JP7110104B2 - ジアンテナ型ｎ－グリカンを有する組み換え糖タンパク質を産生する細胞株、それを使用する方法、及び組み換え糖タンパク質 - Google Patents

ジアンテナ型ｎ－グリカンを有する組み換え糖タンパク質を産生する細胞株、それを使用する方法、及び組み換え糖タンパク質 Download PDF

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Description

本発明は、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少した遺伝子改変された細胞株、該細胞株を使用するトリ及び／又はテトラアンテナ型（tri- and/or tetra-antennary：三分岐及び／又は四分岐）Ｎ－グリカンの数が減少したＮ－グリカンを有する糖タンパク質の産生方法、並びに各糖タンパク質に関する。
治療用タンパク質の開発は、過去数年で著しく進展した。しかしながら、特に複雑にグリコシル化したタンパク質については、好都合なグリコシル化パターンを有するタンパク質を得るのは難しい場合がある。これは、しばしば、例えば血清半減期の減少、又は免疫原性の増加等の次善最適の薬理学的特性をもたらす。
組み換え糖タンパク質の産生における１つの難しさは、特に糖鎖構造の翻訳後修飾の多様性に起因する、生成物の潜在的な不均一性である。これは異なる生産バッチ間で生成物の品質の不一致をもたらす可能性がある。
グリコシル化は最も一般的な翻訳後修飾である。ほぼ全ての生物製剤は、最適な治療効果を示すために、正確にグリコシル化される必要がある。一般に、グリコシル化は、タンパク質表面への糖の共有結合を指し、糖はアスパラギン残基に連結されてＮ結合型グリカン（Ｎ－グリカン）を生じるか、又はセリン残基若しくはスレオニン残基に連結されてＯ結合型グリカン（Ｏ－グリカン）を生じるかのいずれかである。結合したグリカンが単糖の順番、分岐パターン、及び長さにおいて異なる可能性がある（ミクロ不均一性）ため、グリコシル化パターンは、異なる分子間では非常に多様となり得る。さらに、必ずしも全てのグリコシル化部位が完全に占有されるわけではない（マクロ不均一性）。
グリコシル化は、例えば、タンパク質の溶解度、タンパク質分解に対するそれらのタンパク質の抵抗性、及び他のタンパク質又は例えばＡＳＧＰＲ（アシアロ糖タンパク質受容体）等のタンパク質受容体へのそれらのタンパク質の結合挙動に影響を与えることで、血漿中の糖タンパク質の半減期に影響を及ぼす。
約５０ｋＤａ未満の小型のタンパク質については、クリアランスは主に腎臓を介して起こる。また、タンパク質のサイズ以外にも、腎臓において高度に帯電したタンパク質の濾過が減退することから、タンパク質の表面電荷は腎臓クリアランスに影響を与える。大型のタンパク質については、クリアランスは、特異的及び／又は非特異的な肝取込みを通して主に肝臓において起こる。特異的取り込みメディエータに対する例は、末端ガラクトースを有するシアリル化されていないＮ結合型糖タンパク質に特異的に結合するＡＳＧＰＲである。この受容体の作用により、隣接する炭水化物であるガラクトースを包含する末端シアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸；ＮｅｕＡｃ）を有する糖タンパク質は、それらのＮ結合型グリカン上に末端ガラクトース残基を有するシアリル化されていない相当物と比較して、最大１００倍増加された半減期を有する。他の受容体は、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン、又はフコースに特異的に結合し、これらの末端糖を有する糖タンパク質を体から除去する。
この観点から考えると、高度な末端シアリル化を含む天然又はほぼ天然のＮ－グリコシル化パターンは、治療用タンパク質の薬物動態学の特性を決定することから、治療用タンパク質に非常に重要である。さらに、糖タンパク質に適切な結合を有する末端シアル酸は、糖タンパク質の免疫原性を減少させる。
ほぼ天然の糖鎖構造及び高度なシアリル化を得るための主要な戦略は、哺乳動物様の糖鎖構造をタンパク質に結合することができる哺乳動物細胞株、例えばＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）において組み換えタンパク質を産生することである。しかしながら、非ヒト哺乳動物細胞株は、しばしばシアル酸の２，６－結合を触媒するために必要とされる酵素を欠くため、２，３－結合しか触媒することができない。さらにまた、シアル酸に加えて、非ヒト動物細胞株は、しばしば、ヒトでは合成されないため、注入された場合はヒトにおいて免疫原性となる糖であるＮ－グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）をグリカンに結合する。したがって、より良好な戦略は、ＣＡＰ細胞（ヒト羊膜細胞由来）又は、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞由来）のようなヒト細胞株から治療用タンパク質を生成することであろう。しかしながら、発酵中にヒト細胞株から分泌される治療用タンパク質のシアリル化は多くの場合不完全である。
したがって、哺乳動物細胞におけるシアリルトランスフェラーゼ、例えば、β－ガラクトシドα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）又はβ－ガラクトシドα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）の追加的発現は、治療用タンパク質のシアリル化、結果的に血清半減期の増加に有利となり得る。興味深いことに、ヒト血清タンパク質は、大半が２，６－シアリル化され、通常、トリ及びテトラアンテナ型のＮ－グリカンにおける追加の分岐鎖のみが２，３－シアリル化される。この理由は、ウシＳＴ６Ｇａｌ１酵素を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で明らかにされた。特に、このシアリルトランスフェラーゼが、Ｎ－グリカンの第３及び第４の分岐鎖、特にＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｍａｎα１→６分岐鎖に非常に非効率的にＮｅｕＡｃを付加することを示すことができた（図２）。これらの研究と一致して、ＳＴ３Ｇａｌ４の発現と比較して、ＳＴ６Ｇａｌ１の過剰発現は、より低い程度の複合体Ｎ－グリカンのシアリル化を生じることが示された。
この理由は、テトラアンテナ型Ｎ－グリカンの第３及び第４のアンテナが、異なるグリコシド結合を特徴とし、立体的に異なるということである。したがって、それらはＳＴ３Ｇａｌ４及びＳＴ６Ｇａｌ１の酵素に対する差次的な基質利用性を示す。したがって、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３及びＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６のアームは、２，６結合型シアル酸によって優先的にシアリル化されるのに対し、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｍａｎα１→３及びＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｍａｎα１→６のアームは、２，３－シアリル化の好ましい標的である。
発酵中に哺乳動物細胞株から分泌される治療用タンパク質の多くが、ヒト血清血漿から精製されたそれらの相当物と比較して、より高度なトリ及びテトラアンテナ型のＮ－グリカン構造を示す。上に記載される研究と一致して、ＳＴ６Ｇａｌ１の追加的な過剰発現は、完全にシアリル化された治療用タンパク質を生じない。ＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現のみが完全にシアリル化された治療用タンパク質を生じるが、その場合、シアリル化結合は血漿由来タンパク質とは異なる。人体では循環することがわかっていることから、それらの天然起源の相当物と非常に類似する治療用タンパク質を組み換えにより産生するために、該治療用タンパク質のＮ結合型グリカンのアンテナリティ（antennarity）、また任意に末端シアル酸の結合型を改変することが必要な場合がある。
α１－抗トリプシン（ＡＡＴ）は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤である。ＡＡＴはセリンプロテアーゼ、特に好中球エラスターゼの強力な阻害剤である。ＡＡＴは、３つのＮ－グリコシル化部位、すなわちＡｓｎ４６、Ａｓｎ８３及びＡｓｎ２４７を保有する５２ｋＤａ糖タンパク質であり、主にジアンテナ型（Ａｓｎ４６、Ａｓｎ８３及びＡｓｎ２４７）、及びトリアンテナ型（Ａｓｎ８３）のＮ－グリカンを保有する。ヒト血清から精製されたＡＡＴは、ジ及びトリアンテナ型のＮ－グリカンにα－２，６結合型ノイラミン酸を含み、一部のトリアンテナ型Ｎ－グリカンは１個のＮ－グリカン当たりもう１つ単独のα－２，３－ノイラミン酸を含む。ＨＰＬＣによって測定される異なるヒト血漿に由来するＡＡＴ試料中のトリアンテナ型Ｎ－グリカンの量は平均１２％（＋／－０．４％）であり、テトラアンテナ型Ｎ－グリカンは検出することができなかった。
広範囲の哺乳動物細胞におけるヒト組み換えＡＡＴの発現は、１０％程度以上のトリアンテナ型Ｎ－グリカン、更にはテトラアンテナ型Ｎ－グリカン構造の増量を伴うｒｈＡＡＴ（組み換えヒトＡＡＴ）をもたらすことが示された。これはヒト血清由来の相当物と非常に対照的である。
哺乳動物細胞で発現される他の組み換えタンパク質、例えばＣ１阻害剤（Ｃ１ Ｉｎｈ．）について同じことが言える。プロテアーゼ阻害剤であるＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ Ｉｎｈ）はセルピンスーパーファミリーに属する。その主な機能は、自発的な活性化を妨げるための補体系の阻害である。この５００アミノ酸タンパク質は、７個の予想されるＮ－グリカン及び８個の予想されるＯ結合型グリカンで高度にグリコシル化される。
ｒｈＡＡＴのように、哺乳動物発現系に由来するｒｈＣ１ Ｉｎｈは、血清由来の相当物では見られない、トリ及びテトラアンテナ型のＮ－グリカン構造の増量を示す。
かかるタンパク質において全てのＮ－グリカン分岐鎖の完全なシアリル化を達成するため、ＳＴ３Ｇａｌ４シアリルトランスフェラーゼの追加的な発現が必要であり、これは、トリ及びテトラアンテナ型のＮ－グリカンのコアβ１→４及びコアβ１→６の分岐鎖に対する低い親和性の結果、ＳＴ６Ｇａｌ１シアリルトランスフェラーゼの発現の効率が不十分であるためであり、この追加的な発現によって、それらのＮ－グリカンのアンテナリティに関してのみならず、シアリル化結合に関しても血漿タンパク質とは異なる、組み換えタンパク質がもたらされる。
したがって、本発明の基礎となる技術的課題は、組み換えによってかかるタンパク質を産生することのできる細胞株に加えて、主にジアンテナ型Ｎ－グリカンによる相同翻訳後修飾を有する組み換え糖タンパク質を提供することである。
上記技術的課題に対する解決策は、特許請求の範囲で特徴づけられる実施の形態によって達成される。
特に、第１の態様では、本発明は、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及びＧｎＴＶの少なくとも一方の発現を減少させるように遺伝子改変された細胞株に関する。
ＧｎＴＩＶａ及びＧｎＴＩＶｂは、Ｎ結合型グリカンのコアマンノース残基へのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の移行に関与するグリコシルトランスフェラーゼである。これらの酵素は、しばしば等しく発現されるイソ酵素である。これらの酵素は、Ｎ結合型グリカンのコア構造のＧｌｃＮＡｃ β１－２ Ｍａｎ α１－３アーム上のＧｌｃＮＡｃ β１－４分岐鎖の形成を触媒する。ＧｎＴＶは、ジアンテナ型Ｎ結合型オリゴ糖のα結合型マンノースへのβ１－６結合におけるＧｌｃＮＡｃの付加を触媒する。両方の酵素（ＧｎＴＩＶａ／ｂ及びＧｎＴＶ）は、テトラアンテナ型Ｎ結合型糖鎖の産生に必須である（図１）。
これに関し、ＧｎＴＩＶａ及びＧｎＴＩＶｂがおおよそ等しく発現される細胞株では、両方の発現が減少していることが好ましい。しかしながら、ＧｎＴＩＶｂを主に発現するＣＡＰ細胞等のＧｎＴＩＶａ及びＧｎＴＩＶｂのうちの一方を主に発現する細胞株では、主に発現されるイソ酵素の発現の減少で十分な可能性がある。
本発明によれば、細胞株は、ＧｎＴＩＶａ（α－１，３－マンノシル－糖タンパク質４－β－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ；配列番号２）、ＧｎＴＩＶｂ（α－１，３－マンノシル－糖タンパク質４－β－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＢ；配列番号３）、及びＧｎＴＶ（α－１，６－マンノシル糖タンパク質６－β－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ；配列番号１）の少なくとも一方の発現を減少させるように遺伝子改変されている。好ましい実施の形態では、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及びＧｎＴＶの発現が減少している。
本発明では、本明細書で使用される用語「ＧｎＴＩＶａ／ｂ及びＧｎＴＶの少なくとも一方の発現を減少させるように遺伝子改変された細胞株」は、遺伝子改変により、細胞株の個々の細胞がより低い発現レベルを示すため、細胞が遺伝子改変の前に発現していたよりも低い各タンパク質の活性を示すことを表す。
本明細書で使用される用語「発現の減少」又は「活性の減少」は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．２５％、９８．５％、９８．７５％、９９％、９９．２５％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、又は９９．９％のタンパク質発現又はタンパク質活性の減少を指す。
所与のタンパク質の発現の減少を可能とする遺伝子改変は、特に限定されず、当該技術分野において知られている。特定の例では、例えばヒト細胞株等の細胞株は、内因性のＧｎＴＩＶａ／ｂ又はＧｎＴＶ遺伝子を含む。そのような場合、細胞は、上記核酸のノックアウトを引き起こすのに適した位置での細胞のゲノム中のヌクレオチドの欠失又はゲノム中へのヌクレオチドの挿入によって遺伝子改変され得る。これは、ＴＡＬＥＮＳ、Ｚｎ－フィンガータンパク質、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９、又は当該技術分野で知られている他の方法を使用する、非相同末端再結合又は相同組み換えによって行うことができる。したがって、好ましい実施の形態では、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現は、好ましくは各遺伝子の破壊によって完全に消失される。また、対応するｍＲＮＡレベルの減少によって、所与のタンパク質の発現の減少を達成することができ、例えば、細胞は、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶのｍＲＮＡを標的とする干渉ＲＮＡを発現するように遺伝子改変され得る。各方法は、特に限定されず、当該技術分野で知られている。
好ましい実施の形態では、細胞株は、昆虫細胞株、鳥類細胞株、及び哺乳動物細胞株からなる群から選択され、ここで、哺乳動物細胞株、特にヒト細胞株が特に好ましい。特定の実施の形態では、細胞株は、マスコビーダック（Muscovy Duck）細胞（ＡＧＥ．ＣＲ（商標））、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）、メイディンダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７）、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒトニューロン前駆細胞（ＡＧＥ１．ＨＮ（商標）、ＮＣ５Ｔ１１）、ヒト胎児由来網膜芽細胞（Ｐｅｒ．Ｃ６）、骨髄腫細胞株（ＨＭＣＬ、ＭＭ．１、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ８２２６）、ＣＭＬ腫瘍細胞株（ＮＭ、ＮＭ－Ｆ９）、ハイブリッドＨＥＫ２９３及びリンパ腫細胞（ＨＫＢ１１）、並びにヒト羊膜細胞由来ＣＡＰ細胞からなる群から選択される細胞株に由来する。本発明では、ＣＡＰ細胞が特に好ましい。
ＣＡＰ細胞は、アデノウイルス、特にアデノウイルス５型（Ａｄ５）のＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域の遺伝子産物をコードする核酸を含む永久羊膜細胞株（amniocytic cell lines）である。ＣＡＰ細胞は、Ａｄ５のＥ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする核酸により形質転換される初代ヒト羊膜細胞に由来する。
したがって好ましい実施の形態では、本発明による細胞株は、アデノウイルスのＥ１領域及びｐＩＸ領域、好ましくはアデノウイルス５型（Ａｄ５）のＥ１領域及びｐＩＸ領域、より好ましくはヌクレオチド５０５～４０７９の遺伝子産物をコードする少なくとも１つの核酸を含み、好ましくはＥ１Ａがネズミ科ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）プロモータの制御下にあるのに対し、Ｅ１Ｂ及びｐＩＸの発現がそれらの天然プロモータにより制御される、ヒト初代羊膜細胞に由来し得る。Ｅ１Ｂの下流イントロン、スプライスアクセプタ、及びｐｏｌｙＡシグナルは、ＳＶ４０由来の対応するモチーフによって置換されることが好ましい。
好ましい実施の形態では、細胞株は、懸濁細胞株（suspension cell line）、すなわち懸濁培養、例えば血清不含懸濁培養で培養され得る細胞株である。各細胞株は当該技術分野で知られている。
好ましい実施の形態では、細胞株は、β－ガラクトシドα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）及び／又はα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）を過剰発現するように更に遺伝子改変されている。
本発明では、用語「過剰発現された、過剰発現される」は、遺伝子改変の前には各タンパク質を全く発現しなかった細胞におけるタンパク質発現、又は少なくとも１．２倍、好ましくは少なくも１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍以上の内因性発現の増加のいずれかを指す。
細胞における所与のタンパク質の発現／過剰発現方法は、特に限定されず、当該技術分野で知られている。ＳＴ３Ｇａｌ４をコードする好適な遺伝子、及びＳＴ６Ｇａｌ１をコードする好適な遺伝子は特に限定されず、それぞれの活性を有するタンパク質をコードする、任意の起源に由来する任意の遺伝子が挙げられ、哺乳動物、特にヒト遺伝子が特に好ましい。
更なる態様では、本発明は、細胞における目的の組み換え糖タンパク質の発現方法であって、上記糖タンパク質が、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少していない細胞株で発現される同じ組み換え糖タンパク質と比較した場合、ジアンテナ型Ｎ－グリカンの割合が著しく増加したＮ－グリカンを有し、上記方法が、上記細胞においてＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現を減少させるように、また任意にＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現するように上記細胞を遺伝子改変する工程を含む、方法に関する。
特定の実施の形態では、上記方法は、
（ａ）本発明による細胞株を準備する工程と、
（ｂ）上記細胞株において目的の糖タンパク質を発現する工程と、
（ｃ）細胞又は細胞培養上清から糖タンパク質を単離する工程と、
を含む。
所与の細胞株において組み換えにより糖タンパク質を発現する手段は、細胞又は細胞培養上清から上記糖タンパク質を単離する手段と同様に、特に限定されず、当該技術分野で知られている。
これらの態様では、本発明の組み換え糖タンパク質に関して以下に記載される、また本発明の細胞株に関して上に記載される定義、並びに好ましい及び／又は具体的な実施の形態の全てが、該当する場合には同じように適用される。
更なる態様では、本発明は、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少していない細胞株で発現される同じ組み換え糖タンパク質と比較した場合、ジアンテナ型Ｎ－グリカンの割合が著しく増加したＮ－グリカンを有する組み換え糖タンパク質に関する。
本明細書で使用される、用語「組み換え糖タンパク質」は、それぞれの糖タンパク質が遺伝子改変された細胞において生物工学的に産生されることを示す。
本発明によれば、糖タンパク質中のジアンテナ型Ｎ－グリカンの割合は、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少していない細胞株で発現される同じ組み換え糖タンパク質と比較した場合、好ましくは少なくとも１．２倍、より好ましくは少なくとも１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍以上増加される。
関連の好ましい実施の形態では、糖タンパク質中のテトラアンテナ型Ｎ－グリカンの割合は、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少していない細胞株において発現される同じ組み換え糖タンパク質と比較した場合、著しく減少している。上記割合は、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍以上減少している（少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％の減少に対応する）ことが好ましく、ここで、ジアンテナ型Ｎ－グリカンに加えて、少しでも存在する場合には、任意の残りのＮ－グリカンはトリアンテナ型Ｎ－グリカンである。
好ましい実施の形態では、本発明の組み換え糖タンパク質のＮ－グリカンのアンテナの少なくとも８０％は、２，６結合型シアル酸によって末端化される。Ｎ－グリカンの少なくとも８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．２５％、９８．５％、９８．７５％、９９％、９９．２５％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％が、２，６結合型シアル酸によって末端化されることがより好ましい。
各糖タンパク質は、糖タンパク質の発現、並びにＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現の減少と同時に、例えば上に示されるように、ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４が過剰発現される、好適な生体又は細胞における組み換え発現によって産生され得る。本発明の糖タンパク質は、上に定義される本発明の細胞株で発現されることが好ましい。
本発明の組み換え糖タンパク質のＮ－グリカンは、ミクロ不均一性の減少、すなわち、所与の糖タンパク質調剤におけるＮ－グリカン構造及び組成の多様性の減少を特徴とする。各組み換え糖タンパク質は、本明細書に記載されるように、例えば、発現レベル、並びにこのＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの活性を低下させることによって、また任意に、ＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ６Ｇａｌ１の追加的な過剰発現によって産生され得る。上記糖タンパク質は、本明細書に記載される本発明による細胞株において産生されることが好ましい。
本発明による具体的な糖タンパク質は、該糖タンパク質がＮ－グリカンを有する限り、特に限定されない。上記糖タンパク質は哺乳動物の、より好ましくはヒトの糖タンパク質であることが好ましい。糖タンパク質は、増殖因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、抗体フラグメント、血液凝固因子、及びプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択され得る。しかしながら、特定の実施の形態では、上記糖タンパク質は抗体又は抗体フラグメントではなく、すなわち、糖タンパク質は、増殖因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、酵素、血液凝固因子、及びプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される。
糖タンパク質は、α１－抗トリプシン（ＡＡＴ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）、及びＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－阻害剤；Ｃ１ Ｉｎｈ）からなる群から選択されることが好ましく、Ｃ１ Ｉｎｈが特に好ましい。
更なる態様では、本発明は、ＧｎＴＩＶａ／ｂ及びＧｎＴＶの少なくとも一方の発現を減少させるように、また任意にＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現するように細胞株を遺伝子改変する工程を含む、本発明による糖タンパク質の組み換え発現に対する細胞株の生成方法に関する。
更なる態様では、本発明は、細胞で産生される組み換え糖タンパク質のＮ－グリカンのミクロ不均一性を減少させる方法であって、上記細胞でＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現を減少させるように、また任意にＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現するように上記細胞を遺伝子改変する工程を含む、方法に関する。
特定の実施の形態では、上記方法は、
（ａ）本発明による細胞株を準備する工程と、
（ｂ）上記細胞株において目的の糖タンパク質を発現する工程と、
（ｃ）細胞又は細胞培養上清から糖タンパク質を単離する工程と、
を含む。
これらの態様では、本発明の組み換え糖タンパク質及び本発明の細胞株に関して記載される定義、並びに好ましい及び／又は具体的な実施の形態は全て、該当する場合には同じように適用される。
本明細書で使用される、用語「約」は、所定値の±１０％、好ましくは±５％の修飾語であることが意図される。例として、用語「約０．２」は、０．１８～０．２２、好ましくは０．１９～０．２１の範囲を包含することが意図される。
用語「含むこと／含む」、「のみからなること／のみからなる」、及び「のみから本質的になること／のみから本質的になる」は、本明細書において区別なく用いられ、すなわち、上記用語は各々、他の２つの用語のうちの１つに明確に交換され得る。
図は以下を示す。
トリ及びテトラアンテナ型分岐Ｎ－グリカンの生合成を示す図である。トリ及びテトラアンテナ型複合体Ｎ－グリカンは、ＧｎＴＩＶ及びＧｎＴＶの作用によって生成される。これらの分岐鎖は、例えばガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸、及びフコースによって更に伸長され得る。 ＳＴ６Ｇａｌ１活性の枝分かれ特異性を示す図である。ＳＴ６Ｇａｌ１は、トリ及びテトラアンテナ型Ｎ－グリカンの一次分岐鎖のシアリル化を触媒するのに対し、トリ及びテトラアンテナ型Ｎ－グリカンの追加の分岐鎖のシアリル化はＳＴ３Ｇａｌ４によって触媒される。 ＣＡＰ野生型細胞で発現されるｒｈＡＡＴと比較した、ヒト血清から精製されたヒトＡＡＴ（プロラスチン（Prolastin））に由来するＮ－グリカンのＤＳＡ及びＰＨＡ－Ｌのレクチン免疫ブロット分析を示す図である。 シアリルトランスフェラーゼの存在下又は不在下での野生型ＣＡＰ細胞（対照）又はＧｎＴＩＶｂノックアウトを持つＣＡＰ細胞で発現された組み換えｈＡＡＴのＤＳＡレクチン免疫ブロットを示す図である。ＣＡＰ野生型細胞又はＧｎＴＩＶｂノックアウトを持つＣＡＰ細胞（シアリルトランスフェラーゼの追加的な過剰発現を伴わない（Ａ）、又はシアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ４（Ｂ）若しくはＳＴ６Ｇａｌ１（Ｃ）の追加的な過剰発現を伴う）を、ｒｈＡＡＴを安定に発現するように改変した。ｒｈＡＡＴを細胞培養上清から精製し、レクチンブロット分析に供した。シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（ＤＳＡ：Datura stramonium）レクチンは、ＧｎＴＩＶｂによって合成されたコアβ１→４分岐Ｎ－グリカンを検出する。したがって、ＤＳＡブロットにおけるシグナルの減少は、β１→４分岐鎖を有するＮ－グリカンの減量を意味し、ＧｎＴＩＶｂ酵素活性の減少又は不在を示し、β１→４分岐鎖を有しないため、ジ又はトリアンテナ型構造のみを有するＮ－グリカン構造をもたらす。ローディング対照として、ｈＡＡＴ特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析に同じ試料を供した。 シアリルトランスフェラーゼの存在下又は不在下での野生型ＣＡＰ細胞又はＧｎＴＶノックアウトを持つＣＡＰ細胞で発現された組み換えｈＡＡＴのＰＨＡ－Ｌレクチン免疫ブロットを示す図である。ＣＡＰ野生型細胞又はＧｎＴＶノックアウトを持つＣＡＰ細胞（ＳＴ６Ｇａｌ１の追加的な過剰発現を伴う又はそれを伴わない）を、ｒｈＡＡＴを安定して発現するように改変した。ｒｈＡＡＴを細胞培養上清から精製し、レクチンブロット分析に供した。フィトヘマグルチニン－Ｌ（ＰＨＡ－Ｌ）レクチンは、ＧｎＴＶによって合成されたコアβ１→６分岐Ｎ－グリカンを検出する。したがって、ＰＨＡ－Ｌブロットにおけるシグナルの減少は、ＧｎＴＶ酵素活性の減少又は不在を示し、β１→６分岐鎖を有しないため、ジ又はトリアンテナ型構造のみを有する、Ｎ－グリカン構造をもたらす。ＰＨＡ－Ｌレクチンのβ１→６分岐Ｎ－グリカンへの結合は、シアル酸によって阻害されることから、シグナルはＳＴ６Ｇａｌ１を追加的に発現する細胞から精製された試料において減少する。それにもかかわらず、ＣＡＰ野生型試料と比較して、ＧｎＴＶノックアウト試料においてシグナルの減少を観察することができた。ローディング対照として、ｈＡＡＴ特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析に同じ試料を供した。 ＣＡＰ野生型、又はＳＴ３Ｇａｌ４若しくはＳＴ６ＧＡＬ１の追加的な過剰発現を伴う、若しくはそれを伴わないＣＡＰ ΔＧｎＴＩＶｂで発現されたタンパク質のｒｈＡＡＴ Ｎ－グリカンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量スペクトル分析の概要を示す図である。ＣＡＰ野生型（ｗｔ）に対して正規化されたＣＡＰ ΔＧｎＴＩＶｂのハイブリッド、ジ、トリ、及びテトラアンテナ型Ｎ－グリカン構造の相対量の合計を示す。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ又は無視できるシグナルによって生成されたグリカンフラグメントは、この分析に使用しなかった。ＧｎＴＩＶｂのノックアウトは、テトラアンテナ型Ｎ－グリカンの総量の３倍～１５倍の減少をもたらす。テトラアンテナ型Ｎ－グリカンの残存量は、ＧｎＴＩＶａの酵素活性に起因し得た。 野生型ＣＡＰ細胞、又はΔＧｎＴＶ若しくはΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶノックアウトを持つＣＡＰ細胞で発現された組み換えｈＡＡＴのＤＳＡ及びＰＨＡ－Ｌのレクチン免疫ブロットを示す図である。ＣＡＰ野生型細胞、又はＧｎＴＶ若しくはＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶダブルノックアウトを持つＣＡＰ単一細胞クローンを、ｒｈＡＡＴを安定して発現するように改変した。細胞培養上清からｒｈＡＡＴを精製し、レクチンブロット分析に供した。ＤＳＡレクチンは、ＧｎＴＩＶｂによって合成されたコアβ１→４分岐Ｎ－グリカンを検出する。したがって、ＤＳＡブロットにおけるシグナルの減少は、β１→４分岐鎖を有するＮ－グリカンの減量を意味する。ＰＨＡ－Ｌレクチンは、ＧｎＴＶによって合成されたコアβ１→６分岐Ｎ－グリカンを検出する。したがって、ＰＨＡ－Ｌブロットにおけるシグナルの減少は、β１→６分岐鎖を有するＮ－グリカンの減量を意味する。ＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶダブルノックアウトを有するＣＡＰ単一細胞クローンから精製されたＡＡＴは、野生型対照と比較して、両方のレクチンブロット分析において微量のシグナルを示すに過ぎず、ほぼすべてのＮ－グリカンがジアンテナ型であることを示す。 ＩＥＦ分析によるｒｈＡＡＴアイソフォームパターンの比較を示す図である。異なるｒｈＡＡＴの骨格が同一であることから、ＩＥＦの変化はシアル酸含量の変化による可能性が最も高い。ｒｈＡＡＴは、ＳＴ６Ｇａｌの追加的な発現を伴う、野生型、ΔＧｎＴＩＶｂ、ΔＧｎＴＶ、又はΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶ ＣＡＰ細胞で発現された。ノックアウト細胞から精製されたＡＡＴは、より酸性ではないｐＩを示し、１分子当たりのシアル酸総量の減少を示す。さらに、これは、トリ及びテトラアンテナ型構造からジアンテナ型Ｎ－グリカン構造へのシフトによる、潜在的なＮｅｕＡｃ結合部位の減少を示す。 野生型ＣＡＰ細胞、又はΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶノックアウトを持つＣＡＰ細胞で発現された組み換えｈＡＡＴのＥＣＬレクチン免疫ブロットを示す図である。アメリカデイゴ（ＥＣＬ：Erythrina crista-galli）レクチンは、Ｎ結合型グリカン上のβ１－４結合型末端ガラクトースを検出する。ＳＴ６Ｇａｌ１（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３、及びＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６）の枝分かれ特異性により、ＳＴ６Ｇａｌ１の過剰発現は、ΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶ細胞で発現されたｒｈＡＡＴに存在するジアンテナ型Ｎ－グリカンの完全なシアリル化をもたらすのに対し、ＳＴ６Ｇａｌ１の追加的な過剰発現を伴う野生型ＣＡＰ細胞で発現されるｒｈＡＡＴは、まだシアリル化されていないＮ－グリカン分岐鎖を持つ。ノイラミニダーゼは、オリゴ糖に由来するＮ－アセチル－ノイラミン酸残基の加水分解を触媒することから、ノイラミニダーゼ処理試料は陽性対照としてはたらく。ローディング対照として、ｈＡＡＴ特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析に同じ試料を供した。 血漿に由来するＣ１阻害剤（ベリナート（Berinert））と比較した、野生型ＣＡＰ細胞、又はΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶダブルノックアウトを持つＣＡＰ細胞で発現される組み換えｒｈＣ１ ＩｎｈのＤＳＡ及びＰＨＡ－Ｌのレクチン免疫ブロットを示す図である。ＣＡＰ野生型細胞、又はＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶダブルノックアウトを持つＣＡＰ－ＳＴ６Ｇａｌ１単一細胞クローンを、ｒｈＣ１ Ｉｎｈを安定して発現するように改変した。ｒｈＣ１ Ｉｎｈを細胞培養上清から精製し、レクチンブロット分析に供した。レクチンシロバナヨウシュチョウセンアサガオ（ＤＳＡ）レクチンは、ＧｎＴＩＶｂによって合成されたコアβ１→４分岐Ｎ－グリカンを検出する。したがって、ＤＳＡブロットにおけるシグナルの減少は、β１→４分岐鎖を有するＮ－グリカンの減量を証明する。フィトヘマグルチニン－Ｌ（ＰＨＡ－Ｌ）レクチンは、ＧｎＴＶによって合成されたコアβ１→６分岐Ｎ－グリカンを検出する。したがって、ＰＨＡ－Ｌブロットにおけるシグナルの減少は、β１→６分岐鎖を有するＮ－グリカンの減量を証明する。血漿由来Ｃ１ Ｉｎｈ．、及びＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶダブルノックアウトを有するＣＡＰ単一細胞クローンから精製されたＣ１ Ｉｎｈは、両方のレクチンブロット分析において、野生型対照と比較して微量のシグナルを示すに過ぎず、ほぼ全てのＮ－グリカンがジアンテナ型であることを示す。Ｃ１阻害剤特異的ウエスタンブロットを使用して、ＣＡＰ野生型のシグナル強度に対するのと同様に、対応するデンシメトリー分析をインプットに対して正規化した。
本発明を以下の実施例により更に説明するが、本発明はそれらに限定されない。
材料及び方法：
細胞株
本出願で使用した細胞株を下記表１に示す。
Figure 0007110104000001
細胞培養及び発酵
ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少した永久ヒト羊膜細胞株ＣＡＰ １Ｄ５、及びそれらの全ての派生物を、６ｍＭの安定なグルタミン（ドイツ国、biochrom）の添加された既知組成の動物成分不含ＣＡＰ－ＣＤＭ培地（ドイツ国、CEVEC Pharmaceuticals）、又は４ｍＭの安定なグルタミン（ドイツ国、biochrom）の添加された血清不含ＰＥＭ培地（Life Technologies）のいずれかにおいて懸濁培養した。
全ての細胞株を、５％ＣＯ２及び１８５ｒｐｍで振盪フラスコ（Corning、４３１１４３番、１２５ｍＬ（２５ｍＬ ｗｖ）又は４３１２５２番、３０００ｍＬ（１０００ｍＬ ｗｖ））において３７℃で培養した。発酵の間、３日目、５日目及び７日目にＣＡＰ細胞に１０％ＣＡＰ－ＣＤＭフィード溶液（ドイツ国、CEVEC Pharmaceuticals）及び４ｍＭの安定なグルタミン（ドイツ国、biochrom）を与えた。
クローニング
ＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ６Ｇａｌ１を安定に発現するＣＡＰ細胞株を生成するため、対応する核酸コンストラクトを用いて細胞にヌクレオフェクションを行った。
ＳＴ３Ｇａｌ４ ｃＤＮＡの設計のため、前駆体タンパク質及び成熟タンパク質の配列情報は、データベースエントリーＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１１２０６に基づいた。クローニングのため、ｐＳｔｂｌ－Ｎｅｏ－ＣＭＶ－ＭＣＳ（－）ベクター中、ＣｌａＩ制限酵素部位及びコザック配列をヒトＳＴ３Ｇａｌ４ ｃＤＮＡの開始コドンの５’に付加し、ＥｃｏＲＶ制限酵素部位をＣｌａＩ制限酵素部位とＥｃｏＲＶ制限酵素部位との間に挿入される停止コドンの３’に付加して、発現プラスミドｐＳｔｂｌ－Ｎｅｏ－ＣＭＶ－ＳＴ３Ｇａｌ４を得た。このベクターは、目的の遺伝子の発現を駆動するＣＭＶプロモータの後に、改善されたスプライシング媒介ｍＲＮＡ輸送のためのＳＶ４０イントロン、及び目的の遺伝子の挿入のためのマルチプルクローニングサイトを含む。選択マーカーは、ヒトユビキチン（ＵｂＣ）プロモータによって駆動される。ｃＤＮＡ合成をＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ国、Life Technologies）で行った。
ＳＴ６Ｇａｌ１ ｃＤＮＡの設計のため、前駆体タンパク質及び成熟タンパク質の配列情報は、データベースエントリーＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５９０７に基づいた。クローニングのため、ｐＳｔｂｌ－Ｎｅｏ－ＣＭＶ－ＭＣＳ（－）ベクター中、ＣｌａＩ制限酵素部位及びコザック配列をヒトＳＴ６Ｇａｌ１ ｃＤＮＡの開始コドンの５’に付加し、ＥｃｏＲＶ制限酵素部位をＣｌａＩ制限酵素部位とＥｃｏＲＶ制限酵素部位との間に挿入される停止コドンの３’に付加して、発現プラスミドｐＳｔｂｌ－Ｎｅｏ－ＣＭＶ－ＳＴ６Ｇａｌ１を得た。ｃＤＮＡ合成をＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ国、Life Technologies）で行った。
ヌクレオフェクション及びプール生成
ヌクレオフェクションは、製造業者のプロトコルに従って適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（ＫｉｔＶ）を備えるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（LONZA）を使用して行った。簡潔には、培養物の指数増殖期の間に１×１０７個の細胞を遠心分離（１５０ｇで５分間）により採取し、１００μｌの完全ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に再懸濁し、合計５μｇのプラスミドと混合した。Ｘ００１プログラムを使用して、ヌクレオフェクションを行った（ＣＡＰ細胞）。パルスの後、１２５ｍｌ容の振蕩フラスコ中、１２ｍｌの完全細胞培養培地において細胞を回収した。先のように、細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び１８５ｒｐｍで培養した。ヌクレオフェクションの７２時間後～９６時間後、２００μｇ／ｍｌのネオマイシンで細胞を選択して安定なプールを生成した。
細胞培養上清からのＡＡＴの精製
接線流濾過による採取及び濾過滅菌の後、ｒｈＡＡＴ含有細胞培養上清を濃縮し、最初のクロマトグラフィー工程のバッファーに対して透析濾過した。透析濾過溶液をＡＡＴ親和性クロマトグラフィーカラムに充填した。その後、ｒｈＡＡＴタンパク質を、ＭｇＣｌ２濃度が増加する直線濃度勾配で溶出した。プールされた画分を濃縮し、脱塩カラムを使用してバッファーを製剤バッファーに交換した。
細胞培養上清からのＣ１ Ｉｎｈの精製
接線流濾過による採取及び濾過滅菌の後、ネガティブモードで実行された、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム、続いてフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムによって細胞培養上清からＣ１ Ｉｎｈを精製した。このクロマトグラフィー工程のフロースルーを収集、濃縮し、脱塩カラムを使用してバッファーを製剤バッファーに交換した。
レクチン免疫ブロッティング
レクチンは特定の炭水化物構造に結合するタンパク質である。したがって、ビオチン結合型レクチンを使用してＮ結合型グリカンを分析することができる。ＤＳＡレクチンは、ＧｎＴＩＶｂによって合成されたコアβ１→４分岐Ｎ－グリカンを検出する。ＰＨＡ－Ｌレクチンは、ＧｎＴＶによって合成されたコアβ１→６分岐Ｎ－グリカンを検出する。ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少した又は減少していない、並びにＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ６Ｇａｌ１を共発現する又はそれらを共発現しない、精製されたタンパク質又は細胞培養上清を上に記載されるように分離し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（GE healthcare）にブロッティングした。メンブレンをＰＢＳＴＢ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０及び１％ＢＳＡを添加）により室温で１時間ブロックした。その後、メンブレンを、ＰＢＳＴＢで１：２０００に希釈したレクチンと共にインキュベートした。ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を添加）でメンブレンを洗浄した後、メンブレンを室温で１時間、ストレプトアビジン結合型セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＢＳＴＢで１：１０００に希釈）で染色した。ＨＲＰシグナルを、抗ストレプトアビジンＩｇＧ及び抗ＩｇＧ－ＨＲＰを使用して増幅した。化学発光検出器（INTAS）により、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ ＷＢ基質キットを使用してタンパク質を検出した。
ＩＥＦ分析
ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現を伴って又はそれを伴わずに、並びにＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ６Ｇａｌ１の共発現を伴って、又はそれを伴わずにｒｈＡＡＴを発現するＣＡＰ細胞から精製されたｒｈＡＡＴの等電点（ｐＩ）を分析するため、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行った。シアリル化の程度は、所与のタンパク質の酸性度、したがってそのｐＩと相関する。ＩＥＦ分析を製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従って行った。簡潔には、５μｇの精製されたタンパク質をｐＨ３～ｐＨ７のゲルにロードし、電気泳動（１時間 １００Ｖ、１時間 ２００Ｖ、３０分間 ５００Ｖ）に供した。製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従って、タンパク質をＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
実施例１：
ヒト羊膜細胞株ＣＡＰ １Ｄ５の細胞を、ｒｈＡＡＴをコードするプラスミドで安定にトランスフェクトした。プールを生成後、十分な量の組み換えＡＡＴを生成するため、細胞をフェッドバッチに供した。
血漿由来ＡＡＴ（プロラスチン）と比較して、野生型ＣＡＰ細胞で発現されたＡＡＴのコアβ１，６及び／又はコアβ１，４分岐Ｎ－グリカンの程度を特定するため、ＤＳＡ及びＰＨＡ－Ｌのレクチンブロットを行った。ＰＨＡ－ＬはＧｎＴＶによって合成されたコアβ１，６分岐生成物と特異的に反応し、ＤＳＡはＧｎＴＩＶｂによって合成されたコアβ１→４分岐Ｎ－グリカンを検出する。したがって、図３に示されるブロットにおけるシグナルの増加は、血漿由来ＡＡＴと比較して野生型ＣＡＰ細胞に由来するＡＡＴにおいて、より高度のトリ及び／又はテトラアンテナ型Ｎ－グリカンを示す。
レクチンブロット分析（図３）は、他の哺乳動物細胞株におけるように、組み換え糖タンパク質の発現が、対応する血漿由来ヒトタンパク質と比較して、トリ及びテトラアンテナ型構造の量が増加したＮ－グリカン構造をもたらすことを明らかにする。
実施例２：
ＧｎＴＩＶｂの野生型発現又は発現減少のいずれかを伴うヒト羊膜細胞株ＣＡＰ １Ｄ５の細胞を、ｒｈＡＡＴをコードするベクターで安定にトランスフェクトした。プールの生成後、十分な量の組み換えＡＡＴを作製するため、細胞株をフェッドバッチに供した。ｒｈＡＡＴを細胞培養上清から精製し、レクチンブロット分析に供した。ＤＳＡレクチンは、ＧｎＴＩＶｂによって合成されたコアβ１→４分岐Ｎ－グリカンを検出する。図４Ａで示されるＤＳＡシグナルの減少は、ＧｎＴＩＶｂ酵素活性の減少又は不在に起因し、β１→４分岐鎖がなく、したがってテトラアンテナ型構造を持たないＮ－グリカン構造を生じる。ローディング対照として、ｈＡＡＴ特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析に同じ試料を供した（図４）。
これらの結果は、ＧｎＴＩＶｂのノックアウトがテトラアンテナ型Ｎ－グリカンの総量の３倍～４倍の減少をもたらすことから、ＣＡＰ野生型細胞及びＣＡＰ ΔＧｎＴＩＶｂで得られたＡＡＴに由来するＮ－グリカンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析によって確認された（図６）。残りのテトラアンテナ型Ｎ－グリカン構造の量は、おそらくは、改変ＣＡＰ細胞の残余ＧｎＴＩＶｂ活性によるか、又はＧｎＴＩＶａ酵素活性による。
実施例３：
ＧｎＴＶの野生型発現又は発現減少のいずれかを伴うヒト羊膜細胞株ＣＡＰ １Ｄ５の細胞を安定にトランスフェクトした。プールの生成後、十分な量の組み換えＡＡＴを作製するため、細胞株をフェッドバッチに供した。
その後、精製された組み換えＡＡＴを、ΔＧｎＴＶ対野生型のＣＡＰ細胞で発現されたＡＡＴ中のコアβ１，６分岐Ｎ－グリカンの程度を特定するため分析した。そうするため、ＰＨＡ－Ｌ（フィトヘマグルチニン－Ｌ）レクチンブロットを行った。ＰＨＡ－Ｌは、ＧｎＴＶによって合成されたコアβ１，６分岐糖鎖構造と特異的に反応する。
図５（レーン２及びレーン４）及び図７Ｂに示されるように、ＰＨＡ－Ｌブロットにおいてシグナルの減少が検出され、ＧｎＴＶ酵素活性の減少又は不在、β１，６分岐生成物の減量、したがって、トリ－及び／又はテトラアンテナ型Ｎ－グリカンの減量を示した。
実施例４：
ＧｎＴＩＶｂ及びＧｎＴＶの酵素活性の不在がジアンテナ型Ｎ－グリカンのみをもたらすかどうかを調べるため、次の実験を行った。ＧｎＴＩＶｂ及びＧｎＴＶの野生型発現又は発現減少のいずれかを伴うＣＡＰ細胞（ΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶ細胞）にｒｈＡＡＴをコードするベクターでヌクレオフェクションを行った。プールの生成後、十分な量の組み換えＡＡＴを生成するため、細胞株をフェッドバッチに供した。その後、細胞培養上清からＡＡＴを精製した。
次に、野生型又はΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶのＣＡＰ細胞で発現されたｒｈＡＡＴに由来するＮ－グリカン構造を、ＤＳＡ及びＰＨＡ－Ｌのレクチンブロットによって分析した（図７）。
興味深いことに、ＰＨＡ－Ｌレクチンブロットと同様にＤＳＡでも、バックグラウンドシグナルのみがΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶ ＣＡＰで発現されたｒｈＡＡＴに対して検出可能であり、これらの細胞で発現されたｒｈＡＡＴが、トリ又はテトラアンテナ型Ｎ－グリカン構造を含まないか、又はごくわずかにこれらの構造を含むことを強く示唆した。
実施例５：
ｒｈＡＡＴを発現するＣＡＰ野生型細胞、又はｒｈＡＡＴを発現するＧｎＴＩＶｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少した細胞を、ＳＴ６Ｇａｌ１又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする追加のベクターで更にトランスフェクトした。プールの生成後、十分な量の組み換えＡＡＴを生成するため、生成された細胞株をフェッドバッチに供した。後に、ＡＡＴを次の細胞株：ＣＡＰ－ＡＡＴ、ＣＡＰ－ＡＡＴ＋ＳＴ６Ｇａｌ１、ＣＡＰ－ＡＡＴ＋ＳＴ３Ｇａｌ４、ΔＧｎＴＩＶｂ－ＡＡＴ、ΔＧｎＴＩＶｂ－ＡＡＴ＋ＳＴ６Ｇａｌ１、ΔＧｎＴＩＶｂ－ＡＡＴ＋ＳＴ３Ｇａｌ４、ΔＧｎＴＶ－ＡＡＴ、ΔＧｎＴＶ－ＡＡＴ＋ＳＴ６Ｇａｌ１、ΔΔＧｎＴＩＶｂ／Ｖ－ＡＡＴ、及びΔΔＧｎＴＩＶｂ／Ｖ－ＡＡＴ＋ＳＴ６Ｇａｌ１の細胞培養上清から精製した。
図４及び図７は、ＧｎＴＩＶｂ発現の減少によって引き起こされたβ１，６分岐Ｎ－グリカンの減量に対してＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１のようなシアリルトランスフェラーゼの追加的な発現が影響を及ぼさないことを示す。さらに、図５及び図７は、シアリルトランスフェラーゼの追加的な発現もＧｎＴＶの発現の減少によって引き起こされたβ１，４分岐Ｎ－グリカンの減量に対して影響を及ぼさないことを示す。注目すべきことに、β１→６分岐Ｎ－グリカンへのＰＨＡ－Ｌレクチンの結合はシアル酸によって阻害されることで、更にＳＴ６Ｇａｌ１を発現する細胞から精製された試料においてシグナルが減少する。それにもかかわらず、ＣＡＰ野生型細胞と比較して、ＧｎＴＶノックアウトのシグナルの減少を観察することができる。
異なるｒｈＡＡＴの骨格が同一であることから、ＩＥＦの変化はシアル酸含量の変化を示す。ＳＴ６Ｇａｌ１の追加的な発現を伴うΔＧｎＴＩＶｂ、ΔＧｎＴＶ、又はΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶのＣＡＰ細胞で発現されたｒｈＡＡＴは、ＳＴ６Ｇａｌ１を過剰発現する親ＣＡＰ細胞で発現されたｒｈＡＡＴと比較して、より酸性ではないｐＩへとわずかにシフトする改変ｒｈＡＡＴをもたらす。これは、１分子当たりのシアル酸の総量の減少を示す。観察結果は、トリ及びテトラアンテナ型構造からジアンテナ型Ｎ－グリカン構造へのシフトによる、可能性のあるＮｅｕＡｃ結合部位の減少と一致する（図８）。この妥当性は図９に示されるＥＣＬブロットによって支持される。
実施例６：
ｈＡＡＴ（実施例１を参照されたい）のように、哺乳動物発現系に由来するｒｈＣ１ Ｉｎｈも、血清由来の相当物では見られないトリ及びテトラアンテナ型Ｎ－グリカン構造の増量を示すかどうかを調べるため、血漿由来Ｃ１ Ｉｎｈ（ベリナート）と比較して、野生型ＣＡＰ細胞で発現されたＣ１ Ｉｎｈのコアβ１，６及び／又はコアβ１，４分岐Ｎ－グリカンの程度をＤＳＡ（シロバナヨウシュチョウセンアサガオ）及びＰＨＡ－Ｌ（フィトヘマグルチニン－Ｌ）のブロットによって特定した。ＰＨＡ－ＬはＧｎＴＶによって合成されたコアβ１，６分岐アンテナと特異的に反応し、ＤＳＡはＧｎＴＩＶｂによって合成されたコアβ１→４分岐Ｎ－グリカンを検出する。したがって、図１０（レーン１、ＣＡＰ野生型、及びレーン２、ベリナート）に示されるブロットにおけるシグナル比は、血漿由来Ｃ１ Ｉｎｈと比較して、野生型のＣＡＰ細胞に由来するＣ１ Ｉｎｈにおけるトリ及び／又はテトラアンテナ型Ｎ－グリカンの程度が著しく高いことを示す。
したがって、図１０中のレクチンブロット分析は、ｒｈＡＡＴの場合のように、改変されていないＣＡＰ細胞の組み換え糖タンパク質Ｃ１ Ｉｎｈの発現が、対応する血漿由来ヒトタンパク質（ベリナート）と比較して、トリ及びテトラアンテナ構造の量が増加したＮ－グリカン構造をもたらすことを明らかにする。
ＧｎＴＩＶｂ及びＧｎＴＶの酵素活性の不在が、ｒｈＡＡＴにおいてのみならず複合体タンパク質Ｃ１ Ｉｎｈにおいても、ジアンテナ型Ｎ－グリカンのみをもたらすかどうかを調べるため、ＧｎＴＩＶｂ及びＧｎＴＶの野生型発現を有する糖鎖工学処理されていないＣＡＰ細胞、並びにＧｎＴＩＶｂ及びＧｎＴＶの発現が減少したＣＡＰ－ＳＴ６Ｇａｌ１単一細胞クローン（ΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶ細胞）にｒｈＣ１ Ｉｎｈをコードするベクターでヌクレオフェクションを行った。プールの生成後、十分な量の組み換えＣ１ Ｉｎｈを生成するため、細胞株をフェッドバッチに供した。その後、細胞培養上清からＣ１ Ｉｎｈを精製した。次に、野生型又はΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶのＣＡＰ－ＳＴ６Ｇａｌ１細胞で発現されたｒｈＣ１ Ｉｎｈに由来するＮ－グリカン構造を、ＤＳＡ及びＰＨＡ－Ｌのレクチンブロットによって分析した（図１０）。
興味深いことに、ＰＨＡ－Ｌレクチンブロットと同様にＤＳＡでも、バックグラウンドシグナルのみがΔＧｎＴＩＶｂ／ＧｎＴＶ ＣＡＰ－ＳＴ６Ｇａｌ１細胞で発現されたｒｈＣ１ Ｉｎｈに対して検出可能であり、これらの細胞で発現されたｒｈＣ１ Ｉｎｈが、トリ又はテトラアンテナ型Ｎ－グリカン構造を含まないか、又はごくわずかにこれらの構造を含むことを強く示唆した。
本発明は、以下のアミノ酸配列を開示する。
配列番号１
ヒトＧｎＴＶ
ＭＡＬＦＴＰＷＫＬＳＳＱＫＬＧＦＦＬＶＴＦＧＦＩＷＧＭＭＬＬＨＦＴＩＱＱＲＴＱＰＥＳＳＳＭＬＲＥＱＩＬＤＬＳＫＲＹＩＫＡＬＡＥＥＮＲＮＶＶＤＧＰＹＡＧＶＭＴＡＹＤＬＫＫＴＬＡＶＬＬＤＮＩＬＱＲＩＧＫＬＥＳＫＶＤＮＬＶＶＮＧＴＧＴＮＳＴＮＳＴＴＡＶＰＳＬＶＡＬＥＫＩＮＶＡＤＩＩＮＧＡＱＥＫＣＶＬＰＰＭＤＧＹＰＨＣＥＧＫＩＫＷＭＫＤＭＷＲＳＤＰＣＹＡＤＹＧＶＤＧＳＴＣＳＦＦＩＹＬＳＥＶＥＮＷＣＰＨＬＰＷＲＡＫＮＰＹＥＥＡＤＨＮＳＬＡＥＩＲＴＤＦＮＩＬＹＳＭＭＫＫＨＥＥＦＲＷＭＲＬＲＩＲＲＭＡＤＡＷＩＱＡＩＫＳＬＡＥＫＱＮＬＥＫＲＫＲＫＫＶＬＶＨＬＧＬＬＴＫＥＳＧＦＫＩＡＥＴＡＦＳＧＧＰＬＧＥＬＶＱＷＳＤＬＩＴＳＬＹＬＬＧＨＤＩＲＩＳＡＳＬＡＥＬＫＥＩＭＫＫＶＶＧＮＲＳＧＣＰＴＶＧＤＲＩＶＥＬＩＹＩＤＩＶＧＬＡＱＦＫＫＴＬＧＰＳＷＶＨＹＱＣＭＬＲＶＬＤＳＦＧＴＥＰＥＦＮＨＡＮＹＡＱＳＫＧＨＫＴＰＷＧＫＷＮＬＮＰＱＱＦＹＴＭＦＰＨＴＰＤＮＳＦＬＧＦＶＶＥＱＨＬＮＳＳＤＩＨＨＩＮＥＩＫＲＱＮＱＳＬＶＹＧＫＶＤＳＦＷＫＮＫＫＩＹＬＤＩＩＨＴＹＭＥＶＨＡＴＶＹＧＳＳＴＫＮＩＰＳＹＶＫＮＨＧＩＬＳＧＲＤＬＱＦＬＬＲＥＴＫＬＦＶＧＬＧＦＰＹＥＧＰＡＰＬＥＡＩＡＮＧＣＡＦＬＮＰＫＦＮＰＰＫＳＳＫＮＴＤＦＦＩＧＫＰＴＬＲＥＬＴＳＱＨＰＹＡＥＶＦＩＧＲＰＨＶＷＴＶＤＬＮＮＱＥＥＶＥＤＡＶＫＡＩＬＮＱＫＩＥＰＹＭＰＹＥＦＴＣＥＧＭＬＱＲＩＮＡＦＩＥＫＱＤＦＣＨＧＱＶＭＷＰＰＬＳＡＬＱＶＫＬＡＥＰＧＱＳＣＫＱＶＣＱＥＳＱＬＩＣＥＰＳＦＦＱＨＬＮＫＤＫＤＭＬＫＹＫＶＴＣＱＳＳＥＬＡＫＤＩＬＶＰＳＦＤＰＫＮＫＨＣＶＦＱＧＤＬＬＬＦＳＣＡＧＡＨＰＲＨＱＲＶＣＰＣＲＤＦＩＫＧＱＶＡＬＣＫＤＣＬ
配列番号２
ヒトＧｎＴＩＶａ
ＭＲＬＲＮＧＴＶＡＴＡＬＡＦＩＴＳＦＬＴＬＳＷＹＴＴＷＱＮＧＫＥＫＬＩＡＹＱＲＥＦＬＡＬＫＥＲＬＲＩＡＥＨＲＩＳＱＲＳＳＥＬＮＴＩＶＱＱＦＫＲＶＧＡＥＴＮＧＳＫＤＡＬＮＫＦＳＤＮＴＬＫＬＬＫＥＬＴＳＫＫＳＬＱＶＰＳＩＹＹＨＬＰＨＬＬＫＮＥＧＳＬＱＰＡＶＱＩＧＮＧＲＴＧＶＳＩＶＭＧＩＰＴＶＫＲＥＶＫＳＹＬＩＥＴＬＨＳＬＩＤＮＬＹＰＥＥＫＬＤＣＶＩＶＶＦＩＧＥＴＤＩＤＹＶＨＧＶＶＡＮＬＥＫＥＦＳＫＥＩＳＳＧＬＶＥＶＩＳＰＰＥＳＹＹＰＤＬＴＮＬＫＥＴＦＧＤＳＫＥＲＶＲＷＲＴＫＱＮＬＤＹＣＦＬＭＭＹＡＱＥＫＧＩＹＹＩＱＬＥＤＤＩＩＶＫＱＮＹＦＮＴＩＫＮＦＡＬＱＬＳＳＥＥＷＭＩＬＥＦＳＱＬＧＦＩＧＫＭＦＱＡＰＤＬＴＬＩＶＥＦＩＦＭＦＹＫＥＫＰＩＤＷＬＬＤＨＩＬＷＶＫＶＣＮＰＥＫＤＡＫＨＣＤＲＱＫＡＮＬＲＩＲＦＲＰＳＬＦＱＨＶＧＬＨＳＳＬＳＧＫＩＱＫＬＴＤＫＤＹＭＫＰＬＬＬＫＩＨＶＮＰＰＡＥＶＳＴＳＬＫＶＹＱＧＨＴＬＥＫＴＹＭＧＥＤＦＦＷＡＩＴＰＩＡＧＤＹＩＬＦＫＦＤＫＰＶＮＶＥＳＹＬＦＨＳＧＮＱＥＨＰＧＤＩＬＬＮＴＴＶＥＶＬＰＦＫＳＥＧＬＥＩＳＫＥＴＫＤＫＲＬＥＤＧＹＦＲＩＧＫＦＥＮＧＶＡＥＧＭＶＤＰＳＬＮＰＩＳＡＦＲＬＳＶＩＱＮＳＡＶＷＡＩＬＮＥＩＨＩＫＫＡＴＮ
配列番号３
ヒトＧｎＴＩＶｂ
ＭＲＬＲＮＧＴＦＬＴＬＬＬＦＣＬＣＡＦＬＳＬＳＷＹＡＡＬＳＧＱＫＧＤＶＶＤＶＹＱＲＥＦＬＡＬＲＤＲＬＨＡＡＥＱＥＳＬＫＲＳＫＥＬＮＬＶＬＤＥＩＫＲＡＶＳＥＲＱＡＬＲＤＧＤＧＮＲＴＷＧＲＬＴＥＤＰＲＬＫＰＷＮＧＳＨＲＨＶＬＨＬＰＴＶＦＨＨＬＰＨＬＬＡＫＥＳＳＬＱＰＡＶＲＶＧＱＧＲＴＧＶＳＶＶＭＧＩＰＳＶＲＲＥＶＨＳＹＬＴＤＴＬＨＳＬＩＳＥＬＳＰＱＥＫＥＤＳＶＩＶＶＬＩＡＥＴＤＳＱＹＴＳＡＶＴＥＮＩＫＡＬＦＰＴＥＩＨＳＧＬＬＥＶＩＳＰＳＰＨＦＹＰＤＦＳＲＬＲＥＳＦＧＤＰＫＥＲＶＲＷＲＴＫＱＮＬＤＹＣＦＬＭＭＹＡＱＳＫＧＩＹＹＶＱＬＥＤＤＩＶＡＫＰＮＹＬＳＴＭＫＮＦＡＬＱＱＰＳＥＤＷＭＩＬＥＦＳＱＬＧＦＩＧＫＭＦＫＳＬＤＬＳＬＩＶＥＦＩＬＭＦＹＲＤＫＰＩＤＷＬＬＤＨＩＬＷＶＫＶＣＮＰＥＫＤＡＫＨＣＤＲＱＫＡＮＬＲＩＲＦＫＰＳＬＦＱＨＶＧＴＨＳＳＬＡＧＫＩＱＫＬＫＤＫＤＦＧＫＱＡＬＲＫＥＨＶＮＰＰＡＥＶＳＴＳＬＫＴＹＱＨＦＴＬＥＫＡＹＬＲＥＤＦＦＷＡＦＴＰＡＡＧＤＦＩＲＦＲＦＦＱＰＬＲＬＥＲＦＦＦＲＳＧＮＩＥＨＰＥＤＫＬＦＮＴＳＶＥＶＬＰＦＤＮＰＱＳＤＫＥＡＬＱＥＧＲＴＡＴＬＲＹＰＲＳＰＤＧＹＬＱＩＧＳＦＹＫＧＶＡＥＧＥＶＤＰＡＦＧＰＬＥＡＬＲＬＳＩＱＴＤＳＰＶＷＶＩＬＳＥＩＦＬＫＫＡＤ

Claims (8)

  1. （ｉ）ＧｎＴＩＶａ又はＧｎＴＩＶｂ、並びに
    （ｉｉ）ＧｎＴＶ
    の発現を減少させるように遺伝子改変されている細胞株。
  2. ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が完全に消失されている、請求項１に記載の細胞株。
  3. 前記細胞株が、β－ガラクトシドα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）及び／又はα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）を過剰発現するように更に遺伝子改変されている、請求項１又は２に記載の細胞株。
  4. 前記細胞株が、昆虫細胞株、鳥類細胞株、又は哺乳動物細胞株、好ましくはヒト細胞株である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞株。
  5. 前記細胞株が、マスコビーダック細胞（ＡＧＥ．ＣＲ（商標））、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）、メイディンダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７）、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒトニューロン前駆細胞（ＡＧＥ１．ＨＮ（商標）、ＮＣ５Ｔ１１）、ヒト胎児由来網膜芽細胞（Ｐｅｒ．Ｃ６）、骨髄腫細胞株（ＨＭＣＬ、ＭＭ．１、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ８２２６）、ＣＭＬ腫瘍細胞株（ＮＭ、ＮＭ－Ｆ９）、ハイブリッドＨＥＫ２９３及びリンパ腫細胞（ＨＫＢ１１）、並びにヒト羊膜細胞由来ＣＡＰ細胞からなる群から選択される細胞株に由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞株。
  6. 前記細胞株が、アデノウイルスのＥ１領域及びｐＩＸ領域の遺伝子産物をコードする少なくとも１つの核酸を含むヒト初代羊膜細胞に由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞株。
  7. 細胞における目的の組み換え糖タンパク質の発現方法であって、
    ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少していない細胞株において発現される同じ組み換え糖タンパク質と比較した場合、前記糖タンパク質が、ジアンテナ型Ｎ－グリカンの割合が著しく増加したＮ－グリカンを有し、上記方法が、
    （ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞株を準備する工程と、
    （ｂ）前記細胞株において目的の前記糖タンパク質を発現する工程と、
    （ｃ）前記細胞又は細胞培養上清から前記糖タンパク質を単離する工程と、
    を含む、方法。
  8. 前記組み換え糖タンパク質が、以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれかに記載の組み換え糖タンパク質である、請求項７に記載の方法：
    （Ａ） ＧｎＴＩＶａ／ｂ及び／又はＧｎＴＶの発現が減少していない細胞株において発現される同じ組み換え糖タンパク質と比較した場合、ジアンテナ型Ｎ－グリカンの割合が著しく増加し、かつテトラアンテナ型Ｎ－グリカンの割合が著しく減少したＮ－グリカンを有する組み換え糖タンパク質であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞株において発現された、組み換え糖タンパク質；
    （Ｂ） 前記Ｎ－グリカンのアンテナの少なくとも８０％が、２，６結合型シアル酸によって末端化される、（Ａ）に記載の組み換え糖タンパク質；
    （Ｃ） 前記糖タンパク質が、α１－抗トリプシン（ＡＡＴ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）、及びＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１阻害剤；Ｃ１ Ｉｎｈ）からなる群から選択される、（Ａ）又は（Ｂ）に記載の組み換え糖タンパク質；及び
    （Ｄ） 前記糖タンパク質が、哺乳動物の糖タンパク質である、（Ａ）～（Ｃ）のいずれかに記載の組み換え糖タンパク質。
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