KR101640962B1

KR101640962B1 - 재조합 인간 알파1-항트립신

Info

Publication number: KR101640962B1
Application number: KR1020117027863A
Authority: KR
Inventors: 엘리자베스 씨. 엠. 브링크만; 코넬리스 에리크 핵크; 잉그리드 판 덴 니에우웬호프
Original assignee: 크루셀 홀란드 비.브이.
Priority date: 2009-04-23
Filing date: 2010-04-20
Publication date: 2016-07-19
Also published as: AU2010244592A1; CA2756591C; KR20120096871A; US20120214747A1; IL215537A; WO2010127939A1; PL2421895T3; US8357661B2; EP2421895A1; ES2559007T3; JP5711215B2; IL215537A0; EP2421895B1; CN102439037B; ZA201107416B; EA025021B1; CN102439037A; EA201171275A1; CA2756591A1; AU2010244592B2

Abstract

본 발명은 N-결합 글리칸을 포함하는 재조합 인간 알파1-항트립신 (rhAAT)에 관한 것이고; 여기서 N-결합 글리칸의 적어도 10%가 테트라-안테나 글리칸이고; 그리고 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑(capping) 정도(Z/A)는 적어도 50%이다. 본 발명은 더 나아가 약제로서의 용도, 특히 AAT 결핍 관련 질환 및/또는 호중구-매개 조직 손상을 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료에서의 용도로의 rhAAT에 관한 것이다.

Description

재조합 인간 알파1-항트립신{RECOMBINANT HUMAN ALPHA1-ANTITRYPSIN}

본 발명은 약제학적 제품의 분야, 특히 재조합 인간 α1-항트립신에 관한 것으로, 이것은 그중에서도 α1-항트립신 결핍 관련 폐기종의 예방 및/또는 치료용으로 사용될 수 있다.

α₁-항트립신(AAT) 또는 α₁-프로테아제 억제제(α1PI)는 활성화된 호중구에 의해 방출되는 프로테아제의 천연 억제제이다. AAT는 아미노산 394개로 이루어진 분자량 52kD의 당단백질이다. 인간 AAT는 418 아미노산 전구체로서 발현되고, 여기서 24 아미노산 전구체가 잘려나가 394 아미노산 최종 생성물을 산출한다. AAT는 주로 간에서 합성되지만, 발현은 또한 호중구, 단핵 백혈구 및 대식 세포에서 입증된 바 있다.

낮거나 0인 혈장 AAT 수치는 폐에서 호중구 프로테아제의 경쟁자가 없는 파괴적인 작용 때문에 폐기종의 발병을 일으키는 위험요소이다. AAT 결핍-관련 폐기종의 예방 및/또는 치료를 위해, AAT 증대 요법이 개발되었다(Mulgrew et al., 2007).

현재, AAT-결핍-관련 폐기종 환자는 고용량의 혈장-유래(pd) AAT(60mg/kg/주; Talecris의 프로라스틴^?, Baxter의 아라라스트^? 및 ZLB의 제마이라^?)로 치료된다. AAT-결핍 관련 폐기종을 경감시키기 위해서는 AAT를 대량으로 자주 주입할 필요가 있다. 혈장-유래 물질에 대한 주요 관심사는 제제의 안전성이다. 모든 인간-유래 물질에서와 마찬가지로, pdAAT의 잠재적 위험은 프리온 또는 다른 외래 인자(adventitious agents)에 의한 오염이다. 두 번째 관심사는 혈장 물질의 제한된 가용성(availability)이다.

인간 혈장-유래 AAT는 Asn 잔류물 46, 83 및 247에 N-결합 글리칸 3개를 함유한다. 이와 같은 글리칸들은 대체로 디-(di-) 및 트리-안테나(tri-antennary) 구조들로 이루어진다. 재조합 단백질에서의 글리칸의 높은 수준의 시알릴화는 최적의 약동학(PK)을 위해 상당히 중요하다.

지금까지 AAT의 재조합 생산은 대부분의 재조합 플랫폼에서의 저조한 발현에 의해 제한되었다(Karnaukhova et al., 2006). 재조합 AAT는 트랜스제닉계(transgenic systems)에서 높은 수치로 생산되었으나, 그것의 임상적 전개는 차선의 약동학(PK)과 비-인간적 오염물질들로 인한 안전 문제 때문에 중단되었다(Spencer et al., 2005).

따라서, 활성적이고, 충분한 양을 얻을 수 있고 그리고 유용한 약동학적 특성들을 갖는 재조합 인간 AAT(rhAAT)에 대한 요구가 존재한다.

본 발명에 따라, 적절한 약동학적 프로파일을 갖는 재조합 인간 α₁-항트립신(rhAAT)이 PER.C6 세포에서 대량으로 생산될 수 있음이 밝혀졌다.

본 발명에 도달한 연구조사에서, 인간 AAT를 발현하고 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제(ST3) 또는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제(ST6)를 공-발현(co-expressing)하는 세포주가 무혈청 조건 하에서 생성되었다. 이와 같은 세포주는 높은 수치의 rhAAT를 발현할 수 있었다. 따라서, rhAAT의 최대 수율이 22 피코그램/세포/일(pcd)에 도달하였다. 본 발명의 rhAAT가 호중구 엘라스타제 억제제로서 활성을 갖는다는 것이 밝혀진 점이 중요하다. 글리칸 프로파일의 분석은 시알산에 의한 양호한 캡핑(capping) 정도를 나타내었다. 흥미롭게도, 혈장-유래 AAT(프로라스틴^?)와 비교해 볼 때, 본 발명의 rhAAT에서 테트라-안테나(tetra-antennary) 글리칸의 증가가 주목되었다. 게다가, ST3를 공-발현하는 세포에서 생산된 rhAAT는 혈장-유래 AAT와 비교할 때, 래트에게서 증가된 평균 체류 시간(MRT)을 나타내었다. ST6을 공-발현하는 세포에서 생산된 rhAAT는 혈장-유래 AAT와 비교할 때, 감소된 평균 체류 시간을 나타내었다.

한 면에서, 본 발명은 따라서 N-결합 글리칸들을 포함하는 재조합 인간 α1-항트립신(rhAAT)을 제공하고, 여기서:

(a) N-결합 글리칸의 적어도 10%는 테트라-안테나 글리칸이고; 그리고

(b) N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도(Z/A)는 적어도 50%이다.

또 다른 구현예에서, 상기 N-결합 글리칸의 적어도 20%는 테트라-안테나 글리칸이다.

추가 구현예에서, 상기 테트라-안테나 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도는 적어도 30%이다.

추가 구현예에서, 상기 N-결합 글리칸 상에서 총 시알릴화의 적어도 50%는 α-2,3-시알릴화이다. 바람직하기는, 상기 N-결합 글리칸 상에서 총 시알릴화의 적어도 90%는 α-2,3-시알릴화이다.

추가 면에서, 본 발명은 상기 rhAAT를 포함하는 제제 및 약제학적 조성물과, 그리고 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 제공한다.

또 다른 면에서, 본 발명은 그중에서도 AAT-관련 폐기종 및/또는 호중구-매개 조직 손상으로 인한 염증성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한, 상기 rhAAT, 그리고 상기 rhAAT를 포함하는 제제 및/또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

추가 구현예에서, 본 발명은 재조합 인간 α1-항트립신의 생산 방법을 제공하는데, 이 방법은 인간 α1-항트립신을 인코딩하는 핵산을 PER.C6 세포에 제공하여 상기 PER.C6 세포가 상기 핵산을 발현 가능한 형태로 함유하게 하고; 그리고 상기 재조합 인간 AAT의 생산에 유리한 조건 하에서 상기 PER.C6 세포를 배양하는 단계들을 포함하고, 여기서 상기 PER.C6 세포는 α2,3 시알릴트랜스퍼라제 또는 α2,6-시알릴트랜스퍼라제를 공-발현하도록 변형된다.

도 1. α2, 3 시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 세포주(A: PER.C6-AAT-ST3)와 α2,6-시알릴트랜스퍼라제를 과발현하는 세포(B: PER.C6-AAT-ST6) 둘에 대한 배치(batch) 배양액의 비생산성(specific productivies)의 빈도 분포.
도 2. 콜로이드 블루로 염색된, (정제되지 않은) PER.C6-rAAT 샘플들의 세포 배양 수확물들을 포함한 4~12% BIS-트리스 SDS-PAGE 겔.
도 3. AAT에서 글리칸의 시알릴화의 정도를 Z/A 비율로 계산하기 위한 분석의 도식적 개요.
도 4. AAT를 발현하는 PER.C6 세포주의 비생산성들은 PER.C6-rAAT의 글리칸의 시알릴화의 정도와 상관 관계가 없다(스피어만 상관계수 r=-0.024, p=0.893). (◆: PER.C6-AAT-ST3; ○: PER.C6-AAT-ST6).
도 5. ECL 포지티브 FIG 샘플 및 프로라스틴^?에서 유래된 PER.C6-rAAT의 글리칸과 비교하여 ECL 네거티브 샘플에서 유래된 PER.C6-rAAT의 글리칸의 시알릴화 (도 5A) 및 안테나 구조성(antennarity)(도 5B)
도 6. PER.C6-rAAT-ST6 및 프로라스틴^?의 글리칸과 비교하여 PER.C6-rAAT-ST3의 모든 글리칸(도 6A) 그리고 테트라 안테나 글리칸(도 6B) 상에서 시알릴화의 정도.
도 7. 래트에게 정맥주사 투여 이후 완충용액(PBS/T) 또는 PER.C6-CM 중의 다양한 용량의 프로라스틴^?에 대한 혈장 농도-시간 프로파일.
■:PER.C6-CM 중의 프로라스틴^?50 ㎍/kg; ▲:PER.C6-CM 중의 프로라스틴^?100 ㎍/kg:
●:PER.C6-CM 중의 프로라스틴^?200 ㎍/kg; ○:PBS/T 중의 프로라스틴^?2000 ㎍/kg.
도 8. PER.C6-rAAT-ST3, PER.C6-rAAT-ST6 및 프로라스틴^?에 대한 혈장 농도-시간 프로파일.
▲:PER.C6-rAAT-ST3, MRT ~18~23시간; ■:PER.C6-rAAT-ST6, MRT ~4~4시간, ●:프로라스틴^?, MRT ~11~12시간.
도 9. AAT 발현 벡터 pAATopt-ST3(A)와 pAATopt-ST6(B)의 플라스미드 맵. CMV=거대세포바이러스 프로모터, BGHp(A)= 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 염기서열, f1 ori= f1 복제 개시점, SV40=원숭이 바이러스(Simian Virus) 40 프로모터, Neo=네오마이신 저항 표지자, SV40p(A)=원숭이 바이러스 40 폴리아데닐화 염기서열, AAT= 알파₁-항트립신, ColE1=ColE1 복제 개시점, Amp=암피실린 저항 표지자, SIAT4C= ST3(인간 시알릴트랜스퍼라제 IV(L23767))에 대한 유전자 코딩(도 9A), SIAT1= ST6(인간 시알릴트랜스퍼라제 I(NM_003032))에 대한 유전자 코딩.

알파₁-항트립신(AAT)은 활성화된 호중구에 의해 방출된 프로테아제의 천연 억제제이다. AAT는 혈장에 분비되지만, 그것의 주요 작용지점은 폐실질이다. 인간 백혈구 엘라스타제(HLE)(또한 인간 호중구 엘라스타제(HNE)로 알려짐)는 정상적인 염증성 반응의 일부로서 호중구의 아주르 친화성 과립(azurophilic granules)에서 분비되는 세린 프로테아제이다. 정상적인 항상성 조건 하에서, AAT는 인간 백혈구 엘라스타제(HLE)에 의한 단백질 가수분해(proteolysis)의 중요한 조절인자(regulator)로 작용하고, 그로써 폐포 망(matrix)의 손상을 방지한다. AAT는 HLE뿐만 아니라 또한 호중구에 의해 양쪽 폐에 분비되는 서로 다른 두 프로테아제, 즉 카텝신 G(catG)와 프로테아제 3(Pr3)을 억제한다.

혈장-유래 AAT 제품이 개발되어 현재 프로라스틴^?(Talecris), 아라라스트^?(Baxter) 및 제마이라^?(ZLB)와 같이, AAT-결핍(즉, 혈장 AAT 수치가 낮거나 또는 0이다) 관련 폐기종을 앓는 환자들의 치료를 위해 사용되고 있다. 각각의 환자에게는 일반적으로 이들 제품의 많은 양(대략 60mg/kg/주)이 요구된다. 폐기종뿐만 아니라, AAT는 또한 호중구-매개 손상이 있는 염증성 질환을 위한 (잠재적) 치료제다.

예를 들어, 대장균에서의 AAT 재조합 생산은 대부분의 재조합 플랫폼에서의 저조한 발현에 의해 제한된 바 있다(Karnaukhova et al., 2006). 재조합 AAT는 트랜스제닉계에서 높은 수치로 생산되었으나, 그것의 임상적 전개는 차선의 약동학 (PK)과 비-인간적 오염물질들로 인한 안전 문제 때문에 중단되었다(Spencer et al., 2005).

본 발명은 이제 적절한 약동학적 특성들을 갖고 예를 들면 PER.C6 세포에서 대량으로 생산될 수 있는 재조합 인간 α1-항트립신 (rhAAT)을 제공한다. 본 발명의 재조합 AAT는, 인간 호중구 엘라스타제의 억제에 기초한 비색법(chromogenic assay)에 의해 측정되는 바와 같이, 기능적으로 활성이고, 프로라스틴^?과 같은 혈장-유래 AAT 제품과 비교되는 유망한 약동학적 특성들을 갖는 것으로 나타났다.

본 발명은 따라서 N-결합 글리칸을 포함하는 rhAAT를 제공하고, 여기서

a) N-결합 글리칸의 적어도 10%는 테트라-안테나 글리칸이고; 그리고

b) N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도(Z/A)는 적어도 50%이다.

N-결합 글리칸은 폴리펩타이드의 아스파라긴 잔류물에 공유결합된 당사슬(sugar chains)이다(Varki et al. 1999). N-글리코실화 반응은 돌리콜 올리고당 전구체의 아스파라긴 전구체 부착으로 시작된다. 이와 같은 전구체는 추후에 고-만노오즈형, 혼합형(hybrid) 또는 복합형 올리고당으로 변형된다. 복합형 N-결합 당에서, α3- 및 α6-결합 만노오즈 잔류물은 둘 다 N-아세틸-글루코사민(GlcNAc) 잔류물로 치환된다. 복합형 N-글리칸은 안테나(antennae)라고 부르는 GlcNAc-함유 분지 2~5개를 함유할 수 있다. 복합형 N-결합 당의 궁극적인 구조는 광범위하게 다를 수 있는데, 그들이 부착되는 단백질과 숙주 세포 그리고 이와 같은 숙주 세포가 배양되는 환경조건들에 좌우된다. GlcNAc-함유 분지는 갈락토오스(Gal) 또는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)으로 변형되어 일명 LacNAc 또는 LacdiNAc 구조들을 형성할 수 있다. 또한 GlcNAc-함유 분지는 다중 LacNAc 구조를 함유하여 일명 폴리락토사민 구조를 형성할 수 있다. 말단 갈락토오스는 α2,3- 또는 α2,6-결합 시알산에 의해 변형되는 반면, 말단 N-아세틸-갈락토소민은 α2,6-결합 시알산에 의해서만 변형될 수 있다. 말단 Gal 또는 GalNAc에 시알산의 첨가는 시알릴트랜스퍼라제에 의해 매개된다. 20개가 넘는 서로 다른 시알릴트랜스퍼라제가 인간 게놈에 의해 인코딩돼 있을 것이다(Harduin-Lepers et al., 2001). 이들은 기질 특이성, 조직 분산 및 다양한 생화학적 매개변수의 측면에서 서로 다르다.

천연 AAT는 글리코실화 자리가 3개다. 따라서, AAT는 분지결합(branching)이 일어날 수 있는 N-결합 글리칸 3개를 포함한다. 이와 같은 글리칸은 2,3 또는 4-분지, 일명 "안테나"를 갖는다. 놀랍게도, 본 발명의 rhAAT의 N-결합 글리칸의 적어도 10%, 바람직하기는 약 10% 내지 약 50%가 테트라-안테나 글리칸이다. 또 다른 구현예에서, N-결합 글리칸의 적어도 20%가 테트라-안테나 글리칸이고, 바람직하기는 N-결합 글리칸의 약 20~40%가 테트라-안테나 글리칸이다. 본 발명에 따르면, 놀랍게도 예를 들어 안테나 구조성(antennarity)과 같은 글리코실화 프로파일과 본 발명의 rhAAT의 평균 체류 시간과 같은 약동학적 특성들은 프로라스틴^?과 같은 혈장-유래 AAT와 다름이 밝혀졌다.

재조합 단백질 상에서 글리칸의 온전한 시알릴화는 최적의 약동학적 특성들에 있어 중요하기 때문에, 본 발명의 rhAAT는 시알릴트랜스퍼라제와 조합된 PER.C6 세포에서 발현됨으로써 rhAAT의 상당히 시알릴화된 이소포름을 달성한다. 따라서 PER.C6 세포는 α2,3 시알릴트랜스퍼라제(PER.C6-ST3) 또는 α2,6 시알릴트랜스퍼라제(PER.C6-ST6) 중 하나에 의해 공-형질감염(co-transfected)된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, N-결합 글리칸 상에서 총 시알릴화의 적어도 50%는 α-2,3-시알릴화이다. 예를 들어, N-결합 글리칸 상에서 총 시알릴화의 적어도 50, 70 또는 80%는 α-2,3-시알릴화이다. 그러나 또 다른 구현예에서는, N-결합 글리칸 상에서 총 시알릴화의 적어도 90%는 α-2,3-시알릴화이다. 놀랍게도, 이와 같은 구현예들에서, 본 발명의 rhAAT는 프로라스틴^?과 같은 혈장-유래 AAT와 비교하여, 특히 장기화된 평균 체류 시간과 같이 서로 다른 약동학적 특성들을 갖는다. 시알릴화란 AAT 탄수화물 구조에 존재하는 시알산 잔류물의 양을 의미한다: α-2,3-시알릴화는 2, 3 위치에서의 시알릴화, 즉 α2,3-결합 시알산(종래의 기술에 잘 알려진 바와 같이)을 뜻하고, α2,6-시알릴화는 2, 6 위치에서의 시알릴화, 즉 2,6-결합 시알산(또한 종래 기술에 알려진 바와 같이)을 뜻한다. "N-결합 글리칸 상에서 총 시알릴화의 적어도 50%는 α-2,3-시알릴화이다"라는 것은 따라서 rhAAT에 존재하는 시알산 잔류물의 총 개수의 적어도 50%가 2, 3 위치에서 시알릴화되었다는 뜻이다.

본 발명에 있어서, 래트의 PK 연구에서, PER.C6-ST3에 의해 생산된 rhAAT (rhAAT-ST3)와 PER.C6-ST6에 의해 생산된 rhAAT(rhAAT-ST6) 둘 다의 평균 체류 시간(MRT)은 혈장-유래 AAT(프로라스틴^?)의 그것과 현저히 다름이 나타났다. 따라서, 래트에서 rhAAT-ST3의 MRT는 대략 18~23시간이고, 한편 래트에서 프로라스틴^?의 MRT는 대략 11~12시간임이 밝혀졌다. 장기화된 MRT를 갖는 rhAAT의 사용은 예를 들어 환자 1명당 요구되는 용량을 감소시킬 수 있다. 대조적으로, 래트에서 rhAAT-ST6의 MRT는 프로라스틴^?의 것과 비교하여 감소된다(대략 3~4시간). 본 발명의 rhAAT-ST6의 사용은 프로라스틴^?과 같은 혈장-유래 AAT에서의 시알산 결합에 대응하는,“좀 더 자연스러운”시알산의 2,6-결합으로 인해 이로울 수 있을 것이다. rhAAT-ST6의 사용은 더 나아가 감소된 MRT가 이로울 수 있는 경우에 이익이 될 수 있다.

상기와 같이, 재조합 단백질 상의 글리칸의 시알릴화의 정도는 최적의 약동학적 특성들에 있어 중요하다. 바람직한 구현예에서는, 따라서 본 발명의 rhAAT의 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 총 캡핑 정도(Z/A 비율로 계산될 때)는 적어도 70%이다. 더 바람직하기는, N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도(Z/A)는 적어도 80%이고, 훨씬 더 바람직하기는 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도(Z/A)는 적어도 90%이다.

추가 구현예에서, 상기 테트라-안테나 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도는 적어도 20%로, 예를 들어 20~65%이다. 테트라-안테나 N-글리칸 상에서 시알릴화의 비교적 낮은 정도는, 혈장-유래 AAT와 비교할 때, 감소된 MRT를 갖는 rhAAT 제품을 생산한다. 또 다른 구현예에서, 테트라-안테나 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도는 적어도 50%, 예를 들어 50~97%이고, 바람직하기는 적어도 60%, 더 바람직하기는 70~95%이다. 이와 같은 구현예에서 시알릴화의 더 높은 수치는, 혈장-유래 AAT와 비교할 때, MRT의 장기화에 기여할 수 있다.

본 발명은 더욱이 상기 rhAAT와 선택적으로는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제제 및 약제학적 조성물을 제공한다. "약제학적으로 허용가능한 부형제"란 적절한 또는 편리한 복용 제형을 제조하기 위해 활성 분자(약물, 시약 또는 단백질 등)와 결합되는 모든 불활성 물질을 뜻한다. "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 활용되는 용량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이고 활성 분자를 포함하는 제형의 다른 성분들과 양립될 수 있는 부형제이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당업자에게 잘 알려진 모든 투여 방식을 위해 다양한 조성물로 제형될 수 있다. 약제학적 조성물의 최적의 투여 방식의 선택은 예를 들어 조성물 내 활성 분자들의 물리-화학적 특성들, 임상적 상황의 시급성 및 활성 분자의 혈장 농도와 원하는 치료 효과의 관계를 비롯하여, 여러 요인들에 의해 결정된다. 본 발명의 제제 및 약제학적 조성물은 바람직하기는 정맥주사 투여 또는 에어로졸 투여를 위해 제형된다. 약제학적으로 적절한 rhAAT의 제형은 당업자에게 알려진 방법들에 따라 제조될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company(1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis(2000); and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press(2000) 참조).

통상적으로, 약제학적 조성물은 제조 및 보관의 조건 하에서 멸균 상태이고 안정적이어야 한다. 본 발명의 rhAAT를 포함하는 제제 및/또는 약제학적 조성물은 출하(delivery) 이전 또는 그 시점에 약제학적으로 허용가능한 적합한 부형제에서 재구성되도록 하기 위해 분말 형태로 존재할 수 있다. 멸균된 주입 가능한(injectable) 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조의 바람직한 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 원하는 모든 추가 성분들과 함께 활성 성분의 분말을 산출하는 진공 건조법 및 동결-건조(lyophilization)법이다.

선택적으로, 본 발명의 rhAAT는 용액에 존재할 수 있고, 출하 이전 또는 그 시점에 약제학적으로 허용가능한 적합한 부형제가 첨가 및/또는 혼합되어 단위 용량 주입가능 제형을 제공할 수 있다.

이와 같은 rhAAT, 상기 rhAAT를 포함하는 제제 또는 약제학적 조성물은 약제로 사용될 수 있다. 이와 같은 rhAAT, 제제 및 약제학적 조성물은 AAT의 투여가 이롭다고 입증된 바 있는 질환 및/또는 장애의 예방 및/또는 치료에 적절하게 사용될 수 있다. 이들은 그중에서도 AAT-결핍-관련 폐기종의 예방 및/또는 치료, 또는 그들의 조합에 사용될 수 있다. 본 발명의 rhAAT, 제제 또는 약제학적 조성물은 더 나아가 흡연-관련 폐기종, 낭포성 섬유증(CF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. AAT가 항염증 및 세포소멸 억제 효과가 있다고 기술된 바 있기 때문에, 본 발명의 rhAAT, 제제 또는 약제학적 조성물은 또한 항염증제로 사용될 수 있을 것이다(Lewis et al., 2008; Koulmanda et al., 2008).

추가 구현예에서, 본 발명은 재조합 인간 α1-항트립신의 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 인간 α1-항트립신을 인코딩하는 핵산을 PER.C6 세포에 제공하여 상기 PER.C6 세포가 상기 핵산을 발현 가능한 형태로 함유하게 하고; 그리고 상기 재조합 인간 α1-항트립신의 생산에 유리한 조건 하에서 상기 PER.C6 세포를 배양하는 단계들을 포함하고, 여기서 상기 세포는 추가로 이종(heterologous) 프로모터의 제어 하에 시알릴트랜스퍼라제를, 바람직하기는 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제 또는 알파-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산 염기서열을 함유한다. 한 구현예에서, 시알릴트랜스퍼라제는 인간 시알릴트랜스퍼라제이다. 본 발명의 rhAAT는 그러나 또한 예를 들어 293 세포와 같이, 선택적으로 시알릴트랜스퍼라제를 공-발현하는, 다른 포유류 세포에서 생산될 수도 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 재조합 인간 α1-항트립신의 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 인간 α1-항트립신을 인코딩하는 핵산을 PER.C6 세포에 제공하여 상기 PER.C6 세포가 상기 핵산을 발현 가능한 형태로 함유하게 하고, 여기서 상기 세포는 추가로 이종 프로모터의 제어 하에서 시알릴트랜스퍼라제를, 바람직하기는 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제 또는 알파-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산 염기서열을 함유하고; 그리고 무혈청 배지에서 상기 PER.C6 세포를 배양하여 상기 세포에서 상기 인간 α1-항트립신의 발현을 허용하고; 상기 세포 및/또는 상기 배양 배지에서 발현된 인간 α1-항트립신을 수확하고; 그리고 선택적으로 상기 인간 α1-항트립신을 정제하는 단계들을 포함한다.

관심 대상인 단백질을 위한 생산 플랫폼으로서의 PER.C6 세포의 사용은 WO 00/63403에 기술된 바 있고, 여기서 개시된 내용은 참고문헌에 의해 본 명세서에 병합되었다. WO 00/63403에 나타난 바와 같이, PER.C6은 재조합 단백질의 생산을 위해 적절하게 사용될 수 있다. 세포 배양을 통해 재조합 단백질의 대규모 (지속적) 생산을 달성하기 위해, 앵커리지(anchorage)의 필요 없이 성장할 수 있는 세포들을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포는 그와 같은 능력이 있다. 본 발명에 따른 PER.C6 세포는 2006년 2월 29일 응용 미생물학 연구 센터 및 유럽 세포 배양 수집(ECACC)에 ECACC no. 96022940(U.S. 특허 제5,994,128호 참조) 하에 기탁된 세포의 상부 또는 하부 계대(passage) 배양 또는 상부 또는 하부 계대 배양의 후손에서 유래된 세포이다. 산업 공정을 위한 PER.C6 세포의 사용은 예를 들어 Nichols et al, 2002 등에 광범위하게 기술되었고, 더 특별하게는 재조합 단백질 생산을 위한 사용은 특히 Yallop et al, 2005a 및 2005b에 기술되었다.

본 발명에 따른 세포, 특히 PER.C6 세포는 동물- 또는 인간-유래 혈청, 또는 동물- 또는 인간-유래 혈청 성분들의 부재 중에 배양될 수 있다는 추가적인 이점이 있다. 따라서 단리(isolation)가 좀 더 용이하고, 한편 배양액 중의 추가적인 인간 또는 동물 단백질이 없기 때문에 안전성이 향상되고, 그래서 시스템은 매우 신뢰할 만하다(합성 배지는 재현성(reproducibility)에서 최상의 선택이다). 더욱이, 아데노바이러스의 조기 유전자 부위(Early region 1A) ("E1A")의 존재는 이와 같은 특별한 유전자가 없는 (인간) 세포주와 비교해 또 다른 수준의 이점들을 부가한다. 전사 활성 인자(transcriptional activator)로서의 E1A는 CMV 즉각 조기 유전자(Immediate Early genes)의 인핸서(enhancer)/프로모터로부터 전사를 향상시키는 것으로 알려져 있다(Olive et al., 1990, Gorman et al., 1989). 생산될 재조합 단백질이 CMV 인핸서/프로모터의 제어 하에 있을 때, 발현 수치는 세포에서 증가하고 E1A가 부족한 세포에서는 증가하지 않는다.

일반적으로, PER.C6 세포와 같은 숙주 세포에서 rhAAT와 같은 재조합 단백질의 생산은 숙주 세포 내 발현가능 형태로의 핵산의 도입, 핵산의 발현에 유리한 조건 하에서의 세포 배양 및 상기 세포에서의 상기 핵산의 발현의 허용을 포함한다. 선택적으로, 원하는 숙주 세포에서 자연적으로 발현되나 충분한 수치로 발현되지 않는 단백질은 작동 가능하게 연결된 강력한 프로모터와 같은 적당한 조절(regulation) 염기서열들을 도입함으로써 증가된 수치로 발현될 수 있을 것이다(WO 99/05268 참조, 여기서 내생적(endogenous) EPO 유전자가 인간 세포 중의 유전자의 상부의 강력한 프로모터의 도입에 의해 과발현된다).

발현 가능한 포맷으로 AAT를 인코딩하는 핵산은 발현 카세트의 형태로 존재할지도 모르고, 일반적으로 인핸서(들), 프로모터, 폴리아데닐화 시그널 등과 같이 핵산의 발현을 초래할 수 있는 염기서열을 필요로 한다. 몇몇 프로모터들은 재조합 핵산의 발현을 위해 사용될 수 있고, 그리고 이들은 바이러스성, 포유류성, 합성 프로모터 등을 포함할 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 관심대상인 핵산의 발현을 구동하는 프로모터는 CMV 즉각 조기 프로모터로, 예를 들면 CMV 즉각 조기 유전자 인핸서/프로모터에서 nt. -735 ~ +95를 포함하는데, 이와 같은 프로모터는 아데노바이러스의 E1A를 발현하는 세포에서 높은 발현 수치를 제공하는 것으로 나타났기 때문이다(WO 03/051927 참조). 관심대상인 핵산은 게놈성(genomic) DNA, cDNA, 합성 DNA, 이들의 조합 등일 수 있을 것이다.

세포 배양 배지는 다양한 판매사로부터 구입 가능하고, 무혈청 배양 배지는 오늘날 종종 세포 배양을 위해 사용되는데, 그 이유는 이들이 혈청 함유 배지보다 더 뚜렷한 특징을 갖기 때문이다. 본 발명의 세포는 무혈청 배지뿐만 아니라 혈청-함유 배지에서도 잘 자란다. 본 발명의 세포는 일반적으로 혈청-함유 배지에서 점착하여 자라지만, 무혈청 배양 배지에서 세포 밀도가 높은(10x10⁶세포/ml 이상) 현탁액에서 매우 잘 자라는데, 이것은 이들 세포가 점착될 표면이 필요 없고, 그러나 대부분의 시간 동안 비교적 서로에 대해 그리고 배양 용기의 벽으로부터 자유롭게 존재한다는 뜻이다. 본 발명의 세포를 고밀도로 배양하고 그리고/또는 이와 같은 세포들로부터 매우 높은 생산 수득율을 얻기 위한 방법들이 기술되었다(WO 2004/099396).

세포에서 생산된 재조합 단백질의 글리코실화 반응을 변형하는 유전공학의 개념은 충분히 확립된 바 있고, 그리고 예를 들어 US 2005/0164386에서 상세히 다뤄지고 있다. 이와 같은 목적에서, 원하는 글리코실화 효소를 발현가능한 포맷으로 인코딩하는 핵산은 본 발명에 따른 세포에 도입되거나 또는 도입된 바 있고, 원하는 글리코실화 효소는 관심대상인 단백질이 발현될 때 본 발명에 따른 세포의 배양 중에 발현된다. 이것은 재조합 글리코실화 효소가 상기 세포에서 발현되지 않을 때의 상황과 비교하여, 관심대상인 단백질의 변형된 글리코실화 패턴을 낳는다. 본 발명에서, 글리코실화 효소는 시알릴트랜스퍼라제이고, 더 바람직하기는 알파-2,3-시알릴트랜스퍼라제 및/또는 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제이다. 바람직하기는 인코딩된 시알릴트랜스퍼라제는 포유류 시알릴트랜스퍼라제이고, 더 바람직하기는 인간 시알릴트랜스퍼라제이다. 시알릴트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산은 바람직하기는 이종 프로모터의 제어 하에 존재하고, 이것은 활성이거나 또는 본 발명의 세포 중에서 조절될 수 있는 가능성이 있어야 한다. 바람직하기는, 시알릴트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산은 상기 세포의 게놈에 통합되어, 안정된 유전을 보장하고 상기 세포의 추후 재생에서 시알릴트랜스퍼라제의 안정된 발현을 지원한다.

본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 방법들에 의해 얻어질 수 있는 재조합 인간 AAT를 제공한다. 본 방법에 따른 rhAAT는 단리된 천연 인간 대응(counterpart) 단백질과는 다른 인간 글리코실화 패턴을 갖는다. 본 발명은 특히 N-결합 글리칸들을 포함하는 rhAAT를 제공하고, 여기서 N-결합 글리칸의 적어도 10%는 테트라-안테나 글리칸이다. 게다가, 본 발명에 따라 얻을 수 있는 rhAAT는 놀라운 약동학적 특성들을 갖는다.

본 발명에 따른 재조합 인간 AAT는 전 길이(full-length)의 인간 AAT를 포함할 뿐만 아니라, 예를 들어 단백질의 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 결실(deletions)을 가진 인간 AAT의 단편(fragments)과 같은 생물학적 활성 폴리펩타이드 단편뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어 보전적 치환), 하나 이상의 아미노산 결실 또는 부가(addition)를 갖는 AAT와 같은 인간 AAT의 생물학적으로 활성인 변이들(variants)을 포함할 수 있는데, 이들은 상기 단백질의 기능적 활성을 현저히 바꾸지 않는다. 한 구현예에서, 본 발명의 rhAAT는 본 명세서에 SEQ ID NO: 1로서 제공된 아미노산 염기서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAT 변이의 아미노산 염기서열은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 SEQ ID NO:1에 상동하다.

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예들에 의해 추가로 기술된다.

실시예

실시예 1

세포주 생성 및 비생산성 ( specific productivities )

인간 AAT를 발현하고 α2,6-시알릴트랜스퍼라제(SIAT1; NM_003032) 또는 α2,3-시알릴트랜스퍼라제(SIAT4C; L23767)(PER.C6-AAT-ST3/PER.C6-AAT.ST6) 중 하나를 공-발현하는 PER.C6 세포주 700개를 WO 2006/070011에 기술된 대로, 무혈청 조건 하에서 생성하였다. 유전자 주입 도구로 핵 감염(nucleofection)을 사용하는 독립적인 세포주 생성 프로그램으로부터 ELISA(AAT Elisa Kit, US Biologicals)에 의해 측정된 최고 수율을 기반으로, AAT-ST3(세포주 27개) 또는 AAT-ST6(세포주 20개)를 생산하는 무혈청 PER.C6 세포주 47개를 선택하였다. 발현 플라스미드는 둘 다 PER.C6 세포에서 높은 수치의 유전자 발현을 달성하기 위해 변형된 바 있는 거대세포바이러스 프로모터에 의해 구동되는(Yallop et al, 2005), 인간 AAT에 대한 코딩 염기서열(SEQ ID NO:2)과 인간 ST3GalIV에 대한 코딩 염기서열을 함유하였다. AAT 발현 벡터들(pAATopt-ST3 및 pAATopt-ST6)의 플라스미드 맵을 도 9에 나타내었다.

세포주의 생산성은 8~22피코그램/세포/일(pcd)(PER.C6-AAT-ST3)과 7~19 pcd(PER.C6-AAT-ST6)사이로 다양했다(도 1 및 표 1과 2 참조). 상기 세포주를 Proper-1 배지(Lonza)(유리병 6개, 3~5x10⁶세포/ml)에 냉동보관하여, 모든 수탁 허용 기준(생육력>80%, 양호한 성장 2 계대(passage) 후 소생(resuscitation))을 충족시켰다. 배치(Batch) 배양액을 생성하였고(Proper-1 배지에서), 이것을 생화학적 분석에 사용하였다(실시예 2 참조).

실시예 2

생화학적 분석

PER . C6 - rAAT 의 온전성

배치 배양액 47개의 상청액을 콜로이드 블루로 염색된 SDS-PAGE에서 분석하였다. PER.C6-rAAT(비-정제) 샘플의 세포 배양 수확물은 SDS-PAGE에서 주요 단백질 밴드로서 AAT를 나타내었다. 더욱이, 겔은 물질의 온전성(integrity)을 나타내는 온전한 AAT 밴드(도 2에 나타냄)를 나타냈다.

PER . C6 - rAAT 의 활성

애초에(비색 활성 분석법 대신), 인간 호중구 엘라스타제와의 PER.C6-rAAT의 복합체의 형성을 분석함으로써 활성에 대한 표식을 측정하였다. 이를 위해, PER.C6-rAAT 샘플의 세포 배양 수확물을 37℃에서 30분 동안 엘라스타제 0, 0.1, 0.2 및 0.4㎍으로 배양하였고, 추후에 4~12% BIS-트리스 SDS-PAGE에 적용하여, 콜로이드 블루로 염색하였다. 검사대상인 모든 PER.C6-rAAT 샘플들은 엘라스타제와 복합체를 형성하였는데(데이터 없음), 이것은 제제의 활성을 나타낸다. 참조로서 프로라스틴^?을 사용하여 인간 호중구 엘라스타제의 억제작용을 기초로 비색분석법으로 추가 활성 검사를 수행하였다(Bruin et al., 2005에서 발췌). 하나(PER.C6-rAAT-ST3-234c)를 제외한 모든 검사대상 PER.C6-rAAT 샘플은 적어도 프로라스틴^?만큼 활성(>90%)을 띄었다(표 1 및 2).

PER . C6 - rAAT 의 글리칸 분석

함유된 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도가 비교적 높은 PER.C6-rAAT 샘플을 검사하기 위해(최적의 PK 프로파일을 위해 필요), 노출된 갈락토오스의 검출을 위해 에리스리나 크리스타갈리(Erythrina cristagalli ) 렉틴(ECL)을 사용하여 렉틴 분석법을 적용하였다(사용된 분석의 도식적 개요는 도 3 참조). 검사대상인 샘플 47개 중에서, 15개는 OD405(>블랭크(blank) + 0.2 )에서 ECL 시그널을 나타냈고, 이것은 이와 같은 AAT 샘플들 중의 글리칸에서 말단 갈락토오스의 비교적 높은 노출 정도를 나타낸다. 이들 샘플 중 몇몇의 경우, HPLC-기초 방법을 사용한 추가 글리칸 분석(Hermentin et al., 1996; Gervais et al., 2003)으로 시알산에 의한 글리칸의 낮은 캡핑 정도를 확인하였다. 따라서, OD405(> 블랭크 + 0.2)에서 ECL 시그널을 갖는 rhAAT 샘플들은 추가로 확장된 글리칸 분석을 수행하지 않았고 PK 연구에서 검사하지 않았다.

도 3에 도식적으로 나타낸 확장된 글리칸 프로파일링 방법은 효소 N-글리코시다제 F(PNGaseF)에 의한 AAT로부터의 N-결합 글리칸의 방출과 형광 2-안트라닐산(2-aa)에 의한 글리칸 라벨링(labelling)을 포함하였다. 추후에, 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)로 글리칸을 음전하에 따라 여러 군으로 분리하였는데, 즉 이것은 시알산의 개수가 다른 글리칸들의 분리를 뜻한다. 상기 프로파일에서, N-결합 글리칸의 전하(즉,시알릴화) 정도를 나타내는 Z-개수를 계산하였다.

Z에 대한 공식:

Z = (A_아실아로x0)+(A_{모노시알로}x1)(A_디시알로x2)+(A_{트리시알로}x3)+(A_{테트라시알로}x4) (A=면적, Hermentin et al., 1996).

더욱이, 탈시알릴화된(desialylated) 글리칸들을 그들의 크기에 따라 정상 크로마토그래피(NP)에 의해 여러 군으로 분리하였는데, 즉 이것은 서로 다른 안테나 구조성(antennarity)의 정도를 갖는 글리칸들의 분리를 뜻한다. 상기 프로파일에서, N-결합 글리칸의 분지성의 정도를 나타내는 A-개수를 계산하였다.

A에 대한 공식:

A = (A_{디-안테나}x2)+(A_{트리-안테나}x3)+(A_테트라 _-안테나x4).

마지막으로, Z/A 비율을 계산함으로써, 당단백질의 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑의 정도(백분율)를 얻었다(Gervais et al., 2003).

PER.C6-rAAT의 글리칸 프로파일들은 표 1과 2에 나타내었다. PER.C6-rAAT 샘플들의 총 프로파일들(표 1과 2)은 디-안테나(di-antennae)가 12~54%, 트리-안테나(tri-antennae)가 13~39% 그리고 테트라-안테나가 22~48%을 나타내고, 그리고 디-시알로(di-sialo)가 0~55%, 트리-시알로(tri-sialo)가 0~30%, 테트라-시알로(tetra-sialo)가 0~29%를 나타내었다. PER.C6-rAAT의 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도의 범위는 0~92%였고, 이와 같은 시알산에 의한 캡핑 정도는 PER.C6-rAAT 세포주의 비생산성과 상관관계가 없었다(스피어만 상관계수 r=-0.024, p=0.893) (표 1과 2 및 도 4).

예상한 바와 같이, ECL 포지티브(positive) rAAT의 글리칸들은 ECL 네거티브(negative) PER.C6-rAAT와 비교해 더 낮은 수치의 전하(시알릴화)를 함유하였다(Z-개수 범위:0~124(ECL 포지티브) 대 Z-개수 범위: 151~253(ECL 네거티브))(맨-휘트니 검정(p<0.001)에 의해 검사된 차이는 유의미하다)(도 5 참조). ECL-포지티브 PER.C6-rAAT의 글리칸은 ECL-네거티브 PER.C6-rAAT에 비해 더 높은 수치의 안테나 구조성을 함유하였다(A-개수 범위: 299~322(ECL-포지티브) 대 A-개수 범위: 266~307 (ECL-네거티브)(맨-휘트니 검정(p<0.001)에 의해 검사된 차이는 유의미하다) (도 5 참조). 더욱이, PER.C6-rAAT-ST6(ECL 네거티브)의 테트라-안테나 글리칸 상에서의 시알릴화의 정도(범위 6~62%)는 PER.C6-rAAT-ST3(ECL 네거티브)의 테트라-안테나 글리칸 상에서의 시알릴화의 정도(범위 35~106%)에 비해 낮았지만(맨-휘트니 검정(p<0.001)에 의해 검사된 차이는 유의미하다), 이것은 총 시알릴화의 정도에는 해당되지 않는다(표 1 및 2, 도 6). 분지가 더 많은 글리칸에 대한 ST6의 더 낮은 선호성(Joziasse et al., 1987)이 PER.C6-rAAT-ST3에 비해 PER.C6-rAAT-ST6의 테트라-안테나 글리칸 상에서 시알릴화의 더 낮은 정도의 원인일 것이다.

글리칸 프로파일들은 혈장-유래 AAT(프로라스틴^?)와 비교하여 PER.C6-rAAT의 글리칸 상에서의 분지성(branching)의 정도가 더 높은 경향을 나타냈고, 프로라스틴^?에 대한 프로파일은: 디-안테나가 80% , 트리-안테나가 18% 그리고 테트라-안테나가 2%(표 1과 2)였다. 이와 같은 현상은 또한 A-개수의 비교로부터 명확해졌다. (도 5 및 표 1과 2). 프로라스틴^?의 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도는 96%였다(표 1과 2).

실시예 3

래트 모델에서 PER . C6 - rAAT 의 약동학

PER.C6-rAAT의 약동학(PK)을 측정하기 위해 래트 모델를 확립하였다. 상기 모델은 약 40~100㎍/mL (2mL/kg, 이것은 약 80~200㎍/kg의 용량이 된다)의 농도에서 미정제 PER.C6-조건 배지(conditioned medium)(CM)에 존재하는 AAT를 검출할 수 있어야 한다.

4가지 실험을 수행하였다: 처음 두 개는 모델을 세우고, 두 번째, 세 번째 그리고 네 번째 실험은 최적의 PK 특성들을 갖는 rAAT 생산 PER.C6-rAAT 세포주를 선택하기 위한 것이었다. 이와 같은 연구들에, 인간 pdAAT (프로라스틴^?)을 참고로 사용하여 모델을 확립하였다. 실험 방법은 하기와 같았다: 래트(수컷 Wistar, 8주령)에게 AAT 시험 샘플을 정맥주사로 꼬리 정맥에 투여하였다(용량 부피 2ml/kg, 용량 범위 50~200㎍/kg, 실험군당 래트 n=3). 투여 전에 그리고 용량 투여 후에는 여러 차례 꼬리 끝에서 혈액을 채취하였다. 혈액을 K₂EDTA 마이크로베트(microvettes)에 수집하여 혈장을 준비하였다. 혈장 샘플 중의 잔류 AAT 농도를 추후에 ELISA (AAT Elisa Kit, Affinity Biologicals)에 의해 측정하였다. 얻은 데이터를 2-콤파트먼트(compartment) 모델을 가진 래트에 대해 모델링하였고, 추후에 PK 매개변수들을 측정하였다.

실험 1의 데이터(도 7 참조)에 의해 나타난 바와 같이, 상기 모델은 미정제 샘플에서의 PK 프로파일을 측정하기 위해 적절함을 발견하였는데, 이것은 PER.C6-CM 및 완충액 조절(PBS, 0.01% w/v Tween-80 (PT)) 중에 혼합된 프로라스틴^?(용량 200㎍/kg)의 혈장 농도 대 시각 곡선들이 유사하기 때문이다. 유사한 결과가 100㎍/kg 용량의 프로라스틴^?에서도 발견하였다(데이터 표시되지 않음). 도 7에, CM에 혼합된 50~200㎍/kg 용량의 프로라스틴^?에서 증가된 반응이 관측되었음을 나타내었다. 이와 같은 데이터로부터, 프로라스틴^?는 평균 체류 시간(MRT)이 11~12시간이라는 계산을 얻었다. 또한 PER.C6-rAAT 샘플들을 검출한 결과, PER.C6-rAAT-ST3-202c는 프로라스틴^?과 비교해 더 느린 소실(clearance)(MRT ~20.5시간)을 나타내고, PER.C6-rAAT-ST6-530은 프로라스틴^?과 비교해 더 빠른 소실(MRT ~3.6시간)을 나타냈다(표 1과 2). 이와 같은 관측들을 기초로, 상기 모델은 모든 샘플들에 대해 100㎍/kg의 용량 수치에서 실험 2~4에서 검사한 미정제된 PER.C6-rAAT 샘플들에 대해 사용할 수 있다는 결론을 도출하였다. 도 8에, 프로라스틴^?과 비교해 PER.C6-rAAT-ST3과 PER.C6-rAAT-ST6에 대한 대표적인 PK 프로파일들을 나타내었다.

표 1과 2에서 마지막 컬럼은 PK 실험에서 얻은 MRT 값들을 나타낸다. MRT와 관련하여 샘플들과 샘플군들 사이의 차이에 대한 통계학적 검사는 로그 변환 값들에 대해 ANOVA에 의해 수행하였다. 검사한 PER.C6-rAAT-ST3과 PER.C6-rAAT-ST6 제제의 MRT는 프로라스틴^?의 MRT와 현저히 달랐다. 검사한 PER.C6-rAAT-ST3 제제 10개 중 8개의 MRT는 프로라스틴^?의 MRT보다 현저히 길었고, 그 범위는 18~23시간이었다. 이들 PER.C6-rAAT-ST3 제제 8개 사이의 MRT의 차이는 유의미하지 않았다.

PER.C6-rAAT-ST3-053b 및 -539의 MRT는 프로라스틴^?의 것보다 현저히 짧았다. PER.C6-rAAT-ST3-0539의 경우, 이것은 아시알로페투인과의 공동-주입에 의한 아시알로 당단백질 수용체의 저지(blocking) 동안 이 제제의 첫 한 시간의 PK 프로파일의 구조(rescue)에 의해 확인된 바와 같이, 비교적 낮은 시알릴화 정도(49%) 때문이다(데이터 없음). PER.C6-rAAT-ST3-053b의 글리칸 프로파일은 결정적이지 않으나(명확한 피크 부여 불가능), 이 경우에도 역시 저조한 시알릴화(undersialylation)가 짧은 MRT의 가장 유력한 원인이다.

검사한 모든 PER.C6-rAAT-ST6 제제의 경우, MRT는 3.4~3.9 시간으로 프로라스틴^?의 것보다 현저히 짧았다. 이것은 PER.C6-rAAT-ST6 상의 테트라-안테나 글리칸의 비교적 낮은 시알릴화 정도(범위 6~62%) 및/또는 α2,3 시알릴화된 AAT 대 α2,6 시알릴화된 AAT에 대한 소실(clearance)의 잠재적으로 다른 메커니즘에 의해 설명될 수 있을 것이다.

결론

본 발명에 따라, 고수득율(최대 22 pcd)의 인간 AAT를 생산하고 수용가능한 품질(즉, 이 제제는 체외 분석에서 활성이었다)을 가진 PER.C6 세포주를 생성하였다. 놀랍고도 흥미롭게도, 래트 모델에서 장래성 있는 PK 프로파일들이 나타났다. 따라서 PER.C6 세포는 그중에서도 AAT-결핍증 관련 폐기종에서의 용도 또는 호중구-매개 조직 손상에 의한 기타 염증성 질환에서의 용도를 위한 인간 재조합 AAT의 생산을 위한 적절한 플랫폼을 형성한다. 그러나 본 발명의 rhAAT는 α2,3- 또는 2,6-시알릴트랜스퍼라제를 공-발현하는 기타 포유류 세포 유형들에서 생산되는 것이 적합할 것이다.

참고문헌

European Collection of Cell Cultures

96022940

19960229

SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland B.V. <120> Recombinant human alpha1-antitrypsin <130> 0169 EP P00 PRI <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys 1 5 10 15 Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala 20 25 30 Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn 35 40 45 Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln 50 55 60 Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser 65 70 75 80 Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr 85 90 95 His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro 100 105 110 Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn 115 120 125 Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu 130 135 140 Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys 145 150 155 160 Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu 165 170 175 Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys 180 185 190 Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu 195 200 205 Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val 210 215 220 Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val 225 230 235 240 Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys 245 250 255 Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala 260 265 270 Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu 275 280 285 Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp 290 295 300 Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr 305 310 315 320 Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe 325 330 335 Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys 340 345 350 Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly 355 360 365 Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile 370 375 380 Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu 385 390 395 400 Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr 405 410 415 Gln Lys <210> 2 <211> 1257 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgcccagca gcgtgagctg gggcatcctg ctgctggccg gcctgtgctg cctggtgccc 60 gtgagcctgg ccgaggaccc ccagggcgac gccgcccaga aaaccgacac cagccaccac 120 gaccaggacc accccacctt caacaagatc acccccaacc tggccgagtt cgccttcagc 180 ctgtaccggc agctggccca ccagagcaac agcaccaaca tctttttcag ccccgtgagc 240 atcgccaccg ccttcgccat gctgtccctg ggcaccaagg ccgacaccca cgacgagatc 300 ctggaaggcc tgaacttcaa cctgaccgag atccccgagg cccagatcca cgagggcttc 360 caggaactgc tgcggaccct gaaccagccc gacagccagc tccagctcac caccggcaac 420 ggcctgtttc tgagcgaggg cctgaaactg gtggacaagt ttctcgaaga tgtgaagaag 480 ctgtaccaca gcgaggcctt caccgtgaac ttcggcgaca ccgaggaagc caagaagcag 540 atcaacgact acgtggagaa gggcacccag ggcaagatcg tggacctggt gaaagagctg 600 gaccgggaca ccgtgttcgc cctggtgaac tacatcttct tcaagggcaa gtgggagcgg 660 cctttcgagg tgaaggatac cgaggaagag gacttccacg tggaccaggt gaccaccgtg 720 aaggtgccca tgatgaagcg gctgggcatg ttcaacatcc agcactgcaa gaagctgtcc 780 agctgggtcc tgctgatgaa gtacctgggc aacgccaccg ccatcttttt tctgcccgac 840 gagggcaagc tgcagcacct ggaaaacgag ctgacccacg acatcatcac caagtttctg 900 gaaaatgagg accggcggag cgccagcctg cacctgccca agctgtccat caccggcacc 960 tacgacctga agagcgtgct gggccagctg ggcatcacca aggtgttcag caacggcgcc 1020 gacctgagcg gcgtgaccga agaggccccc ctgaagctgt ctaaggccgt gcacaaggcc 1080 gtgctgacca tcgacgagaa ggggaccgaa gccgccggag ccatgtttct ggaagccatc 1140 cccatgagca tcccccccga ggtgaagttc aacaagccct tcgtgttcct gatgatcgag 1200 cagaacacca agagccccct gttcatgggc aaggtggtga accccaccca aaagtga 1257

Claims

N-결합 글리칸을 포함하는 재조합 인간 α1-항트립신(rhAAT)으로:
(a) N-결합 글리칸의 적어도 10%가 테트라-안테나(tetra-antennary) 글리칸이고; 그리고
(b) N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑(capping) 정도(Z/A)가 적어도 50%인 것을 특징으로 하는 재조합 인간 α1-항트립신(rhAAT).
제1항에 있어서, N-결합 글리칸의 적어도 20%가 테트라-안테나 글리칸인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제1항 또는 제2항에 있어서, N-결합 글리칸의 10~50%가 테트라-안테나 글리칸인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제1항 또는 제2항에 있어서, N-결합 글리칸의 20~40%가 테트라-안테나 글리칸인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제1항 또는 제2항에 있어서, N-결합 글리칸 상에서 총 시알릴화의 적어도 50%가 α-2,3-시알릴화인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제5항에 있어서, N-결합 글리칸 상에서 총 시알릴화의 적어도 90%가 α-2,3-시알릴화인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제1항 또는 제2항에 있어서, N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도(Z/A 비율로 계산될 때)가 적어도 70%인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 테트라-안테나 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도가 적어도 20%인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제8항에 있어서, 테트라-안테나 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도가 적어도 50%인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제8항에 있어서, 테트라-안테나 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도가 50% ~ 97%인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제8항에 있어서, 테트라-안테나 N-결합 글리칸 상에서 시알산에 의한 캡핑 정도가 70% ~ 95%인 것인 재조합 인간 α1-항트립신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약제로의 용도를 위한 재조합 인간 α1-항트립신.
제1항 또는 제2항에 있어서, AAT 결핍 관련 질환 또는 호중구-매개 조직 손상을 수반하는 질환의 예방 또는 치료에서의 용도를 위한 재조합 인간 α1-항트립신.
재조합 인간 α1-항트립신(rhAAT)의 생산 방법으로, 인간 α1-항트립신을 인코딩하는 핵산을 PER.C6 세포에 제공하여 상기 PER.C6 세포가 상기 핵산을 발현 가능한 형태로 함유하게 하고; 그리고 상기 재조합 인간 α1-항트립신의 생산에 유리한 조건 하에서 상기 PER.C6 세포를 배양하는 단계들을 포함하고, 여기서 상기 PER.C6 세포는 α2,3 시알릴트랜스퍼라제 또는 α2,6-시알릴트랜스퍼라제와 같은 시알릴트랜스퍼라제를 공-발현하도록 변형되어 있는 것인 생산 방법.
제14항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 재조합 인간 α1-항트립신.