KR20150129001A - 프로모터 조성물 - Google Patents

Abstract

서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 또는 서열번호:7과 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 600 내지 1700개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 단리된 프로모터 서열.

Description

프로모터 조성물{PROMOTER COMPOSITIONS}

관련 출원

본원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/794,818호에 대해 우선권을 주장하며, 이의 전문은 본원에서 참고로 포함된다.

신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)에 대한 유전자요법에 대한 현재의 접근방식은 운반된 치료 유전자의 발현을 턴온(turn on)하고 셧오프(shut off)하는 능력이 결여되어 있다. 또한, 현재의 접근방식은 운반 후 치료 유전자의 발현량을 조절할 수 있는 능력이 결여되어 있다. 오늘날, 조절가능한 프로모터에 대한 요구가 있다.

요약

특정의 구현양태로, 본 발명은 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6 또는 서열번호:7과 적어도 90% 동일성을 갖는, 길이가 500 내지 1700개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는(또는 이루어진) 단리된 프로모터 서열을 제공한다. 특정의 구현양태로, 상기 프로모터는 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6 또는 서열번호:7과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.

특정의 구현양태로, 본 발명은 단백질 또는 RNA 전사물을 암호화하는 미리 결정된 DNA 절편에 기능적으로 연결되어 있는 형질전환된 세포에서 기능성인 상기 기재된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 특정의 구현양태로, 상기 미리 결정된 DNA 절편이 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 포함한다. 특정의 구현양태로, 상기 미리 결정된 DNA 절편이 치료 조성물을 암호화한다. 특정의 구현양태로, 상기 치료 조성물이 RNAi 분자이다.

특정의 구현양태로, 본 발명은 상기 기재된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정의 구현양태로, 상기 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다.

특정의 구현양태로, 본 발명은 상기 기재된 발현 카세트 또는 상기 기재된 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다. 특정의 구현양태로, 숙주 세포가 진핵세포이다. 특정의 구현양태로, 상기 진핵세포가 동물세포 (예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포)이다.

특정의 구현양태로, 본 발명은 형질전환된 세포의 생산 방법으로, (i) DNA 절편에 기능적으로 연결되어 있는, 상기 기재된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA를 세포증으로 도입시켜 형질전환된 세포를 수득하는 단계, 및 (ii) 형질전환된 세포주를 확인하거나 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정의 구현양태로, 상기 재조합 DNA가 발현되어 형질전환된 세포에 표현형질(phenotypic characteristic)을 부여한다. 특정의 구현양태로, 상기 형질전환된 세포가 대조 개체로부터 유래된 세포와 비교하여 헌팅톤병(Huntington's disease) 환자로부터 유래된 세포에 도입되었을 때 유의하게 증가된 리포터 유전자의 발현을 나타낸다.

특정의 구현양태로, 본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 제조되는 형질전환된 세포를 제공한다.

특정의 구현양태로, 본 발명은 상기 기재된 단리된 프로모터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다.

특정의 구현양태로, 본 발명은 상기 기재된 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다.

특정의 구현양태로, 본 발명은 포유류에서 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법으로, (a) 상기 기재된 벡터, 또는 (b) 상기 기재된 형질전환된 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

도 1은 5종의 프로모터에 대한 발현 분석으로 건강한 대조 개체와 비교할 때 헌틴톤병 환자의 사후 뇌 물질에서 이들의 내인성 전사물의 상향조절이 증명됨을 보여준다.
도 2a 내지 2c는 6주(도 2a), 11주(도 2b) 및 19주(도 2c)에서의 헌팅톤병 마우스의 뇌에서 내인성 전사물의 상향조절을 보여준다.
도 3은 클로닝된, 유전자 프로모터 서열의 활성을 보여준다.
도 4는 리포터 유전자(루시퍼라제)의 발현에 의해 증명되는 바와 같은 클로닝된, 유전자 프로모터 서열의 유도를 보여준다.

본 발명은 신경퇴행성 질환의 시작 또는 병리학적 진행 중에 유전자 서열의 발현을 활성화시키거나, 증진시키거나 또는 억제할 수 있는 유전자 프로모터 서열의 용도를 제공한다. 본 발명은 유전자요법 분야에 직접 적용할 수 있다. 이는 신경퇴행성 질환의 조절된 유전자요법 접근방식을 개발하는데 있어서 도구(tool)로서 잠재적인 상업적 가치가 있다. 본 발명은 신경퇴행성 질환의 상태 또는 진행 속도를 기본으로 질병의 과정 중 치료 유전자를 투약하거나 치료 유전자의 발현을 조절하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 질환의 진행 중, 상기 유전자 프로모터 서열은 치료 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. 이 요법이 질환의 진행을 중단시킨다면, 상기 유전자 프로모터 서열의 활성은 차츰 작아져서, 치료 유전자 발현이 감소/제한된다. 이런 치료 유전자 발현에 대한 질병-조절된 동적 접근방식은 독특한 것이며 유전자요법 분야에서 필요로 하는 것이다.

본 발명은 유전자요법 분야에 적용할 수 있다. 이는 치료 유전자가 뇌로 운반된 후 이의 조절 및/또는 투약에 대한 필요성을 만족시킨다. 유전자 발현 분석으로 신경퇴행성 질환의 시작할 때 및/또는 진행 과정 중에, 수 많은 유전자 프로모터 서열이 유전자의 발현을 "턴-온"하거나, 증진시키거나, 억제하거나 또는 "셧-오프"하는 작용을 하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 신경퇴행성 질환의 세포 및 동물 모델에서 신경퇴행성 질환 진행 중에 유전자 발현을 활성화시키고/시키거나 증진시키는 유전자 프로모터 서열을 확인하고 클로닝(cloning)하였다. 이들 유전자 프로모터 서열은 또한 신경퇴행성 질환 모델에서 신경퇴행성 질환 진행 중에 리포터 유전자의 발현을 활성화시키고/시키거나 증진시킬 수 있다. 이런 접근방식은 독특한 것이며 치료 유전자의 발현을 조절하기 위한 신경퇴행성 질환 관련 분자 반응(event)에 의존하는, 인위적으로 치료 유전자 발현을 조절하는, 현재 사용되는 시스템과는 상이하다. 이러한 반응들과, 이에 따른 특정 유전자 프로모터 서열의 활성은 질환의 시작 및/또는 진행에 의존하는, 세포내 및/또는 세포외 시그날에 의해 제어/유도된다.

본 발명자들은 대조 개체 또는 헌팅톤병 (즉, 신경퇴행성 질환) 유전자 돌연변이를 갖고 있는 개체로부터 수득한 조직 배양된 세포에서 7개의 상이한 유전자 프로모터 서열의 활성을 확인하여, 클로닝하고 시험하였다. 그런 실험들은 대조 개체로부터 유래된 세포와 비교할 때 헌팅톤병 환자로부터 유래된 세포에 도입될 경우 이들 유전자 프로모터 서열은 리포터 유전자의 발현을 현저하게 증가시킬 수 있음을 증명한다. 게다가, 프로테아좀(proteasome) 억제제 또는 염증-전 자극과 같은 인위적인 스트레스요인이 도입되면 배양된 세포에서 내재적으로 제어된 전사물 또는 리포터 유전자의 발현으로 측정한 바 상기 유전자 프로모터 서열로부터 활성을 증가시킨다. 또한, 본 발명자들은 헌팅톤병 (즉, 신경퇴행성 질환)의 마우스 모델에서 내인성 조절된 유전자 전사물의 정량적 PCR 분석에 의해 측정한 바 이들 유전자 프로모터 서열의 활성에서 질병 진행-의존적인 증가를 검출하였다.

프로모터 서열

특정의 구현양태로, 본 발명은 유전자 발현을 활성화시키고/시키거나 증진시키는 다음과 같은 프로모터 서열을 제공한다: 유비퀴틴 특이적 펩티다제(ubiquitin specific peptidase) 31 (USP31 , 서열번호:1), 감마- FBG (서열번호:2), H2A 히스톤계, 구성원 Y (H2AFY , 서열번호:3), 핵 전자 인자 Y, 감마 (NYFC , 서열번호:4), DNA-손상-유도성 전사물 3 (CHOP, 서열번호:5), 비-암호화 38A RNA (38A 좌위(locus), 서열번호:6), 및 비-암호화 17A RNA (17A, 서열번호:7).

유전자ID : USP31 ( 서열번호:1 )

유전자 ID: 감마- FBG ( 서열번호:2 )

유전자 ID: H2AFY ( 서열번호:3 )

유전자 ID: NYFC ( 서열번호:4 )

유전자 ID: CHOP ( 서열번호:5 )

유전자 ID: 38A 좌위(locus) ( 서열번호:6 )

유전자 ID: 17A 좌위 ( 서열번호:7 )

"프로모터"는 RNA 폴리머라제 및 적합한 전사에 요구되는 기타 인자에 대해 인식하여 암호화 서열의 발현을 제어하는, 뉴클레오티드 서열, 통상적으로는 이의 암호화 서열에 대해 업스트림(upstream)(5')을 지칭한다. "프로모터"에는 TATA-박스와 전사 개시 부위 (여기에는 발현 제어를 위하여 조절 성분이 부가된다)를 명시하는 역할을 하는 기타 서열로 이루어진 짧은 DNA 서열인 최소 프로모터가 포함된다. "프로모터"는 또한 최소 프로모터 + 암호화 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 조절 성분을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이런 유형의 프로모터 서열은 가까운 쪽의 업스트림 성분과 더 먼 쪽의 업스트림 성분으로 이루어져 있으며, 더 먼 쪽의 업스트림 성분은 흔히 인헨서로 지칭되는 성분이다. 따라서, "인헨서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이며 프로모터의 선천적인 성분이거나 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위하여 삽입된 이종성 성분일 수 있다. 이는 양쪽 배향 (정상 또는 거꾸로)으로 작동할 수 있으며, 프로모터로부터 업스트림 또는 다운스트림으로 이동했을 때에도 작용할 수 있다. 인헨서와 기타 업스트림 프로모터 성분 둘 다 이들의 효과를 매개하는 서열-특이적 DNA-결합 단백질에 결합한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체로 유래될 수 있거나 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래하는 상이한 성분들로 이루어질 수 있거나, 심지어는 합성 DNA 절편으로 이루어질 수 있다. 프로모터는 또한 생리학적 조건 또는 발달과 관련된 조건에 대한 반응으로 전사 개시의 유효성(effectiveness)을 제어하는 단백질 인자의 결합에 관여하는 DNA 서열을 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "생물학적으로 활성"은 서열번호:1 또는 서열번호:2를 포함하는 CCT 프로모터의 활성을 적어도 약 0.1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 심지어 90% 이상, 예를 들면, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 갖고 있음을 의미한다. 프로모터의 활성은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989))을 참조한다. 서열번호:1 또는 서열번호:2와 동일하지 않지만, 필적하는 생물활성(biological activity)을 보유하는 본 발명의 프로모터는 변형 프로모터로 불리운다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 천연 서열 뿐만 아니라 재조합 형태 둘 다 포함한다.

본 발명은 단리된 또는 실질적으로 정제된 핵산 조성물을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, "단리된" 또는 "정제된" DNA 분자 또는 RNA 분자는 이의 천연 환경에서 분리되어 존재하며 따라서 천연 산물이 아닌 DNA 분자 또는 RNA 분자이다. 단리된 DNA 분자 또는 RNA 분자는 정제된 형태로 존재할 수 있거나 예를 들어, 형질전환 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다. 예를 들어, "단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분은 다른 세포질 물질, 또는 재조합 기술에 의해 생산되었을 때 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성되었을 때 화학적 전구물질 또는 기티 화학물질이 실질적으로 없다. 하나의 구현양태로, "단리된" 핵산은 상기 핵산이 유래하는 유기체의 게놈성 DNA에 상기 핵산이 자연적으로 측면에 있는 서열 (즉, 상기 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)이 없다. 예를 들어, 여러 가지 구현양태에서, 상기 단리된 핵산 분자는 상기 핵산이 유래하는 세포의 게놈성 DNA에 핵산 분자가 자연적으로 측면에 있는 뉴클레오티드 서열을 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만으로 포함할 수 있다. 상기 개시된 뉴클레오티드 서열의 단편 및 변형체가 또한 본 발명에 포함된다. "단편" 또는 "부분(portion)"은 전체 길이 또는 전체 길이보다 짧은 상기 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

용어 "핵산"은 당, 인산염과 퓨린 또는 피리미딘 중 하나인 염기를 포함하는 모노머(뉴클레오티드)로 이루어진, 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 천연 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 표시되지 않는 한, 특정의 핵산 서열은 또한 이들의 보존적으로 변형된 변형체 (예, 축퇴성(degenerate) 코돈 치환)와 상보적 서열, 뿐만 아니라 명백하게 표시된 서열을 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코톤 치환은 하나 이상 선택된 (또는 모든) 코돈 중 제3의 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 성취될 수 있다. "핵산 단편"은 제시된 핵산 분자의 부분이다.

"자연적으로 존재하는(naturally occurring)", "천연" 또는 "야생형"은 인위적으로 생산되는 것과 구별되어 자연에서 발견될 수 있는 대상을 기재하기 위하여 사용된다. 예를 들어, 천연 자원으로부터 단리될 수 있으며 실험실의 연구원에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 유기체 (바이러스 포함)에 존재하는 단백질 또는 뉴클레오티드 서열이 자연적으로 존재한다.

벡터 및 발현 카세트

특정의 구현양태로, 본 발명은 상기 기재된 프로모터를 포함하는 벡터 및 발현 카세트를 제공한다.

벡터

"벡터"는 특히 바이러스성 벡터뿐만 아니라 자가-전파(transmissible) 또는 가동성(mobilizable)일 수 있거나 아닐 수 있으며, 세포의 게놈에 삽입시키거나 염색체외적으로 존재함으로써 (예를 들면, 복제 기원이 있는 자율적 복제 플라스미드) 원핵세포 숙주 또는 진핵세포 숙주를 형질전환시킬 수 있는, 이중가닥 또는 단일가닥 선형 또는 환형의, 임의의 플라스미드, 코스미드, 파아지 또는 이원 벡터(binary vector)를 포함하는 것으로 정의된다.

특이적인 치료 조성물 (예를 들면, 단백질)을 세포에서 발현시키기 위하여 특정의 발현 벡터를 선택하고 최적화하는 것은 단백질, 가능하게는 하나 이상의 적합한 제어 영역 (예를 들면, 프로모터, 삽입 서열)을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 수득하고; 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 삽입되어 있는 벡터를 포함하는 벡터 작제물을 제조하여; 상기 벡터 작제물로 배양된 세포를 시험관내에서 형질감염 또는 형질도입시키고; 단백질이 상기 배양된 세포에 존재하는지 여부를 결정함으로써 수행될 수 있다.

세포 유전자요법용 벡터는 복제-결핍 바이러스와 같은 바이러스를 포함한다. 복제-결핍 레트로바이러스는 모든 비리온 단백질의 합성을 지시할 수 있지만, 감염성 입자를 제조할 수는 없다. 따라서, 이들 유전적으로 변화된 레트로바이러스 발현 벡터는 배양된 세포에서 핵산 서열의 고-효율 형질도입에 있어서의 범용성과, 본 발명의 방법에서의 용도에 대한 특이적인 실용성을 갖는다. 그러한 레트로바이러스는 또한 생체내에서 세포에 핵산 서열을 효율적으로 형질도입시키는데 있어서 실용성을 갖는다. 레트로바이러스는 핵산 물질을 세포 중으로 전이시키는데 널리 사용되었다. 복제-결핍 레트로바이러스를 생산하기 위한 프로토콜 (외인성 핵산 물질을 플라스미드 중으로 포함시키는 단계, 패키징 세포주를 플라스미드로 형질감염시키는 단계, 상기 패키징 세포주에 의해 재조합 레트로바이러스를 생산하는 단계, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자를 수집하는 단계, 및 상기 바이러스 입자로 표적 세포를 감염시키는 단계를 포함함)은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다.

유전자요법에 레트로바이러스를 사용하는 것의 유익한 점은 상기 바이러스가 표적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 숙주 세포 게놈 내로 삽입하고, 이에 의해 세포가 분열할 때 세포의 자손에게 표적 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 전달될 수 있도록 하는 것이다. LTR 영역 내의 프로모터 서열은 다양한 유형의 세포에서 삽입된 암호화 서열의 발현을 증진시킬 수 있다.

세포의 형질전환용 발현 벡터로서 유용한 다른 바이러스 후보물질은 아데노바이러스(Ad)로, 이는 이중가닥 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스는 예를 들어, 근육 및 내피세포를 포함한, 광범위한 유형의 세포에서 감염성이다. 아데노바이러스는 36 kb 게놈이 있는 이중가닥 선형 DNA 바이러스이다. 생체내에서 유전자 운반을 용이하게 하는 것과 같은, 아데노바이러스의 여러가지 특성은 이들을 치료적 적용을 위한 전이유전자 운반 비히클로서 유용하게 만들었다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 폐, 뇌, 췌장, 담낭, 및 간을 포함한, 다양한 기관의 실질세포(parenchymal cell)로 제자리(in situ) 유전자를 효율적으로 전이시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 낭성 섬유증과 같은 내재된 유전병의 치료 방법에 이들 벡터를 사용할 수 있도록 하는데, 여기서 벡터가 표적 기관으로 운반될 수 있다.

레트로바이러스와 같이, 아데노바이러스 게놈을 유전자요법에서 발현 벡터용으로 채택할 수 있는데, 즉, 바이러스 자체의 생산을 제어하는 유전자 정보를 제거함으로써 채택할 수 있다. 아데노바이러스가 염색체외적 방식으로 작용하기 때문에, 재조합 아데노바이러스는 삽입성 돌연변이유발의 이론적 문제점을 갖지 않는다.

몇몇 접근방식이 재조합 아데노바이러스를 발생시키는데 전통적으로 사용되었다. 그 중 한가지 접근방식은 당해 핵산 서열을 함유하는 제한 엔도뉴클레아제 단편을 아데노바이러스 게놈의 부분에 직접 라이게이션(ligation)시키는 것을 포함한다. 대안적으로, 당해 핵산 서열을 상동적 재조합 결과에 의해 결함이 있는 아데노바이러스 중에 삽입시킬 수 있다. 목적하는 재조합체는 상보관계 세포의 론(lawn)에서 생성된 개별적 플라크를 스크리닝하여 확인한다.

적합한 벡터의 예로 DNA 바이러스 (예, 아데노바이러스), 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 폴리오바이러스, HSV, 또는 쥐의 몰로니(Moloney)-기본 바이러스성 벡터, 하비 사르코마(Harvey Sarcoma) 바이러스로부터 유래하는 바이러스성 벡터, ROUS 사르코마 바이러스, MPSV 또는 하이브리드 전이인자(transposon) 기본 벡터가 포함된다. 하나의 구현양태로, 벡터가 AAV이다. AAV는 파르보바이러스과 계열의 작은 비병원성 바이러스이다. AAV는 복제를 위한 헬퍼 바이러스에 대한 이의 의존성으로 이 계열의 다른 바이러스와 구별된다. AAV의 대략 5 kb 게놈은 양 또는 음의 극성을 갖는 단일가닥 DNA의 절편 하나로 이루어져 있다. 상기 게놈의 말단은 짧은 역위 말단 반복서열로 이는 헤어핀 구조로 폴딩되어 바이러스 DNA 복제 기원으로 작용할 수 있다. 물리적으로, 파르보바이러스 비리온은 외피가 없으며(non-enveloped) 이의 아이코소헤드랄 캡시드(icosohedral capsid)는 직경이 대략 20 nm이다.

지금까지 수많은 혈정학적으로 구별되는 AAV가 확인되었고 인간 또는 영장류로부터 단리되었다. 예를 들면, AAV2의 게놈은 길이가 4680개의 뉴클레오티드이고 2개의 개방 판독 프레임(ORF)을 포함한다. 좌측 ORF는 비-구조적 Rep 단백질인, Rep 40, Rep 52, Rep 68 및 Rep 78을 암호화하는데, 이들 Rep 단백질은 단일가닥 후손 게놈의 생산 외에 복제와 전사의 조절에 관여한다. Rep68/78은 또한 NTP 결합 활성 뿐만 아니라 DNA 및 RNA 헬리카제 활성을 갖는 것으로 나타났다. Rep 단백질은 핵 국재화 시그날 뿐만 아니라 잠재적인 포스포릴화 부위를 갖는다. 이들 키나제 부위 중 하나의 돌연변이로 복제 활성이 소실되었다.

상기 게놈의 말단은 짧은 역위 말단 반복서열(ITR)로 이는 T-형 헤어핀 구조로 폴딩되어 바이러스 DNA 복제 기원으로 작용하는 잠재성을 갖고 있다. 상기 ITR 영역 내의 2개의 성분은 ITR, GAGC 반복 모티프(motif) 및 말단 분해 부위(trs)의 기능에 있어서 중심이 되는 것으로 기재되어 있다. 상기 반복 모티프는 상기 ITR이 선형 또는 헤어핀 구조로 존재할 때 Rep에 결합하는 것으로 나타났다. 이 결합은 trs에서의 분열을 위하여 Rep68/78이 위치하도록 작용하며, 분열은 부위- 및 가닥(strand)-특이적 방식으로 일어난다. AAV 벡터는 광범위한 숙주를 갖는 것과 같은, 몇몇 특징을 갖는데, 이는 이 벡터가 유전자 전달을 위한 매력적인 벡터로 만들며, 시험관내 및 생체내에서 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포 둘 다에 형질도입시킬 수 있고, 형질도입된 유전자의 발현 수준을 높게 유지할 수 있도록 한다.

특정의 구현양태로, 바이러스성 벡터가 AAV 벡터이다. "AAV" 벡터는 아데노-관련 바이러스를 지칭하는 것이며, 자연적으로 존재하는 야생형 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하는데 사용될 수 있다. 상기 용어는 모든 아류형(subtype), 혈청형(serotype) 및 위형(pseudotype)과, 자연적으로 존재하는 형태 및 재조합 형태 둘 다를 포괄한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "혈청형"은 규명된 항혈청과의 캡시드 단백질 반응성을 기본으로 확인되고 다른 AAV와 구별되는 AAV를 지칭하는 것으로, 예를 들면, 영장류 AAV의 8개의 공지된 혈청형, AAV1 내지 AAV8이다. 예를 들어, 혈청형 AAV9는 AAV9의 캡 유전자로부터 암호화된 캡시드 단백질 및 동일한 AAV9 혈청형으로부터의 5' 및 3' ITR 서열을 함유하는 게놈을 포함하는 AAV를 지칭하는 것으로 사용된다. 특정의 구현양태로, AAV 벡터가 AAV9이다.

약어 "rAAV"는 재조합 AAV 벡터 (또는 "rAAV 벡터")라고도 지칭되는, 재조합 아데노-관련 바이러스를 지칭한다. 하나의 구현양태로, AAV 발현 벡터가, 적어도, 전사 방향으로 기능적으로 연결된 성분들, 전사 개시 영역, 당해 DNA 및 전사 종결 영역을 포함한 제어 성분으로서 제공하기 위한 공지의 기술을 사용하여 작제된다. 상기 제어 성분들은 포유류 세포에서 기능성인 것으로 선택한다. 기능적으로 연결된 성분을 포함하는 생성된 작제물을 기능성 AAV ITR 서열과 측면(5' 및 3')에 배치한다.

"아데노-관련 바이러스 역위 말단 반복서열" 또는 "AAV ITRs"는 DNA 복제 기원 및 바이러스에 대한 패키징 시그날로서 cis에서 함께 작용하는 AAV 게놈의 각각의 말단에서 발견되는 기술-인증된 영역을 의미한다.

AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "AAV ITR"은 묘사된 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요는 없지만, 예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 부가적으로, AAV ITR은 제한없이, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등을 포함한, 수 개의 AAV 혈청형 중 하나로부터 유래할 수 있다. 또한, AAV 벡터에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 측면에 있는 5' 및 3' ITR이 의도하는 대로, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 당해 서열을 절제 및 구조하는 한, 이들이 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형 또는 단리물로부터 유래될 필요는 없다.

문헌(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY (2001))에 기재된 바와 같은 것들과 같은 표준 라이게이션(ligation) 기술을 사용하여 치료 조성물을 암호화하는 핵산을 AAV 벡터내로 조작할 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 20 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 ㎍/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, 및 40 μM ATP, 0.01-0.02 (Weiss) 유니트 T4 DNA 리가제, 0°C ("점착 말단" 라이게이션의 경우) 또는 1 mM ATP, 0.3-0.6 (Weiss) 유니트 T4 DNA 리가제, 14°C ("평활 말단" 라이게이션의 경우) 중 하나로 수행할 수 있다. 분자간 "점착 말단" 라이게이션은 통상적으로 30-100 ㎍/ml 총 DNA 농도 (5-100 nM 총 최종 농도)에서 수행된다. ITRs을 포함하는 AAV 벡터는 미국 특허 제5,139,941호에 기재되어 있다. 특히, 몇몇 AAV 벡터가 상기 특허에 기재되어 있으며 American Type Culture Collection ("ATCC")으로부터 수탁번호 53222, 53223, 53224, 53225 및 53226하에 입수할 수 있다.

특정의 구현양태로, 상기 아데노-관련 바이러스가 전장(full-length) 게놈, 즉, 천연 게놈과 대략 동일한 크기인 게놈을 패키징하고 있으며, 너무 크거나 너무 작지 않다. 특정의 구현양태로, AAV가 자기-상보적 AAV 벡터가 아니다.

바이러스성 벡터는 이종성 유전자의 전사를 제어하기 위한 프로모터를 추가로 포함한다. 상기 프로모터는 치료 조성물의 전사를 제어하기 위한 유도성 프로모터일 수 있다. 발현 시스템은 포유류 수용체로의 투여에 적합하다.

특정의 구현양태로, 바이러스성 입자가 투여된다. 바이러스성 입자는 열안정성이고, 용매, 세제에 대해, 및 pH, 온도에서의 변화에 대해 내성이 있으며, CsCl 구배 상에서 농축될 수 있다. AAV는 어떠한 병원성 사건과도 관련이 없으며, AAV 벡터를 사용한 형질도입은 세포 성장 또는 분화에 어떠한 지속적인 네가티브 효과도 유발하지 않는 것으로 밝혀졌다. ITRs는 벡터 시스템을 생성시키기 위하여 바이러스 유전자를 완전히 제거하도록 하는 패키징에 필요한 cis 성분일 뿐인 것으로 나타났다.

특정의 구현양태로, 본 발명은 표적 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 함유하는 벡터를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "발현 카세트"는 종결 시그날에 기능적으로 연결될 수 있는 당해 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결되어 있는 프로모터를 포함하는, 적합한 숙주 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 상기 암호화 영역은 통상적으로 당해 기능성 RNA, 예를 들면 RNAi 분자에 대해 암호화한다. 당해 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있다.

본 발명의 특정의 구현양태는 단리된 RNAi 분자와 같은, 표적 분자를 암호화하는 벡터를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "에 의해 암호화된"은 특허 전문용어에서 용어 "포함하는"과 유사하게, 광의적 의미로 사용된다. RNAi 분자에는 siRNAs, shRNAs 및 예를 들어 RNA 간섭을 통하여, 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 다른 작은 RNAs가 포함된다. 그러한 작은 RNAs에는 제한없이, shRNAs와 마이크로RNAs (miRNAs)가 포함된다.

"기능적으로 연결된"이란 서열 중 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 연관(association)을 지칭한다. 예를 들어, 조절성 DNA 서열이 암호화 DNA 서열의 발현에 영향을 주도록 두 서열이 위치할 경우, 조절성 DNA 서열은 RNA 또는 폴리펩타이드에 대해 암호화하는 DNA 서열과 "기능적으로 연결되어있다" 또는 "연관되어있다"고 언급된다 (즉, 암호화 서열 또는 기능성 RNA가 프로모터의 전사 제어하에 있다). 암호화 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 기능적으로-연결될 수 있다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치할 때 "기능적으로 연결"되어 있다. 일반적으로, "기능적으로 연결된"이란 연결될 DNA서열이 인접하고 있음을 의미한다. 그러나, 인헨서는 인접하고 있어서는 안된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 성취된다. 그러한 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)가 관례에 따라서 사용된다. 부가적으로, 효소를 암호화하는 핵산의 다중 카피가 발현 벡터에서 함께 연결될 수 있다. 그러한 다중 핵산은 링커에 의해 분리될 수 있다.

"발현"은 세포에서 내인성 유전자 또는 전이유전자의 전사 및/또는 해독을 지칭한다. 예를 들어, 안티센스 작제물의 경우, 발현은 안티센스 DNA 만의 전사를 지칭한다. 또한, 발현은 센스(mRNA) 또는 기능성 RNA의 전사 및 안정한 축적을 지칭한다. 발현은 또한 단백질의 생산을 지칭할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "발현 카세트"는 종결 시그날에 기능적으로 연결되어 있는 당해 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하는, 적합한 숙주 세포에서 특정의 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 이는 또한 전형적으로 뉴클레오티드 서열의 적합한 해독에 필요한 서열을 포함한다. 상기 암호화 영역은 통상적으로 당해 단백질에 대해 암호화하지만 당해 기능성 RNA, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 해독되지 않은 RNA에 대해서도, 센스 또는 안티센스 방향으로 암호화할 수 있다. 당해 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있는데, 이는 이의 성분 중 적어도 하나가 이의 다른 성분 중 적어도 하나에 대해 이종성임을 의미한다. 발현 카세트는 또한 자연적으로 존재하는 것일 수 있지만 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 수득하였다. 그러한 발현 카세트는 당해 뉴클레오티드 서열에 연결되어 있는 전사 개시 영역을 포함하게 될 것이다. 조절 영역의 전사 조절하에 있도록 당해 유전자의 삽입을 위한 제한 부위가 다수개 있는 발현 카세트가 제공될 수 있다. 발현 카세트는 추가로 선택성 마커 유전자를 함유할 수 있다.

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 벡터를 함유하는 포유동물의 세포를 제공한다. 상기 세포는 인간일 수 있으며, 뇌, 비장, 신장, 폐, 심장, 또는 간으로부터의 것일 수 있다. 세포 유형은 줄기 세포 또는 선조 세포 집단일 수 있다.

치료 조성물을 암호화하는 핵산

본 발명은 치료 조성물을 투여하는 방법을 제공한다. 특정의 구현양태로, 상기 치료 조성물이 전이유전자로, 이는 벡터가 주로 유래하는 레트로바이러스에 대해 외래인 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이며 투여되는 유기체에서 유용한 생물활성을 갖는다 (예, 치료적 유전자). 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료적 유전자"는 치료적 효과를 제공하기 위하여, 예를 들어, 질병을 치료하기 위하여 세포에서 이의 발현이 바람직한 유전자를 지칭한다.

사용 방법

본 개시내용은 헌팅톤병, ALS, 유전성 강직성 편측마비, 원발성 측삭 경화증, 척수성 근위축, 케네디병(Kennedy's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 폴리글루타민 반복 질환과 같은 유전병, 또는 파킨슨병과 같은 병소의 노출을 상기 기재된 단리된 프로모터를 함유하는 벡터를 투여함으로써 치료하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 특정 양태는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드, 벡터, 및 유전자 조작된 세포 (생체내 변형된), 및 이들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 치료 유효량의 치료제를 전신적으로 운반할 수 있는 유전자 또는 단백질요법을 위한 방법에 관한 것이다.

이제, 본 발명은 하기의 비-제한 실시예에 의해 예시될 것이다.

실시예 1

본 실험의 경우, 6명의 다른 헌팅톤병 환자 또는 5명의 대조용 건강한 개체로부터 수득한 사망 후 인간 뇌조직을 사용하여 5개의 상이한 폴리머라제 2 프로모터의 활성을 분석하였다. RNA를 추출하여 정량적 PCR을 받도록 하여 이들 프로모터에 의해 생산된 내인성 RNA 전사물의 양을 측정하였다. 본 발명자들은 건강한 개체와 비교할 때 헌팅톤병 환자의 뇌에서 5개의 프로모터 모두에 대한 유의한 상향조절을 발견하였다. 도 1.

야생형 마우스와 HD 마우스를 6주 및 11주령 (증상을 보이기 전) 및 19주령(증상을 보일 때)에 희생시켰다. 선조체 샘플로부터 총 RNA를 단리시키고 실시간 Q-PCR을 사용하여 마우스 Nfyc, H2afy, Usp31 및 Chop 유전자의 발현을 측정하였다. 6주령 및 11주령에서는 유전자 중 어떤 것도 상향-조절되지 않은 반면, 19주령에서는 Nfyc와 H2afy의 발현이 유의하게 상향조절되었다. 시험된 마우스의 수는 그룹당 4마리이다. 도 2a-2c.

각각의 유전자 프로모터 서열을 반딧불이 루시퍼라제(Firefly Luciferase)에 대해 암호화하는 리포터 유전자의 업스트림에 클로닝하였다. 기초 조건에서 이들의 전사 활성을 입증하기 위하여 이들 작제물을 인간 배양된 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 도 3.

첨부 4에 나타낸 프로모터 작제물을 대조용 섬유아세포 또는 헌팅톤병-유래 배양된 섬유아세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 본 발명자들은 대조용 섬유아세포와 비교할 때 헌팅톤병 섬유아세포에서 클로닝된 유전자 프로모터 서열의 활성이 증가되었음을 관찰하였다. 도 4.

모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본원에서 참고로 포함된다. 전술한 명세서에서 본 발명이 특정의 이의 바람직한 구현양태와 관련하여 기재되고, 수많은 세부사항이 예시의 목적으로 기재되었지만, 관련 기술 분야의 숙련가에게는 본 발명이 추가의 구현양태에 대해서도 가능하며 본원에 기재된 특정의 세부사항은 본 발명의 기본적인 원리로부터 벗어나지 않고도 상당히 변화될 수 있음이 자명할 것이다.

본 발명을 기재하는 문맥에서 용어 "a"와 "an" 및 "the"와 유사한 지시체의 사용은 본원에 달리 표시되거나 문맥에 의해 명백하게 반박되지 않는 한, 단수와 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 간주되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)"은 달리 인지되지 않는 한 제약을 두지 않은(open-ended) 용어로 간주된다 (즉, "포함하지만(including) 제한되지 않는"을 의미한다). 본원에서 값의 범위를 나열하는 것은 단지, 본원에서 달리 표시되지 않는 한, 그 범위 내에 속하는 각각의 개별적인 값에 대해 개별적으로 언급한는 속기 방법으로 제공하고자 함이며, 각각의 개별 값은 개별적으로 본원에서 나열되는 것처럼 각각이 값이 본 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 표시되거나 또는 달리 명백하게 문맥에 의해 부정되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공되는 임의의 실시예 및 모든 실시예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예로서")는 단지 본 발명을 더 잘 이해하기 쉽도록 하기 위함이며 달리 특허청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 대해 제한하는 것이 아니다. 본 명세서 중의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 있어서 필수적인 것으로 청구되지 않은 임의의 성분을 표시하는 것으로서 간주되어서는 안된다.

본 발명을 수행하기 위하여 본 발명자들이 알고 있는 최상의 방식을 포함한, 본 발명의 구현양태가 본원에 기재된다. 전술한 기재내용은 판독할 때 관련 기술 분야의 숙련가에게 그러한 구현양태에 대한 변형이 명확해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련가들이 그러한 변형을 적절하게 이용할 것으로 기대하며, 본 발명자들은 본원에 구체적으로 기재된 것외에 달리 본 발명이 실시될 수 있도록 하고자 한다. 따라서, 본 발명은 본원에 첨부되는 특허 청구의 범위에 나열된 주제의 모든 변경 및 등가의 것들을 적용가능한 법에 의해 허용되는 것으로 포함한다. 또한, 달리 본원에 표시되거나 또는 달리 명백하게 문맥에 의해 부정되지 않는 한 모든 가능한 이들의 변형에서 상기-기재된 성분들의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF IOWA RESEARCH FOUNDATION <120> PROMOTER COMPOSITIONS <130> 17023.135WO1 <140> PCT/US2014/021357 <141> 2014-03-06 <150> 61/794,818 <151> 2013-03-15 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1622 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaggtcata tactagttga ttttggacta aaggcatccc aaagatgtac tattttttgc 60 tccctgcact attttttttt taatggaacc aacgtttaaa aataggattt ctgccttctc 120 ttaaaacatc agatgatctg gtaacgctga gctcctgttc tcacatggga acaactggct 180 ggagctgagt ggcagccacc tctttagaaa gatgttaatt tgaagtctgc tatagtcccc 240 atcattcctt atatttcccc caacactgag acccaagtca cttgaaagtc aatatgatga 300 ttcaaacacc aggattcttc actcatttgt gggtttgtga cctgtgatat ttgtggattc 360 gtgacctttg gtttagaggt caagtatagg ggttgtaaat aaaacttggg tttgaatcag 420 ataagaactg taccaatctc aaagacggtg aattaaagat taaagaaaat attgcatgct 480 tggcataatg tgtggaacac aacagctatt gtaaacaccc agtaggaatg taagctgcaa 540 gagggcaggt agaaaccgtg ctaatttaat ccgctgggga tatgacattt gattctaatt 600 taataggttt aattctttgc 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Claims (29)

1. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6 또는 서열번호:7과 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 500 내지 1700개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 단리된 프로모터 서열.
2. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6 또는 서열번호:7과 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 500 내지 1700개인 뉴클레오티드의 핵산으로 이루어진 단리된 프로모터 서열.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6 또는 서열번호:7과 적어도 95%의 동일성을 갖는 것인, 단리된 프로모터 서열.
4. 서열번호:1과 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 1500 내지 1700개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 단리된 프로모터 서열.
5. 서열번호:2와 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 600 내지 800개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 단리된 프로모터 서열.
6. 서열번호:3과 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 1300 내지 1400개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 단리된 프로모터 서열.
7. 서열번호:4와 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 1300 내지 1500개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 단리된 프로모터 서열.
8. 서열번호:5와 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 1000 내지 1200개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 단리된 프로모터 서열.
9. 서열번호:6과 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 500 내지 700개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 단리된 프로모터 서열.
10. 서열번호:7과 적어도 90%의 동일성을 갖는, 길이가 900 내지 1700개인 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 단리된 프로모터 서열.
11. 단백질 또는 RNA 전사물을 암호화하는 미리 결정된 DNA 절편에 기능적으로 연결되어 있는 형질전환된 세포에서 기능성인, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 프로모터를 포함하는 발현 카세트.
12. 제11항에 있어서, 상기 미리 결정된 DNA 절편이 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 포함하는 것인 발현 카세트.
13. 제11항에 있어서, 상기 미리 결정된 DNA 절편이 치료 조성물을 암호화하는 것인 발현 카세트.
14. 제13항에 있어서, 치료 조성물이 RNAi 분자인 발현 카세트.
15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
16. 제15항에 있어서, 상기 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인 벡터.
17. 제11항 내지 14항 중 어느 한 항의 발현 카세트 또는 제15항 또는 제16항의 벡터를 포함하는 형질전환된 세포.
18. 제17항에 있어서, 숙주 세포가 진핵세포인, 형질전환된 세포.
19. 제18항에 있어서, 상기 진핵세포가 동물 세포인, 형질전환된 세포.
20. 제19항에 있어서, 상기 동물 세포가 포유류의 세포인, 형질전환된 세포.
21. 제20항에 있어서, 상기 포유류의 세포가 인간의 세포인, 형질전환된 세포.
22. 형질전환된 세포를 생산하는 방법으로,
    (i) DNA 절편에 기능적으로 연결되어 있는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 프로모터를 포함하는 재조합 DNA를 세포중으로 도입시켜 형질전환된 세포를 수득하는 단계, 및
    (ii) 형질전환된 세포주를 확인하거나 선택하는 단계를 포함하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 재조합 DNA가 발현되어 형질전환된 세포에 표현형질(phenotypic characteristic)을 부여하는 방법.
24. 제22항에 있어서, 대조 개체로부터 유래된 세포와 비교하여 헌팅톤병(Huntington's disease) 환자로부터 유래된 세포에 도입되었을 때 형질전환된 세포가 유의하게 증가된 리포터 유전자의 발현을 나타내는 방법.
25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 형질전환된 세포.
26. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 프로모터를 포함하는 형질전환된 세포.
27. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 세포.
28. 포유류에서 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법으로,
    (i) 제15항 또는 제16항의 벡터, 또는
    (ii) 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 형질전환된 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
29. 프로모터가 신경퇴행성 질환의 시작 또는 병리학적 진행 중에 유전자 서열의 발현을 활성화시키거나, 증진시키거나 억제하는 것인, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 프로모터의 용도.

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