xcell BioRad @ capacitancia 25 pF, 450 V, resistencia infinita ohmios, 4 mm cubeta. El medio de agregó y se se colocó en placas de 96 pozos.

Después de 48 horas, se agregó igual volumen del medio de selección que contiene MTX 0.2 µ?. Aproximadamente a los 10 días, los clones se clasificaron mediante ELISA usando anticuerpo anti-CD20 de ratón revestido en las placas y conjugado Fc-HRP anti-humano. El color se desarrolló con OPD y H202.

Se seleccionó el clon con la mayor productividad (42 mg/L) y se designó como 3D10. V102Y se hizo en botellas de rodillo, se purificó con proteína A, y su pureza mostrada mediante SDS-PAGE y HPLC de exclusión por tamaño. Otras caracterizaciones incluyen determinación de fuera de régimen y ensayo de ADCC.

B. Variante YDE YDE es un mutante de V102Y con dos mutaciones de 2 aminoácidos en el dominio CH2 de Fc:S 239 D (TCA->GAT) y I 332 E (ATC->GAA) Como V102Y, CDRH3 en YDE es STYYGGDWYFDY (SEQ ID NO:21).

Construcción de vector y esquema de clonación.

I Se designan seis cebadores para las dos mutaciones de aminoácido: 5' Pstl-Fc (20 meros) 5' CTCTG CAG AG CCC AAATCTT (SEQ ID NO:26) 5 31S239D (23 meros) 5' AGAGGAAGACATCCGGTCCCCCC (SEQ ID NO:27) 5' S239D (23 mers) 5' GGGGGGACCGGATGTCTTCCTCT (SEQ ID NO:28) 3' I332E (23 meros) 5' ATGGTTTTCTCTTCGGGGGCTGG (SEQ ID NO:29) 10 5?332? (23 meros) 5" CCAGCCCCCGAAGAGAAAACCAT (SEQ ID NO:30) 3' Pstl-Fc (20 meros) 5' ACCTGCAGGCGGCCGTCGCA (SEQ ID NO:31) El esquema de clonación fue como sigue: 15 ADN plantilla: 1826-SV3 (un vector de graduación en casa) PCR#1: 5' Pstl-Fc & 3' S239D primers-> 207 bp PCR#2: 5' S239D & 3' I332E primers-> 303 bp PCR#3: 5' I332E & 3' Pstl-Fc primers-> 477 bp Cada producto de PCR se purificó en gel, se mezcló en 20 concentración molar igual para obtener PCR#4 (941 bp) usando 5' Pstl- Fc y 3' Pstl-Fc como cebadores. PCR#4 se clonó en pGEMT y se confirmó mediante secuenciado. El fragmento se digirió entonces de pGEMT con PstI y se clonó en un vector intermedio, 1826-SV3, el cual se dijo digirió también con PstI. Ligando el corte de PCR#4 del vector 25 de graduación con EagI con V102Y-hA20-lgG-pdHL2 Eagl-restringido completó la construcción del YDE-hA20-pdHL2 final.

Transfección y purificación de proteína Se usaron los mismos procedimientos que se describen antes para V102Y para obtener el clon de producción para YDE, el cual se purificó del cultivo de células mediante proteína A, y su pureza mostrada por SDS-PAGE y SE-HPLC. YDE mostró tener ADCC incrementado en comparación con cualquiera v-mab o V102Y.

C. Variante v-mab-DE v-mab-DE es una variante Fe de v-mab con las mismas mutaciones de aminoácido en el dominio CH2 de Fe como YDE. Se usaron los mismos cebadores y esquema de clonado como se describe para YDE en el Ejemplo 2 en la construcción del vector de expresión v-mab-DE-hA20-pdHL2, el cual no ha sido transfectado.

Ensayos de ADCC de variantes hA20 Se realizó el ensayo de ADCC como sigue. Brevemente, se colocaron en placas células Daudi, 104 células/pozo en 50 µ?_ de medio de ensayo (RPMI 1640 no rojo fenol, 1% Glutamax, 1% PenStrep). Un grupo de pozos recibió solamente los medios para control de fondo y otro grupo de pozos recibió células solamente y sirvieron como el control para lisis máxima de células.

Para cada ensayo, se usó el PBMC recolectado de un donador. Se extrajo sangre en tubos heparinizados (aproximadamente 50 mL de sangre/donador) en cuyo tiempo se usaron maxitubos UNI-SEP (NOVAmed, LTD.) para separación de los linfocitos por gradiente de densidad. Se obtuvieron aproximadamente 3 mL de PBMC a 1.6 x 107 células/mL con cada donador.

Cada ensayo uso o un efector para proporción de objetivo de 40 a 1.5 pg/mL de anticuerpo. Después de 4 horas de incubación en una incubadora humidificada al 37°C, C02 5%, las placas se removieron de la incubadora, permitiendo alcanzar la temperatura ambiente y se analizaron con CytoTox-One Homogenous Membrane Integrity Assay Kit de acuerdo con el protocolo del fabricante. El porcentaje de lisis para cada muestra en 6 replicados se determinó usando la siguiente fórmula: % Lisis - [Experimental - (Efector + Control Objetivo!! x ioo (Lisis Máxima- Control Objetivo) La tabla a continuación resume los resultados de ADCC (% lisis) obtenidos con Daudi como la célula objetivo de tres donadores. Para cada donador, la diferencia entre YDE y cualquiera v-mab o V102Y fue estadísticamente significativa (p<0.0001 para donador 009; p<0.0002 para donador 006; p<0.02 para donador 001). La diferencia entre v-mab y V102Y no fue estadísticamente significativa. El control de isotipo (h734 IgG) mostró ADCC mínimo.

Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados en la presente pueden hacerse y usarse sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y los métodos se han descrito en términos de modalidades preferidas, es aparente para aquellos de pericia en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y los métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en la presente sin apartarse del concepto, el espíritu y el alcance de la invención . Más específicamente, ciertos agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en la presente aunque se lograrían los mismos resultados o similares. Todos esos sustituyentes similares y modificaciones aparentes para aquellos expertos en la técnica están considerados dentro del espíritu , el alcance y el concepto de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Esta solicitud se basa en y reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 61 /082 ,399, presentada el 21 de julio de 2008. La descripción de la solicitud de prioridad en su totalidad , incluyendo los dibujos, las reivindicaciones y la especificación de la misma, se incorpora en la presente por referencia. Además, el contenido de todos los artículos, las patentes y solicitudes de patente a las que se hace referencia en la presente se incorporan en su totalidad .

Claims (59)

170 REIVINDICACIONES

1. Un método para mejorar un anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano o su fragmento de unión a antígeno que comprende hacer por lo menos una sustitución de aminoácidos en la tercera secuencia de región determinante de complementaridad (CDR) de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD20, quimérico, humanizado o humano o su fragmento de unión a antígeno para hacer un anticuerpo sustituido o su fragmento de unión a antígeno, en donde el anticuerpo sustituido o su fragmento de unión a antígeno tiene por lo menos una característica mejorada seleccionada del grupo que consiste de un fuera de régimen más lento, régimen de disociación de antígeno más lento, mayor actividad de CDC, mayor actividad de ADCC, mayor actividad apoptótica, mayor habilidad para inducir la muerte celular in vitro en la ausencia de entrelazamiento y mayor habilidad para matar o inhibir el crecimiento de células CD20 positivas in vivo cuando se administran a un sujeto con células CD20 positivas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las células CD20 positivas son células B.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la sustitución es en la posición 101 cavar de la cadena pesada CDR3 (CDRH3) del anticuerpo.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la sustitución comprende reemplazar un residuo de asparagina en la posición 101 Kabat con un residuo de aspartato.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo 171 sustituido comprende un residuo de arginina en la posición 94 de Kabat y el residuo de aspartato en la posición 101 de Kabat forma un enlace iónico con el residuo de arginina en la posición 94 de Kabat.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo sustituido o sus fragmentos inhibe la unión a CD20 de rituximab.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo sustituido es veltuzumab.

8. El método de la reivindicación 4, en donde la sustitución de aspartato por asparagina en la posición 101 de Kabat resulta en por lo menos un régimen de disociación dos veces más lento del anticuerpo anti-CD20 de CD2o

9. El método de la reivindicación 1, en donde las secuencias de CDR del anticuerpo sin sustituir son idénticas a las secuencias de CDR de un anticuerpo anti-CD20 de múrido.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo anti- CD20 de múrido comprende las secuencias de CDR de cadena ligera (RASSSVSYIH), CDRL2 (ATSNLAS) y CDRL3 (QQWTSNPPT) y las secuencias de CDR de cadena pesada CDRH1 (SYNMH), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG) y CDRH3 (STYYGGD WYFNV).

11. El método de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo anti- CD20 sustituido o su fragmento comprende las secuencias de CDR de cadena ligera CDRL1 (RASSSVSYIH), CDRL2 (ATSNLAS) y CDRL3 (QQWTSNPPT) y las secuencias de CDR de cadena pesada CDRH1 (SYNMH), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG) y CDRH3 (STYYGGD WYFDV). 1 72

1 2. El método de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo anti-CD20 humanizado comprende las secuencias de región de marco del anticuerpo anti-CD20 humanizado, epratuzumab, o las secuencias de región de marco del anticuerpo anti-CD20 humanizado, veltuzumab.

1 3. El método de la reivindicación 4, en donde la sustitución de aspartato por el residuo de asparagina en la posición 1 01 de Kabat resulta en un incremento en citotoxicidad dependiente de complemento de células Daudi expuestas al anticuerpo.

1 4. El método de la reivindicación 4, en donde la sustitución de aspartato por el residuo de asparagina en la posición 1 01 de Kabat resulta en una reducción de 30 a 40% en EC50 en citotoxicidad dependiente de complemento de células Daudi expuestas al anticuerpo.

1 5. Un método para tratar una enfermedad en un sujeto, que comprende: a) obtener un anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano o su fragmento de unión a antígeno hecho mediante el método de la reivindicación 9. b) administrar el anticuerpo anti-CD20 sustituido o su fragmento a un sujeto; y c) tratar la enfermedad en el sujeto, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedad inmune mediada por células B , enfermedad autoinmune, linfoma y leucemia de célula B, enfermedad de injerto versus huésped, rechazo de trasplante de órgano, anemia hemol ítica inmune, alosensibilización y crioglobulinemia. 1 73

1 6. El método de la reivindicación 1 5, en donde la enfermedad es púrpura trombocitopénica inmune, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren , síndrome de Evans, artritis, areritis, pénfigo vulgaris, rechazo de injerto renal , rechazo de injerto cardiaco, artritis 5 reumatoide , linfoma de Burkitt, linfoma de no Hodgkin , linfoma folicular, linfoma linfocítica pequeña, linfoma de célula B difusa, linfoma de zona marginal , leucemia linfocítica crónica , leucemia linfocítica aguda y mieloma múltiple.

1 7. El método de la reivindicación 1 5, en donde el anticuerpo 10 sustituido o su fragmento es un anticuerpo desnudo o fragmento del mismo.

, 1 8. El método de la reivindicación 1 5, que comprende además administrar por lo menos un agente terapéutico al sujeto antes, concurrentemente con o después de la administración del anticuerpo 15 sustituido o su fragmento.

1 9. El método de la reivindicación 1 5, en donde el anticuerpo o i su fragmento esta conjugado con por lo menos un agente terapéutico.

20. El método de la reivindicación 1 5, en donde en donde el anticuerpo sustituido o su fragmento se administra parenteralmente al 20 sujeto en una dosificación de 200 mg o menos, de preferencia 1 00 mg ! o menos, más preferiblemente 80 mg o menos, más preferiblemente 50 mg o menos, lo más preferible 30 mg o menos, en donde la administración es efectiva para tratar la enfermedad inmune mediada por células B, enfermedad autoinmune, otras enfermedades inmunes 25 relacionadas con célula B linfomas o leucemias de célula B . I 174

21. El método de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo sustituido o su fragmento es administrado al sujeto dos o más veces en un intervalo de una a tres semanas.

22. El método de la reivindicación 20, en donde la administración es intravenosa o subcutánea.

23. El método de la reivindicación 20, en donde la administración es subcutánea y en donde la administración subcutánea es más efectiva que la administración intravenosa al matar o inhibir el crecimiento de células CD20 positivas in vivo cuando se administran a un sujeto con células CD20 positivas.

24. El método de la reivindicación 20, en donde la administración del anticuerpo sustituido o su fragmento es efectiva para debilitar los niveles de célula B periférica en el sujeto.

25. El método de la reivindicación 24, en donde la administración es efectiva para debilitar las células B periféricas en el sujeto con una sola dosis de 80 mg7m2 i. v. u 80 mg s. c.

26. El método de la reivindicación 24, en donde la administración es efectiva para debilitar las células C periféricas en el sujeto a una dosificación menor que 80 mg/m2 i. v. o menos de 80 mg s. c. cuando se administra por lo menos una vez, de preferencia cuando se administra dos o cuatro veces al sujeto.

27. El método de la reivindicación 26, que comprende además repetir la administración como se necesite para prevenir o tratar la recaída del sujeto.

28. El método de la reivindicación 17, en donde el anticuerpo 175 sustituido es veltuzumab y la administración veltuzumab a un sujeto quién es refractario al rituximab es efectiva para tratar la enfermedad.

29. El método de la reivindicación 18, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido, boro, un inmunomodulador, una citoquina, una hormona, un antagonista de hormona, una enzima, un inhibidor de enzima, un agente terapéutico fotoactivo, un fármaco citotóxico, una toxina, un inhibidor de angiogénesis, un oligonucleótido, un ARN interferente, un segundo anticuerpo o su fragmento y una combinación de los mismos.

30. El método de la reivindicación 9, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido, boro, un inmunomodulador, una citoquina, una hormona, un antagonista de hormona, una enzima, un inhibidor de enzima, un agente terapéutico fotoactivo, un fármaco citotóxico, una toxina, un inhibidor de angiogénesis, un oligonucleótido, un ARN interferente, un segundo anticuerpo o su fragmento y una combinación de los mismos.

31. El método de la reivindicación 19, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, interferón-alfa, interferón-beta interferón-gamma, TNF-alfa y el factor de crecimiento de célula madre designado factor "S1.

32. Un anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano o su fragmento de unión a antígeno producido mediante el método de la reivindicación 1. 176

33. El anticuerpo anti-CD20 quimérico , humanizado o humano sustituido o su fragmento de la reivindicación 32, en donde las secuencias de CDR de cadena ligera y pesada del anticuerpo sin sustituir son de rituximab y la sustitución comprende reemplazar un residuo de asparagina en la posición 1 01 de Kabat con un residuo de aspartato de VH de CDR3.

34. El anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido o su fragmento de la reivindicación 33, en donde el reemplazo del residuo de asparagina con el residuo de aspartato en la posición 1 01 de Kabat resulta en por lo menos un régimen de disociación dos veces más lento del anticuerpo de CD20.

35. El anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido de la reivindicación 32, en donde el reemplazo del residuo de asparagina en la posición 1 01 de Kabat con un residuo de aspartato resulta en un incremento en la citotoxicidad dependiente de complemento en células Daudi expuestas al anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido.

36. El anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido de la reivindicación 33, en donde el reemplazo del residuo de asparagina en la posición 1 01 de Kabat con un residuo de aspartato resulta en una reducción de 30 a 40% en EC50 en citotoxicidad dependiente de complemento en células Daudi .

37. El anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido o su fragmento de la reivindicación 33, en donde dicho anticuerpo sustituido o su fragmento comprende además un residuo de 177 arginina en la posición 94 de Kabat que forma un enlace iónico con el residuo de aspartato en la posición 101 de Kabat de VH de CDR3.

38. El anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido o su fragmento de la reivindicación 37, en donde dicho anticuerpo o su fragmento comprende además un residuo de valina en la posición 102 de Kabat de VH de CDR3.

39. El anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido o su fragmento de la reivindicación 38, en donde el anticuerpo sin sustituir comprende un residuo de tirosina en la posición 102 de Kabat y el residuo de valina en la posición 102 de Kabat en el anticuerpo sustituido reemplaza al residuo de tirosina.

40. El anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido o su fragmento de la reivindicación 33, en donde dicho anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido o su fragmento comprende secuencias de CDR de cadena ligera CDRL1 (RASSSVSYIH), CDRL2 (ATSNLAS) y CDRL3 (QQWTSNPPT) y secuencias de CDR de cadena pesada CDRH1 (SYNMH), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG) y CDRH3 (STYYGGDWYFDV).

41. El anticuerpo anti-CD20 humanizado sustituido o su fragmento de la reivindicación 40, en donde dicho anticuerpo es veltuzumab.

42. Una proteína de fusión o anticuerpo biespecífico o su fragmento de unión a antígeno comprende el anticuerpo quimérico, humanizado o humano, sustituido o su fragmento de la reivindicación 32. 178

43. La proteína de fusión o anticuerpo biespecífico de la reivindicación 42, que comprende además un segundo anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno.

44. La proteína de fusión o anticuerpo biespecífico de la reivindicación 43, en donde el segundo anticuerpo o su fragmento que se une a un antígeno asociado con un tumor o un hapten en un constructo seleccionable como objetivo

45. La proteína de fusión o anticuerpo biespecífico de la reivindicación 44, en donde el antígeno asociado con tumor se selecciona del grupo que consiste de anhidrasa carbónica IX, B7, CCCL19, CCCL2 , CD , CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29. CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-d, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM6, B7, ED-B fibronectina, Factor H, FHL-1 , Flt-3, receptor de folato, GROB, HMGB-1, factor inducible por hipoxia (HIF), HM 1.24, la, factor-1 de crecimiento similar a insulina (ILGF-1), IFN-?, IFN-a, IFN-ß, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1 , MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, NCA-95, NCA-90, la, HLA-DR, tenascina, Le(y), RANTES, T101, TAC, antígeno Tn, antígenos de Thomson-Friedenreich, antígenos de necrosis de tumor, TNF-a, receptores TRAIL (R1 y R2), VEGFR, EGFR, PIGF, factores de complemento C3, C3a, C3b, C5a, C5, y productos de oncogén, 1 79 incluyendo bcl-2 , Kras y c ET.

46. Un método para diagnosticar o detectar una enfermedad en un sujeto, que comprende: a) obtener un anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido o su fragmento de unión a antígeno hecho mediante el método de la reivindicación 2 en donde dicho anticuerpo fragmento está etiquetado con un agente de diagnóstico. b) administrar el anticuerpo anti-CD20 sustituido o su fragmento a un sujeto; y c) tratar la enfermedad en el sujeto, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedad inmune mediada por células B , enfermedad autoinmune, linfoma y leucemia de célula B, enfermedad de injerto versus huésped, rechazo de trasplante de órgano, anemia hemolítica inmune, alosensibilización y crioglobulinemia.

47. El método de la reivindicación 46, en donde dicho agente de diagnóstico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido, un agente radiológico de contraste, un ion paramagnético, un metal, una etiqueta fluorescente, una etiqueta quimioluminiscente, un agente de ultrasonido de contraste y un agente fotoactivo.

48. El método de la reivindicación 18, en donde el agente terapéutico comprende un segundo anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno.

49. El método de la reivindicación 48, en donde el segundo anticuerpo o su fragmento se une a un antígeno seleccionado del grupo 180 que consiste de anhidrasa carbónica IX, B7, CCCL19, CCCL21 , CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-d, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM6, B7, ED-B fibronectina, Factor H, FHL-1, Flt-3, receptor de folato, GROB, HMGB-1, factor inducible por hipoxia (HIF), HM 1.24, la, factor-1 de crecimiento similar a insulina (ILGF-1), IFN-?, IFN-a, IFN-ß, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, AGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, UC2, MUC3, MUC4, NCA-66, NCA-95, NCA-90, la, HLA-DR, tenascina, Le(y), RANTES, T101, TAC, antígeno Tn, antígenos de Thomson-Friedenreich, antígenos de necrosis de tumor, TNF-a, receptores TRAIL (R1 y R2), VEGFR, EGFR, PIGF, factores de complemento C3, C3a, C3b, C5a, C5, y productos de oncogén, incluyendo bcl-2, Kras y cMET.

50. El método de la reivindicación 48, en donde el segundo anticuerpo o su fragmento se selecciona del grupo que consiste de LL1, LL2, RFB4, hA20, 1F5, L243, MN-3, N-15, L19, G250, y L243.

51. Un paquete que comprende: a) un anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido, o su fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 32; b) una jeringa o pluma de autoinyección que contiene el anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano, sustituido o su 1 81 fragmento.

52. El paquete de acuerdo con la reivindicación 51 , en donde el anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano o su fragmento está en una dosificación de entre 1 0 y 180 mg, más preferiblemente entre 1 0 y 1 00 mg, más preferiblemente entre 20 y 80 mg, más preferiblemente entre 30 y 80, más preferiblemente entre 30 y 60 mg, más preferiblemente entre 40 y 50 mg .

53. El paquete de acuerdo con la reivindicación 51 , en donde el anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano o su fragmento esta liofilizado o en una solución estéril , formulado para inyección s. c. o i . v.

54. El paquete de acuerdo con la reivindicación 51 , que comprende además instrucciones para uso del paquete.

55. El método de la reivindicación 1 , en donde el grupo de 6 CDRs del anticuerpo sustituido no es el mismo que el grupo de 6 CDRs de cualquiera uno de veltuzumab, cA20, 1 F5, B9E9, 2H7, 2F2, 7D8, 1 1 B8 , 1 H4 o GA1 01 .

56. El anticuerpo anti-CD20 quimérico, humanizado o humano sustituido o su fragmento de unión a antígeno producido mediante la reivindicación 1 , en donde el grupo de 6 CDRs del anticuerpo sustituido no es el mismo que el grupo de 6 CDRs de cualquiera uno de veltuzumab, cA20, 1 F5, B9E9, 2H7, 2F2, 7D8, 1 1 B8, 1 H4 o GA1 01 .

57. El método de la reivindicación 55, en donde el anticuerpo anti-CD20 humanizado comprende las frecuencias de región de marco del anticuerpo anti-CD20 humanizado, epratuzumab, o las secuencias 1 82 de la región de marco del anticuerpo anti-CD20 humanizado , veltuzumab .

58. El anticuerpo anti-CD20 quimérico , humanizado o h umano, sustituido o su fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivind icación 56 , en donde el anticuerpo anti-CD20 humanizado comprende las secuencias de región de marco del anticuerpo anti-CD20 humanizado , epratuzumab , o las secuencias de región de marco del anticuerpo anti-CD20 humanizado , veltuzumab .

59. El método de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo sustituido o su fragmento se admi nistra al sujeto por lo menos dos veces por semana. 1 83 RESU MEN La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD20 humanizados, quiméricos o humanos, sustituidos o sus fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos o proteínas de fusión que comprenden los anticuerpos sustituidos o sus fragmentos de unión a antígeno. Los anticuerpos, las proteínas de fusión o los fragmentos son útiles para tratamiento de trastornos de célula B , tales como malignidad es de célula B y enfermedades autoinmunes, así como también GVH D, rechazo de trasplante de órganos y anemia hemol ítica y crioglobulinemia. Las sustituciones de aminoácidos, particularmente la sustitución de un residuo de aspartato en la posición 1 01 de Kabat de VH de CDR3 (CDRH3), resulta en propiedades terapéuticas mejoradas, tales como regímenes de disociación disminuidos, actividad de CDC mejorada, apoptosis mejorada, debilitamiento de célula B y eficacia terapéutica mejorada a dosificaciones muy bajas. Veltuzumab, un anticuerpo anti-CD20 humanizado que incorpora tales variaciones de secuencias, exhibe eficacia terapéutica mejorada en comparación con anticuerpos similares de diferente secuencia de CDRH3, que permite el efecto terapéutico a dosificaciones tan bajas como 200 mg o menos, más preferiblemente 1 00 mg o menos, más preferiblemente 80 mg o menos, lo más preferible 30 mg o menos de anticuerpo desnudo cuando se administra i . v. o s. c.