JP2012524747A - 組換えヒトアルファ1−アンチトリプシン - Google Patents
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Abstract
Description
本発明によれば、適切な薬物動態学的プロファイルを有する組換えヒトα1-アンチトリプシン(rhAAT)は、PER.C6細胞において大量に生産することができることが示された。
(a)前記N結合グリカンの少なくとも10%はテトラアンテナリーグリカンであり、および
(b)前記N結合グリカン上でのシアル酸によるキャッピング(capping with sialic acid)の程度(Z/A)は少なくとも50%である。
アルファ1-アンチトリプシン(AAT)は、活性化した好中球によって放出されるプロテアーゼの自然なインヒビターである。AATは、血しょう中に分泌されるが、その作用の一次的な部位は肺柔組織(実質)である。ヒト白血球エラスターゼ(HLE)は(また、ヒト好中球エラスターゼ(HNE)として知られ、正常な炎症反応の一部として好中球のアズール性(アズール親和性)の顆粒から放出されるセリンプロテアーゼである。正常なホメオスタシス(恒常性)状況の下で、AATはヒト白血球エラスターゼ(HLE)によるタンパク質分解の重要なレギュレーター(制御因子)としてはたらき、それによって肺の肺胞マトリックスの損害が防止される。HLEの他に、AATも好中球によって肺へ放出される2つの他のプロテアーゼ、すなわちカテプシンG(catG)およびプロテアーゼ3(Pr3)を抑制する。
(a)前記N結合グリカンの少なくとも10%がテトラアンテナリーグリカンであり、および
(b)前記N結合グリカン上でのシアル酸によるキャッピングの程度(Z/A)が少なくとも50%である。
本発明をさらに、以下の非制限的な例によって例示する。
細胞系の生成および比生産性
例2
生化学的分析
47のバッチ培養物の上澄みを、コロイド青で染色するSDS-PAGE上で分析した。PER.C6-rAAT(未精製)試料の細胞培養物の収集は、SDS-PAGE上での主要なタンパク質バンドとしてAATを示した。さらにまた、ゲル類は材料の完全性を示す無傷のAATバンドを示した(図2に示す)。
最初に(色素形成活性のアッセイ代わりに)、活性についての徴候を、PER.C6-rAATのヒト好中球エラスターゼとの複合体の形成を分析することによって定めた。このために、PER.C6-rAAT試料の細胞培養収集物を、37°Cで30分間、0、0.1、0.2および0.4μgのエラスターゼと共にインキュベーションし、そして次いで4-12%のBIS-トリスSDS-PAGE上に適用し、そしてコロイド青で染色した)。試験したすべてのPER.C6-rAAT試料はエラスターゼと複合体を形成し(データは示してない)、調製物の活性が指し示された。さらなる活性テストは、参照としてプロラスチン(商標)を用いるヒト好中球エラスターゼの抑制に基づく色素形成アッセイで行った〔出典はBruin(ブルイン)ら、2005年から〕)。試験されたすべてのPER.C6-rAAT試料は、一つのものを除き(PER.C6-rAAT-ST3-234c)、プロラスチン(商標)と少なくとも同じくらい活性であった(>90%)(表1および2)。
グリカンが、最適PKプロファイルのために必要とされる、シアル酸によるキャッピングの比較的高い程度を有するPER.C6-rAAT試料についてスクリーニング(選別)するために、レクチンアッセイを、Erythrina cristagalli(エリスリナ・クリスタガリ)のレクチン(ECL)を用いて、露出したガラクトースの検出用に適用した(用いたアッセイの図式的概観について図3を参照)。試験した47の試料からの15は、ECLによるOD405でのシグナル、>ブランク(空白)+ 0.2を示し、これらのAAT試料のグリカン上での終端のガラクトースの露出の比較的高い程度が指し示された。これらの試料の少数(2、3)について、シアル酸によってグリカンがキャッピングされる低い程度を、HPLCに基づく方法を用いる更なるグリカン分析によって確かめた〔Hermentin(ハーメンチン)ら、1996年;Ggervais(ジェルベー)ら、2003年〕。したがって、OD405でのECLシグナル>ブランク+ 0.2を有するrhAAT試料は、更には拡張グリカン分析を受けず、そしてPK調査において試験されなかった。
Zのための式:
Z =(Aアシアロx0)+(Aモノシアロx1)(Aジシアロx2)+(Aトリシアロx3)+(Aテトラシアロx4)〔A=エリア、Hermentin(ハーメンチン)ら、1996年〕。
Aのための式:
A=(Aジアンテナリーx2)+(Aトリアンテナリーx3)+(Aテトラアンテナリーx4)。
例3
ラットモデルでのPER.C6-rAATの薬物動態
本発明によれば、PER.C6細胞系が生み出され、それは、高収率(最高で22pcd)を有し、そして受入れ可能な品質を有するヒトAATを生成し、すなわち、調製物は生体外(試験管内)のアッセイにおいて活性であった。驚くべきことに、そして興味深いことに、有望なPKプロファイルがラットモデルで実証された。PER.C6細胞は、このようにして、とりわけAAT-不足に関連した気腫(肺気腫)における使用のための、または好中球媒介組織損傷を伴う他の炎症性の病気での使用のための、ヒト組換えAATの生産のために適切なプラットホームを形成する。本発明のrhAATは、しかしまた、2,3-または2,6-シアル酸転移酵素を共発現する他の哺乳類の細胞タイプでも適切に生産することができる。
AATのアミノ酸配列
Mpssvswgilllaglcclvpvslaedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk*
AATの最適化CDS(NM_000295に基づく)
atgcccagcagcgtgagctggggcatcctgctgctggccggcctgtgctgcctggtgcccgtgagcctggccgaggacccccagggcgacgccgcccagaaaaccgacaccagccaccacgaccaggaccaccccaccttcaacaagatcacccccaacctggccgagttcgccttcagcctgtaccggcagctggcccaccagagcaacagcaccaacatctttttcagccccgtgagcatcgccaccgccttcgccatgctgtccctgggcaccaaggccgacacccacgacgagatcctggaaggcctgaacttcaacctgaccgagatccccgaggcccagatccacgagggcttccaggaactgctgcggaccctgaaccagcccgacagccagctccagctcaccaccggcaacggcctgtttctgagcgagggcctgaaactggtggacaagtttctcgaagatgtgaagaagctgtaccacagcgaggccttcaccgtgaacttcggcgacaccgaggaagccaagaagcagatcaacgactacgtggagaagggcacccagggcaagatcgtggacctggtgaaagagctggaccgggacaccgtgttcgccctggtgaactacatcttcttcaagggcaagtgggagcggcctttcgaggtgaaggataccgaggaagaggacttccacgtggaccaggtgaccaccgtgaaggtgcccatgatgaagcggctgggcatgttcaacatccagcactgcaagaagctgtccagctgggtcctgctgatgaagtacctgggcaacgccaccgccatcttttttctgcccgacgagggcaagctgcagcacctggaaaacgagctgacccacgacatcatcaccaagtttctggaaaatgaggaccggcggagcgccagcctgcacctgcccaagctgtccatcaccggcacctacgacctgaagagcgtgctgggccagctgggcatcaccaaggtgttcagcaacggcgccgacctgagcggcgtgaccgaagaggcccccctgaagctgtctaaggccgtgcacaaggccgtgctgaccatcgacgagaaggggaccgaagccgccggagccatgtttctggaagccatccccatgagcatcccccccgaggtgaagttcaacaagcccttcgtgttcctgatgatcgagcagaacaccaagagccccctgttcatgggcaaggtggtgaaccccacccaaaagtga
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Claims (15)
- N結合グリカンを含み、
(a)前記N結合グリカンの少なくとも10%はテトラアンテナリーグリカンであり、および
(b)前記N結合グリカン上でのシアル酸によるキャッピングの程度(Z/A)は少なくとも50%である
ことを特徴とする、組換えヒトα1−アンチトリプシン(rhAAT)。 - 前記N結合グリカンの少なくとも20%はテトラアンテナリーグリカンである、請求項1に従うrhAAT。
- 前記N結合グリカンの約10%から50%まではテトラアンテナリーグリカンである、請求項1または2に従うrhAAT。
- 前記N結合グリカンの約20%から40%まではテトラアンテナリーグリカンである、請求項1または2に従うrhAAT。
- 前記N結合グリカン上での合計シアリル化の少なくとも50%はα−2,3−シアリル化である、請求項1〜4のいずれか一項に従うrhAAT。
- 前記N結合グリカン上の合計シアリル化の少なくとも90%はα−2,3−シアリル化である、請求項5に従うrhAAT。
- 前記N結合グリカン上でのシアル酸によるキャッピングの程度(Z/A比によって算出して)は、少なくとも70%、このましくは少なくとも80%、より一層このましくは少なくとも90%である、先行する請求項のいずれか一項に従うrhAAT。
- テトラアンテナリーである前記N結合グリカン上でのシアル酸によるキャッピングの程度は少なくとも20%である、先行する請求項のいずれか一項に従うrhAAT。
- テトラアンテナリーである前記N結合グリカン上でのシアル酸によるキャッピングの程度は少なくとも50%である、先行する請求項のいずれか一項に従うrhAAT。
- テトラアンテナリーである前記N結合グリカン上でのシアル酸によるキャッピングの程度は約50%から約97%である、請求項9に従うrhAAT。
- テトラアンテナリーである前記N結合グリカン上でのシアル酸によるキャッピングの程度は約70%から約95%である、先行する請求項のいずれか一項に従うrhAAT。
- 薬としての使用のための、先行する請求項のいずれか一項に従うrhAAT。
- AAT(α1−アンチトリプシン)欠乏に関連する病気、および/または好中球媒介組織損傷に関わる病気の予防および/または処置での使用のための、先行する請求項のいずれか一項に従うrhAAT。
- 組換えヒトα1−アンチトリプシン(rhAAT)を生産するための方法であって、ヒトα1−アンチトリプシンをコードする核酸を有するPER.C6細胞を、前記PER.C6細胞が前記核酸を発現可能な形態で抱えるように提供すること、および前記PER.C6細胞を、前記組換えヒトα1−アンチトリプシンの生産をもたらす条件下に培養することのステップを含み、前記PER.C6細胞はあるものを共発現するように修飾され、前記シアリルトレンスフェラーゼはα2,3−シアリルトランスフェラーゼまたはα2,6−シアリルトランスフェラーゼである、方法。
- 請求項14に従う方法によって得られうるrhAAT。
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