KR20150063018A - 고밀도 성장 및 형질감염 배지 및 발현 인핸서의 독특한 페어링을 사용하는 포유동물 세포들 내의 고수율의 일시적 발현 - Google Patents

고밀도 성장 및 형질감염 배지 및 발현 인핸서의 독특한 페어링을 사용하는 포유동물 세포들 내의 고수율의 일시적 발현 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 거대분자들 및 화합물들 (예, 핵산 분자들)을 세포들 (예, 진핵 세포들) 내로 도입하는데 유용한 세포 배양 배지 (특히 무혈청의 비 동물 유도된, 및/또는 화학적으로 한정된 배지)에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 그러한 도입 단계는 상기 배지의 존재 하에 발생할 수 있다. 이어서, 그러한 도입된 물질들을 함유하는 세포들은 배지 내에서 배양될 수 있고, 도입된 물질들의 세포들에 대한 효과가 측정될 수 있거나 또는 결정될 수 있다. 특히, 본 발명은 핵산 분자들 (예, 벡터들)의 세포들 (특히 진핵 세포들) 내로의 도입 및 단백질 세포들 내의 핵산 분자들에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 허용한다. 본 발명은 상이한 절차가 세포들에 의해 수행될 때마다(예, 세포들을 배양시키는 것 대 세포들을 형질감염시키는 것) 세포 배양 배지를 변화시킬 필요를 제거한다. 본 발명은 또한 세포들을 배양 및 형질전환/형질감염시키는데 유용한 조성물들 및 키트들에 관한 것이다.

Description

고밀도 성장 및 형질감염 배지 및 발현 인핸서의 독특한 페어링을 사용하는 포유동물 세포들 내의 고수율의 일시적 발현 {HIGH YIELD TRANSIENT EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS USING UNIQUE PAIRING OF HIGH DENSITY GROWTH AND TRANSFECTION MEDIUM AND EXPRESSION ENHANCERS}
관련 출원들에 대한 교차참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2012년 5월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/641,864호의 우선권을 주장하며, 이는 본 출원에 의해 통상적으로 소유되고, 그의 전체 내용은 본원에 완전히 기재되는 것으로서 참고 문헌으로서 명확히 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 형질감염 및 세포 배양 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 배양된 포유동물 세포들 내의 재조합 단백질의 수율 발현에 적합한 형질감염 시스템을 제공한다. 본 발명은 또한 포유동물 세포들 내의 재조합 단백질의 고수율 발현을 위한 시스템들 및 방법들에 관한 것이다.
세포 배양 배지는 통제되는 인공적 및 시험관내 환경에서 세포들을 유지하고 성장시키는 데 필요한 영양분을 제공한다. 세포 배양 배지의 특성 및 제형들은 특정한 세포 요건들에 따라 변화한다. 중요한 파라미터들은 삼투압 농도, pH, 및 영양분 조성물을 포함한다.
세포 배양 배지 제형들은 문헌에 잘 기록되어 있고 다수의 배지는 상업적으로 입수할 수 있다. 초기 세포 배양 작업에서, 매질 제형들은 혈액의 화학적 조성 및 물리화학적 성질 (예를 들면, 삼투압 농도, pH, 등)에 기초하고, "생리적 용액"이라 지칭된다 (Ringer, S., J. Physiol. 3:380-393 (1880); Waymouth, C., In: Cells and Tissues in Culture, 1권, Academic Press, London, 99-142페이지 (1965); Waymouth, C., In Vitro 6:109-127 (1970)). 그러나, 포유 동물 신체의 다른 조직들 내의 세포들은 영양소, 비타민, 및 미량 원소들의 산소/이산화탄소 분압 및 농도에 관하여 상이한 미세환경에 노출되고; 따라서, 상이한 세포 유형들의 시험관내 배양의 성공은 상이한 배지 제형들을 필요로 할 수 있다. 세포 배양 배지의 전형적인 성분들은 아미노산, 유기 및 무기 염, 비타민, 미량의 금속, 당, 지질 및 핵산을 포함하고, 그의 유형 및 양은 주어진 세포 또는 조직 유형의 특정 요건들에 따라 달라질 수 있다.　
배지 제형들은 동물, 식물 및 박테리아 세포들을 포함하여 수많은 세포 유형들을 재배하기 위해 사용되어 왔다. 재배된 세포들은 유용한 생물학적 물질들의 생리적 과정들의 연구 및 생산을 포함하는 많은 용도를 갖는다. 그러한 유용한 생성물들의 예는 모노클로날 항체, 호르몬, 성장 인자, 효소 등을 포함한다. 그러한 생성물들은 많은 상업적 및 치료적 용도를 갖고, 재조합 DNA 기술의 출현에 의해, 세포들은 이들 생성물을 대량 생산할 수 있도록 조작될 수 있다. 배양된 세포들은 또한 벡터들 및/또는 백신들로서 사용될 수 있는 바이러스의 단리, 식별 및 성장을 위해 일상적으로 사용된다. 따라서, 세포들을 시험관내에서 재배하는 능력은 세포 생리학의 연구를 위해 중요할 뿐만 아니라, 그렇지 않으면 비용 효과적인 수단에 의해 수득될 수 없는 유용한 물질들의 생산을 위해서 필요하기도 하다.
시험관내 세포 배양 배지를 사용하여 성장하는 다양한 세포 유형들 중에서, 특히, 관심사는 상피로부터 유도된 세포들이다. 상피는 고등 생물의 장기 및 샘의 내부 및 외부 표면을 따라 줄지어 있다. 환경과 유기체 사이의 외부 계면 (예, 피부)에서 또는 장기와 간질 공간 사이의 내부 계면 (예, 장내 점막 라이닝)에서 이러한 국지화 때문에, 상피는 항상성의 유지에 있어서 중요한 역할을 한다. 상피는 예를 들면, 영양소와 폐기물의 수송 및 투과율을 조절함으로써 이러한 기능을 수행한다 (Freshney, R. I., in: Culture of Epithelial Cells, Freshney, R. I., 편집, New York: Wiley-Liss, 1-23페이지 (1992)).
상피를 구성하는 세포들은 일반적으로 상피 세포라 일컫는다. 이들 세포들은 피부에서와 같이 다중 층들 내에 또는 폐 폐포에서와 같이 단일 층 내에 존재할 수 있다. 예상할 수 있듯이, 상피 세포들의 구조, 기능 및 생리학은 종종 조직-특이적이다. 예를 들면, 피부의 표피 상피 세포들은 층화된 편평상피 상피로서 조직되고 주로 유기체를 위한 보호 배리어를 형성하는데 관여하는 한편, 많은 샘들의 분비성 상피 세포들은 분비성 단백질 및 당단백질을 생산하는데 중요한 역할을 하는 입방형 세포들의 단일 층들 내에서 종종 발견된다. 그러나, 그들의 위치 또는 기능과 무관하게, 상피 세포들은 일반적으로 재생된다. 즉, 정상적인 조건 하에, 또는 부상 또는 다른 활성화 자극에 반응하여, 상피 세포들은 분할되거나 또는 성장할 수 있다. 이러한 재생 능력은 다양한 일차 상피 세포들 및 세포주들이 시험관내에서 성공적으로 재배되는 시점까지 상피 세포들의 시험관내 조작을 촉진해 왔다(Freshney, Id.).　
다양한 상피 세포들 및 상피 세포주들의 단리 및 사용이 문헌에 보고되어 있지만, 상피 형태학을 나타내는 인간 배아 신장 세포주들 293 ("293 세포들")은 외인성 리간드 수용체의 발현, 바이러스의 생산 및 동종이계 및 이종발생성 재조합 단백질 발현의 연구에 특히 유용한 것으로 입증되었다. 예를 들면, 미국 특허 제5,166,066호는 후보 향정신성 약물의 식별 및 선별에 유용한 것으로 입증된 벤조디아제핀 결합 부위를 포함하는 기능성 GABA 수용체를 포함하는 안정한 293 세포주의 작제를 기재하고 있다. 293 세포들은 또한 천연 및 재조합 아데노바이러스와 같은 바이러스를 생산하는 데 사용되었고 (Garnier, A., 등, Cytotechnol. 15:145-155 (1994); Bout, A., 등, Cancer Gene Therapy 3(6):S24, abs. P-52 (1996); Wang, J.-W., 등, Cancer Gene Therapy 3(6):S24, abs. P-53 (1996)), 이는 백신 생산 또는 재조합 단백질 발현을 위한 백신 생산 또는 아데노바이러스 벡터의 작제를 위해 사용될 수 있다. 마지막으로, 293 세포들은 다양한 재조합 인간 단백질의 대규모 생산에 유용한 것으로 입증되었다 (Berg, D. T., 등, BioTechniques 14(6):972-978 (1993); Peshwa, M. V., 등, Biotechnol. Bioeng. 41:179-187 (1993); Garnier, A., 등, Cytotechnol. 15:145-155 (1994)).
막연히 섬유아세포들이라 칭하는 세포들은 많은 상이한 조직으로부터 단리되어 왔고, 결합 조직 세포들인 것으로 이해된다. 그것은 배아 및 성인 조직에서 세포 라인, 느슨하게 불리는 섬유 모세포 세포를 육성하기 위해 명확하게 할 수 있다. 배아 및 성체 조직으로부터 막연히 섬유아세포 세포들이라 칭하는 세포주들을 재배하는 것이 명백히 가능하다. 섬유아세포들은 특징적으로 "스핀들" 외관을 가지고 있다. 섬유아세포-유사 세포들은 섬유아세포 세포들의 전형적인 형태적 특성을 갖는다. 광학 현미경 하에서 세포들은 이들이 배양 용기의 표면 상에서 단일층으로서 성장될 때 뾰족하게 신장되는 ("스핀들 형상") 것으로 보인다. 세포주들은 콜라겐, 타입 I과 같은 적절한 마커에 의한 확인 후 섬유아세포 또는 섬유아세포-유사물로서 간주될 수 있다 ((Freshney, R. I., in: 배양 of Epithelial Cells, Freshney, R. I., ed., New York: Wiley-Liss, 1-23페이지 (1987)).　
CHO 세포들은 차이니즈 햄스터 난소로부터 유도된 상피 및 섬유아세포 세포들 모두로서 분류되고 있다. 차이니즈 햄스터 난소로부터 시작된 세포주 (CHO-K1) (Kao, F.-T. 및 Puck, T. T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1275-1281 (1968)는 여러 해 동안 배양액 중에 사용되어 왔지만 그의 동일성은 여전히 확인되지 않았다.
대부분의 일차 포유동물 상피 세포들, 포유동물 섬유아세포 세포들, 상피 세포주들, 및 섬유아세포 세포주들은 전형적으로 단일층 배양액 중에서 성장한다. 그러나, 몇몇 용도들에 대해, 현탁 배양물과 같은 세포들을 재배하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 현탁 배양물은 3차원 공간에서 성장한다. 그러나, 유사한 크기의 용기들 내의 단일층 배양물은 유일하게 용기 표면 상에서 이차원으로 성장할 수 있다. 따라서, 현탁 배양물은 단일층 배양물과 비교하여 더 높은 세포 수율, 및 상응하게, 더 높은 수율의 생물제제 (예를 들면, 바이러스, 재조합 폴리펩타이드, 등)을 초래할 수 있다. 또한, 현탁 배양물은 종종 단일층 배양물에 의해 필요한 경우의 트립신화 및 원심분리보다 배양 용기로의 신선한 배양 배지 (희석 계대 배양)의 간단한 부가를 통해 공급 및 확장하기에 더 용이하다. 공급의 용이성 및 현탁 배양물이 확장될 수 있는 용이성은 상당한 수의 세포들을 처리하기 위해 시간 및 노동에 있어서 실질적인 절감을 나타낸다.
그러나, 많은 정박-의존적 세포들, 예컨대 일차 상피 세포들, 일차 섬유아세포 세포들, 상피 세포주들, 및 섬유아세포 세포주들은 현탁 배양에 쉽게 적응된다. 그들은 최적의 성장을 위해 기판에 대한 정박에 일반적으로 의존하기 때문에, 현탁액 중의 이들 세포들의 성장은 라텍스 또는 콜라겐 비드와 같은 마이크로담체에 대한 그의 부착을 요구할 수 있다. 따라서, 이러한 방식으로 성장한 세포들은 전통적 단일층 배양물보다 더 높은 밀도로 배양될 수 있지만, 여전히 표면에 기술적으로 부착되어야 하고; 따라서, 이들 세포들의 계대 배양은 단일층 배양물의 계대 배양을 위해 사용된 것들과 유사한 단계들을 필요로 한다. 더욱이, 대규모 배치 또는 발효조 배양이 확립될 때, 대량의 마이크로담체가 종종 배양 용기의 바닥에 정착되고, 그에 따라 세포들에 대한 전단 손상 없이 마이크로담체 (및 따라서, 세포들)를 현탁 중에 유지하는 더욱 복잡한 진탕 메커니즘을 필요로 한다 (Peshwa, M. V., 등, Biotechnol. Bioeng. 41:179-187 (1993)).
많은 형질전환된 세포들이 현탁액 중에서 성장할 수 있지만(Freshney, R. I., 배양 of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, New York: Alan R. Liss, Inc., 123-125페이지 (1983)), 성공적인 현탁 배양물은 종종 상대적으로 높은 단백질 배지 또는 혈청 또는 혈청 성분들 (예컨대, 부착 인자 파이브로넥틴 및/또는 비트로넥틴)을 갖는 배지의 보충, 또는 정교한 관류 배양 제어 시스템 (Kyung, Y.-S., 등, Cytotechnol. 14:183-190 (1994))을 필요로 하고, 이는 불리할 수 있다. 또한, 현탁액 중에서 성장한 많은 상피 세포들은 성공적인 계대 배양을 간섭할 수 있고, 배양물에 의한 생물 제제의 성장률 및 생산을 감소시킬 수 있는 응집물 또는 "덩어리"를 형성한다. 응집이 발생하면, 배지에 노출된 전반적인 세포의 표면적이 감소하고 세포들은 영양이 결핍되고 폐기물을 배지 내로 효율적으로 교환할 수 없다. 결과적으로, 성장이 느려지고, 감소된 세포 밀도가 수득되고, 단백질 발현이 절충된다.
전형적으로, 세포 배양 배지 제형은 소 태아 혈청 (FBS) (5-20% v/v) 또는 동물의 배아, 기관 또는 샘으로부터의 추출물 (0.5-10% v/v)과 같은 정의되지 않은 성분들을 포함하여 일정 범위의 첨가제로 보충된다. FBS가 동물 세포 배양 배지 중의 가장 통상적으로 적용된 보충물이지만, 신생 송아지, 말 및 인간을 포함하는 다른 혈청 공급원들이 또한 일상적으로 사용된다. 배양 배지의 보충을 위한 추출물들을 제조하기 위해 사용되어 온 기관 또는 샘은 턱밑샘 (Cohen, S., J. Biol. Chem. 237:1555-1565 (1961)), 뇌하수체 (Peehl, D. M., 및 Ham, R. G., In Vitro 16:516-525 (1980); 미국 특허 제4,673,649호), 시상하부 (Maciag, T., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5674-5678 (1979); Gilchrest, B. A., 등, J. 세포 Physiol. 120:377-383 (1984)), 안구 망막 (Barretault, D., 등, Differentiation 18:29-42 (1981)) 및 뇌 (Maciag, T., 등, Science 211:1452-1454 (1981))를 포함한다. 이들 유형의 화학적으로 정의되지 않은 보충물은 세포 배양 배지에서 여러 가지 유용한 기능을 한다 (Lambert, K. J. 등, In: Animal Cell Biotechnology, 1권, Spier, R. E. 등, Eds., Academic Press New York, 85-122페이지 (1985)). 예를 들면, 이들 보충물은 불안정한 또는 수불용성 영양소에 대한 담체 또는 킬레이트를 제공하고; 독성 모이어티를 결합시키고 중화시키며; 호르몬 및 성장 인자, 프로테아제 억제제 및 필수적이고 종종 확인되지 않거나 또는 정의되지 않은 저분자 영양소를 제공하고; 세포들을 물리적 스트레스와 손상으로부터 보호한다. 따라서, 혈청 또는 장기/샘 추출물은 동물 세포들의 배양을 위한 최적의 배양 배지를 제공하기 위해 비교적 낮은 단가의 보충물로서 통상적으로 사용된다.　
불행하게도, 조직 배양 용도에서 혈청 또는 장기/샘 추출물의 사용은 여러 가지 결점을 갖는다 (Lambert, K. J. 등, In: Animal Cell Biotechnology, 1권, Spier, R. E. 등, Eds., Academic Press New York, 85-122페이지 (1985)). 예를 들면, 이들 보충물 및 혈청의 화학적 조성은 단일 제조업자로부터조차 할당물들 사이에서 변화한다. 보충물은 또한 배양 세포들의 건강 및 최종 생성물의 품질을 심각하게 약화시킬 수 있는 감염 인자 (예를 들면, 마이코플라스마 및 바이러스)에 의해 오염될 수 있다. 혈청 또는 동물 추출물과 같은 지정되지 않은 성분들의 사용은 또한 배양된 세포들의 영양 및 호르몬 요건의 진정한 정의 및 설명을 방지하고, 따라서 배양액 중의 세포 성장 및 분화에 대한 특정 성장 인자 또는 영양소의 영향을 제어된 방식으로 연구하는 능력을 제거한다. 게다가, 한정되지 않은 보충물은 연구자가 배양된 세포들에서 비정상적인 성장 및 분화 및 질환-관련된 변화를 연구하는 것을 방지한다. 마지막으로 및 생물학적 물질의 공업적 생산에서 세포 배양 배지를 사용하는 것들에 대해 가장 중요하게, 배양 배지의 혈청 및 장기/샘 추출물 보충은 혈청 또는 추출물 단백질의 비특이적 공통-정제로 인해 배양 배지로부터 원하는 물질의 정제 단가를 복잡하게 하고 증가시킬 수 있다.
혈청이 보충된 배지에서 성장한 세포들에서 나타난 발현 수준에 상대적으로 개선된 수준의 재조합 단백질 발현이 무혈청 배지에서 성장한 세포들로부터 수득된다 (Battista, P. J. 등, Am. Biotech. Lab. 12:64-68 (1994)). 그러나, 무혈청 배지는 알부민, 페투인, 다양한 호르몬 및 다른 단백질을 포함하여 다양한 동물-유도된 성분들 중의 하나 이상을 여전히 함유할 수 있다. 단백질 또는 펩타이드의 존재는 재조합 단백질의 정제를 어렵고, 시간 소비적이고, 고가로 만든다.
혈청 또는 장기/샘 추출물의 사용의 이들 결점을 극복하기 위해, 수많은 소위 "한정된" 배지가 개발되어 왔다. 단일 세포 유형의 배양을 지원하기 위해 종종 특이적으로 제형된 이들 배지는 어떤 한정되지 않은 보충물도 함유하지 않고, 대신에 혈청 또는 추출 보충물에 의해 통상적으로 제공되는 한정된 양의 정제된 성장 인자, 단백질, 지질 단백질 및 다른 물질을 혼입한다. 그러한 배양 배지 내의 성분들 (및 그의 농도)는 정확하게 공지되어 있기 때문에, 이들 배지는 일반적으로 "한정된 배양 배지"라 지칭된다. 때때로 "한정된 배양 배지"와 상호 교환적으로 사용되는 것은 용어 "무혈청 배지" 또는 "SFM"이다. 수많은 SFM 제형, 예컨대 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif로부터 입수할 수 있는 내피 세포들, 각질 세포들, 단핵구/대식세포들, 림프구, 조혈 줄기세포들, 섬유아세포들, 연골세포들 또는 간세포들의 배양을 지원하도록 고안된 것들을 상업적으로 입수할 수 있다. 그러나, SFM과 한정된 배지 사이의 구별은 SFM이 혈청 및 단백질 분획 (예를 들면, 혈청 알부민)이 결여되어 있지만, 반드시 다른 한정되지 않은 성분들, 예컨대 장기/샘 추출물로 구성될 필요는 배지라는 것이다. 사실상, 보고되어 있거나 또는 상업적으로 입수할 수 있는 여러 SFM은 각질 세포들의 시험관 내 배양에서 지원되는 여러 제형들을 포함하여 그러한 한정되지 않은 성분들을 함유한다 (Boyce, S. T., 및 Ham, R. G., J. Invest. Dermatol. 81:33 (1983); Wille, J. J., 등, J. Cell. Physiol. 121:31 (1984); Pittelkow, M. R., 및 Scott, R. E., Mayo Clin. Proc. 61:771 (1986); Pirisi, L., 등, J. Virol. 61:1061 (1987); Shipley, G. D., 및 Pittelkow, M. R., Arch. DermatoL 123:1541 (1987); Shipley, G. D., 등, J. Cell. Physiol. 138:511-518 (1989); Daley, J. P., 등, FOCUS (GIBCO/LTI) 12:68 (1990); 미국 특허 제4,673,649호 및 제4,940,666호). 따라서, SFM은 용어의 진정한 정의에 있어서 한정된 배지인 것으로 간주될 수 없다.
한정된 배지는 일반적으로 여러 가지 뚜렷한 장점을 사용자에게 제공한다. 예를 들면, 한정된 배지의 사용은 세포 생리학에 대한 특이적 성장 인자 또는 다른 배지 성분의 효과의 조사를 촉진하고, 이는 세포들이 혈청- 또는 추출물-함유 배지에서 재배될 때 감추어질 수 있다. 또한, 한정된 배지는 전형적으로 혈청 또는 추출물을 함유하는 것들보다 훨씬 더 적은 양의 단백질 (사실상, 한정된 배지 종종 "저 단백질 배지"라 칭함)을 함유하고, 한정된 배지에서 배양된 세포들에 의해 생산된 생물학적 물질들의 정제를 훨씬 더 간단하고 덜 비싸게 만든다.
본질적으로 비타민, 아미노산, 유기 및 무기 염 및 완충제로 구성된 일부 극히 간단한 한정된 배지는 세포 배양을 위해 사용되어 왔다. 그러나, 그러한 배지 (종종 소위 "기저 배지"라 칭함)는 일반적으로 대부분의 동물 세포들에 의해 요구되는 영양 성분이 심각하게 결핍되어 있다. 따라서, 대부분의 한정된 배지는 상기 배지를 영양학적으로 더 복잡하게 하지만, 배지의 무혈청 및 낮은 단백질 함량을 유지하도록 기본 배지 추가의 성분들 내로 혼입된다. 그러한 성분들의 예는 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 인간 혈청 알부민 (HSA); 천연 (동물) 또는 재조합 공급원, 예컨대 표피 성장 인자 (EGF) 또는 섬유아세포 성장 인자 (FGF)로부터 유도된 특정 성장 인자들; 지질, 예컨대 지방산, 스테롤 및 인지질; 지질 유도체 및 착물, 예컨대 포스포에탄올아민, 에탄올아민 및 지질단백질; 단백질 및 스테로이드 호르몬, 예컨대 인슐린, 하이드로코르티손 및 프로게스테론; 뉴클레오타이드 전구체; 및 특정 미량 원소를 포함한다 (Waymouth, C.에 의해, Cell 배양 Methods for Molecular and Cell Biology, 1권: Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrata for Serum-Free Animal Cell Culture, Barnes, D. W., 등, eds., New York: Alan R. Liss, Inc., 23-68 (1984)페이지에서, 및 Gospodarowicz, D.에 의해, Id., 69-86페이지 (1984)에서 검토됨).
그러나, 세포 배양 배지 중의 동물 단백질 보충물의 사용은 또한 특정 결점을 갖는다. 예를 들면, 특히 보충물이 배양되어야 할 세포들의 공급원과 상이한 동물로부터 유도되는 경우에, 배양 배지 및/또는 이로부터 정제된 생성물은 면역원성일 수 있는 위험이 있다, 치료제로서 사용되어야 하는 생물학적 물질이 그러한 배양 배지로부터 정제되는 경우, 특정량의 이들 면역원성 단백질 또는 펩타이드가 공동-정제될 수 있고, 그러한 치료를 받는 동물에서 아나필락시스를 포함하는 면역학적 반응을 포함할 수 있다.
이러한 잠재적인 문제를 사전에 제거하기 위해, 배양되어야 할 세포들과 동일한 종들로부터 유도된 보충물이 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간 세포들의 배양은 보충물로서 HSA를 사용하여 촉진될 수 있는 한편, 소 세포들의 배양을 위한 배지는 대신에 BSA를 사용할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은 배양 배지 내로 오염물 및 우발적인 병원체 (예컨대, HSA 제제로부터 크로이펠츠-야콥병 (CJD), 또는 BSA 제제로부터 소 해면상 뇌병증 ("광우병") 프리온)를 도입할 위험을 실행하고, 이는 동물 및 인간 치료제의 제조에서 그러한 배지의 사용에 명백하게 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 사실상, 그러한 안전성의 이유로, 생명공학 산업 및 정부 기관들은 그러한 병원체를 함유할 수 있는 동물-유도된 단백질을 함유하는 세포 배양 배지의 사용을 점점 더 규제하고, 막고 심지어 금지하고 있다.
SFM에서 동물 단백질의 사용의 한계를 극복하기 위해, 동물 단백질이 완전히 없는 동물 세포 배양 배지를 작제하기 위한 여러 가지 시도들이 이루어져 왔다. 예를 들면, 일부 배양 배지는 효모 세포들의 추출물을 기본 배지 (예를 들면, U.K. 특허 출원 제GB 901673호; Keay, L., Biotechnol. Bioengin. 17:745-764 (1975) 참조)내로 혼입하여 질소 및 다른 필수 영양소의 공급원을 제공한다. 또 하나의 접근법에서, 밀 글루텐의 가수분해물은 동물 세포들의 시험관 내 성장을 촉진시키기 위해 효모 추출물의 부가와 함께 또는 부가 없이 사용되어 왔다 (일본국 특허 출원 제JP 2-49579호). 혈청이 육류, 또는 단백질 예컨대, α-락트알부민 또는 카세인 (예를 들면, 펩톤)의 효소 소화에 의해 대체되는 또 다른 배지가 개발되어 왔으며, 이는 전통적으로 박테리아 배양에 사용되고 있다 (Lasfargues, E. Y., 등, In Vitro 8(6):494-500 (1973); Keay, L., Biotechnol. Bioeng. 17:745-764 (1975); Keay, L., Biotechnol. Bioeng. 19:399-411 (1977); Schlager, E.-J., J. Immunol. Meth. 194:191-199 (1996)). 그러나, 이들 접근법 중 어느 것도 다양한 동물 세포들의 재배를 위한 최적의 배양 배지를 제공하지 못하였다. 게다가, 밀, 보리, 호밀 및 귀리를 포함하는 특정 식물들로부터의 추출물은 동물 세포들로부터 유도된 무세포들 시스템에서 단백질 합성을 억제하는 것으로 나타나고 있고 (Coleman, W. H., 및 Roberts, W. K., Biochim. Biophys. Acta 696:239-244 (1982)), 이는 세포 배양 배지 중의 이들 식물들로부터 유도된 펩타이드의 사용이 동물 세포들의 시험관 내 성장을 자극하기보다는 오히려 실질적으로 억제할 수 있음을 시사한다. 더욱 최근에, 벼의 펩타이드를 포함하는 동물 세포 배양 SFM 제형이 기재되고 있고, 다양한 정상적인 형질전환된 동물 세포들의 배양에 유용한 것으로 밝혀지고 있다 (본원에 참고 문헌으로서 그의 전문으로 인용된 미국 특허 제6,103,529호 참조).
세포 배양 배지에 동물 유도된 보충물을 부가함으로써 제기되는 잠재적인 어려움에도 불구하고, 그러한 보충물은 일상적으로 사용되고 있다. 한정된 배지에 빈번하게 부가되는 하나의 그러한 보충물은 트랜스페린이다. 트랜스페린은 철분을 세포들로 생체 내 전달하는 기능을 한다. 포유동물 세포들에 의한 철분 흡수의 메커니즘이 검토되어 왔다 (Qian, Z. M. 및 Tang, P. L. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1269, 205-214). 철분이 에너지 발생 및 산화적 호흡을 포함하는 수많은 대사 과정에서 보조 인자로서 요구되는 경우, 무혈청 배지는 대부분의 세포들의 성공적인 시험관내 배양을 위해 필수적인 철분을 전달하기 위해 트랜스페린에 의해 보충된다. 트랜스페린의 제조에서 다양한 잠재적인 외래 물질에 대한 우려는 트랜스페린에 대한 대체물로서 사용될 수 있는 다른 천연 철분 담체 화합물에 대한 검색을 자극했다. 이러한 검색은 천연 철분 담체가 종종 혈청으로부터 유도되고, 그에 따라 혈청 보충제의 상기 한계에 적용되어 있다는 사실에 의해 복잡해진다.
천연적으로 유도된 금속 담체를 사용하는 한계를 극복하기 위해, 특정 금속 결합 화합물이 금속, 특히 아연, 철, 망간 및 마그네슘을 배양된 세포들에 공급하는데 사용하기 위해 탐색되고 있다. 단순한 담체, 예컨대 킬레이트제 (예, EDTA) 및 특정 산 또는 그의 염 (예를 들면, 시트레이트, 피콜리네이트, 및 벤조산 또는 하이드록삼산의 유도체)은 특정 무혈청 성장 배지에서 유용한 것으로 밝혀지고 있다 (미국 특허 제5,045,454호 및 제5,118,513호; Testa 등, Brit. J. Haematol. 60:491-502, (1985); Ganeshaguru 등, Biochem. Pharmacol. 29:1275-1279 (1980); White 등, Blood 48:923-929 (1976) 참조).　
이들 참조 문헌이 일부 금속 담체를 기재하더라도, 그 데이타의 해석은 여러 가지 실험 인자들에 의해 복잡해진다. 데이타는 제한된 수의 세포주들로부터 수집되었고, 단일 계대의 결과를 보여준다. 또한, 배지는 혈청으로 보충되었다. 혈청은 본질적으로 트랜스페린 및 다른 잠재적인 철분 담체를 함유한다. 혈청 또는 트랜스페린의 부재 하에 심지어 1회 또는 2회의 계대 배양 후 혈청-보충된 배지 내에서 배양된 세포들의 성장에 대한 "이월 효과"가 있다 (예를 들면, Keenan, J. and Clynes, M. (1996) In Vitro Cell Dev. Biol-Animal 32, 451-453 참조). 다른 공지된 금속 결합 화합물은 신체로부터 철분을 전달하기 위해서가 아니라 제거하기 위해 의학적으로 사용되고 있다. 불행하게도, 많은 이들 단순한 철 킬레이트 화합물은 배양된 세포들에 충분한 철분 이용가능성을 제공하지 않거나, 또는 그 세포들에 의해 흡수되지 않는다.
일단 특정한 세포 유형들의 성장을 위해 적합한 배지 제형이 결정되면, 원하는 생물학적 물질의 생산을 최적화할 수 있도록 문제의 세포를 변경시키는 것이 빈번하게 필요하다. 생물학적 물질의 효과적인 생산 및 정제에서 중요한 단계는 하나 이상의 거대분자 (예를 들면, 펩타이드, 단백질, 핵산, 등)의 세포 내로의 도입이고, 여기서 물질이 생산될 것이다. 이는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 거대분자를 세포 내로 도입하기 위한 하나의 널리 사용되는 방법은 형질감염으로서 공지되어 있다.
전형적으로, 표적 세포들은 세포의 성장을 위해 최적화된 세포 배양 배지 내에서 원하는 세포 밀도까지 성장된다. 일단 원하는 밀도가 도달되면, 상기 배지는 형질감염 공정을 위해 최적화된 배지에 대해 교환된다. 대부분의 상황 하에, 형질감염을 위해 사용된 배지는 세포들의 성장을 지원하지 않지만, 형질감염 배지는 단지 핵산을 세포들 내로 도입할 목적으로 사용된다. 결과적으로, 그 공정은 일반적으로 통상적으로 원심분리에 의해 배양액으로부터 세포들을 수집하는 단계, 미량의 성장 배지를 제거하기 위해 세포들을 세척하는 단계, 관심있는 거대분자의 존재 하에 형질감염 배지 내에서 세포들을 현탁시키는 단계, 거대분자의 흡수를 위해 충분한 기간 동안 형질감염 배지 내에서 세포들을 인큐베이션시키는 단계, 임의로, 형질감염 배지를 제거하고 세포들로부터 형질감염 배지의 나머지를 세척하는 단계 및 이어서 형질감염된 세포들을 성장 배지 내에 재현탁시키는 단계를 필요로 한다. 형질감염 배지를 위해 성장 배지를 교환하는 단계, 세포들을 세척하는 단계, 및 성장 배지에 대해 형질감염 배지를 다시 교환하는 단계는 세포들의 많은 체험형 조작을 필요로 하고 그렇게 함으로써 재조합 DNA 기술의 시간 및 비용에 실질적으로 부가된다.
역사적인 예로서, 293 세포들은 복합 배지 (즉, DMEM)의 혈청-보충된 버전의 단일층 배양물 중에 재배되고 있다. 현탁액 중에서 성장할 때, 293 세포들은 세포들의 큰 클러스터 내로 응집되는 경향을 갖는다. 이들 대세포들 응집물의 형성은 세포들의 생존률을 감소시킨다. 응집물의 중심의 세포들은 배지로 직접적으로 노출되지 않기 때문에, 이들 세포들은 배지 내의 영양소에 대한 제한된 접근성을 갖고, 배지 내로 폐기물을 교환하는데 있어서 어려움을 갖는다. 또한, 배지에 대한 이러한 감소된 접근은 클러스터 내의 세포들을 배지 내로 도입된 인자들에 의해 유전자 조작을 위해 (즉, 핵산에 의한 형질전환을 위해) 부적합하게 만든다. 이들 어려움의 결과로서, 293 세포들은 일반적으로 생물학적 물질의 생산을 위해 현탁 배양물 내에서 사용되지 않는다.
따라서, 현탁액 중에서 진핵 세포들의 성장을 허용하면서 감소된 양의 조작에 의한 세포들의 형질감염을 허용하는 세포 배지 및 일시적 형질감염 시스템에 대한 필요성이 당업계에 여전히 남아있다. 그러한 배지는 바람직하게는 포유동물 세포들의 고밀도로의 성장을 촉진시키고/시키거나 재조합 단백질의 발현 수준을 증가시키고, 세포 군집을 감소시키고, 동물 단백질, 예컨대 혈청, 트랜스페린, 인슐린 등에 의한 보충을 필요로 하지 않는 무혈청 및/또는 화학적으로 한정된 및/또는 무단백질 배지 및/또는 동물 유도된 물질이 결여된 배지여야 한다. 바람직하게는, 이러한 유형의 배지는 상피 세포들 및 섬유아세포 세포들, 예컨대 293 세포들 및 CHO 세포들을 포함하여 통상적으로 정착-의존적인 포유동물 세포들의 현탁 배양을 허용할 것이다. 바람직하게는, 그러한 배지는 또한 상기 언급된 세포 유형들의 재배 및 배양을 전형적으로 현재 이용가능한 배지에 의해 수득된 것보다 더 높은 밀도에서 가능하게 할 수 있다. 추가로, 그러한 배양 배지는 생명공학 산업에서 배양된 포유동물 세포들에 의해 생산된 많은 양의 상업적으로 또는 과학적으로 중요한 생물학적 물질 (예를 들면, 바이러스, 재조합 단백질, 생물제제, 재조합 항체, 등)의 더욱 용이하고 비용-효과적이고 효율적인 생산 및 정제를 허용할 것이고, 포유동물 세포들의 재배를 사용하는 방법들에서 더욱 일관된 결과를 제공할 것이다. 이들 요구 및 다른 요구는 본 발명에 의해 충족된다.
요약
본 발명은 세포 배양 및 형질감염 시스템을 제공하고, 그것에 의하여 상기 시스템은 형질감염에 의한 도입 및 하나 이상의 거대분자 (예컨대, 예를 들면, 발현성 핵산)의 배양액 중의 복수의 진핵 세포들 내로의 후속 발현을 지원하고, 추가로 도입/형질감염에 후속하는 세포들의 재배 및 성장을 지원하고, 여기서 적어도 하나의 세포의 성장은 신선한 배지가 보충되고 있는 배지의 부재하에 배지 중에서 계속된다.
일부 구현예에서, 세포들의 존재로부터 세포의 도입/형질감염 동안 사용된 배지를 그의 추가의 성장을 지원하도록 제거하거나, 보급하거나 또는 대체할 필요가 없다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 도입/형질감염 후, 세포들의 성장 및 발현성 핵산으로부터 발현된 단백질의 생산은 도입/형질감염이 발생된 배지의 부피와 거의 동일한 부피 내지 그의 약 10배 이하인 배지의 부피에서 달성될 수 있다. 본 발명의 배지를 사용함으로써, 누군가 핵산을 세포들 내로 도입한 후, 및 핵산이 도입된 세포들이 핵산을 발현하도록 추가로 배양되기 전에 배지를 보급하거나, 대체하거나 또는 보충할 필요가 없다.
일시적 발현은 신속한 포유동물 단백질 생산을 위한 선택 시스템이 급속히 되고 있다. 일시적 형질감염의 유연성은 당면한 단백질에 대한 개념으로부터 신속한 시현을 가능케하고, 많은 상이한 단백질이 동시에, 또는 연속으로 생산될 수 있다. 일시적 형질감염 기술에서 다음의 중요한 진전은 일시적 포맷의 속도 및 유연성을 상실함이 없이 안정한 발현 시스템을 사용하여 달성된 발현 수준에 접근하거나 또는 동등해지는 것이다. 본 발명자들은 세포들이 형질감염된 후 7일 내에 > 1g/L (약 2 g/L까지)의 인간 IgG 및 비-IgG 단백질의 발현 수준을 생성하기 위해 고밀도 293F 세포 배양을 이용하는 신규한 일시적 형질감염 시스템의 개발을 최초로 보고하였다.
그러한 높은 수준의 단백질 발현을 달성하기 위해, 그러한 배지 내의 고밀도 성장을 위해 적응된 현탁 세포들의 모집단과 조합하여 새로운 고밀도 성장 배양 배지를 포함하는 신규한 세포 배양 시스템은 포유동물 세포들의 특정 모집단이 20 x106 세포들/ml (더욱 전형적으로 최대 약 15x106 세포들/ml)까지의 생존가능한 세포 밀도에 도달하게 허용하도록 개발되었다. 이들 초고밀도 배양은 전통적 프로토콜보다 더 높은 세포 밀도로 형질감염을 가능케하고, 단백질의 부피 측정 수율을 현저히 증가시킨다. 형질감염 후 또는 그동안 하나 이상의 발현 인핸서 제형의 부가는 또한 현재 상업적으로 입수할 수 있는 일시적 형질감염 시스템에 의해 보여진 발현 수준보다 10-배 내지 12-배 더 큰 수준까지 단백질 발현 수준을 부양하는 것으로 밝혀졌다. 포유동물 세포들의 부모 현탁 배양물은 고밀도 배양 조건 하에 개선된 성장 및 생존률 특성을 위해 적응되었고, 이어서 증가된 단백질 생산을 위해 추가로 선택되었다. 결과의 고밀도 적응된 세포들은 부모 세포주에 비교하여 증가된 성장률, 증가된 세포 크기, 및 증가된 특정 생산성을 갖는다. 마지막으로, 상기 형질감염 방법은 전체적인 단백질 수율을 추가로 증가시키기 위해 하나 이상의 발현 인핸서 제형과 조합하여 사용되는 하나 이상의 형질감염 시약의 사용을 통해 최적화되었다.
모든 이들 개선이 단일 발현 시스템에 조합되었을 때, 단백질 수준은 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM 293 발현 시스템에 비교하여 IgG 및 비-IgG 재조합 단백질 모두에 대해 10배까지 증가되었고, >1g/L의 발현 수준이 다중 단백질에 대해 달성되었다. 추가로, 단백질 기능성은 인기있고 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM 293 시스템에 비교할 때 본 발명의 고수율 발현 시스템에서 발현된 여러 단백질들에 필적하는 것으로 입증되었다. 이들 결과는 함께 기능성 단백질 수율의 현저한 증가가 단백질 발현 기술에서 수많은 진보를 포맷을 사용하기 용이한 단일 기술에 혼입하는 새로운 일시적 포유동물 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있음을 지시한다.
본 발명 또한 다음: 즉. (a) 세포들을 본 발명의 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포들을 배양액 내의 상기 세포들의 배양을 지원하기에 적합한 조건 하에 유지하는 단계; 및 (c) 임의로 단백질 생성물을 형성하도록 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는, 진핵 세포들을 재배하는 방법을 제공한다.
본 발명 또한 하나 이상의 거대분자를 배양물 중의 적어도 하나의 진핵 세포들 내로 도입하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음: 즉, (a) 배양액 중의 청구항 1의 배지 내에서 적어도 하나의 진핵 세포를 배양하는 단계; (b) 하나 이상의 적어도 하나의 거대분자를 적어도 하나의 세포 내에 도입되도록 유발하기에 충분한 조건 하에 적어도 하나의 거대분자를 배양액 내로 도입하는 단계; 및 (c) 그의 생산이 적어도 하나의 분자에 의해 조절되는 생성물을 생산하도록 배지 내에서 적어도 하나의 세포를 재배하는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 세포의 성장은 신선한 배지로 되고 있는 배지의 부재 하에 상기 배지 내에서 계속되고, 여기서 적어도 하나의 세포들의 성장을 지원하는 적어도 하나의 세포의 존재로부터 도입하는 동안 사용된 배지를 제거할 필요가 없고/없거나 여기서 도입 후, 성장은 도입이 발생한 배지의 부피와 동일한 부피 내지 그 부피의 약 10배 이하까지인 배지의 부피로 재배가 달성된다.
본 발명 또한 세포들의 시험관 내 배양 및 형질감염을 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 본 발명의 세포 배양 배지를 포함하고, 및 임의로 다음: 즉, 적어도 하나의 분자를 세포 내로 도입하기 위한 하나 이상의 시약, 하나 이상의 거대분자, 적어도 하나의 세포, 및 배양액 내에서 적어도 하나의 세포를 배양하고/하거나 적어도 하나의 거대분자를 베양액 중의 적어도 하나의 세포 내로 도입하기 위한 설명서 중의 하나 이상을 추가로 포함한다.
본 발명 또한 본 발명의 세포 배양 배지 및 적어도 하나의 진핵 세포, 적어도 하나의 거대분자를 적어도 하나의 세포 내로 도입하기 위한 하나 이상의 시약, 및 하나 이상의 거대분자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예들은 하기의 도면 및 발명의 설명, 및 특허 청구의 범위에 비추어 당업자에게 분명할 것이다.
본 발명은 본원에서 단지 예로써, 수반되는 도면들을 참조하여 기재된다. 이하 특히 도면들을 상세히 참조함으로써, 도시된 특정한 것들은 예로써 및 단지 본 발명의 바람직한 구현예들의 예시적인 논의의 목적을 위한 것이고, 본 발명의 원리 및 개념적 측면의 가장 유용하고 용이하게 이해되는 설명으로 간주되는 것을 제공하는 원인으로 제공되는 것이 강조된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 것보다 더 상세히 본 발명의 구조적 세부 사항들을 보여주기 위한 어떠한 시도도 이루어지지 않았다.
도면에서:
도 1은 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 달성될 수 있는 세포 밀도를 나타내는 그래프이다. 고밀도 성장을 위해 적응된 세포는 3 계대에 걸쳐 다양한 배지 내로 서서히 적응되었다. 세포들이 적응된 배지는 본 발명의 일 구현예에 따른 고밀도 배양 배지 (닫힌 원), 시험 배지 1 (닫힌 삼각형), 시험 배지 2 (열린 삼각형), 시험 배지 3 (열린 다이아몬드)를 포함한다. 세포들은 30 ml 플라스크에 시딩되기 전에 각각의 배지 내에서 다중 계대 배양을 위해 0.2 x 106 세포들/ml로 배양되었다. 세포 밀도 및 생존률은 8 일에 걸쳐 모니터링되었다;
도 2는 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템에 의해 사용하기 위한 세포주 발현 최적화를 개략하는 막대 그래프이다. 부모 293F 세포주는 고밀도 배양 배지 내로 순차로 적응되는 다중 계대 배양물 내로 슬릿되었다. 이어서, 고밀도로 성장될 수 있는 다양한 계대 배양물이 재조합 시험 단백질 (인간 IgG)을 발현하는 그의 능력에 대해 선택되고 평가되었다. 고수율로 적응된 293F 세포들 (우측 막대 세트)로 표시된 세포들의 부분 배양물이 동일한 부모 293F 세포주로부터 유도된 세포들의 2 개의 상이한 계대 배양물보다 35% 내지 45% 더 재조합 IgG를 발현하다;
도 3은 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템에 사용된 다양한 인핸서의 효과를 개략하는 막대 그래프이다. 발현 인핸서는 단백질 생산을 현저히 개선시키는 것으로 확인되었다. 성분들은 2개의 안정한 인핸서 용액 내로 제형되었다. 발현 인핸서 1의 부가는 hIgG 발현 (첫번째 2개의 막대 비교)에 배가되었다. 인핸서 2의 부가는 그것만으로 IgG의 발현을 증진시키는 것에 대한 유일한 한계 효과를 보여주지만, 인핸서 1과 조합하여 부가될 때, 대조군에 비해 거의 3배 더 hIgG를 제공한다 (제3 및 제4 막대 비교);
도 4는 일부 구현예들에 따른 고수율 일시적 형질감염 시스템 및 선행기술의 일시적 형질감염 시스템 (FreestyleTM 293 시스템)을 사용하여 4개의 상이하고 독특한 단백질에 대한 발현 수준의 비교를 보여준다. 도 4a는 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM Max 시스템에 비교할 때 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 인간 IgG의 발현에 있어서 5배 더 큰 증가를 보인다. 도 4b는 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM Max 시스템에 비교할 때 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 Cripto의 발현에 있어서 5.2배 더 큰 증가를 보인다. 도 4c는 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM Max 시스템에 비교할 때 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 β2-아드레날린 수용체의 발현에 있어서 4배 더 큰 증가를 보인다. 도 4d는 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM Max 시스템에 비교할 때 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 토끼 IgG의 발현에 있어서 11배 더 큰 증가를 보인다;
도 5는 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템 및 선행기술의 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 달성된 EPO의 발현 수준을 비교하는 막대 그래프이다. EPO는 본 발명의 일시적 발현 시스템 및 FreestyleTM 293 시스템을 사용하여 발현되었다. 본 발명의 시스템은 1ml (24-웰 플레이트 포맷)으로부터 1L (3L 진탕 플라스크 포맷)까지 확장될 수 있다. 특정 단백질의 발현 수준에서 신뢰할 수 있는 재현성이 3개의 상이한 실험실에서 3개의 개별 분석으로부터의 결과에 나타났다.
바람직한 구현예의 상세한 설명
본 발명은 진핵 및 원핵 세포들 모두의 성장을 위한 개선된 배지 제형을 제공한다. 본 발명의 배지는 세포 성장, 거대 분자의 배양물 중의 세포들 내로의 도입 및 성장, 도입 및/또는 재배 사이의 배지를 보급하거나, 대체하거나, 보충하거나 또는 변화시킬 필요 없이 세포 재배를 지원한다. 본 발명의 배지는 임의의 세포의 성장 및 배양을 지원하거나 또는 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 대체물로서 사용될 수 있거나 또는 하나 이상의 원하지 않는 성분, 예를 들면, 동물 유도된 성분들을 대체하기 위한 화합물을 제공한다. 상기 대체 화합물은 원하지 않는 성분의 적어도 하나의 원하는 기능을 제공한다.
정의
이어지는 설명에서, 세포 배양 및 재조합 DNA 기술에 사용된 수많은 용어들은 광범위하게 이용된다. 그러한 용어들이 주어지는 범위를 포함하여 명세서 및 특허 청구의 범위의 분명하고 더 일치된 이해를 제공하기 위해, 하기의 정의가 제공된다.
거대분자 또는 화합물의 배양물 내로의 "도입"이라는 용어는 거대분자 또는 화합물의 배양 배지 내로의 제공을 지칭한다.
거대분자 또는 화합물의 적어도 하나의 세포 내로의 "도입"이라는 용어는 거대분자 또는 화합물의 세포들로의 제공을 지칭하고, 그에 따라 거대분자 또는 화합물은 세포 내에서 내면화된다. 예를 들면, 거대분자 또는 화합물은 형질감염, 형질전환, 주사, 및/또는 리포좀 도입을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있고, 또한 당업자에게 공지된 다른 방법들을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 거대분자 또는 화합물은 리포좀 도입에 의해 세포 내로 도입된다. 상기 거대분자는 바람직하게는 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 핵산이다. 상기 거대분자는 단백질일 수 있다. 대안으로, 상기 거대분자는 펩타이드일 수 있다. 대안으로, 상기 거대분자는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 거대분자는 또한 핵산일 수 있다.
본원에 사용된 바의 용어 "거대분자"는 생체분자를 포함한다. 일 구현예에서, 용어 거대분자는 핵산을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 용어 거대분자는 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 지칭한다. 더 바람직하게는, 용어 거대분자는 DNA를 지칭한다. 더 바람직하게는, 용어 거대분자는 상보적 DNA (cDNA)를 지칭한다. 거대분자는 충전될 수 있거나 또는 충전되지 않을 수 있다. DNA 분자는 충전된 거대분자의 예이다.　일부 예들에서, 본원에 사용된 바의 용어 "거대분자"는 용어 "발현성 핵산"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "형질감염"은 본원에서 핵산, 단백질 또는 기타 거대분자의 표적 세포들로의 전달을 의미하도록 사용됨으로써, 상기 핵산, 단백질 또는 기타 거대분자가 발현되거나 또는 세포 내에서 생물학적 기능을 갖는다.
본원에 사용된 바의 용어 "발현성 핵산"은 분자량에 관계 없이 DNA 및 RNA 모두를 포함하고, 용어 "발현"은 제한 없이, 일시적 발현 및 안정한 발현 모두를 포함하는 세포 내에서 핵산의 기능성 존재의 임의의 징후를 의미한다. 기능성 측면은 올리고뉴클레오타이드에 의한 발현의 억제 또는 단백질 전달을 포함한다.
용어 "핵산의 발현" 및 그의 등가물은 핵산의 세포들 내의 복제, DNA의 메신저 RNA로의 전사, RNA의 단백질로의 번역, 단백질의 번역후 변형, 및/또는 세포들, 또는 이들의 변종들 또는 조합물들 내의 단백질 이동조절을 지칭한다.　
용어 "성분"은 화학적 기원 또는 생물학적 기원 여부와 무관하게, 세포들의 성장 또는 증식을 유지하거나 또는 촉진시키기 위해 세포 배양 배지에서 사용될 수 있는 임의의 화합물을 지칭한다. 용어들 "성분," "영양소" 및 "성분"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 모두 그러한 화합물을 지칭하는 것을 의미한다. 세포 배양 배지에 사용된 전형적인 성분은 아미노산, 염, 금속, 당, 지질, 핵산, 호르몬, 비타민, 지방산, 단백질 등을 포함한다. 세포들의 생체외 재배를 촉진하거나 또는 유지하는 다른 성분들은 특정 요구에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명의 배지는 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 인간 혈청 알부민 (HSA), 천연 (동물) 또는 재조합 공급원으로부터 유도된 하나 이상의 성장 인자, 예컨대 표피 성장 인자 (EGF) 또는 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 하나 이상의 지질, 예컨대 지방산, 스테롤 및 인지질, 하나 이상의 지질 유도체 및 착물, 예컨대 포스포에탄올아민, 에탄올아민 및 지질단백질, 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 및 스테로이드 호르몬, 예컨대 인슐린, 하이드로코르티손 및 프로게스테론, 하나 이상의 뉴클레오타이드 전구체; 및 하나 이상의 미량 원소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분들을 포함할 수　있다.
본원에 사용된 바의 용어 "세포"는 모든 유형의 진핵 및 원핵세포들을 포함하는 것을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 이 용어는 진핵 세포들, 특히 포유동물 세포들을 지칭한다.　특정한 예시적인 비제한적인 구현예들에서, 용어 "세포"는 인간 293 세포들, 또는 그의 변이체, 예컨대, 예를 들면, 현탁액 중에서 성장할 수 있는 293 변이체를 지칭하는 것을 의미한다. 특히 바람직한 것은 현탁 배양물 중에서 성장하고, 증식되고, 형질감염될 수 있는 293 세포들의 변이체, 특히 고밀도로 (예를 들면, 약 2x106 세포들/ml 초과, 더 바람직하게는 약 3x106 세포들/ml 초과, 또는 심지어 임의로 약 4x106 세포들/ml 초과) 배양될 수 있는 변이체들이다. 그러한 변이체 293 세포주의 예는 EXPI293TM F세포들이다. 다른 예시적인 비제한적인 구현예들에서, 용어 "세포"는 CHO 세포를 지칭하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "고밀도"는 본 발명에 따라 세포들을 배양하는 맥락에서 사용될 때, 및 형질감염 작업 흐름을 수행할 목적으로 동일물을 사용하는 본 발명의 방법의 맥락에서, 일반적으로 약 1x106 세포들/ml 초과, 더 바람직하게는 약 2x106 세포들/ml 초과, 가장 바람직하게는 약 3x106 세포들/ml 초과, 또는 심지어 임의로 약 4x106 세포들/ml 초과, 또는 더 바람직하게는 약 20x106 세포들/ml 까지의 밀도로 적절한 세포 배양 배지 내에서 성장될 수 있거나 또는 배양될 수 있는 공지된 세포주들, 또는 공지된 세포주들의 변이체를 지칭하는 한편, 여전히 형질감염되어야 하는 능력을 높은 효율로 유지하고 표적 단백질을 높은 수준 (예를 들면, 200 ㎍/ml 내지 약 1 mg/ml 또는 그 이상을 초과하는 수준)으로 발현할 수 있다.
어구 "고밀도 배양 배지"는 본원에서 포유동물 세포들, 바람직하게는 현탁액 중에서 성장하는 세포들의 성장을 약 2x107 세포들/ml까지의 밀도로 유지할 수 있는 한편, 상기 세포들의 생존률을 약 80%를 초과하여 유지하고 및 또한, 상기 현탁 세포들의 효율적으로 형질감염되어야 하고 다량의 재조합 단백질을 발현시키는 능력을 유지할 수 있는 임의의 배양 배지를 지칭하도록 사용된다. 본 발명의 실시에 사용된 "고밀도 배양 배지"는 상이한 적용과 용도 사이에서 달라질 수 있고, 사용 중인 세포주의 특성, 일시적으로 발현되고 있는 원하는 단백질, 발현 벡터의 세포들 내로의 전이를 위해 선택된 형질감염 양상의 특성, 및 아래 기재되는 바의 시스템에 부가된 임의의 발현 인핸서의 양 및 특성에 의존할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 일시적 발현 시스템 및 방법에 사용하도록 고려된 바람직한 "고밀도 배양 배지"는 전형적으로 무혈청, 무단백질일 것이고, 현탁 세포들의 배양 및 성장을 약 2x107 세포들/ml까지의, 더욱 전형적으로 약 2x106 세포들/ml 내지 약 1x107 세포들/ml의 밀도로 허용하고, 추가로 일시적 발현 시스템에서 생산된 단백질의 수율을 세포 배양물의 적어도 200 ㎍/mL 내지 세포 배양물의 2 mg/mL, 더욱 전형적으로 세포 배양물의 약 500 ㎍/ml 내지 세포 배양물의 약 1 mg/mL를 초과하게 할 것이다. 이상적으로, 본 발명에 따라 사용된 고밀도 배양 배지는 세포들의 형질감염을 약 1x106 내지 약 20x106 세포들/ml, 약 2x106 내지 약 2x106 세포들/ml, 또는 약 2.5x106 내지 약 6x106 세포들/ml 범위의 밀도로 촉진할 것이다. 본 발명의 실시에 사용하기 적합한 예시적인 고밀도 배양 배지는 HuMEC 기본 무혈청 배지, KNOCKOUTTM CTSTM XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPROTM-34 SFM 배지, STEMPROTM NSC 배지, ESSENTIALTM-8 배지, 배지 254, 배지, 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO®FREESTYLETM 293 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 106, 배지 200PRF, 배지 131, ESSENTIALTM-6 배지, STEMPROTM-34 배지, Gibco® 성상 세포 배지, AIM V® 배지 CTSTM AMINOMAXTM C-100 기본 배지, AMINOMAXTM-II 완전 배지, CD FORTICHOTM 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO®REESTYLETM CHO 발현 배지, CD OPTICHOTM 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900TM 배지, EXPI293TM 발현 배지, LHC 기본 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER. C6® Cell 배지, AIM V® 배지, EXPILIFE® 배지, 각질 세포-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 그의 임의의 유도체 또는 변형을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 고밀도 배양 배지는 CD FORTICHOTM 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO® FREESTYLETM CHO 발현 배지, CD OPTICHOTM 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, GIBCO® FREESTYLETM 293 발현 배지, EXPI293TM 발현 배지, 또는 동일한 배지, 또는 그의 변형된 버전일 수 있다. 상기 열거된 예시적인 고밀도 배양 배지는 CHO 세포들, CHO 세포 변이체, 293 세포들, 293 세포 변이체, CapT 세포들, CapT 세포 변이체, 또는 고밀도 배양 시스템에서 사용하도록 적응된 임의의 다른 세포들의 고밀도 성장, 증식, 형질감염 및 유지에 특히 적합할 수 있다.
어구 "고밀도 배양을 위해 적응된 세포들"은 세포 생존률을 약 80%에서 또는 그를 초과하여 유지하면서 고밀도 배양 배지에서 고밀도로 성장하도록 적응되고 있는 세포 계통 또는 동일한 부모 세포 계통으로부터 유도된 세포들의 (비클론) 모집단을 지칭하도록 의미한다. 그러한 세포들은 세포들을 >40, >50, >60, >70, 또는 >80 순차적인 계대를 초과하는 고밀도로 유지하고 성장 배지의 비율을 원하는 고밀도 배양 배지로 점진적으로 대체함으로써 세포들의 부모 모집단으로부터 단리되거나 또는 선택될 수 있다. 선택적으로, 그 과정 동안, 세포들의 상이한 푸울은 개별적으로 전파될 수 있고 선택 공정에 적용되면서 동시에 형질감염 효율 및 또는 단백질 발현 효율을 평가함으로써, 세포들의 비클론 모집단은 고밀도로 지속되고 성장되고, 높은 효율로 형질감염되고, 높은 수준의 원하는 재조합 단백질을 발현할 수 있도록 선택될 수 있다. 다양한 세포 유형들 및 계통이 이러한 선택 공정에 적용될 수 있음이 당업자에게 쉽게 명백할 것이지만, CHO 세포들로부터 유도된 세포 계통, 293 섬유아세포 세포들로부터 유도된 세포 계통, 및 CapT 세포들로부터 유도된 세포들이 고밀도 성장 조건에 적응되도록 하는 선택 공정에 특히 순응하는 것으로 결정되고 있다. 이상적으로, 고밀도 성장 배양에 적응되고 본 발명에 사용하도록 순응된 세포들은 또한 높은 효율로 형질감염될 수 있고/있거나 재조합 단백질을 세포 배양액의 적어도 약 200 ㎍/mL 내지 세포 배양액의 약 2 mg/mL, 더욱 전형적으로 세포 배양액의 약 500 ㎍/ml 내지 세포 배양액의 약 1 mg/mL를 초과하는 수율로 발현할 수 있다. 이상적으로, 본 발명에 따라 사용된 고밀도 배양을 위해 적응된 세포들은 약 1x106 내지 약 20x106 세포들/ml, 약 2x106 내지 약 2 x106 세포들/ml, 또는 약 2.5x106 내지 약 6 x106 세포들/ml 범위의 밀도로 지속되고 형질감염될 수 있다.
"세포 배양" 또는 "배양"은 인공적인 시험관 내 환경에서 세포들의 유지를 의미한다.
"재배"는 성장 및/또는 분화 및/또는 계속된 생존률을 선호하는 조건 하에 세포들의 시험관 내 유지를 의미한다. "재배"는 "세포 배양"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 재배는 생존 가능한 세포들/ml 배양 배지의 수로 평가된다. 거대분자의 도입 후 배양은 바람직하게는 생성물, 예를 들면, 바이러스 상의 단백질 생성물의 생산을 포함한다.
본원에 사용되는 바의 용어 "보급하거나, 대체하거나, 또는 보충하는 배지"는 일정 부피의 신선한 세포 배양 배지를 배양 중에 이미 존재하는 배지에 부가하는 것 및/또는 배양 중에 이미 존재하는 배지를 신선한 배지로 대체하는 것, 및/또는 배양 중에 이미 존재하는 배지를 새로운 배지로 보충하는 것을 지칭한다. 신선한 배지는 적어도 하나의 세포 내로 도입되어야 할 하나 이상의 거대분자 또는 화합물을 함유하지 않는 배지 또는 재배할 때 그들의 성장을 지원하도록 세포들과 접촉하지 않는 배지이다. 당업자는 당업계에 공지된 기술, 예컨대 세포들 카운팅 (매뉴얼 또는 자동화된), 트립판 블루 배지, 단백질 또는 기타 물질의 생산, 알라마르 블루 검정, 하나 이상의 대사성 생성물의 존재 또는 농도, 세포 부착, 형태적 외관, 소비된 배지의 분석, 등에 의해 세포 성장 및/또는 생존률을 모니터링함으로써 배지를 제거 및/또는 보급, 대체 또는 보충할 필요성 및 그로부터의 이점이 존재하는지 여부를 결정할 수 있다. 모니터링 기술들 중의 하나 또는 그의 조합은 배지가 적어도 하나의 거대분자의 성장, 도입 및/또는 적어도 하나의 거대분자의 도입 후의 배양을 지원하기 위해 필요한지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
"재조합 단백질"은 숙주 세포 내로 도입되는 핵산에 의해 인코딩되는 단백질을 지칭한다. 상기 숙주 세포는 핵산을 발현한다. 용어 "핵산을 발현하는"은 "핵산에 의해 인코딩된 RNA로부터 단백질을 발현하는"과 동의어이다. 본원에 사용된 바의 "단백질"은 광범위하게 중합된 아미노산, 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 지질단백질, 당단백질, 등을 지칭한다.
용어 "단백질 수율"은 배양된 세포들에 의해 발현된 단백질의 양을 지칭하고, 예를 들면, 생산된 단백질의 그램/ml 배지의 관점에서 측정될 수 있다. 단백질이 상기 세포들에 의해 분비되지 않는 경우, 상기 단백질은 당업자들에게 공지된 방법들에 의해 세포들의 내부로부터 단리될 수 있다. 단백질이 상기 세포들에 의해 분비되는 경우, 상기 단백질은 당업자들에게 공지된 방법들에 의해 배양 배지로부터 단리될 수 있다. 상기 세포에 의해 발현된 단백질의 양은 당업자들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 단백질은 재조합 단백질일 수 있다.
"단백질 생성물"은 단백질에 의한 생산 또는 작용과 연관된 생성물이다. 단백질 생성물은 단백질일 수 있다. 단백질 생성물은 또한 생성물을 생산하기 위해 하나 이상의 다른 물질에 의해 단백질의 작용으로부터 초래되는 생성물일 수 있다. 그러한 작용의 예는 단백질에 의한 효소 작용이다.
"현탁 배양"은 배양 용기 내의 세포들의 대부분 또는 전부가 현탁액 중에 존재하고, 배양 용기 내의 세포들의 소수가 용기의 표면 또는 용기 내의 또 하나의 표면에 부착되거나 또는 부착되는 세포가 전혀 없는 세포 배양을 의미한다. 바람직하게는, "현탁 배양"은 배양 용기 상의 또는 그 내부의 표면에 부착되지 않고 현탁액 중에 존재하는 배양 용기 내의 세포들의 75% 이상을 갖고, 더 바람직하게는, "현탁 배양"은 배양 용기 상의 또는 그 내부의 표면에 부착되지 않고 현탁액 중에 존재하는 배양 용기 내의 세포들의 85% 이상을 가지며. 더욱 더 바람직한 것은 배양 용기 상의 또는 그 내부의 표면에 부착되지 않고 현탁액 중에 존재하는 배양 용기 내의 세포들의 95% 이상을 갖는 "현탁 배양"이다.
본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 세포들의 단일층 또는 현탁 배양, 형질감염, 및 배양을 위해서, 및 단일층 또는 현탁 배양에서 세포들 내의 단백질의 발현을 위해 적합하다. 바람직하게는, 본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 세포들의 현탁 배양, 형질감염, 및 배양을 위해서, 및 현탁 배양물 중의 세포들 내의 단백질 생성물의 발현을 위한 것이다.
"배양 용기"는 세포들을 배양하기 위한 무균성 환경을 제공할 수 있는 임의의 용기, 예를 들면, 유리, 플라스틱, 또는 금속 용기를 의미한다.
어구 "세포 배양 배지," "조직 배양 배지," "배양 배지" (각각의 경우에 복수의 "배지") 및 "배지 제형"은 세포들 또는 조직들을 재배하기 위한 영양 용액을 지칭한다. 이들 어구는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.　
용어 "조합하는"은 성분들의 배합 또는 혼합을 지칭한다.
분자의 유도체는 염기 분자를 포함하지만, 추가의 기 또는 변형된 측면기를 갖는 일부 화합물을 포함한다. 바람직하게는, "유도체"는 상기 염기 분자를 단지 1개, 그러나 가능하게는 2, 3, 4, 5, 6개 등의 반응물 분자와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 단일 단계 반응이 바람직하지만, 다단계, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6개 등의 반응은 유도체를 형성하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 치환, 축합 및 가수분해 반응은 바람직하고, 유도체 화합물을 형성하도록 조합될 수 있다. 대안으로, 유도체 화합물은 바람직하게는 1인 화합물일 수 있지만, 가능하게는 2, 3, 4, 5, 6개 등의 반응은 염기 화합물 또는 그에 대한 치환 또는 축합 생성물을 형성할 수 있다.
세포 배양 배지는 수많은 성분들로 구성되어 있고 이들 성분은 배지에서 배지로 변화할 수 있다. 세포 배양 배지에 사용된 각각의 성분은 그의 독특한 물리적 및 화학적 특성을 갖는다. 재료의 호환성 및 안정성은 수용액 중의 성분들의 "용해도" 에 의해 부분적으로 결정된다. 용어들 "용해도" 및 "가용성"은 다른 성분들과 함께 용액 내에서 하나의 성분을 형성하고 유지하는 능력을 지칭한다. 따라서, 성분들은 이들이 측정 가능하거나 또는 검출 가능한 침전물을 형성하지 않고 용액 내에 유지될 수 있는 경우에 호환될 수 있다.
"호환성 성분"은 또한 용액 내에 함께 유지될 수 있고 "안정한" 조합물을 형성하는 배지 성분들을 의미한다. "호환성 성분"을 함유하는 용액은 성분들이 실질적으로 침전되지 않거나, 저하되지 않거나 또는 분해되지 않음으로써 상기 배지로부터 세포들에 대해 이용될 수 있는 성분들 중의 하나 이상의 농도가 세포들의 최적의 또는 원하는 성장을 더 이상 지원하지 않는 수준으로 감소될 때 "안정한" 것이라고 한다. 성분들은 또한 분해가 검출될 수 없는 경우 또는 분해가 1X 세포 배양 배지 제형 내의 동일한 성분의 분해에 비하여 느린 속도로 발생할 때 "안정한" 것으로 고려된다. 예를 들면, 1X 배지 제형 내에서 글루타민은 피롤리돈 카복실산 및 암모니아 내로 분해되는 것으로 공지되어 있다. 2가 양이온과 조합된 글루타민은 용액 중에서 또는 글루타민 및 2가 양이온 모두가 존재하는 조합물에서 시간이 경과함에 따라 글루타민의 분해가 거의 또는 전해 검출될 수 없기 때문에 "호환성 성분"인 것으로 고려된다. 미국 특허 제5,474,931호 참조. 따라서, 본원에 사용된 바의 용어 "호환성 성분"은 농축된 또는 1X 제형으로서 용액 중에 혼합될 때 "안정한" 및 "가용성"인 특정한 배양 배지 성분의 조합을 지칭한다.
용어 "1X 제형"은 세포 배양 배지에서 발견된 일부 또는 모든 성분을 작업 농도로 함유하는 임의의 수용액을 지칭하는 것을 의미한다. "1X 제형"은 예를 들면, 세포 배양 배지 또는 그 배지에 대한 성분의 임의의 하위 그룹을 지칭한다. 1X 용액 중의 하나의 성분의 농도는 세포들을 시험관내에서 유지하거나 또는 재배하기 위해 사용된 세포 배양 제형에서 발견된 성분의 농도와 거의 동일하다. 세포들의 시험관 내 배양을 위해 사용된 세포 배양 배지는 정의에 의해 1X 제형이다. 수많은 성분이 존재할 때, 1X 제형 내의 각각의 성분은 세포 배양 동안 배지 내의 각각의 성분의 농도와 거의 동일한 농도를 갖는다. 예를 들면, RPMI-1640 배양 배지는 다른 성분들 중에서, 0.2 g/L L-아르기닌, 0.05 g/L L-아스파라긴, 및 0.02 g/L L-아스파르트산을 함유한다. 이들 아미노산의 "1X 제형"은 용액 중에 거의 동일한 농도의 이들 성분을 함유한다. 따라서, "1X 제형"을 지칭할 때, 용액 중의 각각의 성분은 기재되고 있는 세포 배양 배지에서 발견되는 것과 동일하거나 또는 거의 동일한 농도를 갖도록 의도된다. 세포 배양 배지의 1X 제형 내의 성분들의 농도는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Allen R. Liss, N.Y. (1984), Handbook of Microbiological Media, 제2판, Ronald M. Atlas, ed. Lawrence C. Parks (1997) CRC Press, Boca Raton, Fla. and Plant Culture Media, 제1권: Formulations and Uses E. F. George, D. J. M. Puttock, and H. J. George (1987) Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA13 4QG England를 참조하며, 이들 각각은 본원에 참고 문헌으로서 그의 전문으로 인용된다. 그러나, 삼투압 농도 및/또는 pH는 특히 더 적은 성분이 1X 제형에 함유되어 있을 때 배양 배지에 비교하여 1X 제형에서 다를 수 있다.
"10X 제형"은 그 용액 내의 각각의 성분의 농도가 세포 배양 중인 배지 내의 각각의 성분의 농도보다 10배 더 큰 용액을 지칭하는 것을 의미한다. 예를 들면, RPMI-1640 배양 배지의 10X 제형은 다른 성분들 중에서 2.0 g/L L-아르기닌, 0.5 g/L L-아스파라긴, 및 0.2 g/L L-아스파르트산을 함유한다 (상기 1X 제형과 비교). "10X 제형"은 수많은 추가 성분은 1X 배양 제형에서 발견되는 것의 10배의 농도로 함유할 수 있다. 금세 확연해지듯이, "25X 제형", "50X 제형", "100X 제형", "500X 제형" 및 "1000X 제형"은 1X 세포 배양 제형에 비교한 바 각각 성분들을 약 25-, 50-, 100-, 500-, 또는 1000-배 농도로 함유하는 용액을 지정한다. 다시, 배지 제형 및 농축된 용액의 삼투압 농도 및 pH는 달라질 수 있다.　
용어 "미량 원소" 또는 "미량 원소 모이어티"는 배양 배지 내에 존재하는 다른 모이어티 또는 성분들의 양 또는 농도에 상대적으로 단지 아주 낮은 (즉, "미량") 양 또는 농도로 세포 배양 배지 내에 존재하는 모이어티를 지칭한다. 본 발명에서, 이들 용어는 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Cu1+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Ge4+, Se4+, Br-, I-, Mn2+, F-, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+ 및 그의 염을 포함한다. 예를 들면, 하기 염들은 본 발명의 배양 배지 내에서 미량 원소로서 사용될 수 있다: AgNO3, AlCl3ㆍ6H2O, Ba(C2H3O2)2, CdSO4ㆍ8H2O, CoCl2ㆍ6H2O, Cr2(SO4)3ㆍ1H2O, GeO2, Na2SeO3, H2SeO3, KBr, KI, MnCl2ㆍ4H2O, NaF, Na2SiO3ㆍ9H2O, NaVO3, (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, NiSO4ㆍ6H2O, RbCl, SnCl2, 및 ZrOCl2ㆍ8H2O. 미량 원소 모이어티의 적합한 농도는 당업자에 의하여 단지 일상적인 실험을 사용하여 결정될 수 있다.　
용어 "아미노산"은 아미노산 또는 그의 유도체 (예를 들면, 아미노산 유사체) 뿐만 아니라 그의 D- 및 L-형태를 지칭한다. 그러한 아미노산의 예는 글리신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-시스테인, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-라이신, L-류신, L-글루타민, L-아르기닌, L-메티오닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, 및 L-발린, N-아세틸 시스테인을 포함한다.
"화학적으로 한정된" 배지는 각각의 화학적 종들 및 그의 각각의 양이 세포들을 배양하는데 있어서 그의 사용 전에 공지되는 것이다. 화학적 한정 배지는 그의 화학적 종들이 공지되지 않고/않거나 정량화되는 용해물 또는 가수분해물 없이 이루어진다. 화학적 한정 배지는 본 발명의 배지의 하나의 바람직한 구현예이다.　
용어들 "무혈청 배양 조건" 및 "무혈청 조건"은 임의의 유형의 혈청을 배제하는 세포 배양 조건을 지칭한다. 이들 용어는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"무혈청 배지" (때때로 "SFM 배지"라 칭함)는 어떠한 혈청 (예를 들면, 소 태아 혈청 (FBS), 송아지 혈청, 말 혈청, 염소 혈청, 인간 혈청, 등)도 함유하지 않고 일반적으로 문자 SFM에 의해 지정되는 배지이다. 당업자에게 친숙한 예시적인 비제한적 무혈청 배지는 HuMEC 기본 무혈청 배지, KNOCKOUTTM (CTSTM XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPROTM-34 SFM 배지, STEMPROTM NSC 배지, ESSENTIALTM-8 배지, 배지 254, 배지, 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO®FREESTYLETM 293 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 106, 배지 200PRF, 배지 131, ESSENTIALTM-6 배지, STEMPROTM-34 배지, Gibco® 성상 세포 배지, AIM V® 배지 CTSTM AMINOMAXTM C-100 기본 배지, AMINOMAXTM-II 완전 배지, CD FORTICHOTM 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO®REESTYLETM CHO 발현 배지, CD OPTICHOTM 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900TM 배지, EXPI293TM 발현 배지, LHC 기본 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER. C6® Cell 배지, AIM V® 배지, EXPILIFE® 배지, 각질 세포-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 그의 임의의 유도체 또는 변형을 포함한다.
어구 "무단백질" 배양 배지는 어떠한 단백질도 함유하지 않는 배양 배지 (예를 들면, 무혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민 또는 부착 인자, 영양 단백질, 예컨대 성장 인자, 또는 금속 이온 담체 단백질, 예컨대 트랜스페린, 세룰로플라스민, 등)를 지칭한다. 바람직하게는, 펩타이드가 존재하는 경우, 상기 펩타이드는 더 작은 펩타이드, 예를 들면, 디- 또는 트리-펩타이드이다. 바람직하게는, 데카-펩타이드 길이 또는 그 이상의 펩타이드는 무단백질 배지에 존재하는 아미노산의 약 1% 미만, 더 바람직하게는 약 0.1% 미만, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 0.01% 미만이다.
본원에 사용된 바의 어구 "저-단백질"은 단지 적은 양의 단백질 (전형적으로 5-10% 혈청으로 보충된 표준 기본 배지 등의 단백질 표준양을 함유하는 배양 배지에서 발견되는 전체 단백질의 양 또는 농도의 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만)을 함유하는 배지를 지칭한다.
본원에 사용된 바의 용어 "동물 유도된" 물질은 재조합 동물 DNA 또는 재조합 동물 단백질 DNA를 포함하는 동물 공급원으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유도된 물질을 지칭한다. 바람직한 배지는 어떤 동물의 원하는 물질도 함유하지 않는다.
용어 "발현 인핸서"는 일반적으로 현재 기재된 구현예들에 따라 배양 배지 제형을 보충하기 위해 사용된 하나 이상의 액체 (바람직하게는 수성) 첨가물을 지칭하고, 상기 첨가물은 현재 기재된 구현예들에 따라 일시적 단백질 발현 시스템에서 생산된 발현된 단백질의 수율을 개선하기 위해 선택되고 있다. 상기 용어는 세포 주기 진행에 영향을 미치거나, 아폽토시스를 억제하거나, 세포 성장을 늦추고/늦추거나 단백질 생산을 촉진하는 여러 화합물들 중의 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "발현 인핸서"는 일반적으로 일시적 형질감염 시스템에 부가되는 임의의 하나 이상의 화합물을 의미하고, 그의 존재는 그러한 발현 인핸서(들)의 부재 하에 나타난 발현 수준의 적어도 2배 내지 약 10배의 인자에 의해 표적 단백질의 발현을 증진시키거나 또는 촉진시킨다. 현재 기재된 구현예들과 함께 사용하기 적합한 예시적인 발현 인핸서는 첨가물, 예컨대 발프로산 (VPA, 산 및 나트륨 염), 나트륨 프로피오네이트, 리튬 아세테이트, 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 갈락토오스를 포함하는 당류, 아미노산 혼합물, 또는 부티르산, 또는 상기 언급된 것들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 각각의 특이적 발현 인핸서의 최적의 농도는 발현 시스템의 개별적인 특성 및 사용자의 요건에 따라 달라질 수 있고, 주어진 실험 시나리오에서 임의의 하나 이상의 발현 인핸서의 최적 농도를 구성하는 것의 결정은 당업계의 통상의 기술 수준을 가진 실무자의 이해 범위 내에서 잘 이루어진다. 단지 예로서, 일부 구현예들에서, 본 발명의 실시에 사용된 발프로산 (VPA)의 최적의 최종 농도 범위는 약 0.20 mM 내지 약 25 mM의 범위 내일 수 있다, 더 바람직하게는, VPA의 최종 농도는 약 0.25 mM 내지 약 24 mM, 약 0.26 mM 내지 약 23 mM, 0.27 mM 내지 약 23 mM, 0.28 mM 내지 약 23 mM, 0.29 mM 내지 약 22 mM, 약 0.30 mM 내지 약 21 mM, 약 0.31 mM 내지 약 20 mM, 약 0.32 mM 내지 약 19 mM, 약 0.33 mM 내지 약 17 mM, 약 0.34 mM 내지 약 18 mM, 약 0.35 mM 내지 약 17 mM, 약 0.36 mM 내지 약 16 mM, 약 0.37 mM 내지 약 15 mM, 약 0.40 mM 내지 약 14 mM, 약 0.41 mM 내지 약 13 mM, 약 0.42 mM 내지 약 12 mM, 약 0.43 mM 내지 약 11 mM, 약 0.44 mM 내지 약 10 mM, 약 0.45 mM 내지 약 9 mM, 약 0.46 mM 내지 약 8 mM, 약 0.47 mM 내지 약 7 mM, 약 0.48 mM 내지 약 6 mM, 약 0.49 mM 내지 약 5 mM, 약 0.50 mM 내지 약 4 mM, 약 0.50 mM 내지 약 4 mM, 약 0.55 mM 내지 약 3 mM, 0.6 mM 내지 약 2 mM 또는 0.75 내지 약 1.5 mM의 범위 내일 수 있다. 일부 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 본 발명의 실시에 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.15 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.16 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.17 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.18 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.19 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.20 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.25 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.30 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.40 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.50 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.60 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.70 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.80 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.90 mM 내지 약 1.5mM 또는 약 0.10 mM 내지 약 1.5mM일 수 있다. 일부 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 본 발명의 실시에 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.20 내지 약 1.5 mM, 약 0.21 내지 약 1.4 mM, 약 0.22 내지 약 1.4 mM, 약 0.23 내지 약 1.4 mM, 약 0.24 내지 약 1.4 mM, 약 0.25 내지 약 1.3 mM, 약 0.25 내지 약 1.2 mM, 약 0.25 내지 약 1.1 mM, 또는 약 0.25 내지 약 1.0 mM일 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 실시에 사용된 나트륨 프로피오네이트 (NaPP)의 최적의 최종 농도는 약 0.2 mM 내지 약 100 mM의 범위 내일 수 있다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NaPP의 최적의 최종 농도는 약 0.5 내지 약 80 mM, 약 0.4 mM 내지 약 70 mM, 약 0.5 mM 내지 약 60 mM, 약 0.6 mM 내지 약 50 mM, 약 0.7 mM 내지 약 40 mM, 약 0.8 mM 내지 약 30 mM, 약 0.9 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 15 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 9 mM, 약 4 mM 내지 약 8 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 범위 내일 수 있다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NAPP의 최적의 최종 농도는 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 2 mM, 약 2 mM 내지 약 3 mM, 약 3 mM 내지 약 4 mM, 약 4 mM 내지 약 5 mM, 약 5 mM 내지 약 6 mM, 약 6 mM 내지 약 7 mM, 약 7 mM 내지 약 8 mM, 약 8 mM 내지 약 9 mM, 또는 약 9 mM 내지 약 10 mM의 범위 내일 수 있다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NAPP의 최적의 최종 농도는 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 3 mM, 약 3.5 mM, 약 4 mM, 약 4.5 mM, 약 5 mM, 약 5.5 mM, 약 6 mM, 약 6.5 mM, 약 7 mM, 약 7.5 mM, 약 8 mM, 약 8.5 mM, 약 9 mM, 약 9.5 mM, 또는 약 10 mM일 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 실시에 사용된 리튬 아세테이트 (LiAc)의 최적의 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25 mM, 약 0.26 mM 내지 약 20 mM, 약 0.27 mM 내지 약 15 mM, 약 0.28 mM 내지 약 10 mM, 약 0.29 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.31 mM 내지 약 4 mM, 약 0.35 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 3 mM의 범위 내일 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 실시에 사용된 부티르산의 최적의 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25 mM, 약 0.26 mM 내지 약 20 mM, 약 0.27 mM 내지 약 15 mM, 약 0.28 mM 내지 약 10 mM, 약 0.29 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.31 mM 내지 약 4 mM, 약 0.35 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 3 mM의 범위 내일 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 발현 인핸서는 형질감염 직전에 또는 형질감염 직후에 세포들 및 발현된 단백질을 수확하기 전에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 이하에 기재된 일부 특이적이고 비제한적인 구현예들에서, "인핸서 1"은 일반적으로 0.25 mM - 1 mM 발프로산을 지칭하고, "인핸서 2"는 일반적으로 5 mM - 7 mM 나트륨 프로피오네이트를 지칭한다. 그러나, 달리 지시되는 경우, 용어, 인핸서 1 및 인핸서 2는 상이한 인핸서 화합물을 포함할 수 있다. 발현 인핸서는 배양 배지에 순차적으로, 또는 칵테일로서 부가될 수 있다.
본원에 사용된 바의 용어 "벡터"는 그것이 연결되어 있는 또 하나의 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하도록 의도된다. 벡터의 하나의 유형은 추가의 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또 하나의 유형은 파아지 벡터이다. 벡터의 또 하나의 유형은 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터들은 그것들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들면, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터들 (예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)은 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 그에 의해 숙주 게놈을 따라 복제된다. 게다가, 특정 벡터들은 그들이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 간단히 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본원 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태일 때 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시예에 따라 사용되는 특정 벡터는 예를 들면, pCDNA 3.3, 또는 그의 변형된 버전과 같이 당업계에 잘 공지된 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 실시에 적합할 수 있는 벡터에 대한 변형 유형들의 비제한적인 예는 하나 이상의 인핸서, 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 리보솜 결합 부위, 하나 이상의 복제의 기원, 등의 변형의 부가와 같은 변형을 포함하지만, 이것으로만 제한되지 않는다. 특정한 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 본 발명의 실시에 사용된 발현 벡터는 본 발명의 일시적인 발현 시스템에서 관심있는 단백질의 발현을 개선시키기 위해 선택된 하나 이상의 인핸서 요소들을 포함할 수 있다. 선택된 인핸서 요소는 관심있는 단백질을 발현하는데 사용된 발현성 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치될 수 있다. 특히 바람직한 비제한적인 인핸서 원소는 우드척 간염 전사후 조절 요소 (WPRE)이다.
본원에서 사용된 바의, 어구 "발현된 단백질을 생산할 수 있는 유전적 서열을 함유하는 발현 벡터"는 일반적으로 세포에서 또는 무세포 발현 시스템에서 이들의 발현을 지원하는데 필요한 하나 이상의 핵산 서열들 또는 원소들 외에 관심있는 목적하는 단백질 (상기 관심있는 단백질은 본 발명의 사용자에 의해 선택되고 있음)의 적어도 하나의 열린 리딩 프레임을 갖는 발현 가능한 핵산 서열을 수용할 수 있는 상기 정의된 바의 벡터를 지칭한다. 본원에 정의된 바의 발현 벡터에 존재할 수 있는 그러한 추가의 핵산 서열들 또는 원소들은 하나 이상의 프로모터 서열, 하나 이상의 인핸서 요소들, 하나 이상의 리보솜 결합 부위, 하나 이상의 번역 개시 서열, 하나 이상의 복제의 기원, 또는 하나 이상의 선별 마커를 포함할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 다양한 핵산 서열들 또는 원소들은 당업자에게 익숙하고, 본 발명의 실시에 사용하기 위한 그들의 하나 이상의 선택은 실무자의 이해 범위 내에서 잘 이루어진다.
본원에 사용된 바의 용어들 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 포함하는 임의의 핵산을 지칭한다. 바람직한 구현예들에서, "핵산"은 게놈 DNA, 상보적 DNA (cDNA), 및 올리고 DNA를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 DNA를 지칭한다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예들에서, "핵산"은 게놈 DNA 및/또는 cDNA를 지칭한다.　뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기들, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분들에 의해 방해될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 합성 후에 이루어진 변형(들), 예컨대 라벨에 대한 콘주게이션을 포함할 수 있다. 변형의 다른 유형들은 예를 들면, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오타이드의 유사체에 의한 "caps" 치환, 예를 들면, 미충전된 연결기 (예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트, 등) 및 충전된 연결기 (예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등)를 갖는 것들과 같은 인터뉴클레오타이드 변형, 예를 들면, 단백질 (예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, ply-L-라이신, 등)과 같은 펜던트 모이어티를 함유하는 것들, 삽입제 (예를 들면, 아크리딘, 소랄렌, 등)를 갖는 것들, 킬레이터 (예를 들면, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화적 금속, 등)를 함유하는 것들, 알킬화제를 함유하는 것들, 변형된 연결기들을 갖는 것들 (예를 들면, 알파 아노머 핵산, 등), 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 변형되지 않은 형태를 포함한다. 게다가, 대개 당류 내에 존재하는 히드록실기 중의 임의의 것은 예를 들면, 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 추가의 뉴클레오타이드에 대한 추가의 연결기를 제조하도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 콘주게이트될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티에 의해 치환될 수 있다. 다른 히드록실기들은 또한 표준 보호기로 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들면, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴-, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보오스, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당류, 예컨대 아라비노오스, 자일로스 또는 릭소스, 파이라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체, 및 염기성 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 메틸 리보사이드를 포함하는 당업계에 일반적으로 공지된 리보오스 또는 데옥시리보스 당류의 유사한 형태를 함유한다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결기는 대안의 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대안의 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO, 또는 CH2 ("포름아세탈")로 대체되고, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 치환된 또는 비치환된 알킬 (1-20 C)이며, 임의로 에테르 (--O--) 연결기, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아랄킬을 함유하는 것인 구현예들을 포함하고, 이것으로만 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드에서 모든 연결기들이 동일할 필요는 없다. 이전의 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
본원에서 사용된 바의 "올리고뉴클레오타이드"는 반드시는 아니지만 일반적으로 길이가 약 200 뉴클레오타이드 미만의 짧은, 일반적으로 단일가닥, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오타이드를 일반적으로 지칭한다. 용어들 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오타이드에 동등하게 및 완전히 적용될 수 있다.
본원에서 사용된 바의, 어구 "제1 기간"은 본원에 기재된 본 발명의 방법들에 따라 세포들을 일시적으로 형질감염시키기 위한 방법의 맥락에서 사용될 때 일반적으로 세포들의 모집단을 발현 가능한 핵산에 의해 형질 감염시키는 것과 형질감염된 세포들에 하나 이상의 발현 인핸서를 추가하는 것 사이의 시간 간격을 의미한다. 통상적으로, 제1 기간은 약 2 시간 내지 약 4 일의 범위 내일 것이다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, 제1 기간은 약 3 내지 약 90 시간, 약 4 내지 약 85 시간, 약 5 내지 약 80 시간, 약 6 내지 약 75 시간, 약 7 내지 약 70 시간, 약 8 내지 약 65 시간, 약 9 내지 약 60 시간, 약 10 내지 약 55 시간, 약 11 내지 약 50 시간, 약 12 내지 약 45 시간, 약 13 내지 약 40 시간, 약 14 내지 약 35 시간, 약 15 내지 30 시간, 약 16 내지 약 24 시간, 약 17 내지 약 24 시간, 약 18 내지 약 24 시간, 약 19 내지 약 24 시간, 약 20 내지 약 24 시간, 약 21 내지 약 24 시간, 약 22 내지 약 24 시간 또는 약 23 내지 약 24 시간의 범위 내일 수 있다. 다른 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 제1 기간은 약 15 시간까지, 최대 약 16 시간까지, 약 17 시간까지, 약 18 시간까지, 약 19 시간까지, 약 20 시간까지, 약 21 시간까지, 약 22 시간까지, 약 23 시간까지, 약 24 시간까지, 약 25 시간까지, 약 26 시간까지, 약 27 시간까지, 약 28 시간까지, 약 29 시간까지 또는 약 30 시간까지일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "제2 기간"은 본원에 기재된 본 발명의 방법들에 따라 세포들을 일시적으로 형질 감염시키는 방법의 맥락에서 사용될 때 일반적으로 하나 이상의 발현 인핸서의 부가와 하나 이상의 추가의 인핸서의 부가 사이의 또는 형질감염된 세포들의 수확과 본원에 발현된 단백질의 정제 및 단리 사이의 시간 간격을 지칭한다. 전형적으로, 제2 기간은 약 10 시간 내지 약 10 일의 범위 내일 것이지만, 다른 시간 간격은 발현되고 있는 단백질에 대해 최적인 것으로 결정되는 경우에 사용될 수 있다. 일부 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 제2 기간은 2 시간 내지 5 일, 2.5 시간 내지 4 일, 약 3 내지 약 90 시간, 약 4 내지 약 85 시간, 약 5 내지 약 80 시간, 약 6 내지 약 75 시간, 약 7 내지 약 70 시간, 약 8 내지 약 65 시간, 약 9 내지 약 60 시간, 약 10 내지 약 55 시간, 약 11 내지 약 50 시간, 약 12 내지 약 45 시간, 약 13 내지 약 40 시간, 약 14 내지 약 35 시간, 약 15 내지 30 시간, 약 16 내지 약 24 시간, 약 17 내지 약 24 시간, 약 18 내지 약 24 시간, 약 19 내지 약 24 시간, 약 20 내지 약 24 시간, 약 21 내지 약 24 시간, 약 22 내지 약 24 시간 또는 약 23 내지 약 24 시간의 범위 내일 수 있다. 다른 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 제1 기간은 약 15 시간까지, 약 16 시간까지, 약 17 시간까지, 약 18 시간까지, 약 19 시간까지, 약 20 시간까지, 약 21 시간까지, 약 22 시간까지, 약 23 시간까지, 약 24 시간까지, 약 25 시간까지, 약 26 시간까지, 약 27 시간까지, 약 28 시간까지, 약 29 시간까지 또는 약 30 시간까지일 수 있다.
본원에서 사용된 바의 어구 "제3 기간"은 본원에 기재된 본 발명의 방법들에 따라 세포들을 일시적으로 형질 감염시키는 방법의 맥락에서 사용될 때 일반적으로 적어도 제1 발현 인핸서와 적어도 제2 발현 인핸서의 부가 사이의 시간 간격을 지칭한다. 제1 및 제2 발현 인핸서의 부가 사이의 시간 간격은 대략 수 초 내지 수 일일 수 있지만, 일부 구현예에서 그러한 제1 및 제2 발현 인핸서는 본질적으로 동시에 부가될 수 있거나, 또는 임의로 단일 제형으로 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 바의 용어들 "착화 반응", "착화 배지" 등은 일반적으로 핵산이 형질감염 시약 제형에 착물화되는 생리적으로 허용가능한 배양 배지 또는 반응을 지칭한다. 전형적으로, 단백질을 발현시킬 목적으로 세포 내로 도입되어야 할 핵산은 먼저 적절한 형질감염 시약 (예를 들면, 양이온성 지질 제형 등)에 의해 지질/핵산 착물 또는 응집물에 대해 착물화된다.
"전이 원소" 또는 "전이금속" (상호교환적으로 사용될 수 있음)은 내부 전자 원자가 껍질이 외부 껍질보다 오히려 단지 부분적으로 충전됨으로써, 그 원소는 주어진 시리즈의 원소들 중에서 가장 많은 양전성과 가장 적은 양전성 사이의 전이적 연결로서 작용하는 것을 의미한다. 전이 원소는 전형적으로 높은 용융점, 높은 밀도, 높은 쌍극자 또는 자기성 모멘트, 다중 원자가, 및 안정한 착이온을 형성하는 능력을 특징으로 한다. 본 발명에 유용한 그러한 전이 원소들의 예는 스칸듐 (Sc), 티타늄 (Ti), 바나듐 (V), 크로뮴 (Cr), 망간 (Mn), 철 (Fe), 코발트 (Co), 니켈 (Ni), 구리 (Cu), 아연 (Zn), 이트륨 (Y), 지르코늄 (Zr), 니오븀 (Nb), 몰리브데늄 (Mo), 테크네튬 (Tc), 루비듐 (Ru), 로듐 (Rh), 팔라듐 (Pd), 은 (Ag), 카드뮴 (Cd), 란탄 (La), 하프늄 (Hf), 탄탈럼 (Ta), 텅스텐 (W), 레늄 (Re), 오스뮴 (Os), 이리듐 (Ir), 백금 (Pt), 금 (Au), 수은 (Hg), 및 악티늄 (Ac)을 포함한다. 본 발명의 조성물을 포함하여 배양 배지 조성물에 사용하기 위한 전이 원소로서 특히 흥미로운 것은 철, 철의 킬레이트, 염, 및 착물 (Fe2+ 또는 Fe3+)이다.
다양한 기술 및 시약이 "형질감염"으로서 공지된 공정에서 거대분자의 표적 세포들 내로의 도입을 위해 이용 가능하다. 통상적으로 사용된 시약은 예를 들면, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란 및 지질을 포함한다. 이들 유형의 시약의 사용을 위한 상세한 프로토콜의 예를 들면, 수많은 참조 문헌 텍스트들이 예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology, 9장, Ausubel, 등. Eds., John Wiley and Sons, 1998이 이용될 수 있다.　세포들을 형질감염시키기 위한 추가의 방법들은 당업계에 공지되어 있고, 전기천공 (유전자 전기 이동), 초음파 천공, 광학적 형질감염, 원형질 융합, 임페일펙션, 마그네토펙션, 또는 바이러스 형질도입을 포함할 수 있다.
세포들 내로의 "거대분자의 도입을 위한 시약" 또는 "형질감염 시약"은 거대분자의 세포 내로의 입장을 촉진하는 당업자에게 공지된 임의의 물질, 제형 또는 조성물이다. 예를 들면, 미국 특허 제5,279,833호 참조. 일부 구현예에서, 상기 시약은 "형질감염 시약"일 수 있고 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 표적 세포들 내로의 흡수를 증가시키는 임의의 화합물 및/또는 조성물일 수 있다. 다양한 형질감염 시약은 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 형질감염 시약은 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI), 양으로 하전된 아미노산의 중합체, 예컨대 폴리라이신 및 폴리아르기닌, 양으로 하전된 덴드리머 및 파쇄된 덴드리머, 양이온성 β-사이클로덱스트린 함유 중합체 (CD-중합체), DEAE-덱스트란 등을 포함하는 하나 이상의 화합물 및/또는 조성물을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 거대분자의 세포들 내로의 도입을 위한 시약은 양이온성 지질 및/또는 중성 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPE), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(4'-트리메틸암모니오) 프로판 (DOTAP), 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오) 부타노일-sn-글리세롤 (DOTB), 1,2-디올레오일-3-석시닐-sn-글리세롤 콜린 에스테르 (DOSC), 콜레스테릴 (4'-트리메틸암모니오)부타노에이트 (ChoTB), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 1,2-디올레오일-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORI), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE), 1,2-디미리스틸록시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), O,O'-디도데실-N-[p(2-트리메틸암모니오에틸옥시)벤조일]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, 하나 이상의 지질에 접합된 스페르민 (예를 들면, 5-카복시퍼밀글리신 디옥타데실아미드 (DOGS), N,NI,NII,NIII-테트라메틸-N,NI,NII,NIII-테트라팔미틸스페르민 (TM-TPS) 및 디팔미토일파스파티딜에탄올아민 5-카복시퍼밀아미드 (DPPES)), 리포폴리라이신 (DOPE에 접합된 폴리라이신), TRIS (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민) 접합된 지방산 (TFAs) 및/또는 펩타이드, 예컨대 트리라이실-알라닐-TRIS 모노-, 디-, 및 트리-팔미테이트, (3β-[N--(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤 (DC-Chol), N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트 클로라이드 (TMAG), 디메틸 디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아민-이늄트리플루오로아세테이트 (DOSPA) 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
당업자는 상기 언급된 지질들의 특정 조합물이 핵산의 세포들 내로의 도입을 위해 특히 적합한 것으로 밝혀지고 있음을 인식할 것이고, 예를 들면 DOSPA와 DOPE의 3:1 (w/w) 조합물은 상표명 LIPOFECTAMINETM 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있고, DOTMA와 DOPE의 1:1 (w/w) 조합물은 상표명 LIPOFECTIN® 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있고, DMRIE와 콜레스테롤의 1:1 (M/M) 조합물은 상표명 DMRIE-C 시약 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있고, TM-TPS와 DOPE의 1:1.5 (M/M) 조합물은 상표명 CellFECTIN® 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있고, DDAB와 DOPE의 1:2.5 (w/w) 조합물은 상표명 LipfectACE® 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있다. 상기-언급된 지질 조합물들 외에, 다른 혼합물들과 혼합된, 특히, 핵의 국지화 서열을 포함하는 펩타이드 및 단백질과 혼합된 지질을 포함하는 다른 제형들이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, WO 00/27795로서 공개된 국제 출원 제PCT/US99/26825호 참조하기 바라며, 이 둘 모두는 본원에 참고 문헌으로서 인용된다.
지질 응집물, 예컨대 리포좀은 거대분자의 세포들 내로의 전달을 위한 약제로서 유용한 것으로 밝혀지고 있다. 특히, 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는 지질 응집물은 음이온성 거대분자 (예를 들면, 핵산)의 세포들 내로의 전달해 극히 효율적인 것으로 입증되고 있다. 하나의 통상적으로 사용된 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)이다. DOTMA를 단독으로 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE)과의 1:1 혼합물로서 포함하는 리포좀은 핵산을 세포들 내로 도입하기 위해 사용되어 왔다. DOTMA:DOPE의 1:1 혼합물은 상표명 LIPOFECTAMINETM 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 핵산을 세포들 내로 도입하기 위해 사용되고 있는 또 하나의 양이온성 지질은 1,2-비스(올레오일-옥시)-3-3-(트리메틸암모니아) 프로판 (DOTAP)이다. DOTAP는 올레오일 모이어티가 DOTAP에서 에테르 결합을 통해 프로필아민 골격에 연결되는 반면에 그들은 DOTMA에서 에스테르 결합을 통해 연결되는 점에서 DOTMA와 다르다. DOTAP는 표적 세포들에 의해 더욱 쉽게 분해되는 것으로 믿어진다. 트리메틸암모늄 모이어티의 메틸기들 중의 하나가 하이드록시에틸기로 대체된 화합물들의 구조적으로 관련된 기는 포스포리파제 A의 로젠탈 억제제 (RI)에 대한 구조에 있어서 유사하다 (Rosenthal, 등, (1960) J. Biol. Chem. 233:2202-2206. 참조). 상기 RI는 프로필아민 코어에 연결된 스테아로일 에스테르이다. RI의 상기 디올레오일 유사체는 일반적으로 프로필아민 코어에 대한 지질 모이어티의 연결에 따라 DOR1-에테르 및 DOR1-에스테르로 축약된다. 상기 하이드록시에틸 모이어티의 하이드록시기는 예를 들면, 카복시스페르민으로의 에스테르화에 의해 추가로 유도될 수 있다.
거대분자의 세포들 내로의 도입을 위해 사용되고 있는 화합물들의 또 다른 부류는 지질에 부착된 카복시스페르민 모이어티를 포함한다 (Behr, 등, (1989) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86:6982-6986 및 EPO 0 394 111 참조). 이러한 유형의 화합물들의 예는 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시퍼밀아미드 (DPPES) 및 5-카복시퍼밀글리신 디옥타데실아미드 (DOGS)를 포함한다. DOGS 상표명 TRANSFECTAMTM 하에 Promega, Madison, Wis. 로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
콜레스테롤의 양이온성 유도체 (3β-[N--(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤, DC-Chol)는 DOPE와 함께 리포좀 내로 합성되고 제형되어 왔고 (Gao, 등, (1991) BBRC 179(1):280-285. 참조), DNA를 세포들 내로 도입하기 위해 사용되고 있다. 따라서, 제형된 리포좀은 DNA를 낮은 수준의 세포 독성을 갖는 세포들 내로 효율적으로 도입하는 것으로 보고되었다. 폴리라이신을 DOPE에 콘주게이팅함으로써 형성된 리포폴리라이신 (Zhou, 등, (1991) BBA 1065:8-14 참조)는 핵산을 혈청의 존재 하에 세포들 내로 도입하는데 효과적인 것으로 보고되고 있다.
핵산을 세포들 내로 도입하기 위해 사용되어 온 양이온성 지질의 다른 유형은 고도로 패킹된 다중양이온성 암모늄, 설포늄 및 포스포늄 지질, 예컨대 미국 특허 제5,674,908호 및 제5,834,439호, 및 WO 00/27795로서 공개된 국제 출원 제PCT/US99/26825호에 기재된 것들을 포함한다. 본 발명에 따라 거대 분자를 전달하기 위한 하나의 특히 바람직한 비제한적인 형질감염 시약은 Life technologies로부터 입수할 수 있는 LIPOFECTAMINE 2000TM이다 (WO 00/27795로서 공개된 미국 국제 출원 제PCT/US99/26825호 참조). 거대분자를 세포에 전달하기에 적합한 또 하나의 바람직한 비제한적인 형질감염 시약은 EXPIFECTAMINETM이다. 다른 적절한 형질감염 시약은 LIOFECTAMINETM RNAiMAX, LIPOFECTAMINETM LTX, OLIGOFECTAMINETM, CellfectinTM, INVIVOFECTAMINETM, INVIVOFECTAMINETM 2.0, 및 미국 특허 출원 공보 제2012/0136073호에서 Yang 등에 의해 개시된 임의의 지질 시약 또는 제형 (본원에서 참고 문헌으로서 인용됨)을 포함한다. 다양한 다른 형질감염 시약이 당업자에게 공지되어 있고, 본원에 기재된 일시적 형질감염 시스템 및 방법에 대한 그의 적합성에 대해 평가될 수 있다.
본 발명은 (a) 적어도 하나의 거대분자, 바람직하게는 발현성 핵산 분자의 배양액 중의 진핵 세포들 내로의 도입, (b) 적어도 하나의 거대분자가 도입되는 세포들의 배양, 및 임의로 (c) 재조합 단백질 생성물의 생산 또는 적어도 하나의 거대분자가 도입되는 세포들 내의 핵산의 발현을 지원하는 고수율의 일시적 형질감염 시스템에 관한 것이며, 여기서 거대분자를 함유하는 배지는 배양물로부터 제거될 필요가 없고, 적어도 하나의 거대분자를 세포들 내로 도입한 후 및 단백질 생성물의 재배 및 생산 또는 핵산의 발현 전에 신선한 배지로 대체될 필요가 없다.
본 발명에 기재된 방법들에 따른 그의 용도인 본 발명의 일시적 형질감염 시스템은 세포 배양 시스템에서 관심있는 높은 수준의 단백질의 신속하고 재생 가능한 발현을 초래한다. 전형적으로, 본 발명의 일시적 형질감염 시스템 및 방법은 원하는 재조합 단백질 및 사용된 세포 유형들의 개별적인 발현 특성에 따라 재조합 발현된 단백질을 배양액의 약 200 ㎍ 단백질/L 내지 배양액의 약 2 g 단백질/L 범위 내의 수준으로 생산할 수 있다. 본원에 제공된 일시적 형질감염 시스템 및 방법을 사용할 때, 사용자는 표준의 상업적으로 입수할 수 있는 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 현재 수득할 수 있는 것을 약 2-배 내지 약 20-배 초과하는 수준의 발현된 단백질을 획득할 수 있다. 본원에 제공된 일시적 형질감염 시스템 및 방법을 사용할 때, 사용자는 현대의 일시적 발현 시스템에 의해 나타나는 것보다 약 2.5-배, 약 3-배, 약 3.5-배, 약 4-배, 약 4.5-배, 약 5-배, 약 5.5-배, 약 6-배, 약 6.5-배, 약 7-배, 약 7.5-배, 약 8-배, 약 8.5-배, 약 9-배, 약 9.5-배, 또는 최대 약 10-배 또는 더 큰 수준의 발현된 단백질을 수득할 수 있다. 예를 들면, 재조합 단백질을 생산하기 위해 본 발명의 일시적 형질감염 시스템을 사용할 때, 사용자는 현탁 세포들 중의 재조합 단백질의 생산을 위해 최적화된 상업적으로 입수할 수 있는 일시적 형질감염 시스템, 예컨대, 예, FREESTYLETM 발현 시스템을 사용하여 수득된 단백질 수율보다 약 2-배 내지 약 10-배 더 큰 단백질 수율을 획득할 수 있다.
다른 원소들 중에서, 적어도 고밀도 배양 배지, 고밀도 성장을 위해 적응된 현탁 세포들의 적어도 모집단, 임의로 하나 이상의 발현 벡터, 임의로 하나 이상의 형질감염 시약, 및 임의로 하나 이상의 발현 인핸서를 포함하는 본 발명의 시스템을 사용함으로써, 누군가 적어도 하나의 거대분자를 적어도 하나의 세포들 내로 도입한 후, 적어도 하나의 거대분자가 도입되는 세포들이 단백질 생성물을 생산하고 핵산을 발현하기 위해 추가로 배양되기 전에 상기 배지를 보급하거나, 대체하거나 또는 보충할 필요가 없다. 본 발명의 시스템에서, 상기 배지는 이상적으로 무혈청 배지 및/또는 화학적 한정 배지 및/또는 단백질이 없거나 또는 실질적으로 적은 단백질의 배지, 및/또는 동물 유도된 성분들을 함유하지 않는 배지, 또는 이들 특징의 조합을 갖는 배지이다.
본 발명의 하나의 비제한적인 측면에서, 화합물 또는 거대분자 (예, 핵산)의 배양액 중의 세포들 내로의 도입에 관하여, 본 발명의 고수율 배양 배지는 전형적으로 현재 이용될 수 있는 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 수득될 수 있는 것보다 더 높은 세포 형질감염 효율을 촉진시킨다. 본 발명의 또 하나의 관련된 비제한적인 측면에서, 상기 시스템은 또한 세포들이 형질감염 후에 배양되어야 하는 것보다 더 작은 부피로 세포들을 형질감염시키는 것을 요구하지 않는다. 본 발명의 다른 또 하나의 관련된 비제한적인 측면에서, 상기 시스템은 현재 이용될 수 있는 일시적 형질감염 시스템보다 더 높은 세포 생존률을 촉진시킨다. 또 다른 추가의 관련된 비제한적인 측면에서, 상기 시스템은 현재 이용될 수 있는 일시적 형질감염 시스템보다 더 높은 세포 밀도 (즉, 배양 배지의 세포들/ml)를 촉진시킨다. 본 발명의 또 하나의 관련된 비제한적인 측면에서, 상기 시스템은 현재 이용가능한 일시적 형질감염 시스템보다 배양액 중의 세포들에서 더 높은 수준의 재조합 단백질 발현을 촉진시킨다. 바람직하게는, 반드시 필수적이지는 않지만, 동일한 부피의 배지가 세포들의 형질 감염이 발생하는 배지를 대체하거나, 제거하거나, 보충하거나 또는 보급할 필요 없이 적어도 하나의 거대분자를 세포 내로 도입하기 위해서 및 후속 재배를 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 상기 세포들이 분할되거나 또는 배지 부피는 약 2, 약 5, 약 8 또는 약 10배 미만으로 증가된다.
본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 적어도 하나의 거대분자를 도입하거나 또는 임의의 부피의 배양 배지 내의 세포들을 형질감염시키고 배양하기 위해 사용되도록 의도된다. 그러한 도입은 바람직하게는 형질감염되어야 하는 세포들을 배양하기 위해 사용된 배지의 양의 0.1 내지 10배로 달성된다. 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 1 밀리리터보다 더 크다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 200 μL 내지 100 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 2 ml 내지 약 50 리터, 가장 바람직하게는 약 5 ml 내지 약 5 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 100 ml 내지 약 50 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 50 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 25 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 10 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 5 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 1 리터이다.
본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물에서, 상기 배지는 임의로 거대분자의 도입 또는 형질감염을 간섭할 수 있는 화합물, 예를 들면, 다중음이온성 화합물, 예컨대 폴리설폰화된 및/또는 폴리설페이트화된 화합물을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 상기 배지는 덱스트란 설페이트를 함유하지 않는다.
본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 화합물 또는 거대분자 (특히 거대분자, 예를 들면 핵산, 단백질 및 펩타이드)의 배양 세포들 내로의 도입을 (예를 들면 형질감염에 의해) 배지를 변화시킬 필요 없이 허용한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 진핵 세포들의 배양 및 형질감염을 위한 배지를 제공한다.
본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물을 사용함으로써, 당업자는 거대분자 또는 화합물 (예를 들면, 핵산)을 배양액 중의 세포들 내로 도입할 수 있다. 바람직하게는, 상기 거대분자 또는 화합물 (예를 들면, 핵산)은 적어도 약 20 퍼센트의 세포들 내로 도입된다. 더 바람직하게는, 상기 거대분자 또는 화합물 (예를 들면, 핵산)은 약 20 내지 약 100 퍼센트의 세포들 내로 도입된다. 더 바람직하게는, 상기 거대분자 또는 화합물 (예를 들면, 핵산)은 약 30 내지 약 100 퍼센트의 세포들 내로 도입된다. 더 바람직하게는, 상기 거대분자 또는 화합물 (예를 들면, 핵산)은 약 50 내지 약 100 퍼센트의 세포들 내로 도입된다. 실제로, 상기 거대분자 또는 화합물은 약 20% 내지 약 90%의 세포들, 약 20% 내지 약 80%의 세포들, 약 30% 내지 약 60, 70, 80 또는 90%의 세포들, 약 20, 30, 40 또는 50% 내지 약 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 98%의 세포들, 등 내로 도입될지도 모른다. 심지어 약 60, 70, 75 또는 80 내지 약 90%의 세포들 또는 100%에 가까운 세포들이 도입된 분자 또는 화합물을 함유할 수 있다.
본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물의 바람직한 구현예들에서, 하나 이상의 바람직하지 않은 성분들 (즉, 하나 이상의 혈청 성분들, 하나 이상의 한정되지 않은 성분들, 하나 이상의 단백질 성분들 및/또는 하나 이상의 동물 유도된 성분들)은 하나 이상의 대체 화합물에 의해 치환되거나 또는 하나 이상의 기능에서 대체되어 왔다. 본 발명의 대체 화합물은 임의로 하나 이상의 금속 결합 화합물 및/또는 하나 이상의 전이 원소 착물을 포함할 수 있고, 상기 착물은 하나 이상의 전이 원소들 또는 그의 염 또는 이온들을 하나 이상의 금속 결합 화합물과의 착물로 포함한다. 바람직하게는, 상기 배지는 하나 이상의 천연적으로 유도된 금속 담체, 예컨대 트랜스페린, 또는 기타 동물 유도된 단백질 또는 추출물의 부재 하에 세포의 시험관 내 재배를 지원할 수 있다. 상기 금속 결합 화합물은 금속 결합 화합물을 배지에 부가하기 전에 전이 금속과의 착물로 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 금속 결합 화합물은 금속 결합 화합물을 배지에 부가하기 전에 전이 금속과의 착물로 존재하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 배지는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나 인슐린을 포함하지 않는다.
본 발명은 또한 배지를 하나 이상의 대체 화합물과 조합함으로써 수득되는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 배지는 무혈청 배지 및/또는 화학적 한정 배지 및/또는 단백질이 없거나 또는 적은 단백질의 배지일 수 있고/있거나 동물 유도된 성분들이 결여된 배지일 수 있다. 상기 배지는 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나 인슐린을 함유하지 않는다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 배지는 세포의 시험관 내 배양을 지원할 수 있고/있거나 거대분자의 세포 내로의 도입을 허용할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 대체 화합물은 금속 결합 화합물일 수 있고/있거나 전이 원소 착물일 수 있고, 상기 착물은 적어도 하나의 금속 결합 화합물에 착물화되는 적어도 하나의 전이 원소 또는 그의 염 또는 이온을 포함한다. 본 발명의 이러한 측면에서 사용하기 위한 바람직한 전이 원소들, 금속 결합 화합물, 및 전이 원소 착물은 본원에 상세히 기재된 것들을 포함한다.
본 발명의 대체 화합물은 전이금속의 시험관 내에서 배양된 세포로의 전달을 촉진할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 대체 화합물은 철을 전달할 수 있고 트랜스페린을 대체할 수 있다. 바람직한 대체 화합물은 하이드록시피리딘 유도체이다. 바람직하게는, 상기 하이드록시피리딘 유도체는 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 3-하이드록시-4-파이론, 3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시피리드-4-온, 1-하이드록시피리드-2-온, 1,2-디메틸-3-하이드록시피리드-4-온, 1-메틸-3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시-2(1H)-피리디논, 및 피리독살 이소니코티닐 하이드라존, 니코틴산-N-옥사이드, 2-하이드록시-니코틴산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 하이드록시피리딘 유도체는 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드이다.　
본 발명의 대체 화합물은 진핵 및/또는 원핵세포들, 조직, 기관, 등을 재배하거나 또는 성장시키기 위한 배지를 포함하는 임의의 배지와 함께 사용될 수 있다. 그러한 배지는 CD FORTICHOTM 배지, Expi293TM 발현 배지, 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기본 배지 Eagle (BME), RPMI-1640, Ham의 F-10, Ham의 F-12, α-최소 필수 배지 (α-MEM), Glasgow의 최소 필수 배지 (G-MEM), 및 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM)를 포함할 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 상업적으로 입수할 수 있거나 (예, Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터) 또는 그렇지 않으면 당업계에 공지되어 있는 다른 배지는 본 발명에 따라 동등하게 사용될 수 있고, 293 SFM, CD-CHO 배지, VP SFM, BGJb 배지, Brinster의 BMOC-3 배지, 세포 배양 동결 배지, CMRL 배지, EHAA 배지, eRDF 배지, Fischer의 배지, Gamborg의 B-5 배지, GLUTAMAXTM 보충된 배지, Grace의 곤충 세포 배지, HEPES 완충된 배지, Richter의 변형된 MEM, IPL-41 곤충 세포 배지, Leibovitz의 L-15 배지, McCoy의 5A 배지, MCDB 131 배지, 배지 199, 변형된 이글 배지 (MEM), 배지 NCTC-109, 슈나이더의 드로소필라 배지, TC-100 곤충 배지, Waymouth의 MB 752/1 배지, William의 배지 E, 단백질 없는 하이브리도마 배지 II (PFHM II), AIM V 배지, 각질 세포들 SFM, 한정된 각질 세포 SFM, STEMPRO® SFM, STEMPRO® 완전한 메틸셀룰로오스 배지, HepatoZYME-SFM, NeurobasalTM 배지, Neurobasal-A 배지, HibernateTM A 배지, Hibernate E 배지, 내피 SFM, 인간 내피 SFM, 하이브리도마 SFM, PFHM II, Sf 900 배지, Sf 900 TI SFM, EXPRESS FIVE® 배지, CHO-S-SFM, AMINOMAX-II 완전한 배지, AMINOMAX-C100 완전한 배지, AMINOMAX-C 100 기본 배지, PB-MAXTM 염색체 분석 배지, KARYOMAX 골수 염색체 분석 배지, KNOCKOUT D-MEM 및 CO2 독립적인 배지를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 상기 배지는 당업자에게 공지된 제조업체, 예컨대 JRH, Sigma, HyClone, 및 BioWhittaker로부터 수득된다. 본 발명의 실시에 사용하기 적합한 배지의 추가의 예는 국제 공개 번호 WO 88/02774, WO 98/15614, WO 98/08934 및 유럽 특허 번호 0 282 942 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,135,866 및 5,232,848에서 발견될 수 있고, 이들의 전문은 본원에 참고 문헌으로서 특이적으로 인용된다.
본 발명은 또한 본 발명의 배지에서 세포들을 배양하는 단계 및 배지 내의 세포들을 거대분자가 하나 이상의 세포들에 의해 채택되도록 유발하는 조건 하에 하나 이상의 거대분자와 접촉시키는 단계를 포함하는 거대분자를 세포들 내로 도입하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 배지는 무혈청 배지 및/또는 화학적 한정 배지 및/또는 단백질이 없거나 또는 적은 단백질 배지이고/이거나 동물 유도된 성분들이 결여된 배지일 수 있다. 바람직한 세포들은 진핵 세포들을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 세포들은 포유동물 세포들이다. 상기 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나 인슐린을 함유하지 않는다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 배지는 동일한 배지에서 세포의 성장 및 형질감염을 허용한다. 일부 구현예에서, 상기 거대분자는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있고, 핵산 분자가 세포들에 의해 채택되도록 유발하는 조건은 핵산을 상기 핵산이 하나 이상의 세포들 내로 도입되도록 유발하는 시약과 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 배지 및 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 배지는 무혈청 배지 및/또는 화학적 한정 배지 및/또는 단백질이 없거나 또는 적은 단백질 배지 및/또는 동물 유도된 성분들이 결여된 배지이다. 바람직한 세포들은 진핵 세포들을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 세포들은 포유동물 세포들이다. 가장 바람직한 것은 293 섬유아세포들로부터 유도된 현탁 세포들이다. 상기 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나 인슐린을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 상기 배지는 동일한 배지 내의 세포의 성장 및 형질감염을 지원한다, 더 바람직하게는, 상기 배지는 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포들의 성장 및 배양을 지원하고, 여기서 상기 배지는 재조합 단백질을 생산할 목적을 위해 발현성 핵산의 도입 후에 보충되거나, 대체되거나 또는 그렇지 않으면 보충될 필요가 없다.
본 발명은 또한 거대분자의 하나 이상의 세포들 내로의 도입을 위해 본 발명의 배지 및 하나 이상의 시약을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 배지는 무혈청 배지 및/또는 화학적 한정 배지 및/또는 단백질이 없거나 또는 적은 단백질 배지 및/또는 동물 유도된 성분들이 결여된 배지이다. 상기 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나 인슐린을 함유한다. 바람직하게는, 상기 배지는 형질감염 시약을 함유하고 상기 거대분자는 핵산이다. 상기 거대분자는 또한 단백질 및/또는 펩타이드일지도 모른다. 일부 구현예들에서, 상기 시약은 그의 하나 이상이 양이온성 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 시약은 천연 지질 및 양이온성 지질의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 단독으로 또는 하나 이상의 지질과의 혼합물로 제공될 수 있는 하나 이상의 펩타이드 및/또는 단백질을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 배지 및 세포 내로 도입되어야 하는 하나 이상의 거대분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 배지는 무혈청 배지 및/또는 화학적 한정 배지 및/또는 단백질이 없거나 또는 적은 단백질 배지 및/또는 동물 유도된 성분들이 결여된 배지이다. 상기 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나 인슐린을 함유하지 않는다. 상기 거대분자는 예를 들면, 핵산 및/또는 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있고, 착물화될 수 없거나 또는 거대분자의 세포들 내로의 도입을 위해 하나 이상의 시약과의 착물의 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 거대분자는 핵산이고, 하나 이상의 형질감염 시약과의 착물의 형태로 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 배지, 적어도 하나의 세포들, 적어도 하나의 거대분자, 적어도 하나의 거대분자를 적어도 하나의 세포 내로 도입하기 위한 적어도 하나의 시약으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 성분 (또는 이들의 조합물) 을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포들은 진핵 세포들이다. 더 바람직하게는, 상기 세포들은 포유동물 세포들이다. 바람직하게는, 상기 배지는 무혈청 배지 및/또는 화학적 한정 배지 및/또는 단백질이 없거나 또는 적은 단백질 배지 및/또는 동물 유도된 성분들이 결여된 배지이다. 상기 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나 인슐린을 함유하지 않는다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 시약은 형질감염 시약이고, 상기 거대분자는 핵산, 예를 들면 RNA 및/또는 DNA이다. 대안으로, 상기 거대분자는 단백질 및/또는 펩타이드이다.
일부 구현예에서, 상기 시약은 그의 하나 이상이 양이온성 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 시약은 천연 지질과 양이온성 지질의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 하나 이상의 펩타이드 및/또는 단독으로 또는 하나 이상의 지질과의 혼합물로 제공될 수 있는 단백질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 시약은 거대분자를 세포 내로 도입하기 위해 상기 거대분자와 착물화된다.
본 발명은 또한 세포들의 배양 및 형질감염을 위한 배지를 포함하는 적어도 하나의 용기를 포함하는 세포들의 배양 및 형질감염을 위한 키트들을 제공한다. 그러한 키트들은 또한 본 발명의 배지, 적어도 하나의 세포들, 적어도 하나의 거대분자, 적어도 하나의 거대분자를 적어도 하나의 세포들 내로 도입하기 위한 적어도 하나의 시약, 적어도 하나의 완충제 또는 완충 염, 및 적어도 하나의 거대분자를 적어도 하나의 세포 내로 도입하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분 (또는 이들의 조합물)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배지는 무혈청 배지 및/또는 화학적 한정 배지 및/또는 단백질이 없거나 또는 적은 단백질 배지 및/또는 동물 유도된 성분들이 결여된 배지이다. 상기 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나 인슐린을 함유하지 않고/않거나 동물 성장 인자를 함유하지 않는다. 상기 배지는 금속 결합 화합물일 수 있는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고/있거나 하나 이상의 대체 화합물을 포함하는 하나 이상의 착물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 배지 하나 이상의 착물을 포함할 수 있고, 상기 착물은 금속 결합 화합물일 수 있는 하나 이상의 대체 화합물과 착물화되는 하나 이상의 전이 원소들 또는 그의 염 또는 이온을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 배지는 세포의 시험관 내 배양을 지원할 수 있고, 내부에서 배양된 세포의 형질감염을 허용한다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 키트들은 세포들을 형질감염시키기 위한 지질을 함유하는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키트들은 핵산을 포함하는 적어도 하나의 용기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따라, 전이 원소는 바람직하게는 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크로뮴, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 이트륨, 지르코늄, 니오븀, 몰리브데늄, 테크네튬, 루비듐, 로듐, 팔라듐, 은, 카드뮴, 란탄, 하프늄, 탄탈럼, 텅스텐, 레늄, 오스뮴, 이리듐, 백금, 금, 수은, 및 악티늄, 또는 그의 염 또는 이온들, 및 바람직하게는 철 염으로 구성된 군으로부터 선택된다. 적합한 철 염은 FeCl3, Fe(NO3)3 또는 FeSO4 또는 Fe+++ 또는 Fe++ 이온들을 함유하는 다른 화합물들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
바람직한 대체 화합물은 금속 결합 화합물을 포함하지만, 이것으로만 제한되지 않는다. 예를 들면, 국제 특허 출원 번호 PCT/US00/23580, 공보 번호 WO 01/16294 참조.
본 발명의 금속 결합 화합물은 전이 원소들과 상호작용할 수 있고 그와 결합할 수 있고, 세포들에 의한 그의 흡수를 촉진할 수 있는 임의의 거대 분자를 포함한다. 그러한 상호작용/결합은 사실 상 공유될 수 있거나 또는 비공유될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에서 사용된 금속 결합 화합물은 바람직하게는 폴리올, 하이드록시피리딘 유도체, 1,3,5-N,N',N''-트리(2,3-디하이드록시벤조일)아미노-메틸벤젠, 에틸렌디아민-N,N'-테트라메틸렌포스폰산, 트리석신, 산성 사카라이드 (예를 들면, 제1철 글루코네이트), 글리코사미노글리칸, 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 니코틴산-N-옥사이드, 2-하이드록시-니코틴산, 모노-, 비스-, 또는 트리스-치환된 2,2'-바이피리딘, 하이드록사메이트 유도체 (예를 들면 아세토하이드록삼산), 아미노산 유도체, 데페록사민, 페리옥사민, 철 염기성 포르핀 및 그의 유도체, DOTA-라이신, 텍사파이린, 사피린, 폴리아미노카복실산, α-하이드록시카복실산, 폴리에틸렌카바메이트, 에틸 말톨, 3-하이드록시-2-피리딘, 및 IRC011로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 금속 결합 화합물은 폴리올, 예컨대 소르비톨 또는 덱스트란, 및 특히 소르비톨이다. 관련된 구현예에서, 상기 금속 결합 화합물은 하이드록시피리딘 유도체, 예컨대 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 3-하이드록시-4-파이론, 3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시피리드-4-온, 1-하이드록시피리드-2-온, 1,2-디메틸-3-하이드록시피리드-4-온, 1-메틸-3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시-2(1H)-피리디논, 에틸 말톨 또는 피리독살 이소니코티닐 하이드라존이고, 바람직하게는 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드이다. 본 발명의 이러한 측면에 따른 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 전이 금속 착물은 소르비톨-철 착물 또는 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드-철 착물일 수 있다. 본 발명의 금속 결합 화합물은 또한 2가 양이온, 예컨대 Ca++ 및 Mg++에 결합할 수 있다.　
본 발명은 금속 결합 화합물일 수 있는 하나 이상의 대체 화합물을 포함하고 적어도 하나의 아미노산 (예컨대 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 또는 L-발린, N-아세틸-시스테인), 적어도 하나의 비타민 (예컨대 바이오틴, 콜린 클로라이드, D-Ca++-판토테네이트, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민 또는 비타민 B12), 적어도 하나의 무기 염 (예컨대 칼슘 염, CuSO4, FeSO4, Fe(NO3)3, FeCl3, KCl, 마그네슘 염, 망간 염, 나트륨 아세테이트, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na. 2SO4, 셀레늄 염, 실리콘 염, 몰리브데늄 염, 바나듐 염, 니켈 염, 주석 염, ZnCl2, ZnSO4 또는 기타 아연 염), 아데닌, 에탄올아민, D-글루코오스, 하나 이상의 사이토카인, 헤파린, 하이드로코르티손, 리포산, 페놀 레드, 포스포에탄올아민, 푸트레신, 나트륨 피루베이트, 트리-아이오도티로닌, 플루론성 F68, 및 티미딘으로 구성된 성분들의 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다.
본 발명의 배양 배지는 임의로 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 적절한 완충제는 N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산] (HEPES), MOPS, MES, 포스페이트, 바이카보네이트 및 세포 배양 적용에 사용하기 적합한 다른 완충제를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 적절한 완충제는 배양된 세포에 대한 실질적인 세포독성 없이 완충 능력을 제공하는 것이다. 적합한 완충제의 선택은 세포 배양 분야의 통상적인 기술의 영역 내에 있다.
본 발명에 따라, 본 발명의 세포 배양 배지를 형성하는 데 사용하기 적합한 배지는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있고, 예를 들면, 아데닌, 에탄올아민, D-글루코오스, 헤파린, 완충제, 하이드로코르티손, 리포산, 페놀 레드, 포스포에탄올아민, 푸트레신, 나트륨 피루베이트, 트리-아이오도티로닌, 티미딘, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, N-아세틸-시스테인, 바이오틴, 콜린 클로라이드, D-Ca++-판토테네이트, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B12, 플루론성 F68, 재조합 인슐린, 칼슘 염, CuSO4, FeSO4, FeCl3, Fe(NO3)3, KCl, 마그네슘 염, 망간 염, 나트륨 아세테이트, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4, 셀레늄 염, 실리콘 염, 몰리브데늄 염, 바나듐 염, 니켈 염, 주석 염, ZnCl2, ZnSO4 또는 기타 아연 염으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분들을 조합함으로써 수득될 수 있고, 여기서 각각의 성분은 세포의 시험관 내 재배를 지원하는 양으로 첨가된다.
본 발명은 또한 에탄올아민, D-글루코오스, HEPES, 인슐린, 리놀레산, 리포산, 페놀 레드, PLURONIC F68, 푸트레신, 나트륨 피루베이트, 트랜스페린, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 바이오틴, 콜린 클로라이드, D-Ca++-판토테네이트, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B12, 하나 이상의 칼슘 염, Fe(NO3)3, KCl, 하나 이상의 마그네슘 염, 하나 이상의 망간 염, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, 하나 이상의 셀레늄 염, 하나 이상의 바나듐 염 및 하나 이상의 아연 염으로부터 선택된 성분들을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이며, 여기서 각각의 성분은 포유동물 상피 세포의 시험관 내 재배를 지원하는 양으로 존재한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 사이토카인, 헤파린, 하나 이상의 동물 펩타이드, 하나 이상의 효모 펩타이드 및 하나 이상의 식물 펩타이드 (가장 바람직하게는 벼, 알로에 베라, 대두, 옥수수, 밀, 완두콩, 호박, 시금치, 당근, 감자, 고구마, 타피오카, 아보카도, 보리, 코코넛 및/또는 껍질 콩, 및/또는 하나 이상의 기타 식물들 중의 하나 이상)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 보충물을 추가로 포함할 수 있는 그러한 배지에 관한 것이며, 예를 들면, 국제 출원 번호 PCT/US97/18255, 공개 WO 98/15614 참조.
본 발명에 의해 제공된 배지는 무단백질일 수 있고, 1X 제형일 수 있거나 또는 예를 들면, 10X, 20X, 25X, 50X, 10X, 500X, 또는 1000X 배지 제형으로서 농축될 수 있다.
본 발명의 배지는 또한 상이한 형태로, 예컨대 건조 분말 배지 ("DPM"), 과립화된 제제 (물의 부가를 필요로 하지만, pH를 조절하는 것과 같은 다른 과정은 필요로 하지 않음), 액체 배지 또는 배지 농축물로서 제조될 수 있다.
단지 생성물의 유지를 위해 유용하지만, 그의 성장 또는 생산을 위해서는 유용하지 않은 배지인 기본 배지는 아미노산, 비타민, 유기 및 무기 염, 당류 및 기타 성분들을 포함하는 수많은 성분들을 포함할 수 있고, 각각의 성분은 포유동물 상피 세포의 시험관 내 재배를 지원하는 양으로 존재한다.
본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물에서, 상기 배지는 다양한 세포들을 배양하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 배지는 진핵 세포들을 배양하기 위해 사용된다. 더 바람직하게는, 상기 배지는 식물 및/또는 동물 세포들을 배양하기 위해 사용된다, 더 바람직하게는, 상기 배지는 포유동물 세포들, 물고기 세포들, 곤충 세포들, 양서류 세포들 또는 조류 세포들을 배양하기 위해 사용된다. 더 바람직하게는 상기 배지는 포유동물 세포들을 배양하기 위해 사용된다. 더 바람직하게는, 상기 배지는 일차 상피 세포들 (예, 각질 세포들, 자궁경부 상피 세포들, 기관지 상피 세포들, 기관 상피 세포들, 신장 상피 세포들 및 망막 상피 세포들)을 포함하는 포유동물 세포들 및 확립된 세포주들 및 그의 균주 (예, 293 배아 신장 세포들, BHK 세포들, HeLa 자궁경부 상피 세포들 및 PER-C6 망막 세포들, MDBK (NBL-1) 세포들, 911 세포들, CRFK 세포들, MDCK 세포들, CapT 세포들, CHO 세포들, BeWo 세포들, Chang 세포들, 디트로이트 562 세포들, HeLa 229 세포들, HeLa S3 세포들, Hep-2 세포들, KB 세포들, LS180 세포들, LS174T 세포들, NCI-H-548 세포들, RPMI 2650 세포들, SW-13 세포들, T24 세포들, WI-28 VA13, 2RA 세포들, WISH 세포들, BS-C-I 세포들, LLC-MK2 세포들, 클론 M-3 세포들, 1-10 세포들, RAG 세포들, TCMK-1 세포들, Y-1 세포들, LLC-PK1 세포들, PK(15) 세포들, GH1 세포들, GH3 세포들, L2 세포들, LLC-RC 256 세포들, MH1C1 세포들, XC 세포들, MDOK 세포들, VSW 세포들, 및 TH-I, B1 세포들, 또는 그의 유도체), 임의의 조직 또는 장기 (심장, 간, 신장, 결장, 창자, 식도, 위, 신경 조직 (뇌, 척수), 폐, 혈관 조직 (동맥, 정맥, 모세혈관)으로부터의 섬유아세포 세포들, 림프 조직 (림프샘, 아데노이드, 편도, 골수, 및 혈액), 비장을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않음)으로부터의 섬유아세포 세포들, 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주들 (예를 들면, CHO 세포들, TRG-2 세포들, IMR-33 세포들, 돈 세포들, GHK-21 세포들, 시트룰린미아 세포들, 뎀지 세포들, 디트로이트 551 세포들, 디트로이트 510 세포들, 디트로이트 525 세포들, 디트로이트 529 세포들, 디트로이트 532 세포들, 디트로이트 539 세포들, 디트로이트 548 세포들, 디트로이트 573 세포들, HEL 299 세포들, IMR-90 세포들, MRC-5 세포들, WI-38 세포들, WI-26 세포들, MiCl1 세포들, CHO 세포들, CV-1 세포들, COS-1 세포들, COS-3 세포들, COS-7 세포들, 베로 세포들, DBS-FrhL-2 세포들, BALB/3T3 세포들, F9 세포들, SV-T2 세포들, M-MSV-BALB/3T3 세포들, K-BALB 세포들, BLO-11 세포들, NOR-10 세포들, C3H/IOTI/2 세포들, HSDM1C3 세포들, KLN2O5 세포들, McCoy 세포들, 마우스 L 세포들, 균주 2071 (마우스 L) 세포들, L-M 균주 (마우스 L) 세포들, L-MTK- (마우스 L) 세포들, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포들, 스위스/3T3 세포들, 인도 문탁 세포들, SIRC 세포들, CII 세포들, 및 젠센 세포들, 또는 그의 유도체)을 배양하기 위해 사용된다. 가장 바람직하게는, 상기 배지는 293 세포들, 293 F 세포들 또는 그의 유도체, PER-C6 세포들 또는 그의 유도체, CHO 세포들 또는 그의 유도체, CapT 세포들 또는 그의 유도체, COS-7L 세포들 또는 그의 유도체 및 Sp2/0 세포들 또는 그의 유도체, 또는 상기 정의된 바와 같이 고밀도로 배양될 수 있는 임의의 다른 현탁 세포주 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포들을 배양하기 위해 사용된다. 더 바람직하게는, 상기 배지는 본 발명의 기본을 형성하는 세포 배양 배지 내의 최적의 성장을 위해 특이적으로 적응된 293 세포들 또는 변형된 293 세포주들을 배양하기 위해 사용된다. 일부 바람직한 비제한적인 측면들에서, 상기 배지는 현탁액 중에서 세포들을 배양하기 위해 사용된다.
본 발명의 배지에 의해 지원된 세포들은 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 마우스 또는 인간으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 배지에서 배양된 세포들은 정상 세포들 또는 비정상 세포들 (즉, 형질전환된 세포들, 확립된 세포들, 또는 병든 조직 샘플로부터 유도된 세포들)일 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 세포들을 본 발명의 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포들을 상기 세포들의 배양을 지원하기에 적합한 조건 하에 재배하는 단계를 포함하는 본원에 개시된 배양 배지 제형을 사용하여 포유동물 상피 또는 섬유아세포 세포들을 재배하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 방법들은 배양된 세포들을 하나 이상의 거대분자를 포함하는 (바람직하게는 하나 이상의 핵산을 포함하는) 용액과 하나 이상의 거대분자의 하나 이상의 세포들 내로의 도입을 유발하는 조건 하에 접촉시키는 단계를 임의로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이들 방법에 따라 재배된 세포들 (임의의 상기 세포들을 포함할 수 있음)이 현탁액 중에서 재배된다.
일부 측면들에서, 일시적 형질감염 및 재조합 단백질 시스템은 약 1x106 내지 약 20 x106 세포들/ml의 범위 내, 더 바람직하게는 약 2x106 내지 약 6x106의 범위 내의 밀도로 배양된 포유동물 세포들의 성장 및 증식에 적합한 고밀도 배양 배지를 포함할 수 있다. 임의의 배양 배지는 본 발명의 실시에 사용될 수 있고, 단, 사용된 배양 배지는 포유동물 세포들, 바람직하게는 현탁액 중에서 성장하는 세포들의 성장을 약 2x107 세포들/ml까지의 밀도로 유지할 수 있는 한편, 상기 세포들의 생존률을 약 80%를 초과하여 유지하고 및 또한, 상기 현탁 세포들의 효율적으로 형질감염되어야 하고 다량의 재조합 단백질을 발현시키는 능력을 유지한다. 본 발명의 실시에 사용된 고밀도 배양 배지는 상이한 적용과 용도 사이에서 달라질 수 있고, 사용 중인 세포주의 특성, 일시적으로 발현되고 있는 원하는 단백질, 발현 벡터의 세포들 내로의 전이를 위해 선택된 형질감염 양상의 특성, 및 아래 기재되는 바의 시스템에 부가된 임의의 발현 인핸서의 양 및 특성에 의존할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 일시적 발현 시스템 및 방법에 사용하도록 고려된 바람직한 고밀도 배양 배지는 전형적으로 무혈청, 무단백질일 것이고, 현탁 세포들의 배양 및 성장을 약 2x107 세포들/ml까지의, 더욱 전형적으로 약 2x106 세포들/ml 내지 약 1x107 세포들/ml의 밀도로 허용하고, 추가로 일시적 발현 시스템에서 생산된 단백질의 수율을 세포 배양물의 적어도 200 ㎍/mL 내지 세포 배양물의 2 mg/mL, 더욱 전형적으로 세포 배양물의 약 500 ㎍/ml 내지 세포 배양물의 약 1 mg/mL를 초과하게 할 것이다. 이상적으로, 본 발명에 따라 사용된 고밀도 배양 배지는 세포들의 형질감염을 약 1x106 내지 약 20 x106 세포들/ml, 약 2x106 내지 약 2 x106 세포들/ml, 또는 약 2.5x106 내지 약 6 x106 세포들/ml 범위의 밀도로 촉진할 것이다.
본 발명의 실시에 적합한 특히 바람직한 고밀도 성장 배지는 각각의 화학적 종 및 그의 각각의 양이 세포들을 배양하는데 있어서 그의 사용 전에 공지되는 화학적 한정 배지일 수 있다. 선택된 화학적 한정 배지는 세포 또는 조직 용해물 또는 그의 화학적 종들이 공지되어 있지 않고/않거나 정량화되지 않은 가수분해물 없이 임의로 이루어질 수 있다.　
본 발명의 일부 측면들에서, 본 발명의 실시를 위한 특히 적합한 유형의 배지는 예를 들면, 우태혈청 (FBS), 송아지 혈청, 말 혈청, 염소 혈청, 인간 혈청, 등이 전적으로 결여된 무혈청 배지 (때때로 "SFM 배지"라 칭함)이다. 당업자에 친숙한 예시적인 비제한적인 무혈청 배지는 HuMEC 기본 무혈청 배지, KNOCKOUTTM CTSTM XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPROTM-34 SFM 배지, STEMPROTM NSC 배지, ESSENTIALTM-8 배지, 배지 254, 배지, 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO®FREESTYLETM 293 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 106, 배지 200PRF, 배지 131, ESSENTIALTM-6 배지, STEMPROTM-34 배지, Gibco® 성상 세포 배지, AIM V® 배지 CTSTM AMINOMAXTM C-100 기본 배지, AMINOMAXTM-II 완전 배지, CD FORTICHOTM 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO®REESTYLETM CHO 발현 배지, CD OPTICHOTM 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900TM 배지, EXPI293TM 발현 배지, LHC 기본 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER. C6® Cell 배지, AIM V® 배지, EXPILIFE® 배지, 각질 세포-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 그의 임의의 유도체 또는 변형을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 실시에 특히 적합한 유형의 배지는 단백질 (예를 들면, 무혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민 또는 부착 인자, 영양 단백질, 예컨대 성장 인자, 또는 금속 이온 담체 단백질, 예컨대 트랜스페린, 세룰로플라스민, 등)이 전적으로 결여된 무단백질 배지 (때때로 "PFM 배지"라 칭함)이다. 바람직하게는, 펩타이드가 존재하는 경우, 상기 펩타이드는 더 작은 펩타이드, 예를 들면, 디- 또는 트리-펩타이드이다. 바람직하게는, 데카-펩타이드 길이 또는 그 이상의 펩타이드는 단백질 없는 배지에 존재하는 아미노산의 약 1% 미만, 더 바람직하게는 약 0.1% 미만, 및 더욱 더 바람직하게는 약 0.01% 미만이다.
이상적으로, 본 발명에 의해 사용하도록 고려된 무혈청 및 무단백질 배지 모두는 추가로 임의의 동물 유도된 물질, 또는 재조합 동물 DNA 또는 재조합 동물 단백질 DNA를 포함하는 동물 공급원으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유도되는 임의의 물질이 결여될 것이다.
본 발명의 실시에 사용하기 적합한 예시적인 고밀도 배양 배지는 HuMEC 기본 무혈청 배지, KNOCKOUTTM CTSTM XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPROTM-34 SFM 배지, STEMPROTM NSC 배지, ESSENTIALTM-8 배지, 배지 254, 배지, 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO®FREESTYLETM 293 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 106, 배지 200PRF, 배지 131, ESSENTIALTM-6 배지, STEMPROTM-34 배지, Gibco® 성상 세포 배지, AIM V® 배지 CTSTM AMINOMAXTM C-100 기본 배지, AMINOMAXTM-II 완전 배지, CD FORTICHOTM 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO®REESTYLETM CHO 발현 배지, CD OPTICHOTM 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900TM 배지, EXPI293TM 발현 배지, LHC 기본 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER. C6® Cell 배지, AIM V® 배지, EXPILIFE® 배지, 각질 세포-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 그의 임의의 유도체 또는 변형을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 고밀도 배양 배지는 CD FORTICHOTM 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO® FREESTYLETM CHO 발현 배지, CD OPTICHOTM 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, GIBCO® FREESTYLETM 293 발현 배지, EXPI293TM 발현 배지, 또는 동일한 배지, 또는 그의 변형된 버전일 수 있다. 상기 열거된 예시적인 고밀도 배양 배지는 CHO 세포들, CHO 세포 변이체, 293 세포들, 293 세포 변이체, CapT 세포들, CapT 세포 변이체, 또는 고밀도 배양 시스템에서 사용하도록 적응된 임의의 다른 세포들의 고밀도 성장, 증식, 형질감염 및 유지에 특히 적합할 수 있다. 임의로, 사용자는 본원에 기재된 특성들을 갖는 새로운 배양 배지를 제형화하기를 원할 수 있거나, 또는 대신에 현존하는 배양 배지를 다시 재형화하거나 또는 수정하고자 선택할 수 있다.
일부 측면에서, 고밀도 성장 배지는 목록으로부터 선택될 수 있다. 그러한 배지는 CD FORTICHOTM 배지, Expi293TM 발현 배지, 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기본 배지 Eagle (BME), RPMI-1640, Ham의 F-10, Ham의 F-12, α-최소 필수 배지 (α-MEM), Glasgow의 최소 필수 배지 (G-MEM), 및 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM)를 포함할 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 상업적으로 입수할 수 있거나 (예, Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터) 또는 그렇지 않으면 당업계에 공지되어 있는 다른 배지는 본 발명에 따라 동등하게 사용될 수 있고, 293 SFM, CD-CHO 배지, VP SFM, BGJb 배지, Brinster의 BMOC-3 배지, 세포 배양 동결 배지, CMRL 배지, EHAA 배지, eRDF 배지, Fischer의 배지, Gamborg의 B-5 배지, GLUTAMAXTM 보충된 배지, Grace의 곤충 세포 배지, HEPES 완충된 배지, Richter의 변형된 MEM, IPL-41 곤충 세포 배지, Leibovitz의 L-15 배지, McCoy의 5A 배지, MCDB 131 배지, 배지 199, 변형된 이글 배지 (MEM), 배지 NCTC-109, 슈나이더의 드로소필라 배지, TC-100 곤충 배지, Waymouth의 MB 752/1 배지, William의 배지 E, 단백질 없는 하이브리도마 배지 II (PFHM II), AIM V 배지, 각질 세포들 SFM, 한정된 각질 세포 SFM, STEMPRO® SFM, STEMPRO® 완전한 메틸셀룰로오스 배지, HepatoZYME-SFM, NeurobasalTM 배지, Neurobasal-A 배지, HibernateTM A 배지, Hibernate E 배지, 내피 SFM, 인간 내피 SFM, 하이브리도마 SFM, PFHM II, Sf 900 배지, Sf 900 TI SFM, EXPRESS FIVE® 배지, CHO-S-SFM, AMINOMAX-II 완전한 배지, AMINOMAX-C100 완전한 배지, AMINOMAX-C 100 기본 배지, PB-MAXTM 염색체 분석 배지, KARYOMAX 골수 염색체 분석 배지, KNOCKOUT D-MEM 및 CO2 독립적인 배지를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 상기 배지는 당업자에게 공지된 제조업체, 예컨대 JRH, 시그마, HyClone, 및 BioWhittaker로부터 수득된다. 본 발명의 실시에 사용하기 적합한 배지의 추가의 예는 국제 공개 번호 WO 88/02774, WO 98/15614, WO 98/08934 및 유럽 특허 번호 0 282 942 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,135,866 및 5,232,848에서 발견될 수 있고, 이들의 전문은 본원에 참고 문헌으로서 특이적으로 인용된다. 임의로, 사용자는 본원에 기재된 특성들을 갖는 새로운 배양 배지를 제형화하기를 원할 수 있거나, 또는 대신에 현존하는 배양 배지를 다시 재형화하거나 또는 수정하고자 선택할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 배양 배지를 포함하는 조성물을 제공하고, 이는 임의로 하나 이상의 포유동물 상피 또는 섬유아세포 세포들, 예컨대 상기 기재된 것들, 특히 하나 이상의 293 세포들, 293 F 세포들, PER-C6 세포들, CHO 세포들, CapT 세포들, COS-7L 세포들 및 Sp2/0 세포들, 또는 이들의 임의의 유도체를 추가로 포함할 수 있다.　
본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 고수율의 일시적 형질감염 시스템은 그의 생존률의 실질적인 손실, 효율적으로 형질감염되어야 하는 능력, 또는 높은 수준의 재조합 단백질을 발현해야 하는 능력 없이 고밀도 조건 하에 성장하도록 존재하거나 또는 적응된 하나 이상의 세포들 또는 세포주들을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 본 발명에서 배양된 포유동물 세포들의 성장 및 증식을 약 1x106 내지 약 20x106 세포들/ml의 범위 내, 더 바람직하게는 약 2x106 내지 약 6x106의 범위 내의 밀도로 사용하기에 적합한 세포주들이다. 임의의 세포주들은 비제한적으로 사용될 수 있고, 단 상기 세포주는 상기 정의된 고밀도 조건 하에 성장할 수 있는 한편, 그의 생존률을 약 80%를 초과하는 고밀도로 유지할 수 있고, 높은 효율로 형질감염되고 약 2 g/L의 배양물까지의 수준으로 재조합 단백질을 발현하는 그의 능력을 유지할 수 있다. 그러한 세포주의 식별은 당업자의 이해 범위 내에서 잘 이루어지고, 그러한 사람은 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어남이 없이 본 발명에 사용하기 적합한 세포주를 확인할 수 있다. 고밀도 배양을 위해 적응된 세포들은 세포 생존률을 약 80%에서 또는 그를 초과하여 유지하면서 고밀도 배양 배지에서 고밀도로 성장하도록 적응되고 있는 세포 계통 또는 동일한 부모 세포 계통으로부터 유도된 세포들의 (비클론) 모집단일 수 있다. 그러한 세포들은 세포들을 >40, >50, >60, >70, 또는 >80 순차적인 계대를 초과하는 고밀도로 유지하고 성장 배지의 비율을 원하는 고밀도 배양 배지로 점진적으로 대체함으로써 세포들의 부모 모집단으로부터 단리되거나 또는 선택될 수 있다. 선택적으로, 그 과정 동안, 세포들의 상이한 푸울은 개별적으로 전파될 수 있고 선택 공정에 적용되면서 동시에 형질감염 효율 및 또는 단백질 발현 효율을 평가함으로써, 세포들의 비클론 모집단은 고밀도로 지속되고 성장되고, 높은 효율로 형질감염되고, 높은 수준의 원하는 재조합 단백질을 발현할 수 있도록 선택될 수 있다. 다양한 세포 유형들 및 계통이 이러한 선택 공정에 적용될 수 있음이 당업자에게 쉽게 명백할 것이지만, CHO 세포들로부터 유도된 세포 계통, 293 섬유아세포 세포들로부터 유도된 세포 계통, 및 CapT 세포들로부터 유도된 세포들이 고밀도 성장 조건에 적응되도록 하는 선택 공정에 특히 순응하는 것으로 결정되고 있다. 이상적으로, 고밀도 성장 배양에 적응되고 본 발명에 사용하도록 순응된 세포들은 또한 높은 효율로 형질감염될 수 있고/있거나 재조합 단백질을 세포 배양액의 적어도 약 200 ㎍/mL 내지 세포 배양액의 약 2 mg/mL, 더욱 전형적으로 세포 배양액의 약 500 ㎍/ml 내지 세포 배양액의 약 1 mg/mL를 초과하는 수율로 발현할 수 있다. 이상적으로, 본 발명에 따라 사용된 고밀도 배양을 위해 적응된 세포들은 약 1x106 내지 약 20x106 세포들/ml, 약 2x106 내지 약 2 x106 세포들/ml, 또는 약 2.5x106 내지 약 6 x106 세포들/ml 범위의 밀도로 지속되고 형질감염될 수 있다.
비제한적인 예로서, 본원에 기재된 구현예들에 따라 고밀도 배양을 위해 적응될 수 있는 세포들 또는 세포주들은 세포, 예컨대 배양된 진핵 세포들, 더 바람직하게는, 배양된 식물 및/또는 동물 세포들, 더 바람직하게는, 배양된 포유동물 세포들, 물고기 세포들, 곤충 세포들, 양서류 세포들 또는 조류 세포들을 포함할 수 있다. 특정한 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 본원에 기재된 구현예들에 따라 고밀도 배양을 위해 적응될 수 있는 세포들 또는 세포주들은 일차 상피 세포들 (예, 각질 세포들, 자궁경부 상피 세포들, 기관지 상피 세포들, 기관 상피 세포들, 신장 상피 세포들 및 망막 상피 세포들)을 포함하는 배양 포유동물 세포들 및 확립된 세포주들 및 그의 균주 (예, 293 배아 신장 세포들, BHK 세포들, HeLa 자궁경부 상피 세포들 및 PER-C6 망막 세포들, MDBK (NBL-1) 세포들, 911 세포들, CRFK 세포들, MDCK 세포들, CapT 세포들, CHO 세포들, BeWo 세포들, Chang 세포들, 디트로이트 562 세포들, HeLa 229 세포들, HeLa S3 세포들, Hep-2 세포들, KB 세포들, LS180 세포들, LS174T 세포들, NCI-H-548 세포들, RPMI 2650 세포들, SW-13 세포들, T24 세포들, WI-28 VA13, 2RA 세포들, WISH 세포들, BS-C-I 세포들, LLC-MK2 세포들, 클론 M-3 세포들, 1-10 세포들, RAG 세포들, TCMK-1 세포들, Y-1 세포들, LLC-PK1 세포들, PK(15) 세포들, GH1 세포들, GH3 세포들, L2 세포들, LLC-RC 256 세포들, MH1C1 세포들, XC 세포들, MDOK 세포들, VSW 세포들, 및 TH-I, B1 세포들, 또는 그의 유도체), 임의의 조직 또는 장기 (심장, 간, 신장, 결장, 창자, 식도, 위, 신경 조직 (뇌, 척수), 폐, 혈관 조직 (동맥, 정맥, 모세혈관)으로부터의 섬유아세포 세포들, 림프 조직 (림프샘, 아데노이드, 편도, 골수, 및 혈액), 비장을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않음)으로부터의 섬유아세포 세포들, 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주들 (예를 들면, CHO 세포들, TRG-2 세포들, IMR-33 세포들, 돈 세포들, GHK-21 세포들, 시트룰린미아 세포들, 뎀지 세포들, 디트로이트 551 세포들, 디트로이트 510 세포들, 디트로이트 525 세포들, 디트로이트 529 세포들, 디트로이트 532 세포들, 디트로이트 539 세포들, 디트로이트 548 세포들, 디트로이트 573 세포들, HEL 299 세포들, IMR-90 세포들, MRC-5 세포들, WI-38 세포들, WI-26 세포들, MiCl1 세포들, CHO 세포들, CV-1 세포들, COS-1 세포들, COS-3 세포들, COS-7 세포들, 베로 세포들, DBS-FrhL-2 세포들, BALB/3T3 세포들, F9 세포들, SV-T2 세포들, M-MSV-BALB/3T3 세포들, K-BALB 세포들, BLO-11 세포들, NOR-10 세포들, C3H/IOTI/2 세포들, HSDM1C3 세포들, KLN2O5 세포들, McCoy 세포들, 마우스 L 세포들, 균주 2071 (마우스 L) 세포들, L-M 균주 (마우스 L) 세포들, L-MTK- (마우스 L) 세포들, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포들, 스위스/3T3 세포들, 인도 문탁 세포들, SIRC 세포들, CII 세포들, 및 젠센 세포들, 또는 그의 유도체)를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 배지는 293 세포들, 293 F 세포들 또는 그의 유도체, PER-C6 세포들 또는 그의 유도체, CHO 세포들 또는 그의 유도체, CapT 세포들 또는 그의 유도체, COS-7L 세포들 또는 그의 유도체 및 Sp2/0 세포들 또는 그의 유도체, 또는 상기 정의된 바와 같이 고밀도로 배양될 수 있는 임의의 다른 현탁 세포주 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포들을 배양하기 위해 사용된다. 더 바람직하게는, 상기 배지는 본 발명의 기본을 형성하는 세포 배양 배지 내의 최적의 성장을 위해 특이적으로 적응된 293 세포들 또는 변형된 293 세포주들을 배양하기 위해 사용된다. 본 발명의 일부 바람직한 비제한적인 측면에서, 고밀도 배양에 사용하도록 적응된 세포들은 현탁 세포들, 또는 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 부착 세포들이다.　
본 발명의 배지에 의해 지원된 세포들은 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 마우스 또는 인간으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 배지에서 배양된 세포들은 정상 세포들 또는 비정상 세포들 (즉, 형질전환된 세포들, 확립된 세포들, 또는 병든 조직 샘플로부터 유도된 세포들)일 수 있다.
본원에 기재된 구현예들에 따라 배양된 고밀도까지 적응된 세포들은 하나 이상의 발현-증진 단백질을 임의로 발현시킬 수 있다. 본원에 사용된 바의 용어 "발현 증진 단백질"은 세포에 의해 발현된 임의의 단백질을 지칭하고; 단백질의 발현은 재조합 단백질의 발현을 증진시킨다. 세포주들 또는 세포들의 모집단에 의한 발현-증진 단백질의 발현은 본 발명의 구현예들의 목적을 위해 안정적이거나 또는 일시적일 수 있다. 다양한 그러한 발현-증진 단백질은 당업계에 공지되어 있고, 단백질들 예컨대, 예를 들면, PKBa, Bcl-xL, P21, P18, AKT, 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 측면들에서, 본 발명의 고수율의 일시적 형질감염 시스템은 관심있는 재조합 단백질을 일시적으로 발현시키기 위한 하나 이상의 발현 벡터를 포함할 수 있다. 상기 발현 벡터는 이미 발현성 핵산 (예컨대, 예를 들면, 최적화된 대조군 단백질에 비교할 때 발현 효율을 평가하기 위한 양성 대조군)을 함유하는 것이 제공될 수 있거나, 또는 대안으로, 상기 발현 벡터는 그것에 의하여 사용자가 관심있는 단백질의 열린 리딩 프레임을 함유하는 발현성 핵산을 용이하게 삽입할 수 있는 형태로 제공될 수 있음으로써, 상기 관심있는 단백질은 세포들 내에서 재조합으로 및 고 효율로 발현될 수 있다.
관심있는 단백질의 재조합 생산을 위해, 단백질을 인코딩하는 발현성 핵산은 추가의 클로닝 (DNA의 증폭)을 위해 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 단리되고 삽입될 수 있다. 단백질을 인코딩하는 DNA는 종래의 공정을 사용하여 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자들에 특이적으로 결합될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다. 많은 벡터들이 이용될 수 있다. 상기 벡터 성분들은 일반적으로 다음: 즉, 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자들, 인핸서 원소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중의 하나 이상을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
a) 신호 서열 성분
관심있는 단백질은 직접적으로 뿐만 아니라 이종기원 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 재조합적으로 생산될 수 있고, 이는 바람직하게는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드이다. 선택된 이종기원 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포들에 의해 인식되고 가공되는 (즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 포유동물 세포
발현에서, 바이러스 분비성 리더, 예를 들면, 단순 포진 gD 신호 뿐만 아니라 포유동물 신호 서열이 이용될 수 있다.
b) 복제의 기원
발현 및 클로닝 벡터 모두는 하나 이상의 선택된 숙주세포들에서 벡터가 복사될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이러한 서열은 상기 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있게 하고, 복제의 기원 또는 자율적으로 복제하는 서열을 포함하는 것이다. 그러한 서열들은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 잘 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터 복제 기원은 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적합하고, 2μ 플라스미드 기원은 효모에 대해 적합하며, 다양한 바이러스 기원 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포들에서 클로닝 벡터에 대해 유용하다. 일반적으로, 복제 성분의 기원은 포유동물 발현 벡터에 대해 필요하지 않다 (SV40 기원은 일반적으로 단지 그것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다).
c) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터들은 선별 마커로 지칭되기도 하는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자들은 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하거나, (b) 영양 요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지, 예를 들면, 바실러스에 대한 유전자 인코딩 D-알라닌 라세마제로부터 이용될 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다.
선택 도식의 일 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종기원 유전자에 의해 성공적으로 형질전환되는 그들 세포들은 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고 따라서 선택 레지멘을 생존시킨다. 그러한 지배적인 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포들에 대해 적합한 선별 마커의 또 하나의 예는 항체-인코딩 핵산, 예컨대 DHFR, 글루타민 합성효소 (GS), 티미딘 키나아제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자들, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 탈탄산효소, 등을 채택하기에 능숙한 세포들의 식별을 가능케 하는 것들이다.
예를 들면, DHFR 유전자에 의해 형질전환된 세포들은 메토트렉세이트 (Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이들 조건 하에, DHFR 유전자는 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산에 따라 증폭된다. 내인성 DHFR 활성이 결핍핀 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들면, ATCC CRL-9096)가 사용될 수 있다.
대안으로, GS 유전자에 의해 형질전환된 세포들은 GS의 억제제인 L-메티오닌 설폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지 내에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이들 조건 하에, 상기 GS 유전자는 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산에 따라 증폭된다. 상기 GS 선택/증폭 시스템은 상기 DHFR 선택/증폭 시스템과 조합되어 사용될 수 있다.
대안으로, 관심있는 항체를 인코딩하는 DNA 서열, 야생형 DHFR 유전자, 및 또 하나의 선별 마커, 예컨대 아미노글리코사이드 3'-인산전이효소 (APH)로 형질전환되거나 또는 공동-형질전환된 숙주세포들 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 호스트)은 선별 마커 예컨대, 아미노글리코시드 항생제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418에 대한 선택제를 함유하는 배지 내에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호 참조.　
효모에서 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb 등, Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여되어 있는 효모의 돌연변이 균주에 대한 선택 마커를 제공한다, 예를 들면, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재 하에 성장에 의해 형질전환을 검출하는 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.　
또한, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유도된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 재조합 송아지 카이모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템은 K. 락티스에 대해 보고되었다. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). 클루이베로마이세스의 공업용 균주에 의한 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 멀티-카피 발현 벡터는 또한 Fleer 등, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)에 기재되어 있다.
d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고, 관심있는 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 프로모터 서열들이 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵 생물의 유전자들은 전사가 개시되는 부위로부터 상류에 대략적으로 25 내지 30개의 염기들이 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자들의 전사의 시작으로부터 상류에 70 내지 80개의 염기들로부터 발견된 또 하나의 서열은 N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵 유전자들의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단으로 폴리 A 꼬리를 부가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 그들 서열은 진핵 생물의 발현 벡터 내로 적절히 삽입된다.
포유동물 숙주 세포들 내의 벡터들로부터 단백질 전사는 조절된, 예를 들면, 바이러스들, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 유인원 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해, 또는 이종기원 포유동물 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-충격 프로모터로부터 조절될 수 있고, 단, 그러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 호환성이다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기원을 함유하는 SV40 제한 프래그먼트로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 프래그먼트로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유동물 호스트에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 번호 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한 단순 포진 바이러스로부터 티미딘 키나아제 프로모터의 통제 하에 마우스 세포들 내의 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 Reyes 등, Nature 297:598-601 (1982) 참조. 대안으로, Rous 육종 바이러스 긴 말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수 있다.
e) 인핸서 원소 성분
본 발명에 따라 고등 진핵생물에 의해 관심있는 단백질을 인코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내에 삽입함으로써 종종 증가되거나 또는 증진된다. 많은 인핸서 서열은 현재 포유동물 유전자들 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백, 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 배타적이지는 않지만 종종, 누구나 진핵 세포 바이러스로부터 인핸서를 사용할 것이다. 예들은 복제 기원의 후기 측 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵 프로모터의 활성화를 위한 증진 원소에 대해 Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) 참조. 인핸서는 항체-인코딩 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.　추가의 인핸서는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 포유동물 또는 바이러스 유전자들로부터 수득되고 유도된 인핸서를 포함할 수 있다. 본원에 사용하기 위해 예상되는 특히 바람직한 인핸서는 우드척 간염 전사후 조절 인자 (WPRE)이다.
f) 전사 종료 성분
진핵 숙주 세포들 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다중세포 유기체로부터 유핵 세포들)에 사용된 발현 벡터는 또한 전사의 종료를 위해서 및 mRNA를 안정화시키기 위해 필요한 서열을 함유한다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNAs 또는 cDNAs의 5' 및, 때때로 3', 미번역된 영역으로부터 입수할 수 있다. 이들 영역은 mRNA 인코딩 항체의 미번역된 부분 내의 폴리아데닐화된 세그먼트로서 전사된 뉴클레오타이드 세그먼트를 함유한다. 하나의 유용한 전사 종료 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 제WO94/11026호 및 본원에 개시된 발현 벡터 참조.
일부 측면에서, 본 발명의 실시에 매우 적합한 발현 벡터는 당업계에 잘 공지된 벡터들 중의 임의의 것, 예컨대, 예를 들면, pCDNA 3.3, 또는 그의 변형된 버전일 수 있다. 본 발명의 실시에 적합할 수 있는 벡터에 대한 변형 유형의 비제한적인 예는 하나 이상의 인핸서, 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 리보솜 결합 부위, 하나 이상의 복제의 기원, 등의 변형의 부가와 같은 변형을 포함하지만, 이것으로만 제한되지 않는다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, 및 본 발명의 실시에 사용된 발현 벡터는 본 발명의 일시적 발현 시스템에서 관심있는 단백질의 발현을 개선하기 위해 선택된 하나 이상의 인핸서 요소들을 포함할 수 있다. 상기 선택된 인핸서 원소는 관심있는 단백질을 발현하기 위해 사용된 발현성 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 배치될 수 있다. 특히 바람직한 비제한적인 인핸서 원소는 우드척 간염 전사후 조절 인자 (WPRE)이다.
하나의 바람직한 비제한적인 구현예에서, 현재 기재된 발명에 따라 사용된 발현 벡터는 pcDNA 벡터, 또는 특히 pcDNA 3.3 벡터, 더 상세하게는 pcDNA 3.3 벡터의 변이체일 수 있다. 상기 벡터는 임의로 증진된 프로모터, 예컨대, 예를 들면, 증진된 CMV 프로모터를 포함할 수 있다. 임의로, 상기 벡터는 아데노 T+M 영역, 임의로 SV40ori 부위, 임의로 SV40 스플라이스 공여체/수용체 부위, 또는 임의로 우드척 간염 전사후 조절 인자 (WPRE)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 고수율의 일시적 형질감염 시스템은 하나 이상의 발현 인핸서를 포함할 수 있다. 발현 인핸서는 일시적 발현 시스템에서 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 하나 이상의 화합물을 함유하는 수용액일 수 있다. 다양한 발현 인핸서는 당업계에 공지되어 있고, 임의의 하나 이상의 인핸서는 제한 없이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
일반적으로, 하나 이상의 형질감염 인핸서는 상기 세포들이 발현 가능한 핵산 또는 발현 벡터에 의해 형질감염되는 동안 또는 그 후 단백질-발현 세포들의 모집단과 접촉된다. 2개 이상의 발현 인핸서가 사용될 때, 각각의 발현 인핸서는 실질적으로 동일한 시점에 세포들과 접촉될 수 있거나, 또는 대안으로 상기 발현 인핸서는 임의로 상기 세포들을 제1 발현 인핸서와 접촉시키는 것과 상기 세포들을 제2 발현 인핸서와 접촉시키는 것 사이에 일정 기간이 경과한 후 단백질-발현 세포들과 순차적으로 접촉될 수 있다.
임의의 수의 발현 인핸서가 제한 없이 본 발명의 실시에 사용될 수 있고, 본 발명의 구현예들에 사용하기 적합한 발현 인핸서를 구성하는 것들의 식별이 당업자의 이해 범위 내에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 쉽게 인정될 것이지만, 다양한 예시적이고 비제한적인 발현 인핸서가 이하 기재될 것이지만, 그의 인용은 본 발명의 실시에 사용하기 위해 고려될 수 있는 적합한 발현 범위를 제한하지 않음이 이해되어야 한다.
일부 측면에서, 하나 이상의 발현 인핸서는 현재 기재된 구현예들에 따라 배양 배지 제형을 보충하기 위해 사용된 액체 (바람직하게는 수성) 첨가물을 포함할 수 있고, 상기 첨가물은 현재 기재된 구현예들에 따라 일시적 단백질 발현 시스템에서 생산된 발현된 단백질의 수율을 개선하기 위해 선택되고 있다. 하나 이상의 발현 인핸서는 세포 주기 진행에 영향을 미치거나, 아폽토시스를 억제하거나, 세포 성장을 늦추고/늦추거나 단백질 생산을 촉진하는 여러 화합물들 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "발현 인핸서"는 일반적으로 일시적 형질감염 시스템에 부가되는 임의의 하나 이상의 화합물을 의미하고, 그의 존재는 그러한 발현 인핸서(들)의 부재 하에 나타난 발현 수준의 적어도 2배 내지 약 10배의 인자에 의해 표적 단백질의 발현을 증진시키거나 또는 촉진시킨다. 현재 기재된 구현예들과 함께 사용하기 적합한 예시적인 발현 인핸서는 첨가물, 예컨대 발프로산 (VPA, 산 및 나트륨 염), 나트륨 프로피오네이트, 리튬 아세테이트, 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 갈락토오스를 포함하는 당류, 아미노산 혼합물, 또는 부티르산, 또는 상기 언급된 것들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 각각의 특이적 발현 인핸서의 최적의 농도는 발현 시스템의 개별적인 특성 및 사용자의 요건에 따라 달라질 수 있고, 주어진 실험 시나리오에서 임의의 하나 이상의 발현 인핸서의 최적 농도를 구성하는 것의 결정은 당업계의 통상의 기술 수준을 가진 실무자의 이해 범위 내에서 잘 이루어진다.
하나의 예시적인 구현예에서, 발현 인핸서는 발프로산을 함유하는 제형일 수 있다. 본 발명의 실시에 사용된 발프로산 (VPA)의 최적의 최종 농도 범위는 달라질 수 있지만, 바람직하게는 약 0.20 mM 내지 약 25 mM의 범위 내, 또는 이러한 범위에 포함되는 임의의 하위 범위 또는 농도 값일 것이다. 더 바람직하게는, VPA의 최종 농도는 약 0.25 mM 내지 약 24 mM, 약 0.26 mM 내지 약 23 mM, 0.27 mM 내지 약 23 mM, 0.28 mM 내지 약 23 mM, 0.29 mM 내지 약 22 mM, 약 0.30 mM 내지 약 21 mM, 약 0.31 mM 내지 약 20 mM, 약 0.32 mM 내지 약 19 mM, 약 0.33 mM 내지 약 17 mM, 약 0.34 mM 내지 약 18 mM, 약 0.35 mM 내지 약 17 mM, 약 0.36 mM 내지 약 16 mM, 약 0.37 mM 내지 약 15 mM, 약 0.40 mM 내지 약 14 mM, 약 0.41 mM 내지 약 13 mM, 약 0.42 mM 내지 약 12 mM, 약 0.43 mM 내지 약 11 mM, 약 0.44 mM 내지 약 10 mM, 약 0.45 mM 내지 약 9 mM, 약 0.46 mM 내지 약 8 mM, 약 0.47 mM 내지 약 7 mM, 약 0.48 mM 내지 약 6 mM, 약 0.49 mM 내지 약 5 mM, 약 0.50 mM 내지 약 4 mM, 약 0.50 mM 내지 약 4 mM, 약 0.55 mM 내지 약 3 mM, 0.6 mM 내지 약 2 mM 또는 0.75 내지 약 1.5 mM의 범위 내일 수 있다. 일부 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 본 발명의 실시에 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.15 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.16 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.17 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.18 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.19 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.20 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.25 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.30 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.40 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.50 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.60 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.70 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.80 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.90 mM 내지 약 1.5mM 또는 약 0.10 mM 내지 약 1.5mM일 수 있다. 일부 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 본 발명의 실시에 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.20 내지 약 1.5 mM, 약 0.21 내지 약 1.4 mM, 약 0.22 내지 약 1.4 mM, 약 0.23 내지 약 1.4 mM, 약 0.24 내지 약 1.4 mM, 약 0.25 내지 약 1.3 mM, 약 0.25 내지 약 1.2 mM, 약 0.25 내지 약 1.1 mM, 또는 약 0.25 내지 약 1.0 mM일 수 있다.
또 하나의 예시적인 구현예에서, 발현 인핸서는 나트륨 프로피오네이트 (NaPP)를 함유하는 제형일 수 있다. 임의로, NaPP는 단독으로 또는 상기한 바의 발프로산과 조합하여 제공될 수 있다. 본 발명의 실시에 사용된 NaPP의 최적의 최종 농도 범위는 달라질 수 있지만, 바람직하게는 약 추가 구현예의 범위 내일 수 있고, 본 발명의 실시에 사용된 NaPP의 최적의 최종 농도는 약 0.2 mM 내지 약 100 mM의 범위 내, 또는 이러한 범위 내에 포함된 임의의 하위 범위 또는 개별적인 농도일 수 있다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NAPP의 최적의 최종 농도는 약 0.5 내지 약 80 mM, 약 0.4 mM 내지 약 70 mM, 약 0.5 mM 내지 약 60 mM, 약 0.6 mM 내지 약 50 mM, 약 0.7 mM 내지 약 40 mM, 약 0.8 mM 내지 약 30 mM, 약 0.9 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 15 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 9 mM, 약 4 mM 내지 약 8 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 범위 내일 수 있다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NaPP의 최적의 최종 농도는 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 2 mM, 약 2 mM 내지 약 3 mM, 약 3 mM 내지 약 4 mM, 약 4 mM 내지 약 5 mM, 약 5 mM 내지 약 6 mM, 약 6 mM 내지 약 7 mM, 약 7 mM 내지 약 8 mM, 약 8 mM 내지 약 9 mM, 또는 약 9 mM 내지 약 10 mM의 범위 내일 수 있다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NaPP의 최적의 최종 농도는 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 3 mM, 약 3.5 mM, 약 4 mM, 약 4.5 mM, 약 5 mM, 약 5.5 mM, 약 6 mM, 약 6.5 mM, 약 7 mM, 약 7.5 mM, 약 8 mM, 약 8.5 mM, 약 9 mM, 약 9.5 mM, 또는 약 10 mM일 수 있다.
또 하나의 예시적인 구현예에서, 발현 인핸서는 리튬 아세테이트 (LiAc)를 함유하는 제형일 수 있다. 임의로, LiAc는 단독으로 또는 상기한 바의 NaPP 또는 발프로산과 조합하여 제공될 수 있다. 추가 구현예에서, 본 발명의 실시에 사용된 리튬 아세테이트 (LiAc)의 최적의 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25 mM, 약 0.26 mM 내지 약 20 mM, 약 0.27 mM 내지 약 15 mM, 약 0.28 mM 내지 약 10 mM, 약 0.29 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.31 mM 내지 약 4 mM, 약 0.35 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 3 mM의 범위 내일 수 있다.
또 다른 하나의 예시적인 구현예에서, 발현 인핸서는 부티르산을 함유하는 제형일 수 있다. 본 발명의 실시에 사용된 부티르산의 최적의 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25 mM, 약 0.26 mM 내지 약 20 mM, 약 0.27 mM 내지 약 15 mM, 약 0.28 mM 내지 약 10 mM, 약 0.29 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.31 mM 내지 약 4 mM, 약 0.35 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 3 mM의 범위 내일 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 발현 인핸서는 형질감염 직전에 또는 그 동안, 또는 형질감염 후이지만, 세포들 및 발현된 단백질을 수확하기 전에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 이하에 기재된 일부 특이적이고 비제한적인 구현예들에서, "인핸서 1"은 일반적으로 0.25 mM - 1 mM 발프로산을 지칭하고, "인핸서 2"는 일반적으로 5 mM 7 mM 나트륨 프로피오네이트를 지칭한다. 그러나, 달리 지시되는 경우, 용어, 인핸서 1 및 인핸서 2는 상이한 인핸서 화합물을 포함할 수 있다. 발현 인핸서는 배양 배지에 순차적으로, 또는 칵테일로서 부가될 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 고수율의 일시적 형질감염 시스템은 거대분자의 배양된 세포들 내로의 도입을 위한 하나 이상의 시약 (상기 시약은 통상적으로 "형질감염 시약"으로서 지칭됨)을 포함할 수 있다. 현재 기재된 구현예들에 따라 사용된 형질감염 시약은 생물학적 분자, 특히 핵산 분자를 세포 내로 도입하고, 그것에 의하여 상기 핵산이 생물학적 기능을 발휘할 수 있거나, 또는 발현성 핵산의 경우에, 상기 발현성 핵산에 의해 인코딩된 유전자 또는 단백질이 발현될 수 있게 하기 위한 임의의 화합물 또는 다른 화학적 양상일 수 있다. 다양한 적절한 형질감염 시약은 당업계에 공지되어 있고, 임의의 하나 이상의 시약이 제한 없이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
본 구현예들과 함께 사용하기 위한 형질감염 시약은 거대분자의 세포 내로의 입장을 촉진하는 당업자에게 공지된 임의의 제형 또는 조성물이다. 예를 들면, 미국 특허 제5,279,833호 참조. 일부 구현예에서, 상기 시약은 "형질감염 시약"일 수 있고 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 표적 세포들 내로의 흡수를 증가시키는 임의의 화합물 및/또는 조성물일 수 있다. 다양한 형질감염 시약은 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 형질감염 시약은 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI), 양으로 하전된 아미노산의 중합체, 예컨대 폴리라이신 및 폴리아르기닌, 양으로 하전된 덴드리머 및 파쇄된 덴드리머, 양이온성 β-사이클로덱스트린 함유 중합체 (CD-중합체), DEAE-덱스트란 등을 포함하는 하나 이상의 화합물 및/또는 조성물을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 거대분자의 세포들 내로의 도입을 위한 시약은 양이온성 지질 및/또는 중성 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPE),1,2-비스(올레오일옥시)-3-(4'-트리메틸암모니오) 프로판 (DOTAP), 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오) 부타노일-sn-글리세롤 (DOTB), 1,2-디올레오일-3-석시닐-sn-글리세롤 콜린 에스테르 (DOSC), 콜레스테릴 (4'-트리메틸암모니오)부타노에이트 (ChoTB), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 1,2-디올레오일-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORI), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE), 1,2-디미리스틸록시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), O,O'-디도데실-N-[p(2-트리메틸암모니오에틸옥시)벤조일]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, 하나 이상의 지질에 접합된 스페르민 (예를 들면, 5-카복시퍼밀글리신 디옥타데실아미드 (DOGS), N,NI,NII,NIII-테트라메틸-N,NI,NII,NIII-테트라팔미틸스페르민 (TM-TPS) 및 디팔미토일파스파티딜에탄올아민 5-카복시퍼밀아미드 (DPPES)), 리포폴리라이신 (DOPE에 접합된 폴리라이신), TRIS (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민) 접합된 지방산 (TFAs) 및/또는 펩타이드, 예컨대 트리라이실-알라닐-TRIS 모노-, 디-, 및 트리-팔미테이트, (3β-[N--(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤 (DC-Chol), N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트 클로라이드 (TMAG), 디메틸 디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아민-이늄트리플루오로아세테이트 (DOSPA) 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
당업자는 상기 언급된 지질들의 특정 조합물이 핵산의 세포들 내로의 도입을 위해 특히 적합한 것으로 밝혀지고 있음을 인식할 것이고, 예를 들면 DOSPA와 DOPE의 3:1 (w/w) 조합물은 상표명 LIPOFECTAMINETM 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있고, DOTMA와 DOPE의 1:1 (w/w) 조합물은 상표명 LIPOFECTIN® 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있고, DMRIE와 콜레스테롤의 1:1 (M/M) 조합물은 상표명 DMRIE-C 시약 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있고, TM-TPS와 DOPE의 1:1.5 (M/M) 조합물은 상표명 CellFECTIN® 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있고, DDAB와 DOPE의 1:2.5 (w/w) 조합물은 상표명 LipfectACE® 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 입수할 수 있다. 상기-언급된 지질 조합물들 외에, 다른 혼합물들과 혼합된, 특히, 핵의 국지화 서열을 포함하는 펩타이드 및 단백질과 혼합된 지질을 포함하는 다른 제형들이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, WO 00/27795로서 공개된 국제 출원 제PCT/US99/26825호 참조하기 바라며, 이 둘 모두는 본원에 참고 문헌으로서 인용된다.
지질 응집물, 예컨대 리포좀은 거대분자의 세포들 내로의 전달을 위한 약제로서 유용한 것으로 밝혀지고 있다. 특히, 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는 지질 응집물은 음이온성 거대분자 (예를 들면, 핵산)의 세포들 내로의 전달해 극히 효율적인 것으로 입증되고 있다. 하나의 통상적으로 사용된 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)이다. DOTMA를 단독으로 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE)과의 1:1 혼합물로서 포함하는 리포좀은 핵산을 세포들 내로 도입하기 위해 사용되어 왔다. DOTMA:DOPE의 1:1 혼합물은 상표명 LIPOFECTAMINETM 하에 Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 핵산을 세포들 내로 도입하기 위해 사용되고 있는 또 하나의 양이온성 지질은 1,2-비스(올레오일-옥시)-3-3-(트리메틸암모니아) 프로판 (DOTAP)이다. DOTAP는 올레오일 모이어티가 DOTAP에서 에테르 결합을 통해 프로필아민 골격에 연결되는 반면에 그들은 DOTMA에서 에스테르 결합을 통해 연결되는 점에서 DOTMA와 다르다. DOTAP는 표적 세포들에 의해 더욱 쉽게 분해되는 것으로 믿어진다. 트리메틸암모늄 모이어티의 메틸기들 중의 하나가 하이드록시에틸기로 대체된 화합물들의 구조적으로 관련된기은 포스포리파제 A의 로젠탈 억제제 (RI)에 대한 구조에 있어서 유사하다 (Rosenthal, 등, (1960) J. Biol. Chem. 233:2202-2206. 참조). 상기 RI는 프로필아민 코어에 연결된 스테아로일 에스테르이다. RI의 상기 디올레오일 유사체는 일반적으로 프로필아민 코어에 대한 지질 모이어티의 연결에 따라 DOR1-에테르 및 DOR1-에스테르로 축약된다. 상기 하이드록시에틸 모이어티의 하이드록시기는 예를 들면, 카복시스페르민으로의 에스테르화에 의해 추가로 유도될 수 있다.
거대분자의 세포들 내로의 도입을 위해 사용되고 있는 화합물들의 또 다른 부류는 지질에 부착된 카복시스페르민 모이어티를 포함한다 (Behr, 등, (1989) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86:6982-6986 및 EPO 0 394 111 참조). 이러한 유형의 화합물들의 예는 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시퍼밀아미드 (DPPES) 및 5-카복시퍼밀글리신 디옥타데실아미드 (DOGS)를 포함한다. DOGS 상표명 TRANSFECTAMTM 하에 Promega, Madison, Wis. 로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
콜레스테롤의 양이온성 유도체 (3β-[N--(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤, DC-Chol)는 DOPE와 함께 리포좀 내로 합성되고 제형되어 왔고 (Gao, 등, (1991) BBRC 179(1):280-285. 참조), DNA를 세포들 내로 도입하기 위해 사용되고 있다. 따라서, 제형된 리포좀은 DNA를 낮은 수준의 세포 독성을 갖는 세포들 내로 효율적으로 도입하는 것으로 보고되었다. 폴리라이신을 DOPE에 콘주게이팅함으로써 형성된 리포폴리라이신 (Zhou, 등, (1991) BBA 1065:8-14 참조)는 핵산을 혈청의 존재 하에 세포들 내로 도입하는데 효과적인 것으로 보고되고 있다.
핵산을 세포들 내로 도입하기 위해 사용되어 온 양이온성 지질의 다른 유형은 고도로 패킹된 다중양이온성 암모늄, 설포늄 및 포스포늄 지질, 예컨대 미국 특허 제5,674,908호 및 제5,834,439호, 및 WO 00/27795로서 공개된 국제 출원 제PCT/US99/26825호에 기재된 것들을 포함한다. 본 발명에 따라 거대 분자를 전달하기 위한 하나의 특히 바람직한 비제한적인 형질감염 시약은 Life technologies로부터 입수할 수 있는 LIPOFECTAMINE 2000TM이다. WO 00/27795로서 공개된 미국 국제 출원 제PCT/US99/26825호 참조.　거대분자를 세포에 전달하기에 적합한 또 하나의 바람직한 비제한적인 형질감염 시약은 EXPIFECTAMINETM이다. 다른 적절한 형질감염 시약은 LIOFECTAMINETM RNAiMAX, LIPOFECTAMINETM LTX, OLIGOFECTAMINETM, CellfectinTM, INVIVOFECTAMINETM, INVIVOFECTAMINETM 2.0, 및 미국 특허 출원 공보 제2012/0136073호에서 Yang 등에 의해 개시된 임의의 지질 시약 또는 제형 (본원에서 참고 문헌으로서 인용됨)을 포함한다. 다양한 다른 형질감염 시약이 당업자에게 공지되어 있고, 본원에 기재된 일시적 형질감염 시스템 및 방법에 대한 그의 적합성에 대해 평가될 수 있다.
본 발명은 부분적으로 (a) 적어도 하나의 거대분자, 바람직하게는 발현성 핵산 분자의 배양액 중의 진핵 세포들 내로의 도입, (b) 적어도 하나의 거대분자가 도입되는 세포들의 배양, 및 임의로 (c) 재조합 단백질 생성물의 생산 또는 적어도 하나의 거대분자가 도입되는 세포들 내의 핵산의 발현을 지원하는 고수율의 일시적 형질감염 시스템에 관한 것이며, 여기서 거대분자를 함유하는 배지는 배양물로부터 제거될 필요가 없고, 적어도 하나의 거대분자를 세포들 내로 도입한 후 및 단백질 생성물의 재배 및 생산 또는 핵산의 발현 전에 신선한 배지로 대체될 필요가 없다.
본 발명에 기재된 방법들에 따른 그의 용도인 본 발명의 일시적 형질감염 시스템은 세포 배양 시스템에서 관심있는 높은 수준의 단백질의 신속하고 재생 가능한 발현을 초래한다. 전형적으로, 본 발명의 일시적 형질감염 시스템 및 방법은 원하는 재조합 단백질 및 사용된 세포 유형들의 개별적인 발현 특성에 따라 재조합 발현된 단백질을 배양액의 약 200 ㎍ 단백질/L 내지 배양액의 약 2 g 단백질/L 범위 내의 수준으로 생산할 수 있다. 본원에 제공된 일시적 형질감염 시스템 및 방법을 사용할 때, 사용자는 표준의 상업적으로 입수할 수 있는 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 현재 수득할 수 있는 것을 약 2-배 내지 약 20-배 초과하는 수준의 발현된 단백질을 획득할 수 있다. 본원에 제공된 일시적 형질감염 시스템 및 방법을 사용할 때, 사용자는 현대의 일시적 발현 시스템에 의해 나타나는 것보다 약 2.5-배, 약 3-배, 약 3.5-배, 약 4-배, 약 4.5-배, 약 5-배, 약 5.5-배, 약 6-배, 약 6.5-배, 약 7-배, 약 7.5-배, 약 8-배, 약 8.5-배, 약 9-배, 약 9.5-배, 또는 최대 약 10-배 또는 더 큰 수준의 발현된 단백질을 수득할 수 있다. 예를 들면, 재조합 단백질을 생산하기 위해 본 발명의 일시적 형질감염 시스템을 사용할 때, 사용자는 현탁 세포들 중의 재조합 단백질의 생산을 위해 최적화된 상업적으로 입수할 수 있는 일시적 형질감염 시스템, 예컨대, 예, FREESTYLETM 발현 시스템을 사용하여 수득된 단백질 수율보다 약 2-배 내지 약 10-배 더 큰 단백질 수율을 획득할 수 있다.
본 발명은 추가로 관심 있는 높은 수준의 단백질을 발현하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 포유동물 세포들 (특히 상기 기재된 것들 및 가장 특별하게는 293 세포들, 293 F 세포들, PER-C6 세포들, CHO 세포들, CapT 세포들, COS-7L 세포들 및 Sp2/0 세포들, 또는 이들의 임의의 유도체)을 (a) 현탁액 중에서 재배되어야 할 포유동물 세포를 획득하는 것; 및 (b) 상기 세포를 현탁액 중의 세포의 배양을 지원하기에 충분한 조건 하에 본 발명의 배양 배지와 접촉시키는 것을 포함하여 현탁액 중에서 재배하는 단계, 상기 배양된 세포들을 관심있는 단백질을 인코딩하는 발현성 핵산으로 형질감염시키는 단계, 상기 형질감염된 세포들을 하나 이상의 발현 인핸서와 접촉시키는 단계, 상기 형질감염된 세포들을 한정된 기간 동안 관심있는 단백질의 발현에 허용되는 조건 하에 배양하는 단계, 및 상기 세포들을 수확하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드의 생산 방법들, 및 이들 방법에 의해 생산된 폴리펩타이드에 관한 것이며, 상기 방법들은 (a) 세포들, 바람직하게는 상기 기재된 포유동물 세포 및 가장 바람직하게는 293 세포들, 293 F 세포들, PER-C6 세포들, CHO 세포들, CapT 세포들, COS-7L 세포들 및 Sp2/0 세포들, 또는 이들의 임의의 유도체를 획득하는 단계; (b) 상기 세포를 핵산의 세포 내로의 도입을 유발하는 조건 하에 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 세포에 의한 원하는 폴리펩타이드의 발현을 선호하는 조건 하에 본 발명의 배양 배지 내에서 상기 세포를 재배하는 단계를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명에 따라 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 고밀도 배양 배지 내의 세포들의 배양물을 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 세포들은 바람직하게는 293 세포들, 293 F 세포들, PER-C6 세포들, CHO 세포들, CapT 세포들, COS-7L 세포들 또는 Sp2/0 세포들, 또는 이들의 임의의 유도체의 현탁 배양물이고, 그의 세포들은 고밀도 배지에서 성장하도록 적응되어 있다. 임의의 부피의 세포 배양액이 본 발명의 실시에 사용될 수 있음이 당업자에 의해 용이하게 인식될 수 있지만, 상기 배양액은 일반적으로 약 200 μL 내지 100 리터일 것이고, 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 2 ml 내지 약 50 리터, 가장 바람직하게는 약 5 ml 내지 약 5 리터이다. 일부 측면에서, 상기 세포 배양 부피는 약 100 ml 내지 약 50 리터일 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 50 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 25 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 10 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 5 리터이다. 더 바람직하게는, 상기 세포 배양 부피는 약 500 ml 내지 약 1 리터이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 배양 부피는 약 100 리터까지, 약 95 리터까지, 약 90 리터까지, 약 85 리터까지, 약 80 리터까지, 약 75 리터까지, 약 70 리터까지, 약 65 리터까지, 약 60 리터까지, 약 55 리터까지, 약 50 리터까지, 약 45 리터까지, 약 40 리터까지, 약 35 리터까지, 약 30 리터까지, 약 35 리터까지, 약 20 리터까지, 약 15 리터까지, 약 10 리터까지, 약 9 리터까지, 약 8 리터까지, 약 7 리터까지, 약 6 리터까지, 약 5 리터까지, 약 4 리터까지, 약 2 리터까지 또는 약 1 리터까지일 수 있다.
일 측면에서, 상기 세포 배양액은 약 1.5 x 106 세포들/ml 내지 약 20 x 106 세포들/ml, 또는 그에 포함되는 임의의 농도, 농도 범위 또는 하위 범위의 세포 밀도로 유지될 수 있다.
현재 기재된 발명에 따라 세포들 내의 단백질을 발현하기 위해, 상기 세포들은 전형적으로 신선한 부피의 배지 내로 희석될 것이다. 최적의 희석은 예시적인 목적을 위해 달라질 수 있지만, 신선한 부피의 배지 내로 희석된 세포들의 밀도는 0.5 x 106 세포들/ ml 내지 약 10 x 106 세포들/ml, 더 바람직하게는 1 x 106 세포들/ml 내지 약 5 x 106 세포들/ml, 더 바람직하게는, 1.5 x 106 세포들/ml 내지 약 3 x 106 세포들/ml일 수 있다.
일 측면에서, 세포들의 신선한 부피의 배양 배지 내로의 희석 후, 상기 세포들은 발현성 핵산에 의해 형질감염되기 전에 일정 기간 동안 상기 부피로 배양될 수 있다. 임의로, 상기 세포들은 2 일까지, 더 바람직하게는 약 하루 반나절까지, 가장 바람직하게는, 약 하루까지 동안 배양될 수 있다. 임의로, 상기 세포들은 내부에서 배양된 세포들의 밀도가 약 100%까지, 더 바람직하게는 약 95%까지, 약 90%까지, 약 85%까지, 약 80%까지, 약 75%까지, 약 70%까지, 약 65%까지, 약 60%까지, 약 55%까지, 약 50%까지, 약 45%까지, 약 40%까지, 약 35%까지, 약 30%까지, 약 25%까지, 약 20%까지 또는 약 15%까지 만큼 증가할 때까지 신선한 부피의 배지에서 배양될 수 있다.
일 측면에서, 세포들은 상기 세포들이 상기한 바와 같이 일정 기간 동안 고밀도 성장 배지에서 배양된 후 발현성 핵산 또는 발현 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 사용자가 발현 벡터의 세포들 내로의 도입을 수행하기 위해 착수하는 단계들의 정확한 순서는 선택된 특정 형질감염 시약, 세포주들, 배지 및 다양한 다른 실험 파라미터에 따라 달라질 수 있고, 이는 당업계의 통상의 기술 수준을 가진 실무자에 용이하게 인식될 것이다. 단지 예로서, 지질-기반 형질감염 시스템 (특히, 적어도 하나의 양이온성 지질을 갖는 형질감염 시스템)이 선택되는 경우에, 상기 형질감염 시약은 먼저 수용액 중의 핵산과 접촉하여 상기 정의되고 본원에 인용된 바의 "착화" 또는 "착화 반응"으로서 비공식적으로 공지된 공정에서 지질-DNA 착물을 형성할 것이다. 그러한 반응은 전형적으로 세포들이 배양되고 있는 별개의 반응 용기에서 달성될 것이다.
일 측면에서, 상기 착화 단계에서 지질-DNA 착물의 형성 후, 형질 감염 착물들은 배양된 세포들과 접촉될 수 있다. 세포들이 형질 감염 착물들과 접촉한 후, 이 세포들은 제1 기간 동안 형질 감염 착물들의 존재 하에 배양될 수 있다. 제1 기간의 지속 기간은 세포들, 사용된 형질감염 시약, 당업자에게 공지된 다양한 다른 인자들의 특성에 따라 변화할 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 방법들에 따라 세포들을 일시적으로 형질 감염시키는 방법의 맥락에서 사용될 때 어구 "제1 기간"은 일반적으로 세포들의 모집단을 발현 가능한 핵산에 의해 형질 감염시키는 것과 형질감염된 세포들에 하나 이상의 발현 인핸서를 추가하는 것 사이의 시간 간격을 의미한다. 통상적으로, 제1 기간은 약 2 시간 내지 약 4 일의 범위 내, 또는 그에 포함되는 임의의 범위 또는 하위 범위일 것이다. 특정한 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 제1 기간은 약 3 내지 약 90 시간, 약 4 내지 약 85 시간, 약 5 내지 약 80 시간, 약 6 내지 약 75 시간, 약 7 내지 약 70 시간, 약 8 내지 약 65 시간, 약 9 내지 약 60 시간, 약 10 내지 약 55 시간, 약 11 내지 약 50 시간, 약 12 내지 약 45 시간, 약 13 내지 약 40 시간, 약 14 내지 약 35 시간, 약 15 내지 30 시간, 약 16 내지 약 24 시간, 약 17 내지 약 24 시간, 약 18 내지 약 24 시간, 약 19 내지 약 24 시간, 약 20 내지 약 24 시간, 약 21 내지 약 24 시간, 약 22 내지 약 24 시간 또는 약 23 내지 약 24 시간의 범위 내일 수 있다. 다른 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 제1 기간은 약 15 시간까지, 약 16 시간까지, 약 17 시간까지, 약 18 시간까지, 약 19 시간까지, 약 20 시간까지, 약 21 시간까지, 약 22 시간까지, 약 23 시간까지, 약 24 시간까지, 약 25 시간까지, 약 26 시간까지, 약 27 시간까지, 약 28 시간까지, 약 29 시간까지 또는 약 30 시간까지 일 수 있다.
하나의 고도로 바람직한 비제한적인 구현예에서, 배양 배지는 형질 감염 착물들의 세포들로의 도입 후, 및 제1 기간의 지속 기간 동안 대체되거나, 보강되거나 또는 보충되지 않는다.
본 발명의 일 측면에서, 배양액 중의 형질감염된 세포들은 제1 기간 후 하나 이상의 발현 인핸서와 접촉될 수 있다. 발현 인핸서는 일시적 발현 시스템에서 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 하나 이상의 화합물을 함유하는 수용액일 수 있다. 다양한 발현 인핸서는 당업계에 공지되어 있고, 임의의 하나 이상의 인핸서가 제한 없이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
일반적으로, 하나 이상의 형질감염 인핸서는 상기 세포들이 발현 가능한 핵산 또는 발현 벡터에 의해 형질감염되는 동안 또는 그 후에 단백질-발현 세포들의 모집단과 접촉된다. 2개 이상의 발현 인핸서가 사용될 때, 각각의 발현 인핸서는 실질적으로 동일한 시점에 세포들과 접촉될 수 있거나, 또는 대안으로 발현 인핸서는 임의로 상기 세포들을 제1 발현 인핸서와 접촉시키는 것과 상기 세포들을 제2 발현 인핸서와 접촉시키는 것 사이에 일정 기간이 경과한 후 단백질-발현 세포들과 순차적으로 접촉될 수 있다.
임의의 수의 발현 인핸서가 제한 없이 본 발명의 실시에 사용될 수 있고, 본 발명의 구현예들에 사용하기 적합한 발현 인핸서를 구성하는 것들의 식별이 당업자의 이해 범위 내에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 쉽게 인정될 것이지만, 다양한 예시적이고 비제한적인 발현 인핸서가 이하 기재될 것이지만, 그의 인용은 본 발명의 실시에 사용하기 위해 고려될 수 있는 적합한 발현 범위를 제한하지 않음이 이해되어야 한다.
일부 측면에서, 하나 이상의 발현 인핸서는 현재 기재된 구현예들에 따라 배양 배지 제형을 보충하기 위해 사용된 액체 (바람직하게는 수성) 첨가물을 포함할 수 있고, 상기 첨가물은 현재 기재된 구현예들에 따라 일시적 단백질 발현 시스템에서 생산된 발현된 단백질의 수율을 개선하기 위해 선택되고 있다. 하나 이상의 발현 인핸서는 세포 주기 진행에 영향을 미치거나, 아폽토시스를 억제하거나, 세포 성장을 늦추고/늦추거나 단백질 생산을 촉진하는 여러 화합물들 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "발현 인핸서"는 일반적으로 일시적 형질감염 시스템에 부가되는 임의의 하나 이상의 화합물을 의미하고, 그의 존재는 그러한 발현 인핸서(들)의 부재 하에 나타난 발현 수준의 적어도 2배 내지 약 10배의 인자에 의해 표적 단백질의 발현을 증진시키거나 또는 촉진시킨다. 현재 기재된 구현예들과 함께 사용하기 적합한 예시적인 발현 인핸서는 첨가물, 예컨대 발프로산 (VPA, 산 및 나트륨 염), 나트륨 프로피오네이트, 리튬 아세테이트, 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 갈락토오스를 포함하는 당류, 아미노산 혼합물, 또는 부티르산, 또는 상기 언급된 것들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 각각의 특이적 발현 인핸서의 최적의 농도는 발현 시스템의 개별적인 특성 및 사용자의 요건에 따라 달라질 수 있고, 주어진 실험 시나리오에서 임의의 하나 이상의 발현 인핸서의 최적 농도를 구성하는 것의 결정은 당업계의 통상의 기술 수준을 가진 실무자의 이해 범위 내에서 잘 이루어진다.
하나의 예시적인 구현예에서, 발현 인핸서는 발프로산을 함유하는 제형일 수 있다. 본 발명의 실시에 사용된 발프로산 (VPA)의 최적의 최종 농도 범위는 달라질 수 있지만, 바람직하게는 약 0.20 mM 내지 약 25 mM의 범위 내, 또는 이러한 범위에 포함되는 임의의 하위 범위 또는 농도 값일 것이다. 더 바람직하게는, VPA의 최종 농도는 약 0.25 mM 내지 약 24 mM, 약 0.26 mM 내지 약 23 mM, 0.27 mM 내지 약 23 mM, 0.28 mM 내지 약 23 mM, 0.29 mM 내지 약 22 mM, 약 0.30 mM 내지 약 21 mM, 약 0.31 mM 내지 약 20 mM, 약 0.32 mM 내지 약 19 mM, 약 0.33 mM 내지 약 17 mM, 약 0.34 mM 내지 약 18 mM, 약 0.35 mM 내지 약 17 mM, 약 0.36 mM 내지 약 16 mM, 약 0.37 mM 내지 약 15 mM, 약 0.40 mM 내지 약 14 mM, 약 0.41 mM 내지 약 13 mM, 약 0.42 mM 내지 약 12 mM, 약 0.43 mM 내지 약 11 mM, 약 0.44 mM 내지 약 10 mM, 약 0.45 mM 내지 약 9 mM, 약 0.46 mM 내지 약 8 mM, 약 0.47 mM 내지 약 7 mM, 약 0.48 mM 내지 약 6 mM, 약 0.49 mM 내지 약 5 mM, 약 0.50 mM 내지 약 4 mM, 약 0.50 mM 내지 약 4 mM, 약 0.55 mM 내지 약 3 mM, 0.6 mM 내지 약 2 mM 또는 0.75 내지 약 1.5 mM의 범위 내일 수 있다. 일부 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 본 발명의 실시에 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.15 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.16 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.17 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.18 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.19 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.20 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.25 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.30 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.40 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.50 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.60 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.70 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.80 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.90 mM 내지 약 1.5mM 또는 약 0.10 mM 내지 약 1.5mM일 수 있다. 일부 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 본 발명의 실시에 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.20 내지 약 1.5 mM, 약 0.21 내지 약 1.4 mM, 약 0.22 내지 약 1.4 mM, 약 0.23 내지 약 1.4 mM, 약 0.24 내지 약 1.4 mM, 약 0.25 내지 약 1.3 mM, 약 0.25 내지 약 1.2 mM, 약 0.25 내지 약 1.1 mM, 또는 약 0.25 내지 약 1.0 mM일 수 있다.
또 하나의 예시적인 구현예에서, 발현 인핸서는 나트륨 프로피오네이트 (NaPP)를 함유하는 제형일 수 있다. 임의로, NaPP는 단독으로 또는 상기한 바의 발프로산과 조합하여 제공될 수 있다. 본 발명의 실시에 사용된 NaPP의 최적의 최종 농도 범위는 달라질 수 있지만, 바람직하게는 약 추가 구현예의 범위 내일 수 있고, 본 발명의 실시에 사용된 NaPP의 최적의 최종 농도는 약 0.2 mM 내지 약 100 mM의 범위 내, 또는 이러한 범위 내에 포함된 임의의 하위 범위 또는 개별적인 농도일 수 있다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NAPP의 최적의 최종 농도는 약 0.5 내지 약 80 mM, 약 0.4 mM 내지 약 70 mM, 약 0.5 mM 내지 약 60 mM, 약 0.6 mM 내지 약 50 mM, 약 0.7 mM 내지 약 40 mM, 약 0.8 mM 내지 약 30 mM, 약 0.9 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 15 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 9 mM, 약 4 mM 내지 약 8 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 범위 내일 수 있다. 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NAPP의 최적의 최종 농도는 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 2 mM, 약 2 mM 내지 약 3 mM, 약 3 mM 내지 약 4 mM, 약 4 mM 내지 약 5 mM, 약 5 mM 내지 약 6 mM, 약 6 mM 내지 약 7 mM, 약 7 mM 내지 약 8 mM, 약 8 mM 내지 약 9 mM, 또는 약 9 mM 내지 약 10 mM의 범위 내일 수 있다. 특정한 바람직한 비제한적인 구현예에서, NAPP의 최적의 최종 농도는 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 3 mM, 약 3.5 mM, 약 4 mM, 약 4.5 mM, 약 5 mM, 약 5.5 mM, 약 6 mM, 약 6.5 mM, 약 7 mM, 약 7.5 mM, 약 8 mM, 약 8.5 mM, 약 9 mM, 약 9.5 mM, 또는 약 10 mM일 수 있다.
또 하나의 예시적인 구현예에서, 발현 인핸서는 리튬 아세테이트 (LiAc)를 함유하는 제형일 수 있다. 임의로, LiAc는 단독으로 또는 상기한 바의 NaPP 또는 발프로산과 조합하여 제공될 수 있다. 추가 구현예에서, 본 발명의 실시에 사용된 리튬 아세테이트 (LiAc)의 최적의 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25 mM, 약 0.26 mM 내지 약 20 mM, 약 0.27 mM 내지 약 15 mM, 약 0.28 mM 내지 약 10 mM, 약 0.29 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.31 mM 내지 약 4 mM, 약 0.35 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 3 mM의 범위 내일 수 있다.
또 다른 하나의 예시적인 구현예에서, 발현 인핸서는 부티르산을 함유하는 제형일 수 있다. 본 발명의 실시에 사용된 부티르산의 최적의 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25 mM, 약 0.26 mM 내지 약 20 mM, 약 0.27 mM 내지 약 15 mM, 약 0.28 mM 내지 약 10 mM, 약 0.29 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.31 mM 내지 약 4 mM, 약 0.35 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 3 mM의 범위 내일 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 발현 인핸서는 형질감염 직전에 또는 그 동안, 또는 형질감염 후이지만, 세포들 및 발현된 단백질을 수확하기 전에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 이하에 기재된 일부 특이적이고 비제한적인 구현예들에서, "인핸서 1"은 일반적으로 0.25 mM - 1 mM 발프로산을 지칭하고, "인핸서 2"는 일반적으로 5 mM 7 mM 나트륨 프로피오네이트를 지칭한다. 그러나, 달리 지시되는 경우, 용어, 인핸서 1 및 인핸서 2는 상이한 인핸서 화합물을 포함할 수 있다. 발현 인핸서는 배양 배지에 순차적으로, 또는 칵테일로서 부가될 수 있다.
일 측면에서, 2개 이상의 발현 인핸서가 사용될 때, 2개 이상의 발현 인핸서는 실질적으로 동시에 형질감염된 배양 세포들과 접촉될 수 있거나, 또는 대안으로 형질감염된 배양 세포들은 제1 발현 인핸서와 최초로 접촉될 수 있고, 제2 기간 후, 형질감염된 배양 세포들은 제2 발현 인핸서와 접촉될 수 있다. 일 측면에서, 본원에 기재된 본 발명의 방법에 따라 세포들을 일시적으로 형질 감염시키는 방법의 맥락에서 사용될 때 "제2 기간"은 일반적으로 하나 이상의 발현 인핸서의 부가와 하나 이상의 추가의 인핸서의 부가 사이의 또는 형질감염된 세포들의 수확과 본원에 발현된 단백질의 정제 및 단리 사이의 시간 간격을 지칭한다. 전형적으로, 제2 기간은 약 10 시간 내지 약 10 일의 범위 내일 것이지만, 다른 시간 간격은 발현되고 있는 단백질에 대해 최적인 것으로 결정되는 경우에 사용될 수 있다. 일부 바람직한 비제한적인 구현예들에서, 제2 기간은 2 시간 내지 5 일, 2.5 시간 내지 4 일, 약 3 내지 약 90 시간, 약 4 내지 약 85 시간, 약 5 내지 약 80 시간, 약 6 내지 약 75 시간, 약 7 내지 약 70 시간, 약 8 내지 약 65 시간, 약 9 내지 약 60 시간, 약 10 내지 약 55 시간, 약 11 내지 약 50 시간, 약 12 내지 약 45 시간, 약 13 내지 약 40 시간, 약 14 내지 약 35 시간, 약 15 내지 30 시간, 약 16 내지 약 24 시간, 약 17 내지 약 24 시간, 약 18 내지 약 24 시간, 약 19 내지 약 24 시간, 약 20 내지 약 24 시간, 약 21 내지 약 24 시간, 약 22 내지 약 24 시간 또는 약 23 내지 약 24 시간의 범위 내일 수 있다. 다른 바람직한 비제한적인 구현예들예서, 제1 기간은 약 15 시간까지, 약 16 시간까지, 약 17 시간까지, 약 18 시간까지, 약 19 시간까지, 약 20 시간까지, 약 21 시간까지, 약 22 시간까지, 약 23 시간까지, 약 24 시간까지, 약 25 시간까지, 약 26 시간까지, 약 27 시간까지, 약 28 시간까지, 약 29 시간까지 또는 약 30 시간까지일 수 있다.
적절한 양의 시간이 경과한 후, 사용자는 세포들을 수확할 수 있고 임의로 발현된 재조합 단백질을 정제할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 공정 동안 배양 배지를 대체하거나, 보충하거나 또는 그렇지 않으면 보급할 필요 없이 상기 기재된 구현예들에 따라 사용자가 재조합 단백질을 일시적으로 발현하도록 허용한다. 본원에 기재된 방법들은 사용자가 배양 세포들을 약 2 g/L까지 발현하게 허용한다. 일부 구현예들에서, 사용자는 배양된 세포들의 리터마다 재조합 단백질을 약 1.9 g까지, 약 1.8 g까지, 약 1.7 g까지, 약 1.6 g까지, 약 1.5 g까지, 약 1.4 g까지, 약 1.3 g까지, 약 1.2 g까지, 약 1.1 g까지, 또는 약 1 g까지 발현시킬 수 있다.
본 발명은 또한 임의로 하나 이상의 대체 화합물을 포함하는 조성물, 특히 상기 정의된 바의 고밀도 세포 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 예를 들면, 진핵 세포들, 특히 동물 세포들을 시험관내에서 배양하는 방법을 포함하여 그러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 배양 배지 및 하나 이상의 세포들을 포함하는 조성물, 특히 내부에 특이적으로 참조된 세포들, 및 하나 이상의 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.　본 발명은 프로모터, 인핸서, 및 또한 상기 정의되고 본원에 인용된 바와 같이 배양 세포들 내의 상기 발현성 핵산을 발현하는데 필요한 다른 원소들과 조합하여 하나 이상의 발현성 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하나 이상의 발현 인핸서 조성물을 포함하는 조성물, 특히 적어도 하나의 인자에 의해 또는 2배 내지 2.5 배로 배양 세포들 내의 상기 발현성 핵산의 발현을 증진시키기 위해 선택된 것들에 관한 것이다. 임의로, 상기 발현 인핸서는 둘의 조합일 수 있거나 또는 발현 인핸서들은 공동-제형되거나 또는 별도로 제공될 수 있다. 본 발명은 또한 형질감염 시약, 특히 하나 이상의 핵산 분자를 배양 세포들의 내부로 전달하는 것을 촉진하기 위해 최적화된 것들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하나 이상의 상기-기재된 조성물, 벡터, 발현 인핸서, 형질감염 시약, 등을 포함하는 키트, 및 하나 이상의 상기-기재된 조성물, 특히 본원에 특이적으로 참조된 세포들을 포함하는 키트에 관한 것이다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 세포들의 시험관내 배양을 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 하나 이상의 용기를 포함하고, 여기서 제1 용기는 본 발명의 배양 배지를 함유한다. 상기 키트는 하나 이상의 추가의 용기를 추가로 포함할 수 있고, 각각의 용기는 하나 이상의 사이토카인, 헤파린, 하나 이상의 동물 또는 동물-유도된 펩타이드, 하나 이상의 효모 펩타이드 및 하나 이상의 식물 펩타이드 (벼, 알로에 베라, 대두, 옥수수, 밀, 완두콩, 호박, 시금치, 당근, 감자, 고구마, 타피오카, 아보카도, 보리 코코넛 및/또는 껍질 콩, 및/또는 하나 이상의 다른 식물들로부터의 하나 이상의 펩타이드임)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 보충물을 함유한다.
본 발명의 키트는 핵산 및/또는 적어도 하나의 거대분자의, 예, 핵산의 본 발명의 배지에서 배양된 세포들 내로의 도입을 촉진시키는 시약, 즉, 형질감염 시약을 포함하는 하나 이상의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 형질감염 시약은 양이온성 지질 등을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 따른 키트는 하나 이상의 본 발명의 배양 배지, 하나 이상의 금속 결합 화합물일 수 있는 하나 이상의 대체 화합물 및/또는 하나 이상의 전이 원소 착물을 포함할 수 있고, 임의로 하나 이상의 핵산 및 형질감염 시약을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 하나의 측면에 따를 키트는 하나 이상의 세포 배양 배지 (그중 하나는 기본 배지일 수 있음) 및 임의로 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 세포들을 배양하고/배양하거나 거대분자 또는 화합물 (예를 들면, 핵산, 예컨대 DNA)을 세포들 내로 도입하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서를 함유한다.
관련된 분야의 당업자에게 본 발명의 방법들에 대한 다른 적절한 변형 및 적응 본원에서 기재된 용도들은 명백하고 본 발명의 범위 또는 그의 임의의 구현예에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이하 본 발명을 상세히 기재하였지만, 동일한 것은 하기 실시예들을 참조하여 더욱 명확하게 이해될 것이고, 이는 단지 예시의 목적으로 이와 함께 포함된 것으로 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
목적:
단백질 수율을 (상업적으로 입수할 수 있는 일시적 발현 시스템, 예컨대, 예, FreestyleTM 293 시스템에 의해 수득된 것을 적어도 2배 초과하여) 최대화하는 세포 배양 배지 및 형질감염 시스템을 개발하기 위해. 이 시스템은 다수의 단백질 유형들에 대해서 및 다양한 현탁 세포들에서 작동해야 한다. 이 시스템은 재현성을 증가시키고 가변성을 최소화해야 하고 (다중-웰 플레이트에서 대규모로) 확장될 수 있어야 한다. 본 발명의 추가의 구현예들은 본 발명의 배양 시스템에서 고밀도 배양 조건하의 성장을 위해 적응된 고밀도 세포주인 개선된 발현 벡터의 발달, 예를 들면, (무엇보다도) 발프로산 및 나트륨 프로피오네이트와 같은 형질감염 인핸서들의 사용 및 혼입을 포함한다. 본 발명의 추가의 목적은 형질감염 동안 또는 그 후에 배지 교환을 수반하지 않고, 간단하고 사용하기 용이한, 형질감염을 높은 세포 밀도로 가능하게 하는 프로토콜을 개발하는 것이다.
명료함을 위해, 개별 구현예들의 맥락에서 기재된 본 발명의 특정 특징들은 단일 구현예에서 조합되어 제공될 수 있음이 인식된다. 반대로, 간결함을 위해, 단일 구현예의 맥락에서 기재된 본 발명의 다양한 특징들은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다.
실시예 1: 고밀도 배양 배지
다양한 상업적으로 입수할 수 있는 무혈청의 무단백질 배양 배지는 약 14 x 106 세포들/ml에 이르는 세포 밀도를 갖는 적응된 293 F 세포주들의 생존률을 지속하는 그들의 능력에 대해 평가되었고, 따라서 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 1주일을 초과하는 시간 프레임에 걸쳐 배양 세포주들의 생존률이 거의 15 x 106 세포들/ml의 높고 심지어 접근된 밀도로 남겨지는 동안에 무혈청의 무단백질 배지가 선택된 한편, 또한 약 3 x 106 세포들/ml (대 본 발명의 상업적으로 입수할 수 있는 일시적 형질감염 시스템에 대해 1 x 106 세포들/ml)의 놀랍게도 높은 세포 밀도에서 형질감염을 가능케 한다. 결과는 도 1에 도시되고, 이는 달성 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적인 형질감염 시스템을 사용하여 달성할 수 있는 결과의 세포 밀도의 그래프를 보여준다. 고밀도 성장을 위해 이전에 적응된 세포들은 3회 계대에 걸쳐 다양한 시험된 성장 배지 내로 서서히 적응되었다. 세포들이 적응되는 배지는 발명의 일 구현예에 따른 고밀도 배양 배지 (닫힌 원), 시험 배지 1 (닫힌 삼각형), 시험 배지 2 (열린 삼각형), 및 시험 배지 3 (열린 다이아몬드)를 포함한다. 세포들은 0.2 x 106 세포들/ml로 30 ml 플라스크에 시딩되기 전에 각각의 배지에서 다중 계대를 위해 배양되었다. 세포 밀도 및 생존률은 실험 과정에 걸쳐 성장 배지를 보급하거나, 대체하거나 또는 그렇지 않으면 보충하지 않고 8일에 걸쳐 모니터링되었다. 선택된 성장 배지 (고밀도 성장 배지; 닫힌 원) 중의 하나는 실험 과정에 걸쳐 생존률을 실질적으로 잃지 않고 배양된 현탁 세포들을 놀라울 정도의 고밀도로 유지할 수 있었다. 따라서, 당업자는 세포주의 변종인 특이적 세포주와 함께 사용하기 위한 다양한 성장 배지를 용이하게 평가하는 것이 가능하고, 여기서 성장 배지는 지정된 기간에 걸쳐 상기 배지를 대체하거나, 보충하거나 또는 보급할 필요 없이 고밀도의 현탁 세포들의 재배를 촉진하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 그러한 것은 과도한 실험과정 없이 당업자에 의해 달성될 수 있다.
실시예 2: 세포주 최적화
다양한 현탁 세포들이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 본 발명의 구현예들에 따라 선택된 고밀도 성장 배지에서 사용하도록 적응된 세포주를 사용하는 것이 바람직하다. 추가로, 세포들은 고밀도 성장, 높은 생존률, 및 증가된 단백질 발현을 위해 특별히 선택될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 부모 293F 섬유아세포 세포들은 여러 계대에 걸쳐 점진적인 배지 대체와 연관된 광범위한 적응 과정을 겪었다. 추가로, 적응된 세포들의 크기 및 발현 능력은 후속 세대들에 따라 증가한 것이 주목되었다. 계대 72에서, 세포들은 ATCC에서 기탁되고 유전적 분석을 통해 검증되었으며, 어떠한 마이코플라스마 오염도 없는 293F 세포로서 인증되었다. 세포들이 해동되었고 그의 생존률이 확인되었다. 세포들은 약 20 x 106 세포들/ml까지의 밀도로 배양액 중에서 성장할 때 안정성, 발현 성능, 및 높은 생존률을 유지하는 그의 능력을 검증하도록 30 계대 동안 계대 배양되었다. 상기 기재된 바의 증가된 세포 밀도, 생존률, 및 인간 IgG 발현을 위해 선택된 세포 집단은 원래의 세포주 (Line 1)보다 대략적으로 대략적으로 1.7-배 큰 hIgG를 보였다. 고수율의 적응된 세포들 (Line 3)은 또한 증가된 성장률, 생존률 및 세포 크기를 갖는다.
도 2는 본 발명의 일부 구현예들에 따라 일시적 형질감염 시스템과 함께 사용할 세포주 발현 최적화를 개략하는 막대 그래프를 보여준다. 부모 293F 세포주는 고밀도 배양 배지 내로 후속하여 적응된 다수의 계대 배양물로 슬릿되었다. 이어서, 고밀도로 성장할 수 있었던 다양한 계대 배양물이 선택되고 재조합 시험 단백질 (인간 IgG)을 발현하는 그들의 능력에 대해 평가되었다. 고수율의 적응된 293F 세포들로 표지된 세포들의 계대 배양물 (막대들의 우측 설정)은 동일한 부모 293F 세포주로부터 유도된 세포들의 2개의 상이한 계대 배양물보다 35% 내지 45% 더 많은 재조합 IgG를 발현하였다. 따라서, 당업자는 성장 배지와 함께 사용하기 위해 특별히 선택된 세포주 또는 세포주의 유도체를 용이하게 얻는 것이 가능하고, 지정된 기간에 걸쳐 배지를 대체하거나, 보충하거나 또는 보급할 필요 없이 고밀도의 현탁 세포들의 재배를 촉진하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 그러한 것은 당업자에 의해 과도한 실험 없이 달성될 수 있다.
실시예 3: 일시적 형질감염은 발현 인핸서에 의해 보조된다
화학적 첨가제들의 패널은 단백질 수율에 대해 각각의 성분의 상대적 기여도 또는 하나 이상의 성분들의 조합을 평가하기 위해 조합 실험에서 시험되었다. 다양한 형질감염/발현 인핸서는 단백질 생산을 현저히 개선시키는 것으로 확인되었다. 성분들은 2개의 안정한 인핸서 용액으로 제형되었다. 형질감염 인핸서 1 (상기 정의된 바의 발프로익산)은 hIgG 발현을 배가하였다. 인핸서 2 (상기 정의된 바의 나트륨 프로피오네이트)는 어떠한 강한 효과도 단독으로 갖지 않지만, 인핸서 1과의 조합으로, 대조군 (인핸서 1도 인핸서 2도 없음)에 비하여 거의 3배 이상의 hIgG를 제공한다.
도 3은 일부 구현예들에 따라 일시적 형질감염 시스템에 사용된 다양한 인핸서 1 및 인핸서 2의 효과를 개략하는 막대 그래프를 보여준다. 성분들은 2개의 안정한 인핸서 용액으로 제형되었다. 발현 인핸서 1의 부가는 hIgG 발현 (제1의 2개의 막대를 비교함)을 배가한다. 인핸서 2 자체의 부가는 IgG의 발현을 증진시키는데 대한 유일한 한계 효과를 보여주지만, 인핸서 1과 조합하여 첨가될 때, 대조군 (제3 및 제4 막대를 비교함)에 비하여 거의 3배 이상의 hIgG를 제공한다.
실시예 4: 단백질 발현 결과
본 발명의 일시적 발현 시스템은 1g/L 내지 약 2 g/L의 인간 IgG 및 Cripto를 생산할 수 있다. 본 발명 시스템의 일시적 발현 시스템은 상업적으로 입수할 수 있는 FreestyleTM 293 시스템과 비교하였을 때 도 4a 내지 4d에 나타낸 단백질들의 일시적 단백질 발현에서 3.5x 내지 11.8x 증가를 보였다. 도 4는 일부 구현예들 및 선행기술의 일시적 형질감염 시스템 (FreestyleTM 293 시스템)에 따라 고수율의 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 4개의 상이하고 독특한 단백질의 발현 수준의 비교를 보여준다. 도 4a는 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM Max 시스템에 비교하였을 때 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템을 사용하는 인간 IgG의 발현에 있어서 5배 이상의 증가를 보여준다. 도 4b는 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM Max 시스템에 비교하였을 때 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템을 사용하는 Cripto의 발현에 있어서 5.2배 이상의 증가를 보여준다. 도 4c는 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM Max 시스템에 비교하였을 때 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템을 사용하는 β2-아드레날린 수용체의 발현에 있어서 4배 이상의 증가를 보여준다. 도 4d는 상업적으로 입수할 수 있는 FreeStyleTM Max 시스템에 비교하였을 때 본 발명의 일부 구현예들에 따른 일시적 형질감염 시스템을 사용하는 토끼 IgG의 발현에 있어서 11배 이상의 증가를 보여준다.
실시예 5: EPO 발현, 확장성 및 재현성
다음으로, 본 발명자들은 임상적으로 중요한 널리 사용되는 발현된 단백질을 사용하여 일시적 형질감염 시스템의 확장성 및 재현성을 검사하고자 하였다. 에리트로포이에틴 (EPO)은 본 발명의 일시적 형질감염 시스템 (그래프 우측의 막들) 및 FreestyleTM 293 시스템 (그래프 좌측의 막대들)을 사용하여 발현되었다. 본 발명의 시스템은 1 ml (24-웰 플레이트 포맷)로부터 1L (3L 진탕 플라스크 포맷)까지 확장될 수 있다. 매우 우수한 재현성은 3개의 상이한 실험실에서 3개의 개별 분석의 결과에서 보여졌다.
결론:
2개의 상이한 단백질의 1 g/L 발현은 고수율의 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 달성되었다. 고밀도 배양 배지는 고밀도 형질감염을 가능케 하였다. 일시적 단백질 발현에 대한 현저한 개선이 세포주 선택을 통해 수득되었다. 형질감염 인핸서 형질감염 및 발현을 높은 세포 밀도로 개선시킨다. 그 결과는 매우 확장 가능하고, 재생 가능하다. 본 발명의 일시적 형질감염 시스템은 FreestyleTM 293 시스템에 비교하여 단백질 발현에서 3.5배 내지 15배 증가를 달성하였다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보들, 특허들 및 특허 출원들은 각각의 개별적인 공보, 특허 또는 특허 출원이 참고 문헌으로서 본원에 특별히 및 개별적으로 인용된 것을 지시하는 것과 동일한 정도까지 본원 명세서에 참고 문헌으로서 그의 전문으로 인용된다. 상충하는 경우 정의를 포함하여 본원 명세서는 제어될 것이다. 본 출원에서 임의의 참조 문헌의 인용 또는 확인은 그러한 참조가 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용 가능함을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

Claims (37)

  1. 배양된 진핵 세포들 내에 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음 단계:
    고밀도 배양 배지 중의 세포들을 포함하는 현탁 배양물 (상기 현탁 배양물은 약 2x106 내지 약 2x107 세포들/ml의 세포 밀도를 가짐)을 획득하는 단계;
    발현된 단백질을 생산할 수 있는 유전적 서열을 함유하는 발현 벡터를
    포함하는 발현성 핵산으로 상기 세포들을 형질 감염시키는 단계;
    상기 형질감염된 세포들을 제1 기간 동안 인큐베이팅하는 단계;
    상기 형질감염된 세포들을 적어도 하나의 발현 인핸서 조성물과 접촉시키는 단계;
    상기 벡터가 상기 단백질을 발현하도록 상기 형질감염된 세포들을 상기 형질감염 인핸서의 존재 하에 제2 기간 동안 인큐베이팅하는 단계; 및
    상기 제2 기간 후 상기 형질감염된 세포들을 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 배양된 진핵 세포들은 고밀도 조건 하에 성장하도록 적응된 현탁 배양물인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 현탁 배양물은 293 세포들, 293 세포들의 유도체, 293F 세포들, 293F 세포들의 유도체, PER-C6 세포들, PER-C6 세포들의 유도체, CHO 세포들, CHO 세포들의 유도체, CapT 세포들, CapT 세포들의 유도체, COS 세포들, COS 세포들의 유도체, COS-7 세포들, COS-7의 유도체, Sp2/0 세포들, 또는 Sp2/0 세포들의 유도체를 포함하고, 상기 세포들은 고밀도 조건 하에 성장을 위해 적응된 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 현탁 배양물이 293F 세포들의 유도체를 포함하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 현탁 배양물의 부피는 약 200 μL 내지 약 5 L의 범위 내인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 조성물은 발프로산 (VPA, 산 및 나트륨 염), 나트륨 프로피오네이트, 리튬 아세테이트, 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 갈락토오스를 포함하는 당류, 아미노산 혼합물, 또는 부티르산, 또는 상기 언급된 것들의 임의의 조합물 중의 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 발현 조성물은 발프로산을 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 발프로산 (VPA)의 농도가 약 0.20 mM 내지 약 25 mM의 범위 내인 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 발프로산의 농도가 약 0.25 mM 내지 약 24 mM, 약 0.26 mM 내지 약 23 mM, 0.27 mM 내지 약 23 mM, 0.28 mM 내지 약 23 mM, 0.29 mM 내지 약 22 mM, 약 0.30 mM 내지 약 21 mM, 약 0.31 mM 내지 약 20 mM, 약 0.32 mM 내지 약 19 mM, 약 0.33 mM 내지 약 17 mM, 약 0.34 mM 내지 약 18 mM, 약 0.35 mM 내지 약 17 mM, 약 0.36 mM 내지 약 16 mM, 약 0.37 mM 내지 약 15 mM, 약 0.40 mM 내지 약 14 mM, 약 0.41 mM 내지 약 13 mM, 약 0.42 mM 내지 약 12 mM, 약 0.43 mM 내지 약 11 mM, 약 0.44 mM 내지 약 10 mM, 약 0.45 mM 내지 약 9 mM, 약 0.46 mM 내지 약 8 mM, 약 0.47 mM 내지 약 7 mM, 약 0.48 mM 내지 약 6 mM, 약 0.49 mM 내지 약 5 mM, 약 0.50 mM 내지 약 4 mM, 약 0.50 mM 내지 약 4 mM, 약 0.55 mM 내지 약 3 mM, 0.6 mM 내지 약 2 mM 또는 0.75 내지 약 1.5 mM, 약 0.15 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.16 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.17 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.18 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.19 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.20 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.25 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.30 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.40 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.50 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.60 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.70 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.80 mM 내지 약 1.5mM, 약 0.90 mM 내지 약 1.5mM 또는 약 0.10 mM 내지 약 1.5mM의 범위 내인 방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 발현 조성물은 나트륨 프로피오네이트를 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 배양액 중의 나트륨 프로피오네이트의 상기 최종 농도는 약 0.2 mM 내지 약 100 mM의 범위 내인 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 배양액 중의 나트륨 프로피오네이트의 상기 최종 농도는 약 0.5 내지 약 80 mM, 약 0.4 mM 내지 약 70 mM, 약 0.5 mM 내지 약 60 mM, 약 0.6 mM 내지 약 50 mM, 약 0.7 mM 내지 약 40 mM, 약 0.8 mM 내지 약 30 mM, 약 0.9 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 15 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 9 mM, 약 4 mM 내지 약 8 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 범위 내이고, 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NAPP의 상기 최적의 최종 농도는 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 2 mM, 약 2 mM 내지 약 3 mM, 약 3 mM 내지 약 4 mM, 약 4 mM 내지 약 5 mM, 약 5 mM 내지 약 6 mM, 약 6 mM 내지 약 7 mM, 약 7 mM 내지 약 8 mM, 약 8 mM 내지 약 9 mM, 또는 약 9 mM 내지 약 10 mM의 범위 내일 수 있고, 특정 바람직한 비제한적인 구현예에서, NAPP의 상기 최적의 최종 농도는 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 3 mM, 약 3.5 mM, 약 4 mM, 약 4.5 mM, 약 5 mM, 약 5.5 mM, 약 6 mM, 약 6.5 mM, 약 7 mM, 약 7.5 mM, 약 8 mM, 약 8.5 mM, 약 9 mM, 약 9.5 mM, 또는 약 10 mM일 수 있는 방법.
  13. 청구항 6에 있어서, 상기 발현 조성물은 리튬 아세테이트를 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 배양액 중의 LiAc의 상기 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25 mM의 범위 내인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 배양액 중의 LiAc의 상기 최종 농도는 약 0.26 mM 내지 약 20 mM, 약 0.27 mM 내지 약 15 mM, 약 0.28 mM 내지 약 10 mM, 약 0.29 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.31 mM 내지 약 4 mM, 약 0.35 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 3 mM의 범위 내인 방법.
  16. 청구항 6에 있어서, 상기 발현 조성물은 부티르산을 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 배양액 중의 부티르산의 상기 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25 mM, 약 0.26 mM 내지 약 20 mM, 약 0.27 mM 내지 약 15 mM, 약 0.28 mM 내지 약 10 mM, 약 0.29 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.31 mM 내지 약 4 mM, 약 0.35 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 3 mM의 범위 내인 방법.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 현탁 배양물의 상기 부피는 약 25 mL μL 내지 약 50 L의 범위 내인 방법.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 현탁 배양물의 상기 부피는 약 100 mL μL 내지 약 1 L의 범위 내인 방법.
  20. 청구항 1에 있어서, 상기 현탁 배양물의 상기 부피는 약 200 mL μL 내지 약 500 mL의 범위 내인 방법.
  21. 청구항 1에 있어서, 상기 형질감염 단계의 상기 세포 밀도는 약 1x106 내지 약 20x106 세포들/ml인 방법.
  22. 청구항 1에 있어서, 상기 형질감염 단계의 상기 세포 밀도는 약 2x106 내지 약 6x106의 범위 내인 방법.
  23. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 벡터가 pCDNA3.3의 유도체인 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 pCDNA3.3의 유도체가 WPRE 요소를 포함하는 것인 방법.
  25. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 벡터가 WPRE 요소를 포함하는 것인 방법.
  26. 청구항 1에 있어서, 상기 방법이 상기 형질감염 단계 후 상기 고밀도 배양 배지의 대체, 보급, 또는 보충을 필요로 하지 않는 방법.
  27. 청구항 1에 있어서, 상기 고밀도 배양 배지가 상기 형질감염 단계 후 대체되지 않거나, 보급되지 않거나 또는 보충되지 않는 것인 방법.
  28. 청구항 1에 있어서, 상기 고밀도 배양 배지는 80%를 초과하여 남겨지는 세포 생존률을 갖는 2.5 x 106 세포들/ml을 초과하는 세포 밀도에서 형질감염된 세포들의 성장을 촉진할 수 있는 무혈청/무단백질 화학적으로 한정된 배양 배지인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 고밀도 배양 배지는 상기 형질감염 단계 후 상기 배지의 보충, 대체 또는 보급을 필요로 하지 않는 것인 방법.
  30. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 기간 후 상기 형질감염된 세포들을 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 발현된 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 청구항 1에 있어서, 상기 세포들은 하나 이상의 발현 증진 단백질을 발현하는 것인 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 발현 증진 단백질이 AKT, P18, P21, Bcl-XL, 및 PKBa로 구성된 리스트로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 청구항 32에 있어서, 상기 세포들은 하나 이상의 발현 증진 단백질을 일시적으로 발현하는 것인 방법.
  35. 청구항 32에 있어서, 상기 세포들은 하나 이상의 발현 증진 단백질을 안정되게 발현하는 것인 방법.
  36. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 기간은 약 2 시간 내지 약 4 일, 약 3 내지 약 90 시간, 약 4 내지 약 85 시간, 약 5 내지 약 80 시간, 약 6 내지 약 75 시간, 약 7 내지 약 70 시간, 약 8 내지 약 65 시간, 약 9 내지 약 60 시간, 약 10 내지 약 55 시간, 약 11 내지 약 50 시간, 약 12 내지 약 45 시간, 약 13 내지 약 40 시간, 약 14 내지 약 35 시간, 약 15 내지 30 시간, 약 16 내지 약 24 시간, 약 17 내지 약 24 시간, 약 18 내지 약 24 시간, 약 19 내지 약 24 시간, 약 20 내지 약 24 시간, 약 21 내지 약 24 시간, 약 22 내지 약 24 시간 또는 약 23 내지 약 24 시간의 범위 내이고, 다른 바람직한 비제한적인 구현예에서, 제1 기간은 최대 약 15 시간, 최대 약 16 시간, 최대 약 17 시간, 최대 약 18 시간, 최대 약 19 시간, 최대 약 20 시간, 최대 약 21 시간, 최대 약 22 시간, 최대 약 23 시간, 최대 약 24 시간, 최대 약 25 시간, 최대 약 26 시간, 최대 약 27 시간, 최대 약 28 시간, 최대 약 29 시간 또는 최대 약 30 시간일 수 있는 방법.
  37. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 기간은 약 10 시간 내지 약 10 일, 약 2 시간 내지 5 일, 약 2.5 시간 내지 4 일, 약 3 내지 약 90 시간, 약 4 내지 약 85 시간, 약 5 내지 약 80 시간, 약 6 내지 약 75 시간, 약 7 내지 약 70 시간, 약 8 내지 약 65 시간, 약 9 내지 약 60 시간, 약 10 내지 약 55 시간, 약 11 내지 약 50 시간, 약 12 내지 약 45 시간, 약 13 내지 약 40 시간, 약 14 내지 약 35 시간, 약 15 내지 30 시간, 약 16 내지 약 24 시간, 약 17 내지 약 24 시간, 약 18 내지 약 24 시간, 약 19 내지 약 24 시간, 약 20 내지 약 24 시간, 약 21 내지 약 24 시간, 약 22 내지 약 24 시간 또는 약 23 내지 약 24 시간의 범위 내이고, 다른 바람직한 비제한적인 구현예에서, 제1 기간은 최대 약 15 시간, 최대 약 16 시간, 최대 약 17 시간, 최대 약 18 시간, 최대 약 19 시간, 최대 약 20 시간, 최대 약 21 시간, 최대 약 22 시간, 최대 약 23 시간, 최대 약 24 시간, 최대 약 25 시간, 최대 약 26 시간, 최대 약 27 시간, 최대 약 28 시간, 최대 약 29 시간 또는 최대 약 30 시간일 수 있는 방법.

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