EA028491B1 - СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОЗИЛИРОВАННОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ МОЛЕКУЛЫ CTLA4Ig - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения гликозилированной рекомбинантной молекулы CTLA4Ig в процессе культивирования клеток СНО в присутствии дексаметазона, где CTLA4Ig представляет собой молекулу, слитую из антигена-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) и иммуноглобулина (Ig).

Description

Настоящее изобретение относится к новым способам культивирования клеток млекопитающих, которые продуцируют белковый продукт, предпочтительно гликозилированный белковый продукт. Осуществление способов культивирования клеток приводит к высокой жизнеспособности клеток и может также приводить к высокому качеству продукта и производительности, увеличению фазы роста и снижению смертности в фазе гибели.

Уровень техники

Культура клеток животных, в частности культура клеток млекопитающих, предпочтительно используется для экспрессии рекомбинантно продуцируемых, гликозилированных белков для терапевтического и/или профилактического применения. Паттерны гликозилирования рекомбинантных гликопротеинов имеют большое значение, поскольку олигосахаридные боковые цепи гликопротеинов влияют на функцию белка, а также внутримолекулярные взаимодействия между различными участками белка. Такие внутримолекулярные взаимодействия принимают участие в конформации белка и третичной структуре гликопротеина (см., например, А. ХУПНусг и соавт., 1990, Вюсйет181гу, 29:4175-4180; Най, 1992, Сигг. Ор. Се11 ΒίοΙ, 4:1017-1023; Ооосйее и соавт., 1991, Вю/Тесйпо1, 9:1347-1355; и К.В. Рагекй, 1991, Сигг. Ор. ЗйисО ΒίοΙ., 1:750-754). Кроме того, олигосахариды могут функционировать для нацеливания определенного полипептида к определенным структурам на основе специфических клеточных углеводных рецепторов (М.Р. ВеуПассща и соавт., 1993, ί. С1ш. 1пуекк, 91:379-387; К.М. №1коп и соавт., 1993, ί. С1ш. 1пуек1, 91:1157-1166; К.Е. Ыогдагб и соавт., 1993, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск И8А, 90:1068-1072; и Υ. 1та1 и соавт., 1993, ЫаШге, 361-555-557).

Терминальный компонент сиаловой кислоты олигосахарида боковой цепи гликопротеина, как известно, оказывает влияние на многочисленные характеристики и свойства гликопротеина, включая абсорбцию, растворимость, термостойкость, период полураспада в сыворотке, выведение из сыворотки, а также его физическо-химическую структуру/поведение и его иммуногенность (А. Уагкц 1993, О1усоЪю1оду, 3:97-100; К.В. Рагекй, 1б, Ооосйее и соавт., 1б., ί. Раи1коп и соавт., 1989, Т1В§, 14:272-276; и А. КоЪа1а, 1992, Ет. ί. Вюсйет., 209:483-501; ЕЦ. Ьатекоп и соавт., 1983, Агсй. Вюсйет. Вюрйук., 220:572575; и Е. Ткиба и соавт., 1990, Еиг. ί. Вюсйет., 188:405-411).

Количество сиаловой кислоты в гликопротеинах зависит от двух противоположных процессов: внутриклеточных добавлений сиаловой кислоты с помощью действия сиалилтрансферазы и внеклеточное удаление сиаловой кислоты с помощью расщепления сиалидазой.

Внутриклеточное добвление сиаловой кислоты является последним этапом процесса гликозилирования, который протекает в транс-Гольджи. Данный процесс включает в себя ферментативный перенос сиаловой кислоты от нуклеотида предшественника сахара, СМР-сиаловую кислоту к доступной галактозе на развивающейся структуре гликана, которая прикреплена к вновь синтезированному белку. Возможные ограничения в процессе, которые могут привести к неполному сиалированию, включают наличие СМР-сиаловой кислоты, действие фермента сиалилтрансферазы, количество галактозы на развивающейся структуре гликана и действие фермента галактозиалтрансферазы. Значительное количество исследований было направлено на максимальное увеличение сиалирования посредством сверхэкспрессии гена и усиления ферментной активности сиалилтрансферазы и гликозилтрансферазы. 2йапд и совт. (Вюсйип Вюрйук Ас1а 1425(3): 1998, 441-52) сообщают, что экспрессия человеческой а2,6-сиалилтрансферазы в клетках СНО с образованием тканевого активатора плазминогена (1РА) усиливает а2,6-сиалирование 1РА. ХУебзеП и соавт. (Яа1 Вю1есйпо1 17(11): 1999, 1116-21) сообщают, что коэкспрессия α2,6сиалилтрансферазы и β 1,4-галактозилтрансферазы вызывает более чем 90% сиалирования ТНК-1РА и ТОТКДдО. Кроме того, добавки с соответствующим количеством марганца (Мп²'), кофактора для β 1,4галактозилтрансферазы, значительно снижают количество гНиЕРО в нижней сиалированной фракции, повышают заполнение углеводных сайтов и уменьшают разветвление углеводов (2йапд и соавт. 1998) по отношению к биантенным структурам в этих низших сталированных видах (СгохееП и соавт. Вю1есйпо1 Вюепд 96(3):538-49, 2007).

Количество сиаловой кислоты в гликопротеинах также зависит от внеклеточного удаления сиаловой кислоты путем расщепления сиалидазой. Огатег и Ооосйее (Вю1есйпо1 Ргод 9(4):366-73, 1993) показали увеличение лактатдегидрогеназы (ЬОН), что означает увеличение лизиса клеток, связанное с увеличением активности внеклеточной сиалидазы в перфузионных культурах СНО. Ои и соавт. ( Вю1есйпо1 Вюепд 55(2):390-8, 1997) также показали заметную потерю терминальной сиаловой кислоты интерферона-γ (ΙΡΝ-γ) совместно со снижением жизнеспособности клеток СНО и сопутствующим увеличением гибели клеток на протяжении длительного периодического культивирования.

Таким образом, важно замедлить начало гибели клеток и улучшить жизнеспособность клеток для уменьшения или предотвращения этого эффекта деградации.

Как правило, уровни экспрессии белка в системах на основе культур клеток млекопитающих значительно ниже, чем в микробных системах экспрессии, например, системах экспрессии на основе бактерий или дрожжевых грибов. Однако клетки бактерий и дрожжевых грибов ограничены в своей способности оптимальной экспрессии высокомолекулярных белковых продуктов, правильной укладки белка, имею- 1 028491 щего сложную пространственную структуру, и/или обеспечения необходимых посттрансляционных модификаций для созревания экспрессированного гликопротеина, тем самым влияя на иммуногенность и скорость клиренса продукта.

В результате ограничений культивирования клеток животных или млекопитающих, в частности клеток животных и млекопитающих, которые производят рекомбинантные продукты, были исследованы манипуляции различными параметрами, включая использование сосудов для культивирования большого размера; изменение основных условий культивирования, таких как температура инкубации, концентрация растворенного кислорода, рН, и т.п.; использование различных типов среды и добавок к среде; и увеличение плотности культивируемых клеток. Кроме того, усовершенствование способа культивирования клеток млекопитающих помогает в достижении способности к увеличению периода работы для увеличения концентрации конечного продукта с сохранением при этом высокого качества продукта. Важным параметром качества продукта является степень и завершенность гликозилирования структуры полипептидного продукта, содержание сиаловой кислотой широко используют в качестве показателя качества гликопротеина.

Продолжительность способов культивирования клеток, в особенности прерывистых способов, обычно ограничена оставшейся жизнеспособностью клеток, которая, как правило, снижается в ходе проведения. Поэтому желательно обеспечить максимально возможное продление высокой жизнеспособности клеток. Проблемы качества продукта также являются основанием для минимизации снижения плотности жизнеспособных клеток и поддержания высокой жизнеспособности клеток, в то время как гибель может высвобождать сиалидазы в надосадочную жидкость культуры, что может снижать содержание сиаловой кислоты экспрессированного белка. Проблемы очистки белка являются еще одним основанием для минимизации снижения плотности жизнеспособных клеток и поддержания высокой жизнеспособности клеток. Наличие клеточного дебриса и содержание мертвых клеток в культуре может негативно влиять на способность к выделению и/или очистке белкового продукта в конце периода культивирования. Поддерживание жизнеспособности клеток в течение длительного времени в культуре, таким образом, сопутствует уменьшению загрязнения культуральной среды клеточными белками и ферментами, например, клеточными протеазами и сиалидазами, которые могут привести к деградации и окончательной потери качества желаемого гликопротеина, продуцируемого клетками.

Различные параметры были исследованы для достижения высокой жизнеспособности клеток в культурах клеток. Один параметр включает разовое снижение температуры культивирования после начального культивирования при 37°С (например, Кое881ег и соавт., 1996, Еп/утс апб МюгоЫа1 Тесйпо1оду, 18:423-427; патенты США № 5705364 и 5721121 Т. ЕюНеуеггу и соавт., 1998; патент США № 5976833 К. Еигика\уа и соавт., 1999; патент США № 5851800 Ь. Абатзоп и соавт.; \УО 99/61650 и \УО 00/65070 СепеШесН. 1ис.; \УО 00/36092 Вюдеп, 1ис.; и патент США № 4357422 Отатб и соавт.).

Другие исследованные параметры включали добавление компонентов к культуре. Ингибитор фактора роста сурамин, как было показано, предотвращает апоптоз во время экспоненциального роста клеток К:СусЕ СНО (2йаи§1 и соавт., Вю1есЬио1. Ргод. 2000, 16, 319-325). Однако сурамин не защищает против апоптоза в фазе гибели. В результате, сурамин был способен поддерживать высокую жизнеспособность в фазе роста, но не позволял продлить продолжительность жизни культуры. Те же авторы сообщают, что для клеточной линии 111-10РЕ СНО сульфат декстрана и сульфат поливинила могут, подобно сурамину, увеличить 3 дневную плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность по сравнению с контрольной культурой. Однако о влиянии сульфата декстрана или сульфата поливинила в фазе гибели не сообщается. Также сообщается, что сурамин, сульфат декстрана и сульфат поливинила являются эффективными в предотвращении агрегации клеток.

Влияние дополнения среды культуры клеток насекомых дексаметазоном или Νацетилманносарнином на комплексное гликозилирование белков, включая добавление терминальной сиаловой кислоты к Ν-связанным олигосахаридам, приготовленных с помощью экспрессионной векторной системы на основе бакуловируса (ВЕУ§), описаны в патенте США № 6472175 Воусе Тйотрзои ЕъО1и1е Еог Р1ап1 КезеатсЬ, 1ис. (ЙЬаса, ΝΥ), 2002.

Белковые терапевтические средства являются по существу гетерогенными в связи с их размерами, сложностью структуры и характером биологического получения (СЬтпо и Мйе-81ш5, Вю1ес1то1.

2004; 22:1383-1391). Даже в растворе чистого белка будет существовать определенный процент низкомолекулярных фрагментов, высокомолекулярных соединений и различные степени химических модификаций. Образование высокомолекулярных соединений обычно связано с агрегацией белка, которая является общей проблемой, встречающейся при производстве биопрепаратов. Как правило, наличие агрегатов считается нежелательным по причине опасения того, что агрегаты могут привести к иммуногенной реакции или могут вызывать побочные явления при введении (Стошетей и соавт, ΆΛΡδ 1. 2006; 8:Е572579). Хотя некоторые типы агрегатов биопрепаратов могут действовать нормально, это остается важным для сохранения однородности в качестве продукта, поскольку однородность продукта является необходимым условием для разрешения контролирующего органа.

Агрегаты белков могут появляться с помощью нескольких механизмов и встречаться на каждом этапе в ходе способа изготовления. В культуре клеток секретируемые белки могут подвергаться воздей- 2 028491 ствию условий, которые неблагоприятны для стабильности белка; но чаще всего, накопление больших количеств белка может привести к внутриклеточной агрегации вследствие любых взаимодействий развернутых белковых молекул или к неспособности распознавания появляющейся цепи пептида молекулярными шаперонами, ответственными за надлежащую укладку (Сгот\ус11 и соавт., ЛЛР8 1. 2006; 8:Е572-579). В эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) клеток дисульфидная связь вновь синтезированного белка формируется в окислительной среде. При нормальных условиях сульфгидрильные группы белка обратимо окисляются до протеиндисульфидов и сульфеновых кислот, но наиболее высокоокисленные структуры, такие как сульфиновые и сульфоновые кислотные формы цестеинов белка являются необратимыми (ТЬотав и Ма1Й5, Ехр СегоШо1. 2001; 36:1519-1526). Сверхокисленные белки могут содержать неправильные дисульфидные связи или иметь смешанные дисульфидные связи с другими относящимися к ЭР белками; в любом случае, это приводит к неправильной укладке белка и агрегации. Поэтому важно для сохранения свойств контролировать окислительную среду в ЭР. В связи с этим, Сио//о и КаЬег (Ν;·ιΙ Се11 Βίο1. 1999; 1:130-135) с самого начала показали, что в дрожжевых грибах глютатион буферизировал против сверхокисления ЭР и позже СЬакгауайЫ и Ви11еЫ (1 Βίο1 СЬет. 2004; 279:39872-39879) подтвердили, что глютатион в клетках млекопитающих также необходим для регуляции формирования природных дисульфидных связей в белках, вступающих на секреторный путь.

С увеличением концентрации продукта в культуре, как можно наблюдать в способах культивирования клеток, качество продукта снижается, как установлено измерением содержания сиаловой кислоты гликоструктуры олигосахарида. Как правило, существует нижний предел допустимого содержания сиаловой кислоты, что установлено исследованиями выведения лекарственных веществ. Высокий избыток белка, произведенного клетками в культуре, оптимально сопровождается высоким качеством белка, который в конечном итоге восстанавливают для использования по назначению.

Рекомбинантно полученные белковые продукты, которые правильно гликозилированы, становятся все более медицински и клинически важными для использования в качестве терапевтических, лечебных и профилактических средств. Таким образом, разработка надежных способов культивирования клеток, которые экономично и эффективно достигают увеличения концентрации конечного белкового продукта, в сочетании с высоким уровнем качества продукта, такого, который определяется содержанием сиаловой кислоты, выполняет как желательную, так и необходимую задачу в уровне технике.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новым способам получения белков, предпочтительно рекомбинантных белковых продуктов, более предпочтительно гликопротеиновых продуктов, с помощью культур клеток животных или млекопитающих. Эти новые способы обеспечивают увеличение плотности жизнеспособных клеток на поздней фазе, жизнеспособности клеток, продуктивности и содержания сиаловой кислоты и снижение агрегации белка.

Один из аспектов данного изобретения касается добавления глюкокортикоида, в частности дексаметазона, к среде. В этом аспекте способ культивирования клеток по данному изобретению может успешно обеспечить увеличение удельной продуктивности, например, гликопротеина, в частности гликозилированной рекомбинантной молекулы СТЬА41д. которая представляет собой слитую молекулу мутантного внеклеточного домена антигена-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬА4) и иммуноглобулина (1д), а также увеличение содержания сиаловой кислоты гликопротеина, продуцируемого культурой клеток. Более конкретно, в соответствии с данным изобретением, добавление глюкокортикоида в течение периода культивирования клеток поддерживает высокую жизнеспособность клеток в культуре и может обеспечивать высокое качество и количество получаемого продукта в продолжение всего способа культивирования. Кроме того, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, добавление глюкокортикоида в способе культивирования может позволить успешно продлить продуктивную фазу культивирования (фазу продукции). В способе продления фазы продукции титр целевого продукта увеличивается; качество продукта, которое характеризуется содержанием сиаловой кислоты, поддерживается на высоком уровне; уровень агрегации белка поддерживается на низком уровне, а жизнеспособность клеток также поддерживается на высоком уровне. Кроме того, продление фазы продукции, связанной со способами культивирования изобретения, позволяет получать продукт сверх того, который продуцируется в течение стандартной фазы продукции.

В одном конкретном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ, в котором удельная продуктивность увеличена, уровень агрегации белка снижен и содержание сиаловой кислоты получаемого гликопротеина увеличено с помощью добавления глюкокортикоида. В соответствии с данным аспектом добавление глюкокортикоида поддерживает высокую жизнеспособность клеток в культуре, тем самым позволяя продлить фазу продукции, в течение которой титр продукта, предпочтительно гликозилированной рекомбинантной молекулы СТЬА41§, возрастает, а качество продукта, которое характеризуется содержанием сиаловой кислоты, поддерживается на высоком уровне. Добавление глюкокортикоида может минимизировать преобладающее соотношение между титром белка и содержанием сиаловой кислоты при получении продукта во время способа культивирования клеток. Таким образом, добавление глюкокортикоида оказывает положительный эффект на усовершенствование важного параметра качества способа культивирования, т.е. математического продукта конечный (т.е. последний) титр х конечная (т.е.

- 3 028491 последнее) сиаловая кислота X содержание мономера (конечный титр х конечная сиаловая кислота х конечное содержание мономера).

В одном аспекте данного изобретения глюкокортикоидное соединение добавляют к культуре во время посева или после посева, т.е. перед началом начальной фазы гибели или в течение начальной фазы роста, или в течение второй половины начальной фазы роста, или в или почти в конце начальной фазы роста. В соответствии с данным аспектом изобретения фаза роста увеличивается и/или начало фазы гибели задерживается на определенный период времени, а именно на несколько дней.

В другом предпочтительном аспекте данного изобретения, и как далее описано в данном изобретении, способ культивирования клеток для получения гликозилированной рекомбинантной молекулы СТЬА41§ включает питание клеток питательной средой, содержащей дексаметазон, причем концентрация дексаметазона поддерживается в культуре клеток в пределах от 0,1 до 10 мкМ.

В другом предпочтительном аспекте данного изобретения, и как далее описано в данном изобретении, недавно разработанные способы культивирования клеток, включающие добавление глюкокортикоидного соединения, особенно подходят для получения растворимых молекул СТЬА4 и растворимых мутантных молекул СТЬА4, таких как СТЬА41§, с помощью генно-инженерных клеток-хозяев для экспрессии и получения данных белков. Предпочтительные варианты настоящего изобретения включают культивирование клеток, продуцирующих СТЬА41§, при наличии добавленного глюкокортикоидного соединения в ходе способа культивирования для достижения больших объемов высококачественных продуктов СТЬА41§, что определяется с помощью измерения сиаловой кислоты и/или низкой агрегации белка конечных продуктов.

Другие аспекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут оценены после чтения подробного описания сущности изобретения и рассмотрения чертежей/фигур.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана эспрессия β 1,4-галактозилтрансферазы (1А) и а2,3-сиалилтрансферазы (1В), обычно возрастающая с концентрацией дексаметазона (ΌΕΧ) в ΌΕΧ обработанных клетках, как описано в примере 1. ΌΕΧ был добавлен на 2-й день после посева к культурам в концентрациях от 0,1 до 10 мкМ. На пятый день после посева образцы клеток были собраны и все клеточные лизаты были приготовлены, разделены на 4-15% градиентным гелем и исследованы с антителом для каждой гликотрансферазы. Пятно затем повторно зондировали антителом бета-актина для определения соответствующей загрузки.

На фиг. 2 показано защитное воздействие ΌΕΧ на клетки, приводящее к снижению активности сиалидазы в надосадочной жидкости культуры, как описано в примере 1. Профили жизнеспособности клеток (2А) и абсорбции исследуемой сиалидазы (2В) в ходе периода культивирования между обработкой ΌΕΧ и необработанными культурами. Обработанные ΌΕΧ в концентрациях от 1 мкМ производили на 2 день. Значения отражают среднюю величину и стандартное отклонение данных из пяти экспериментов.

На фиг. 3 показаны улучшения в сиалировании гликопротеина в обработанных культурах с аналогами глюкокортикоида, гидрокортизоном (НУС) и преднидозолоном (РКП), как описано в примере 1. Нормализированное общее содержание сиаловой кислоты (3А) и нормализированная фракция Νсвязанных сталированных видов (3В) культур, обработанных с ΌΕΧ, НУС и РКЭ соответственно. Обработку начинали на второй день после посева в концентрации 0,1, 1 и 10 мкМ в среду для каждого соединения. Значения каждого параметра представлены как средняя величина±различие/2 (п=2).

На фиг. 4 показано, что повышение сиалирования с помощью ΌΕΧ было блокировано с помощью антагониста глюкокортикоида КН-486, как описано в примере 1. Нормализированное общее содержание сиаловой кислоты (4А) и нормализированная фракция Ν-связанных сталированных видов (4В) в присутствии и отсутствии КИ-486. КИ-486 при 0 или 1 мкМ вносили в суспензию культуры клеток через 48 ч после посева. ΌΕΧ 0,1, 1 и 10 мкМ затем добавляли в культуры через 24 ч. Значения каждого параметра представлены как средняя величина±различие/2 (п=2).

На фиг. 5 показано, что обработка ΌΕΧ клеток СНО культур с подпиткой в 5-л биореакторах приводит к увеличению содержания сиаловой кислоты и сталированных видов фракций, как описано в примере 1. Нормализированное общее содержание сиаловой кислоты (5А) и нормализированная фракция Νсвязанных сталированных видов (5В) от необработанной и обработанной культур в способе культивирования. Значения каждого параметра представлены как средняя величина±среднее отклонение (п=3). Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение.

На фиг. 6 показана способность ΌΕΧ к улучшению сиалирования гликопротеина при 7, 10 и 20 л масштабе биореакторов, как описано в примере 1. Нормализированная общая сумма молярного соотношения сиаловой кислоты против нормализированной сиалированной фракции обработанных и необработанных ΌΕΧ культур от различных периодов суммируются. Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение.

На фиг. 7 показан процент снижения высокомолекулярных (НУМ) видов в 1§О-слитых белках, продуцируемых клетками СНО, обработанными дексаметазоном (ΌΕΧ), как описано в примере 2. На фиг. 7А все клетки первоначально были культивированы вместе в одной колбе в течение двух дней, а

- 4 028491 затем разделены на две группы, причем половина из них получала одну дозу ΌΕΧ в конечной концентрации 1 мкМ в основной среде. Надосадочные жидкости собирали на 10 день и очищали прежде 8ЕСВЭЖХ методом для определения процента НУМ видов. Точки на графике означают (±δ.Ό.) результаты от пяти встряхиваемых колб в одном эксперименте. **Р < 0.01 по сравнению с контролем (СОЫ). На 7В ΌΕΧ при различных концентрациях добавляли к культурам клеток СНО на 2 день и собирали надосадочные жидкости на 10 день. Точки на графике означают результаты, полученные от дублирующих колб. На 7С все культуры производили одновременно, но 1 мкМ ΌΕΧ добавляли в различные дни, давая различное время инкубации, как указано, тогда как клетки собирали одновременно на 10 день. Точки на графике означают результаты от дублирующих колб.

На фиг. 8 показано повышение экспрессии глутатионредуктазы в клетках СНО, обработанных дексаметазоном (ΌΕΧ), как описано в примере 2. ΌΕΧ при различных концентрациях добавляли к культурам клеток в день посева и образцы клеток собирали на 5 день. Полные клеточные лизаты были разделены на 4-15% градиентном геле. После определения глутатионредуктазы, одинаковые пятна были использованы для определения β-актина для сравнения загрузки образцов.

На фиг. 9 показано снижение процентного содержания видов НУМ в 1дО-слитых белках, инкубированных с С8Н ίη νίίτο, как описано в примере 2. Восстановленный глутатион (С8Н) при 0, 1 и 3 мМ конечных концентраций добавляли к трис-ацетатному буферу (рН 7.5) раствора очищенных 1дО-слитых белков и смешанные С8Н и белки инкубировали при 37°С в течение 1 ч перед §ΕС-ВЭЖХ методом. Точки на графике означают (±δ.Ό.) четыре определения из двух экспериментов. *Р < 0.05 по сравнению с контролем (0 мМ СЗН).

На фиг. 10 показано ослабление эффектов дексаметазона (ΌΕΧ) в присутствии антагониста рецептора глюкокортикоида КП-48б, как описано в примере 2. На фиг. 10А все клеточные лизаты приготовлены из необработанных клеток НерС-2 и СНО и разделены на 4-15% градиентном геле. Образец НерС-2 использовали в качестве контроля человеческого происхождения для цели подтверждения первичных антител. На фиг. 10В КП-486 в 1 мкМ вводили в однодневную культуру после посева (1 день) и предварительно обработанные КЛ-486 клетки СНО разделяли на 2 день, причем половина из них получала одну дозу ΌΕΧ при конечной концентрации 0.1 мкМ в основную среду. Образцы клеток собирали на 10 день; все другие процедуры были такими же, как на фиг. 2. На фиг. 10С КЛ-486 при 1 мкМ вводили в культуры на 1 день, а ΌΕΧ затем добавляли к Ки-486-предварительно обработанным культурам в конечной концентрации любой из 0.1 или 1 мкМ на 2 день. Точки на графике означают результаты от дублирующих колб.

На фиг. 11 показано, что клеточная гибель ингибируется с помощью ΌΕΧ в культурах клеток СНО в среде, не содержащей сыворотки, как описано в примере 3. Доза-зависимая кривая эффектов ΌΕΧ на плотность жизнеспособных клеток (11А) и жизнеспособность (11В) с обработкой, начатой на 2 день. Кривая зависимости от времени эффекта ΌΕΧ на плотность жизнеспособных клеток (11С) и жизнеспособность (11Ό) с 1 мкМ обрабатываемой концентрацией. Каждое значение означает данные, полученные от экспериментов, проведенных в двух повторах.

На фиг. 12 показано снижение удельной скорости роста клеток СНО, в то время как удельная продуктивность клеток повышается с помощью ΌΕΧ, как описано в примере 3. Эффекты ΌΕΧ на удельную скорость роста клеток СНО (12А), нормализированная волюметрическая продуктивность (12В). Обработку ΌΕΧ начинали на 2 день. Значения отражают среднее значение и стандартное отклонение данных от пяти экспериментов. Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение.

На фиг. 13 показано, что повышенная регуляция антиапоптотического гена ΟΙΕΖ в ΌΕΧобработанных клетках СНО была подтверждена с помощью цКТ-ПЦР и Вестерн-блоттингом, как описано в примере 3. (13А) ΌΕΧ добавляли в утроенные культуры на 2 день после посева в конечной концентрации 0 и 1 мкМ соответственно. Образцы мРНК были извлечены на 5 и 8 дни после посева. Значения каждого параметра представлены как средняя величина±среднее отклонение (η=3). (13В) ΌΕΧ добавляли в утроенные культуры на 2 день после посева в конечной концентрации 0 и 1 мкМ соответственно. Образцы клеток собирали и все клеточные лизаты приготавливали на 5 и 8 дни после посева.

На фиг. 14 показано подавление гибели под влиянием дексаметазона, включая ΟΙΌΖ и рецептор глюкокортикоида, как описано в примере 3. Процентное повышение (по сравнению с отсутствием обработки ΌΕΧ) конечной жизнеспособности (14А), кратное измерение экспрессии гена ΟΙΌΖ (14В) и индуцированной экспрессии белка ΟΙΌΖ с помощью ΌΕΧ (14С) в присутствии и отсутствии КЛ-486. Ки-486 при 0 или 1 мкМ вводили в суспензию культуры клеток через 48 ч после посева, 0, 0,1 и 1 мкМ ΌΕΧ затем добавляли в культуры спустя 24 ч. Клетки собирали для жизнеспособности, цКТ-ПЦР и Вестернблоттинг-анализа. Каждое значение, представленное на панели А, представляет собой среднее значение данных, полученных от экспериментов, проведенных в двух повторах. Каждое значение, представленное на панели В, представляет собой среднее значение и стандартное отклонение данных, полученных от экспериментов, проведенных в трех посторах.

На фиг. 15 показано, что обработка ΌΕΧ клеток СНО культуры с подпиткой в 10-л биореакторах

- 5 028491 приводит к улучшению УС.ГО жизнеспособности, титра и молярного соотношения сиаловой кислоты, как описано в примере 3. Плотность жизнеспособных клеток (15А), жизнеспособность (15В) и нормализированный титр (15С) профили необработанных культур и обработанных культур с ΌΕΧ, начало обработки на 2 и 7 день. Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение.

На фиг. 16 показаны эффекты ΌΕΧ на клеточный рост клеток СНО культуры с секрецией СТЬА41§. Доза-зависимые кривые эффекта ΌΕΧ на плотность жизнеспособных клеток (16А) и жизнеспособность (16В), обработанных с ΌΕΧ в конечной концентрации 0, 0,001, 0,01, 1 и 10 мкМ соответственно. Обработку начинают на второй день после посева, и каждое значение представляет собой среднюю величину данных, полученных от экспериментов, проведенных в двух повторах.

На фиг. 17 показаны влияния ΌΕΧ на молярное соотношение сиаловой кислоты и уровень ΗΜν СТЬА41§. На фигуре показаны общее молярное соотношение сиаловой кислоты (17А) и видов ΗΜν (17В) культур клеток, обработанных ΌΕΧ в конечной концентрации 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ соответственно. Обработку начинают на второй день поле посева, и каждое значение представляет собой среднюю величину данных, полученных от экспериментов, проведенных в двух повторах. Значения, представленные на панели А, представляют собой нормализированные значения, которые являются фактическим значением, деленным на произвольное значение.

На фиг. 18 показаны возможности включения ΌΕΧ в больших масштабах получения рекомбинантного гликопротеина, как описано в примере 5. На фигуре показана плотность жизнеспособных клеток (18А), жизнеспособность (18В), нормализированный титр (18С) и нормализированное содержание сиаловой кислоты (18Ό) получаемого рекомбинантного гликопротеина при 7 л (п=16) и 500 л (п=6) и 5000 л (п=3) масштабах соответственно. Значения отражают среднюю величину и стандартное отклонение данных от множественных экспериментов на каждом масштабе. Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение. Одинаковый делитель был использован для нормализации всех масштабов.

На фиг. 19 показаны последовательность нуклеотида (8ΕΟ ГО N0: 1) и кодируемая аминокислотная последовательность (8ΕΟ ГО N0: 2) СТЬА4, имеющего сигнальный пептид, аминокислотную последовательность дикого типа внеклеточного домена СТЬА4, начиная с метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, и участок 1д.

На фиг. 20 показаны последовательность нуклеотида (8ΕΟ ГО N0: 3) и кодируемая аминокислотная последовательность (8ΕΟ ГО N0: 4) мутантной молекулы СТЬА4 (Ь104ВА29¥1§), имеющей сигнальный пептид, мутантный внеклеточный домен СТЬА4, начинающийся с метионина в положении +1 и заканчивающийся аспарагиновой кислотой в положении +124, или начинающийся с аланина в положении -1 и заканчивающийся аспарагиновой кисотой в положении +124, и участок 1д.

На фиг. 21 показаны последовательность нуклеиновой кислоты (8ΕΟ ГО N0: 5) и кодируемая полная аминокислотная последовательность (8Ε0 ГО N0: 6) человеческого рецептора СТЬА4 (именуемого в данном изобретении как дикий тип СТЬА4) слитого с сигнальным пептидом онкостатином М (положение от -26 до -2) (патенты США № 5434131 и 5844095).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новым способам получения белков, предпочтительно рекомбинантных белковых продуктов, более предпочтительно гликопротеиновых продуктов, в культуре клеток млекопитающих или животных. Данные способы обеспечивают повышение плотности жизнеспособных клеток, жизнеспособности клеток, продуктивности и содержания сиаловой кислоты и снижение агрегации белка.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения изобретение направлено на способ культивирования клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление гликокортикоидных соединений к культуре клеток.

Глюкокортикоидные соединения включают, но не ограничиваются ими, гидрокортизон (представленный от 8щта-А1бпс1т δΐ. Ьош8, МО), преднизон (представленный от §1дша-А1±тсй), преднизолон (представленный от §1§ша-А1бт1сЬ), метилпреднизолон (представленный от §1£ша-А1±тсй), дексаметазон (представленный от §1§ша-А1±тсй), бетаметазон (представленный от §1§ша-АШпсЬ), триамцинолон (представленный от §1дша-АШтюй), ацетат флудрокортизона (представленного от Зщша-АИпсй). Соединения являются общедоступными из перечисленных источников или легко получаемы с помощью средств, известных любому специалисту в данной области техники.

Предпочтительные глюкокортикоидные соединения включают, но не ограничиваются ими, гидрокортизон, преднизолон, бетаметазон и дексаметазон. Более предпочтительным является дексаметазон.

В одном из вариантов осуществления изобретения глюкокортикоидное соединение добавляют при посеве или он может быть компонентом основной среды. Посев проводится в день 0.

В одном из вариантов осуществления изобретения глюкокортикоидное соединение добавляют после посева, т.е. он не присутствует в основной среде и не присутствует при посеве. Предпочтительно глюкокортикоидное соединение добавляют на 1 день культивирования или позже.

- 6 028491

Согласно изобретению глюкокортикоидное соединение может быть добавлено к культуре клеток один раз, два раза, три раза или любое количество раз в течение определенного периода времени. Одно или более глюкокортикоидных соединений может быть использовано в сочетании. Т.е. любое одно добавление глюкокортикоидного соединения может включать добавление одного или более других соединений глюкокортикоидов. Подобным образом, если есть более одного добавления глюкокортикоидного соединения, различные глюкокортикоидные соединения могут быть добавлены в различных добавлениях. Дополнительные соединения и вещества, включающие глюкокортикоидные соединения, могут быть добавлены к культуре прежде, с или после добавления глюкокортикоидного соединения - во время или не во время определенного периода времени. В предпочтительном варианте существует одно, т.е. однократное, добавление глюкокортикоидного соединения. В предпочтительном варианте добавляют одно глюкокортикоидное соединение.

Согласно изобретению глюкокортикоидное соединение может быть добавлено к культуре клеток с помощью любого способа. Способы добавления глюкокортикоидного соединения включают, но не ограничиваются ими, растворение в ЛМ8О, растворение в органическом растворителе, растворение в воде, растворение в культуральной среде, растворение в питательной среде, растворение в соответствующей среде, в виде, в котором он получен или любой его комбинации.

Предпочтительно ЛЕХ добавляют в качестве раствора, где ЛЕХ является растворенным в этаноле, который затем разбавляют водой для дальнейшего использования (например, такого как добавление ЛЕХ к питательной среде).

Согласно изобретению глюкокортикоидное соединение добавляют для доведения концентрации в культуре до подходящего уровня. В качестве неограничивающих примеров глюкокортикоидное соединение добавляют до концентрации 1 нМ-1 мМ. Предпочтительно глюкокортикоидное соединение добавляют до концентрации 1 нМ-0,1 мкМ или 0,1-10 мкМ; более предпочтительно около 5-15 нМ или 0,5-5 мкМ; более предпочтительно около 10 нМ или 1 мкМ целевого количества.

Согласно изобретению культивирование может проводиться в течение длительного периода времени после добавления глюкокортикоидного соединения. Время проведения культивирования может быть определено любым специалистом в данной области техники на основе важных факторов, таких как количество и качество извлекаемого белка и уровень загрязняющих клеточных веществ (например, белков и ДНК) в надосадочной жидкости в результате клеточного лизиса, который осложняет восстановление представляющего интерес белка.

В конкретных воплощениях способа культивирования клеток и способа повышения жизнеспособности клеток по изобретению, глюкокортикоидное соединение добавляют после посева, а именно перед началом начальной фазы гибели. Предпочтительно глюкокортикоидное соединение добавляют после посева, а именно в течение начальной фазы роста. Более предпочтительно глюкокортикоидное соединение добавляют в течение второй половины начальной фазы роста. Более предпочтительно глюкокортикоидное соединение добавляют в конце или ближе к концу начальной фазы роста.

Начальная фаза роста относится к ростовой фазе, которая наблюдается при отсутствии указанного добавления глюкокортикоидного соединения. Начальная фаза гибели относится к фазе гибели, которая наблюдается при отсутствии указанного добавления глюкокортикоидного соединения.

Начальная фаза роста может заканчиваться, когда начинается начальная фаза гибели, или между начальной фазой роста и начальной фазой гибели может быть стационарная фаза любой продолжительности.

Например, в культуре клеток, в которой начальная фаза роста длится от 0 до 6 дня, а начальная фаза гибели начинается на 7 день, в конкретном варианте глюкокортикоидное соединение добавляют после посева и перед 7 днем. В конкретном варианте, глюкокортикоидное соединение добавляют после посева и на 6 день. В конкретном варианте, глюкокортикоидное соединение добавляют между 1 и 6 днями. В другом конкретном варианте, глюкокортикоидное соединение добавляют с питательной средой на 3-6 дни. В другом конкретном варианте, глюкокортикоидное соединение добавляют примерно на 2 день, или на 2 день.

Было установлено (см. пример 3), что при осуществлении настоящего изобретения жизнеспособность культивируемых клеток продлевается. Условие, такое как добавление глюкокортикоидного соединения, является причиной продления жизнеспособности клеток, если жизнеспособность клеток в культуре выше в период присутствия условия, чем в отсутствие условия.

Таким образом, в другом варианте изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ продления жизнеспособности клеток в культуре, включающий культивирование клеткихозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток; при котором жизнеспособность клеток клеточной культуры продлевается.

Было установлено (см. пример 3), что, когда глюкокортикоидное соединение добавляют после посева и перед началом начальной фазы гибели, смертность в фазе гибели может быть снижена, менее чем смертность в фазе гибели, наблюдаемая при отсутствии глюкокортикоидного соединения.

Таким образом, в другом варианте изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток и (2) способ снижения смертности в фазе гибели культуры клеток, включающий культивирование клетки- 7 028491 хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток после посева, то есть до начала начальной фазы гибели; при котором смертность в фазе гибели снижается. В более конкретных вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ снижения смертности в фазе гибели культуры клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток после посева, то есть в течение начальной фазы роста; при котором смертность в фазе гибели задерживается. В более конкретных вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ снижения смертности в фазе гибели культуры клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток во время второй половины начальной фазы роста; при котором смертность в фазе гибели снижается. В других конкретных вариантах, изобретение направлено на способ снижения смертности в фазе гибели культуры клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток в конце или примерно в конце начальной фазы роста; при котором смертность в фазе гибели задерживается.

Пример 3 также демонстрирует, что гидрокортизон (НУС), преднизолон (ΡΚΌ) и дексаметазон (ΌΕΧ) все показывают доза-зависимый защитный эффект клеток в обработанных культурах клеток по сравнению с необработанными культурами клеток. Однако высокие концентрации НУС и ΡΚΌ необходимы для достижения одинакового уровня защитного эффекта, который в соответствии с их активностью различается (например, НУС и ΡΚΌ только 5 и 20% которые действуют как ΌΕΧ).

Время проведения способа культивирования клеток, в частности прерывистых способов, обычно ограничено из-за оставшейся плотности жизнеспособных клеток, которая снижается в течение фазы гибели. Более длительный период может позволить достигать более высоких титров. Проблемы качества продукта также является причиной для снижения смертности, гибель клеток может высвобождать сиалидазы в надосадочную жидкость культуры, которая может снижать содержание сиаловой кислоты экспрессируемого белка. Проблемы очистки белка являются еще одной причиной для задержки или торможения фазы гибели. Присутствие клеточного дебриса и содержимого погибших клеток в культуре может отрицательно отразиться на способности к выделению и/или очистке белкового продукта в конце периода культивирования.

Было установлено (см. пример 2), что добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток снижает агрегацию представляющих интерес белков.

Таким образом, в другом варианте изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ снижения процента агрегации белков, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток; при котором процентное содержание высокомолекулярных видов снижается.

Было установлено (см. пример 1), что добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток улучшает сиалирование представляющих интерес белков с помощью увеличения общего содержания сиаловой кислоты и увеличения процентного содержания сталированных видов.

Пример 1 также демонстрирует, что гидрокортизон (НУС), преднизолон (ΡΚΌ) и дексаметазон (ΌΕΧ) все показали доза-зависимое улучшение сиалирования в обработанных культурах клеток по сравнению с необработанными культурами клеток. Однако высокая концентрация НУС и ΡΚΌ были необходимы для достижения одинакового уровня улучшения, которая в соответствии с их активностью различается.

При этом в других вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ для увеличения процента сталированных видов, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток; при котором процентное содержание сталированных видов увеличивается.

Таким образом, в других вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ увеличения общего содержания сиаловой кислоты, включающий культивирование клеткихозяина, которая экспрессирует представляющий интерес гликопротеин; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток; при котором общее содержание сиаловой кислоты увеличилось.

При этом в других вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ снижения скорости десиалирования гликопротеинов в культуре клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес гликопротеин; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток; при котором скорость десиалирования снижена.

Способы и методики, относящиеся к очистке и исследованию гликопротеина

В способах культивирования, охватываемых настоящим изобретением, белок, продуцируемый клетками, как правило, собирали, восстанавливали, выделяли и/или очищали, или по существу очищали, желательно, в конце всего периода культивирования клеток, используя способы выделения и очистки, которые известны и практикуются в уровне техники. Предпочтительно белок, который секретируется культивированными клетками, выделяют из культуральной среды или надосадочной жидкости; однако белок может быть также получен из клетки-хозяина, например клеточного лизата, с использованием спо- 8 028491 собов, которые известны и практикуются в уровне техники, и которые далее описаны ниже.

Сложные углеводы, включающие гликопротеин, получаемый с помощью способа заявленного изобретения, могут быть изучены по стандартной методике, при желании, с помощью общепринятых способов исследования углеводов. Например, способы, такие как блоттинг лектина, широко известный из уровня техники, показывают количественное отношение терминальной маннозы или других Сахаров, таких как галактоза. Окончание моно-, би-, три- или тетра-антенного олигосахарида сиаловыми кислотами может быть подтверждено с помощью высвобождения сахаров от белка с использованием безводного гидразина или ферментных способов и разделением олигосахаридов ионообменной хроматографией, гель-хроматографией, или другими способами, которые известны из уровня техники.

ρί гликопротеина может также быть измерена до или после обработки нейраминидазой для удаления сиаловых кислот. Повышение в ρί после обработки нейроминидазой указывает на присутствие сиаловых кислот на гликопротеине. Углеводные структуры, как правило, встречаются на экспрессированном белке как Ν-связанные или О-связанные углеводы. Ν-связанные и О-связанные углеводы различаются, главным образом, в их внутренних структурах. Ν-связанное гликозилирование относится к добавлению углеводной части посредством ΟΙεΝΆε к остатку аспарагина в цепи белка. Ν-связанные углеводы все содержат общую Μαη1-6(Μαη1-3)Μαηβ1-401οΝΛοβ1-401οΝΛοβ-Κ. основную структуру, где К в данной основной структуре представляет собой остаток аспарагина. Пептидная последовательность произведенного белка будет содержать аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Х-цистеин, где X является любой аминокислотой, кроме пролина.

В отличие от этого, О-связанные углеводы характеризуются общей основной структурой, которая является ОаШАс добавленной к гидроксильной группе треонина или серина. Из Ν-связанных и Освязанных углеводов наиболее важными являются сложные Ν- и О-связанные углеводы. Сложные углеводы содержат несколько антенных структур. Моно-, би-, три- и тетра-внешние структуры важны для добавления терминальных сиаловых кислот. Такие структуры внешней цепи обеспечивают дополнительные участки для конкретных сахаров и соединений, которые включают углеводы белковых продуктов.

В результате, углеводы могут быть исследованы любым способом, известным из уровня техники. Несколько способов известны из уровня техники для исследования гликозилирования и используются в контексте настоящего изобретения. Данные способы дают информацию относительно идентичности и состава олигосахарида, прикрепленного к получаемому белку. Способы для исследования углевода, пригодные по отношению к настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, лектин хроматографию; НРАЕС-РАИ, который использует высокий рН анионообменной хроматографии для разделения олигосахаридов на основе зарядов; ЯМР; масс-спектрометрию; ВЭЖХ; ОРС; моносахаридный композиционный анализ; и последовательное ферментативное расщепление.

Кроме того, способы высвобождения олигосахаридов известны и применяются в уровне техники. Данные способы включают 1) ферментативные способы, которые обычно выполняют с использованием пептид-Х-гликозидазы Р/эндо-в-галактозидазы; 2) способы β исключения с использованием жесткой щелочной среды для высвобождения в основном О-связанных структур; и 3) химические способы с использованием безводного гидразина для высвобождения Ν- и О-связанных олигосахаридов. Исследование может быть выполнено с использованием следующих этапов. 1. Диализ образца против деионизированной воды для удаления солей буфера, с последующей лиофилизацией. 2. Высвобождение неповрежденных цепей олигосахарида безводным гидразином. 3. Обработка неповрежденных цепей олигосахарида безводным метанольным НС1 для освобождения отдельных моносахаридов как О-метил производных. 4. Ν-ацетилирование любой простейшей аминогруппы. 5. Дериватизация для получения пер-Отриметилсилильных метилглюкозидов. 6. Разделение этих производных с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ОЬС) на СР-81Ь8 колонке. 7. Идентификация конкретных производных гликозидов с помощью времени отстаивания из ОЬС и масс-спектроскопии, по сравнению с известными стандартами. 8. Количественная оценка конкретных производных с помощью РГО с внутренними стандартами (13-О-метил-И-глюкоза).

Нейтральные и аминосахара могут быть определены с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии в сочетании с импульсным амперометрическим детектированием (НРЛЕ-РЛИ углеводная система; Июпех Согр.). Например, сахара могут быть высвобождены с помощью гидролиза в 20% (объемное содержание) трифторуксусной кислоте при 100°С в течение 6 ч. Гидролизаты затем высушивают с помощью лиофилизации или с 8рееб-Уас (δαναηΐ ОШгитепЦ). Остатки затем растворяют в 1% растворе тригидрата ацетата натрия и исследуют на ВЭЖХ-А86 колонке (как описывал Апити1а и соавт., 1991, Апа1. ВюсЬет., 195:269-280).

Альтернативно, может быть выполнен анализ иммуноблоттинга углеводов. В данной процедуре белок-связанные углеводы определяются с использованием коммерческой системы обнаружения гликана (ВоеЬгшдег), которая основана на методике окислительного иммуноблоттинга, описанного На§е1Ьеск и соавт. (1993, О1усосопщда1е к. 7:63). Протокол окрашивания рекомендуется производителем, за исключением того, что белок переносится на мембрану из поливинилидендифторида вместо нитроцеллюлозной мембраны и блокирующие буферы содержат 5% альбумина бычий сыворотки в 10 мМ Трис-буфере,

- 9 028491 рН 7.4, с 0 .9% натрия хлорида. Определение проводится с антидигоксигенин антителами, связанными с конъюгатом щелочного фосфата (ВоеЬттдет), 1:1000 разведенные в трис-забуференном растворе с использованием субстратов фосфатазы, хлорид 4-нитросинего тетразолия, 0.03% (вес./об.) и 5-бромо-4 хлоро-3-индол-фосфата 0.03% (вес./об.) в 100 мМ Трис-буфера, рН 9.5, содержащего 100 мМ хлорида натрия и 50 мМ хлорида магния. Полоски белка, содержащие углеводы, обычно визуализируются примерно в течение от 10 до 15 мин.

Углеводы, связанные с белком, могут быть также исследованы с помощью расщепления пептид-Νгликозидазой Р. Согласно этой процедуре, остаток суспендировали в 14 мкл буфера, содержащего 0.18% 8Ό8, 18 мМ бета-меркаптоэтанола, 90 мМ фосфата, 3.6 мМ ЭДТА, при рН 8.6 и нагревали при 100°С в течение 3 мин. После, охлажденный при комнатной температуре, образец разделяют на две равные части. Одна часть, которую не обрабатывают дальше, служит в качестве контроля. Другую часть доводят до примерно 1% ΝΡ-40 детергентом с последующим добавлением 0,2 единиц пептид^-гликозидазы Р (ВоеЬттдет). Оба образца нагревают при 37°С в течение 2 ч и затем исследуют с помощью электрофореза в δΌδ-полиакриламидном геле.

Кроме того, содержание сиаловой кислоты продукта гликопротеина оценивают общепринятыми способами. Например, сиаловая кислота может быть отдельно определена с помощью прямого колориметрического метода (Уао и соавт., 1989, Апа1. Вюсйет., 179:332-335), предпочтительно с использованием трех образцов. Другие способы определения сиаловой кислоты включают использование тиобарбитуровой кислоты (ТВА), как описывал ХУаггеп и соавт. (1959, I. Вю1. СЬет., 234:1971-1975). Еще один способ включает высокоэффективную хроматографию, такую как описывал Н.К. Ода\\а и соавт. (1993,7. СЬтота1одтарЬу, 612:145-149).

Для иллюстрации, для восстановления гликопротеина, выделения и/или очистки, культуральную клеточную среду или клеточный лизат центрифугировали для удаления частиц клеток и клеточного дебриса. Желаемый полипептидный продукт выделяли или очищали от загрязнений растворимых белков и полипептидов с помощью соответствующих способов очистки. Следующие процедуры обеспечивали примерные, но не ограничивающие, способы очистки для белков: разделение или фракционирование на иммуноаффинной или ионообменной колонке; осаждение этанолом; обращенно-фазовая ВЭЖХ; хроматография на смоле, такой как силикагель, или катионообменные смолы, например, ΌΕΑΕ; хроматофокусирование; 8Ό8-ΡΑΟΕ; фракционирование сульфатом аммония; гель-хроматография с использованием, например, Сефадекса Ο-75, сефарозы; хроматография на сефарозе белка А для удаления загрязнений иммуноглобулинов; и т.п. Другие добавки, такие как ингибиторы протеиназ (например, ΡΜ8Ε или протеинкиназа К), могут применяться для подавления протеолитического распада в способе очистки. Специалисту в данной области будет очевидно, что способы очистки для данного представляющего интерес полипептида могут требовать изменений, которые предусматривают изменения в экспрессии рекомбинантного полипептида в культуре клеток. Те способы очистки, которые можно выбрать для углеводов и обогащения для сиаловой кислоты являются особенно предпочтительными, например, ионообменная мягкая гель-хроматография, или ВЭЖХ с использованием катион- или анион-обменных смол, в которых собираются более кислые фракции.

Клетки, белки и культуры клеток

В методах или способах культивирования клеток по данному изобретению, клетки могут быть содержаться в различных культуральных средах, т.е. основной культуральной среде, которые, как правило, известны. Например, способы подходят для применения к большим объемам клеток, поддерживающихся в культуральной среде, которая может быть дополнена питательными веществами и т.д. Обычно, среда для культивирования клеток (также называемая культуральной средой) является термином, который понятен специалисту в данной области техники, и, как известно, относится к питательному раствору, в котором клетки, предпочтительно клетки животного или млекопитающего, растут и которая обычно обеспечивает по меньшей мере один или несколько веществ из следующих: источник энергии (обычно в виде углевода, такого как глюкоза); все незаменимые аминокислоты и, как правило, двадцать основных аминокислот, а также цистеин; витамины и/или другие органические вещества, как правило необходимые в низких концентрациях; липиды и свободные жирные кислоты, например, линолевая кислота; и микроэлементы, например, неорганические соединения или природные элементы, которые, как правило, необходимы в очень низких концентрациях, обычно в микромолярном диапазоне. Среда для культивирования клеток может также быть дополнена для содержания различных дополнительных веществ, таких как гормоны и другие факторы роста, например, инсулин, трансферрин, эпидермальный фактор роста, сыворотка и т.п.; соли, например, кальция, магния и фосфаты, и буферы, например, ΗΕΡ8; нуклеозиды и основания, например, аденозин, тимидин, оксипурин; и гидролизаты белка и ткани, например гидролизированный животный белок (пептон или смесь пептона, который может быть получен от животных биопродуктов, очищенного желатина или растительного материала); антибиотики, например гентамицин; и клеточные защитные вещества, например, полиола Плюроник (Плюроник Р68). Предпочтительной является питательная среда для клеток, которая не содержит сыворотки и продуктов или ингредиентов животного происхождения.

Практикующему специалисту понятно, что клетки животных или млекопитающих культивируют в

- 10 028491 среде, подходящей для культивирования определенных клеток, и которая может быть определена специалистом в данном уровне технике без излишних экспериментов. Коммерчески доступная среда может применяться и включает, например, минимальную поддерживающую среду (МЕМ, §1§ша, δΐ. Ьошк, МО); Нат'к Р10 среду ^1дта); модифицированную Дульбекко среду Игла (ИМЕМ, δί^α); КРМ1-1640 среду (δίβΐηα); НуС1опе культуральную среду для клеток (НуС1опе, Бодаи, ИТ); и химически-определенную (СИ) среду, которая разработана для определенных типов клеток, например, СИ-СНО среда (1иуйгодеи, СагкЪай, СА). К вышеупомянутой примерной среде могут быть добавлены описанные выше дополнительные вещества и ингредиенты, включающие дополнительные вещества в соответствующих концентрациях или количествах, при необходимости или по желанию, и которые известны и применяются в данной области техники с использованием обычных навыков.

Кроме того, условия культивирования клеток, подходящие для способов по настоящему изобретению, те которые обычно применяются и известны для периодического, подпитывающего или непрерывного культивирования клеток, с вниманием к рН, например, около 6,5 до примерно 7,5; растворенному кислороду (О₂), например, около 5-90% насыщения воздухом и диокисью углерода (СОг), перемешивания и влажности, в дополнение к температуре. В качестве иллюстрирующего, но не ограничивающего, примера, подходящая среда культивирования клеток для подпитываемых способов настоящего изобретения включает модифицированную СИ-СНО среду (1иуйгодеи, СагкЪай, СА). Питательная среда может также применяться, как например модифицированная еКИР среда Диуйгодеи, СагкЪай, СА). Предпочтительной является питательная среда также содержащая глюкокортикоиды, например дексаметазон.

Клетки животных, клетки млекопитающих, культивируемые клетки, клетки-хозяева животных или млекопитающих, клетки-хозяева, рекомбинантные клетки, рекомбинантные клетки-хозяева и т.п., являются всеми теми терминами для обозначения клеток, которые могут быть культивированы в соответствии со способами по данному изобретению. Такие клетки являются, как правило, клеточными линиями, получаемыми или происходящими от млекопитающих, и способные к росту и выживанию, когда располагаются в любой монослойной культуре или суспензионной культуре в среде, содержащей подходящие питательные вещества и/или факторы роста. Факторы роста и питательные вещества, которые необходимы для роста и сохранения определенной культуры клеток, могут быть легко определены специалистом в данной области техники опытным путем, таким как описывает, например, Вагиек и δаΐо, (1980, Се11, 22:649); в Маттайаи Се11 СиЙиге, Ей. ТР. Ма!йег, Р1еиит Ргекк, ΝΥ, 1984; и в патенте США № 5721121.

Многочисленные типы клеток можно культивировать в соответствии со способами по настоящему изобретению. Клетки, как правило, клетки животных или млекопитающих, которые могут экспрессировать и выделять, или которые могут быть разработаны на молекулярном уровне для экспрессии и выделения большого количества определенного белка, более предпочтительно, представляющего интерес гликопротеина, в культуральную среду. Будет понятно, что гликопротеин, продуцируемый клеткойхозяином, может быть эндогенным или гомологичным для клетки-хозяина. В качестве альтернативы, и, предпочтительно, гликопротеин является гетерологическим, т.е. чужеродным, для клетки-хозяина, как например, человеческий гликопротеин, продуцируемый и секретируемый клеткой-хозяином яичника китайского хомячка (СНО). Также предпочтительно, гликопротеин млекопитающих, т.е. полученный изначально или происходящий от организма млекопитающего, получают с помощью способов по настоящему изобретению и, предпочтительно, секретируется клетками в культуральную среду.

Примеры гликопротеинов млекопитающих, которые могут быть предпочтительно получены с помощью способов по данному изобретению, включают, без ограничения, цитокины, рецепторы цитокинов, факторы роста (например, ЕОР, НЕН-2.РСР-р. ТОР-α, ТОР-β, РИОР. ЮР-1, ЮР-2, ΝΟΡ, ΝΟΡ-β); рецепторы факторов роста, включающие слитые или химерные белки. Другие неограничивающие примеры включают гормоны роста (например, человеческий гормон роста, бычий гормон роста); инсулин (например, А цепь инсулина и В цепь инсулина), проинсулин; эритропоэтин (ЕРО); колониестимулирующий фактор (например, О-КСФ, ОМ-КСФ, М-КСФ); интерлейкины (например, от Ш-1 до 1Б-12); фактор роста эндотелия сосудов (УЕОР) и его рецептор (УЕОР-К); интерфероны (например, ΙΕΝ-α. β, или γ); фактор некроза опухоли (например, ΤΝΓ-α и ΤΝΓ-β) и их рецепторы, ТРТК-1 и ТЖ-2; тромбопоэтин (ТРО); тромбин; натрийуретический пептид головного мозга (В№); факторы свертывания крови (например, фактор VIII, фактор IX, фактор ван Виллебранда и т.п.); противосвертывающие факторы; тканевой активатор плазминогена (ТРА), например, урокиназа или человеческая мочевина или ТРА тканевого типа; фолликулостимулирующий гормон (РЬН); лютеинизирующий гормон (ЬН); кальцитонин; СИ белки (например, СИ3, СИ4, СИ8, СИ28, СИ19, и т.д.); СТЬА белки (например, СТЬА4); Т-клеточные и В-клеточные рецепторные белки; костные морфогенетические белки (В№§, например, ВМР-1, ВМР-2, ВМР-3, и т.д.); нейротрофические факторы, например, нейротрофический фактор мозга); нейротрофины, например, 3-6; ренин; ревматоидной фактор; КАNΤЕδ; альбумин; релаксин; макрофагальный ингибиторный протеин (например, МГР-1, МГР-2); вирусные белки или антигены; белки поверхности мембраны; белки с ионным каналом; ферменты; регуляторные белки; антитела; иммуномодулирующие белки, (например, НЬА, МНС семейства В7); хоминг рецепторы; транспортные белки; супероксид-дисмутаза ^ОИ); О-белок сопряженный рецептор белков (ОРСКк); мейромодуляторные белки; белки и пептиды,

- 11 028491 связанные с болезнью Альцгеймера, (например, А-бета) и другие, известные из уровня техники. Слитые белки и полипептиды, химерные белки и полипептиды, а также фрагменты или части, или мутанты, варианты или аналоги любых вышеупомянутых белков и полипептидов также включены в состав подходящих белков, полипептидов и пептидов, которые могут быть произведены с помощью способов настоящего изобретения.

Неограниченные примеры клеток-хозяев животных и млекопитающих, пригодных для содержания, экспрессии и получения белков для последующего выделения и/или очистки, включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), такие как СНО-К1 (АТСС ССЬ-61), ΌΟ44 (СЬазш и соавт., 1986, Зот. Се11 Мо1ес. Сепек 12:555-556; и Ко1кекаг и соавт., 1997, ВюсЬет1зДу, 36:10901-10909), СНО-К1 Те1-Оп клеточная линия (С1оп1ес11). СНО обозначенные ЕСАСС 85050302 (САМИ, ЗаНзЬшу, ХУШзЫге, ИК), СНО клон 13 (ОЕ1МО, Сепоуа, 1Т), СНО клон В (ОЕ1МО, Сепоуа, 1Т), СНО-К1/ЗЕ обозначенные ЕСАСС 93061607 (САМИ, ЗаДзЬигу, №ШзЫте, ИК), ИИ-СНОК1 обозначенные ЕСАСС 92052129 (САМИ, ЗаДзЪшу, \УД1з1иге„ ИК), дигидрофлатредуктаза негативных СНО клеток (СНО/-ЛНРИ, Иг1аиЬ апД СДазиг, 1980, Ргос. №-Н1. АсаД. 8с1. ИЗА, 77:4216), и Др12.СНО клетки (патент США № 5721121); клетки почки обезьяны СУ1, преобразованные в ЗУ40 (СОЗ клетки, СОЗ-7, АТСС СИЬ-1651); человеческие эмбриональные клетки почек (например, 293 клетки или 293 клетки, субклонированные для роста в суспензии культуры, СгаЬат и соавт., 1977, 1. Сеп. У1то1, 36:59); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, АТСС ССЬ-10); клетки почки обезьяны (СУ1, АТСС ССЬ-70); клетки почки африканской зеленой мартышки (УЕИО-76, АТСС СИЬ-1587; УЕИО, АТСС ССЬ-81); мышиные клетки Сертоли (ТМ4, МаДюг, 1980, Вю1. ИергоД., 23:243-251); клетки рака шейки матки человека (НЕБА, АТСС ССЬ-2); клетки почек собаки (МЛСК, АТСС ССЬ-34); клетки легкого человека (^138, АТСС ССЬ-75); клетки гепатомы человека (НЕР-С2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС ССЬ-51); клетки печени лабораторной крысы Вийа1о (ВРЬ ЗА, АТСС СРЬ-1442); ТИ1 клетки (МаДюг, 1982, Аппа1з ΝΥ АсаД. Зе!, 383:44-68); МСИ 5 клетки; РЗ4 клетки. Предпочтительными являются клетки СНО, особенно СНО/-ЛНРИ клетки.

Клетки, подходящие для культивирования в методах и способах по настоящему изобретению, могут содержать введенные, например, посредством трасформации, трансфекции, инфицирования или инъекции векторы экспрессии (конструкции), такие как плазмиды и т.п., которые содержат кодирующие последовательности или их части, кодирующие белки для экспрессии и продуцирования в способе культивирования. Такие векторы экспрессии содержат необходимые элементы для траскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности. Способы, которые известны и применяются специалистами в данной области техники, могут применяться для построения векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие продуцируемые белки и полипептиды, а также подходящие транскрипционные и трансляционные контрольные элементы. Такие способы включают ίη уДго технологии рекомбинантной ДНК, синтетические технологии и ίη νί\Ό генетическую рекомбинацию. Такие технологии описаны у ί. ЗатЬгоок и соавт., 1989, Мо1еси1аг С1отп§, А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1Д Зргшд НагЬог Ргезз, Ркип\ае\у, Ν.Υ. и у Е.М. АизиЬе1 и соавт., 1989, СиггеШ Рго1осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1окп \УДеу & Зопз, Νον Уогк, Ν.Υ.

Контролирующие элементы или регуляторные последовательности это те нетранслируемые участки вектора, например, энхансеры, промоторы, 5' и 3' нетранслируемые участки, которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для выполнения транскрипции и трансляции. Такие элементы могут различаться по своей эффективности и специфичности. В зависимости от системы векторов и применяемых клеток-хозяев, любое количество подходящих транскрипционных и трансляционных элементов, включающих конститутивные и индуцибельные промоторы, могут быть использованы. В системах клеток млекопитающих промоторы от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих являются предпочтительными. Конструкции для применения в системах экспрессии белка сконструированы так, чтобы они содержали по меньшей мере один промотор, последовательность энхансера (необязательна для систем экспрессии млекопитающих) и другие последовательности, которые необходимы или требуются для правильной транскрипции и регуляции экспрессии гена (например, транскрипционная инициация стопкодона, сайтов начала репликации, полиаденилирование последовательностей, например, гормон роста крупного рогатого скота (ВСН) поли А последовательность).

Как будет понятно любому специалисту в данной области техники, выбор подходящего вектора, например, плазмиды, компонентов для правильной транскрипции, экспрессии, и выделение полученных белков в эукариотических (например, млекопитающих) системах экспрессии известны и определяются по стандартной методике и применяются специалистами в данной области техники. Экспрессия белков культивированными клетками в соответствии со способами данного изобретения может находиться под контролем промоторов, таких как вирусные промоторы, например, цитомегаловируса (СМУ), вируса саркомы Рауса (ИЗУ), глицерофосфат киназа (РСК), тримидинкиназа (ТК) или промотор α-актина. Кроме того, регулирующие промоторы придают индуцибельность для конкретных соединений или молекул, например, глюкокортикоид-отвечающий элемент (СИЕ) на вирус опухоли молочной железы мышей (ММТУ) индуцируется глюкокортикоидами (У. СЬапД1ет и соавт., 1983, Се11, 32:489-499). Также, тканеспецифические промоторы или контролирующие элементы могут быть использованы (С. З\\аП и соавт.,

- 12 028491

1984, Се11, 38:639-646), если необходимо или желательно.

Конструкции экспрессии могут быть введены в клетки с помощью различных способов переноса гена, известных специалистам в данной области техники, например, обычно применяемых способов переноса гена, таких как ко-преципитация фосфата кальция, липосомальная трансфекция, микроинъекция, электропорация и инфекционная или вирусная трансдукция. Выбор способа находится в компетенции специалиста в данной области техники. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что одна или несколько конструкций, несущих последовательности ДНК для экспрессии в клетках, могут быть трансфицированы в клетки так, что продукты экспрессии впоследствии производятся в и/или получают из клеток.

В конкретном аспекте, экспрессирующие системы млекопитающих, содержащие подходящие контрольные и регуляторные последовательности, являются предпочтительными для применения в клетках млекопитающих по настоящему изобретению, экспрессирующих белок. Широко применяемые эукариотические контрольные последовательности для применения в векторах экспрессии млекопитающих, включают промоторы и контрольные последовательности, совместимые с клетками млекопитающих, такие как, например, промотор цитомегаловируса (СМУ) (СЭМ8 вектор) и вируса саркомы птиц (АЗУ), (πΕΝ). Другие широко используемые промоторы включают ранние и поздние промоторы от вируса обезьяны 40 (ЗУ40) (Неге и соавт., 1973, №!иге, 273:113), или другие вирусные промоторы, такие как производные от полиомы, аденовируса 2 и вируса папилломы крупного рогатого скота. Индуцибельный промотор, такой как ЬМТ11 (Капп и соавт., 1982, №Циге, 299:797-802), может также применяться.

Примеры векторов экспрессии, подходящих для эукариотических клеток-хозяев, включают, но не ограничиваются ими, векторы для клеток-хозяев млекопитающих (например, ВРУ-1, рНуд, рКЗУ, рЗУ2, рТК2 (МашаИв); р1КЕЗ (ОоШесЬ); рКс/СМУ2, рКс/КЗУ, рЗРУ1 (ЫГе ТесЬпо1од1ев); рУРакс векторы, рСМУ векторы, рЗО5 векторы (З!га!адепе), ретровирусные векторы (например, рРВ векторы (ЗйШадепе)), рс^NА-3 (1пуйгодеп), аденовирусные векторы; векторы аденоассоциируемого вируса, бакуловирусные векторы, векторы дрожжевых грибов (например, рЕЗС векторы (З1га1адепе)), или измененные формы любого из вышеуказанных. Векторы также могут содержать энхансерные последовательности выше или ниже участка последовательностей промотора для оптимизации экспрессии генов.

Селектируемый маркер может также применяться в рекомбинантном векторе (например, плазмиде) для обеспечения резистентности клеток, несущих (предпочтительно, имеющих стабильную интеграцию) вектор с целью их отбора в подходящей селективной среде. Ряд систем отбора может применяться, включая, но не ограничиваясь ими, тимидин киназы вируса простого герпеса (НЗУ ТК), (^1§1ег и соавт., 1977, Се11, 11:223), гипоксантингуанидин-фосфорибозилтрансферазы (НОРКТ), (З/уЬа1вка и З/уЬа1вкг 1992, Ргос. №ιΐ1. АсаД. Зск ИЗА, 48:202), и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Ьоиу и соавт., 1980, Се11, 22:817) гены, которые могут быть применены в !к-, Ьдрй- или адрг1- или арй-клетках (АРКТ) соответственно.

Резистентность против метаболитов также может применяться в качестве основы отбора для следующих неограничивающих примеров маркерных генов: ДЬГг, который придает резистентность к метотрексату (^1§1ег и соавт., 1980, Ргос. №·ιΐ1. АсаД. Зсг ИЗА, 77:357; и О'Наге и соавт., 1981, Ргос. №·ιΐ1. АсаД. Зс1. ИЗА, 78:1527); др!, который придает резистентность к микофеноловой кислоте (МиШдап и Вегд, 1981, Ргос. №·ιΐ1. АсаД. Зск ИЗА, 78:2072); пео, который придает резистентность к аминогликозиду О418 (С1шюа1 РЬагтасу, 12:488-505; \Уи и \Уи, 1991, ВюШегару, 3:87-95; То1в!овЬеу, 1993, Апп. Кеу. РЬагтасо1. Тохюо1, 32:573-596; МиШдап, 1993, Заепсе, 260:926-932; АпДегеоп, 1993, Апп. Кеу. ВюсЬет., 62:191-21; Мау, 1993, 775 ТЕСН, 11(5): 155-215); и Ьудго, который придает резистентность к гигромицину (Зайегге и соавт., 1984, Оепе, 30:147). Способы технологии рекомбинантной ДНК, общеизвестные в уровне техники, можно применять по стандартной методике для отбора желательных рекомбинантных колоний клеток и такие способы описаны, например, у АивиЬе1 и соавт. (еДв.), Снггей Рго!осо1в ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп \УПеу & Зопв, ΝΥ (1993); Кпед1ег, 1990, Оепе ТгапвГег апД Ехргеввюп, А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, ЗЮскЮп Ргевв, ΝΥ; ш СЬар!егв 12 апД 13, ЭгасороЬ е! а1. (еДв), СиггеШ Рго!осо1в ш Нитап ОепеЬсв, 1оЬп \УПеу & Зопв, ΝΥ (1994); Со1Ьегге-Оагарт е! а1., 1981. 1. Мо1. Вю1., 150:1, которые включены посредством ссылок в полном объеме в настоящем изобретении.

Кроме того, уровни экспрессии экспрессируемой молекулы белка могут быть повышены с помощью векторной амплификации (для обзора см. ВеЬЬюдЮп и Неп!всЬе1, ТЬе иве оГ уес!огв ЬавеД оп депе атрЬПсаЬоп Гог !Ье ехргеввюп оГ с1опеД депев ш таттаЬап се11в ш ΩΝΛ с1ошпд, Уо1. 3, АсаДепнс Ргевв, Νον Υο^к, 1987). Когда маркер в экспрессирующей векторной системе белка амплифицирован, повышение уровня присутствующего ингибитора в культуре клеток-хозяев будет увеличивать число копий маркерного гена. Поскольку амплифицированный участок связан с геном, кодирующим белок, продукция белка будет одновременно повышаться (Сгоиве и соавт., 1983, Мо1. Се11. Вю1, 3:257).

Векторы, которые содержат глутаминсинтазу (ОЗ) или дигидрофолатредуктазу (ОНРК), кодирующие нуклеиновые кислоты в качестве селектируемых маркеров, могут быть амплифицированы в присутствии средства метионинсульфоксимина или метотрексата соответственно. Преимуществом глутаминсинтазы на основе векторов является наличие клеточных линий (например, мышиной миеломной клеточной линии, ЖО), которые являются глутиминсинтаза-отрицательными. Глутаминсинтазные экспрес- 13 028491 сионные системы могут также действовать в клетках, экспрессирующих глутаминсинтазу (например, СНО клетках) с помощью обеспечения дополнительного ингибитора для предотвращения действия эндогенного гена.

Векторы, которые экспрессируют ΌΗΕΚ в качестве селектируемого маркера, включают, но не ограничиваются ими, плазмиду р§У2-бЫт (§иЪтаташ и соавт., Мо1. Се11. Вю1. 1:854 (1981)). Векторы, которые экспрессируют глутаминсинтазу в качестве селектируемого маркера, включают, но не ограничиваются ими, экспрессионный вектор рЕЕ6, описанный §1ерЬепз и СоскеП. 1989, №с1. Лабз. Кез., 17:7110. Глутаминсинтазная экспрессионная система и ее компоненты подробно описаны в публикациях РСТ: \О 87/04462; \О 86/05807; \О 89/01036; \О 89/10404 и \О 91/06657, которые включены посредством ссылок в полном объеме в данное изобретение. Кроме того, глутаминсинтазные векторы экспрессии, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, являются коммерчески доступными от поставщиков, включая, например, Боп/а Вю1о§юз, 1пс. (РойзтоиН, ΝΗ).

В конкретном варианте последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая растворимую молекулу СТЬЛ4 или растворимую мутантную молекулу СТЬЛ4, может быть введена в вектор, предназначенный для экспрессии чужеродных последовательностей в эукариотическом хозяине. Регуляторные элементы вектора могут изменяться в зависимости от конкретного эукариотического хозяина. Векторы, которые экспрессируют растворимый СТЬЛ4 или растворимый мутантный СТЬЛ4 в эукариотических клетках-хозяевах, могут включать энхансерные последовательности для оптимизации экспрессии белка.

Виды культур клеток

В целях понимания, а не ограничения, практикующему специалисту понятно, что культуры клеток и проведение культивирования для получения белка могут включать три основных вида; а именно, непрерывная культура, периодическая культура и культура с подпиткой. В непрерывной культуре, например, добавление свежей культуральной среды (т.е. питательной среды) обеспечивается для клеток в течение периода культивирования, в то время как старая культуральная среда удаляется ежедневно, а продукт собирают ежедневно или постоянно. В непрерывной культуре питательная среда может добавляться ежедневно и может добавляться непрерывно, т.е. в виде капания или вливания. Для непрерывного культивирования клетки могут сохраняться в культуре до тех пор, пока необходимо, при условии, что клетки сохраняются живыми и окружающие условия и условия культивирования поддерживаются.

В периодической культуре клетки изначально культивируют в среде и данная среда не удаляется, не заменяется, не дополняется, т.е. клетки не подпитываются новой средой, в течение или до окончания проведения культивирования.

Для культуры с подпиткой время проведения культивирования увеличено пополнением культуральной среды один или несколько раз в день (или постоянно) новой средой в способе выполнения, т.е. клетки подпитывают новой средой (питательной средой) в способе проведения культивирования. Культуры с подпиткой могут включать различные режимы и время питания, например, ежедневно, через день, каждые два дня и т.д., несколько раз в день или реже, чем раз в день, и так далее. Кроме того, культуры с подпиткой могут быть подпитаны непрерывно питательной средой.

Целевой продукт затем собирают в конце проведения культивирования/производства. Настоящее изобретение, преимущественно, включает культуры клеток с подпиткой, в которых глюкокортикоидные соединения добавляют после посева.

Согласно настоящему изобретению, культивирование клеток может быть выполнено и гликопротеины могут быть произведены клетками в условиях для больших и малых масштабов производства белков с использованием сосудов для культивирования и/или аппаратов для культивирования, которые обычно применяются для культивирования клеток животных или млекопитающих. Как известно специалистам в данной области, в лаборатории обычно используются чашка Петри, Т-колба и вращающаяся колба. Для культивирования в больших масштабах (например, 500, 5000 л и т.п., например, как описано в принадлежащим одному и тому же правообладателю, патенте США № 7541164, патенте США № 7332303, и заявке США порядковым номером № 12/086786, поданном 19 декабря 2006 г., содержание которых включено посредством ссылок в полном объеме в данном изобретении) могут применяться процедуры, включающие, но не ограничивающиеся ими, биореактор с кипящим слоем, половолоконные биореакторы, культивирование во вращающемся флаконе или биореакторе с механическим перемешиванием системы. Микроносители могут быть или могут не быть использованы в системах вращающегося флакона или в биореакторе с механическим перемешиванием. Системы могут быть использованы в периодическом, непрерывном или подпитываемом способе. Кроме того, аппараты или системы для культивирования могут быть или могут не быть оборудованы клеточным сепаратором с использованием фильтров, тяжести, центробежных сил и т.п.

- 14 028491

Этапы культивирования клеток и связанные с ними параметры

Термин посев относится к добавлению клеток к исходной среде для начала культивирования.

Фаза роста культуры представляет собой фазу, в которой плотность жизнеспособных клеток в каждый момент времени выше, чем в любой предыдущий момент времени.

Стационарная фаза культуры представляет собой фазу, в которой плотность жизнеспособных клеток приблизительно постоянна (т.е. в пределах погрешности измерений) за определенный период времени любой продолжительности.

Фаза гибели культуры представляет собой фазу, которая следует за фазой роста или после фазы роста и стационарной фазы, и в которой плотность жизнеспособных клеток в каждый момент времени меньше, чем в предыдущий момент времени в процессе данной фазы.

В связанном с ростом способе культивирования, в таких случаях, где глюкокортикоидное соединение вызывает продление фазы роста, фаза продукции может начаться в процессе продления фазы роста.

В не связанном с ростом способе культивирования фаза продукции культуры клеток может быть стационарной фазой.

Предпочтительно культуральная среда дополняется (подпитывается) в процессе фазы продукции для поддержания непрерывного производства белка, особенно в продлённой фазе продукции, и для достижения большого количества высококачественного продукта гликопротеина (что подтверждается и/или определяется высоким уровнем содержания терминальной сиаловой кислоты при извлечении белка). Подпитывание может происходить ежедневно или в соответствии с другим графиком для поддержания жизнеспособности клеток и продукции белка.

Способ культивирования по настоящему изобретению может приводить к выживаемости более жизнеспособных клеток до завершения периода культивирования. Соответственно, в некоторых вариантах, чем больше клеток, которые выжили, тем больше клеток, которые производят желаемый продукт. Это, в свою очередь, приводит к большему накоплению количества продукта по завершению способа культивирования с интенсивностью продукции белка отдельными клетками, т.е. удельной продуктивностью клеток, остающейся такой же. Удельная продуктивность клеток или специфическая интенсивность клеток, как известно из уровня техники, обычно относится к специфической интенсивности экспрессии продукта, продуцируемого клетками, или измерению клеточной массы или объема. Удельная продуктивность клеток измеряется в граммах белка, продуцируемого клетками за день, например, и может быть измерена в соответствии с интегральным методом, включающим следующие формулы:

άΡ/άΐ = Яр X или Р = Чр Ιο¹ Χάΐ где с]_р является константой удельной продуктивности клеток; Χ является количеством клеток, или клеточным объемом, или эквивалентами клеточной массы; и άΡ/άί является интенсивностью продукции белка. Таким образом, ς_ρ может быть получен от зависимости концентрации продукта против интеграла во времени жизнеспособных клеток (^° Χάί дни жизнеспособных клеток). В соответствии с данной формулой, когда количество продуцируемого продукта гликопротеина наносится против дней жизнеспособности клеток, наклон является эквивалентным специфической интенсивности клеток. Жизнеспособные клетки могут быть определены с помощью различных измерений, например, биомассы, интенсивности поглощения О₂, лактатдегидрогиназы (ЬЭН), гематокринного числа или плотности (например, патент США № 5705364 Т. ΕίοΗονβΓ^ и соавт.).

Получение растворимых молекул СТБА4 и растворимых мутантных молекул СТБА4 с помощью способов культивирования по настоящему изобретению

В других вариантах осуществления настоящего изобретения способы культивирования клеток по изобретению применяются для получения растворимой молекулы СТЬА4 или растворимой мутантной молекулы СТЬА4, как описано ниже. Растворимая молекула СТЬА4 является предпочтительно белком слияния СТЬА4, предпочтительно СТЬА41§. Более предпочтительным является СТЬА41§, которая содержит аминокислоты -1 до 357 или +1 до 357, как описано на фиг. 19. Растворимая мутантная молекула СТБА4, предпочтительно, Ρ104ΕΛ29ΥΙ^, которая содержит аминокислоты -1 до 357 или +1 до 357, как показано на фиг. 20. Способы культивирования клеток, включающие продление фаз продукции для получения белка, особенно подходят для получения высокого качества и больших количеств растворимых молекул СТБА4 и растворимых мутантных молекул СТБА4 с помощью их клеток-хозяев при культивировании.

В предпочтительном варианте СТЬА41§ продуцируется рекомбинантно сконструированными клетками-хозяевами. Слитый белок СТЬА41§ может рекомбинантно продуцироваться клетками СНО, трансфицированными вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую СТЬА41§ (см. патент США № 5844095 Р.8. Ьтз1еу и соавт.). Слитый белок СТЬА41§ продуцируется в значительном количестве и соответственно сиалирован при культивировании, согласно способам по данному изобретению. Изобретение обеспечивает получение высоких уровней извлекаемого белкового продукта, т.е. сиалиро- 15 028491 ванного белкового продукта СТЬА41§. В другом предпочтительном варианте, растворимую мутантную молекулу СТБА4 6104ΕΑ29ΥΙ§. которая содержит аминокислоты -1 до 357 или +1 до 357, как показано на фиг. 20, получают способами культивирования клеток по настоящему изобретению.

Лигандом для СТБА4 является молекула В7. В контексте данного изобретения лиганд относится к молекуле, которая специфически распознает и связывает другие молекулы. Взаимодействие молекулы и ее лиганда может регулироваться продуктами способов культивирования по данному изобретению. Например, взаимодействие СТБА4 с его лигандом В7 может быть блокировано с помощью введения молекул СТЬА41§. В качестве других примеров, взаимодействие фактора некроза опухоли (ТЫР) с его лигандом, ТОТ¹ рецептором (ТЫРК), может быть блокировано с помощью введения этанерцепта или других ТЫР/ТЫРК блокирующих молекул.

Дикий тип СТБА4 или не мутированный СТЬА4 имеет аминокислотную последовательность природного происхождения, полная длина СТЬА4, как показано на фиг. 20 (а также как описано в патентах США № 5434131, 5844095 и 5851795, включенных посредством ссылок в полном объеме в данном изобретении), или любая часть ее, которая распознает и связывает молекулу В7, или препятствует молекуле В7, так что связывание с СЭ28 и/или СТБА4 (например, эндогенными СЭ28 и/или СТБА4) блокируется. Дикий тип СТБА4 содержит особенные части, включающие, например, внеклеточный домен дикого типа СТБА4, начинающийся с метионина в положении +1 и заканчивающийся аспарагиновой кислотой в положении +124, или внеклеточный домены дикого типа СТЬА4, начинающийся с аланина в положении -1 и заканчивающийся аспарагиновой кислотой в положении +124, как показано на фиг. 21.

Дикий тип СТЬА природного происхождения представляет собой белок клеточной поверхности, имеющий Ν-концевой внеклеточный домен, трансмембранный домен и С-концевой цитоплазматический домен. Внеклеточный домен связывает молекулу-мишень, такую как молекулу В7. В клетках дикий тип СТБА4 белка природного происхождения представляет собой транслированный незрелый полипептид, который включает сигнальный пептид на амино- или Ν-терминальном конце. Незрелый полипептид претерпевает пост-трансляционную обработку, в том числе отщепление и удаление сигнального пептида с образованием СТБА4 продукта расщепления, имеющего вновь образованный Ν-терминальный конец в незрелом виде. Специалисту в данной области техники будет понятно, что может происходить посттрансляционная обработка, которая отделяет одну или несколько аминокислот от вновь образованного Ν-терминального конца продукта расщепления СТБА4. Зрелый белок СТБА4 может начинаться с метионина в положении +1 или аланина в положении -1. Зрелая форма молекулы СТБА4 включает внеклеточный домен или любую его часть, которая связывает В7.

Мутантная молекула СТЬА4, в контексте данного изобретения, относится к молекуле, содержащей СТБА4 дикого типа, как показано на фиг. 21, или любой ее части или ее производному, которое имеют мутацию или множественные мутации в последовательности СТБА4 дикого типа, предпочтительно, во внеклеточном домене СТБА4 дикого типа, и связывают В7. Мутантная молекула СТБА4 имеет последовательность, которая схожа, но не идентична, последовательности молекулы СТБА4 дикого типа, но все же связывает В7. Мутации могут включать одну или несколько замен аминокислотных остатков на аминокислоты, имеющие консервативные (например, лейцин используется вместо изолейцина) или неконсервативные (например, глицин заменен на триптофан) структуры или химические свойства, аминокислотные делеции, добавления, сдвиги рамки или усечения.

Мутантные молекулы СТБА4 могут включать молекулы не-СТЬА4 в ней или прикрепленные к ним, т.е. мутантные белки слияния СТБА4. Мутантные молекулы могут быть растворимыми (т.е. циркулирующими) или они могут быть связаны с поверхностью клетки (мембраносвязанные). Мутантные молекулы СТБА4 включают 6104ΕΛ29Υί§ и те, которые описаны в заявке США с порядковым номером 60/214065 и 60/287576; в АО 01/92337 А2; в патентах США 6090914, 5844095, 7094874 и 5773253; и как описано у К.1. РеасЬ и соавт., 1994, ί. Εχρ Меб, 180:2049-2058. Мутантные молекулы СТБА4 могут быть получены синтетически или рекомбинантно.

СТЬА41§ представляет собой растворимый слитый белок, включающий внеклеточный домен СТБА4 дикого типа, или его часть, которая связывает В7, присоединенный к молекуле иммуноглобулина (1д) или ее части. Внеклеточный домен СТБА4 или его часть присоединен к фрагменту Ι§, включающему целую или часть молекулы иммуноглобулина, предпочтительно, целую или часть иммуноглобулина, содержащего константную область, такую как целую или часть ^СуЩдС-гаммаЦ, Ι§Ογ2 (I§С-гамма2), Ι^γ3 ДдС-гамма3), Ιβθγ4 ДдС-гамма4), Ιβί',’μ ДдС-мю), ΙβΟ/. 1 ДдС-альфа1), ΙβΟ/.2 ДдС-альфа2), ΙβΟδ ЦдС-дельта) ог ΙβΟ: ЦдС-эпсилон), что делает слитые молекулы растворимыми. Фрагмент Ι§ может включать шарнир, СН2 и СН3 домены, или СН1, шарнир, СН2 и СН3 домены вышеуказанных константных областей или другие константные области. Предпочтительно фрагмент Ι§ является человеческим или обезьяньим и включает в себя шарнир, СН2 и СН3 домены. Более предпочтительно фрагмент Ι§ включает в себя шарнир, СН2 и СН3 домены человеческого ЕС'Д, или состоит из шарнира, СН2 и СН3 доменов человеческого Ι§Ογ1. Во фрагменте Ιβ СТ^А4I§, константная область Ι§ или его часть могут быть мутированы, тем самым приводя к снижению его эффекторных функций (см., например, патенты США № 5637481, 5844095 и 5434131). В контексте данного изобретения термины фрагмент Ι§, констант- 16 028491 ная область 1д, 1дС (константный) домен, 1дС^1 (1дС-гамма1), 1дС--/2 (1дС-гамма2), 1дС--/3 (1дС-гамма3), 1дС-';4 (1дС-гамма4), 1дС-ц (1дС-мю), 1дС-а1 (1дС-альфа1), 1дС-а2 (1дС-альфа2), 1дС-5 (1дС-дельта) ог 1дС-е (1дС-эпсилон), включают как нативные последовательности, так и последовательности, которые мутировали, такие как, например, последовательности, имеющие мутации в константной области, которые снижают эффекторную функцию.

Конкретный вариант осуществления изобретения относится к СТЬА4, включающей внеклеточный домен СТЬА4 дикого типа, начиная с метионина в положении +1 и заканчивая аспарагиновой кислотой в позиции +124, или начиная с аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124; соединение аминокислотного остатка глутамина в позиции +125; и часть иммуноглобулина, содержащая глутаминовую кислоту в положении +126 посредством лизина в положении +357, как показано на фиг. 19. ДНК, кодирующая данный СТЬА41д, была внесена 31 мая 1991 года в Американскую коллекцию типовых культур (АТТС), 10801 Ищуегкйу В1уб., Мапаккак, УА 20110-2209, в соответствии с положением Будапешского договора, и имеет, согласно АТТС, номер доступа АТТС 68629; Р. Ыпк1еу и соавт., 1994, 1ттипИу 1:793-80. Клеточная линия СНО, экспрессирующая СТЬА41д, была внесена 31 мая 1991 г. в АТТС под идентификационным номером СКЬ-10762. Растворимые молекулы СТЬА41д, полученные в соответствии со способами, описанными в данном изобретении, могут включать или не включать последовательность сигнального (лидерного) пептида. Фиг. 19 и 20 включают иллюстрацию последовательности сигнального (лидерного) пептида. Обычно, молекулы не включают последовательность сигнального пептида.

Е104ЕА2^<^Ш представляет собой слитый белок, который является растворимой мутантной молекулой СТБА4, содержащей внеклеточный домен СТБА4 дикого типа с аминокислотными заменами А29Н (аминокислотный остаток тирозина заменен на аланин в положении 29) и Б104Е (аминокислотный остаток глутаминовой кислоты заменен на лейцин в положении +104), присоединенный к концевому участку 1д. На фиг. 20 показана ^104ЕА29ΥIд. Аминокислотная последовательность ^104ЕА29ΥIд включает аланин в положении аминокислоты -1 до лизина в положении аминокислоты +357, как показано на фиг. 20. Кроме того, аминокислотная последовательность Е104ЕА2^<^Ш включает метионин в положении аминокислоты +1 до лизина в положении аминокислоты +357, как показано на фиг. 20. Е104ЕА2^<^Ш включает соединение аминокислотного остатка глутамина в положении +125 и части 1д, содержащей глутаминовую кислоту в положении +126 посредством лизина в положении +357. ДНК, кодирующая ^104ЕА29ΥIд, была внесена 20 июня 2000 г. в коллекцию типовых культур (АТТС) в соотвествии с положением Будапешского договора, и имеет, согласно АТТС, номер доступа РТА-2104. 104ЕА29Υ-Iд описан в совместно рассматриваемых заявках на патент США с порядковыми номерами 09/579927, 60/287576 и 60/214065 и в \УО/01/923337 А2, которые включены посредством ссылок в полном объеме в данное изобретение. Растворимые молекулы Е104ЕА2^<^Ш· производимые с помощью способов культивирования по настоящему изобретению, могут включать или не включать последовательность сигнального (лидерного) пептида. Обычно, молекулы, производимые в соответствии с настоящим изобретением, не содержат последовательность сигнального пептида.

В контексте данного изобретения термин растворимая относится к любой молекуле или ее фрагменту, не связанной или не присоединенной к клетке, т.е. циркулирующей. Например, СТБА4 может быть получена растворимой с помощью прикрепления фрагмента 1д к внеклеточному домену СТБА4. Кроме того, молекулы, такие как СТБА4, могут быть приведены в растворимое состояние посредством удаления трансмембранного домена. Как правило, растворимые молекулы, получаемые в соответствии с настоящим изобретением, не включают сигнальную (или лидерную) последовательность.

Растворимые молекулы СТБА4 относятся к не клеточно-поверхностно-связанным (т.е. циркулирующим) молекулам, содержащим СТБА4 дикого типа или любую часть или производные, которые связывают В7, включая, но не ограничиваясь ими, растворимые белки слияния СТБА4; растворимые белки слияния СТБА4, такие как белки слияния СТЬА41д (например, АТТС 68629), в которых внеклеточный домен СТБА4 слит с фрагментом 1д, который представляет собой целую или часть молекулы 1д, предпочтительно целую или часть константной области 1д, такой как целая или часть 1дС^1 (1дС-гамма1), ШС-γ2 (1дС-гамма2), 1дС^3 (1дС-гамма3), 1дС^4 (1дС-гамма4), 1дС-ц (1дС-мю), 1дС-а1 (1дС-альфа1), 1дСα2 (1дС-альфа2), 1дС-5 (1дС-дельта) ог 1дС-е (1дС-эпсилон), делая слитые молекулы растворимыми; растворимые слитые белки СТБА4, в которых внеклеточный домен слит или присоединен к части биологически активного или химически активного белка, такому как продукт гена Е7 папилломовируса (СТБА4Е7), меланома-ассоциированный антиген р97 (СТЬА4-р97) или епу белок Н1У (СТЬА4-епу др120), как описано в патенте США № 5844095, включенном в данное изобретение посредством ссылки в полном объеме; гибридные (химерные) слитые белки, такие как СБ28/СТЬА41д, как описано в патенте США № 5434131, включенном в данное изобретение посредством ссылки в полном объеме; молекулы СТЬА4 с удаленным трансмембранным доменом для приведения белка в растворимое состояние (См., например, М.К. Оакк и соавт., 2000, Се11и1аг 1ттипо1оду, 201:144-153, включенный в данном изобретении посредством ссылки в полном объеме); растворимая мутантная молекула СТЬА4 ^104ЕА29ΥIд.

Растворимая молекула СТЬА4 может также быть растворимой мутантной молекулой. Растворимые

- 17 028491 молекулы СТЬА4, получаемые в соответствии с настоящим изобретением, могут включать или не включать последовательность сигнального (лидерного) пептида. Сигнальный пептид может быть любой последовательностью, которая позволяет секрецию молекулы, включая сигнальный пептид из онкостатина М (Майк и соавт., 1989, Мо1ес. Се11. Βίο1., 9:2847-2853), или СЭ5 (ΝΗ. 1опе8 и соавт., 1986, №1иге, 323:346-349), или сигнальный пептид из любого внеклеточного белка. Растворимая молекула СТЬА4, получаемая с помощью способов культивирования по настоящему изобретению, может включать сигнальный пептид онкостатина М, связанный ^терминальным концом внеклеточного домена СТЬА4. Как правило, в настоящем изобретении молекулы не включают последовательность сигнального пептида.

Слитый белок СТЬА4, в контексте данной заявки, относится к молекуле, содержащей внеклеточный домен СТЬА4 дикого типа или его часть, которая связывает В7, слитой с фрагментом не принадлежащим СТЬА4, что приводит к растворимой молекуле СТЬА4, таким как фрагмент 1д. Например, слитый белок СТЬА4 может включать внеклеточный домен СТЬА4, слитый с целой или частью константной областью 1д. Примеры константных доменов 1д (или их частей), которые могут быть слиты с СТЬА4, включают все, но не ограничиваются вышеперечисленными. Белок слияния СТЬА4 может также быть мутантной молекулой СТЬА4.

В контексте данного изобретения фрагмент не принадлежащий СТЬА4 относится к молекуле или ее части, которая не связывает ί'.Ό80 и/или СЭ86 и не препятствует связыванию СТЬА4 с его лигандом. Примеры включают, но не ограничиваются ими, фрагмент 1д, который является целым или частью молекулы, часть биологически активного или химически активного белка, такого как продукт гена Е-7 папилломовируса (СТЕА4-Б7), меланома-ассоциированный антиген р97 (СТЬА4-р97) или епу белок Ηΐν (СТЬА4-епу др120) (как описано в патенте США порядкового номера № 5844095, включенном в данном изобретении посредством ссылки в полном объеме). Примеры фрагментов 1д включают полностью или часть константного домена иммуноглобулина, такого как 1дСу1 (1дС-гамма1), 1дС-у2 (1дС-гамма2), 1дС-у3 (1дС-гамма3), 1дС-у4 (1дС-гамма4), 1§С-ц (1дС-мю), 1дС-а1 (1дС-альфа1), 1дС-а2 (1дС-альфа2), 1§С-5 (1дСдельта) ог 1§С-е (1дС-эпсилон). Фрагмент 1д может включать шарнир, СН2 и СН3 домены, или СН1, шарнир, СН2 и СН3 домены вышеуказанных константных областей или других константных областей. Предпочтительно фрагмент 1д является человеческим или обезьяньим и включает шарнир, СН2 и СН3 домены. Более предпочтительно фрагмент 1д включает шарнир, СН2 и СН3 домены человеческого 1дСу 1, или представляет собой шарнир, СН2 и СН3 домены человеческого 1дСу 1. В фрагменте 1д константная область 1д или ее часть могут быть мутированы для снижения его эффекторной функции (см., например, патенты США № 5637481, 5844095 и 5434131).

Внеклеточный домен СТЬА4 относится к любой части СТЬА4 дикого типа, которая распознает и связывает В7. Например, внеклеточный домен СТЬА4 включает метионин в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг. 21). Например, внеклеточный домен СТЬА4 включает аланин в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг. 21).

В контексте данного изобретения термин мутация относится к изменению в нуклеотидной или аминокислотной последовательности молекулы дикого типа, например, изменение в ДНК и/или аминокислотных последовательностях внеклеточного домена СТЬА4 дикого типа. Мутация в ДНК может изменить кодон, приводящий к изменению в кодирующей аминокислотной последовательности. Изменение ДНК может включать замены, делеции, вставки, альтернативный сплайсинг или усечения. Аминокислотное изменение может включать замены, делеции, вставки, добавления, усечения или обработку или ошибки расщепления белка. Кроме того, мутации в последовательности нуклеотида могут привести к молчащей мутации в аминокислотной последовательности, как это понимают в уровне техники. Также понятно, что некоторые нуклеотидные кодоны кодируют одну и ту же аминокислоту. Примеры включают нуклеотидные кодоны СОИ, СОО, СОС и СОА, которые кодируют аминокислоты аргинина (К); или кодоны ОАи и ОАС, которые кодируют аминокислоты аспарагиновой кислоты (Ό).

Таким образом, белок может кодироваться одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, которые различаются по их конкретной нуклеотидной последовательности, но тем не менее кодируют молекулы белка, имеющие идентичные последовательности. Мутантная молекула может иметь одну или более чем одну мутацию. Для руководства аминокислотная кодирующая последовательность выглядит следующим образом:

- 18 028491

Аминокислота	Обозначение	Единимое буквенное обозначение	Кодоны
Аланин	А1а	А	оси, осс, оса, осо
Цистеин	Суз	С	иои, иос
Аспарагиновая кислота	Азр	ϋ	ОАИ, ОАС
Глутаминовая кислота	О1и	Е	ОАА, ОАО
Фенилаланин	РНе	Г	иии, иис
Глицин	О1у	О	оои, оос, ооа, ооо
Г истидин	Из	Н	САИ, САС
Изолейцин	Не	I	лии, лис, лил
Лизин	Ьуз	к	ΑΑΑ, ААО
Лейцин	Ьеи	ь	иил, иио, сии, сис, сил, сио
Метионин	Ме!	м	лио
Аспарагин	Азп	N	ААИ, ААС
Пролин	Рго	Р	сси, ссс, сса, ссо
Глутамин	О1п	Ω	САА, САО
Аргинин	Агд	к	сои, СОС, СОА, СОО, АСА, АОО
Серин	8ег	8	иси, исс, исл, исо, лои, АОС
Траонин	ТНг	Т	АСИ, АСС, АСА, АСО
Валин	Уа1	V	оии, оис, сил, оио
Триптофан	Тгр	\ν	иоо
Тирозин	Туг	Υ	или, иле

В контексте данного изобретения фрагмент или часть представляет собой любую часть или сегмент молекулы. Для СТЬА 4 или СЭ28, фрагмент или часть является, предпочтительно, внеклеточным доменом СТБЛ4 или СЭ28, или его часть или сегмент, который распознает и связывает В7 или препятствует В7 так, что это блокирует связывание с СЭ28 и/или СТБЛ4. Также, в контексте данного изобретения, соответствующий означает идентичность обмена последовательности.

В контексте данного изобретения производное представляет собой молекулу, в которой доля сходства последовательности и активности его исходной молекулы. Например, производное СТБЛ4 включает растворимую молекулу СТБЛ4, обладающую аминокислотной последовательностью по меньшей мере 70% похожей на внеклеточный домен СТБЛ4 дикого типа и которая распознает и связывает В7, например, СТЬЛ41§ или растворимая мутантная молекула СТБЛ4 Ы04ЕА29У1§. Производное означает любое изменение в аминокислотной последовательности и/или химическом качестве аминокислоты, например, аминокислотные аналоги.

В контексте данного изобретения к регуляции иммунных ответов относится активирование, стимулирование, повышающая регуляция, ингибирование, блокирование, снижение, ослабление, понижающая регуляция или изменение иммунного ответа. Различные заболевания, например, аутоиммунные заболевания, можно лечить с помощью регулирования иммунного ответа, например, с помощью регулирования функциональных СТБА4 и/или СЭ28- позитивных клеточных взаимодействий с В7- позитивными клетками. Например, способ регуляции иммунного ответа включает контактирование В7-позитивных клеток с растворимой молекулой СТБА4, такой как те, которые получены в соответствии с настоящим изобретением, для формирования растворимых СТБА4/В7 комплексов, где растворимая молекула СТБА4 препятствует взаимодействию эндогенной СТБА4 и/или СЭ28 молекуле с молекулой В7. К блокированию или ингибированию рецептора, сигнала или молекулы, как изложено в настоящем изобретении, относится препятствование активации рецептора, сигнала или молекулы, как определено с помощью принятых в данной области техники тестов. Блокирование или ингибирование может быть частичным или общим.

В контексте данного изобретения блокирование взаимодействия В7 относится к препятствованию

- 19 028491 связывания В7 с его лигандами, такими как СЭ28 и/или СТБА4, тем самым мешающими взаимодействию Т-клеток и В-позитивных клеток. Примеры агентов, которые блокируют взаимодействия В7 включают, но не ограничиваются ими, молекулы, такие как антитела (или их часть), которые распознают и связываются с любыми СТБА4, СЭ28 или В7 молекулами (например, В7-1, В7-2); растворимые формы (или их часть) молекул, таких как растворимый СТБА4; фрагмент пептида или другие малые молекулы, предназначенные для вмешательства в клеточный сигнал посредством СТБА4/СО28/В7-опосредованного воздействия. В предпочтительном варианте блокирующий агент представляет собой растворимую молекулу СТБА4, такую как СТЬА41§ (АТСС 68629) или Ь104ЕА29У1§ (АТСС РТА-2104); растворимую молекулу ί'.Ό28, такую как СЭ281д (АТСС 68628); растворимую молекулу В7, такую как В7-1§ (АТСС 68627); моноклональное антитело анти-В7 (например, АТСС НВ-253, АТСС СКЬ-2223, АТСС СКЬ-2226, АТСС НВ-301, АТСС НВ-11341 и моноклональное антитело, как описано в патенте США № 6113898 или у УокосЫ и соавт., 1982, ί. 1ттипо1, 128(2): 823-827); моноклональное антитело анти-СТЬА4 (например, АТСС НВ-304, и моноклональные антитела, как описано в противопоставленном материале 82-83); и/или моноклональное антитело анти-СО28 (например АТСС НВ 11944 и МАЬ 9.3, как описано у Напкеп и соавт., 1980, 1ттиподепеЬс8, 10: 247-260, или Магйп и соавт., 1984, I. С1ш. 1ттипо1, 4(1): 18-22). Блокирование взаимодействий В7 можно было определить с помощью принятых в данной области техники тестов, таких как определение снижения симптомов, связанных с иммунным заболеванием (например, ревматического заболевания), с помощью определения снижения взаимодействий Т-клеток/В7-клеток, или с помощью определения снижения взаимодействия В7 с СТБА4/СЭ28. Блокирование может быть частичным или общим.

В контексте данного изобретения эффективное количество молекул относится к количеству, которое блокирует взаимодействие молекулы с ее лигандом. Например, эффективное количество молекул, которое блокирует взаимодействие В7 с СТЬА4 и/или СЭ28, представляет собой количество молекул, которое при связывании с В7 молекулами на В7-позитивных клетках, ингибирует В7 молекулы от связывания эндогенных лигандов, таких как СТЬА4 и СЭ28. Кроме того, эффективное количество молекул, которые блокируют взаимодействие В7 с СТЬА4 и/или СЭ28, является количество молекул, которое при связывании с молекулами СТЬА4 и/или СЭ28 на Т-клетках, ингибирует В7 молекулы от связывания эндогенных лигандов, таких как СТЬА4 и СЭ28. Ингибирование или блокирование может быть частичным или полным.

Для клинических протоколов желательно, чтобы фрагмент 1§ белка слияния, такого как СТЬА4 или мутантный СТЬА41§, не вызывал вредного иммунного ответа у субъекта. Предпочтительным фрагментом является целая или часть константой области 1§, включая константную область 1§ человека или низшего примата. Примеры подходящих областей 1§ включают 1§Су 1 (1дС-гамма1), 1дСу2 (1§С-гамма2), 1дСу3 (1дС-гамма3), 1дСу4 (1дС-гамма4), 1§Сц (1дС-мю), 1дСа1 (1дС-альфа1), 1дСа2 (1дС-альфа2), 1дС5 (1дС-дельта) или 1§Се (1§С-эпсилон), включающие шарнир, СН2 и СН3 домены, или СН1, шарнир, СН2 и СН3 домены, которые участвуют в эффекторных функциях, таких как связывание с рецепторами Рс, комплемент-зависимая цитотоксичность (СЭС) или антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЭСС). Фрагмент 1§ может иметь одну или несколько мутаций в них (например, в СН2 домене для снижения эффекторных функций, таких как СЭС или АЭСС), где мутация изменяет способность 1§ связывать свой лиганд путем повышения или снижения способности 1§ к связыванию с рецепторами Рс. Например, мутации во фрагменте 1д могут включать изменения в частично или полностью его остатках цистеина в петле домена. Например, цистеины в положениях +130, +136 и +139 заменены на серин. Фрагмент 1§ может также включать пролин в положении +148, замененный на серин. Кроме того, мутации во фрагменте 1д могут включать в себя имеющие лейцин в положении +144 заменен на фенилаланин; лейцин в положении +145 заменен на глутаминовую кислоту; или глицин в положении +147 заменен на аланин.

Примеры

В следующих примерах изложены конкретные аспекты изобретения для пояснения изобретения и представлено описание настоящих способов для специалистов в данной области техники. Примеры не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение, Примеры только приводят конкретные методологии и пояснения, которые являются полезными для понимания и применения изобретения и его различных аспектах.

Примеры 1-5, как указано ниже, описывают эксперименты, относящиеся к способам культивирования клеток, включающих добавление глюкокортикоидов в способе проведения культивирования.

Пример 1.

В данном исследовании были исследованы внутриклеточные эффекты дексаметазона (ΌΕΧ) на процесс гликозилирования клеток СНО и внеклеточные эффекты, связанные с активностью сиалидазы. В данной работе впервые показано, что ΌΕΧ способен улучшать сиалирование рекомбинантного слитого гликопротеина, продуцируемого СНО. Суммарный эффект ΌΕΧ в обеспечении улучшенного сиалирования был исследован в культивируемых встряхиваемых колбах, затем успешно подтверждён в контролируемых биореакторах, и привел к повышению содержания сиаловой кислоты, а также снижению процен- 20 028491 та десиалирования в культурах с подпиткой.

Клеточная линия и среда.

Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была первоначально субклонирована от ΌΟ44 первичных клеток и культивировалась в собственной безбелковой ростовой среде.

Экспериментальные встряхимаемые колбы.

Эксперименты проводили в 250-мл встряхиваемых колбах (УУК т1егпа1юпа1) с исходными объемами 100 мл и первичной плотностью клеток 6х10⁵ клеток/мл. Культуры размещали на шейкере платформы (У\УК иИегпа1юпа1) при 150 об/мин и поддерживали при 37°С и 6% СО₂ в течение десяти дней. Культуры отбирали ежедневно и рН доводили по мере необходимости, используя 1М углекислого натрия и подпиткой с глюкозой и глутамином каждые два дня для поддержания их на надлежащем уровне. Плотность клеток и жизнеспособность измеряли в рабочем порядке, используя автоматизированный счетчик клеток Себех (Чппоуабк АО, В|е1еГе1б, Оегтапу). рН культуры и концентрации для глюкозы и глутамина измеряли автономно, используя Вюргой1е Апа1у/ег 400 (№уа Вютебюа1 Согрогайоп, УаНЬат, МА).

Работа биореактора.

Биореакторные эксперименты проводили в 5-л биореакторах (Байопик АО, ОоеПшдеп, Оегтапу) с начальным рабочим объемом 1,5 л. Перемешивание, рН и растворенный кислород контролировали при 150 об/мин, 7,05 и 50% воздуха насыщения соответственно. Температуру изначально контролировали при 37°С, но было смещение на более низкую температуру в способе культивирования для продления жизнеспособности культуры. Биореакторы работали в режиме периодических культур с подпиткой и подпитывались каждый день, начиная с 3 дня собственной питательной средой для поддержания необходимых концентраций глюкозы и других питательных веществ. Образцы брали во время способа культивирования клеток и анализировали на плотность клеток, жизнеспособность клеток, субстратов и метаболитов.

Вестерн-блоттинг а2,3-сиалтрансферазы (а2,3-БТ) и β 1,4-галактозилтрансферазы (β 1,4-СТ).

Приблизительно 10⁷ клеток СНО промывали в 1Х фосфатно-буферном солевом растворе (РВБ), лизировали 1 мл Ьаеттй буфером для образца (Вю-Каб БаЬогаЮпек, Негси1ек, СА), затем денатурировали при 90°С в течение 5 мин. Весь клеточный лизат отделяли на 4-15% БИБ-полиакриламидным гелем, пропускали в 0,4 мкм нитроцеллюлозную мембрану (Вю-Каб БаЬогаЮпек, Негси1ек, СА), и исследовали первичные и вторичные антитела. Первичные антитела были поликлональными антителами кролика против а2,3-БТ человека и поликлональными антителами кролика против β 1,4-ОТ человека (БаШа Сги/ В1о1есЬпо1оду, БаШа Сги/, СА). Вторичные антитела были антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (НКР) (БаШа Сги/ В|о1есЬпо1о8у, Бап1а Сги/, СА). Мембраны были сняты и повторно зондированы антителом с β-актином (БаШа Сги/ В|о1есЬпо1о8у, БаШа Сги/, СА) и антимышиными вторичными антителами, конъюгированными с НКР. Иммунологический анализ проводили с использованием усиленной хемилюминесценцией системы обнаружения Вестрн-блоттинга (ОЕ НеаИЬсаге) и визуализировали с системой визуализации УегкаЭос (Вю-Каб ЬаЬогаФйек, Негси1ек, СА).

Измерение активности сиалидазы в надосадочной жидкости.

Активность сиалидазы была исследована с использованием Атр1ех Кеб №игат1тбаке (ЗтаПбаке) Аккау Кб (ЧпуПгодеп, Саг1кЬаб, СА). Кратко, нейроминидаза в образце использовалась для десиалирования фетуина. Данное исследование использовало Атр1ех Кеб для обнаружения Н2О2, производимого окислением десиалированных остатков галактозы на фетуине с помощью галактозоксидазы. Н2О2 в присутствии НКР реагирует стехиометрически с реагентом Атр1ех Кеб для производства красного флюоресцирующего продукта окисления, резоруфина 5, который затем исследуется либо флюорометрически или спектрофотометрически. В каждом исследовании, 50 мкл рабочего раствора (100 мкМ Атр1ех Кеб, 0.2 Ед./мл НКР, 4 Ед./мл галактозоксидазы и 500 мкг/мл фетуина) добавляли в каждую лунку микропланшета, содержащую 50 мкл разбавленной надосадочной жидкости культуры клеток. После 30 мин инкубации при 37°С, образцы исследовали на поглощение при 560 нм, с использованием планшетридера.

Анализ сиаловой кислоты.

Молярное отношение сиаловой кислоты к рекомбинантному белку рассчитывалось с помощью определения концентраций сиаловой кислоты и рекомбинантного белка. Сиаловая кислота (БА), включающая Ν-ацетилнейраминовую кислоту (№и5Ас) и Ν-гликолилнейраменовую кислоту (№и5Ос), высвобождалась путем кислотного гидролиза. Производные затем разделяли путем обратно-фазовой ВЭЖХ для определения содержания сиаловой кислоты. Концентрации белка определяли путем УФ-поглощения при 280 нм.

Содержание сиаловой кислоты отражается как молярное отношение, которое является суммой молей №и5Ас и №и5Ос на моль рекомбинантного гликопротеина. Содержания сиаловой кислоты отражаются как нормализированные значения, которые являются фактическим значением, деленным на произвольное значение. Одинаковый делитель использовали для нормализации всех данных содержания сиаловой кислоты в исследованиях, описанных в данном изобретении.

- 21 028491

Измерение Ν-связанных олигосахаридов.

Анионобменная хроматография высокого рН с импульсным амперометрическим детектированием (НРАВС-РАБ) была использована для профилирования Ν-связанных олигосахаридов (Ваза и Зре11тап 1990; Тохупзепб и Нагбу 1991) для предоставления информации о сайт-специфическом Ν-связанном гликозилировании. Ν-связанные олигосахариды отщеплялись от белка и разделялись на ИРАНС-РАЮ на четыре домена, на основе количества присутствующей сиаловой кислоты. Домен I представляет асиало виды. Домены II, III и IV представляют собой сталированные виды и представляют моносиалированные, дисиалированные и три- и тетра-сиалированные виды соответственно. Фракция Ν-связанных сталированных видов представлена как процент Ν-связанных сталированных видов в общих Ν-связанных видов олигосахаридов, которые включают оба асиало и сталированные виды. Фракции Ν-сиалированных видов представлены как нормализированное значения, которые являются фактическими значениями, деленными на произвольное значение. Одинаковый делитель использовали для нормализирования всех данных фракции Ν-сиалированных видов в исследованиях, описанных в данном изобретении.

Измерение О-связанных олигосахаридов.

О-связанное гликозилирование характеризуется масс-анализом в неизменном виде образца для сравнения и очищенными Белком-А образцами белка слияния (ссылка). Образцы разводили в 100 мМ Трис, 25 мМ №С1, рН 7,6 и инкубировали с ΡNΘ-азой В всю ночь для ферментативного удаления всех Νсвязанных олигосахаридов. Образцы были затем введены для масс-анализа в неизменном виде после смешивания с внутренними стандартами инсулина. Содержание О-связанной сиаловой кислоты представлено как молярное отношение, которое представляет собой моли О-связанной сиаловой кислоты на моль рекомбинантного гликопротеина.

Результаты.

Дексаметазон повышает содержание сиаловой кислоты и процент сиалированных видов в Νсвязанных олигосахаридах.

ΌΘ44 клеточную линию СНО, экспрессирующую слитый гликопротеин, обрабатывали различными уровнями ΌΕΧ для определения любого воздействия ΌΕΧ на содержание сиаловой кислоты и процент различных сиалированных видов. Данные исследования осуществляли в двух повторах 250 мл встряхиваемых колбах, используя условия культивирования, как описано выше. На второй день после посева, добавляли ΌΕΧ к культурам клеток СНО в конечных концентрациях, начинающихся с 0,01 до 10 мкМ ΌΕΧ. Культуры собирали на 10 день и слитые белки очищали с использованием белка А колонки и анализировали общее содержание сиаловой кислоты, содержание О-связанной сиаловой кислоты и Νсвязанного профиля. Сиалирование повышается в ΌΕΧ-обработанной культуре в зависимости от концентрации (табл. 1).

Таблица 1

ΌΕΧ обработк а (мкМ)	Процент увеличен ия ЗА (%)	Процент увеличен ия Ν- связанно й асиало- (%)	Процент увеличен ия Ν- связанно й-Моно- (%)	Процент увеличения Ν- связанной- Ди- (%)	Процент увеличения Ν- связанной- Три и Тетра- (%)	Процент увеличения О- связанной ЗА (%)
0,01	9,3	-8,6	6,6	13,9	4,5	о,о
0,1	13,0	-9,6	7,3	13,9	13,6	0,5
1,0	13,0	-10,0	4,3	19,4	15,9	0,9
10	20,4	-15,6	7,3	24,3	20,5	о,о

Концентрации ΌΕΧ от 0,01 до 10 мкМ приводят к от 9,3 до 20,4% увеличения содержания сиаловой кислоты, с максимальным эффектом при 10 мкМ. По сравнению с контролем, хроматограммы Νсвязанного олигосахарида для культуры, обработанной ΌΕΧ, показывают повышение моносиалированных, дисиалированных и три-, а также тетра-сталированных фракций на величину от 4,3 до 7,3%, от 13,9 до 24,3% и от 4,5 до 20,5% соответственно. Напротив, было от 8,5 до 15,6% снижение по сравнению с контролем в асиало-фракциях в распределениях олигосахарида для ΌΕΧ-обработанных культур. Νсвязанные хроматограммы также показывали максимальный эффект при 10 мкМ ΌΕΧ. Эти результаты указывают на сиалирование в обработанных ΌΕΧ культурах. Однако существенных изменений не наблюдалось в молярных отношениях О-связанной сиаловой кислоты от обработанных ΌΕΧ образцов.

ΌΕΧ способствует экспрессии β 1,4-галактозилтрансферазы (β1,4-Θϊ) и а2,3-сиалилтрансферазы (α2,3-δϊ).

Вестерн-блоттинг использовали для выяснения возможных механизмов действия ΌΕΧ на сиалирование путем исследования экспрессии двух ферментов, β1,4-ΘΣ и а2,3-8Т, которые участвуют в путях добавления сиаловой кислоты. В данных экспериментах ΌΕΧ добавляли на второй день после посева в

- 22 028491 культуры в концентрациях от 0,1 до 10 мкМ и клетки собирали для вестерн-блоттинга через три дня. Белок домашнего хозяйства β-актин использовали для сравнения образца загрузки. Как показано на фиг. 1А и 1В, уровни экспрессии β 1,4-СТ и а2,3-§Т повышаются в основном в культурах, обработанных ΌΕΧ, по сравнению с культурами, не обработанными ΌΕΧ. Интенсивность экспрессии для обоих ферментов обычно повышается с концентрацией ΌΕΧ. Данные результаты показывают, что ΌΕΧ способен стимулировать экспрессию сиалилтрансфераз β 1,4-СТ и а2,3-§Т в клетках СНО.

Клеточный защитный эффект ΌΕΧ приводит к снижению активности сиалидазы в надосадочной жидкости культуры клеток.

В примере 3 обработка ΌΕΧ показывала увеличение экспрессии антиапоптического белка С1Ь2, приводящее к повышению жизнеспособности культур клеток СНО. Чтобы определить, является ли улучшение жизнеспособности клеток связанным с ΌΕΧ, можно уменьшить деструктивное действие сиалидаз на рекомбинантный слитый белок, изучение встряхиваемых колб было инициировано для сравнения жизнеспособности клеток и профилей активности сиалидазы надосадочной жидкости от культур клеток в присутствии или отсутствии 1 мкМ ΌΕΧ. Как показано на фиг. 2А и Фиг. 2В, повышение активности сиалидазы было связано со снижением жизнеспособности клеток как в ΌΕΧ-обработанных, так и в необработанных культурах клеток. Жизнеспособность клеток снизилась от 98,0±0,1% на 4 день до 85,0±2,7% на 10 день в обработанных ΌΕΧ культурах клеток в сравнении с жизнеспособностью на 10 день, составляющей 70,2±4,6% для контроля. Значение измерения абсорбции активности сиалидазы увеличилось от 0,006±0,002 на 4 день, до 0,024±0,003 на 10 день в обработанных ΌΕΧ культурах клеток в сравнении со значением на 10 день 0,047±0,004 в контроле. Таким образом, скорость, при которой в обеих культурах клеток ухудшалась жизнеспособность клеток, а также повышалась активность сиалидазы, была значительно медленнее в ΌΕΧ-обработанных культурах. Данные результаты показывают, что ΌΕΧ способен ингибировать высвобождение сиалидазы посредством его клеточного защитного действия.

Сравнение дексаметазона с другими двумя глюкокортикоидами, гидрокортизоном и преднизолоном.

Добавление глюкокортикоидных соединений, гидрокортизона (НУС) и преднизолона (ΡΚΌ) также оценивали для определения, распространим ли эффект ΌΕΧ на повышение сиалирования в клетках СНО на другие глюкокортикоидные соединения, ΌΕΧ, НУБ и ΡΚΌ добавляли в культуральную среду клеток на второй день после посева в конечной концентрации 0, 0,1, 1 и 10 мкМ. На фиг. 3А и 3В показано нормализированное общее содержание сиаловой кислоты и нормализированная фракция Ν-связанных сталированных видов после 10-дневного культивирования при различных условиях глюкокортикоидов. Общее содержание сиаловой кислоты при концентрациях глюкокортикоидов в пределах от 0,1 до 10 мкМ, где от 12,4±0,4 до 14,0±0,5 для ΌΕΧ, от 11,2±0,1 до 13,0±0,2 для НУС и от 11,8±0,2 до 13,4±0,8 для ΡΚΌ, по сравнению с 10,2±0,2 для контроля. Фракция Ν-связанных сталированных видов при концентрациях глюкокортикоидов в пределах от 0,1 до 10 мкМ, где от 85,6±1,6 до 88,8±0,9 для ΌΕΧ, от 79,8±1,6 до 89,6±0,1 для НУС и от 83,7±0,1 до 89,0±0,2 для ΡΚΌ по сравнению с 77,1±0,7 для контроля. Таким образом, подобно ΌΕΧ, оба НУС и ΡΚΌ также показали повышение в сиалировании и максимальное действие наблюдалось при 10 мкМ для всех трех глюкокортикоидных соединений в исследуемом диапазоне концентраций. Однако, высокие концентрации НУС и ΡΚΌ необходимы для достижения такого же уровня относительно повышения сиалирования, как ΌΕΧ.

Механизм повышения сиалирования дексаметазоном включает глюкокортикоидный рецептор.

Для определения, было ли улучшение сиалирования от добавления ΌΕΧ опосредовано глюкокортикоидным рецептором (СК), антагонист СК мифепристон (КИ-486) добавляли к культуральной среде клеток перед обработкой ΌΕΧ. В частности, 1 мкМ КИ-486 был добавлен 48 ч после посева и ΌΕΧ в концентрациях 0,1, 1 и 10 мкМ был затем добавлен спустя 24 ч. ΌΕΧ также добавляли к культурам без КИ486 в качестве контроля. В условиях в присутствии или отсутствии КИ-486, нормализированное общее содержание сиаловой кислоты и нормализированная фракция Ν-связанных сталированных видов индуцированы ΌΕΧ, как показано на фиг. 4А и 4В соответственно. Способность ΌΕΧ к увеличению продукта сиалирования была значительно снижена в присутствии 1 мкМ КИ-486 и была наиболее выражена при условии 0,1 мкМ ΌΕΧ. Общее содержание сиаловой кислоты и фракции Ν-связанных сталированных видов при условии 0,1 мкМ ΌΕΧ снижается с 15,1±0,1 и 92,2±2,0 (без КИ-486) до 12,7±0,1 и 81,5±0,8 (с 1 мкМ КИ-486) соответственно. Данные результаты показывают, что механизм, посредством которого ΌΕΧ повышает сиалирование, был СК-зависимым, так как КИ-486 конкурирует с ΌΕΧ в лигандсвязывании домена СК (Каих-Оетау и соавт. 1990).

Применимость ΌΕΧ при культивировании в подпитываемом биореакторе.

Влияние ΌΕΧ на повышение сиалирования белков слияния, находящихся во встряхиваемой колбе, было затем протестировано в подпитываемых культурах с использованием контролируемых 5-л биореакторов. Биореакторы работали, как описано в разделе способы. Более высокое общее содержание сиаловой кислоты (фиг. 5А) и фракции Ν-связанных сталированных видов (фиг. 5В) наблюдалось в культурах с добавлением шарика 1 мкМ ΌΕΧ. Общее содержание сиаловой кислоты с ΌΕΧ составило 16,5±0,1 по сравнению с 14,2±0,1 для контроля (16,2% повышения). Подобным образом, фракция Ν-связанных ста- 23 028491 лированных видов с ΌΕΧ составила 90,2±1,3 по сравнению с 77,9±1,6 для контроля (15,8% повышение). В соответствии с наблюдением во встряхиваемой колбе исследований активности сиалидазы (фиг. 3А и 3В), общие содержания сиаловой кислоты снижаются в промежутке с 8 по 14 день с 17,9±0,1 до 16,5±0,1 (-7,8%) с ΌΕΧ по сравнению с 16,3±0,1 до 14,2±0,1 (-12,9%) для контроля. Кроме того, процентное содержание сиалированной фракции в промежутке с 8 по 14 день понижается от 97,7±0,9 до 90,2±1,3 (-7,7%) с ΌΕΧ по сравнению с 91,3±0,9 до 77,9±1,6 (-14,7%) для контроля.

Увеличение в сиалировании гликопротеина с помощью ΌΕΧ было в дальнейшем подтверждено в биореакторах различных масштабов. Нормализированное конечное содержание сиаловой кислоты и нормализированное процентное содержание сталированных фракций от различных выполнений приведены на фиг. 6. В этих различных выполнениях, условие ΌΕΧ включает выполнения с добавлением ΌΕΧ в виде шарика или включенного в питательную среду. В соответствии с фиг. 6 ΌΕΧ показывает значительное улучшение сиалирования с увеличением конечного содержания сиаловой кислоты (р-значение < 0,001 1 -критерием) и конечной фракцией сталированных видов (р-значение < 0,0011 -критерием).

Заключение.

Добавление дексаметазона к культуре СНО, продуцирующей рекомбинантный слитый гликопротеин, приводит к повышению сиалирования. Данное исследование было первым для того, чтобы показать, что дексаметазон способен увеличивать экспрессию гликозилтрансферазы α2,3-δΤ и β1,4-0Τ и, что эффект дексаметазона был опосредован через глюкокортикоидные рецепторы. Общий эффект дексаметазона в улучшении сиалирования включает как внутриклеточные эффекты посредством гликозилтрансфераз, так и внутриклеточные эффекты посредством продления жизнеспособности культуры, которая снижается в присутствии высвобожденных сиалидаз в надосадочной жидкости культуры клеток посредством клеточного лизиса. Дексаметазон оказался подходящим способом для улучшения сиалирования.

Пример 2.

Клеточная линия и среда.

Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была первоначально субклонирована из ΌΟ44 родительских клеток и культивирована в безбелковой собственно питательной среде. Клеткихозяины были генетически модифицированы для выделения 1§О-белка слияния под контролем промотора СМУ.

Экспериментальные встряхиваемые колбы.

Эксперименты проводились в 250-мл встряхиваемых колбах (У^К ш1ета1юпа1) с начальным объемом 100 мл и начальной плотностью клеток 6х10⁵ клеток/мл. Встряхиваемые колбы помещали на платформу шейкера (У\УК ш1егпайопа1) при 150 об/мин скорости вращения. Клетки культивировали при стандартных условиях, увлажнение при 37°С и 6% СО₂, в течение десяти дней с ежедневным регулированием значения рН, используя 1М карбоната натрия, и подпитывали глюкозой и глутамином каждые два дня для сохранения их определенного уровня. Плотность клеток, жизнеспособность клеток и субстраты/метаболиты автономно анализировали с помощью автоматизированной системы подсчета клеток Себех (1ппоуаЙ8 АО, В1е1еГе1б, Оеттапу) и Вюртой1е Лпа1у/ег 400 (Νονα Вютейюа1 Сотрогайоп, ХУаННат, МА). Надосадочную жидкость, собранную от каждой культуры, собирали для δΕС исследования.

Гель-хроматография (δΕΟ).

δΕС исследование производили в соответствии с ранее опубликованными способом (Репсо и соавт., 2008) с некоторыми изменениями. Кратко, очистку Белком-А образцов проводили на ВЭЖХ системе ЛдПеШ 1100 (АдПеи! ТесЬпо1од1е8, 1пс., Ра1о АНо, СА) на ТокоЬ Вюкаепсе ТБК-Ое1 03000 δ\ν.χ1 колонке (7,8 ГОх30 см, 5 мкм частиц). Подвижная фаза содержит 1хфосфатно-солевой буферный раствор (ΡΒδ) при рН 7,4, расход жидкости был 9,5 мл/мин, а температура колонки котролировалась при 25°С. Сигнал контролировали по поглощению при длине волны 280 нм.

Вестерн-блоттинг глутатионредуктазы и глюкокортикоидного рецептора.

После промывания 1χΡΒδ, приблизительно 10⁷ клеток СНО лизировали с 1 мл Ьаеттй буфера для образца (Вю-Каб ЬаБогаЮпек) и денатурировали при 90°С в течение 5 мин. Весь клеточный лизат отделяли на 4-15% δΌδ-полиакриламидном геле, наносили на 0,45 мкм нитроцеллюлозные мембраны (ВюКаб ЬаЪогаЮйек), и исследовали с первичными антителами и вторичными антителами. Первичным антителом для определения глутатионредуктазы было моноклональное антитело, вырабатываемое против аминокислот 391-510, расположенных вблизи С-конца глутатионредуктазы человеческого происхождения (Ъап1а Сти/ Вю1есЬио1оду, δаηΐа Сти/, СА). Хотя изначально китайский хомячок не был указан производителем для обнаружения глутатионредуктазы с использованием данных антител, предварительный эксперимент показал, что имеется только одна полоска, обнаруженная в лизатах от обоих клеток СНО и клеток НЕ60 человеческого происхождения с идентичным молекулярным размером на пятне. Первичное антитело, используемое для обнаружения глюкокортикоидного рецептора, было античеловеческим моноклональным антителом (Ъап1а Сти/ Вю1есЬио1оду, δаηίа Сти/, СА). Вторичное антитело было антимышиное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (НКР) (Ъап1а Сти/ Вю1есЬио1оду, δаηΐа Сти/, СА). Мембраны были сняты и повторно зондированы антителом с β-актином (ЪаШа Сти/ Вю1есЬио1оду, δаηΐа Сти/, СА) и антимышиными вторичными антителами, конъюгированными с НКР. Иммунодетек- 24 028491 цию проводили системой обнаружения вестерн-блоттинга с повышенной хемилюминесценцией (ОЕ НеаИЪсате) и визуализировали с системой визуализации УетзаЭос (Вю-Каб ЬаЪогаФпез).

Результаты.

Дексаметазон (ΌΕΧ) снижает агрегацию продуцируемых СНО 1дО-слитых белков в широком диапазоне концентраций.

На фиг. 7 показано значительное снижение процентного содержания высокомолекулярных (НМ\) видов в 1дО-слитых белков после обработки клеток СНО ΌΕΧ в конечной концентрации 1 мкМ в культуральной среде. Основными компонентами НМ\ видов были димеры и тримеры, формируемые ковалентно или нековалентно, и категорически рассматриваемые как белковые агрегаты. Учитывая, что 15% снижение агрегации белка было обнаружено в условиях культивирования, которые были оптимизированы, улучшение было практически важно для производственного процесса. Для определения дозазависимой кривой и зависимости от времени для эффектов ΌΕΧ на агрегацию белка, авторы настоящего изобретения культивировали клетки либо при различных концентрациях ΌΕΧ, либо при той же концентрации (1 мкМ), но с различным временем инкубации. Как показано на фиг. 7С, ΌΕΧ в зависимости от времени снижается скорость агрегации белка, что соответствует предыдущим наблюдениям зависимости от времени ΌΕΧ на улучшение жизнеспособности клеток и профили гликозилирования белка (табл. 1 и фиг. 11). Однако, зависимое от концентрации влияние ΌΕΧ на снижение уровня агрегации белка не было очевидно (фиг. 7В), что позволяет предположить, что антиагрегационный эффект был связан не только с улучшением жизнеспособности клеток, так как предыдущие результаты авторов настоящего изобртения показали, что жизнеспособность клеток СНО была повышена при концентрации ΌΕΧ от 0,01 мкМ до 10 мкМ в культуральной среде.

Дексаметазон активирует экспрессию глутатионредуктазы в клетках СНО.

Вестерн-блоттинг производился для обнаружения экспрессии глутатионредуктазы в целом клеточном лизате, приготовленном из клеток СНО, обработанных различными концентрациями ΌΕΧ. Как показано на фиг. 8, ΌΕΧ повышает экспрессию глутатионредуктазы, которая может быть увидена даже, когда препарат был при 1 нМ. Обнаружение β-актина используется для сравнения образца загрузки для исключения возможности того, что расширение полоски глутатионредуктазы было обусловлено совпадением повышения образца загрузки.

О8Н снижают агрегацию очищенного 1дО-белка слияния ш νίΙΐΌ.

Для определения, может ли сам О8Н влиять на агрегацию белка путем прямого взаимодействия с белками, авторы настоящего изобретения провели исследование ш νίΙΐΌ путем добавления О8Н к 1дОбелками слияния, очищенным Белком-А, которые восстанавливали в трис-ацетатном буфере, и анализировали профили §ЕС. Как показано на фиг. 9, процентное содержание высокомолекулярных видов был значительно снижено с уменьшением скорости 15,3 и 27,3% в присутствии 1 и 3 мМ О8Н соответственно. Данные наглядно демонстрируют, что О8Н может напрямую ингибировать агрегацию 1дО-белков слияния.

Эффекты дексаметазона являются опосредованными через глюкокортикоидные рецепторы.

ΌΕΧ представляет собой сильнодействующий глюкокортикоид с широким фармакологическим действием. Для определения, был ли ингибирующий эффект ΌΕΧ на агрегацию 1дО-слитого белка специфически опосредован через активацию глюкокортикоидных рецепторов, сначала подтвердили, что существует эндогенная экспрессия глюкокортикоидных рецепторов (ОК) в используемой клеточной линии, которая представлена на фиг. 10А. Поскольку антитело, используемое в Вестерн-блоттинге, было индуцировано против консервативной области человеческого ОК, весь образец клеточного лизата клеток НерО-2 был также загружен как образец человеческого происхождения с целью проверки антитела. Хотя антитело может обнаруживать оба ОКа и ОКР, данный анализ показывает только одну группу. Это может быть вызвано тем, что молекулярные массы этих двух изоформ (95 кДа против 90 кДа) были слишком близки, чтобы их разделить на 5-15% градиентном геле или, более вероятно потому, что в образцах была представлена только одна изоформа.

Так как было обнаружено, что ΌΕΧ активирует экспрессию глутатионредуктазы в клетках СНО (см. фиг. 8), дальнейшая оценка была направлена на то, чтобы определить, был ли этот эффект вызван активацией ОК рецепторов. КИ-486 представляет собой антагонист ОК и широко используется как обрабатывающий препарат во многих ОК связанных исследованиях. Предварительный эксперимент авторов изобретения показывает, что КИ-486 не действует на жизнеспособность клеток СНО и метаболические параметры, если его концентрация не превышает 1 мкМ; при 10 мкМ наблюдалось значительное снижение жизнеспособности клеток и скорости роста клеток. В последующих экспериментах, КИ-486 был поэтому использован при 1 мкМ или более низких концентрациях и вводился в культуру до обработки клеток СНО, за день до добавления ΌΕΧ. На фиг. 10 показано, что в присутствии 1 мкМ КИ-486 активация эффекта ΌΕΧ на экспрессию глутатионредуктазы была ослаблена, подтверждая участие ОК.

В заключении, процентное содержание НМ\ видов в 1дО-слитых белках, продуцируемых клетками СНО, обработаными 1 мкМ ΌΕΧ и его сочетанием с разлиными концентрациями КИ-486, было определено. В соответствии с результатами на фиг. 7В процентное содержание НМ\ видов было снижено примерно на 17%, тогда как культура клеток была обработана только 1 мкМ ΌΕΧ, и этот эффект был посте- 25 028491 пенно уменьшен с повышением концентраций КИ-486 (фиг. 10С). При условии, что использовали одинаковую концентрацию ИЕХ и КИ-486, скорость ингибирования НМ\У видов составляна приблизительно половину скорости, полученной с одним ИЕХ, указывая на то, что ИЕХ в качестве агониста и КИ-486 в качестве антагониста имели подобное сходство для конкурирования друг с другом в отношении ОК в клетках СНО. Таким образом, принятые все три части данных на фиг. 9 тесно связаны, результаты наглядно демонстрируют, что ингибирование агрегации ЦО-слитого белка было опосредовано через ОК.

Вывод.

В качестве недорогого, но сильнодействующего глюкокортикоида и с его полезной триадой, улучшающей жизнеспособность клеток, как описано в примере 3, и гликозилирование, как описано в примере 1, и ингибирование агрегации белка, как описано здесь, дексаметазон может обеспечить простой, бюджетный и эффективный способ для общего улучшения способа культивирования клеток.

Пример 3.

Данное исследование впервые показало, что дексаметазон способен предупреждать апоптоз клеток СНО в бессывороточных условиях в зависимости от концентрации и времени. ИЕХ индуцирует экспрессию гена ОК-Ζ (индуцируемая глюкокортикоидами лейциновая молния) в клетках СНО. ИЕХ успешно применяли при культивировании СНО в 10-л биореакторе для улучшения жизнеспособности клеток и производительности Рс-слитого белка и содержания сиаловой кислоты. Данное исследование показало применимость ИЕХ в промышленном культивировании клеток для улучшения продуктивности рекомбинантного белка и гликозилирования.

Клеточная линия и среда.

Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была субклонирована из родительских клеток ИО44 и культивирована в собственной химически определенной ростовой среде.

Эксперименты во встряхиваемых колбах.

Эксперименты проводили в 250-мл встряхиваемых колбах (ν\νΡ. Гиетайоиа!) с начальными объемами 10 мл и начальной плотностью клеток 6х 10⁵ клеток/мл. Культуры помещали на платформу шейкера (ν\νΡ. ГиГетайоиа!) при 150 об/мин и поддерживали при 37°С и 6% СО₂ в течение десяти дней. Культуры отбирали ежедневно и рН регулировали, используя 1 М карбоната натрия, и подпитывали глюкозой и глутаминов каждые два дня до того, чтобы сохранить их на определенном уровене. Плотность и жизнеспособность клеток измеряли автономно ВюргоГЛе Аиа1у/ег 400 (№уа Вютей1са1 Согрогайои, ^аЙНат, МА).

Работа биореактора.

Биореакторные эксперименты проводили в 10-л биореакторах (ЬаПопик δΐей^т В1о!есй, Ргаисе) с начальным рабочим объемом 5л. Перемешивание, рН и растворенный кислород находились под контролем при значениях 150 об/мин, 7,05, и 50% насыщение воздухом соответственно. Температуру изначально контролировали при 37°С и смещали на более низкую температуру в течение культивирования для продления жизнеспособности культуры. Биореакторы были работающими в режиме периодической подпитки, их подпитывали ежедневно, начиная с 3 дня собственной питательной средой для сохранения достаточных концентраций глюкозы и других питательных веществ. Пробы были взяты в течение способа культивирования клеток и анализированы на плотность клеток, жизнеспособность клеток, субстратов и метаболитов.

дКТ-ПЦР анализ.

Анализ количественной КТ-ПЦР реальном времени с ТадМаи® 5'-нуклеазой был проведен для подтвержения повышенной с помощью ИЕХ регуляции ОК-Ζ. Общую РНК, очищенную из каждой утроенной культуры с добавлением или без добавления 1 мкМ ИЕХ, использовали набор К№аку® т1Й1, как описано выше. Очищенная РНК была обработана КШкеГгее ϋΝ;ιΜ (ЦГадеи), а затем применялась в качестве матрицы для синтеза первичной к ДНК, используя набор КТ² Рйк1 δίπ-ιπύ Кй (δΆ Вюкшеисек, Ргейег1ск, МИ). Экспрессию ОК-Ζ количественно определяли, изпользуя ОК-Ζ специфический ТадМаи МОВ зонд (6-РАМ-АОАООАСТТСАСОТОТ) и праймеры (прямой: 5-ССТСССТСАТСТОТССАСТОА-3 и обратный: 5-ТООТОООТТТООСАТТСАА-3). 20 нг к ДНК было амплифицировано с использованием 900 нМ праймеров и 250 нМ зонда в 1х ТадМаи Рак! Ишуегка1 РСК Мак!ег М1х (АррНей Вюкуйетк, СагкЪай, СА). Реакции проводили в трех повторах на АррНей Вюкуйетк 7500 Рак! Кеа1-Т1те РСК δукΐет с применением универсальных параметров цикла (20 с при 95°С, 40 циклов по 3 с при 95°С, 30 с при 60°С). Параллельные реакции были поставлены на той же пластине анализирующей β-актин в каждой пробе в качестве эндогенного контроля. Пороговый цикл каждого гена был нормализирован против прогового цикла гена домашнего хозяйства β-актина. Нормализированные изменения в экспрессии гена по отношению к контролю рассчитывали с использованием способа дельта-дельта порогового цикла (Ыуак и δ^ίΜΗ^Α 2001).

Вестерн-блоттинг ОК2.

Приблизительно 10⁷ клеток СНО промывали в 1Х фосфатно-буферном солевом растворе (РВδ), лизировали с 1 мл Ьаеттй буфере для образца (Вю-Кай ЬаЪога!опек, Негси1ек, СА), а затем денатурировали при 90°С в течение 5 мин. Весь лизат клеток отделяли на 4-15% δΒδ-полиакриламидном геле, про- 26 028491 пускали через 0,45-мкм нитроцеллюлозные мембраны (Вю-Кай ЬаЬога1ог1е8), и исследовали с первичными мышиными моноклональными антителами, направленными на О1Б2 (§ап!а Сги/ Вю1есЬпо1о§у, 8ап!а Сги/, СА), с последующей конъюгацией с пероксидазой хрена (НКР) антимышиных вторичных антител (8ап1а Сги/ Вю!есЬпо1о§у). Мембраны были сняты и повторно зондированы антителом с Р-актином (§ап1а Сги/ Вю!есЬпо1о§у, 8ап1а Сги/, СА) и антимышиными вторичными антителами, конъюгированными с НКР. Иммунологический анализ производили с системой обнаружения Вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (ОБ НеаИЪсаге ИК ЫшИей ЫШе СНаНопб Вискш§Ьаш8Ыге, ИК) и визуализировали с системой визуализации Vе^8а^οс (Вю-Кай ЬаЬога1ог1е8, Негси1е8, СА).

Измерение титра.

Титр определяли путем аффинной хроматографии с использованием насоса ВЭЖХ и УФ детектирования (Адйеп! ТесЬпо1од1е8, 8ап1а С1ага, СА) и АррПей Вю8у81еш8 Рого8 А/20 колоки с белком А (100x4.6 мм). Элюированный белок был количественно определен с использованием 10-уровневой стандартной кривой.

Результаты.

Действие дексаметазона на рост клеток СНО.

Глюкокортикоид дексаметазон (ΌΕΧ) добавляли во встяхиваемые колбы к культурам в конечной концентрации от 0,01 до 10 мкМ через два дня после посева для определения действия глюкокортикоидов на жизнеспособность клеток СНО и возможность продления периода культивирования клеток. Профиль плотности жизнеспособных клеток (УСЭ) в исследовании влияния величины дозы (фиг. 11А) показал повышение ингибирования роста клеток, происходящее в первый день после обработка ΌΕΧ в завасисмости от дозы. Пик νί',Ό достиг 8,5х10⁶ клеток/мл в не обработанной контрольной культуре, тогда как пик νί',Ό был 6,5х10⁶ клеток/мл в культурах, обработанных 10 мкМ ΌΕΧ. Жизнеспособность клеток снижалась стремительно после 6 дня (фиг. 11В), а процент жизнеспособности на 10 день составил только 42,1%. В отличие от этого, конечная жизнеспособность клеток при 0,01 и 10 мкМ ΌΕΧ составила 53,1 и 64,0% соответственно. Потеря жизнеспособности начинается на 6 день улучшаться в зависимости от концентрации ΌΕΧ в обработанных культурах, с максимальным действием при 10 мкМ (фиг. 11А и 11В).

Исследование в зависимости от времени для добавления ΌΕΧ затем проводили на культурах во встряхиваемых колбах, в которые ΌΕΧ добавляли в конечной концентрации 1 мкМ и добавляли в период между днем посева по шестой день после посева. Как показано на Фигурах ПС и 11Ό, конечная νΕΌ и жизнеспособность клеток увеличивается во всех ΌΕΧ-обработанных культурах, и оба νΟΌ и жизнеспособность клеток улучшаются в зависимости от времени более раннего добавления ΌΕΧ. Жизнеспособность не обработанных культур клеток СНО снизилась на 50% на 10 день, при этом культуры, в которых ΌΕΧ добавляли на 0, 2, 4 и 6 дни, была 63, 68, 72 и 74% соответственно.

ΌΕΧ снижает удельную скорость роста клеток, но увеличивает удельную продуктивность клеток.

Удельная скорость роста, нормализированная объемная производительность и нормализированная удельная продуктивность клеток была количественно определена и сравнена между ΌΕΧобработанными и не обработанными клетками. Данные сравнения удельной скорости роста клеток и профилей нормализированной производительности с добавлением или без добавления 1 мкМ ΌΕΧ показаны на фиг. 12 А и 12В (п=5). ΌΕΧ добавляли на 2 день, в результате чего приблизительно на 30% снижалась удельная скорость роста с ΌΕΧ по сравнению с контролем на день после добавления ΌΕΧ. Однако, данное действие задержки роста снижается со временем культивирования. В конце периода культивирования скорость гибели клеток замедляется в культурах обработанных ΌΕΧ клеток. Кроме того, ранняя задержка роста клеток, вызванная ΌΕΧ, не влияет на объемную производительность (6,5 для всех культур); однако, культуры, обработанные ΌΕΧ, имеют значительно более высокую продуктивность, чем не обработанные клетки, с максимальной удельной продуктивностью (7,0±0,6)х10^-9.

Повышение экспрессии О1Б2 с помощью ΌΕΧ подтверждено цКУ-ПРЦ и Вестерн-блоттингом.

О1Б2 был анализирован с использованием цКТ-ПЦР для проверки профелей экспрессии гена, полученных путем исследования микрочипа. Образцы РНК от 5 и 8 дней для обработанных ΌΕΧ и не обработанных утроенных культур применялись в количественном анализе ТацМап® с|РСК. Паралелльные реакции были поставлены на той же пластине, анализирующей β-актин в каждой пробе в качестве эндогенного контроля. Как показано на фиг. 13А, нормализированный профиль экспрессии изменений СШЖ полученный цКТ-ПЦР на 5 день и 8 день образцов, составил 7,66±1,08 и 10,48±2,16 соответственно.

Лизаты клеток от культур на 5 день, обработанных и не обработанных 1мкМ ΌΕΧ анализировали с помощью Вестергн-блоттинга для проверки любой сверхэкспрессии О1Б2 в обработанных ΌΕΧ культурах. Пятно было также повторно зондировано с антителом бета-атина в качестве контроля для определения эквивалентной загрузки геля. Как показано на фиг. 13В, экспрессия белка СШ® значительно повышается в обработанных ΌΕΧ образцах по сравнению с не обработанными образцами. Кроме того, кратное изменение СШЖ вызванное ΌΕΧ, немного выше в образцах 8 дня, чем образцах 5 дня, что соответствует результатам дКТ-ПЦР.

- 27 028491

Сравнение дексаметазона с другими двумя глюкокортикоидами, гидрокортизоном и преднизолоном.

Эксперименты во встряхимаемых колбах затем проверяли, действительно ли защитное действие ИЕХ на жизнеспособность клеток СНО ограничивается ИЕХ, или может быть распространена на другие глюкокортикоидные соединения, такие как гидрокортизин (НУС) и преднизолон (РКИ). ИЕХ, НΥС и РКИ (31дта-А1бпсЬ, δΐ. Ьошк, МО) добавляли через два дня после посева в конечных концентрациях 0, 0,1, 1 и 10 мкМ для каждого из этих трех соединений. Пик УСИ. Конечная УСИ и конечная жизнеспособность культивированных клеток представлены в табл. 2.

Таблица 2

	Концентрация обработки (мкМ)	Пик УСО (хЮ6 клетки/мл)	Конечная УСО (хЮ6 клетки/мл)	Жизнеспосо бность (%)
Дексаметазон (ОЕХ)	ОД	7,99	7,64	72,3
	1	9,02	8,40	75,8
	10	7,49	7,38	82,3
Гидрокортизон (НУС)	ОД	10,06	7,86	60,1
	1	9,51	8,15	65,1
	10	8,44	7,80	75,5
Преднизолон (РКО)	0,1	8,99	8,26	69,4
	1	9,25	8,79	76,8
	10	8,05	8,27	77,5
Контроль	Нет данных	8,69	7,56	56,6

Подобно ИЕХ, НУС (60,1-75,5% конечная жизнеспособность) и РКИ (69,4-75,5% конечная жизнеспособность) таже показывают защитное воздействие на клетки в зависимости от дозы. Жизнеспособность на 10 день составила 56,6% для контроля по сравнению с жизнеспособностьями на 10 день с концентрациями 0,1 и 10 мкМ для ИЕХ, составившими 72,3 и 82,3%; для НУС - 60,1 и 75,5%; и для РКИ 69,4 и 77,5% соответственно. Таким образом, все три глюкокортикоидных соединения продлевают жизнеспособность культуре с максимальным действием при 10 мкм для всех трех глюкокортикоидных соединений.

Подавление гибели под влиянием дексаметазона включает ОН./ и глюкокортикоидный рецептор.

Для определения того, было ли повышение жизнеспособности из-за добавления дексаметазона опосредовано 61ΧΖ и глюкокортикоидным рецептором (ОК), антагонист ОК мифепристон (КИ-486) добавляли к культуральной среде клеток перед обработкой ИЕХ. В условиях с содержанием или без содержания КИ-486, процентное увеличение конечной жизнеспособности клеток, индуцированной ИЕХ, показано на фиг. 14А. Способность ИЕХ улучшать жизнеспособность клеток была значительно снижена в присутствии 1 мкМ КИ-486. Процентное увеличение жизнеспособности клеток, индуцированное 0,1 и 1 мкМ ИЕХ, снижается от 30,5 и 32,6% (без содержания КИ-486) до 4,7 и 5,7% (с содержанием 1 мкМ КИ-486) соответственно. В то же время анализ цКТ-ПЦР (фиг. 14В) показывает, что в присутствии 1 мкМ КИ-486, регуляция действия ИЕХ на экспрессию 61ΗΖ значительно ослаблена. Кратность изменения, вызванная 0,1 и 1 мкМ ИЕХ, снижается от 9,0±1,9 и 11,3±3,0 (без добавления КИ-486) до 1,8±0,9 и 2,3±1,0 (с добавлением 1 мкМ КИ-486) соответственно. Анализ Вестерн-блоттинга (фиг. 14С) далее подтвердил значительное снижение сверхэкспрессии белка 61ΗΖ в присутствии 1 мкМ КИ-486. Данные результаты показывают, что механизм, через который ИЕХ повышает жизнеспособность, вовлекает 61ΣΖ и является ОКзависимым, поскольку КИ-486 конкурирует с ИЕХ за лигандсвязывающий участок ОК.

Применение дексаметазона при подпитываемом культивировании в 10-л биореакторе.

Подпитываемое культивирование в 10-л биореакторах проводили для определения того, может ли быть эффект ИЕХ, наблюдаемый во встряхиваемых колбах, масштабирован на биореакторы. Общая задача ИЕХ была в подавлении гибели клеток, продлении срока жизни культуры клеток и, как следствие, повышение продукции гликопротеина для процесса в биореакторах. В данном исследовании были использованы три биореактора с использованием одинаковых условий, описанных выше; 1 мкМ ИЕХ добавляют к двум биореакторам на 2 день или на 7 день соответственно. В отличие от встряхиваемых колб, время выполнения в биореакторе продлили до 14 дней, температура культуры клеток была сдвинута в сторону более низкой температуры в конце экспоненциальной фазы культивирования и собственная пи- 28 028491 тательная среда была использована взамен подпитки только глюкозой и глутамином.

Биореакторы с добавленным ΌΕΧ либо на 2 день или 7 день достигают максимальной плотности клеток, составляющей приблизительно 8,3 х10⁶ клеток/мл на 8 день, по сравнению с 7,8х10⁶ клеток/мл без добавления ΌΕΧ (фиг. 15А). Добавление ΌΕΧ снижает скорость гибели клеток в биореакторах. Жизнеспособность клеток составляла 94% жизнеспособности при всех условиях на 6 день (фиг. 15В). К 14 дню процент жизнеспособности снизился до 29% без добавления ΌΕΧ, по сравнению с 55% и 39% с добавлением ΌΕΧ на 2 день и 7 день соответственно. Конечная УСЭ на 14 день с добавлением ΌΕΧ на 2 или 7 день составила 4,1 и 3,5х10⁶ клеток/мл, соответственно, по сравнению с 2,8х10⁶ клеток/мл без добавления ΌΕΧ. Нормализированные титры белка составили приблизительно 5,5 на 7 день до максимального УСЭ (фиг. 15С). Впоследствие, продукция белка в течение стационарной фазы и фазы гибели культур была на высоком уровне в биореакторах с добавлением ΌΕΧ. На 14 день собранные нормализированные титры составили 12,5 в обоих биореаторах с добавленным ΌΕΧ, по сравнению с 10,5 без добавления ΌΕΧ, повышение составило 20%.

Вывод.

Достижения авторов изобретения по средней оптимизации привели к неожиданному обнаружению того, что глюкокортикоиды могут значительно ослаблять снижение жизнеспособности клеток в подпитываемых культивируемых клетках СНО. В механизм исследования данного феномена вовлечена повышенная регуляция антиапоптического гена ΟΙΕΖ, определенная посредством ςΡΤ-ПЦР и анализом Вестерн-блоттинга. Исследуя действия аналогов и антагониста ΌΕΧ на рост клеток СНО, была определена роль ΟΙΕΖ и глюкокортикоидного рецептора в посредничестве действия ΌΕΧ. Эксперименты в подпитываемых биореаторах показали, что данные аналоги глюкокортикоидов являются эффективными, целесообразными и экономичными химическими веществами для ослабления снижения жизнеспособности в клеточных культурах.

Пример 4.

В данном исследовании действие дексаметазона (ΌΕΧ) на рост клеток СНО, сиалирование белка и агрегацию были изучены на другой клеточной линии СНО с отличительной секрецией гликопротеина (СТЬА41§).

Клеточная линия и среда.

Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была изначально субклонирована от родительских клеток ΌΟ44 и культивирована в собственной химически-определенной ростовой среде.

Эксперименты во встряхиваемых колбах.

Эксперименты проводили в 250-мл встряхиваемых колбах (У\УР иИегпа1юпа1) с начальными объемами 100 мл и начальной плотностью клеток 6х10⁵ клеток/мл. Культуры помещали на платформу шейкера (У\УР ш1етпа1юпа1) при 150 об/мин при 37°С и 6% СО₂ в течение десяти дней. Культуры отбирали ежедневно и рН регулировали при необходимости, используя 1М карбоната натрия, и подпитывали глюкозой и глутамином каждые два дня для поддержания их на соответствующем уровне. Глюкокортикоид дексаметазон (ΌΕΧ) добавляли в конечной концентрации в пределах 0,001-10 мкМ на 2 день. Плотность и жизнеспособность клеток измеряли автономно, с использованием автоматизированного счетчика клеток Себех (Iηηοναΐίδ АС, В|е1еГе1б. Сетшапу). рН культуры и концентрации для глюкозы и глутамина были измерены автономно, с использованием ВюртоШе Апа1у/ег 400 (Νονα ВютеШса1 Сотротайоп, УаЙНат, МА). Надосадочные жидкости от полученных культур были собраны для анализа содержания сиаловой кислоты и уровня НМУ.

Анализ содержания сиаловой кислоты и НМУ.

Исследование содержания сиаловой кислоты и НМУ проводили, как указано в предыдущих примерах.

Результаты.

Действие дексаметазона на рост клеток СНО.

Глюкокортикоид дексаметазон (ΌΕΧ) добавляли к культурам во встряхиваемых колбах в конечной концентрации от 0,001 до 10 мкМ через два дня после посева для определения действий ΌΕΧ на жизнеспособность клеток СНО и возможность продления периода культивирования клеток. Профиль плотности жизнеспособных клеток (УСЭ) в исследовании влияния величины дозы (фиг. 16А) показывает повышение ингибирования роста клеток, возникающее после обработки ΌΕΧ, хотя зависимость от концентрации не очевидна в исследуемом диапазоне. Пик УСЭ достигает 13,9х 10⁶ клеток/мл в не обработанном контроле клеток, в то время как пик УСЭ колебался от 10,6х10⁶ до 12,7х10⁶ клеток/мл в культурах, обработанных от 0,001 до 10 мкМ ΌΕΧ. Жизнеспособность клеток для необработанных культур снижалась стремительно после 6 дня (фиг. 16В) и процент жизнеспособности на 10 день был только 64,5%. В отличие от этого, конечная жизнеспособность клеток с 0,001 мкМ и 10 мкМ ΌΕΧ составила 75,5 и 82,3% соответственно.

Дексаметазон повышает сиалирование и снижает НМУ уровень гликопротеина СТЬА41§.

Кроме роста клеток, действия ΌΕΧ на содеражание сиаловой кислоты и уровень НМУ были также определены. По сравнению с необработанными культурами, процентное содержание сиаловой кислоты

- 29 028491 повышается (фиг. 17А), а процентное содержание видов НМ\У снижается (фиг. 17В), вызванные различными концентрациями ЛЕХ, как показано на фиг. 17. Очевидно, что ЛЕХ способен увеличивать сиалирование и снижать НМ\У виды гликопротеина, что указывает на улучшение качества белка, даже при концентрации 0,001 мкМ. Зависимость от концентрации ЛЕХ на содержание сиаловой кислоты и НМ\У видов не очевидно, как концентрация ЛЕХ выше 0,01 мкМ.

Данные результаты показывают, что действия ЛЕХ на улучшение жизнеспособности клеток, улучшение сиалирования гликопротеина и снижение агрегации не ограничены ни одной переходной одноклеточной формой или составом среды.

Пример 5.

В данном исследовании практическая возможность применения ЛЕХ в культуральной среде клеток для масштабного производства рекомбинантного гликопротеина показана в размере 500 и 5000 л биореакторов.

Клеточная линия и среда.

Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была субклонирована из родительских клеток ЛС44 и культивирована в собственной ростовой среде.

Работа биореатора.

Эксперименты в биореаторах проводили в 7-, 500- и 5000-л биореакторах с начальным рабочим объемом около 3, 300 и 3000 л соответственно. Все биореаторы начинали работу при 37°С и переходили к снижению температуры, когда клетки вступали в фазу продукции для того, чтобы продлить период культивирования клеток. рН и растворенный кислород поддерживали при 7,05 и 50% насыщения воздуха. Скорость перемешивания для размеров 7, 500 и 5000 л составляла 180, 75 и 60 об/мин соответственно. Все эксперименты в биореакторах проводили в подпитываемом режиме с ежедневным питанием безбелковой средой для поддержания определенного уровня глюкозы и других питательных веществ. Дексаметазон включают в питательную среду на всех производственных масштабах с целью повышения жизнеспособности клеток и сиалирования белка. Образцы были взяты во время способа культивирования клеток и анализированы на плотность клеток, жизнеспособность клеток, субстраты и метаболиты.

Исследование титра, содержания сиаловой кислоты и НМ\У проводили, как описано в предыдущих примерах.

Результаты.

На фиг. 18А и 18В представлена производительность биореактора относительно роста и жизнеспособности клеток. Рост клеток посредством увеличения объема от 7 л до 5000 л наблюдался в похожих пиках плотности жизнеспособных клеток в пределах от 12 до 13х10⁶ клеток/мл с погрешностью, представляющей стандартное отклонение выполнений определенных масштабов, частично совпадающих в каждой точке. Плотность клеток достигает максимума на 7 день в масштабе 5000 л и на 8 день для масштабов 7 и 500 л. На 14 день средняя величина жизнеспособности культур клеток составляла 88, 84 и 91% в 7, 500 и 5000 л масштабах биореатора соответственно. На фиг. 18С и 18Л преставлена продуктивность и профили сиаловой кислоты для 7-, 500- и 5000-л биореакторов. Титры на 14 день (сообщенное и нормализованное значение) составляли 13,2, 11,6 и 13,6 для 7-, 500- и 5000-л реакторов соответственно. Пик уровней сиаловой кислоты (сообщенное и нормализированное значение) составлял 16,0, 18,0 и 19,0 при возрастающих масштабах. Сиаловая кислота уменьшилась приблизительно 2,6 единиц к концу проведения для всех масштабов.

Вывод.

В целом включение дексаметазона в питательную среду эффективно во всех масштабах, что указывает на практическую применимость дексаметахона в качестве добавки к питательной среде для получения в промышленных масштабах.

- 30 028491

Список последовательностей <110> БРИСТОЛ-МАЙЕРС СКВИББ КАМПАНИ

ЦЗИН, Ин <120> СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА <130> 11400 ИО РСТ <150> 61/278,343 >151> 2009/10/06 <160> 6 <170> РабепбЬп чегзгоп 3.5 <210> 1 <211> 1152 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз

<220> <221> ( <222> <400> :

ЮЗ (1) .. 1

, (1149)

абд 48

ддб

дба

сбд

сбс

аса

сад

адд

асд

сбд

сбс

адб

сбд

дбе

ебб

дса

Меб 1

С1у

Уа1

Ьеи

Ьеи 5

ТЪг

С1п

Агд

ТЪг

Ьеи 10

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи 15

А1а

сбс 96

сбд

ббб

сса

аде

абд

дед

аде

абд

дса

абд

сас

дбд

дсс

сад

ссб

Ьеи

Ьеи

РЪе

Рго 20

Зег

Меб

А1а

Зег

Меб 25

А1а

Меб

ΗΪ8

Уа1

А1а 30

С1п

Рго

дсб 144

дбд

дба

сбд

дсс

аде

аде

еда

ддс

абс

дсб

аде

ббб

дбд

бдб

дад

А1а

Уа1

Уа1 35

Ьеи

А1а

Зег

Зег

Агд 40

С1у

Не

А1а

Зег

РЪе 45

Уа1

Суз

С1и

баб 192

дса

бсб

сса

ддс

ааа

дсс

асб

дад

дбе

едд

дбд

аса

дбд

ебб

едд

Туг

А1а 50

Зег

Рго

С1у

Ьуз

А1а 55

ТЪг

С1и

Уа1

Агд

Уа1 60

ТЪг

Уа1

Ьеи

Агд

сад 240

дсб

дас

аде

сад

дбд

асб

даа

дбе

бдб

дед

дса

асе

бас

абд

абд

С1п 65

А1а

Азр

Зег

С1п

Ча1 70

ТЪг

С1и

Ча1

Суз

А1а 75

А1а

ТЪг

Туг

Меб

Меб 80

ддд 288

ааб

дад

ббд

асе

ббс

сба

даб

даб

бсс

абс

бде

асд

ддс

асе

бсс

С1у

Азп

С1и

Ьеи

ТЪг 85

РЪе

Ьеи

Азр

Азр

Зег 90

Не

Суз

ТЪг

С1у

ТЪг 95

Зег

- 31 028491

адЕ 336

дда

ааЕ

саа

дЕд

аас

сЕс

асЕ

аЕс

саа

дда

сЕд

адд

дсс

аЕд

дас

Зег

С1у

Азп

С1п 100

Уа1

Азп

Ьеи

ТНг

Не 105

С1п

С1у

Ьеи

Агд

А1а 110

МеЕ

Азр

асд 384

дда

сЕс

Еас

аЕс

Еде

аад

дЕд

дад

сЕс

аЕд

Еас

сса

ссд

сса

Еас

ТНг

С1у

Ьеи 115

Туг

11е

Суз

Ьуз

Уа1 120

С1и

Ьеи

МеЕ

Туг

Рго 125

Рго

Рго

Туг

Нас 432

сЕд

ддс

аЕа

ддс

аас

дда

асе

сад

аЕЕ

ЕаЕ

дЕа

аЕЕ

даЕ

сса

даа

Туг

Ьеи 130

С1у

Не

С1у

Азп

С1у 135

ТНг

С1п

Не

Туг

Уа1 140

Не

Азр

Рго

61и

ссд 480

Еде

сса

даЕ

ЕсЕ

даЕ

сад

дад

ссс

ааа

ЕсЕ

ЕсЕ

дас

ааа

асЕ

сас

Рго 145

Суз

Рго

Азр

Зег

Азр 150

С1п

С1и

Рго

Ьуз

Зег 155

Зег

Азр

Ьуз

ТНг

ΗΪ3 160

аса 528

Есс

сса

ссд

Есс

сса

дса

ссЕ

даа

сЕс

сЕд

ддЕ

дда

Есд

Еса

дЕс

ТНг

Зег

Рго

Рго

Зег 165

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи 170

Ьеи

С1у

С1у

Зег

Зег 175

Уай

ЕЕс 576

сЕс

ЕЕс

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асе

сЕс

аЕд

аЕс

Есс

едд

асе

РНе

Ьеи

РНе

Рго 180

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр 185

ТНг

Ьеи

МеЕ

Не

Зег 190

Агд

ТНг

ссЕ 624

дад

дЕс

аса

Еде

дЕд

дЕд

дЕд

дас

дЕд

аде

сас

даа

дас

ссЕ

дад

Рго

С1и

Уа1 195

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1 200

Азр

Уа1

Зег

Низ

С1и 205

Азр

Рго

С1и

дЕс 672

аад

ЕЕс

аас

Едд

Еас

дЕд

дас

ддс

дЕд

дад

дЕд

саЕ

ааЕ

дсс

аад

Уа1

Ьуз 210

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1 215

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1 220

Нйз

Азп

А1а

Ьуз

аса 720

аад

ссд

едд

дад

дад

сад

Еас

аас

аде

асд

Еас

едд

дЕд

дЕс

аде

ТНг 225

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и 230

С1п

Туг

Азп

Зег

ТНг 235

Туг

Агд

Уай

Уай

Зег 240

дЕс 768

сЕс

асе

дЕс

сЕд

сас

сад

дас

Едд

сЕд

ааЕ

ддс

аад

дад

Еас

аад

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи 245

Нйз

С1п

Азр

Тгр

Ьеи 250

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг 255

Ьуз

Еде 816

аад

дЕс

Есс

аас

ааа

дсс

сЕс

сса

дсс

ссс

аЕс

дад

ааа

асе

аЕс

Суз

Ьуз

Уа1

Зег 260

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго 265

А1а

Рго

Не

С1и

Ьуз 270

ТНг

Не

Есс 864

ааа

дсс

ааа

ддд

сад

ссс

еда

даа

сса

сад

дЕд

Еас

асе

сЕд

ссс

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

Рго

- 32 028491

275

280

285

сса бсс 912

сдд

даб

дад

сбд

асе

аад

аас

сад

дбс

аде

сбд

асе

бде

сбд

Рго Зег

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТНг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

Ьеи

290

295

300

дбс ааа 960

ддс

ббс

баб

ссс

аде

дас

абс

дсс

дбд

дад

бдд

дад

аде

ааб

Уа1 Ьуз

С1у

РНе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

305

310

315

320

ддд сад 1008

ссд

дад

аас

аас

бас

аад

асе

асд

ссб

ссс

дбд

сбд

дас

бсс

С1у С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТНг

ТНг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

325

330

335

дас ддс 1056

бсс

ббс

ббс

сбс

бас

аде

аад

сбс

асе

дбд

дас

аад

аде

адд

Азр С1у

Зег

РНе

РНе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТНг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

340

345

350

бдд сад 1104

сад

ддд

аас

дбс

ббс

бса

бде

бсс

дбд

абд

саб

дад

дсб

сбд

Тгр С1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РНе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

НЬз

С1и

А1а

Ьеи

355

360

365

сас аас

сас

бас

асд

сад

аад

аде

сбс

бсс

сбд

бсб

ссд

ддб

ааа

бда

1152 Н1з Азп

ΗΪ5

Туг

ТНг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

370

375

380

<210>

2

<211>

383

<212> :

БЕЛОК

<213>

Нолю

зариепз

<400>

2

Меб С1у

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТНг

С1п

Агд

ТНг

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

1

5

10

15

Ьеи Ьеи

РНе

Рго

Зег

Меб

А1а

Зег

Меб

А1а

Меб

Нбз

Уа1

А1а

С1п

Рго

20

25

30

А1а Уа1

Уа1

Ьеи

А1а

Зег

Зег

Агд

С1у

Не

А1а

Зег

РНе

Уа1

Суз

С1и

35

40

45

Туг А1а

Зег

Рго

С1у

Ьуз

А1а

ТНг

С1и

Уа1

Агд

Уа1

ТНг

Уа1

Ьеи

Агд

50

55

60

С1п А1а

Азр

Зег

С1п

Уа1

ТНг

С1и

Уа1

Суз

А1а

А1а

ТНг

Туг

Меб

Меб

65

70

75

80

- 33 028491

С1у Азп С1и Ьеи ТЪг РЪе Ьеи Азр Азр Зег Не Суз ТЪг С1у ТЪг Зег 85 90 95

Зег С1у Азп С1п Уа1 Азп Ьеи ТЪг 11е С1п С1у Ьеи Агд А1а МеЪ Азр 100 105 110

ТЪг С1у Ьеи Туг 11е Суз Ьуз Уа1 С1и Ьеи МеЬ Туг Рго Рго Рго Туг 115 120 125

Туг Ьеи С1у Не С1у Азп С1у ТЪг С1п Не Туг Уа1 Не Азр Рго С1и 130 135 140

Рго Суз Рго Азр Зег Азр С1п С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЪг Низ 145 150 155 160

ТЪг Зег Рго Рго Зег Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Зег Зег Уа1 165 170 175

РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЪг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЪг 180 185 190

Рго С1и Уа1 ТЪг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго С1и 195 200 205

Уа1 Ьуз РЪе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Шз Азп А1а Ьуз 210 215 220

ТЪг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЪг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег 225 230 235 240

Уа1 Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи ΗΪ5 С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз 245 250 255

Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТЪг Не 260 265 270

Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЪг Ьеи Рго 275 280 285

Рго Зег Агд Азр 61и Ьеи ТЪг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЪг Суз Ьеи 290 295 300

- 34 028491

Уа1 Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

305

310

315

320

С1у С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

325

330

335

Азр С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

340

345

350

Тгр С1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

Низ

С1и

А1а

Ьеи

355

360

365

Нхз Азп

ΗΪ5

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

370

375

380

<210> :

3

<211>

1152

<212> ,

цнк

<213> 1

4 ото

зариепз

<220> <221> ι

сэз

<222>

(1) ..

.(1149)

<400>

3

абд ддб 48

дба

сбд

сбс

аса

сад

адд

асд

сбд

сбс

адб

сбд

дбе

ебб

дса

Меб С1у

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

С1п

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

1

5

10

15

сбс сбд 96

ббб

сса

аде

абд

дед

аде

абд

дса

абд

сас

дбд

дсс

сад

ссб

Ьеи Ьеи

РЬе

Рго

Зег

Меб

А1а

Зег

Меб

А1а

Меб

Низ

Уа1

А1а

С1п

Рго

20

25

30

дсб дбд 144

дба

сбд

дсс

аде

аде

еда

ддс

абс

дсб

аде

ббб

дбд

бдб

дад

А1а Уа1

Уа1

Ьеи

А1а

Зег

Зег

Агд

С1у

11е

А1а

Зег

РЬе

Уа1

Суз

С1и

35

40

45

баб дса 192

бсб

сса

ддс

ааа

баб

асб

дад

дбе

едд

дбд

аса

дбд

ебб

едд

Туг А1а

Зег

Рго

С1у

Ьуз

Туг

ТЬг

С1и

Уа1

Агд

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьеи

Агд

50

55

60

сад дсб 240

дас

аде

сад

дбд

асб

даа

дбе

бдб

дед

дса

асе

бас

абд

абд

С1п А1а

Азр

Зег

С1п

Уа1

ТЬг

С1и

Уа1

Суз

А1а

А1а

ТЬг

Туг

Меб

Меб

65

70

75

80

ддд ааб

дад

ббд

асе

ббс

сба

даб

даб

бсс

абс

бде

асд

ддс

асе

бсс

288

С1у

Азп

С1и

Ьеи

ТНг 85

РНе

Ьеи

Азр

Азр

Зег 90

Не

Суз

ТНг

С1у

ТНг 95

Зег

адб 336

дда

ааб

саа

дбд

аас

сбс

асб

абс

саа

дда

сбд

адд

дсс

абд

дас

Зег

С1у

Азп

С1п 100

Уа1

Азп

Ьеи

ТНг

11е 105

С1п

С1у

Ьеи

Агд

А1а 110

Меб

Азр

асд 384

дда

сбс

бас

абс

бдс

аад

дбд

дад

сбс

абд

бас

сса

ссд

сса

бас

ТЬг

С1у

Ьеи 115

Туг

11е

Суз

Ьуз

Уа1 120

С1и

Ьеи

Меб

Туг

Рго 125

Рго

Рго

Туг

бас 432

дад

ддс

аба

ддс

аас

дда

асе

сад

абб

баб

дба

абб

даб

сса

даа

Туг

С1и 130

С1у

Не

С1у

Азп

С1у 135

ТНг

С1п

Не

Туг

Уа1 140

Не

Азр

Рго

С1и

ссд 480

бдс

сса

даб

бсб

даб

сад

дад

ссс

ааа

бсб

бсб

дас

ааа

асб

сас

Рго 145

Суз

Рго

Азр

Зег

Азр 150

С1п

С1и

Рго

Ьуз

Зег 155

Зег

Азр

Ьуз

ТНг

Нбз 160

аса 528

бсс

сса

ссд

бсс

сса

дса

ссб

даа

сбс

сбд

ддд

дда

бед

бса

дбс

ТНг

Зег

Рго

Рго

Зег 165

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи 170

Ьеи

С1у

С1у

Зег

Зег 175

Уа1

ббс 576

сбс

ббс

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асе

сбс

абд

абс

бсс

едд

асе

РНе

Ьеи

РНе

Рго 180

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр 185

ТНг

Ьеи

Меб

Не

Зег 190

Агд

ТНг

ссб 624

дад

дбс

аса

бдс

дбд

дбд

дбд

дас

дкд

аде

сас

даа

дас

ссб

дад

Рго

С1и

Уа1 195

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1 200

Азр

Уа1

Зег

Нбз

С1и 205

Азр

Рго

С1и

дбс 672

аад

ббс

аас

бдд

бас

дбд

дас

ддс

дбд

дад

дбд

саб

ааб

дсс

аад

Уа1

Ьуз 210

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1 215

Азр

С1у

Уа1

С1и

\7а1 220

Нбз

Азп

А1а

Ьуз

аса 720

аад

ссд

едд

дад

дад

сад

бас

аас

аде

асд

бас

едб

дбд

дбс

аде

ТНг 225

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и 230

С1п

Туг

Азп

Зег

ТНг 235

Туг

Агд

Уаб

Уаб

Зег 240

дбс 768

сбс

асе

дбс

сбд

сас

сад

дас

бдд

сбд

ааб

ддс

аад

дад

бас

аад

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи 245

Н±5

С1п

Азр

Тгр

Ьеи 250

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг 255

Ьуз

бдс 816

аад

дбс

бсс

аас

ааа

дсс

сбс

сса

дсс

ссс

абс

дад

ааа

асе

абс

Суз

Ьуз

Уа1

Зег 260

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго 265

А1а

Рго

Не

С1и

Ьуз 270

ТНг

11е

бсс 864

ааа

дсс

ааа

ддд

сад

ссс

еда

даа

сса

сад

дбд

бас

асе

сбд

ссс

Зег

Ьуз

А1а 275

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд 280

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг 285

ТЬг

Ьеи

Рго

сса 912

бсс

сдд

даб

дад

сбд

асе

аад

аас

сад

дбе

аде

сбд

асе

бде

сбд

Рго

Зег 290

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТЬг 295

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег 300

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

дбе 960

ааа

ддс

ббс

баб

ссс

аде

дас

абс

дсс

дбд

дад

бдд

дад

аде

ааб

Уа1 305

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго 310

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1 315

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп 320

ддд

сад

ссд

дад

аас

аас

бас

аад

асе

асд

ссб

ссс

дбд

сбд

дас

бее

1008

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп 325

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг 330

Рго Рго

Уа1

Ьеи

Азр 335

Зег

дас

ддс

бее

ббс

ббс

ебс

бас

аде

аад

ебс

асе дбд

дас

аад

аде

адд

1056

Азр

С1у

Зег

РЬе 340

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз 345

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз 350

Зег

Агд

бдд

сад

сад

ддд

аас

дбе

ббс

бса

бде

бее

дбд

абд

саб

дад

дсб

сбд

1104

Тгр

С1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

НЬз

С1и

А1а

Ьеи

355

360

365

сас

аас

сас

бас

асд

сад

аад

аде

ебс

бее

сбд

бсб

сед

ддб

ааа

бда

1152

ΗΪ3

Азп

Низ

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

370

375

380

<210> 4 <211> 383 <212> БЕЛОК <213> Ношо зарЬепз

<400> 4

Меб С1у Уа1 1

Ьеи Ьеи 5

ТЬг

С1п

Агд

ТЬг

Ьеи 10

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи 15

А1а

Ьеи Ьеи РЬе

Рго Зег 20

Меб

А1а

Зег

Меб 25

А1а

Меб

ΗΪ5

Уа1

А1а 30

С1п

Рго

А1а Уа1 Уа1 35

Ьеи А1а

Зег

Зег

Агд 40

С1у

11е

А1а

Зег

РЬе 45

Уа1

Суз

С1и

Туг А1а Зег 50

Рго 61у

Ьуз

Туг 55

ТЬг

С1и

Уа1

Агд

Уа1 60

ТЬг

Уа1

Ьеи

Агд

- 38 028491

290

295

300

Уа1 Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

305

310

315

320

С1у С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уаб

Ьеи

Азр

Зег

325

330

335

Азр С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

340

345

350

Тгр С1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

Нбз

Сби

А1а

Ьеи

355

360

365

Нбз Азп

ΗΪ5

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

370

375

380

<210>

5

<211>

636

<212> ,

ЦНК

<213> :

Ното

зарбепз

<220> <221> '

СОЗ

<222>

(1) ..

.(636)

<400>

5

абд ддб 48

дба

сбд

сбс

аса

сад

адд

асд

сбд

сбс

адб

сбд

дбе

ебб

дса

Меб С1у

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

С1п

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

Уаб

Ьеи

Аба

1

5

10

15

сбс сбд 96

ббб

сса

аде

абд

дед

аде

абд

дса

абд

сас

дбд

дсс

сад

ссб

Ьеи Ьеи

РЬе

Рго

Зег

Меб

А1а

Зег

Меб

А1а

Меб

Нбз

Уаб

Аба

С1п

Рго

20

25

30

дсб дбд 144

дба

сбд

дсс

аде

аде

еда

ддс

абс

дсс

аде

ббб

дбд

бдб

дад

А1а Уа1

Уа1

Ьеи

А1а

Зег

Зег

Агд

С1у

11е

А1а

Зег

РЬе

Уаб

Суз

Сби

35

40

45

баб дса 192

бсб

сса

ддс

ааа

дсс

асб

дад

дбе

едд

дбд

аса

д£д

ебб

едд

Туг А1а

Зег

Рго

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

С1и

Уа1

Агд

Уаб

ТЬг

Уаб

Ьеи

Агд

50

55

60

сад дсб 240

дас

аде

сад

дбд

асб

даа

дбе

бдб

дед

дса

асе

бас

абд

абд

С1п А1а

Азр

Зег

С1п

Уа1

ТЬг

С1и

Уа1

Суз

А1а

А1а

ТЬг

Туг

Меб

Меб

65

70

75

80

- 39 028491

ддд 288 С1у

ааб Азп

дад С1и

ббд Ьеи

асе ТЪг 85

ббс РЪе

сба Ьеи

даб Азр

даб Азр

бсс Зег 90

абс Не

бде Суз

асд ТЪг

ддс СЯу

асе ТЪг 95

бсс Зег

адб

дда

ааб

саа

дбд

аас

сбс

асб

абс

саа

дда

сбд

адд

дсс

абд

дас

336

Зег

С1у

Азп

С1п

Уа1

Азп

Ьеи

ТЪг

Не

С1п

СЯу

Ьеи

Агд

А1а

Меб

Азр

100

105

НО

асд

дда

сбс

бас

абс

бде

аад

дбд

дад

сбс

абд

бас

сса

ссд

сса

бас

384

ТЪг

С1у

Ьеи

Туг

Не

Суз

Ьуз

Уа1

С1и

Ьеи

Меб

Туг

Рго

Рго

Рго

Туг

115

120

125

бас

сбд

ддс

аба

ддс

аас

дда

асе

сад

абб

баб

дба

абб

даб

сса

даа

432

Туг

Ьеи

С1у

Не

С1у

Азп

СЯу

ТЪг

С1п

Не

Туг

Уа1

Не

Азр

Рго

С1и

130

135

140

ссд

бде

сса

даб

бсб

дас

ббс

сбс

сбс

бдд

абс

ебб

дса

дса

дбб

адб

480

Рго

Суз

Рго

Азр

Зег

Азр

РЪе

Ьеи

Ьеи

Тгр

Не

Ьеи

А1а

А1а

Уа1

Зег

145

150

155

160

бед

ддд

ббд

ббб

ббб

баб

аде

ббб

сбс

сбс

аса

дсб

дбб

бсб

ббд

аде

528

Зег

С1у

Ьеи

РЪе

РЪе

Туг

Зег

РЪе

Ьеи

Ьеи

ТЪг

А1а

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

ааа

абд

сба

аад

ааа

ада

аде

ссб

ебб

аса

аса

ддд

дбе

баб

дбд

ааа

576

Ьуз

Меб

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Агд

Зег

Рго

Ьеи

ТЪг

ТЪг

СЯу

Уа1

Туг

Уа1

Ьуз

180

185

190

абд

ссс

сса

аса

дад

сса

даа

бдб

даа

аад

саа

ббб

сад

ссб

баб

ббб

624

Меб

Рго

Рго

ТЪг

С1и

Рго

С1и

Суз

С1и

Ьуз

СЯп

РЪе

С1п

Рго

Туг

РЪе

195

200

205

абб

ссс

абс

ааб

636

Не

Рго

Не

Азп

210

<210> <211> <212> <213>	6 212
БЕЛОК Ното	зарбепз
<400>	6
Меб СЯу Уа1	Ьеи Ьеи	ТЪг С1п Агд ТЪг Ьеи	Ьеи Зег Ьеи Уа1 Ьеи А1а
1		5	10	15

Ьеи

Ьеи

РЪе

Рго 20

Зег

МеЪ

А1а

Зег

МеЬ 25

А1а

МеЬ

Низ

Уа1

А1а 30

С1п

Рго

А1а

Уа1

Уа1

Ьеи

А1а

Зег

Зег

Агд

С1у

11е

А1а

Зег

РЪе

7а1

Суз

С1и

35

40

45

Туг

А1а

Зег

Рго

С1у

Ьуз

А1а

ТЪг

С1и

Уа1

Агд

Уа1

ТЪг

Уа1

Ьеи

Агд

50

55

60

С1п

А1а

Азр

Зег

С1п

Уа1

ТЪг

С1и

Уа1

Суз

А1а

А1а

ТЪг

Туг

МеЬ

МеЬ

65

70

75

80

С1у

Азп

С1и

Ьеи

ТЪг

РЪе

Ьеи

Азр

Азр

Зег

11е

Суз

ТЪг

С1у

ТЪг

Зег

85

90

95

Зег

С1у

Азп

С1п

Уа1

Азп

Ьеи

ТЪг

11е

С1п

С1у

Ьеи

Агд

А1а

МеЪ

Азр

100

105

110

ТЪг

С1у

Ьеи

Туг

11е

Суз

Ьуз

Уа1

С1и

Ьеи

МеЬ

Туг

Рго

Рго

Рго

Туг

115

120

125

Туг

Ьеи

С1у

Не

С1у

Азп

С1у

ТЪг

С1п

11е

Туг

Уа1

11е

Азр

Рго

С1и

130

135

140

Рго

Суз

Рго

Азр

Зег

Азр

РЪе

Ьеи

Ьеи

Тгр

11е

Ьеи

А1а

А1а

Уа1

Зег

145

150

155

160

Зег

С1у

Ьеи

РЪе

РЪе

Туг

Зег

РЪе

Ьеи

Ьеи

ТЪг

А1а

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Ьуз

МеЬ

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Агд

Зег

Рго

Ьеи

ТЪг

ТЪг

С1у

Уа1

Туг

Уа1

Ьуз

180

185

190

МеЬ

Рго

Рго

ТЪг

С1и

Рго

С1и

Суз

С1и

Ьуз

С1п

РЪе

61п

Рго

Туг

РЪе

195 200 205

11е Рго 11е Азп

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Способ культивирования клеток для получения гликозилированной рекомбинантной молекулы СТЬА41д, включающий:

   а) культивирование клеток СНО, которые продуцируют указанную молекулу С'П,А41ц в культуре клеток в условиях, которые обеспечивают получение белка;

   б) питание клеток питательной средой, содержащей дексаметазон, причем концентрация дексаметазона поддерживается в культуре клеток в пределах от 0,1 до 10 мкМ;

   при этом молекула СТЬА41д представляет собой слитую молекулу мутантного внеклеточного домена антигена-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬА4) и иммуноглобулина (1д) и имеет аминокислотную последовательность, соответствующую 26/27-383 аминокислотным остаткам последовательности 5Н(4 ГО ΝΟ: 4.