JP6473079B2 - 高密度増殖およびトランスフェクション培地並びに発現増強物質の固有の組み合わせを用いる、哺乳類細胞における高収率一過性発現 - Google Patents
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Description
本出願の共通の所有者による、その内容全体が本明細書で完全に述べられるように参照により本明細書に明示的に組み込まれる2012年5月2日出願の米国仮出願第61/641,864号に対する35U.S.C.§119(e)に基づく優先権の権利を、本出願は主張する。
本発明は、概して、トランスフェクションおよび細胞培養の分野に関する。特に、本発明は、培養された哺乳類細胞における組換えタンパク質の発現をもたらすのに適したトランスフェクションシステムを提供する。本発明は、さらに、哺乳類細胞における組換えタンパク質の高収率な発現のためのシステムおよび方法に関する。
細胞培養培地は、制御された、人工の、インビトロ環境における、細胞の維持および増殖に必要な栄養素を提供する。細胞培養培地の特性および処方は、特定の細胞の要求に応じて変化する。重要なパラメータは、モル浸透圧濃度、pH、および栄養素組成物を含む。
本発明は、細胞培養およびトランスフェクションシステムを提供し、これにより、システムは、培養における複数の真核細胞内への(例えば、発現可能な核酸のような)1つまたは複数の高分子のトランスフェクションおよびその後の発現による導入をサポートし、かつ導入/トランスフェクションに続く細胞の培養および増殖をさらにサポートし、少なくとも1つの細胞の増殖は、新鮮な培地が補給されることのない培地で継続する。
[本発明1001]
以下の工程を含む、培養された真核細胞である組換えタンパク質を産生する方法:
高密度培養培地において細胞を含む浮遊培養物を得る工程であって、前記浮遊培養物が、約2×10 6 から約2×10 7 細胞/mlの間の細胞密度を有する、工程;
発現タンパク質を産生することが可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸を、前記細胞にトランスフェクトする工程;
前記トランスフェクトされた細胞を第1の期間にわたってインキュベートする工程;
前記トランスフェクトされた細胞を、少なくとも1つの発現増強物質組成物と接触させる工程;
前記ベクターが前記タンパク質を発現するように、前記トランスフェクトされた細胞を、前記発現増強物質組成物の存在下で第2の期間にわたってインキュベートする工程;および
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程。
[本発明1002]
前記培養された真核細胞が、高密度条件下での増殖に適応した浮遊培養物である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記浮遊培養物が、293細胞、293細胞の派生物、293F細胞、293F細胞の派生物、PER−C6細胞、PER−C6細胞の派生物、CHO細胞、CHO細胞の派生物、CapT細胞、CapT細胞の派生物、COS細胞、COS細胞の派生物、COS−7細胞、COS−7の派生物、Sp2/0細胞、またはSp2/0細胞の派生物を含み、前記細胞が、高密度条件下での増殖に適応している、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記浮遊培養物が293F細胞の派生物を含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記浮遊培養物の量が、約200μLから約5Lの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記発現増強物質組成物が、バルプロ酸(VPA、酸およびナトリウム塩)、プロピオン酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ガラクトースを含む糖、アミノ酸混合物、もしくは酪酸のうちの少なくとも1つ、または前述の任意の組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記発現増強物質組成物がバルプロ酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
バルプロ酸(VPA)の濃度が、約0.20mMから約25mMの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
バルプロ酸の前記濃度が、約0.25mMから約24mM、約0.26mMから約23mM、0.27mMから約23mM、0.28mMから約23mM、0.29mMから約22mM、約0.30mMから約21mM、約0.31mMから約20mM、約0.32mMから約19mM、約0.33mMから約17mM、約0.34mMから約18mM、約0.35mMから約17mM、約0.36mMから約16mM、約0.37mMから約15mM、約0.40mMから約14mM、約0.41mMから約13mM、約0.42mMから約12mM、約0.43mMから約11mM、約0.44mMから約10mM、約0.45mMから約9mM、約0.46mMから約8mM、約0.47mMから約7mM、約0.48mMから約6mM、約0.49mMから約5mM、約0.50mMから約4mM、約0.50mMから約4mM、約0.55mMから約3mM、0.6mMから約2mMまたは0.75から約1.5mM、約0.15mMから約1.5mM、約0.16mMから約1.5mM、約0.17mMから約1.5mM、約0.18mMから約1.5mM、約0.19mMから約1.5mM、約0.20mMから約1.5mM、約0.25mMから約1.5mM、約0.30mMから約1.5mM、約0.40mMから約1.5mM、約0.50mMから約1.5mM、約0.60mMから約1.5mM、約0.70mMから約1.5mM、約0.80mMから約1.5mM、約0.90mMから約1.5mM、または約0.10mMから約1.5mMの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記発現増強物質組成物がプロピオン酸ナトリウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1011]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約0.2mMから約100mMの範囲である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの前記最終濃度が、約0.5から約80mM、約0.4mMから約70mM、約0.5mMから約60mM、約0.6mMから約50mM、約0.7mMから約40mM、約0.8mMから約30mM、約0.9mMから約20mM、約1mMから約15mM、約2mMから約10mM、約3mMから約9mM、約4mMから約8mM、または約5mMから約7mMの範囲であり、特定の好ましい非限定的な実施形態において、NAPPの最適な最終濃度が、約1mMから約10mM、約1mMから約2mM、約2mMから約3mM、約3mMから約4mM、約4mMから約5mM、約5mMから約6mM、約6mMから約7mM、約7mMから約8mM、約8mMから約9mM、または約9mMから約10mMの範囲であってもよく、特定の好ましい非限定的な実施形態において、NAPPの最適な最終濃度が、約1mM、約1.5mM、約2mM、約2.5mM、約3mM、約3.5mM、約4mM、約4.5mM、約5mM、約5.5mM、約6mM、約6.5mM、約7mM、約7.5mM、約8mM、約8.5mM、約9mM、約9.5mM、または約10mMであってもよい、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記発現増強物質組成物が酢酸リチウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1014]
前記培養物におけるLiAcの最終濃度が、約0.25から約25mMの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記培養物におけるLiAcの前記最終濃度が、約0.26mMから約20mM、約0.27mMから約15mM、約0.28mMから約10mM、約0.29mMから約5mM、約0.3mMから約4.5mM、約0.31mMから約4mM、約0.35mMから約3mM、約0.5mMから約2.5mM、約1mMから約3mM、約1.5mMから約2.5mM、または約2mMから約3mMの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記発現増強物質組成物が酪酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1017]
前記培養物における酪酸の最終濃度が、約0.25から約25mM、約0.26mMから約20mM、約0.27mMから約15mM、約0.28mMから約10mM、約0.29mMから約5mM、約0.3mMから約4.5mM、約0.31mMから約4mM、約0.35mMから約3mM、約0.5mMから約2.5mM、約1mMから約3mM、約1.5mMから約2.5mM、または約2mMから約3mMの範囲である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記浮遊培養物の量が、約25mLμlから約50Lの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記浮遊培養物の量が、約100mLμlから約1Lの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記浮遊培養物の量が、約200mLμlから約500mLの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約1×10 6 から約20×10 6 細胞/mlの間である、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約2×10 6 から約6×10 6 の範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記発現ベクターがpCDNA3.3の派生物である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
pCDNA3.3の前記派生物がWPREエレメントを含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記発現ベクターがWPREエレメントを含む、本発明1001の方法。
[本発明1026]
前記トランスフェクション工程の後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補給を必要としない、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、交換、補充、または補給されない、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記高密度培養培地が、トランスフェクトされた細胞の増殖を、80%を上回ったままの細胞生存率で、2.5×10 6 細胞/mlを超える細胞密度で促進することが可能な、無血清/無タンパク質の、化学的に規定された培養培地である、本発明1001の方法。
[本発明1029]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、前記培地の補給、交換、または補充を必要としない、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記発現タンパク質を精製する工程をさらに含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を発現する、本発明1001の方法。
[本発明1033]
前記発現増強タンパク質が、AKT、P18、P21、Bcl−X L 、およびPKBaからなるリストから選択される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を一過性に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を安定に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1036]
前記第1の期間が、約2時間から約4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記第2の期間が、約10時間から約10日、約2時間から5日、約2.5時間から4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。
以下の記述では、細胞培養および組換えDNA技術に使用される多くの用語が、広範に利用される。本明細書および特許請求の範囲の明確でより一貫した理解のために、その用語の範囲を含めて、次に定義を示す。
関心タンパク質は、直接にだけでなく、好ましくはシグナル配列、または成熟したタンパク質またはポリペプチドのN末端に特定の切断部位を有する、他のポリペプチドである、異種ポリペプチドを有する融合ポリペプチドとしても、組換えで産生され得る。選択された異種のシグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識されおよび処理される(つまり、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものである。哺乳類細胞の発現において、哺乳類のシグナル配列並びにウイルスの分泌性のリーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが使用可能である。
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方が、1つまたは複数の選択された宿主細胞において、ベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。概して、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主染色体DNAとは独立したベクターの複製を可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、2μプラスミド起点は、酵母に適しており、および種々のウイルスの起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV、またはBPV)は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。概して、複製成分の起点は、哺乳類の発現ベクターを必要としない(SV40起点は、典型的には、それが初期プロモーターを含むという理由のみで使用され得る)。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択可能なマーカーともよばれる選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、(b)栄養要求性の欠乏を補完する、または(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するための、タンパク質をコードし、例えば、杆菌についてのD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
発現およびクローニングベクターは、概して、宿主生物体により認識されるプロモーターを含み、関心タンパク質をコードする核酸に対して操作可能に結合される。種々のプロモーター配列が、真核生物について既知である。ほとんど全ての真核性遺伝子が、転写が開始される位置から約25〜30塩基上流に位置するATリッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から70〜80塩基上流でみられる他の配列は、NがあらゆるヌクレオチドであってもよいCNCAAT領域である。ほとんどの真核性遺伝子の3'末端では、3'末端のコード配列に対するポリAテールの追加に関するシグナルであり得るAATAAA配列がある。これらの配列の全てが、適切に、真核性の発現ベクター内に挿入される。
より高度な真核生物による、本発明による関心タンパク質をコードするDNAの転写は、ベクター内にエンハンサー配列を導入することにより増加されまたは高められることが多い。多くのエンハンサー配列は、哺乳類の遺伝子から現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、およびインスリン)。しばしば、もっぱらではないが、真核細胞のウイルス由来のエンハンサーが使用される。例には、複製起点の後期側(late side)(bp100〜270)のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核性のプロモーターの活性化のためのエレメントを高めることについてのYaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照。エンハンサーは、抗体コード配列に対して、位置5'または3'でベクター内にスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから位置5'で配置される。さらなるエンハンサーが当該分野で知られており、例えば、哺乳類またはウイルスの遺伝子から得られた、または由来のエンハンサーを含み得る。本明細書での使用のために企図される、1つの特に好ましいエンハンサーは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)である。
真核性の宿主細胞(酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞の生物体由来の有核細胞)で使用される発現ベクターはまた、転写の終結のためにおよびmRNAを安定させるために必要な配列を含む。このような配列は、通常、真核性のまたはウイルスのDNAまたはcDNAの5'および時折3'非翻訳領域から使用可能である。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分において、ポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドのセグメントを含む。1つの有用な転写終結成分は、ウシ増殖ホルモンのポリアデニル化領域である。国際出願公開第94/11026号および本明細書に記載される発現ベクターを参照。
本発明は、さらに、高いレベルの関心タンパク質を発現するための方法に関する。本発明の方法は、(a)懸濁液において培養されるための、哺乳類細胞を得ることと、(b)懸濁液における細胞の培養をサポートするのに十分な条件下で、細胞を本発明の培養培地と接触させることと、関心タンパク質をコードする発現可能な核酸を培養細胞にトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた細胞を1つまたは複数の発現増強物質と接触させることと、トランスフェクトされた細胞を、関心タンパク質の発現を許容する条件下で規定された期間培養することと、細胞を収集することとを含む、懸濁液において哺乳類細胞(特に、上記のもの、および最も特には、293細胞、293F細胞、PER−C6細胞、CHO細胞、CapT細胞、COS−7L細胞、およびSp2/0細胞、またはあらゆるその派生物)を培養することを含み得る。
タンパク質収率を最大に(例えば、Freestyle(商標)293システムのような、市販されている一過性発現システムにより得られるものに対して少なくとも2倍超に)するための細胞培養培地およびトランスフェクションシステムを開発すること。システムは、複数のタンパク質のタイプについておよび種々の浮遊細胞において有効であるべきである。システムは、再現性を増加させ、変動性を最小化するべきであり、スケーラブルであるべきである(マルチウェルプレートからラージスケールへ)。本発明のさらなる実施形態は、向上した発現ベクターの開発、本発明の培養システムにおける高密度培養条件下での増殖に適応した高密度細胞株、トランスフェクション増強物質、例えばバルプロ酸およびプロピオン酸ナトリウム(とりわけ)等の組み込みおよび使用を含む。トランスフェクション中またはトランスフェクション後の培地交換を伴わず、簡易で使用しやすい、高い細胞密度でのトランスフェクションを可能にするためのプロトコールを開発することは、本発明のさらなる目的である。
種々の市販の無血清、無タンパク質の培養培地が、約14×106細胞/mlまでの細胞密度を有する適応した293F細胞株の生存率を維持するそれらの能力について評価され、その後、本発明の実施において使用された。1週間を超える時間枠にわたって培養細胞株の生存率を15×106細胞/ml近くの密度に達しても高く維持する、無血清、無タンパク質の培地が選択されたが、また、約3×106細胞/mlの驚くべき高い細胞密度でのトランスフェクションを可能にした(対して、現在市販されている一過性トランスフェクションシステムについては1×106細胞/ml)。結果を図1に示し、これは、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いて達成可能な、得られた細胞密度のグラフを示す。これまでに高密度増殖に適応した細胞を、3回の継代にわたって種々のテスト増殖培地にゆっくりと適応させた。細胞が適応された培地は、本発明の一実施形態による高密度培養培地(黒い丸)、テスト培地1(黒い三角)、テスト培地2(白い三角)、およびテスト培地3(白いひし形)を含む。細胞は、0.2×106細胞/mlで30mlフラスコに播種される前に、各培地において複数回の継代にわたって培養された。細胞密度および生存率が、実験の過程にわたって、増殖培地を補充せず、交換せず、またはそうでなければ補給せずに、8日間にわたってモニタリングされた。選択された増殖培地の1つ(高密度増殖培地、黒い丸)は、実験の過程にわたって生存率を実質的に低下させることなく、培養された浮遊細胞の驚くべき高い密度を維持することができた。よって、当業者は、細胞株の変種である特定の細胞株を用いる使用のための種々の増殖培地を、容易に評価することが可能であり、ここで増殖培地は、培地を交換、補給、または補充することなく規定された期間にわたって浮遊細胞の高密度の培養を促進する能力に基づいて選択され得る。このようなことは、当業者により、過度の実験を行うことなく達成され得る。
種々の浮遊細胞が、本発明の実施において使用され得るが、選択された高密度増殖培地における使用および本実施形態による使用に適応した細胞株を使用することが好ましい。さらに、細胞は、高密度増殖、高い生存率、および増加したタンパク質発現のために具体的に選択され得る。このことを達成するために、親293F線維芽細胞は、数回の継代にわたって段階的な培地交換をともなう、広範な適応プロセスを受けた。さらに、適応した細胞のサイズおよび発現能力は、後の世代で増加することがわかった。細胞は、継代72回でATCCに預けて、遺伝子解析による検証を受け、マイコプラズマ汚染のない293F細胞として認証された。細胞は解凍され、それらの生存率が検証された。細胞は、安定性、発現性能、および培養中および約20×106細胞/mlの密度まで増殖したときに高い生存率を保持するそれらの能力を検証するために、30回にわたって継代された。上記のような、増加した細胞密度、生存率、およびヒトIgG発現のために選択された細胞集団は、もとの細胞株(ライン1)よりも約1.7倍多いhIgGを示した。高収率に適応した細胞(ライン3)はまた、増殖率、生存率、および細胞サイズを増加させた。
化学的な添加物のパネルは、タンパク質収率に対する、各成分または1つもしくは複数の成分の組み合わせの相対的寄与を評価するための組み合わせの実験においてテストされた。種々のトランスフェクション/発現増強物質は、それが有意にタンパク質産生を向上させることが確認された。成分は、2つの安定した増強物質溶液に処方された。トランスフェクション増強物質1(上記に定義されるように、バルプロ酸(valprioc acid))はhIgGを2倍にする。増強物質2(上記に定義されるように、プロピオン酸ナトリウム)は、単独では強い効果を有しないが、増強物質1と組み合わせると、対照(増強物質1も増強物質2もいずれも有しない)に対してほぼ3倍多いhIgGを提供する。
本発明の一過性発現のシステムは、1g/Lから最大で約2g/Lまでの間のヒトIgGおよびCriptoを産生し得る。本発明のシステムの一過性発現システムは、図4Aから図4Dに示されるタンパク質の一過性タンパク質発現において、市販されているFreestyle(商標)293システムと比較した場合、3.5倍〜11.8倍の間の増加を示した。図4は、いくつかの実施形態による高収率一過性トランスフェクションシステムおよび従来技術の一過性トランスフェクションシステム(Freestyle(商標)293システム)を用いた、4つの異なるおよび固有のタンパク質の発現レベルの比較を示す。図4Aは、市販されているFreeStyle(商標)Maxシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたヒトIgGの発現における5倍より多い増加を示す。図4Bは、市販されているFreeStyle(商標)Maxシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたCriptoの発現における5.2倍より多い増加を示す。図4Cは、市販されているFreeStyle(商標)Maxシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたβ2アドレナリン受容体の発現におけるほぼ4倍の増加を示す。図4Dは、市販されているFreeStyle(商標)Maxシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたウサギIgGの発現における11倍より多い増加を示す。
次に、本発明者らは、広く使用される、臨床的重要性のある発現タンパク質を用いて、一過性トランスフェクションシステムのスケーラビリティおよび再現性を試験することを探求した。エリスロポエチン(EPO)は、本発明の一過性トランスフェクションシステム(グラフの右側の複数の棒)およびFreestyle(商標)293システム(グラフの左側の複数の棒)を用いて発現された。当該発明のシステムは、1ml(24ウェルプレートの形式において)から1L(3Lの振とうフラスコ形式)までスケーラブルである。非常に良い再現性が、3つの異なる研究室における、3つの別個の分析からの結果にみられた。
2つの異なるタンパク質の1g/Lの発現が、高収率一過性トランスフェクションシステムを用いて達成された。高密度培養培地は、高密度のトランスフェクションを可能にした。一過性タンパク質発現に対する有意な向上が、細胞株の選択を介して得られた。トランスフェクション増強物質は、高い細胞密度でのトランスフェクションおよび発現を向上させる。結果は非常にスケーラブルであり、かつ再現性がある。本発明の一過性トランスフェクションシステムは、Freestyle(商標)293システムと比較して、タンパク質発現における、3.5倍〜15倍の増加を達成した。
Claims (14)
- 培養された293細胞または293細胞の派生物において組換えタンパク質を産生する方法であって、
高密度培養培地において、高密度浮遊培養での増殖に適応している、293細胞または該293細胞の派生物を含む浮遊培養物を提供する工程であって、前記浮遊培養物が、2×106から2×107細胞/mlの間の細胞密度を有する、工程;
発現タンパク質を産生することが可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸を、前記293細胞または293細胞の派生物にトランスフェクトする工程;
前記トランスフェクトされた293細胞または293細胞の派生物を第1の期間にわたってインキュベートする工程;
前記トランスフェクトされた293細胞または293細胞の派生物を、バルプロ酸(VPA、酸およびナトリウム塩)を含む少なくとも1つの発現増強物質組成物と接触させる工程;
前記ベクターが前記タンパク質を発現するように、前記トランスフェクトされた293細胞または293細胞の派生物を、前記発現増強物質組成物の存在下で第2の期間にわたってインキュベートする工程;および
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた293細胞または293細胞の派生物を収集する工程
を含み、前記高密度培養培地が、前記トランスフェクション工程の後に、交換、補充、または補給されない、方法。 - 前記培養された293細胞または293細胞の派生物が、高密度条件下での増殖に適応した浮遊培養物である、請求項1に記載の方法。
- 前記浮遊培養物が、293細胞、293細胞の派生物、293F細胞、または293F細胞の派生物を含み、前記細胞が、高密度条件下での増殖に適応しており;
任意で、前記浮遊培養物が293F細胞の派生物を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記発現増強物質組成物が、プロピオン酸ナトリウム、または酢酸リチウムをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- バルプロ酸(VPA)の濃度が、0.20mMから25mMの範囲であり;任意で、バルプロ酸の濃度が、0.25mMから24mM、0.26mMから23mM、0.27mMから23mM、0.28mMから23mM、0.29mMから22mM、0.30mMから21mM、0.31mMから20mM、0.32mMから19mM、0.33mMから17mM、0.34mMから18mM、0.35mMから17mM、0.36mMから16mM、0.37mMから15mM、0.40mMから14mM、0.41mMから13mM、0.42mMから12mM、0.43mMから11mM、0.44mMから10mM、0.45mMから9mM、0.46mMから8mM、0.47mMから7mM、0.48mMから6mM、0.49mMから5mM、0.50mMから4mM、0.50mMから4mM、0.55mMから3mM、0.6mMから2mMまたは0.75から1.5mM、0.15mMから1.5mM、0.16mMから1.5mM、0.17mMから1.5mM、0.18mMから1.5mM、0.19mMから1.5mM、0.20mMから1.5mM、0.25mMから1.5mM、0.30mMから1.5mM、0.40mMから1.5mM、0.50mMから1.5mM、0.60mMから1.5mM、0.70mMから1.5mM、0.80mMから1.5mM、0.90mMから1.5mM、または0.10mMから1.5mMの範囲である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 以下のいずれかである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法:
前記発現増強物質組成物がプロピオン酸ナトリウムを含み、かつ任意で、前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、0.2mMから100mMの範囲であり;
さらに任意で、前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの前記最終濃度が、0.5から80mM、0.4mMから70mM、0.5mMから60mM、0.6mMから50mM、0.7mMから40mM、0.8mMから30mM、0.9mMから20mM、1mMから15mM、2mMから10mM、3mMから9mM、4mMから8mM、または5mMから7mMの範囲であり;またさらに任意で、NAPPの最適な最終濃度が、1mMから10mM、1mMから2mM、2mMから3mM、3mMから4mM、4mMから5mM、5mMから6mM、6mMから7mM、7mMから8mM、8mMから9mM、または9mMから10mMの範囲であり;なおまたさらに任意で、NAPPの最適な最終濃度が、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、または10mMであるか;あるいは、
前記発現増強物質組成物が酢酸リチウムを含み、かつ任意で、前記培養物におけるLiAcの最終濃度が、0.25から25mMの範囲であり;
さらに任意で、前記培養物におけるLiAcの前記最終濃度が、0.26mMから20mM、0.27mMから15mM、0.28mMから10mM、0.29mMから5mM、0.3mMから4.5mM、0.31mMから4mM、0.35mMから3mM、0.5mMから2.5mM、1mMから3mM、1.5mMから2.5mM、または2mMから3mMの範囲である。 - 前記浮遊培養物の量が、200μLから5Lの範囲であるか;前記浮遊培養物の量が、25mLから50Lの範囲であるか;前記浮遊培養物の量が、100mLから1Lの範囲であるか;または、前記浮遊培養物の量が、200mLから500mLの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、1×106から20×106細胞/mlの間であるか;または、前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、2×106から6×106の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記発現ベクターがWPREエレメントを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高密度培養培地が、トランスフェクトされた細胞の増殖を、80%を上回ったままの細胞生存率で、2.5×106細胞/mlを超える細胞密度で促進することが可能な、無血清/無タンパク質の、化学的に規定された培養培地である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程をさらに含み;任意で、前記発現タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記293細胞または293細胞の派生物が、1種または複数種の発現増強タンパク質を発現する、前記方法であって、任意で以下のうち少なくとも1つをさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法:
前記発現増強タンパク質が、AKT、P18、P21、Bcl−XL、およびPKBaからなるリストから選択される;
前記293細胞または293細胞の派生物が、1種または複数種の発現増強タンパク質を一過性に発現する;
前記293細胞または293細胞の派生物が、1種または複数種の発現増強タンパク質を安定に発現する。 - 前記第1の期間が、2時間から4日、3から90時間、4から85時間、5から80時間、6から75時間、7から70時間、8から65時間、9から60時間、10から55時間、11から50時間、12から45時間、13から40時間、14から35時間、15から30時間、16から24時間、17から24時間、18から24時間、19から24時間、20から24時間、21から24時間、22から24時間、または23から24時間の範囲であり、任意で、前記第1の期間が、15時間まで、16時間まで、17時間まで、18時間まで、19時間まで、20時間まで、21時間まで、22時間まで、23時間まで、24時間まで、25時間まで、26時間まで、27時間まで、28時間まで、29時間まで、または30時間までである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の期間が、10時間から10日、2時間から5日、2.5時間から4日、3から90時間、4から85時間、5から80時間、6から75時間、7から70時間、8から65時間、9から60時間、10から55時間、11から50時間、12から45時間、13から40時間、14から35時間、15から30時間、16から24時間、17から24時間、18から24時間、19から24時間、20から24時間、21から24時間、22から24時間、または23から24時間の範囲であり、任意で、前記第2の期間が、15時間まで、16時間まで、17時間まで、18時間まで、19時間まで、20時間まで、21時間まで、22時間まで、23時間まで、24時間まで、25時間まで、26時間まで、27時間まで、28時間まで、29時間まで、または30時間までである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
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