CN104364369A

CN104364369A - 哺乳动物细胞中使用独特的高密度生长和转染培养基与表达增强剂对的高产量瞬时表达

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Publication number: CN104364369A
Application number: CN201380031703.4A
Authority: CN
Inventors: S·K·瓦苏; H·C·丘; J·罗杰斯; M·西斯内罗斯; J·李; C·Y·刘; M·琼斯
Original assignee: Life Technologies Inc
Current assignee: Life Technologies Inc; Life Technologies Corp
Priority date: 2012-05-02
Filing date: 2013-05-02
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2033-05-02
Also published as: WO2013166339A1; EP3404095B1; BR112014027378A2; US20230130038A1; EP4148122A1; JP2019088304A; KR102136698B1; KR102292949B1; EP2844737B1; JP6473079B2; EP2844737A1; JP2015515859A; US20130316400A1; CA2872476C; US10066000B2; EP3404095A1; JP6772309B2; US11498949B2; CN109370980A; KR20200090935A

Abstract

本发明大体上是针对适用于将大分子和化合物(例如核酸分子)引入到细胞(例如真核细胞)中的细胞培养基(尤其是无血清、非动物来源和/或化学成分确定的培养基)。根据本发明，所述引入可以在所述培养基存在下进行。含有所述经引入的物质的细胞可以接着在所述培养基中加以培养，且所述经引入的物质对所述细胞的作用可以经测量或测定。具体来说，本发明允许将核酸分子(例如载体)引入到细胞(尤其真核细胞)中以及在所述细胞中表达由所述核酸分子编码的蛋白质。本发明避免了每次用所述细胞执行不同程序(例如培养细胞对转染细胞)时更换所述细胞培养基的需要。本发明还涉及适用于培养和转化/转染细胞的组合物和试剂盒。

Description

哺乳动物细胞中使用独特的高密度生长和转染培养基与表达增强剂对的高产量瞬时表达

【相关申请的交叉引用】

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2012年5月2日提交的美国临时申请第61/641,864号的优先权，其与本申请共同拥有且其全部内容特此明确以引用的方式并入，就如同在本文中完全阐述般。

【技术领域】

本发明大体上涉及转染和细胞培养领域。具体来说，本发明提供一种适于在培养的哺乳动物细胞中产量表达重组蛋白的转染系统。本发明进一步涉及用于在哺乳动物细胞中高产量表达重组蛋白的系统和方法。

【背景技术】

细胞培养基提供在受控制的人造和体外环境中维持和生长细胞所必需的营养物。细胞培养基的特征和配方取决于具体细胞需求而改变。重要的参数包括渗透压摩尔浓度、pH和营养物组成。

细胞培养基调配物在文献中已有充分记载且大量培养基是可商购的。在早期细胞培养工作中，培养基调配物是基于血液的化学组成和物理化学特性(例如渗透压摩尔浓度、pH等)，且被称为“生理溶液”(林格S.(Ringer,S.),生理学杂志(J.Physiol.)3:380-393(1880)；威茅斯C.(Waymouth,C.),培养物中的细胞和组织(Cells and Tissuesin Culture),第1卷,学术出版社(Academic Press),伦敦(London),第99-142页(1965)中；威茅斯C.,体外(In Vitro)6:109-127(1970))。然而，哺乳动物身体的不同组织中的细胞暴露于在氧气/二氧化碳分压以及营养物、维生素和微量元素的浓度方面不同的微环境；因此，成功体外培养不同细胞类型可能需要使用不同培养基调配物。细胞培养基的典型组分包括氨基酸、有机和无机盐、维生素、微量金属、糖、脂质和核酸，其类型和量可能取决于给定细胞或组织类型的具体需求而改变。

培养基调配物已用于培育多种细胞类型，包括动物、植物和细菌细胞。经培育的细胞具有许多用途，包括研究生理过程以及产生有用的生物物质。所述有用的产物的实例包括单克隆抗体、激素、生长因子、酶等。所述产物具有许多商业和治疗性应用，并且，随着重组DNA技术的出现，细胞可以经工程改造以产生大量的这些产物。经培养的细胞还常规地用于可以用作载体和/或疫苗的病毒的分离、鉴别和生长。因此，能够体外培育细胞不仅对于研究细胞生理学来说很重要，而且还是产生不可另外通过有成本效益的手段获得的有用物质所必需的。

在已使用体外细胞培养基生长的各种细胞类型之中，特别令人感兴趣的是来源于上皮的细胞。上皮内衬于高等生物体的器官和腺体的内和外表面。由于此定位处于环境与生物体之间的外部界面(例如皮肤)或处于器官与间质间隙之间的内部界面(例如肠粘膜内衬)，故上皮在维持内稳定方面具有主要作用。上皮例如通过调节营养物和废弃物的运输和通透性来执行此功能(弗瑞旭尼R.I.(Freshney,R.I.),上皮细胞的培养(Culture of Epithelial Cells),弗瑞旭尼R.I.编,纽约：威立-利斯公司(New York:Wiley-Liss),第1-23页(1992)中)。

构成上皮的细胞一般被称为上皮细胞。这些细胞可以多层形式存在，如在皮肤中，或以单层形式存在，如在肺泡中。如可能所预期的，上皮细胞的结构、功能和生理学通常是组织特异性的。举例来说，皮肤的表皮上皮细胞被组织为成层的鳞状上皮且主要参与形成生物体的保护屏障，而许多腺体的分泌性上皮细胞通常以单层的立方形细胞形式发现，其在产生分泌性蛋白质和糖蛋白方面具有主要作用。然而，与其位置或功能无关，上皮细胞通常是再生性的。也就是说，在正常条件下，或响应于损伤或其它活化刺激，上皮细胞能够分裂或生长。此再生能力已促进上皮细胞的体外操纵，达到多种原代上皮细胞和细胞系已在体外得到成功培育的程度(弗瑞旭尼，同上)。

虽然已在文献中报道了多种上皮细胞和上皮细胞系的分离和使用，但已证实了展现出上皮形态的人类胚胎肾细胞系293(“293细胞”)尤其适用于研究外源性配体受体的表达、病毒的产生以及同种异体和异种重组蛋白的表达。举例来说，美国专利第5,166,066号描述了包含包括苯二氮卓结合位点的功能性GABA受体的稳定293细胞系的构建，已证实其适用于鉴别和筛选精神活性的候选药物。293细胞也已用于产生病毒，如天然和重组腺病毒(加尼尔A.(Garnier,A.)等人,细胞技术(Cytotechnol.)15:145-155(1994)；保特A.(Bout,A.)等人,癌症基因疗法(Cancer Gene Therapy)3(6):S24,摘要P-52(1996)；王J.-W.(Wang,J.-W.)等人,癌症基因疗法3(6):S24,摘要P-53(1996))，所述病毒可用于疫苗生产或构建用于重组蛋白表达的腺病毒载体。最后，已证实293细胞适用于大规模生产多种重组人类蛋白质(伯格D.T(Berg,D.T.)等人,生物技术(BioTechniques)14(6):972-978(1993)；佩夏M.V.(Peshwa,M.V.)等人,生物技术与生物工程学(Biotechnol.Bioeng.)41:179-187(1993)；加尼尔A.等人,细胞技术15:145-155(1994))。

不严谨地称为成纤维细胞的细胞已从许多不同组织中分离出来且被理解为结缔组织细胞。培养来自胚胎和成年组织的细胞系(不严谨地称为成纤维细胞)明显是可能的。成纤维细胞特性上具有“纺锤体”外形。成纤维细胞样细胞具有成纤维细胞典型的形态特征。在光学显微镜下，细胞在其于培养容器表面上生长为单层时呈现尖和细长形(“纺锤体形状”)。细胞系在用适当标记物(如胶原蛋白I型)证实之后可被视为成纤维细胞或成纤维细胞样(弗瑞旭尼R.I.,上皮细胞培养,弗瑞旭尼R.I.编,纽约：威立-利斯公司,第1-23页(1987))。

CHO细胞已被归类为来源于中国仓鼠卵巢的上皮和成纤维细胞两者。起始于中国仓鼠卵巢的细胞系(CHO-K1)(高F.-T.(Kao,F.-T.)和普克T.T.(Puck,T.T.),美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)60:1275-1281(1968))已被培养多年，但其身份仍未经证实。

大部分原代哺乳动物上皮细胞、哺乳动物成纤维细胞、上皮细胞系和成纤维细胞系通常以单层培养物形式生长。然而，对于一些应用，将所述细胞培育为悬浮培养物将是有利的。举例来说，悬浮培养物生长在三维空间中。然而，类似大小容器中的单层培养物仅可以二维生长在容器表面上。因此，与单层培养物相比，悬浮培养物可引起较高细胞产量，且相对应地引起较高生物制剂(例如病毒、重组多肽等)产量。另外，悬浮培养物通常更易于经由向培养容器中简单加入新鲜培养基(稀释传代培养)而非如在单层培养物下通常所需的进行胰蛋白酶消化和离心来进料和按比例扩大。进料的简易性和可将悬浮培养物按比例扩大的简易性代表了在用于处理相当数目细胞的时间和人工方面的实质性节约。

然而，许多锚着依赖性细胞(如原代上皮细胞、原代成纤维细胞、上皮细胞系和成纤维细胞系)不易于被调适成悬浮培养物。因为其通常依赖于锚着于基底以实现最佳生长，故这些细胞悬浮生长可需要将其连接于微载体(如乳胶或胶原蛋白珠粒)。因此，以此方式生长的细胞虽然与传统单层培养物相比能够形成较高密度培养物，但仍在技术上连接于表面；因此，这些细胞的传代培养需要与用于传代培养单层培养物的步骤类似的步骤。此外，在建立大批式或发酵罐培养物时，较大体积的微载体通常沉降到培养容器的底部，由此需要更复杂的搅拌机制来保持微载体(且因此保持细胞)悬浮而不造成对细胞的剪切损伤(佩夏M.V.等人,生物技术与生物工程学41:179-187(1993))。

尽管许多经转化的细胞能够悬浮生长(弗瑞旭尼R.I.,动物细胞的培养：基本技术手册(Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique)，纽约：艾伦R.利斯公司(New York:Alan R.Liss,Inc.),第123-125页(1983))，但成功的悬浮培养物通常需要相对高蛋白培养基或用血清或血清组分(如连接因子纤维粘连蛋白和/或玻璃粘连蛋白)补充培养基、或复杂的灌注培养控制系统(京Y.-S.(Kyung,Y.-S.)等人,细胞技术14:183-190(1994))，这可能是不利的。另外，许多上皮细胞在以悬浮形式生长时形成聚集体或“凝集块”，其可能会干扰成功传代培养且减少生长速率和培养物产生的生物制品。在发生凝集时，暴露于培养基的总细胞表面积减少，且细胞缺乏营养且不能将废弃物有效交换到培养基中。因此，生长减缓，获得降低的细胞密度，且蛋白质表达受损。

通常，细胞培养基调配物用一系列添加剂补充，包括成分不确定的组分，如胎牛血清(FBS)(5％-20％v/v)或来自动物胚胎、器官或腺体的提取物(0.5％-10％v/v)。虽然FBS是动物细胞培养基中最常施用的补充，但也常规使用其它血清来源，包括新生小牛、马和人类。已用于制备提取物以便补充培养基的器官或腺体包括下颚腺体(柯亨S.(Cohen,S.),生物化学杂志(J.Biol.Chem.)237:1555-1565(1961))、垂体(佩尔D.M.(Peehl,D.M.)和汉姆R.G.(Ham,R.G.),体外16:516-525(1980)；美国专利第4,673,649号)、下丘脑(马恰格T.(Maciag,T.)等人,美国国家科学院院刊76:5674-5678(1979)；吉尔克里斯特B.A.(Gilchrest,B.A.)等人,细胞生理学杂志(J.Cell Physiol.)120:377-383(1984))、眼视网膜(巴里托D.(Barretault,D.)等人,分化(Differentiation)18:29-42(1981))和脑(马恰格T.等人,科学(Science)211:1452-1454(1981))。这些类型的化学成分不确定的补充剂在细胞培养基中提供数个有用功能(兰伯特K.J.(Lambert,K.J.)等人,动物细胞生物技术(Animal CellBiotechnology),第1卷,施皮尔R.E.(Spier,R.E.)等人编,学术出版社纽约,第85-122页(1985)中)。举例来说，这些补充剂向不稳定或水不溶性营养物提供载剂或螯合剂；结合并中和毒性部分；提供激素和生长因子、蛋白酶抑制剂和必需的通常未经鉴别或成分不确定的低分子量营养物；以及保护细胞免于物理应力和损伤。因此，血清或器官/腺体提取物常用作相对低成本补充剂以向动物细胞的培养提供最佳培养基。

令人遗憾的是，血清或器官/腺体提取物在组织培养应用中的使用具有数个缺点(兰伯特K.J.等人,动物细胞生物技术,第1卷,施皮尔R.E.等人编,学术出版社纽约,第85-122页(1985)中)。举例来说，这些补充剂和血清的化学组成即使是来自单一制造商也在批次之间存在变化。补充剂还可能会污染有感染剂(例如支原体和病毒)，所述感染剂可能会严重地渐渐损害所培养的细胞的健康和最终产物的品质。成分不确定的组分(如血清或动物提取物)的使用也妨碍对所培养的细胞的营养和激素需求的真实定义和阐明，由此排除了以受控制的方式研究特异性生长因子或营养物对培养物中细胞生长和分化的作用的能力。此外，成分不确定的补充剂防碍研究人员研究所培养的细胞中的异常生长和分化和疾病相关的变化。最后且对于在工业生产生物物质中采用细胞培养基者来说最重要的是，培养基的血清和器官/腺体提取物补充可因血清或提取物蛋白的非特异性共纯化而使从培养基中纯化所需物质变得复杂并增加所述纯化的成本。

相对于在生长于用血清补充的培养基中的细胞中看到的表达水平，从生长于无血清培养基中的细胞获得重组蛋白表达水平改进(巴蒂斯塔P.J.(Battista,P.J.)等人,美国生物技术实验室(Am.Biotech.Lab.)12:64-68(1994))。然而，无血清培养基可以仍含有多种动物来源组分中的一或多者，包括白蛋白、胎球蛋白、各种激素和其它蛋白质。蛋白质或肽的存在使得重组蛋白的纯化困难、耗时并昂贵。

为了克服使用血清或器官/腺体提取物的这些缺点，已开发了多种所谓的“成分确定的”培养基。这些通常经特定调配以支持单一细胞类型培养的培养基不含有成分不确定的补充剂，并取而代之并入经定义量的通常由血清或提取物补充剂提供的经纯化生长因子、蛋白质、脂蛋白和其它物质。因为所述培养基中的组分(和其浓度)是精确已知的，故这些培养基一般被称为“成分确定的培养基”。有时与“成分确定的培养基”互换使用的是术语“无血清培养基”或“SFM”。多种SFM调配物是可商购的，如被设计成用于支持内皮细胞、角化细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、造血干细胞、成纤维细胞、软骨细胞或肝细胞培养的那些，其购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(LifeTechnologies Corporation,Carlsbad,Calif.)。然而，SFM与成分确定的培养基之间的区别在于，SFM是不含血清和蛋白质部分(例如血清白蛋白)但不必不含其它成分不确定的组分(如器官/腺体提取物)的培养基。实际上，已经报道或可商购的数种SFM含有所述成分不确定的组分，包括支持角化细胞体外培养的数种调配物(博伊斯S.T.(Boyce,S.T.)和汉姆R.G.,研究性皮肤病学杂志(J.Invest.Dermatol.)81:33(1983)；威尔J.J.(Wille,J.J.)等人,细胞生理学杂志(J.Cell.Physiol.)121:31(1984)；皮特尔科M.R.(Pittelkow,M.R.)和斯科特R.E.(Scott,R.E.),梅奥诊所学报(Mayo Clin.Proc.)61:771(1986)；皮里希L.(Pirisi,L.)等人,病毒学杂志(J.Virol.)61:1061(1987)；希普利G.D.(Shipley,G.D.)和皮特尔科M.R.,皮肤病学文献(Arch.DermatoL)123:1541(1987)；希普利G.D.等人,细胞生理学杂志138:511-518(1989)；戴利J.P.(Daley,J.P.)等人,FOCUS(GIBCO/LTI)12:68(1990)；美国专利第4,673,649号和第4,940,666号)。SFM由此在术语的真实定义方面无法被视为成分确定的培养基。

成分确定的培养基一般向使用者提供数种独特的优点。举例来说，使用成分确定的培养基有助于研究特异性生长因子或其它培养基组分对细胞生理学的作用，所述作用在细胞培育于含血清或含提取物的培养基中时可被掩蔽。另外，成分确定的培养基与含有血清或提取物的培养基相比通常含有量低得多的蛋白质(实际上，成分确定的培养基通常被称为“低蛋白培养基”)，使得对由在成分确定的培养基中培养的细胞产生的生物物质的纯化更简单且更便宜。

一些极简单的成分确定的培养基(其主要由维生素、氨基酸、有机和无机盐以及缓冲液组成)已用于细胞培养。然而，所述培养基(通常称为“基础培养基”)通常严重缺乏大部分动物细胞所需的营养内含物。因此，大部分成分确定的培养基使其它组分并入到基础培养基中以使培养基在营养学上更复杂，但维持培养基的无血清和低蛋白含量。所述组分的实例包括牛血清白蛋白(BSA)或人类血清白蛋白(HSA)；来源于天然(动物)或重组来源的某些生长因子，如表皮生长因子(EGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)；脂质，如脂肪酸、固醇和磷脂；脂质衍生物和复合物，如磷酸乙醇胺、乙醇胺和脂蛋白；蛋白质和类固醇激素，如胰岛素、氢化可的松(hydrocortisone)和孕酮；核苷酸前体；以及某些微量元素(由威茅斯C.(Waymouth,C.)分子和细胞生物学的细胞培养方法(Cell Culture Methods for Molecularand Cell Biology),第1卷:用于无血清动物细胞培养的培养基、补充剂和底物的制备方法(Methods for Preparation of Media,Supplements,and Substrata for Serum-Free Animal Cell Culture),巴尔内斯D.W.(Barnes,D.W.)等人编,纽约：艾伦R.利斯公司,第23-68页(1984)和高斯泊达洛维奇D.(Gospodarowicz,D.),同上,在第69-86页(1984)综述)。

然而，在细胞培养基中使用动物蛋白补充剂也具有某些缺点。举例来说，存在这样的风险：从其纯化的培养基和/或产物可以是免疫原性的，尤其在补充剂是来源于不同于所培养的细胞来源的动物时。如果从所述培养基中纯化待用作治疗剂的生物物质，那么一定量的这些免疫原性蛋白质或肽可以被共纯化且可在接受所述治疗剂的动物中诱导免疫反应(达到且包括全身性过敏反应)。

为了排除这一潜在问题，可使用来源于与待培养的细胞相同的物种的补充剂。举例来说，可使用HSA作为补充剂促进人类细胞的培养，而用于培养牛细胞的培养基将改为使用BSA。然而，这种方法会带来将污染物和不定的病原体引入到培养基中的风险(如来自HSA制剂的克雅二氏病(Creutzfeld-Jakob Disease，CJD)，或来自BSA制剂的牛海绵状脑病(“疯牛病”)朊病毒)，所述风险显然可能会不利地影响所述培养基在制备动物和人类治疗剂中的使用。实际上，为了所述安全性原因，生物技术工业和政府机构逐渐管制、劝阻且甚至禁止使用可含有所述病原体的含有动物来源蛋白的细胞培养基。

为了克服在SFM中使用动物蛋白的局限性，已数次尝试构建完全不含动物蛋白的动物细胞培养基。举例来说，一些培养基已将酵母细胞的提取物并入到基础培养基中(参见例如英国专利申请第GB901673号；凯伊L.(Keay,L.),生物技术与生物工程学17:745-764(1975))，从而提供氮和其它必需营养物的来源。在另一种方法中，已在加入或不加入酵母提取物的情况下使用小麦面筋的水解产物来促进动物细胞的体外生长(日本专利申请第JP 2-49579号)。已开发了其它培养基，其中血清经传统上已用于细菌培养的肉或蛋白质(如α-乳白蛋白或酪蛋白(例如蛋白胨))的酶促消化物替换(拉斯法尔格E.Y.(Lasfargues,E.Y.)等人,体外8(6):494-500(1973)；凯伊L.,生物技术与生物工程学17:745-764(1975)；凯伊L.,生物技术与生物工程学19:399-411(1977)；施拉格尔E.-J.(Schlager,E.-J.),免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)194:191-199(1996))。然而，这些方法中无一者提供对于培养多种动物细胞最佳的培养基。此外，已展示出来自某些植物(包括小麦、大麦、黑麦和燕麦)的提取物会抑制来源于动物细胞的无细胞系统中的蛋白质合成(科尔曼W.H.(Coleman,W.H.)和罗伯茨W.K.(Roberts,W.K.),生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)696:239-244(1982))，表明在细胞培养基中使用来源于这些植物的肽可以实际上抑制而非刺激体外动物细胞的生长。最近，包含大米肽的动物细胞培养SFM调配物已经描述且展示出适用于培养多种正常和经转化的动物细胞(参见美国专利第6,103,529号，其以全文引用的方式并入本文中)。

不管由将动物来源的补充剂加入到细胞培养基中造成的潜在困难，所述补充剂是常规使用的。时常加入到成分确定的培养基中的一种所述补充剂是转铁蛋白。转铁蛋白在体内起到将铁传递到细胞的作用。哺乳动物细胞摄取铁的机制已经综述(钱Z.M.(Qian,Z.M.)和唐P.L.(Tang,P.L.)(1995)生物化学与生物物理学报1269,205-214)。由于包括能量产生和氧化呼吸在内的许多代谢过程中需要铁作为辅因子，故通常用转铁蛋白补充无血清培养基，以便传递必需的铁以实现大部分细胞体外的成功培育。关于转铁蛋白制备中各种潜在不定的试剂的担忧已刺激了对其它可用作转铁蛋白替代物的天然铁载体化合物的搜寻。这种搜寻因以下事实而复杂：天然铁载体通常来源于血清且由此经历上述血清补充的局限性。

为了克服使用天然来源金属载体的局限性，正探索某些结合金属的化合物以用于向所培养的细胞供应金属，尤其是锌、铁、锰和镁。简单载体，如螯合剂(例如EDTA)和某些酸或其盐(例如柠檬酸盐、吡啶甲酸盐、以及苯甲酸或异羟肟酸的衍生物)已展示出适用于某些无血清生长培养基(参见美国专利第5,045,454号和第5,118,513号；特斯塔(Testa)等人,英国血液学杂志(Brit.J.Haematol.)60:491-502,(1985)；伽内沙咕噜(Ganeshaguru)等人,生物化学与药理学(Biochem.Pharmacol.)29:1275-1279(1980)；怀特(White)等人,血液(Blood)48:923-929(1976))。

尽管这些参考文献公开了一些金属载体，但对数据的解释因数种实验因素而复杂。数据是从有限数目的细胞系搜集的且展示出单通道的结果。另外，培养基补充有血清。血清固有地含有转铁蛋白和其它潜在铁载体。即使在血清或转铁蛋白不存在下传代一或两次之后，对已在补充血清的培养基中培养过的细胞的生长也有“延续作用”(参见例如基南J.(Keenan,J.)和克莱因斯M.(Clynes,M.)(1996)体外细胞发育生物学-动物(In Vitro Cell Dev.Biol-Animal)32,451-453)。其它已知结合金属的化合物已在医学上用于从体内去除铁且不用于传递。令人遗憾的是，许多这些简单铁螯合化合物不提供足够的可供所培养的细胞使用或为所培养的细胞摄取的铁。

一旦确定供具体细胞类型生长用的适合的培养基调配物，就时常需要改变所讨论的细胞以便将所需生物学物质的产生优化。有效产生并纯化生物学物质中的关键步骤是将一或多种大分子(例如肽、蛋白质、核酸等)引入到将产生所述物质的细胞中。这可通过各种方法实现。一种广泛使用的将大分子引入到细胞中的方法被称为转染。

通常，目标细胞在针对细胞生长进行优化的细胞培养基中生长到所需细胞密度。一旦达到所需密度，就将培养基更换为针对转染方法进行优化的培养基。在大部分情形下，用于转染的培养基并不支持细胞生长，但转染培养基仅用于将核酸引入到细胞中的目的。因此，所述方法一般需要从培养物收集细胞(通常通过离心进行)，洗涤细胞以去除生长培养基的痕迹，将细胞在相关大分子存在下悬浮在转染培养基中，将细胞在转染培养基中孵育足以摄取大分子的时间段，任选地去除转染培养基，并从细胞洗涤转染培养基的残余物，且接着将经转染的细胞再悬浮于生长培养基中。将生长培养基更换为转染培养基、洗涤细胞并将转染培养基更换回生长培养基的步骤需要大量的细胞实际动手操作，由此实质上增加重组DNA技术的时间和费用。

作为一个历史实例，293细胞已以单层培养物形式培育在补充血清型复合培养基(即DMEM)中。在悬浮生长时，293细胞具有聚集成大细胞团簇的倾向。这些大细胞聚集体的形成降低了细胞的存活力。因为在聚集体中心的细胞并不直接暴露于培养基，故这些细胞对培养基中营养物的接近有限，且难以将废弃物交换到培养基中。另外，这种对培养基的接近减少使团簇中的细胞不适于利用引入到培养基中的因子进行遗传操作(即，利用核酸转化)。由于这些困难，293细胞总体上尚未用于悬浮培养以用于生物物质的产生。

因此，在所属领域中仍然需要允许真核细胞悬浮生长同时允许以减少量的操作转染细胞的细胞培养基和瞬时转染系统。这类培养基应优选地是无血清和/或化学成分明确和/或无蛋白质的培养基和/或缺乏动物来源物质的培养基，其促进哺乳动物细胞生长到高密度和/或增加重组蛋白的表达水平，减少细胞凝集，且其并不需要补充动物蛋白，如血清、转铁蛋白、胰岛素等。这类培养基优选地将允许通常是锚着依赖性的哺乳动物细胞(包括上皮细胞和成纤维细胞，如293细胞和CHO细胞)的悬浮培育。优选地，这类培养基也将能够以比用当前可供使用的培养基通常可获得的密度高的密度培育和培养上述细胞类型。另外，所述培养基将允许更容易且更有成本效益且有效地产生并纯化生物技术工业中通过经培养的哺乳动物细胞产生的大量商业上或科学上重要的生物学物质(例如病毒、重组蛋白、生物制品、重组抗体等)，且将在采用哺乳动物细胞培育的方法中提供更一致的结果。本发明满足了这些和其它需求。

【发明概述】

本发明提供一种细胞培养和转染系统，借此所述系统借助于一或多种大分子(如，例如可表达的核酸)转染到培养的多个真核细胞中并在所述细胞中后续表达来支持引入，且进一步支持细胞在引入/转染之后的培育和生长，其中至少一种细胞在不存在培养基用新鲜培养基补充的情况下在培养基中继续生长。

在一些实施例中，不必在细胞的引入/转染期间从存在的细胞去除、补给或更换所用培养基来支持其进一步生长。在另一个优选实施例中，在引入/转染之后，细胞的生长以及从可表达的核酸产生表达的蛋白质可在一定体积的培养基中实现，所述体积是与进行引入/转染的培养基的体积大致相同的体积到不超过约10倍其体积。使用本发明的培养基，在已将核酸引入到细胞中之后以及在已引入核酸的细胞被进一步培养以表达核酸之前不必补给、更换或补充培养基。

瞬时表达正迅速成为所选择的用于快速的哺乳动物蛋白产生的系统。瞬时转染的灵活性允许从概念到在手中的蛋白质的快速实现时间，且许多不同蛋白质可同步或依序产生。瞬时转染技术的下一个关键发展是在不损失瞬时形式的速度和灵活性的情况下使用稳定表达系统获得的接近或相同的表达水平。我们首次报道了新颖瞬时转染系统的开发，所述系统利用高密度293F细胞培养物来在细胞经转染之后7天内产生表达水平>1g/L(高达约2g/L)的人类IgG和非IgG蛋白。

为了获得所述高水平的蛋白质表达，开发了一种新颖细胞培养系统，其包括新高密度生长培养基与适宜于在所述培养基中高密度生长的悬浮细胞群体的组合，所述系统允许某些哺乳动物细胞群体达到高达20×10⁶个细胞/毫升(更通常高达约15×10⁶个细胞/毫升)的活细胞密度。这些超高密度培养物与传统方案相比能够在较高细胞密度下转染，显著增加蛋白质的容积产量。添加剂还发现在转染之后或期间加入一或多种表达增强剂调配物会使蛋白质表达水平升高到比在当前可商购的瞬时转染系统下可见的表达水平高多达10到12倍的水平。亲本悬浮培养哺乳动物细胞针对在高密度培养条件下改进的生长和存活率特征进行调适，且接着进一步针对增加的蛋白质产生进行选择。所得高密度调适的细胞与亲本细胞系相比生长速率增加、细胞大小增加、且比生产量增加。最后，转染方法通过使用与一或多种表达增强剂调配物组合使用的一或多种转染试剂来优化以进一步增加总蛋白质产量。

当所有这些改进组合到单一表达系统中时，蛋白质水平对于IgG和非IgG重组蛋白两者来说与可商购的FreeStyle^TM293表达系统相比增加高达10倍，且针对多种蛋白质获得>1g/L的表达水平。另外，蛋白质功能性被证实对于在本发明的高产量表达系统中表达的数种蛋白质来说在与流行的可商购的FreeStyle^TM293系统相比时是相当的。总之，这些结果指示出可使用将许多蛋白质表达技术的进展合并成单一易于使用形式的新颖瞬时哺乳动物表达系统来获得功能蛋白产量的显著增加。

本发明还提供了一种培育真核细胞的方法，其包含：(a)使细胞与本发明的细胞培养基接触；(b)将细胞维持在适于支持细胞在培养物中培育的条件下；以及(c)任选地表达核酸以形成蛋白质产物。

本发明还提供了一种将一或多种大分子引入到培养物中的至少一种真核细胞中的方法，所述方法包含：(a)在培养物的根据权利要求1所述的培养基中培养至少一种真核细胞；(b)将至少一种大分子在足以使所述至少一种大分子中的一或多者引入至少一种细胞中的条件下引入到培养物中；以及(c)在培养基中培育至少一种细胞以产生产物，所述产物的产生受所述至少一种分子控制，其中在不存在培养基用新鲜培养基替换的情况下至少一种细胞在培养基中继续生长，其中不必在引入期间从存在的至少一种细胞去除所用培养基来支持所述至少一种细胞的生长，和/或其中在引入之后，生长是在一定体积的培养基中培育中实现的，所述体积是与进行引入的培养基的体积大致相同的体积到不超过约10倍其体积。

本发明还提供了一种用于体外培育和转染细胞的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的细胞培养基，且任选地进一步包含以下各项中的一或多者：一或多种用于将至少一种分子引入到细胞中的试剂、一或多种大分子、至少一种细胞、和关于在培养物中培养至少一种细胞和/或关于将至少一种大分子引入到培养物中的至少一种细胞中的说明书。

本发明还提供了一种组合物，其包含本发明的细胞培养基和至少一种选自由以下各项组成的群组的组分：至少一种真核细胞、一或多种用于将至少一种大分子引入到至少一种细胞中的试剂以及一或多种大分子。

所属领域的技术人员根据本发明的以下图式和描述以及权利要求书将清楚本发明的其它实施例。

【附图说明】

本文中参考随附图式仅借助于实例描述本发明。现具体参考详细图式，强调所示细节是作为举例且仅出于说明性论述本发明优选实施例的目的，且以提供被认为是对本发明的原理和概念方面的最有用且易于理解的描述的原因呈现。在这点上，未试图比基本理解本发明所必需更详细地展示本发明的结构详情。

在附图中：

图1是展示使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统可实现的细胞密度的图式。被调适用于高密度生长的细胞经3代缓慢调适到各种培养基中。细胞调适的培养基包括根据本发明的一个实施例的高密度培养基(实心圆)、测试培养基1(实心三角形)、测试培养基2(空心三角形)、测试培养基3(空心菱形)。将细胞在每一培养基中培养多代，随后以0.2×10⁶个细胞/毫升接种于30ml烧瓶中。经8天监测细胞密度和存活率；

图2是概述用于根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的细胞系表达优化的条形图。将亲本293F细胞系分割成多个传代培养物，随后将所述多个传代培养物调适到高密度培养基中。能够以高密度生长的各个传代培养物接着针对其表达重组测试蛋白(人类IgG)的能力进行选择和评估。标记高产量调适的293F细胞的细胞的传代培养物(右组条形)与来源于相同亲本293F细胞系的细胞的两种不同传代培养物相比表达多35％到45％之间的重组IgG；

图3是概述用于根据一些实施例的瞬时转染系统的各种增强剂的作用的条形图。鉴别出显著改进蛋白质产生的表达增强剂。组分被调配成2种稳定增强剂溶液。表达增强剂1的加入使hIgG表达加倍(比较前两个条形)。增强剂2本身的加入仅展示对IgG增强表达的边际作用，但当与增强剂1组合加入时，相较于对照提供多到几乎3倍的hIgG(比较第三和第四)；

图4展示使用根据一些实施例的高产量瞬时转染系统和现有技术瞬时转染系统(Freestyle^TM 293系统)的4种不同且独特蛋白质的表达水平的比较。图4A展示在与可商购的FreeStyle^TM Max系统相比时使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的人类IgG表达的大于5倍的增加。图4B展示在与可商购的FreeStyle^TM Max系统相比时使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的Cripto表达的大于5.2倍的增加。图4C展示在与可商购的FreeStyle^TM Max系统相比时使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的β2-肾上腺素受体表达的几乎4倍的增加。图4D展示在与可商购的FreeStyle^TM Max系统相比时使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的兔IgG表达的大于11倍的增加；

图5是比较使用根据一些实施例的瞬时转染系统与现有技术瞬时转染系统实现的EPO表达水平的条形图。EPO使用本发明的瞬时表达系统和Freestyle^TM 293系统表达。本发明系统可从1ml(24孔板形式)按比例扩大到1L(3L摇瓶形式)。在来自三个不同实验室的三个独立分析员的结果中可见特定蛋白质表达水平的可靠再现性。

【具体实施方式】

本发明提供了用于真核和原核细胞两者生长的改进的培养基调配物。本发明培养基支持细胞生长、将大分子引入到培养的细胞中以及在不需要在生长、引入和/或培育之间补给、更换、补充或改变培养基的情况下进行细胞培育。本发明的培养基可用于支持或增强任何细胞的生长和培育。本发明还提供了可用作一或多种非所需组分(例如动物来源组分)的取代物或替代所述一或多种非所需组分的化合物。替代化合物提供非所需组分的至少一种所需功能。

【定义】

在随后的描述中，广泛地使用多个用于细胞培养和重组DNA技术的术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括欲给出所述术语的范围)清楚且更一致的理解，提供以下定义。

术语将大分子或化合物“引入”到培养物中是指将大分子或化合物供应到培养基中。

术语将大分子或化合物“引入”到至少一种细胞中是指将大分子或化合物供应到细胞，使得大分子或化合物变得内化在细胞中。举例来说，大分子或化合物可使用转染、转化、注射和/或脂质体引入来引入到细胞中，并且还可以使用所属领域的技术人员已知的其它方法引入到细胞中。优选地，大分子或化合物是通过脂质体引入来引入到细胞中的。大分子优选地是蛋白质、肽、多肽或核酸。大分子可为蛋白质。或者，大分子可为肽。或者，大分子可为多肽。大分子还可为核酸。

如本文中所用，术语“大分子”涵盖生物分子。在一个实施例中，术语大分子是指核酸。在一个优选实施例中，术语大分子是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。更优选地，术语大分子是指DNA。更优选地，术语大分子是指互补DNA(cDNA)。大分子可带电荷或不带电荷。DNA分子是带电荷大分子的一个实例。在一些情况下，如本文中所用的术语“大分子”可与术语“可表达的核酸”互换使用。

术语“转染”在本文中用于指将核酸、蛋白质或其它大分子传递到目标细胞，使得核酸、蛋白质或其它大分子在所述细胞中得以表达或具有生物功能。

如本文中所用的术语“可表达的核酸”与分子量无关地包括DNA和RNA两者，且术语“表达”意指细胞内核酸的功能性存在的任何表现，包括(但不限于)瞬时表达和稳定表达两者。功能方面包括通过寡核苷酸或蛋白质传递对表达进行抑制。

术语“核酸的表达”和其等效说法是指核酸在细胞中复制、DNA转录成信使RNA、RNA翻译成蛋白质、蛋白质的翻译后修饰和/或蛋白质在细胞中运输或其变化形式或组合。

术语“成分”是指可在细胞培养基中用于维持或促进细胞生长或增殖的任何化合物(无论是化学来源还是生物来源)。术语“组分”、“营养物”和“成分”可互换使用且都意欲指所述化合物。用于细胞培养基的典型成分包括氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白质等。促进或维持细胞离体培育的其它成分可由所属领域的技术人员根据具体需要加以选择。本发明的培养基可包括一或多种选自由以下各项组成的群组的组分：牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)；一或多种来源于天然(动物)或重组来源的生长因子，如表皮生长因子(EGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)；一或多种脂质，如脂肪酸、固醇和磷脂；一或多种脂质衍生物和复合物，如磷酸乙醇胺、乙醇胺和脂蛋白；一或多种蛋白质；一或多种和类固醇激素，如胰岛素、氢化可的松和孕酮；一或多种核苷酸前体；以及一或多种微量元素。

如本文中所用的术语“细胞”是指包括所有类型的真核和原核细胞。在优选实施例中，所述术语是指真核细胞，尤其是哺乳动物细胞。在某些示例性但非限制性实施例中，术语“细胞”意欲指人类293细胞或其变异体，如可悬浮生长的293变异体。尤其优选的是可以在悬浮培养物中生长、增殖并转染的293细胞的变异体，具体地说是可以高密度(例如大于约2×10⁶个细胞/毫升，更优选地大于约3×10⁶个细胞/毫升，或甚至任选地大于约4×10⁶个细胞/毫升)培养的那些变异体。所述变异型293细胞系的一个实例是EXPI293^TM F细胞。在其它示例性但非限制性实施例中，术语“细胞”意欲指CHO细胞。

如本文中所用，当用于根据本发明培养细胞以及出于进行转染工作流程的目的采用其的本发明方法的情形时，术语“高密度”一般是指已知细胞系、或已知细胞系的变异体，其可在适当细胞培养基中生长或培养到大于约1×10⁶个细胞/毫升、更优选地大于约2×10⁶个细胞/毫升、最优选地大于约3×10⁶个细胞/毫升、或甚至任选地大于约4×10⁶个细胞/毫升、或更高达约20×10⁶个细胞/毫升的密度，同时仍然保持以高效率转染的能力并且能够以高水平(例如超过200μg/ml到高达约1mg/ml或更高的水平)表达目标蛋白。

短语“高密度培养基”在本文中用于指能够维持哺乳动物细胞(优选地悬浮生长的细胞)以高达约2×10⁷个细胞/毫升的密度生长同时维持所述细胞超过约80％的存活率且此外维持所述悬浮细胞有效转染并表达高量重组蛋白的能力的任何培养基。本发明的实践中所用的“高密度培养基”可在不同应用和用途之间变化，且可能取决于所用细胞系、瞬时表达的所需蛋白质的性质、选择用于将表达载体转移到细胞中的转染模态的性质以及加入到如下文所述的系统中的任何表达增强剂的量和性质。尽管如此，预期用于本发明瞬时表达系统和方法的优选的“高密度培养基”将通常是无血清、无蛋白质的，允许悬浮细胞培育和生长到高达约2×10⁷个细胞/毫升、更通常在约2×10⁶个细胞/毫升到约1×10⁷个细胞/毫升之间的密度，且将进一步实现在瞬时表达系统中产生的蛋白质产量超过至少200μg/mL细胞培养物到2mg/mL细胞培养物、更通常在约500μg/ml细胞培养物到约1mg/mL细胞培养物之间。理想地，根据本发明使用的高密度培养基将有助于细胞以在约1×10⁶到约20×10⁶个细胞/毫升、约2×10⁶到约2×10⁶个细胞/毫升、或约2.5×10⁶到约6×10⁶个细胞/毫升范围内的密度转染。适用于本发明实践的示例性高密度培养基包括(但不限于)HuMEC基础无血清培养基、KNOCKOUT^TM CTS^TM无外来物ESC/iPSC培养基、STEMPRO^TM-34SFM培养基、STEMPRO^TM NSC培养基、ESSENTIAL^TM-8培养基、培养基254、培养基106、培养基131、培养基154、培养基171、培养基171、培养基200、培养基231、HeptoZYME-SFM、人类内皮-SFM、FREESTYLE^TM 293表达培养基、培养基154CF/PRF、培养基154C、培养基154CF、培养基106、培养基200PRF、培养基131、Essential^TM-6培养基、STEMPRO^TM-34培养基、星形胶质细胞培养基、培养基CTS^TM、AMINOMAX^TM C-100基础培养基、AMINOMAX^TM-II完全培养基、CD FORTICHO^TM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLE^TM CHO表达培养基、CD OPTICHO^TM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基、SF-900^TM培养基、EXPI293^TM表达培养基、LHC基础培养基、LHC-8培养基、293SFM培养基、CD 293培养基、AEM生长培养基、PER.细胞培养基、培养基、培养基、角质细胞-SFM培养基、LHC培养基、LHC-8培养基、LHC-9培养基和其任何衍生物或修改型。在某些优选但非限制性的实施例中，高密度培养基可为CD FORTICHO^TM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLE^TM CHO表达培养基、CD OPTICHO^TM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基、FREESTYLE^TM293表达培养基、EXPI293^TM表达培养基或类似培养基、或其修改型。以上列出的示例性高密度培养基可尤其适于CHO细胞、CHO细胞变异体、293细胞、293细胞变异体、CapT细胞、CapT细胞变异体或经调适用于高密度培养系统的任何其它细胞的高密度生长、繁殖、转染和维持。

短语“被调适用于高密度培养物的细胞”意欲指已调适成以高密度生长在高密度培养基中同时保持细胞存活率处于或高于约80％的细胞谱系或来源于同一亲本细胞谱系的细胞的(非克隆)群体。所述细胞可通过经>40、>50、>60、>70或>80次连续传代以高密度维持细胞且用所需高密度培养基逐渐更换生长培养基的比例来从亲本细胞群体中分离或选择出。任选地，在所述方法期间，不同细胞池可个别地繁殖且经历选择程序，同时同步评估转染效率和或蛋白质表达效率，使得可选择出可以高密度维持和生长、以高效率转染且表达高水平所需重组蛋白的细胞的非克隆群体。虽然熟练的从业者将易于清楚，多种细胞类型和谱系可经历这种选择程序，但已确定来源于CHO细胞的细胞谱系、来源于293成纤维细胞的细胞谱系和来源于CapT细胞的细胞尤其经受所述选择方法以便被调适成高密度生长条件。理想地，被调适用于高密度生长培养物且适用于本发明的细胞还将能够以高效率转染和/或能够以超过至少约200μg/mL细胞培养物到约2mg/mL细胞培养物、更通常在约500μg/ml细胞培养物到约1mg/mL细胞培养物之间的产量表达重组蛋白。理想地，被调适用于根据本发明使用的高密度培养物的细胞能够以在约1×10⁶到约20×10⁶个细胞/毫升、约2×10⁶到约2×10⁶个细胞/毫升、或约2.5×10⁶到约6×10⁶个细胞/毫升范围内的密度维持和转染。

“细胞培养”或“培养”意指在人造体外环境中维持细胞。

“培育”意指在有利于生长和/或分化和/或持续存活力的条件下体外维持细胞。“培育”可与“细胞培养”互换使用。培育是通过每毫升培养基活细胞数来评估的。在引入大分子之后的培育优选地包括产生产物，例如病毒上的蛋白质产物。

如本文中所用的术语“补给、更换或补充培养基”是指将一定体积的新鲜细胞培养基加入到已存在于培养物中的培养基中，和/或用新鲜培养基更换已存在于培养物中的培养基，和/或用新培养基补充已存在于培养物中的培养基。新鲜培养基是不含待引入到至少一种细胞中的一或多种大分子或化合物的培养基或尚未与细胞接触以支持其生长培育的培养基。熟练的业内人士可通过利用所属领域中已知的技术(如细胞计数(手动或自动)、台盼蓝拒染(trypan blue exclusion)、产生蛋白质或其它物质、阿尔玛蓝分析(alamar blue assay)、一或多种代谢产物的存在或浓度、细胞粘附、形态外观、废培养基的分析等)监测细胞生长和/或存活率来判定去除和/或补给、更换或补充培养基是否有优点或有此需要。监测技术中的一者或组合可用于判定是否需要培养基来支持生长、引入至少一种大分子和/或在引入至少一种大分子之后进行培育。

“重组蛋白”是指由引入到宿主细胞中的核酸编码的蛋白质。所述宿主细胞表达所述核酸。术语“表达核酸”与“从由核酸编码的RNA表达蛋白质”同义。如本文中所用的“蛋白质”广泛地是指聚合氨基酸，例如肽、多肽、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白等。

术语“蛋白质产量”是指由培养的细胞表达的蛋白质的量，且可例如根据每毫升培养基所产生的蛋白质克数来测量。如果蛋白质不由细胞分泌，那么蛋白质可通过所属领域的技术人员已知的方法从细胞内部分离。如果蛋白质由细胞分泌，那么蛋白质可通过所属领域的技术人员已知的方法从培养基中分离。由细胞表达的蛋白质的量可易于由所属领域的技术人员测定。蛋白质可为重组蛋白。

“蛋白质产物”是与通过蛋白质产生或通过蛋白质起的作用有关的产物。蛋白质产物可为蛋白质。蛋白质产物还可为由会产生产物的通过一或多种其它物质的蛋白质的作用引起的产物。所述作用的一个实例是通过蛋白质的酶促作用。

“悬浮培养物”意指培养容器中大部分或所有细胞以悬浮形式存在、且培养容器中少数或没有细胞附着于容器表面或容器内的另一个表面的细胞培养物。优选地，“悬浮培养物”在培养容器中具有大于75％的细胞呈悬浮形式，不附着于培养容器之上或之中的表面。更优选地，“悬浮培养物”在培养容器中具有大于85％的细胞呈悬浮形式，不附着于培养容器之上或之中的表面。甚至更优选的是“悬浮培养物”在培养容器中具有大于95％的细胞呈悬浮形式，不附着于培养容器之上或之中的表面。

本发明的培养基、方法、试剂盒和组合物适于细胞的单层或悬浮培养、转染和培育，且适于蛋白质在单层或悬浮培养的细胞中表达。优选地，本发明的培养基、方法、试剂盒和组合物用于细胞的悬浮培养、转染和培育，且用于蛋白质产物在悬浮培养的细胞中表达。

“培养容器”意指可向培养细胞提供无菌环境的任何容器，例如玻璃、塑料或金属容器。

短语“细胞培养基”、“组织培养基”、“培养基”(在每一种情况下复数“培养基”)和“培养基调配物”是指用于培育细胞或组织的营养性溶液。这些短语可互换使用。

术语“组合”是指成分的混合或掺合。

分子的衍生物包括包含基础分子但具有其它或经修饰侧基的一些化合物。优选地，“衍生物”可通过使基础分子与仅1个但可能是2、3、4、5、6个等反应物分子反应而形成。单步骤反应是优选的，但多步骤，例如2、3、4、5、6步等反应在所属领域中已知形成衍生物。取代、缩合和水解反应是优选的且可组合以形成衍生化合物。或者，衍生化合物可为优选地在1个中但可能是2、3、4、5、6个等反应中可形成基础化合物或其取代或缩合产物的化合物。

细胞培养基由多种成分组成且这些成分在培养基间可有所不同。用于细胞培养基的每一成分具有其独特的物理和化学特征。成分的相容性和稳定性部分地由成分在水溶液中的“可溶性”确定。术语“可溶性”和“可溶”是指成分与其它成分形成且保持溶解状态的能力。成分由此在其可维持溶解状态而不形成可测量或可检测沉淀时是相容的。

“相容成分”还意指可一起维持在溶液中且形成“稳定”组合的那些培养基组分。含有“相容成分”的溶液在成分不实质上沉淀、降解或分解使得可用于来自培养基的细胞的一或多种组分的浓度降低到不再支持细胞最优或所需生长的水平时被称为是“稳定的”。成分在降解无法检测时或当降解在与1×细胞培养基调配物中相同成分的分解相比时以较慢速率发生时也被视为是“稳定的”。举例来说，在1×培养基调配物中，已知谷氨酰胺降解成吡咯烷酮羧酸和氨。谷氨酰胺与二价阳离子的组合由于随时间推移在存在谷氨酰胺和二价阳离子两者的溶液或组合中可检测到极少或无谷氨酰胺分解而被视为是“相容成分”。参见美国专利第5,474,931号。因此，如本文中所用的术语“相容成分”是指在作为浓缩的或1×调配物混合于溶液中时是“稳定”且“可溶”的具体培养基成分的组合。

术语“1×调配物”意欲指含有以工作浓度见于细胞培养基中的一些或所有成分的任何水溶液。“1×调配物”可以指例如细胞培养基或所述培养基成分的任何子组。1×溶液中成分的浓度与用于体外维持或培育细胞的细胞培养调配物中可见的所述成分的浓度大致相同。用于体外培育细胞的细胞培养基是根据定义的1×调配物。当存在多种成分时，1×调配物中的每一成分的浓度约等于在细胞培养期间培养基中每一对应成分的浓度。举例来说，RPMI-1640培养基除了其它成分之外含有0.2g/L L-精氨酸、0.05g/L L-天冬酰胺和0.02g/L L-天冬氨酸。这些氨基酸的“1×调配物”在溶液中含有大致相同浓度的这些成分。因此，当提及“1×调配物”时，预期溶液中的每一成分具有与所述细胞培养基中可见的浓度相同或大致相同的浓度。所属领域的技术人员熟知细胞培养基的1×调配物中的成分浓度。参见例如，用于无血清动物细胞培养的培养基、补充剂和底物的制备方法艾伦R.利斯(Allen R.Liss),N.Y.(1984)，微生物培养基手册(Handbook of MicrobiologicalMedia),第二版,罗纳德M.阿特拉斯(Ronald M.Atlas)编劳伦斯C.帕克斯(Lawrence C.Parks)(1997)佛罗里达州波卡拉顿的CRC出版社(CRC Press,Boca Raton,Fla.)，和植物培养基(Plant CultureMedia),第1卷:调配和使用(Formulations and Uses)E.F.乔治(E.F.George),D.J.M.帕陶克(D.J.M.Puttock)和H.J.乔治(H.J.George)(1987)英格兰BA134QG威尔特郡韦斯特伯里埃丁顿的解经公司(Exegetics Ltd.Edington,Westbury,Wilts,BA134QGEngland)，所述文献中的每一者以全文引用的方式并入本文中。然而，与培养基相比，1×调配物中的渗透压摩尔浓度和/或pH可不同，尤其当1×调配物中含有更少成分时。

“10×调配物”意欲指一种溶液，其中所述溶液中每一成分的浓度与在细胞培养期间培养基中每一对应成分的浓度相比多到约10倍。举例来说，RPMI-1640培养基的10×调配物除了其它成分之外可含有2.0g/L L-精氨酸、0.5g/L L-天冬酰胺和0.2g/L L-天冬氨酸(比较1×调配物，上文)。“10×调配物”可含有浓度是1×培养调配物中所见约10倍的多种其它成分。如将易于清楚，“25×调配物”、“50×调配物”、“100×调配物”、“500×调配物”和“1000×调配物”分别表示如与1×细胞培养调配物相比含有约25、50、100、500或1000倍浓度的成分的溶液。此外，培养基调配物和浓缩溶液的渗透压摩尔浓度和pH可以变化。

术语“微量元素”或“微量元素部分”是指相对于培养基中存在的其它部分或组分的量或浓度仅以极低(即“微量”)的量或浓度存在于细胞培养基中的部分。在本发明中，这些术语涵盖Ag⁺、Al³⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu¹⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ge⁴⁺、Se⁴⁺、Br^-、I^-、Mn²⁺、F^-、Si⁴⁺、V⁵⁺、Mo⁶⁺、Ni²⁺、Rb⁺、Sn²⁺和Zr⁴⁺和其盐。举例来说，以下盐可用作本发明培养基中的微量元素：AgNO₃、AlCl₃·6H₂O、Ba(C₂H₃O₂)₂、CdSO₄·8H₂O、CoCl₂·6H₂O、Cr₂(SO₄)₃·1H₂O、GeO₂、Na₂SeO₃、H₂SeO₃、KBr、KI、MnCl₂·4H₂O、NaF、Na₂SiO₃·9H₂O、NaVO₃、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、NiSO₄·6H₂O、RbCl、SnCl₂和ZrOCl₂·8H₂O。微量元素部分的适合浓度可由所属领域的技术人员仅使用常规实验确定。

术语“氨基酸”是指氨基酸或其衍生物(例如氨基酸类似物)以及其D和L形式。所述氨基酸的实例包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸、N-乙酰基半胱氨酸。

“化学成分确定的”培养基是其中每一化学物质和其对应的量在其用于培养细胞之前是已知的培养基。化学成分确定的培养基在没有化学物质未知和/或未经定量的溶解产物或水解产物的情况下制得。化学成分确定的培养基是本发明培养基的一个优选实施例。

术语“无血清培养条件”和“无血清条件”是指排除任何类型血清的细胞培养条件。这些术语可互换使用。

“无血清培养基”(有时被称为“SFM培养基”)是不含血清(例如胎牛血清(FBS)、小牛血清、马血清、山羊血清、人类血清等)的培养基且一般通过字母SFM表示。熟练的业内人士熟悉的示例性但非限制性无血清培养基包括HuMEC基础无血清培养基、KNOCKOUT^TM CTS^TM无外来物ESC/iPSC培养基、STEMPRO^TM-34SFM培养基、STEMPRO^TM NSC培养基、ESSENTIAL^TM-8培养基、培养基254、培养基106、培养基131、培养基154、培养基171、培养基171、培养基200、培养基231、HeptoZYME-SFM、人类内皮-SFM、FREESTYLE^TM 293表达培养基、培养基154CF/PRF、培养基154C、培养基154CF、培养基106、培养基200PRF、培养基131、Essential^TM-6培养基、STEMPRO^TM-34培养基、星形胶质细胞培养基、AIM培养基CTS^TM、AMINOMAX^TM C-100基础培养基、AMINOMAX^TM-II完全培养基、CD FORTICHO^TM培养基、CDCHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLE^TMCHO表达培养基、CD OPTICHO^TM培养基、CD CHO培养基、CDDG44培养基、SF-900^TM培养基、EXPI293^TM表达培养基、LHC基础培养基、LHC-8培养基、293SFM培养基、CD 293培养基、AEM生长培养基、PER.细胞培养基、AIM培养基、培养基、角质细胞-SFM培养基、LHC培养基、LHC-8培养基、LHC-9培养基和其任何衍生物或修改型。

短语“无蛋白质”培养基是指不含蛋白质(例如无血清蛋白(如血清白蛋白或连接因子)、营养蛋白(如生长因子)或金属离子载体蛋白(如转铁蛋白、铜蓝蛋白)等)的培养基。优选地，如果存在肽，那么肽是较小肽，例如二肽或三肽。优选地，长度为十肽或更长的肽是存在于无蛋白质培养基中的氨基酸的不到约1％、更优选地不到约0.1％、且甚至更优选地不到约0.01％。

如本文中所用的短语“低蛋白质”培养基是指仅含有低量蛋白质(通常是含有标准量蛋白质的培养基(如补充有5％-10％血清的标准基础培养基)中可见的总蛋白质的量或浓度的不到约10％、不到约5％、不到约1％、不到约0.5％、或不到约0.1％)的培养基。

如本文中所用的术语“动物来源的”物质是指完全或部分来源于动物来源的物质，包括重组动物DNA或重组动物蛋白质DNA。优选的培养基不含有动物所需物质。

术语“表达增强剂”一般是指用于补充根据目前所述实施例的培养基调配物的一或多种液体(优选地水性)添加剂，所述添加剂经选择以改进在根据目前所述实施例的瞬时蛋白质表达系统中产生的所表达蛋白质的产量。所述术语涵盖了影响细胞周期进程、抑制细胞凋亡、减缓细胞生长和/或促进蛋白质产生的数种化合物中的任一或多者。在本发明的情形下，术语“表达增强剂”一般是指加入到瞬时转染系统中的任一或多种化合物，所述一或多种化合物的存在增强或促进目标蛋白的表达高于在不存在所述表达增强剂下可见的表达水平至少2倍到约10倍。适合与目前所述实施例一起使用的示例性表达增强剂包括(但不限于)添加剂，如丙戊酸(VPA，酸和钠盐)、丙酸钠、乙酸锂、二甲亚砜(DMASO)、包括半乳糖的糖、氨基酸混合物、或丁酸或上述的任何组合。每一特定表达增强剂的最佳浓度可根据表达系统的个别特征和使用者的需求变化，且对在给定实验情境中构成任一或多种表达增强剂的最佳浓度的要素的测定充分处于在所属领域中具有普通技能水平的从业者的范围内。仅举例来说，在一些实施例中，本发明的实践中所用的丙戊酸(VPA)的最佳最终浓度范围可能在约0.20mM到约25mM范围内。更优选地，VPA的最终浓度可能在以下范围内：约0.25mM到约24mM、约0.26mM到约23mM、0.27mM到约23mM、0.28mM到约23mM、0.29mM到约22mM、约0.30mM到约21mM、约0.31mM到约20mM、约0.32mM到约19mM、约0.33mM到约17mM、约0.34mM到约18mM、约0.35mM到约17mM、约0.36mM到约16mM、约0.37mM到约15mM、约0.40mM到约14mM、约0.41mM到约13mM、约0.42mM到约12mM、约0.43mM到约11mM、约0.44mM到约10mM、约0.45mM到约9mM、约0.46mM到约8mM、约0.47mM到约7mM、约0.48mM到约6mM、约0.49mM到约5mM、约0.50mM到约4mM、约0.50mM到约4mM、约0.55mM到约3mM、0.6mM到约2mM或0.75到约1.5mM。在一些优选但非限制性的实施例中，本发明的实践中所用的VPA的最终浓度可能在约0.15mM到约1.5mM之间、在约0.16mM到约1.5mM之间、在约0.17mM到约1.5mM之间、在约0.18mM到约1.5mM之间、在约0.19mM到约1.5mM之间、在约0.20mM到约1.5mM之间、在约0.25mM到约1.5mM之间、在约0.30mM到约1.5mM之间、在约0.40mM到约1.5mM之间、在约0.50mM到约1.5mM之间、在约0.60mM到约1.5mM之间、在约0.70mM到约1.5mM之间、在约0.80mM到约1.5mM之间、在约0.90mM到约1.5mM之间或在约0.10mM到约1.5mM之间。在一些优选但非限制性的实施例中，本发明的实践中所用的VPA的最终浓度可能在约约0.20到约1.5mM之间、在约0.21到约1.4mM之间、在约0.22到约1.4mM之间、在约0.23到约1.4mM之间、在约0.24到约1.4mM之间、在约0.25到约1.3mM之间、在约0.25到约1.2mM之间、在约0.25到约1.1mM之间或在约0.25到约1.0mM之间。

在其它实施例中，本发明的实践中所用的丙酸钠(NaPP)的最佳最终浓度可能在约0.2mM到约100mM范围内。在某些优选但非限制性的实施例中，NAPP的最佳最终浓度可能在以下范围内：约0.5到约80mM、约0.4mM到约70mM、约0.5mM到约60mM、约0.6mM到约50mM、约0.7mM到约40mM、约0.8mM到约30mM、约0.9mM到约20mM、约1mM到约15mM、约2mM到约10mM、约3mM到约9mM、约4mM到约8mM或约5mM到约7mM。在某些优选但非限制性的实施例中，NAPP的最佳最终浓度可能在以下范围内：约1mM到约10mM、约1mM到约2mM、约2mM到约3mM、约3mM到约4mM、约4mM到约5mM、约5mM到约6mM、约6mM到约7mM、约7mM到约8mM、约8mM到约9mM或约9mM到约10mM。在某些优选但非限制性的实施例中，NAPP的最佳最终浓度可能是约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM、约5mM、约5.5mM、约6mM、约6.5mM、约7mM、约7.5mM、约8mM、约8.5mM、约9mM、约9.5mM或约10mM。

在其它实施例中，本发明的实践中所用的乙酸锂(LiAc)的最佳最终浓度可能在以下范围内：约0.25到约25mM、约0.26mM到约20mM、约0.27mM到约15mM、约0.28mM到约10mM、约0.29mM到约5mM、约0.3mM到约4.5mM、约0.31mM到约4mM、约0.35mM到约3mM、约0.5mM到约2.5mM、约1mM到约3mM、约1.5mM到约2.5mM或约2mM到约3mM。

在其它实施例中，本发明的实践中所用的丁酸的最佳最终浓度可能在以下范围内：约0.25到约25mM、约0.26mM到约20mM、约0.27mM到约15mM、约0.28mM到约10mM、约0.29mM到约5mM、约0.3mM到约4.5mM、约0.31mM到约4mM、约0.35mM到约3mM、约0.5mM到约2.5mM、约1mM到约3mM、约1.5mM到约2.5mM或约2mM到约3mM。

根据本发明使用的表达增强剂可在即将转染之前或在转染之后在收获细胞和所表达的蛋白质之前加入到培养基中。在下文描述的一些特定但非限制性实施例中，“增强剂1”一般是指0.25mM-1mM丙戊酸，且“增强剂2”一般是指5mM-7mM丙酸钠。然而，如果另外指示，那么术语增强剂1和增强剂2可涵盖不同增强剂化合物。表达增强剂可依序或以混合物形式加入到培养基中。

如本文中所用的术语“载体”打算指能够运输其已连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可接合其它DNA区段的环状双链DNA。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它DNA区段可接合到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)当引入到宿主细胞中时可整合到宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地说是“表达载体”)。一般来说，用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以可互换地使用，这是由于质粒是最常用的载体形式。根据本文中所述的本发明实践使用的某些载体可为在所属领域中所用的熟知载体，如pCDNA 3.3或其修饰型。可适于本发明实践的载体修饰类型的非限制性实例包括(但不限于)修饰，如加入一或多种增强子、一或多种启动子、一或多种核糖体结合位点、一或多种复制起点等的修饰。在某些优选但非限制性的实施例中，且本发明的实践中所用的表达载体可包括一或多种经选择以改进所关注蛋白质在本发明瞬时表达系统中的表达的增强子元件。所选增强子元件可位于用于表达所关注蛋白质的可表达的核酸序列的5'或3'。尤其优选但非限制性的增强子元件是土拔鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)。

如本文中所用，短语“含有能够产生所表达蛋白质的基因序列的表达载体”通常是指如上所定义的载体，其除了一或多种支持其在细胞或无细胞表达系统中表达所需的核酸序列或元件之外还能够容纳具有所需所关注蛋白质的至少一个开放阅读框架的可表达的核酸序列。可存在于如本文中所定义的表达载体中的所述其它核酸序列或元件可包括一或多种启动子序列、一或多种增强子元件、一或多种核糖体结合位点、一或多种翻译起始序列、一或多种复制起点或一或多种可选择标记物。服务这一目的的多种核酸序列或元件为熟练的业内人士所熟悉，且选择其中一或多种用于本发明的实践充分处于熟练的从业者的范围内。

如本文中所用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何核酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在优选实施例中，“核酸”是指DNA(包括基因组DNA、互补DNA(cDNA))和寡核苷酸(包括寡DNA)。在某些优选但非限制性的实施例中，“核酸”是指基因组DNA和/或cDNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰核苷酸或碱基和/或其类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入到聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和其类似物。如果存在，那么可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可间杂有非核苷酸组分。多核苷酸可包含在合成之后进行的修饰，如与标签结合。其它类型的修饰包括例如“盖”；一或多个天然存在的核苷酸经类似物取代；核苷酸修饰，如具有不带电键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有侧接部分、如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰，含有烷基化剂的修饰，具有经修饰的键(例如α异头核酸等)的修饰，以及多核苷酸的未经修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基可例如被膦酸酯基、磷酸酯基替代，被标准保护基保护，或活化以制备与额外核苷酸的额外键联，或可结合于固体或半固体支撑物。5'和3'末端OH可为经磷酸化或经1到20个碳原子的胺或有机封端基团部分而取代。其它羟基也可衍生成标准保护基。多核苷酸还可含有所属领域中通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟基-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖、非环状类似物和碱基核苷类似物(例如甲基核糖苷)。一或多个磷酸二酯键可被替代性连接基团替代。这些替代性连接基团包括(但不限于)其中磷酸酯基被P(O)S(“硫代酸酯基”)、P(S)S(“二硫代酸酯基”)、(O)NR₂(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)替代的实施例，其中每个R或R'独立地是H或任选地含有醚(--O--)键的经取代或未经取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基、或芳烷基。多核苷酸中所有的键不需要都一致。前面描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

如本文中所用的“寡核苷酸”通常是指短的、通常是单链的、通常是合成多核苷酸，其通常(但不必)长度不到约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非相互排斥。以上关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。

如本文中所用，短语“第一时间段”当用于根据本文中所述的本发明方法瞬时转染细胞的方法的情形时通常是指在细胞群体经可表达的核酸转染与一或多种表达增强剂加入到经转染的细胞中之间的时间间隔。第一时间段通常将在约2小时到约4天范围内。在某些优选但非限制性的实施例中，第一时间段可能在以下范围内：约3到约90小时、约4到约85小时、约5到约80小时、约6到约75小时、约7到约70小时、约8到约65小时、约9到约60小时、约10到约55小时、约11到约50小时、约12到约45小时、约13到约40小时、约14到约35小时、约15到30小时、约16到约24小时、约17到约24小时、约18到约24小时、约19到约24小时、约20到约24小时、约21到约24小时、约22到约24小时或约23到约24小时。在其它优选非限制性实施例中，第一时间段可能高达约15小时、高达约16小时、高达约17小时、高达约18小时、高达约19小时、高达约20小时、高达约21小时、高达约22小时、高达约23小时、高达约24小时、高达约25小时、高达约26小时、高达约27小时、高达约28小时、高达约29小时或高达约30小时。

如本文中所用，短语“第二时间段”当用于根据本文中所述的本发明方法瞬时转染细胞的方法的情形时通常是指在加入一或多种表达增强剂与或者加入一或多种其它增强剂或者收获经转染的细胞并对其中表达的蛋白质进行纯化或分离之间的时间间隔。第二时间段通常将在约10小时到约10天范围内，但其它时间间隔在确定对于所表达蛋白质最佳时可以使用。在一些优选但非限制性的实施例中，第二时间段可能在以下范围内：2小时到5天、2.5小时到4天、约3到约90小时、约4到约85小时、约5到约80小时、约6到约75小时、约7到约70小时、约8到约65小时、约9到约60小时、约10到约55小时、约11到约50小时、约12到约45小时、约13到约40小时、约14到约35小时、约15到30小时、约16到约24小时、约17到约24小时、约18到约24小时、约19到约24小时、约20到约24小时、约21到约24小时、约22到约24小时或约23到约24小时。在其它优选非限制性实施例中，第一时间段可能高达约15小时、高达约16小时、高达约17小时、高达约18小时、高达约19小时、高达约20小时、高达约21小时、高达约22小时、高达约23小时、高达约24小时、高达约25小时、高达约26小时、高达约27小时、高达约28小时、高达约29小时或高达约30小时。

如本文中所用，短语“第三时间段”当用于根据本文中所述的本发明方法瞬时转染细胞的方法的情形时通常是指在加入至少一种第一表达增强剂与至少一种第二表达增强剂之间的时间间隔。在加入第一与第二表达增强剂之间的时间间隔可为约数秒到数天，但在一些实施例中，所述第一和第二表达增强剂可基本上同步加入，或可任选地以单一调配物形式提供。

如本文中所用，术语“复合反应”、“复合培养基”等通常是指其中核酸与转染试剂调配物复合的生理上可接受的培养基或反应。通常，被引入到细胞中以便表达蛋白质的核酸首先与适合的转染试剂(如阳离子脂质调配物)复合成脂质/核酸复合物或聚集体。

“过渡元素”或“过渡金属”(其可互换使用)意指内部电子价壳层而非外部壳层仅经部分填充的元素，使得所述元素充当给定系列元素中最多与最少正电性之间的过渡连接。过渡元素的特征通常在于高熔点、高密度、高偶极或磁力矩、多价以及能够形成稳定络合离子。适用于本发明的所述过渡元素的实例包括钪(Sc)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、钇(Y)、锆(Zr)、铌(Nb)、钼(Mo)、锝(Tc)、铷(Ru)、铑(Rh)、钯(Pd)、银(Ag)、镉(Cd)、镧(La)、铪(Hf)、钽(Ta)、钨(W)、铼(Re)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、金(Au)、汞(Hg)以及锕(Ac)。特别令人感兴趣的是用于培养基组合物的过渡元素(包括本发明的那些)是铁的离子、螯合物、盐以及络合物(Fe²⁺或Fe³⁺)。

多种技术和试剂可用于将大分子在称为“转染”的过程中引入到目标细胞中。常用试剂包括例如磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及脂质。关于使用这些类型试剂的详细方案的实例，许多参考文献文本可用于实例，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology),第9章,奥斯贝(Ausubel)等人编,约翰威利父子公司(John Wiley andSons),1998。转染细胞的其它方法在所属领域中是已知，且可包括电穿孔(基因电转移)、声孔作用、光学转染、原生质体融合、刺穿感染(impalefection)、磁性转染或病毒转导。

“用于将大分子引入到细胞中的试剂”或“转染试剂”是所属领域的技术人员已知有助于大分子进入到细胞中的任何物质、调配物或组合物。举例来说，参见美国专利第5,279,833号。在一些实施例中，试剂可为“转染试剂”且可为增加一或多种核酸摄取到一或多种目标细胞中的任何化合物和/或组合物。所属领域的技术人员已知多种转染试剂。适合的转染试剂可包括(但不限于)一或多种化合物和/或组合物，其包含阳离子聚合物(如聚乙二亚胺(PEI))、带正电荷氨基酸的聚合物(如聚赖氨酸和聚精氨酸)、带正电荷树枝状聚合物和断裂的树枝状聚合物、含有阳离子β-环糊精的聚合物(CD-聚合物)、DEAE-葡聚糖等。在一些实施例中，用于将大分子引入到细胞中的试剂可包含一或多种可为阳离子脂质和/或中性脂质的脂质。优选的脂质包括(但不限于)氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲铵(DOTMA)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPE)、1,2-双(油酰基氧基)-3-(4'-三甲铵基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-(4'-三甲铵基)丁酰基-sn-甘油(DOTB)、1,2-二油酰基-3-琥珀酰基-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、(4'-三甲铵基)丁酸胆固醇酯(ChoTB)、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、溴化1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙铵(DORI)、溴化1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙铵(DORIE)、溴化1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙铵(DMRIE)、氯化O,O'-双十二烷基-N-[对(2-三甲氨基乙氧基)苯甲酰基]-N,N,N-三甲铵、结合于一或多种脂质的精胺(例如5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺(DOGS)、N,N^I,N^II,N^III-四甲基-N,N^I,N^II,N^III-四棕榈基精胺(TM-TPS)和二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(DPPES))、脂聚赖氨酸(结合于DOPE的聚赖氨酸)、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷，氨基丁三醇)结合的脂肪酸(TFA)和/或肽，如三赖氨酰基-丙氨酰基-TRIS单-、二-和三-棕榈酸酯、(3β-[N--(N',N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、氯化N-(α-三甲氨基乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯(TMAG)、溴化二甲基双十八烷铵(DDAB)、三氟乙酸2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵(DOSPA)和其组合。

所属领域的技术人员将理解上述脂质的某些组合已展示出尤其适于将核酸引入到细胞中，例如DOSPA与DOPE的3:1(w/w)组合以商标名LIPOFECTAMINE^TM购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies Corporation,Carlsbad,Calif.)，DOTMA与DOPE的1:1(w/w)组合以商标名购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司，DMRIE与胆固醇的1:1(M/M)组合以商标名DMRIE-C试剂购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司，TM-TPS与DOPE的1:1.5(M/M)组合以商标名购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司，且DDAB与DOPE的1:2.5(w/w)组合以商标名购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司。除了上述脂质组合之外，包含脂质与其它化合物的掺合物、具体来说与包含核定位序列的肽和蛋白质的掺合物的其它调配物是所属领域的技术人员已知的。举例来说，参见国际申请第PCT/US99/26825号，作为WO 00/27795公开，其两者都以引用的方式并入本文中。

已发现脂质聚集体(如脂质体)适用作将大分子传递到细胞中的试剂。具体来说，已证实包含一或多种阳离子脂质的脂质聚集体在将阴离子大分子(例如核酸)传递到细胞中时极其有效。一种常用阳离子脂质是氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲铵(DOTMA)。包含单独DOTMA或与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1混合物的脂质体已被用于将核酸引入到细胞中。DOTMA:DOPE的1:1混合物可以商标名LIPOFECTIN^TM购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司。已用于将核酸引入到细胞中的另一种阳离子脂质是1,2-双(油酰基氧基)-3-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)。DOTAP与DOTMA的不同之处在于油酰基部分在DOTAP中经由醚键键联到丙胺主链，而其在DOTMA中是经由酯键键联的。DOTAP被认为更易于被目标细胞降解。其中三甲铵部分的一个甲基经羟乙基替代的结构上相关的化合物组在结构上与磷脂酶A的罗森塔尔抑制剂(Rosenthalinhibitor，RI)类似(参见罗森塔尔等人,(1960)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)233:2202-2206)。RI具有键联到丙胺核心的硬脂酰基酯。RI的二油酰基类似物通常简称为DOR1-醚和DOR1-酯，取决于脂质部分与丙胺核心的键联。羟乙基部分的羟基可进一步例如通过酯化成羧基精胺来衍生。

已用于将大分子引入到细胞中的另一类化合物包含与脂质连接的羧基精胺部分(参见贝尔(Behr)等人,(1989)美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences,USA)86:6982-6986和EPO 0394111)。这类化合物的实例包括二软脂酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(DPPES)和5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺(DOGS)。DOGS可以商标名TRANSFECTAM^TM购自威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.)。

胆固醇的阳离子衍生物(3β-[N--(N',N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇，DC-Chol)已经合成且与DOPE一起调配到脂质体中(参见高(Gao)等人,(1991)BBRC 179(1):280-285)且用于将DNA引入到细胞中。由此调配的脂质体据报道有效地将DNA以低细胞毒性水平引入到细胞中。通过将聚赖氨酸结合于DOPE所形成的脂聚赖氨酸(参见周(Zhou)等人,(1991)BBA 1065:8-14)据报道在将核酸在血清存在下引入到细胞中时有效。

已用于将核酸引入到细胞中的其它类型的阳离子脂质包括高度填充聚阳离子铵、锍和鏻脂质，如美国专利第5,674,908号和第5,834,439号和国际申请第PCT/US99/26825号(作为WO 00/27795公开)中所述的那些。根据本发明一种尤其优选但非限制性的用于传递大分子的转染试剂是购自生命技术公司的LIPOFECTAMINE 2000^TM(参见美国国际申请第PCT/US99/26825号，作为WO 00/27795公开)。适于将大分子传递到细胞中的另一种优选但非限制性转染试剂是EXPIFECTAMINE^TM。其它适合的转染试剂包括LIOFECTAMINE^TMRNAiMAX、LIPOFECTAMINE^TM LTX、OLIGOFECTAMINE^TM、Cellfectin^TM、INVIVOFECTAMINE^TM、INVIVOFECTAMINE^TM 2.0以及杨(Yang)等人的美国专利申请公开第2012/0136073号中所公开的任何脂质试剂或调配物(所述公开以引用的方式并入本文中)。多种其它转染试剂是熟练的业内人士已知的且可针对其对于本文中所述的瞬时转染系统和方法的适合性进行评估。

本发明是针对一种高产量瞬时转染系统，其支持(a)将至少一种大分子(优选地是可表达的核酸分子)引入到培养物中的真核细胞中，(b)培育其中已引入至少一种大分子的细胞，以及任选地(c)在其中已引入至少一种大分子的细胞中产生重组蛋白产物或表达核酸，其中含有大分子的培养基并不需要在将至少一种大分子引入到细胞中之后以及在培育并产生蛋白质产物或表达核酸之前从培养物中移出并用新鲜培养基更换。

本发明的瞬时转染系统、其根据本文中所描述方法的使用引起所关注蛋白质在细胞培养系统中快速且可重现的高水平表达。通常，本发明瞬时转染系统和方法能够以在约200μg蛋白质/L培养物到约2g蛋白质/L培养物范围内的水平产生重组表达的蛋白质，取决于所需重组蛋白的个别表达特征和所用细胞类型。使用为本文提供的瞬时转染系统和方法，使用者可获得超过目前使用标准可商购的瞬时转染系统可获得水平约2倍到高达约20倍的所表达的蛋白质水平。使用为本文提供的瞬时转染系统和方法，使用者可获得与用当代瞬时表达系统可见水平相比约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍或高达约10倍或更大的所表达的蛋白质水平。举例来说，使用本发明瞬时转染系统来产生重组蛋白，使用者可获得比使用为在悬浮细胞中产生重组蛋白而优化的可商购的瞬时转染系统(如FREESTYLE^TM表达系统)获得的蛋白质产量高在约2倍到约10倍之间的蛋白质产量。

使用本发明的系统，所述系统除了其它要素之外包括至少一种高密度培养基、至少一种被调适用于高密度生长的悬浮细胞群体、任选地一或多种表达载体、任选地一或多种转染试剂以及任选地一或多种表达增强剂，在已将至少一种大分子引入到至少一种细胞中之后以及在其中已引入至少一种大分子的细胞被进一步培养以产生蛋白质产物或表达核酸之前不必补给、更换或补充培养基。在本发明的系统中，培养基理想地是无血清培养基和/或化学成分确定的培养基和/或无蛋白质或实质上低蛋白质培养基、和/或不含动物来源组分的培养基、或具有这些特征的组合的培养基。

在本发明的一个非限制性方面，就将化合物或大分子(例如核酸)引入到培养物中的细胞中来说，本发明的高产量培养基有助于与使用目前可用的瞬时转染系统通常可获得的细胞转染效率相比更高的细胞转染效率。在本发明的另一个相关但非限制性方面，系统还不需要以欲在转染之后培养细胞的较小体积转染细胞。在本发明的另一个相关但非限制性方面，系统与目前可用的瞬时转染系统相比有助于较高细胞存活率。在另一个相关但非限制性方面，系统与目前可用的瞬时转染系统相比有助于较高细胞密度(即每毫升培养基细胞数)。在本发明的另一个相关但非限制性方面，系统与目前可用的瞬时转染系统相比有助于培养物中细胞的较高重组蛋白表达水平。优选地但未必地，相同体积的培养基可用于将至少一种大分子引入到细胞中以及在不必更换、去除、补充或补给已发生细胞转染的培养基的情况下进行的后续培育。或者，将细胞分割或培养基体积增加不到约2倍、约5倍、约8倍或约10倍。

本发明的培养基、方法、试剂盒以及组合物打算用于引入至少一种大分子或在任何体积的培养基中转染并培养细胞。所述引入优选地以用于培养待转染细胞的培养基的量的0.1到10倍实现。优选地，细胞培养物体积大于约一毫升。更优选地，细胞培养物体积是约200μl到100升。更优选地，细胞培养物体积是约2ml到约50升，最优选地约5ml到约5升。更优选地，细胞培养物体积是约100ml到约50升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约50升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约25升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约10升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约5升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约1升。

在本发明的培养基、方法、试剂盒以及组合物中，培养基任选地不含可干扰大分子引入或转染的化合物，例如聚阴离子化合物，如聚磺酸化和/或聚硫酸化的化合物。优选地，培养基不含硫酸葡聚糖。

本发明的培养基、方法、试剂盒以及组合物允许在不需要更换培养基的情况下将化合物或大分子(尤其是大分子，例如核酸、蛋白质以及肽)引入到所培养的细胞中(例如通过转染进行)。在一个优选实施例中，本发明提供一种用于培育和转染真核细胞的培养基。

使用本发明的培养基、方法、试剂盒以及组合物，所属领域的技术人员可以将大分子或化合物(例如核酸)引入到培养物中的细胞中。优选地，大分子或化合物(例如核酸)被引入到至少约20％细胞中。更优选地，大分子或化合物(例如核酸)被引入到约20％到约100％细胞中。更优选地，大分子或化合物(例如核酸)被引入到约30％到约100％细胞中。更优选地，大分子或化合物(例如核酸)被引入到约50％到约100％细胞中。实际上，大分子或化合物可被引入到约20％到约90％细胞、约20％到约80％细胞、约30％到约60％、70％、80％或90％细胞、约20％、30％、40％或50％到约70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％细胞等中。甚至约60％、70％、75％或80％到约90％或接近100％的细胞可含有所引入的分子或化合物。

在本发明的培养基、方法、试剂盒以及组合物的优选实施例中，一或多种非所需组分(即，一或多种血清组分、一或多种成分不确定的组分、一或多种蛋白质组分和/或一或多种动物来源的组分)已经一或多种替代化合物在一或多种功能方面取代或替代。本发明的替代化合物可任选地包括一或多种结合金属的化合物和/或一或多种过渡元素络合物，所述络合物包含与一或多种结合金属的化合物络合的一或多种过渡元素或其盐或离子。优选地，培养基能够在不存在一或多种天然来源金属载体(如转铁蛋白或其它动物来源蛋白质或提取物)的情况下支持细胞体外培育。结合金属的化合物可在将结合金属的化合物加入到培养基中之前与过渡金属络合。在其它实施例中，结合金属的化合物在将结合金属的化合物加入到培养基中之前不与过渡金属络合。优选地，本发明的培养基不含转铁蛋白和/或不含胰岛素。

本发明还涉及通过将培养基与一或多种替代化合物组合而获得的细胞培养基。优选地，培养基可为无血清培养基和/或化学成分确定的培养基和/或无蛋白质或低蛋白质培养基和/或可为缺乏动物来源组分的培养基。培养基优选地不含转铁蛋白和/或不含胰岛素。在一些优选实施例中，培养基可能够支持细胞体外培育和/或可允许将大分子引入到细胞中。在一些实施例中，一或多种替代化合物可为结合金属的化合物和/或可为过渡元素络合物，所述络合物包含与至少一种结合金属的化合物络合的至少一种过渡元素或其盐或离子。优选的用于本发明这一方面的过渡元素、结合金属的化合物以及过渡元素络合物包括本文中详细地描述的那些。

本发明的替代化合物可有助于过渡金属传递到体外培养的细胞中。在优选实施例中，替代化合物可传递铁并替代转铁蛋白。优选的替代化合物是羟基吡啶衍生物。优选地，羟基吡啶衍生物选自由以下各项组成的群组：2-羟基吡啶-N-氧化物、3-羟基-4-吡喃酮、3-羟基哌吡啶-2-酮、3-羟基吡啶-2-酮、3-羟基吡啶-4-酮、1-羟基吡啶-2-酮、1,2-二甲基-3-羟基吡啶-4-酮、1-甲基-3-羟基吡啶-2-酮、3-羟基-2(1H)-吡啶酮、和吡哆醛异烟碱基腙、烟碱酸-N-氧化物、2-羟基-烟碱酸。最优选地，羟基吡啶衍生物是2-羟基吡啶-N-氧化物。

本发明的替代化合物可与任何培养基一起使用，包括用于培育或生长真核和/或原核细胞、组织、器官等的培养基。所述培养基包括(但不限于)CD FORTICHO^TM培养基、Expi293^TM表达培养基、杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、最小必需培养基(MEM)、基础培养基伊格尔(Basal MediumEagle，BME)、RPMI-1640、汉姆氏F-10(Ham's F-10)、汉姆氏F-12、α最小必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最小必需培养基(Glasgow's Minimal Essential Medium，G-MEM)和伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)。可商购的(例如来自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)或所属领域中另外已知的其它培养基可根据本发明等效地使用，包括(但不限于)293SFM、CD-CHO培养基、VP SFM、BGJb培养基、布林斯特氏BMOC-3培养基(Brinster's BMOC-3medium)、细胞培养冷冻培养基、CMRL培养基、EHAA培养基、eRDF培养基、费舍尔氏培养基(Fischer's medium)、冈堡氏B-5培养基(Gamborg'sB-5medium)、GLUTAMAX^TM补充培养基、格雷斯氏昆虫细胞培养基(Grace's insect cell media)、HEPES缓冲培养基、里克特氏改良MEM(Richter's modified MEM)、IPL-41昆虫细胞培养基、莱博维茨氏L-15培养基(Leibovitz's L-15media)、麦考伊氏5A培养基(McCoy's 5A media)、MCDB 131培养基、培养基199、改良伊格尔培养基(Modified Eagle's Medium，MEM)、培养基NCTC-109、施奈德氏果蝇培养基(Schneider's Drosophila medium)、TC-100昆虫培养基、威茅斯氏MB 752/1培养基(Waymouth's MB 752/1media)、威廉氏培养基E(William's Media E)、无蛋白质杂交瘤培养基II(PFHM II)、AIM V培养基、角质细胞SFM、成分确定的角质细胞SFM、SFM、完全甲基纤维素培养基、HepatoZYME-SFM、Neurobasal^TM培养基、神经基质-A培养基、Hibernate.TM.A培养基、Hibernate E培养基、内皮SFM、人类内皮SFM、杂交瘤SFM、PFHM II、Sf 900培养基、Sf 900TI SFM、EXPRESS培养基、CHO-S-SFM、AMINOMAX-II完全培养基、AMINOMAX-C100完全培养基、AMINOMAX-C 100基础培养基、PB-MAX^TM核型分析培养基、KARYOMAX骨髓核型分析培养基、KNOCKOUT D-MEM和CO₂非依赖性培养基。以上培养基从所属领域的技术人员已知的制造商获得，如JRH、西格玛公司(Sigma)、海克隆公司(HyClone)和拜奥惠特克公司(BioWhittaker)。适用于本发明的实践的培养基的其它实例可见于美国专利第5,135,866号和第5,232,848号以及国际公开第WO 88/02774号、第WO 98/15614号、第WO 98/08934号和欧洲专利第0282942号，所述专利的全文特别地以引用的方式并入本文中。

本发明还提供了一种用于将大分子引入到细胞中的方法，其包含在本发明的培养基中培养细胞且使培养基中的细胞与一或多种大分子在使得大分子被一或多种细胞吸收的条件下接触。优选地，培养基是无血清培养基和/或化学成分确定的培养基和/或无蛋白质或低蛋白质培养基和/或可为缺乏动物来源组分的培养基。优选的细胞包括真核细胞。更优选地，细胞是哺乳动物细胞。培养基可包含一或多种替代化合物且优选地不含转铁蛋白和/或不含胰岛素。在一些优选实施例中，培养基允许细胞在相同培养基中生长和转染。在一些实施例中，大分子可包含一或多种核酸，且使得核酸分子被细胞吸收的条件包括使核酸与会引起核酸被引入到一或多种细胞中的试剂接触。

本发明还提供了一种包含本发明的培养基和细胞的组合物。优选地，培养基是无血清培养基和/或化学成分确定的培养基和/或无蛋白质或低蛋白质培养基和/或缺乏动物来源组分的培养基。优选的细胞包括真核细胞。更优选地，细胞是哺乳动物细胞。最优选的是来源于293成纤维细胞的悬浮细胞。培养基可包含一或多种替代化合物且优选地不含转铁蛋白和/或不含胰岛素。优选地，培养基支持细胞在相同培养基中生长和转染，更优选地，培养基支持表达重组蛋白的哺乳动物细胞的生长和培育，其中所述培养基并不必在出于产生重组蛋白的目的引入其中可表达的核酸之后进行补给、更换或另外补充。

本发明还提供了包含本发明的培养基和一或多种用于将大分子引入到一或多种细胞中的试剂的组合物。优选地，培养基是无血清培养基和/或化学成分确定的培养基和/或无蛋白质或低蛋白质培养基和/或缺乏动物来源组分的培养基。培养基可包含一或多种替代化合物且优选地不含转铁蛋白和/或不含胰岛素。优选地，培养基含有转染试剂且大分子是核酸。大分子还可为蛋白质和/或肽。在一些实施例中，试剂包含一或多种脂质，其中一或多种可为阳离子脂质。更优选地，试剂包含中性和阳离子脂质的混合物。在一些实施例中，试剂包含一或多种肽和/或蛋白质，其可单独或与一或多种脂质掺合提供。

本发明还提供了包含本发明的培养基和待引入到细胞中的一或多种大分子的组合物。优选地，培养基是无血清培养基和/或化学成分确定的培养基和/或无蛋白质或低蛋白质培养基和/或缺乏动物来源组分的培养基。培养基可包含一或多种替代化合物且优选地不含转铁蛋白和/或不含胰岛素。大分子可为例如核酸和/或蛋白质和/或肽，且可为非复合的或可呈与一或多种用于将大分子引入到细胞中的试剂的复合物的形式。优选地，大分子是核酸且可呈与一或多种转染试剂的复合物形式。

本发明还提供了一种组合物，其包含至少一种选自由以下各项组成的群组的组分(或其组合)：本发明的培养基、至少一种细胞、至少一种大分子、至少一种用于将至少一种大分子引入到至少一种细胞中的试剂。优选地，细胞是真核细胞。更优选地，细胞是哺乳动物细胞。优选地，培养基是无血清培养基和/或化学成分确定的培养基和/或无蛋白质或低蛋白质培养基和/或缺乏动物来源组分的培养基。培养基可包含一或多种替代化合物且优选地不含转铁蛋白和/或不含胰岛素。在一些优选实施例中，试剂是转染试剂且大分子是核酸，例如RNA和/或DNA。或者，大分子是蛋白质和/或肽。

在一些实施例中，试剂包含一或多种脂质，其中一或多种可为阳离子脂质。更优选地，试剂包含中性和阳离子脂质的混合物。在一些实施例中，试剂包含一或多种肽和/或蛋白质，其可单独或与一或多种脂质掺合提供。在优选实施例中，试剂与大分子复合以将大分子引入到细胞中。

本发明还提供了用于培养和转染细胞的试剂盒，其包含至少一个包含用于培养和转染细胞的培养基的容器。所述试剂盒还可包含至少一种选自由以下各项组成的群组的组分(或其组合)：本发明的培养基、至少一种细胞、至少一种大分子、至少一种用于将至少一种大分子引入到至少一种细胞中的试剂、至少一种缓冲液或缓冲盐、以及关于使用试剂盒来将至少一种大分子引入到至少一种细胞中的说明书。优选地，培养基是无血清培养基和/或化学成分确定的培养基和/或无蛋白质或低蛋白质培养基和/或缺乏动物来源组分的培养基。培养基可包含一或多种替代化合物且优选地不含转铁蛋白和/或不含胰岛素和/或不含动物生长因子。培养基可包含一或多种可为结合金属的化合物的替代化合物和/或可包含一或多种包含一或多种替代化合物的络合物。在一些实施例中，培养基可包含一或多种络合物，所述络合物包含络合一或多种可为结合金属的化合物的替代化合物的一或多种过渡元素或其盐或离子。在一些实施例中，所述培养基能够支持细胞体外培育且允许其中培养的细胞的转染。在一些实施例中，本发明的试剂盒可以进一步包含至少一个包含用于转染细胞的脂质的容器。在一些实施例中，本发明的试剂盒可包含至少一个包含核酸的容器。

根据本发明的一个方面，过渡元素优选地选自由以下各项组成的群组：钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、锝、铷、铑、钯、银、镉、镧、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、汞和锕或其盐或离子，且优选地是铁盐。适合的铁盐包括(但不限于)FeCl₃、Fe(NO₃)₃或FeSO₄或含有Fe⁺⁺⁺或Fe⁺⁺离子的其它化合物。

优选的替代化合物包括(但不限于)结合金属的化合物。参见例如国际专利申请第PCT/US00/23580号，公开第WO 01/16294号。

本发明的结合金属的化合物包括可与过渡元素相互作用或结合且有助于其被细胞摄取的任何大分子。所述相互作用/结合的性质可为共价或非共价的。在本发明的这一方面所用的结合金属的化合物优选地选自由以下各项组成的群组：多元醇、羟基吡啶衍生物、1,3,5-N,N',N"-三(2,3-二羟基苯甲酰基)氨基-甲苯、乙二胺-N,N'-四亚甲基磷酸、翠苏素(trisuccin)、酸性糖类(如葡萄糖酸亚铁)、葡糖胺聚糖、二亚乙三胺五乙酸、烟碱酸-N-氧化物、2-羟基-烟碱酸、单、双、三取代的2,2'-二吡啶、异羟肟酸盐衍生物(如乙异羟肟酸)、氨基酸衍生物、去铁胺、铁草铵(ferrioxamine)、铁基卟吩和其衍生物、DOTA-赖氨酸、德卟啉(texaphyrin)、萨普卟啉(sapphyrin)、多氨基羧酸、α-羟基羧酸、聚乙烯氨基甲酸盐、乙基麦芽酚、3-羟基-2-吡啶和IRC011。在一个优选实施例中，结合金属的化合物是多元醇，如山梨糖醇或葡聚糖，且尤其是山梨糖醇。在一个相关实施例中，结合金属的化合物是羟基吡啶衍生物，如2-羟基吡啶-N-氧化物、3-羟基-4-吡喃酮、3-羟基哌吡啶-2-酮、3-羟基吡啶-2-酮、3-羟基吡啶-4-酮、1-羟基吡啶-2-酮、1,2-二甲基-3-羟基吡啶-4-酮、1-甲基-3-羟基吡啶-2-酮、3-羟基-2(1H)-吡啶酮、乙基麦芽酚或吡哆醛异烟碱基腙，且优选地是2-羟基吡啶-N-氧化物。在根据本发明这一方面的尤其优选实施例中，过渡金属络合物可为山梨糖醇-铁络合物或2-羟基吡啶-N-氧化物-铁络合物。本发明的结合金属的化合物还可结合二价阳离子，如Ca⁺⁺和Mg⁺⁺。

本发明涉及细胞培养基，其包含一或多种可为结合金属的化合物的替代化合物且进一步包含一或多种选自由以下各者组成的成分群组的成分：至少一种氨基酸(如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-缬氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸)、至少一种维生素(如生物素、氯化胆碱、D-Ca⁺⁺-泛酸盐、叶酸、i-肌醇、烟碱酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺或维生素B12)、至少一种无机盐(如钙盐、CuSO₄、FeSO₄、Fe(NO₃)₃、FeCl₃、KCl、镁盐、锰盐、乙酸钠、NaCl、NaHCO₃、Na₂HPO₄、Na₂SO₄、硒盐、硅盐、钼盐、钒盐、镍盐、锡盐、ZnCl₂、ZnSO₄或其它锌盐)、腺嘌呤、乙醇胺、D-葡萄糖、一或多种细胞因子、肝素、氢化可的松、硫辛酸、酚红、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸钠、三碘化甲腺氨酸、PLURONIC F68和胸苷。

本发明的培养基可任选地包括一或多种缓冲剂。适合的缓冲剂包括(但不限于)N-[2-羟乙基]-哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)、MOPS、MES、磷酸盐、碳酸氢盐和适用于细胞培养应用的其它缓冲剂。适合的缓冲剂是提供缓冲能力而对所培养的细胞无实质性细胞毒性的缓冲剂。对适合缓冲剂的选择处于在细胞培养领域中具普通技能者的范围内。

根据本发明，适用于形成本发明细胞培养基的培养基可包含一或多种成分，且可例如通过将一或多种选自由以下各项组成的群组的成分组合来获得：腺嘌呤、乙醇胺、D-葡萄糖、肝素、缓冲剂、氢化可的松、硫辛酸、酚红、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸钠、三碘化甲腺氨酸、胸苷、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸、生物素、氯化胆碱、D-Ca⁺⁺-泛酸盐、叶酸、i-肌醇、烟碱酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、维生素B12、Pluronic F68、重组胰岛素、钙盐、CuSO₄、FeSO₄、FeCl₃、Fe(NO₃)₃、KCl、镁盐、锰盐、乙酸钠、NaCl、NaHCO₃、Na₂HPO₄、Na₂SO₄、硒盐、硅盐、钼盐、钒盐、镍盐、锡盐、ZnCl₂、ZnSO₄或其它锌盐，其中每一成分都以支持细胞体外培育的量加入。

本发明还针对细胞培养基，其包含选自以下各者的成分：乙醇胺、D-葡萄糖、HEPES、胰岛素、亚油酸、硫辛酸、酚红、PLURONIC F68、腐胺、丙酮酸钠、转铁蛋白、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、生物素、氯化胆碱、D-Ca⁺⁺-泛酸盐、叶酸、i-肌醇、烟碱酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、维生素B12、一或多种钙盐、Fe(NO₃)₃、KCl、一或多种镁盐、一或多种锰盐、NaCl、NaHCO₃、Na₂HPO₄、一或多种硒盐、一或多种钒盐和一或多种锌盐，其中每一成分都以支持哺乳动物上皮细胞体外悬浮培育的量存在。本发明还针对此类培养基，其可任选地进一步包含一或多种选自由以下各项组成的群组的补充剂：一或多种细胞因子、肝素、一或多种动物肽、一或多种酵母肽和一或多种植物肽(最优选地是大米、芦荟、大豆、玉米、小麦、豌豆、南瓜、菠菜、胡萝卜、马铃薯、甘薯、木薯、鳄梨、大麦、椰子和/或绿豆和/或一或多种其它植物中的一或多者)，例如参见国际申请第PCT/US97/18255号，作为WO 98/15614公开。

由本发明提供的培养基可为无蛋白质的，且可为1×调配物或浓缩成例如10×、20×、25×、50×、10×、500×或1000×培养基调配物。

本发明的培养基还可以不同形式制备，如干粉培养基(“DPM”)、颗粒状制备物(其需要加入水，但无其它处理，如调节pH)、液体培养基或呈培养基浓缩物形式。

基础培养基(即，仅适用于维持但不用于生长或产物产生的培养基)可包含多种成分，包括氨基酸、维生素、有机和无机盐、糖和其它组分，每一成分都以支持哺乳动物上皮细胞体外培育的量存在。

在本发明的培养基、方法、试剂盒以及组合物中，培养基可用于培养多种细胞。优选地，培养基用于培养真核细胞。更优选地，培养基用于培养植物和/或动物细胞。更优选地，培养基用于培养哺乳动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或禽类细胞。更优选地，培养基用于培养哺乳动物细胞。更优选地，培养基可用于培养哺乳动物细胞，包括原代上皮细胞(例如角质细胞、颈椎上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾脏上皮细胞和视网膜上皮细胞)和建立的细胞系和其品系(例如293胚胎肾脏细胞、BHK细胞、HeLa颈椎上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CapT细胞、CHO细胞、BeWo细胞、张氏细胞(Chang cell)、Detroit 562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LS180细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI 2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK₂细胞、Clone M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-1细胞、LLC-PK₁细胞、PK(15)细胞、GH₁细胞、GH₃细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MH₁C₁细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞或其衍生物)、来自任何组织或器官(包括(但不限于)心、肝、肾、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺体、腺样体、扁桃体、骨髓和血液)、脾)的成纤维细胞、以及成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系(例如CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞(citrullinemia cell)、登普西细胞(Dempsey cell)、Detroit 551细胞、Detroit 510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、MiCl₁细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C₃H/IOTI/2细胞、HSDM₁C₃细胞、KLN₂O₅细胞、麦考伊细胞、小鼠L细胞、品系2071(小鼠L)细胞、L-M品系(小鼠L)细胞、L-MTK^-(小鼠L)细胞、NCTC克隆株2472和2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞、SIRC细胞、C_II细胞和延森细胞(Jensen cell)或其衍生物)。最优选地，培养基用于培养选自由以下各项组成的群组的哺乳动物细胞：293细胞、293F细胞或其衍生物、PER-C6细胞或其衍生物、CHO细胞或其衍生物、CapT细胞或其衍生物、COS-7L细胞或其衍生物和Sp2/0细胞或其衍生物、或能够以如上所定义的高细胞密度培养的任何其它悬浮细胞系或衍生物。更优选地，培养基用于培养293细胞或经修饰的293细胞系，其被专门调适用于在形成本发明基础的细胞培养基中最佳生长。在一些优选但非限制性方面，培养基用于悬浮培养细胞。

通过本发明的培养基支持的细胞可来源于任何动物，优选地是哺乳动物，且最优选地是小鼠或人类。在本发明培养基中培育的细胞可为正常细胞或异常细胞(即，经转化的细胞、建立的细胞或来源于患病组织样品的细胞)。

本发明还提供了使用本文中所公开的培养基调配物培育哺乳动物上皮或成纤维细胞的方法，其包含(a)使细胞与本发明的细胞培养基接触；和(b)在适于支持细胞培育的条件下培育细胞。在一些实施例中，本发明的方法可任选地包括使所培养的细胞与包含一或多种大分子(优选地包含一或多种核酸)的溶液在使得所述大分子中的一或多者引入到所述细胞中的一或多者中的条件下接触的步骤。优选地，根据这些方法培育的细胞(其可包括上述细胞中的任一者)被悬浮培育。

在一些方面，瞬时转染和重组蛋白系统可包括适于所培养的哺乳动物细胞以在约1×10⁶到约20×10⁶个细胞/毫升范围内、更优选地在约2×10⁶到约6×10⁶范围内的密度生长并繁殖的高密度培养基。任何培养基都可用于本发明的实践，其条件是所用培养基能够维持哺乳动物细胞(优选地悬浮生长的细胞)以高达约2×10⁷个细胞/毫升的密度生长同时维持所述细胞超过约80％的存活率且此外维持所述悬浮细胞有效转染并表达高量重组蛋白的能力。本发明的实践中所用的高密度培养基可在不同应用和用途之间变化，且可能取决于所用细胞系、瞬时表达的所需蛋白质的性质、选择用于将表达载体转移到细胞中的转染模态的性质以及加入到如下文所述的系统中的任何表达增强剂的量和性质。尽管如此，预期用于本发明瞬时表达系统和方法的优选的高密度培养基将通常是无血清、无蛋白质的，允许悬浮细胞培育和生长到高达约2×10⁷个细胞/毫升、更通常在约2×10⁶个细胞/毫升到约1×10⁷个细胞/毫升之间的密度，且将进一步实现在瞬时表达系统中产生的蛋白质产量超过至少200μg/mL细胞培养物到2mg/mL细胞培养物、更通常在约500μg/ml细胞培养物到约1mg/mL细胞培养物之间。理想地，根据本发明使用的高密度培养基将有助于细胞以在约1×10⁶到约20×10⁶个细胞/毫升、约2×10⁶到约2×10⁶个细胞/毫升、或约2.5×10⁶到约6×10⁶个细胞/毫升范围内的密度转染。

适于本发明实践的尤其优选的高密度生长培养基可为化学成分确定的培养基，其中每一化学物质和其对应的量在其用于培养细胞之前是已知的。所选化学成分确定的培养基可任选地在没有化学物质未知和/或未经定量的细胞或组织溶解产物或水解产物的情况下制得。

在本发明的一些方面，对于本发明的实践尤其适合的培养基类型是无血清培养基(有时被称为“SFM培养基”)，其完全不含例如胎牛血清(FBS)、小牛血清、马血清、山羊血清、人类血清等。熟练的业内人士熟悉的示例性但非限制性无血清培养基包括HuMEC基础无血清培养基、KNOCKOUT^TM CTS^TM无外来物ESC/iPSC培养基、STEMPRO^TM-34SFM培养基、STEMPRO^TM NSC培养基、ESSENTIAL^TM-8培养基、培养基254、培养基106、培养基131、培养基154、培养基171、培养基171、培养基200、培养基231、HeptoZYME-SFM、人类内皮-SFM、FREESTYLE^TM 293表达培养基、培养基154CF/PRF、培养基154C、培养基154CF、培养基106、培养基200PRF、培养基131、Essential^TM-6培养基、STEMPRO^TM-34培养基、星形胶质细胞培养基、AIM培养基CTS^TM、AMINOMAX^TM C-100基础培养基、AMINOMAX^TM-II完全培养基、CD FORTICHO^TM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLE^TM CHO表达培养基、CD OPTICHO^TM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基、SF-900^TM培养基、EXPI293^TM表达培养基、LHC基础培养基、LHC-8培养基、293SFM培养基、CD 293培养基、AEM生长培养基、PER.细胞培养基、AIM培养基、培养基、角质细胞-SFM培养基、LHC培养基、LHC-8培养基、LHC-9培养基和其任何衍生物或修改型。

在本发明的一些方面，对于本发明的实践尤其适合的培养基类型是无蛋白质培养基(有时被称为“PFM培养基”)，其完全不含蛋白质(例如无血清蛋白(如血清白蛋白或连接因子)、营养蛋白(如生长因子)或金属离子载体蛋白(如转铁蛋白、铜蓝蛋白)等)。优选地，如果存在肽，那么肽是较小肽，例如二肽或三肽。优选地，长度为十肽或更长的肽是存在于无蛋白质培养基中的氨基酸的不到约1％、更优选地不到约0.1％、且甚至更优选地不到约0.01％。

理想地，预期用于本发明的无血清和无蛋白质培养基两者将进一步不含任何动物来源物质、或任何完全或部分地来源于动物来源的物质，包括重组动物DNA或重组动物蛋白DNA。

适用于本发明实践的示例性高密度培养基包括(但不限于)HuMEC基础无血清培养基、KNOCKOUT^TM CTS^TM无外来物ESC/iPSC培养基、STEMPRO^TM-34SFM培养基、STEMPRO^TM NSC培养基、ESSENTIAL^TM-8培养基、培养基254、培养基106、培养基131、培养基154、培养基171、培养基171、培养基200、培养基231、HeptoZYME-SFM、人类内皮-SFM、FREESTYLE^TM 293表达培养基、培养基154CF/PRF、培养基154C、培养基154CF、培养基106、培养基200PRF、培养基131、Essential^TM-6培养基、STEMPRO^TM-34培养基、星形胶质细胞培养基、AIM培养基CTS^TM、AMINOMAX^TM C-100基础培养基、AMINOMAX^TM-II完全培养基、CD FORTICHO^TM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLE^TM CHO表达培养基、CD OPTICHO^TM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基、SF-900^TM培养基、LHC基础培养基、LHC-8培养基、293SFM培养基、CD 293培养基、AEM生长培养基、PER.细胞培养基、AIM培养基、培养基、角质细胞-SFM培养基、LHC培养基、LHC-8培养基、LHC-9培养基和其任何衍生物或修改型。在某些优选但非限制性的实施例中，高密度培养基可为CD FORTICHO^TM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLE^TM CHO表达培养基、CD OPTICHO^TM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基、FREESTYLE^TM 293表达培养基、EXPI293^TM表达培养基或类似培养基、或其修改型。以上列出的示例性高密度培养基可尤其适于CHO细胞、CHO细胞变异体、293细胞、293细胞变异体、CapT细胞、CapT细胞变异体或经调适用于高密度培养系统的任何其它细胞的高密度生长、繁殖、转染和维持。任选地，使用者可希望调配具有本文中所述特性的新培养基，或可改为选择重新调配或修改现有培养基。

在一些方面，高密度生长培养基可选自所述清单。所述培养基包括(但不限于)CD FORTICHO^TM培养基、Expi293^TM表达培养基、杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、基础培养基伊格尔(BME)、RPMI-1640、汉姆氏F-10、汉姆氏F-12、α最小必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最小必需培养基(G-MEM)和伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(IMDM)。可商购的(例如来自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)或所属领域中另外已知的其它培养基可根据本发明等效地使用，包括(但不限于)293SFM、CD-CHO培养基、VP SFM、BGJb培养基、布林斯特氏BMOC-3培养基、细胞培养冷冻培养基、CMRL培养基、EHAA培养基、eRDF培养基、费舍尔氏培养基、冈堡氏B-5培养基、GLUTAMAX^TM补充培养基、格雷斯氏昆虫细胞培养基、HEPES缓冲培养基、里克特氏改良MEM、IPL-41昆虫细胞培养基、莱博维茨氏L-15培养基、麦考伊氏5A培养基、MCDB 131培养基、培养基199、改良伊格尔培养基(MEM)、培养基NCTC-109、施奈德氏果蝇培养基、TC-100昆虫培养基、威茅斯氏MB 752/1培养基、威廉氏培养基、无蛋白质杂交瘤培养基II(PFHM II)、AIM V培养基、角质细胞SFM、成分确定的角质细胞SFM、SFM、完全甲基纤维素培养基、HepatoZYME-SFM、Neurobasal^TM培养基、神经基质-A培养基、Hibernate^TM A培养基、Hibernate E培养基、内皮SFM、人类内皮SFM、杂交瘤SFM、PFHM II、Sf 900培养基、Sf 900TI SFM、EXPRESS培养基、CHO-S-SFM、AMINOMAX-II完全培养基、AMINOMAX-C100完全培养基、AMINOMAX-C 100基础培养基、PB-MAX^TM核型分析培养基、KARYOMAX骨髓核型分析培养基、KNOCKOUT D-MEM和CO₂非依赖性培养基。以上培养基从所属领域的技术人员已知的制造商获得，如JRH、西格玛公司、海克隆公司和拜奥惠特克公司。适用于本发明的实践的培养基的其它实例可见于美国专利第5,135,866号和第5,232,848号以及国际公开第WO88/02774号、第WO 98/15614号、第WO 98/08934号和欧洲专利第0282942号，所述专利的全文特别地以引用的方式并入本文中。任选地，使用者可希望调配具有本文中所述特性的新培养基，或可改为选择重新调配或修改现有培养基。

本发明进一步提供包含本发明培养基的组合物，其任选地可进一步包含一或多种哺乳动物上皮或成纤维细胞，如上述那些，尤其是一或多种293细胞、293F细胞、PER-C6细胞、CHO细胞、CapT细胞、COS-7L细胞和Sp2/0细胞或其任何衍生物。

在本发明的一些方面，本发明的高产量瞬时转染系统可包括一或多种已被调适用于在高密度条件下生长而不实质性损失其存活率、有效转染的能力或其表达高水平重组蛋白的能力的细胞或细胞系。优选地，细胞是适用于在本发明中所培养的哺乳动物细胞以在约1×10⁶到约20×10⁶个细胞/毫升范围内、更优选地在约2×10⁶到约6×10⁶范围内的密度生长并繁殖的细胞系。可非限制性地使用任何细胞系，限制条件为细胞系能够在如上所定义的高密度条件下生长，同时以超过约80％的高密度维持其存活率，并保持其以高效率转染并以高达约2g/L培养物的水平表达重组蛋白的能力。所述细胞系的鉴别充分处于熟练的业内人士的范围内，且所述个人可在不背离本发明的精神和范围的情况下鉴别适用于本发明的细胞系。被调适用于高密度培养物的细胞可为已调适成以高密度生长在高密度培养基中同时保持细胞存活率处于或高于约80％的细胞谱系或来源于同一亲本细胞谱系的细胞的(非克隆)群体。所述细胞可通过经>40、>50、>60、>70或>80次连续传代以高密度维持细胞且用所需高密度培养基逐渐更换生长培养基的比例来从亲本细胞群体中分离或选择出。任选地，在所述方法期间，不同细胞池可个别地繁殖且经历选择程序，同时同步评估转染效率和或蛋白质表达效率，使得可选择出可以高密度维持和生长、以高效率转染且表达高水平所需重组蛋白的细胞的非克隆群体。虽然熟练的从业者将易于清楚，多种细胞类型和谱系可经历这种选择程序，但已确定来源于CHO细胞的细胞谱系、来源于293成纤维细胞的细胞谱系和来源于CapT细胞的细胞尤其经受所述选择方法以便被调适成高密度生长条件。理想地，被调适用于高密度生长培养物且适用于本发明的细胞还将能够以高效率转染和/或能够以超过至少约200μg/mL细胞培养物到约2mg/mL细胞培养物、更通常在约500μg/ml细胞培养物到约1mg/mL细胞培养物之间的产量表达重组蛋白。理想地，被调适用于根据本发明使用的高密度培养物的细胞能够以在约1×10⁶到约20×10⁶个细胞/毫升、约2×10⁶到约2×10⁶个细胞/毫升、或约2.5×10⁶到约6×10⁶个细胞/毫升范围内的密度维持和转染。

借助于非限制性实例，根据本文中所述的实施例可被调适用于高密度培养的细胞或细胞系可包括细胞，如培养的真核细胞，更优选地培养的植物和/或动物细胞，更优选地培养的哺乳动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或禽类细胞。在某些优选但非限制性实施例中，根据本文中所述的实施例可被调适用于高密度培养的细胞或细胞系可包括培养哺乳动物细胞，包括原代上皮细胞(例如角质细胞、颈椎上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾脏上皮细胞和视网膜上皮细胞)和建立的细胞系和其品系(例如293胚胎肾脏细胞、BHK细胞、HeLa颈椎上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CapT细胞、CHO细胞、BeWo细胞、张氏细胞、Detroit 562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LS180细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI 2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK₂细胞、Clone M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-1细胞、LLC-PK₁细胞、PK(15)细胞、GH1细胞、GH₃细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MH₁C₁细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞或其衍生物)、来自任何组织或器官(包括(但不限于)心、肝、肾、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺体、腺样体、扁桃体、骨髓和血液)、脾)的成纤维细胞、以及成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系(例如CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、登普西细胞、Detroit 551细胞、Detroit 510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、MiCl₁细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C₃H/IOTI/2细胞、HSDM₁C₃细胞、KLN₂O₅细胞、麦考伊细胞、小鼠L细胞、品系2071(小鼠L)细胞、L-M品系(小鼠L)细胞、L-MTK^-(小鼠L)细胞、NCTC克隆株2472和2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞、SIRC细胞、C_II细胞和延森细胞(Jensen cell)或其衍生物)。最优选地，培养基用于培养选自由以下各项组成的群组的哺乳动物细胞：293细胞、293F细胞或其衍生物、PER-C6细胞或其衍生物、CHO细胞或其衍生物、CapT细胞或其衍生物、COS-7L细胞或其衍生物和Sp2/0细胞或其衍生物、或能够以如上所定义的高细胞密度培养的任何其它悬浮细胞系或衍生物。更优选地，培养基用于培养293细胞或经修饰的293细胞系，其被专门调适用于在形成本发明基础的细胞培养基中最佳生长。在本发明的一些优选但非限制性方面，被调适用于高密度培养的细胞是悬浮细胞或已被调适用于悬浮生长的附着细胞。

被调适用于根据本文中所述的实施例高密度培养的细胞可任选地表达一或多种表达增强性蛋白质。如本文中所用，术语“表达增强性蛋白质”是指由细胞表达的任何蛋白质；所述蛋白质的表达增强重组蛋白的表达。出于本发明实施例的目的，细胞系或细胞群体对表达增强性蛋白质的表达可为稳定或瞬时的。多种此类表达增强性蛋白质是所属领域中已知的，且可包括如PKBa、Bcl-x_L、P21、P18、AKT等的蛋白质。在本发明的一些方面，本发明的高产量瞬时转染系统可包括一或多种用于瞬时表达所关注重组蛋白的表达载体。可提供已含有可表达的核酸的表达载体(如，评估在与优化的对照蛋白质相比时的表达效率的阳性对照)，或可替代地，表达载体可以一种形式提供，借此使用者可易于插入含有所关注蛋白质的开放阅读框架的可表达的核酸，使得所关注蛋白质可以重组方式且以高效率表达在细胞中。

为了重组产生所关注蛋白质，编码所述蛋白质的可表达的核酸被分离且插入到可复制载体中以便进一步克隆(扩增DNA)或表达。编码蛋白质的DNA可易于使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离并测序。许多载体是可供使用的。载体组件通常包括(但不限于)以下各项中的一或多者：信号序列、复制起点、一或多种标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

【(a)信号序列组件】

所关注蛋白质可以不仅直接重组地产生，而且以与异源多肽的融合多肽形式产生，所述异源多肽优选地是信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N端处具有特异性裂解位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选地是会被宿主细胞识别并加工(即，通过信号肽酶裂解)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导子(例如单纯疱疹病毒gD信号)是可供使用的。

【(b)复制起点】

表达载体或克隆载体都含有使得载体能够在一或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。一般来说，在克隆载体中，这一序列是使得载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，并包括复制起点或自主复制序列。所述序列对于多种细菌、酵母和病毒来说是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适用于酵母，并且各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般来说，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(SV40起点可通常仅由于其含有早期启动子而被使用)。

【(c)选择基因组件】

表达载体和克隆载体可以含有也称为可选择标记物的选择基因。典型选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄西林(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)或四环素(tetracycline))的抗性；(b)补充营养缺陷型缺乏；或(c)供应不可获自复合培养基的关键营养素，例如编码用于杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个实例利用药物来遏止宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞产生赋予耐药性的蛋白质并由此经受住选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。

适用于哺乳动物细胞的可选择标记物的另一个实例是能够鉴别有能力吸收编码抗体的核酸的细胞的标记物，如DHFR、谷氨酰胺合成酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II，优选地是灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

举例来说，经DHFR基因转化的细胞通过将转化体培养在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中来加以鉴别。在这些条件下，DHFR基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可使用缺乏内源性DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCCCRL-9096)。

或者，经GS基因转化的细胞通过将转化体培养在含有L-甲硫氨酸磺酰亚胺(Msx，GS的抑制剂)的培养基中来加以鉴别。在这些条件下，GS基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。GS选择/扩增系统可与上述DHFR选择/扩增系统组合使用。

或者，经编码所关注抗体的DNA序列、野生型DHFR基因和另一种可选择标记物(如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))转化或共转化的宿主细胞(尤其是含有内源性DHFR的野生型宿主)可通过细胞生长在含有针对可选择标记物(如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的选择剂的培养基中来加以选择。参见美国专利第4,965,199号。

用于酵母的适合选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(斯丁寇姆(Stinchcomb)等人,自然(Nature),282:39(1979))。trp1基因向缺乏生长于色氨酸中的能力的酵母突变菌株(例如ATCC第44076号或PEP4-1)提供了选择标记物。琼斯(Jones),遗传(Genetics),85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤则提供了有效环境以便在不存在色氨酸的情况下生长来检测转化。类似地，Leu2缺失型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)用负载Leu2基因的已知质粒补充。

另外，来源于1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维酵母(Kluyveromyces yeast)。或者，针对乳酸克鲁维酵母(K.lactis)报道了用于大规模制造重组牛凝乳酶的表达系统。范登博格(Van denBerg),生物技术(Bio/Technology),8:135(1990)。用于通过工业克鲁维酵母菌株分泌成熟重组人类血清白蛋白的稳定多拷贝表达载体也已公开。弗利尔(Fleer)等人,生物技术,9:968-975(1991)。

【(d)启动子组件】

表达载体和克隆载体通常含有启动子，所述启动子由宿主生物体识别且可操作地连接于编码所关注蛋白质的核酸。真核生物的多种启动子序列是已知的。几乎所有真核基因都具有富AT区，其位于转录起始位点上游约25到30个碱基处。在许多基因转录起点上游70到80个碱基处可见的另一个序列是CNCAAT区，其中N可为任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端处是AATAAA序列，其可为聚A尾加入到编码序列的3'端的信号。所有这些序列都适合地插入到真核表达载体中。

从哺乳动物宿主细胞中的载体转录蛋白质可例如通过从以下各者获得的启动子而受到控制：病毒基因组，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猴病毒40(SV40)；或异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)；热休克启动子，限制条件为此类启动子与宿主细胞系统相容。

SV40病毒的早期和晚期启动子方便地以还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段形式获得。人类巨细胞病毒的立即早期启动子方便地以HindIII E限制性片段形式获得。在哺乳动物宿主中使用牛乳头瘤病毒作为载体表达DNA的系统公开于美国专利第4,419,446号中。对这一系统的修改描述于美国专利第4,601,978号中。也参见雷耶斯(Reyes),自然297:598-601(1982)关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在小鼠细胞中表达人类β-干扰素cDNA。或者，劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列可用作启动子。

【(e)增强子元件组件】

高等真核生物对根据本发明的编码所关注蛋白质的DNA的转录通常通过将增强子序列插入到载体中而得以增加或增强。许多增强子序列现从哺乳动物基因已知(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。通常但非排他性地，将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括在复制起点的后侧(bp 100-270)上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的后侧上的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。还参见亚尼夫(Yaniv),自然297:17-18(1982)关于用于活化真核启动子的增强元件。增强子可在抗体编码序列的5'或3'位处剪接到载体中，但优选地位于始于启动子的5'位点处。其它增强子在所属领域中是已知的，且可包括例如获自或来源于哺乳动物或病毒基因的增强子。预期在此使用的一种尤其优选的增强子是土拔鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)。

【(f)转录终止组件】

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其它多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体还将含有终止转录和稳定化mRNA所需的序列。所述序列通常可获自真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区。这些区域含有作为聚腺苷酸化片段在mRNA编码抗体的非翻译部分中转录的核苷酸区段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。

在一些方面，非常适用于本发明实践的表达载体可为所属领域中使用的熟知载体中的任一者，如pCDNA 3.3或其修饰型。可适于本发明实践的载体修饰类型的非限制性实例包括(但不限于)修饰，如加入一或多种增强子、一或多种启动子、一或多种核糖体结合位点、一或多种复制起点等的修饰。在某些优选但非限制性的实施例中，且本发明的实践中所用的表达载体可包括一或多种经选择以改进所关注蛋白质在本发明瞬时表达系统中的表达的增强子元件。所选增强子元件可位于用于表达所关注蛋白质的可表达的核酸序列的5'或3'。尤其优选但非限制性的增强子元件是土拔鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)。

在一个优选但非限制性实施例中，根据目前所述本发明使用的表达载体可为pcDNA载体，或尤其是pcDNA 3.3载体，更具体地说是pcDNA 3.3载体的变异体。载体可任选地包括经增强启动子，如和经增强CMV启动子。任选地，载体可包括腺T+M区，任选地SV40ori位点，任选地SV40剪接供体/受体位点，或任选地土拔鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)。

在本发明的一些方面，本发明的高产量瞬时转染系统可包括一或多种表达增强剂。表达增强剂可为含有一或多种会在瞬时表达系统中增加重组蛋白表达的化合物的水溶液。多种表达增强剂在所属领域中是已知的，且任一或多种可非限制性地用于本发明的实践。

一般来说，一或多种转染增强剂与表达蛋白质的细胞群体在所述细胞已经可表达的核酸或表达载体转染期间或之后接触。当使用两种或更多种表达增强剂时，每一表达增强剂可在实质上同一时间与细胞接触，或可替代地表达增强剂可依序与表达蛋白质的细胞接触，任选地在使细胞与第一表达增强剂接触与使细胞与第二表达增强剂接触之间过了一段时间之后。

虽然熟练的业内人士将容易了解到任何数目的表达增强剂都可非限制性地用于本发明的实践，且对构成适用于本发明实施例的表达增强剂的要素的鉴别充分在所述个人的范围内，下文将描述多种示例性但非限制性表达增强剂，但应了解其叙述并不限制可预期用于本发明实践的适合表述的范围。

在一些方面，一或多种表达增强剂可包括用于补充根据目前所述实施例的培养基调配物的液体(优选地水性)添加剂，所述添加剂经选择以改进在根据目前所述实施例的瞬时蛋白质表达系统中产生的所表达蛋白质的产量。一或多种表达增强剂可包括会影响细胞周期进程、抑制细胞凋亡、减缓细胞生长和/或促进蛋白质产生的数种化合物中的一或多者。在本发明的情形下，术语“表达增强剂”一般是指加入到瞬时转染系统中的任一或多种化合物，所述一或多种化合物的存在增强或促进目标蛋白的表达高于在不存在所述表达增强剂下可见的表达水平至少2倍到约10倍。适合与目前所述实施例一起使用的示例性表达增强剂包括(但不限于)添加剂，如丙戊酸(VPA，酸和钠盐)、丙酸钠、乙酸锂、二甲亚砜(DMSO)、包括半乳糖的糖、氨基酸混合物、或丁酸或上述的任何组合。每一特定表达增强剂的最佳浓度可根据表达系统的个别特征和使用者的需求变化，且对在给定实验情境中构成任一或多种表达增强剂的最佳浓度的要素的测定充分处于在所属领域中具有普通技能水平的从业者的范围内。

在一个示例性实施例中，表达增强剂可以是含有丙戊酸的调配物。本发明的实践中所用的丙戊酸(VPA)的最佳最终浓度范围可改变，但将优选地在约0.20mM到约25mM范围内，或由此范围涵盖的任何子范围或浓度值。更优选地，VPA的最终浓度可能在以下范围内：约0.25mM到约24mM、约0.26mM到约23mM、0.27mM到约23mM、0.28mM到约23mM、0.29mM到约22mM、约0.30mM到约21mM、约0.31mM到约20mM、约0.32mM到约19mM、约0.33mM到约17mM、约0.34mM到约18mM、约0.35mM到约17mM、约0.36mM到约16mM、约0.37mM到约15mM、约0.40mM到约14mM、约0.41mM到约13mM、约0.42mM到约12mM、约0.43mM到约11mM、约0.44mM到约10mM、约0.45mM到约9mM、约0.46mM到约8mM、约0.47mM到约7mM、约0.48mM到约6mM、约0.49mM到约5mM、约0.50mM到约4mM、约0.50mM到约4mM、约0.55mM到约3mM、0.6mM到约2mM或0.75到约1.5mM。在一些优选但非限制性的实施例中，本发明的实践中所用的VPA的最终浓度可能在约0.15mM到约1.5mM之间、在约0.16mM到约1.5mM之间、在约0.17mM到约1.5mM之间、在约0.18mM到约1.5mM之间、在约0.19mM到约1.5mM之间、在约0.20mM到约1.5mM之间、在约0.25mM到约1.5mM之间、在约0.30mM到约1.5mM之间、在约0.40mM到约1.5mM之间、在约0.50mM到约1.5mM之间、在约0.60mM到约1.5mM之间、在约0.70mM到约1.5mM之间、在约0.80mM到约1.5mM之间、在约0.90mM到约1.5mM之间或在约0.10mM到约1.5mM之间。在一些优选但非限制性的实施例中，本发明的实践中所用的VPA的最终浓度可能在约0.20到约1.5mM之间、在约0.21到约1.4mM之间、在约0.22到约1.4mM之间、在约0.23到约1.4mM之间、在约0.24到约1.4mM之间、在约0.25到约1.3mM之间、在约0.25到约1.2mM之间、在约0.25到约1.1mM之间或在约0.25到约1.0mM之间。

在另一个示例性实施例中，表达增强剂可以是含有丙酸钠(NaPP)的调配物。任选地，NaPP可单独或与如上丙戊酸组合提供。本发明的实践中所用的NaPP的最佳最终浓度范围可能改变，但将优选地在约范围内在其它实施例中，本发明的实践中所用的NaPP的最佳最终浓度可能在约0.2mM到约100mM范围内，或此范围内涵盖的任何子范围或个别浓度。在某些优选但非限制性的实施例中，NAPP的最佳最终浓度可能在以下范围内：约0.5到约80mM、约0.4mM到约70mM、约0.5mM到约60mM、约0.6mM到约50mM、约0.7mM到约40mM、约0.8mM到约30mM、约0.9mM到约20mM、约1mM到约15mM、约2mM到约10mM、约3mM到约9mM、约4mM到约8mM或约5mM到约7mM。在某些优选但非限制性的实施例中，NAPP的最佳最终浓度可能在以下范围内：约1mM到约10mM、约1mM到约2mM、约2mM到约3mM、约3mM到约4mM、约4mM到约5mM、约5mM到约6mM、约6mM到约7mM、约7mM到约8mM、约8mM到约9mM或约9mM到约10mM。在某些优选但非限制性的实施例中，NAPP的最佳最终浓度可能是约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM、约5mM、约5.5mM、约6mM、约6.5mM、约7mM、约7.5mM、约8mM、约8.5mM、约9mM、约9.5mM或约10mM。

在另一个示例性实施例中，表达增强剂可以是含有乙酸锂(LiAc)的调配物。任选地，LiAc可能单独或与如上NaPP或丙戊酸组合提供。在其它实施例中，本发明的实践中所用的乙酸锂(LiAc)的最佳最终浓度可能在以下范围内：约0.25到约25mM、约0.26mM到约20mM、约0.27mM到约15mM、约0.28mM到约10mM、约0.29mM到约5mM、约0.3mM到约4.5mM、约0.31mM到约4mM、约0.35mM到约3mM、约0.5mM到约2.5mM、约1mM到约3mM、约1.5mM到约2.5mM或约2mM到约3mM。

在另一个示例性实施例中，表达增强剂可以是含有丁酸的调配物。本发明的实践中所用的丁酸的最佳最终浓度可能在以下范围内：约0.25到约25mM、约0.26mM到约20mM、约0.27mM到约15mM、约0.28mM到约10mM、约0.29mM到约5mM、约0.3mM到约4.5mM、约0.31mM到约4mM、约0.35mM到约3mM、约0.5mM到约2.5mM、约1mM到约3mM、约1.5mM到约2.5mM或约2mM到约3mM。

根据本发明使用的表达增强剂可在即将转染之前或在转染期间、或在转染之后但在收获细胞和所表达的蛋白质之前加入到培养基中。在下文描述的一些特定但非限制性实施例中，“增强剂1”一般是指0.25mM-1mM丙戊酸，且“增强剂2”一般是指5mM-7mM丙酸钠。然而，如果另外指示，那么术语增强剂1和增强剂2可涵盖不同增强剂化合物。表达增强剂可依序或以混合物形式加入到培养基中。

在本发明的一些方面，本发明的高产量瞬时转染系统可包括一或多种用于将大分子引入到所培养的细胞中的试剂(所述试剂通常被称为“转染试剂”)。根据目前所述实施例使用的转染试剂可为用于将生物分子(尤其是核酸分子)引入到细胞中的任何化合物或其它化学模态，由此核酸可发挥生物功能，或在可表达的核酸的情况下，其中由所述可表达的核酸编码的基因或蛋白质可被表达。多种适合的转染试剂在所属领域中是已知的，且任一或多种可非限制性地用于本发明的实践。

用于本发明实施例的转染试剂是所属领域的技术人员已知有助于大分子进入到细胞中的任何调配物或组合物。举例来说，参见美国专利第5,279,833号。在一些实施例中，试剂可为“转染试剂”且可为增加一或多种核酸摄取到一或多种目标细胞中的任何化合物和/或组合物。所属领域的技术人员已知多种转染试剂。适合的转染试剂可包括(但不限于)一或多种化合物和/或组合物，其包含阳离子聚合物(如聚乙二亚胺(PEI))、带正电荷氨基酸的聚合物(如聚赖氨酸和聚精氨酸)、带正电荷树枝状聚合物和断裂的树枝状聚合物、含有阳离子β-环糊精的聚合物(CD-聚合物)、DEAE-葡聚糖等。在一些实施例中，用于将大分子引入到细胞中的试剂可包含一或多种可为阳离子脂质和/或中性脂质的脂质。优选的脂质包括(但不限于)氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲铵(DOTMA)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPE)、1,2-双(油酰基氧基)-3-(4'-三甲铵基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-(4'-三甲铵基)丁酰基-sn-甘油(DOTB)、1,2-二油酰基-3-琥珀酰基-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、(4'-三甲铵基)丁酸胆固醇酯(ChoTB)、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、溴化1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙铵(DORI)、溴化1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙铵(DORIE)、溴化1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙铵(DMRIE)、氯化O,O'-双十二烷基-N-[对(2-三甲氨基乙氧基)苯甲酰基]-N,N,N-三甲铵、结合于一或多种脂质的精胺(例如5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺(DOGS)、N,N^I,N^II,N^III-四甲基-N,N^I,N^II,N^III-四棕榈基精胺(TM-TPS)和二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(DPPES))、脂聚赖氨酸(结合于DOPE的聚赖氨酸)、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷，氨基丁三醇)结合的脂肪酸(TFA)和/或肽，如三赖氨酰基-丙氨酰基-TRIS单-、二-和三-棕榈酸酯、(3β-[N--(N',N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、氯化N-(α-三甲氨基乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯(TMAG)、溴化二甲基双十八烷铵(DDAB)、三氟乙酸2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵(DOSPA)和其组合。

所属领域的技术人员将理解上述脂质的某些组合已展示出尤其适于将核酸引入到细胞中，例如DOSPA与DOPE的3:1(w/w)组合以商标名LIPOFECTAMINE^TM购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司，DOTMA与DOPE的1:1(w/w)组合以商标名购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司，DMRIE与胆固醇的1:1(M/M)组合以商标名DMRIE-C试剂购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司，TM-TPS与DOPE的1:1.5(M/M)组合以商标名购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司，且DDAB与DOPE的1:2.5(w/w)组合以商标名购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司。除了上述脂质组合之外，包含脂质与其它化合物的掺合物、具体来说与包含核定位序列的肽和蛋白质的掺合物的其它调配物是所属领域的技术人员已知的。举例来说，参见国际申请第PCT/US99/26825号，作为WO 00/27795公开，其两者都以引用的方式并入本文中。

已发现脂质聚集体(如脂质体)适用作将大分子传递到细胞中的试剂。具体来说，已证实包含一或多种阳离子脂质的脂质聚集体在将阴离子大分子(例如核酸)传递到细胞中时极其有效。一种常用阳离子脂质是氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲铵(DOTMA)。包含单独DOTMA或与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1混合物的脂质体已被用于将核酸引入到细胞中。DOTMA:DOPE的1:1混合物可以商标名LIPOFECTIN^TM购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司。已用于将核酸引入到细胞中的另一种阳离子脂质是1,2-双(油酰基氧基)-3-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)。DOTAP与DOTMA的不同之处在于油酰基部分在DOTAP中经由醚键键联到丙胺主链，而其在DOTMA中是经由酯键键联的。DOTAP被认为更易于被目标细胞降解。其中三甲铵部分的一个甲基经羟乙基替代的结构上相关的化合物组在结构上与磷脂酶A的罗森塔尔抑制剂(RI)类似(参见罗森塔尔等人,(1960)生物化学杂志233:2202-2206)。RI具有键联到丙胺核心的硬脂酰基酯。RI的二油酰基类似物通常简称为DOR1-醚和DOR1-酯，取决于脂质部分与丙胺核心的键联。羟乙基部分的羟基可进一步例如通过酯化成羧基精胺来衍生。

已用于将大分子引入到细胞中的另一类化合物包含与脂质连接的羧基精胺部分(参见贝尔等人,(1989)美国国家科学院院刊86:6982-6986和EPO 0 394 111)。这类化合物的实例包括二软脂酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(DPPES)和5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺(DOGS)。DOGS可以商标名TRANSFECTAM^TM购自威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司。

胆固醇的阳离子衍生物(3β-[N--(N',N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇，DC-Chol)已经合成且与DOPE一起调配到脂质体中(参见高等人,(1991)BBRC 179(1):280-285)且用于将DNA引入到细胞中。由此调配的脂质体据报道有效地将DNA以低细胞毒性水平引入到细胞中。通过将聚赖氨酸结合于DOPE所形成的脂聚赖氨酸(参见周等人,(1991)BBA 1065:8-14)据报道在将核酸在血清存在下引入到细胞中时有效。

已用于将核酸引入到细胞中的其它类型的阳离子脂质包括高度填充聚阳离子铵、锍和鏻脂质，如美国专利第5,674,908号和第5,834,439号和国际申请第PCT/US99/26825号(作为WO 00/27795公开)中所述的那些。根据本发明一种尤其优选但非限制性的用于传递大分子的转染试剂是购自生命技术公司的LIPOFECTAMINE 2000^TM。参见美国国际申请第PCT/US99/26825号，作为WO 00/27795公开。适于将大分子传递到细胞中的另一种优选但非限制性转染试剂是EXPIFECTAMINE^TM。其它适合的转染试剂包括LIOFECTAMINE^TMRNAiMAX、LIPOFECTAMINE^TM LTX、OLIGOFECTAMINE^TM、Cellfectin^TM、INVIVOFECTAMINE^TM、INVIVOFECTAMINE^TM 2.0以及杨等人的美国专利申请公开第2012/0136073号中所公开的任何脂质试剂或调配物(所述公开以引用的方式并入本文中)。多种其它转染试剂是熟练的业内人士已知的且可针对其对于本文中所述的瞬时转染系统和方法的适合性进行评估。

本发明在某种程度上是针对一种高产量瞬时转染系统，其支持(a)将至少一种大分子(优选地是可表达的核酸分子)引入到培养物中的真核细胞中，(b)培育其中已引入至少一种大分子的细胞，以及任选地(c)在其中已引入至少一种大分子的细胞中产生重组蛋白产物或表达核酸，其中含有大分子的培养基并不需要在将至少一种大分子引入到细胞中之后以及在培育并产生蛋白质产物或表达核酸之前从培养物中移出并用新鲜培养基更换。

【方法】

本发明进一步涉及表达高水平的所关注蛋白质的方法。本发明的方法可包括悬浮培育哺乳动物细胞(尤其是上述那些且最尤其是293细胞、293F细胞、PER-C6细胞、CHO细胞、CapT细胞、COS-7L细胞和Sp2/0细胞或其任何衍生物)，包含(a)获得以悬浮形式培育的哺乳动物细胞；和(b)使细胞与本发明的培养基在足以支持细胞悬浮培育的条件下接触，用编码所关注蛋白质的可表达的核酸转染所培养的细胞，使经转染的细胞与一或多种表达增强剂接触，在允许所关注蛋白质表达所界定时间段的条件下培养经转染的细胞，以及收获细胞。

本发明进一步涉及产生多肽的方法，以及通过这些方法产生的多肽，所述方法包含(a)获得细胞，优选地是上述哺乳动物细胞，且最优选地是293细胞、293F细胞、PER-C6细胞、CHO细胞、CapT细胞、COS-7L细胞和Sp2/0细胞或其任何衍生物；(b)使细胞与包含编码多肽的核酸的溶液在引起核酸引入到细胞中的条件下接触；以及(c)在本发明的培养基中在有利于所需多肽通过细胞表达的条件下培育细胞。

在一个方面，根据本发明的表达重组蛋白的方法可包括在高密度培养基中获得细胞的培养物。细胞优选地是以下各者的悬浮培养物：293细胞、293F细胞、PER-C6细胞、CHO细胞、CapT细胞、COS-7L细胞或Sp2/0细胞或其任何衍生物，所述细胞已适宜于在高密度培养基中生长。虽然熟练的业内人士将容易了解在本发明的实践中可使用任何体积的细胞培养物，但培养物通常将为约200μl到100升，更优选地，细胞培养物体积是约2ml到约50升，最优选地是约5ml到约5升。在一些方面，细胞培养物体积可以是约100ml到约50升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约50升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约25升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约10升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约5升。更优选地，细胞培养物体积是约500ml到约1升。在一些实施例中，细胞培养物体积可以高达约100升、高达约95升、高达约90升、高达约85升、高达约80升、高达约75升、高达约70升、高达约65升、高达约60升、高达约55升、高达约50升、高达约45升、高达约40升、高达约35升、高达约30升、高达约35升、高达约20升、高达约15升、高达约10升、高达约9升、高达约8升、高达约7升、高达约6升、高达约5升、高达约4升、高达约2升或高达约1升。

在一个方面，细胞培养物可以在约1.5×10⁶个细胞/毫升到约20×10⁶个细胞/毫升之间的细胞密度、或其中涵盖的任何浓度、浓度范围或子范围维持。

为了根据目前描述的本发明在细胞中表达蛋白质，细胞将通常稀释到新鲜体积培养基中。最佳稀释度可以改变，但为了说明性目的，稀释到新鲜体积培养基中的细胞密度可以在0.5×10⁶个细胞/毫升到约10×10⁶个细胞/毫升之间，更优选地在1×10⁶个细胞/毫升到约5×10⁶个细胞/毫升之间，更优选地在1.5×10⁶个细胞/毫升到约3×10⁶个细胞/毫升之间。

在一个方面，在将细胞稀释到新鲜体积培养基中之后，细胞可以所述体积培养一段时间，随后用可表达的核酸转染。任选地，细胞可以培养高达2天，更优选地高达约一天半，最优选地高达约一天。任选地，细胞可以培养在新鲜体积培养基中直到其中培养的细胞密度已增加高达约100％、更优选地高达约95％、高达约90％、高达约85％、高达约80％、高达约75％、高达约70％、高达约65％、高达约60％、高达约55％、高达约50％、高达约45％、高达约40％、高达约35％、高达约30％、高达约25％、高达约20％或高达约15％。

在一个方面，在细胞已在高密度生长培养基中培养如上文所述的一段时间之后，细胞可经可表达的核酸或表达载体转染。使用者进行以实现将表达载体引入到细胞中的步骤的精确顺序可变化，取决于所选择的特定转染试剂、细胞系、培养基和各种其它实验参数，如在所属领域中具有普通技能水平的从业者将易于认识到般。仅举例来说，在选择基于脂质的转染系统(具体来说，具有至少一种阳离子脂质的转染系统)的情况下，转染试剂将首先与核酸在水溶液中接触以在如上所定义且并入本文中的过程(非正式地称为“复合”或“复合反应”)中形成脂质-DNA复合物。所述反应通常将在与培养细胞的容器分开的反应容器中实现。

在一个方面，在上述复合步骤中形成脂质-DNA复合物之后，转染复合物可与所培养的细胞接触。在细胞与转染复合物接触之后，细胞可在转染复合物存在下培养第一时间段。第一时间段的持续时间将根据细胞的性质、所用转染试剂和所属领域的技术人员已知的多种其它因素变化。短语“第一时间段”当用于根据本文中所述的本发明方法瞬时转染细胞的方法的情形时通常是指在细胞群体经可表达的核酸转染与一或多种表达增强剂加入到经转染的细胞中之间的时间间隔。第一时间段通常将在约2小时到约4天范围内，或其中涵盖的任何范围或子范围。在某些优选但非限制性的实施例中，第一时间段可能在以下范围内：约3到约90小时、约4到约85小时、约5到约80小时、约6到约75小时、约7到约70小时、约8到约65小时、约9到约60小时、约10到约55小时、约11到约50小时、约12到约45小时、约13到约40小时、约14到约35小时、约15到30小时、约16到约24小时、约17到约24小时、约18到约24小时、约19到约24小时、约20到约24小时、约21到约24小时、约22到约24小时或约23到约24小时。在其它优选非限制性实施例中，第一时间段可能高达约15小时、高达约16小时、高达约17小时、高达约18小时、高达约19小时、高达约20小时、高达约21小时、高达约22小时、高达约23小时、高达约24小时、高达约25小时、高达约26小时、高达约27小时、高达约28小时、高达约29小时或高达约30小时。

在一个高度优选但非限制性实施例中，培养基在转染复合物引入到细胞中且维持第一时间段的持续时间之后不经更换、补充或补给。

在本发明的一个方面，培养的经转染的细胞可在第一时间段之后与一或多种表达增强剂接触。表达增强剂可为含有一或多种会在瞬时表达系统中增加重组蛋白表达的化合物的水溶液。多种表达增强剂在所属领域中是已知的，且任一或多种可非限制性地用于本发明的实践。

在一个示例性实施例中，表达增强剂可以是含有丙戊酸的调配物。本发明的实践中所用的丙戊酸(VPA)的最佳最终浓度范围可改变，但将优选地在约0.20mM到约25mM范围内，或由此范围涵盖的任何子范围或浓度值。更优选地，VPA的最终浓度可能在以下范围内：约0.25mM到约24mM、约0.26mM到约23mM、0.27mM到约23mM、0.28mM到约23mM、0.29mM到约22mM、约0.30mM到约21mM、约0.31mM到约20mM、约0.32mM到约19mM、约0.33mM到约17mM、约0.34mM到约18mM、约0.35mM到约17mM、约0.36mM到约16mM、约0.37mM到约15mM、约0.40mM到约14mM、约0.41mM到约13mM、约0.42mM到约12mM、约0.43mM到约11mM、约0.44mM到约10mM、约0.45mM到约9mM、约0.46mM到约8mM、约0.47mM到约7mM、约0.48mM到约6mM、约0.49mM到约5mM、约0.50mM到约4mM、约0.50mM到约4mM、约0.55mM到约3mM、0.6mM到约2mM或0.75到约1.5mM。在一些优选但非限制性的实施例中，本发明的实践中所用的VPA的最终浓度可能在约0.15mM到约1.5mM之间、在约0.16mM到约1.5mM之间、在约0.17mM到约1.5mM之间、在约0.18mM到约1.5mM之间、在约0.19mM到约1.5mM之间、在约0.20mM到约1.5mM之间、在约0.25mM到约1.5mM之间、在约0.30mM到约1.5mM之间、在约0.40mM到约1.5mM之间、在约0.50mM到约1.5mM之间、在约0.60mM到约1.5mM之间、在约0.70mM到约1.5mM之间、在约0.80mM到约1.5mM之间、在约0.90mM到约1.5mM之间或在约0.10mM到约1.5mM之间。在一些优选但非限制性的实施例中，本发明的实践中所用的VPA的最终浓度可能在约约0.20到约1.5mM之间、在约0.21到约1.4mM之间、在约0.22到约1.4mM之间、在约0.23到约1.4mM之间、在约0.24到约1.4mM之间、在约0.25到约1.3mM之间、在约0.25到约1.2mM之间、在约0.25到约1.1mM之间或在约0.25到约1.0mM之间。

在一个方面，当使用两种或更多种表达增强剂时，所述两种或更多种表达增强剂可与所转染的经培养细胞实质上同时接触，或可替代地所转染的经培养细胞可首先与第一表达增强剂接触，且在第二时间段之后，所转染的经培养细胞可与第二表达增强剂接触。在一个方面，“第二时间段”当用于根据本文中所述的本发明方法瞬时转染细胞的方法的情形时通常是指在加入一或多种表达增强剂与或者加入一或多种其它增强剂或者收获经转染的细胞并对其中表达的蛋白质进行纯化或分离之间的时间间隔。第二时间段通常将在约10小时到约10天范围内，但其它时间间隔在确定对于所表达蛋白质最佳时可以使用。在一些优选但非限制性的实施例中，第二时间段可能在以下范围内：2小时到5天、2.5小时到4天、约3到约90小时、约4到约85小时、约5到约80小时、约6到约75小时、约7到约70小时、约8到约65小时、约9到约60小时、约10到约55小时、约11到约50小时、约12到约45小时、约13到约40小时、约14到约35小时、约15到30小时、约16到约24小时、约17到约24小时、约18到约24小时、约19到约24小时、约20到约24小时、约21到约24小时、约22到约24小时或约23到约24小时。在其它优选非限制性实施例中，第一时间段可能高达约15小时、高达约16小时、高达约17小时、高达约18小时、高达约19小时、高达约20小时、高达约21小时、高达约22小时、高达约23小时、高达约24小时、高达约25小时、高达约26小时、高达约27小时、高达约28小时、高达约29小时或高达约30小时。

在经过适当量时间之后，使用者可以收获细胞并任选地纯化所表达的重组蛋白。

本发明的方法允许使用者根据上述实施例瞬时表达重组蛋白而不必在所述方法期间更换、补充或另外补给培养基。本文中所描述的方法允许使用者每升培养的细胞表达高达约2克。在一些实施例中，使用者可以对每升培养的细胞表达高达约1.9g、高达约1.8g、高达约1.7g、高达约1.6g、高达约1.5g、高达约1.4g、高达约1.3g、高达约1.2g、高达约1.1g或高达约1g重组蛋白。

本发明还针对组合物，尤其是如上所定义的高密度细胞培养基，其任选地包含一或多种替代化合物。本发明还针对使用所述组合物的方法，包括例如体外培育真核细胞(尤其是动物细胞)的方法。本发明还涉及包含所述培养基和一或多种细胞(尤其是本文中特定提及的那些细胞)的组合物，和包含上述组合物中的一或多者的试剂盒。本发明还涉及表达载体，其包含一或多种可表达的核酸序列与一或多种启动子、增强子和在如上所定义且并入本文中的所培养的细胞中表达所述可表达的核酸所需的其它元件的组合。本发明还涉及组合物，其包含一或多种表达增强剂组合物，尤其是经选择以使所述可表达的核酸在所培养的细胞中的表达增强至少2到2.5倍的那些。任选地，表达增强剂可为共同调配或分别提供的两种或表达增强剂的组合。本发明还涉及转染试剂，尤其是经优化以有助于一或多种核酸分子传递到所培养的细胞内部的那些。本发明还涉及包含上述组合物、载体、表达增强剂、转染试剂等中的一或多者的试剂盒，和包含上述组合物(尤其是本文中特定提及的那些细胞)中的一或多者的试剂盒。

在另一个方面，本发明涉及一种用于体外培育细胞的试剂盒。试剂盒包含一或多个容器，其中第一容器含有本发明的培养基。试剂盒可进一步包含一或多个其它容器，每一容器含有一或多种选自由以下各项组成的群组的补充剂：一或多种细胞因子、肝素、一或多种动物或动物来源肽、一或多种酵母肽和一或多种植物肽(优选地是来自大米、芦荟、大豆、玉米、小麦、豌豆、南瓜、菠菜、胡萝卜、马铃薯、甘薯、木薯、鳄梨、大麦、椰子和/或绿豆和/或一或多种其它植物的一或多种肽)。

本发明的试剂盒可进一步包含一或多个容器，所述一或多个容器包含核酸和/或有助于将至少一种大分子(例如核酸)引入到培养在本发明培养基中的细胞中的试剂(即转染试剂)。优选的转染试剂包括(但不限于)阳离子脂质等。

根据本发明的一个方面的试剂盒可包含本发明的培养基、一或多种替代化合物(其可为一或多种结合金属的化合物)和/或一或多种过渡元素络合物中的一或多者，且可任选地包含一或多种核酸和转染试剂。根据本发明的另一个方面的试剂盒可包含一或多种细胞培养基(其中的一者可为基础培养基)且任选地包含一或多种替代化合物。本发明的试剂盒还可含有关于使用试剂盒来培养细胞和/或将大分子或化合物(例如核酸，如DNA)引入到细胞中的说明书。

相关领域的技术人员将易于清楚的是，对本文中所述的方法和应用的其它适合修改和改编是显而易见的且可在不脱离本发明或其任何实施例的范围的情况下进行。现已详细描述本发明，通过参考以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例仅出于说明的目的随同包括在内且并不打算限制本发明。

【实施例】

【目的】

为了开发将蛋白质产量增到最大(超过用可商购的瞬时表达系统(如Freestyle^TM 293系统)获得的产量至少2倍)的细胞培养基和转染系统。系统应对于多种蛋白质类型和在多种悬浮细胞中起作用。系统应增加再现性且将变异性减到最少且应是可按比例扩大的(多孔板到大规模)。本发明的其它实施例包括开发改进的表达载体、被调适用于在高密度培养条件下在本发明的培养系统中生长的高密度细胞系、使用且并入转染增强子(如丙戊酸和丙酸钠(除其它之外))。本发明的另一个目的是开发一种能够以高细胞密度转染的方案，其并不涉及在转染期间或之后进行培养基更换，且其简单并易于使用。

应了解，本发明出于清楚的目的描述于分开的实施例的情形中的某些特征还可以组合形式提供于单个实施例中。相反地，出于简洁的目的描述于单个实施例的情形中的本发明的各种特征还可以分开地或以任何适合的子组合形式提供。

【实施例1：高密度培养基】

评估多种可商购的无血清、无蛋白质培养基维持细胞密度高达约14×10⁶个细胞/毫升且由此用于本发明的实践的经调适293F细胞系的存活率的能力。选择这样的无血清、无蛋白质培养基：其中培养物细胞系经超过一周的时间范围存活率保持较高且甚至接近几乎15×10⁶个细胞/毫升的密度，同时还能够以出人意料高的约3×10⁶个细胞/毫升的细胞密度(相较于目前可商购的瞬时转染系统的1×10⁶个细胞/毫升)转染。结果描绘于图1中，其展示使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统可实现的所得细胞密度的图式。先前被调适用于高密度生长的细胞经3代缓慢调适到各种测试的生长培养基中。细胞调适的培养基包括根据本发明的一个实施例的高密度培养基(实心圆)、测试培养基1(实心三角形)、测试培养基2(空心三角形)和测试培养基3(空心菱形)。将细胞在每一培养基中培养多代，随后以0.2×10⁶个细胞/毫升接种于30ml烧瓶中。在经实验过程不补给、更换或另外补充生长培养基的情况下，经8天监测细胞密度和存活率。所选生长培养基之一(高密度生长培养基；实心圆)经实验过程能够维持出人意料高密度的所培养的悬浮细胞而不实质上损失存活率。因此，所属领域的技术人员可能易于评估用于作为细胞系变异体的特定细胞系的多种生长培养基，其中生长培养基可基于有助于经所界定时间段培育高密度悬浮细胞而不必替换、补充或补给培养基的能力进行选择。这可由熟练的业内人士在无过度实验的情况下实现。

【实施例2：细胞系优化】

尽管本发明的实践中可使用多种悬浮细胞，但优选的是使用已被调适用于本发明的实施例和所选高密度生长培养基的细胞系。另外，细胞可经特定选择以实现高密度生长、高存活率和增加的蛋白质表达。为了实现这一点，亲本293F成纤维细胞经历了广泛的调适过程，所述过程涉及经数代逐渐更换培养基。另外，应注意经调适的细胞大小和表达能力伴随后代增加。在第72代，将细胞在ATCC库存且通过基因分析验证，且将其认证为无支原体污染的293F细胞。将细胞解冻且检验其存活率。将细胞传30代以验证稳定性、表达性能和其在生长于培养物中时保持高存活率和高达约20×10⁶个细胞/毫升的密度的能力。与原始细胞系(系1)相比，如上文所述的针对增加的细胞密度、存活率和人IgG表达进行选择的细胞群体展示出多到约1.7倍的hIgG。高产量调适的细胞(系3)还具有增加的生长速率、存活率和细胞大小。

图2展示概述用于根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的细胞系表达优化的条形图。将亲本293F细胞系分割成多个传代培养物，随后将所述多个传代培养物调适到高密度培养基中。能够以高密度生长的各个传代培养物接着针对其表达重组测试蛋白(人类IgG)的能力进行选择和评估。标记为高产量调适的293F细胞的细胞的传代培养物(右组条形)与来源于相同亲本293F细胞系的细胞的两种不同传代培养物相比表达多35％到45％之间的重组IgG。因此，所属领域的技术人员可能易于获得已经特定选择以用于生长培养基的细胞系或细胞系衍生物，且可基于有助于经所界定时间段培育高密度悬浮细胞而不必替换、补充或补给培养基的能力进行选择。这可由熟练的业内人士在无过度实验的情况下实现。

【实施例3：由表达增强剂辅助的瞬时转染】

在组合实验中测试一组化学添加剂以评估每一组分或一或多种组分的组合对蛋白质产量的相对贡献。鉴别出显著改进蛋白质产生的多种转染/表达增强剂。组分被调配成2种稳定增强剂溶液。转染增强剂1(丙戊酸，如上所定义)使hIgG表达加倍。增强剂2(丙酸钠，如上所定义)单独不具有强作用，但与增强剂1组合，提供了相较于对照(既无增强剂1也无增强剂2)多到几乎3倍的hIgG。

图3展示概述根据一些实施例的瞬时转染系统中所用的各种增强剂1和增强剂2的作用的条形图。组分被调配成2种稳定增强剂溶液。表达增强剂1的加入使hIgG表达加倍(比较前两个条形)。增强剂2本身的加入仅展示对IgG增强表达的边际作用，但当与增强剂1组合加入时，相较于对照提供多到几乎3倍的hIgG(比较第三和第四)。

【实施例4：蛋白质表达结果】

本发明的瞬时表达系统可以产生在1g/L到约2g/L之间的人IgG和Cripto。本发明系统的瞬时表达系统展示出在与可商购的Freestyle^TM 293系统相比时在图4A到4D中所示的蛋白质的瞬时蛋白质表达方面在3.5×-11.8×之间的增加。图4展示使用根据一些实施例的高产量瞬时转染系统和现有技术瞬时转染系统(Freestyle^TM 293系统)的4种不同且独特蛋白质的表达水平的比较。图4A展示在与可商购的FreeStyle^TM Max系统相比时使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的人类IgG表达的大于5倍的增加。图4B展示在与可商购的FreeStyle^TM Max系统相比时使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的Cripto表达的大于5.2倍的增加。图4C展示在与可商购的FreeStyle^TM Max系统相比时使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的β2-肾上腺素受体表达的几乎4倍的增加。图4D展示在与可商购的FreeStyle^TM Max系统相比时使用根据本发明的一些实施例的瞬时转染系统的兔IgG表达的大于11倍的增加。

【实施例5：EPO表达、可按比例扩大性和再现性】

接下来，我们试图探讨使用具临床重要性的广泛使用的所表达蛋白质的瞬时转染系统的可按比例扩大性和再现性。使用本发明的瞬时转染系统(图式右侧上的条形)和Freestyle^TM 293系统(图式左侧上的条形)表达红血球生成素(EPO)。本发明系统可从1ml(呈24孔板形式)按比例扩大到1L(3L摇瓶形式)。在来自三个不同实验室的三个独立分析员的结果中可见极好的再现性。

【结论】

使用高产量瞬时转染系统实现两种不同蛋白质的1g/L表达。高密度培养基能够实现高密度转染。经由细胞系选择获得对瞬时蛋白质表达的显著改进。转染增强子以高细胞密度改进转染和表达。结果是非常可按比例扩大且可再现的。本发明的瞬时转染系统与Freestyle^TM293系统相比在蛋白质表达方面实现3.5倍-15倍增加。

本说明书中所提及的所有公开、专利和专利申请在此以全部引用的方式并入本说明书中，达到如同每一单独的公开、专利或专利申请被专门并且单独地指示以引用的方式并入本文中的相同程度。倘若有冲突，则将以本文说明书(包括定义)为准。对本申请中任何参考文献的引用或确认不应被解释为承认所述参考文献可用作本发明的现有技术。

Claims

1.一种在培养的真核细胞中产生重组蛋白的方法，所述方法包含：

在高密度培养基中获得包含细胞的悬浮培养物，所述悬浮培养物具有在约2×10⁶到约2×10⁷个细胞/毫升之间的细胞密度；

用包含可表达的核酸的表达载体转染所述细胞，所述表达载体含有能够产生所表达的蛋白质的基因序列；

将所述经转染的细胞孵育第一时间段；

使所述经转染的细胞与至少一种表达增强剂组合物接触；

将所述经转染的细胞在所述转染增强剂存在下孵育第二时间段，使得所述载体表达所述蛋白质；以及

在所述第二时间段之后收获所述经转染的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养的真核细胞是适宜于在高密度条件下生长的悬浮培养物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述悬浮培养物包含293细胞、293细胞的衍生物、293F细胞、293F细胞的衍生物、PER-C6细胞、PER-C6细胞的衍生物、CHO细胞、CHO细胞的衍生物、CapT细胞、CapT细胞的衍生物、COS细胞、COS细胞的衍生物、COS-7细胞、COS-7的衍生物、Sp2/0细胞或Sp2/0细胞的衍生物，其中所述细胞已适宜于在高密度条件下生长。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述悬浮培养物包含293F细胞的衍生物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述悬浮培养物的体积在约200μL到约5L范围内。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达组合物包含以下各者中的至少一者：丙戊酸(VPA，酸和钠盐)、丙酸钠、乙酸锂、二甲亚砜(DMSO)、包括半乳糖的糖、氨基酸混合物、或丁酸、或上述的任何组合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述表达组合物包含丙戊酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其中丙戊酸(VPA)的浓度在约0.20mM到约25mM范围内。

9.根据权利要求7所述的方法，其中丙戊酸浓度在以下范围内：约0.25mM到约24mM、约0.26mM到约23mM、0.27mM到约23mM、0.28mM到约23mM、0.29mM到约22mM、约0.30mM到约21mM、约0.31mM到约20mM、约0.32mM到约19mM、约0.33mM到约17mM、约0.34mM到约18mM、约0.35mM到约17mM、约0.36mM到约16mM、约0.37mM到约15mM、约0.40mM到约14mM、约0.41mM到约13mM、约0.42mM到约12mM、约0.43mM到约11mM、约0.44mM到约10mM、约0.45mM到约9mM、约0.46mM到约8mM、约0.47mM到约7mM、约0.48mM到约6mM、约0.49mM到约5mM、约0.50mM到约4mM、约0.50mM到约4mM、约0.55mM到约3mM、0.6mM到约2mM或0.75到约1.5mM、约0.15mM到约1.5mM、约0.16mM到约1.5mM、约0.17mM到约1.5mM、约0.18mM到约1.5mM、约0.19mM到约1.5mM、约0.20mM到约1.5mM、约0.25mM到约1.5mM、约0.30mM到约1.5mM、约0.40mM到约1.5mM、约0.50mM到约1.5mM、约0.60mM到约1.5mM、约0.70mM到约1.5mM、约0.80mM到约1.5mM、约0.90mM到约1.5mM或约0.10mM到约1.5mM。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述表达组合物包含丙酸钠。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述培养物中丙酸钠的最终浓度在约0.2mM到约100mM范围内。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述培养物中丙酸钠的最终浓度在以下范围内：约0.5到约80mM、约0.4mM到约70mM、约0.5mM到约60mM、约0.6mM到约50mM、约0.7mM到约40mM、约0.8mM到约30mM、约0.9mM到约20mM、约1mM到约15mM、约2mM到约10mM、约3mM到约9mM、约4mM到约8mM或约5mM到约7mM，在某些优选但非限制性的实施例中，NAPP的最佳最终浓度可能在以下范围内：约1mM到约10mM、约1mM到约2mM、约2mM到约3mM、约3mM到约4mM、约4mM到约5mM、约5mM到约6mM、约6mM到约7mM、约7mM到约8mM、约8mM到约9mM或约9mM到约10mM，在某些优选但非限制性的实施例中，NAPP的最佳最终浓度可能是约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM、约5mM、约5.5mM、约6mM、约6.5mM、约7mM、约7.5mM、约8mM、约8.5mM、约9mM、约9.5mM或约10mM。

13.根据权利要求6所述的方法，其中所述表达组合物包含乙酸锂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养物中LiAc的最终浓度在约0.25到约25mM范围内。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养物中LiAc的最终浓度在以下范围内：约0.26mM到约20mM、约0.27mM到约15mM、约0.28mM到约10mM、约0.29mM到约5mM、约0.3mM到约4.5mM、约0.31mM到约4mM、约0.35mM到约3mM、约0.5mM到约2.5mM、约1mM到约3mM、约1.5mM到约2.5mM或约2mM到约3mM。

16.根据权利要求6所述的方法，其中所述表达组合物包含丁酸。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述培养物中丁酸的最终浓度在以下范围内：约0.25到约25mM、约0.26mM到约20mM、约0.27mM到约15mM、约0.28mM到约10mM、约0.29mM到约5mM、约0.3mM到约4.5mM、约0.31mM到约4mM、约0.35mM到约3mM、约0.5mM到约2.5mM、约1mM到约3mM、约1.5mM到约2.5mM或约2mM到约3mM。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述悬浮培养物的体积在约25mLμl到约50L范围内。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述悬浮培养物的体积在约100mLμl到约1L范围内。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述悬浮培养物的体积在约200mLμl到约500mL范围内。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述转染步骤的细胞密度在约1×10⁶到约20×10⁶个细胞/毫升之间。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述转染步骤的细胞密度在约2×10⁶到约6×10⁶范围内。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达载体是pCDNA3.3的衍生物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述pCDNA3.3的衍生物包含WPRE元件。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达载体包含WPRE元件。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在所述转染步骤之后并不需要更换、补给或补充所述高密度培养基。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述高密度培养基在所述转染步骤之后并不经更换、补给或补充。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述高密度培养基是无血清/无蛋白质的化学成分确定的培养基，其能够促进经转染的细胞以超过2.5×10⁶个细胞/毫升的细胞密度以保持超过80％的细胞存活率生长。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述高密度培养基在所述转染步骤之后并不需要所述培养基的所述补充、更换或补给。

30.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在所述第二时间段之后收获所述经转染的细胞。

31.根据权利要求30所述的方法，其进一步包含纯化所述经表达的蛋白质。

32.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞表达一或多种表达增强性蛋白质。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述表达增强性蛋白质选自由以下组成的清单：AKT、P18、P21、Bcl-X_L和PKBa。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞瞬时表达一或多种表达增强性蛋白质。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞稳定表达一或多种表达增强性蛋白质。

36.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一时间段在以下范围内：约2小时到约4天、约3到约90小时、约4到约85小时、约5到约80小时、约6到约75小时、约7到约70小时、约8到约65小时、约9到约60小时、约10到约55小时、约11到约50小时、约12到约45小时、约13到约40小时、约14到约35小时、约15到30小时、约16到约24小时、约17到约24小时、约18到约24小时、约19到约24小时、约20到约24小时、约21到约24小时、约22到约24小时或约23到约24小时，在其它优选非限制性实施例中，第一时间段可能高达约15小时、高达约16小时、高达约17小时、高达约18小时、高达约19小时、高达约20小时、高达约21小时、高达约22小时、高达约23小时、高达约24小时、高达约25小时、高达约26小时、高达约27小时、高达约28小时、高达约29小时或高达约30小时。

37.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二时间段在以下范围内：约10小时到约10天、约2小时到5天、约2.5小时到4天、约3到约90小时、约4到约85小时、约5到约80小时、约6到约75小时、约7到约70小时、约8到约65小时、约9到约60小时、约10到约55小时、约11到约50小时、约12到约45小时、约13到约40小时、约14到约35小时、约15到30小时、约16到约24小时、约17到约24小时、约18到约24小时、约19到约24小时、约20到约24小时、约21到约24小时、约22到约24小时或约23到约24小时，在其它优选非限制性实施例中，第一时间段可能高达约15小时、高达约16小时、高达约17小时、高达约18小时、高达约19小时、高达约20小时、高达约21小时、高达约22小时、高达约23小时、高达约24小时、高达约25小时、高达约26小时、高达约27小时、高达约28小时、高达约29小时或高达约30小时。