CN117242179A - 有义、抑制性转移rna组合物以及相关用途和功能 - Google Patents
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Abstract
本发明至少部分涉及包含受体茎和包含非同源三联体密码子的反密码子臂的有义、抑制性转移RNA(sstRNA)及其使用方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年12月31日提交的美国临时申请号63/132,932、于2021年2月19日提交的美国临时申请号63/151,416以及于2021年2月19日提交的美国临时申请号63/151,436的优先权。上述引用的申请的全部内容特此以引用的方式并入本文。
背景技术
DNA分子以构成DNA聚合物的核苷酸碱基序列的形式携带遗传信息。DNA中仅利用四种核苷酸碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。此信息以三个邻接碱基的密码子形式转录为信使RNA(mRNA)，并且然后通过转移RNA(tRNA)和核糖体翻译形成蛋白质。RNA中利用四种核苷酸碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。遗传密码是三联密码子与特定氨基酸之间的关系。六十四个可能的密码子三联体形成遗传密码，其中三个终止(stop)(也称为“终止(terminating)”或“无义”)密码子向翻译机器(细胞核糖体)提供信号，以停止特定密码子处的蛋白质生产。其他六十一个密码子三联体(也称为“有义密码子”)对应于20个标准氨基酸之一。
DNA由核糖体翻译，根据DNA具体所提供的遗传指令，使每个氨基酸一一连接在一起以形成多肽。转移RNA将mRNA在核糖体上翻译成蛋白质。每个tRNA都含有与mRNA上的互补密码子杂交的“反密码子”区域。携带其指定氨基酸的tRNA称为“负载”tRNA。如果tRNA是61个氨基酸相关tRNA(或“有义tRNA”)之一，它通常会将其氨基酸附接到生长的肽上。tRNA的结构基因长约72-90个核苷酸，并折叠成三叶草结构。
发明内容
令人惊讶地发现，tRNA可被工程化，使得它们识别非同源密码子并携带用于多肽生产的替代氨基酸。这些有义、抑制性tRNA可用于转换多肽和蛋白质中的氨基酸，从而可导致蛋白质表达或功能破坏以及细胞活力降低。
因此，在一个方面，提供了一种包含受体茎和对非同源密码子具有特异性的反密码子的有义、抑制性转移RNA(sstRNA)。
在本文所提供的任何一种sstRNA中的一个实施方案中，反密码子对任何非同源密码子具有特异性。在本文所提供的任何一种此类sstRNA中的一个实施方案中，受体茎对与所述sstRNA的反密码子编码的氨基酸不同的任何氨基酸具有特异性。
在本文所提供的任何一种sstRNA中的一个实施方案中，反密码子对亮氨酸密码子具有特异性。在本文所提供的任何一种此类sstRNA中的一个实施方案中，受体茎对脯氨酸具有特异性并且可在多肽或蛋白质生产中用亮氨酸取代脯氨酸。在本文所提供的任何一种此类sstRNA中的一个实施方案中，sstRNA由如SEQ ID NO:3和4中所示的序列编码。
在本文所提供的任何一种sstRNA中的一个实施方案中，反密码子对脯氨酸密码子具有特异性。在本文所提供的任何一种此类sstRNA中的一个实施方案中，受体茎对亮氨酸具有特异性并且可在多肽或蛋白质生产中用脯氨酸取代亮氨酸。在本文所提供的任何一种此类sstRNA中的一个实施方案中，sstRNA由如SEQ ID NO:1、2和5-13中所示的序列编码。
在本文所提供的任何一种sstRNA中的一个实施方案中，反密码子对脯氨酸密码子具有特异性。在本文所提供的任何一种此类sstRNA中的一个实施方案中，受体茎对异亮氨酸具有特异性并且可在多肽或蛋白质生产中用脯氨酸取代异亮氨酸。在本文所提供的任何一种此类sstRNA中的一个实施方案中，sstRNA由如SEQ ID NO:14和15中所示的序列编码。
在本文所提供的任何一种sstRNA中的一个实施方案中，反密码子对有错义突变的密码子具有特异性。在本文所提供的任何一种此类sstRNA中的一个实施方案中，受体茎对替代氨基酸具有特异性，而不是由具有错义突变的密码子编码的氨基酸，并且可取代替代氨基酸用于生产多肽或蛋白质的氨基酸。
在另一个方面，提供了一种编码本文所提供的任何一种sstRNA的寡核苷酸。在本文所提供的任何一种寡核苷酸的一个实施方案中，寡核苷酸具有小于150或300个核苷酸的总长度。在本文所提供的任何一种寡核苷酸的一个实施方案中，寡核苷酸是DNA。在本文所提供的任何一种寡核苷酸的一个实施方案中，寡核苷酸是RNA。
在另一个方面，提供了一种表达盒，其包含启动子和编码本文所提供的任何一种sstRNA或任何一种所述寡核苷酸的核酸。在本文所提供的任何一种表达盒的一个实施方案中，表达盒还包含终止子。在本文所提供的任何一种表达盒的一个实施方案中，表达盒包含如SEQ ID NO:16-26中所示的核苷酸序列。
在另一个方面，提供了一种载体，其包含本文所提供的任何一种寡核苷酸或表达盒。在一个实施方案中，载体是病毒载体或质粒载体。
在另一个方面，本文所提供的任何一种寡核苷酸或表达盒呈cDNA的形式。
在另一个方面，提供了一种组合物，其包含本文所提供的任何一种sstRNA、任何一种寡核苷酸、任何一种表达盒，或任何一种载体以及药学上可接受的载剂。
在另一个方面，提供了一种组合物，其包含本文所提供的至少两种或至少三种任何一种sstRNA、至少两种或至少三种任何一种寡核苷酸、至少两种或至少三种任何一种表达盒，或至少两种或至少三种任何一种载体，以及药学上可接受的载剂。
在本文所提供的任何一种组合物或方法的一个实施方案中，当存在至少两种或三种sstRNA时，所述至少两种或三种sstRNA在相同的寡核苷酸、表达盒、载体或组合物中。在本文所提供的任何一种组合物或方法的另一个实施方案中，当存在至少两种或三种sstRNA时，所述至少两种或三种sstRNA在至少两种或三种不同的寡核苷酸、表达盒、载体或组合物中。
在另一个方面，提供了一种细胞，其包含本文所提供的任何一种sstRNA、任何一种寡核苷酸、任何一种表达盒，或任何一种载体。
在另一个方面，提供了一种细胞，其包含本文所提供的任何一种sstRNA中的至少两种或至少三种、任何一种寡核苷酸中的至少两种或至少三种、任何一种表达盒中的至少两种或至少三种，或任何一种载体中的至少两种或至少三种。
提供了一种方法，其包括使细胞与以下各项接触：本文所提供的任何一种sstRNA(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种寡核苷酸(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种表达盒(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种载体(例如，至少一种或至少两种或至少三种)，或任何一种组合物(例如，至少一种或至少两种或至少三种)。
在另一个方面，提供了一种修饰或破坏蛋白质表达或功能的方法，其包括递送本文所提供的任何一种sstRNA(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种寡核苷酸(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种表达盒(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种载体(例如，至少一种或至少两种或至少三种)，或任何一种组合物(例如，至少一种或至少两种或至少三种)。在任何一种此类方法的一个实施方案中，sstRNA、寡核苷酸、表达盒、载体或组合物的量有效修饰或破坏细胞中的蛋白质表达或功能。
在另一个方面，提供了一种杀伤细胞的方法，其包括使所述细胞与以下各项接触：本文所提供的任何一种sstRNA(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种寡核苷酸(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种表达盒(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种载体(例如，至少一种或至少两种或至少三种)，或任何一种组合物(例如，至少一种或至少两种或至少三种)。在任何一种此类方法的一个实施方案中，sstRNA、寡核苷酸、表达盒、载体或组合物的量有效杀伤细胞。在任何一种此类方法的一个实施方案中，细胞在体外。在任何一种此类方法的一个实施方案中，细胞在体内。
在另一个方面，提供了一种降低细胞存活率的方法，其包括使所述细胞与以下各项接触：本文所提供的任何一种sstRNA(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种寡核苷酸(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种表达盒(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种载体(例如，至少一种或至少两种或至少三种)，或任何一种组合物(例如，至少一种或至少两种或至少三种)。
在另一个方面，提供了一种降低细胞迁移率的方法，其包括使所述细胞与以下各项接触：本文所提供的任何一种sstRNA(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种寡核苷酸(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种表达盒(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种载体(例如，至少一种或至少两种或至少三种)，或任何一种组合物(例如，至少一种或至少两种或至少三种)。
提供了一种激活免疫细胞的方法，其包括使细胞与以下各项接触：本文所提供的任何一种sstRNA(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种寡核苷酸(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种表达盒(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种载体(例如，至少一种或至少两种或至少三种)，或任何一种组合物(例如，至少一种或至少两种或至少三种)接触。在一个实施方案中，细胞可与免疫细胞或其他免疫组分接触或被接触，使得免疫应答被激活。
在另一个方面，提供了一种治疗患有过度增殖性疾病或病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用本文所提供的任何一种sstRNA(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种寡核苷酸(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种表达盒(例如，至少一种或至少两种或至少三种)、任何一种载体(例如，至少一种或至少两种或至少三种)，或任何一种组合物(例如，至少一种或至少两种或至少三种)。在任何一种此类方法的一个实施方案中，sstRNA、寡核苷酸、表达盒、载体或组合物的量有效治疗过度增殖性疾病或病症。在任何一种此类方法的一个实施方案中，过度增殖性疾病或病症是癌症。在任何一种此类方法的一个实施方案中，癌症是黑色素瘤或乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌。
在另一个方面，提供了一种鉴定sstRNA的方法。在本文所提供的任何一种鉴定方法的一个实施方案中，选择或工程化sstRNA以包含对非同源密码子具有特异性的反密码子。在本文所提供的任何一种鉴定方法的一个实施方案中，sstRNA是一种具有对不同于其反密码子编码的氨基酸的氨基酸具有特异性的受体茎或臂的sstRNA。在本文所提供的任何一种鉴定方法的一个实施方案中，所述方法包括或还包括高通量克隆和筛选。在本文所提供的任何一种鉴定方法的一个实施方案中，所述方法包括或还包括诸如通过转染在细胞通表达sstRNA，并评估蛋白质表达或功能修饰或破坏和/或细胞死亡、杀伤、存活或迁移。在本文所提供的任何一种鉴定方法的一个实施方案中，所述方法包括或还包括选择导致蛋白质表达或功能修饰或破坏和/或细胞死亡、杀伤、存活或迁移的sstRNA。
附图说明
图1提供了遗传密码表。
图2示出了tRNA的一般四臂结构，其包括T臂、D臂、反密码子臂和受体茎(或臂)。这些区域也可自始至终称为“环”。
图3示出了SWTX2和SWTX3共转染的结果，其中GFP表达和细胞分裂迅速减缓。
图4示出了SWTX5和SWTX7共转染的结果。
图5示出了GFP质粒文库筛选的板图。
图6示出了24小时时的板/细胞监测结果。
图7示出了44小时时的板/细胞监测结果。
图8示出了表达个别质粒的HEK293-T细胞中44小时时的GFP强度。
图9示出了RPMI-7951细胞(黑色素瘤细胞系)中转染后30小时的GFP表达(仅GFP)。
图10示出了RPMI-7951细胞(黑色素瘤细胞系)中转染后30小时的GFP表达(GFP+sstRNA 51)。
图11示出了HEK293T细胞中43小时时的GFP表达结果。
图12示出了SKMEL3细胞(黑色素瘤细胞系)中43小时时的GFP表达结果。
图13示出了用RPMI-7951细胞(P14)SWTX+/-tdtomato(1μg/孔)进行Fugene转染的结果(24小时时Fugene:DNA比率为2:1)。
图14示出了用RPMI-7951细胞(P14)SWTX+/-Nluc WT(1μg/孔)进行Fugene转染的结果(24小时时Fugene:DNA比率为2:1)。
图15示出了用RPMI-7951细胞(P14)SWTX+/-tdtomato(1μg/孔)进行Fugene转染的结果(48小时时Fugene:DNA比率为2:1)。
图16示出了用RPMI-7951细胞(P14)SWTX+/-Nluc WT(1μg/孔)进行Fugene转染的结果(48小时时Fugene:DNA比率为2:1)。
图17示出了以1:1.5、1:3和1:6比率用GFP、51或52质粒的cDNA进行Lipofectamine3000转染的结果。示出了GFP信号。
图18示出了Lipofetamine 3000(LP)转染的结果，按SKMEL黑色素瘤细胞系中试剂与cDNA的比率进行总结。每个图示出了相同条件的两个生物重复。
图19示出了HCC三阴性乳腺癌细胞系的结果。
图20示出了指定条件下Fugene转染的HEK293细胞。在48小时时进行划痕测定，并对GFP表达和细胞密度进行成像。72小时时的图像示出了GFP的迁移率/存活率，但未示出SWTX2+SWTX3条件下的迁移率/存活率。
图21示出了三重sstRNA组合的结果。实验条件如下：150V下跑胶至底部；在4℃下以250mA转移2小时；在室温下在1XTBST中的5％牛奶中封闭30min；在4℃下初次过夜(封闭溶液中1:2000Sigma T2949)；用1XTBST洗涤3次；在室温下封闭溶液(1:10000抗兔IgG)中二次1小时；用1XTBST洗涤3次；ECL成像+“5次拍摄”。
具体实施方式
转移RNA是DNA和RNA“蓝图”的解码器，并且有助于制造形成细胞和组织结构的蛋白质。这些RNA分子可被修饰或工程化，使得它们能够系统地“重新编码”遗传密码。本文提供基于转移RNA(tRNA)中的定点改变的平台技术，使得tRNA可用于在多肽或蛋白质生产中递送非同源氨基酸。例如，tRNA诸如脯氨酸tRNA可被工程化以识别并解码非同源密码子，诸如亮氨酸密码子。在此实例中，tRNA可用于在多肽或蛋白质生产过程中抑制亮氨酸密码子，并将其用脯氨酸替换。此类靶向变化的生物学影响是多肽或蛋白质生产可能受到不利影响，诸如表达和/或功能被修饰、降低。以脯氨酸为例，当氨基酸促进“扭结”时，表达的多肽或蛋白质通常会改变形状，继而使蛋白质功能失效。其他氨基酸取代也可能有不利结果。在一些实施方案中，最终结果可以是细胞死亡、杀死、存活或迁移。因此，本文所提供的tRNA可用于治疗其中细胞死亡、杀伤、存活或迁移将具有益处的疾病或病症。这些有义、抑制性tRNA还可用于修饰或破坏蛋白质表达和/或功能，优选内源蛋白的蛋白质表达和/或功能。
因此，本文提供了有义、抑制性tRNA，其可抑制非同源有义密码子以用于编码替代氨基酸的目的。如本文所用，“有义、抑制性转移RNA(sstRNA)”是指可携带、递送或提供与其反密码子编码的氨基酸不同的氨基酸的tRNA。优选地，氨基酸是天然氨基酸，但不同于其反密码子编码的氨基酸。换句话说，sstRNA抑制其反密码子编码的氨基酸，并且使不同的氨基酸取代它的位置。如本文所用，由sstRNA反密码子编码的氨基酸是反密码子具有特异性的氨基酸。如本文所用，当提及受体茎或臂的氨基酸特异性时，“对……具有特异性”是指由或可由tRNA的受体茎或臂携带、递送或所提供的氨基酸。
通过改变tRNA的反密码子环(与RNA信息结合的部分)，新的tRNA序列已被鉴定具有转换蛋白质密码子含义的能力。例如，已产生可将脯氨酸密码子作为RNA解码成结构不同的氨基酸(亮氨酸)；可将亮氨酸密码子解码成脯氨酸；或者可将脯氨酸密码子解码成异亮氨酸的tRNA分子。实际上，转换了前述密码子的遗传含义。此技术也被称为“SWTX”tRNA，是基于具有转移RNA密码子交换的取代(Substitution with transfer RNA codonExchange)的首字母缩略词。本文所提供的tRNA在本文中也称为有义、抑制性tRNA。这种治疗方法利用了“密码转换”。通过实施密码子选择性氨基酸转化进行的密码转换允许多种蛋白质修饰途径，诸如大小、形状和/或电荷的改变。任何一种或多种此类改变可以是本文所提供的任何一种方法中的期望结果。系统性和选择性的侧链转化可麻痹细胞功能、停止细胞分裂和/或生长等。
编码tRNA的核苷酸序列可合成产生。此外，编码数百个人tRNA的核苷酸序列是已知的并且本领域技术人员通常可通过诸如Genbank的来源获得。tRNA的结构高度保守，并且tRNA可跨物种发挥功能。因此，细菌或其他真核tRNA序列也是本发明的tRNA的潜在来源。确定特定的tRNA是否具有所需的功能(诸如在所需的哺乳动物细胞中)可如本文所述或通过对受益于本文所提供的教导的本领域普通技术人员将显而易见的其他实验来认定。
目前的研究表明，可通过对tRNA内的反密码子序列进行分子编辑来改变tRNA。这种方法允许重新编程有义密码子以被非同源氨基酸取代。如本文所提供的工程化tRNA允许将密码子“重新编辑”为特定氨基酸。这些tRNA分子的小尺寸使它们易于表达，例如，tRNA+启动子仅为约300bp或更小。本发明的另一个优点是它提供了便捷的表达和细胞递送，因为整个系统可以是紧凑的。简而言之，可合成包含在细胞诸如人细胞中起作用的tRNA基因的结构组分的寡核苷酸。寡核苷酸的序列是基于已知序列设计的，并在tRNA的反密码子区域进行取代，导致特定的tRNA识别特定密码子，但递送替代氨基酸。
tRNA具有一般四臂结构，包括T臂、D臂、反密码子臂和受体茎或臂(图2)。T臂由“T茎”和“TΨC环”组成。本文所提供的任何一种tRNA可包含此四臂结构。tRNA的长度为大约100个核苷酸，并且可很容易地引入细胞中。
在某些实施方案中，tRNA在表达盒中编码。由于tRNA编码序列的内部启动子序列，tRNA序列不需要包含在单独的转录单元中，尽管可提供一个转录单元。因此，本发明还提供了包含编码如本文所提供的tRNA的序列的表达盒。在某些实施方案中，表达盒还含有启动子。在某些实施方案中，启动子是可调控启动子。在某些实施方案中，启动子是组成型启动子。驱动编码待递送的tRNA的序列表达的启动子可以是任何所需的启动子，根据已知的考虑因素进行选择，诸如与启动子功能性连接的核酸的表达水平以及其中载体待使用的细胞类型。启动子可以是外源或内源启动子。
如本文所用的“表达盒”意指能够指导特定核苷酸序列在适当细胞中表达的核酸序列，其可包含可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列的启动子，所述感兴趣的核苷酸序列可与终止信号可操作地连接。包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的。表达盒还可以是天然存在的但已经以可用于异源表达的重组形式获得的表达盒。表达盒中核苷酸序列的表达可在组成型启动子或可调控启动子的控制下。表达盒可以是或包含在载体中。
“可操作地连接”是指单个核酸片段上核酸序列的缔合，使得一个序列的功能受到另一个序列的影响。例如，如果两个序列的位置使得调节性DNA序列影响编码DNA的表达，则称调节性DNA序列“可操作地连接至”编码RNA或多肽的DNA序列或与其“缔合”(即，编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制之下)。编码序列可以有义或反义定向可操作地连接至调节性序列。
如本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物并且包括全长蛋白质及其片段。因此，“蛋白质”和“多肽”在本文中经常互换使用。
本发明的方法提供了将核酸递送至细胞的方法。向细胞的施用可通过任何方式完成，包括简单地接触细胞。与细胞的接触可持续任何所需的时间长度。细胞可包括人以及其他大型(非啮齿类)哺乳动物(诸如灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪和狗)中的任何所需细胞。本文所提供的任何一个受试者可以是人或其他哺乳动物。术语“哺乳动物”包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、猴、狗、猫、马、牛、猪和羊。
还提供了或以其他方式为本领域所理解的用于递送和引入受试者的合适方法。在一个实施方案中，药物组合物将包含足够的遗传物质以产生治疗有效量的感兴趣的核酸，即，足以破坏蛋白质表达或功能以导致细胞死亡、杀伤、存活或迁移或减少或改善所讨论的疾病状态的症状的量，或足以赋予所需益处的量。
tRNA可以有效量递送并用tRNA合成酶诸如内源tRNA合成酶递送至细胞中。如果tRNA合成酶存在于根据本发明引入tRNA的细胞中，则认为tRNA合成酶对于细胞是“内源的”。对于本领域普通技术人员显而易见的是，出于这些目的，tRNA合成酶可被认为是内源性的，无论它是否天然存在于相关类型的细胞中，或者无论所讨论的特定细胞是否已被工程化或以其他方式由人工操纵来容纳或表达它。
药物组合物还将含有药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括可施用而没有过度毒性的任何药剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨醇、Tween80和液体诸如水、盐水、甘油和乙醇。其中可包括药学上可接受的盐，例如矿物酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于此类媒介物中。Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中提供了对药学上可接受的赋形剂的全面讨论。
鉴于本说明书的教导，本领域技术人员显而易见的是所提供的tRNA的有效量可凭经验确定。施用可在整个治疗过程中以一次剂量、连续地或间歇地实现。确定最有效的施用方式和剂量的方法可根据治疗的组成、靶细胞和所治疗的受试者等而变化。可进行单次和多次施用，剂量水平和模式由治疗医师选择。
本发明可采用包括水、盐水、人工CSF或其他已知物质的媒介物。为了制备制剂，可分离纯化的组合物。然后可将组合物调节至适当的浓度并包装以供使用。
术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，由含有糖、磷酸盐和为嘌呤或嘧啶的碱基的单体(核苷酸)组成。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸与参考核酸具有类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。
“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。术语多核苷酸序列的“基本同一性”意指多核苷酸包含与使用使用标准参数描述的比对程序之一的参考序列相比具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％或94％或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
外源遗传物质(例如，编码sstRNA或SWTX tRNA)可通过遗传转移方法(诸如转染)引入体内细胞中。各种表达载体(即，用于促进外源遗传物质递送至靶细胞中的媒介物)是本领域普通技术人员已知的。如本文所用，“细胞转染”是指细胞通过掺入获得新的遗传物质。因此，转染是指使用物理或化学方法将核酸插入细胞中。几种转染技术是本领域普通技术人员已知的或在本文中以其他方式描述。
如本文所用，“外源遗传物质”是指非天然存在于细胞中的天然或合成核酸或寡核苷酸；或者，如果它天然存在于细胞中，则它不会被细胞以具有生物学意义的水平转录或表达。因此，“外源遗传物质”包括例如可转录成tRNA的非天然存在的核酸。
通常，外源遗传物质可包括异源基因以及控制新基因转录的启动子。启动子的特征在于具有启动转录所需的特定核苷酸序列。任选地，外源遗传物质还可包括获得所需基因转录活性所需的额外序列(即，增强子)。外源遗传物质可被引入紧邻启动子下游的细胞基因组中，使得启动子和编码序列可操作地连接以便允许编码序列的转录。
除了至少一种启动子和至少一种异源核酸之外，表达载体可包含选择基因(例如绿色荧光蛋白(GFP))，用于促进对已用表达载体转染的细胞的选择。或者，可用两种或更多种表达载体转染细胞，至少一种载体含有编码tRNA的基因，另一种载体含有选择基因。合适的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列(下文所述)的选择被认为在本领域普通技术人员的认知范围内，无需过度实验。
在本文所提供的任一实施方案的实施方案中，sstRNA呈cDNA的形式并且可如此递送或与细胞接触。
在本文所提供的任一实施方案的实施方案中，sstRNA负载或不负载所需氨基酸，并且可如此递送或与细胞接触。
在一个实施方案中，本发明包括用于本文所提供的任何一种方法或用途的组合物和方法，诸如用于通过施用本发明的sstRNA或SWTX tRNA来治疗过度增殖性疾病或病症。如本文所用，“过度增殖性疾病或病症”是指其中通过快速分裂、显著过度增殖等而存在异常高的细胞增殖率的任何疾病或病症。本公开的某些实施方案提供了一种治疗受试者(诸如哺乳动物)的过度增殖性疾病或病症的方法。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
本公开的某些实施方案提供了如本文所述的sstRNA、寡核苷酸、表达盒、载体或组合物制备可用于本文所提供的任何一种方法或用途的药物的用途，诸如用于治疗受试者(诸如哺乳动物，诸如人)的过度增殖性疾病或病症。在某些实施方案中，所述治疗具有用于治疗/管理过度增殖性疾病或病症的潜在用途，所述过度增殖性疾病或病症包括肿瘤、癌症和肿瘤组织，以及非肿瘤性或非恶性过度增殖性病症。在某些实施方案中，过度增殖性疾病或病症是癌症，诸如黑色素瘤或乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌。癌症还可以是肺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈/子宫癌、膀胱癌或肝癌。
癌症可以是一种耐药性癌症。“耐药性癌症”是指已经历治疗但即使治疗后仍然进展的癌症。在一个实施方案中，耐药性癌症是“泛耐药性癌症”，其中尽管多于一种治疗(诸如化疗、放疗和/或靶向治疗)，癌症仍进展。
本公开还提供了含有本文所述的sstRNA、寡核苷酸、表达盒或载体的细胞。细胞可以是哺乳动物的，诸如人的。根据一个方面，提供了一种细胞表达系统。表达系统包括本文所提供的细胞和表达盒。表达盒包括但不限于质粒、病毒载体和用于将异源遗传物质递送至细胞的其他媒介物。
细胞表达系统可在体内形成。根据又一个方面，提供了一种用于体内治疗受试者的方法。所述方法包括将sstRNA、寡核苷酸、表达盒、载体或组合物引入受试者体内。受试者可以是哺乳动物，诸如人。
术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和可减轻症状或对受试者提供一些益处的措施，其中目的是预防或减慢(减少)不希望的生理变化或病症，诸如癌症的增长、发展或扩散。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于，症状的减轻、疾病范围的减小、稳定的(即，不恶化)疾病状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意指与未接受治疗时的预期存活期相比延长存活期。需要治疗的受试者包括那些已经患有病状、疾病或病症的受试者。
短语“治疗有效量”意指(i)治疗特定疾病、病状或病症，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病状或病症的一种或多种症状，或(iii)防止或延迟本文所述特定疾病、病状或病症的一种或多种症状的发作的本发明的化合物的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减慢且优选停止)癌细胞向外周器官的浸润；抑制(即，在一定程度上减慢且优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。就药物可防止现有癌细胞生长和/或杀伤现有癌细胞的程度而言，其可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，功效可例如通过评估疾病进展时间(TTP)和/或确定反应速率(RR)来测量。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述特征通常在于不受调控的细胞生长的哺乳动物的生理病状。“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。癌症的实例包括但不限于癌、恶性肿瘤等。此类癌症的更具体实例包括黑色素瘤或乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌。
可施用本发明的剂以便引起与过度增殖性疾病或病症(例如，癌症)相关的至少一种症状的减轻。施用量将基于多种因素而变化，包括但不限于所选择的组合物、具体疾病、体重、身体状况和哺乳动物的年龄。临床医生可采用动物模型或本领域已知的其他测试系统容易地确定此类因素。
根据本发明的sstRNA、寡核苷酸、表达盒、载体或组合物的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是否是治疗性的以及熟练的从业者已知的其他因素。本发明的剂的施用可在预选的时间段内基本上连续或可以一系列间隔的剂量进行。
可配制具有本发明的sstRNA、寡核苷酸、表达盒、载体或组合物的一种或多种合适的单位剂型并且所述单位剂型可通过多种途径施用。当制备本发明的剂用于施用时，它们可与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合以形成药物制剂或单位剂型。此类制剂中的总活性成分占制剂重量的0.1％至99.9％。“药学上可接受的”是与制剂的其他成分相容并且对于其接受者无害的载剂、稀释剂、赋形剂和/或盐。含有本发明的剂的药物制剂可通过本领域已知的程序使用熟知且容易获得的成分来制备。本发明的剂还可配制成适于施用的溶液。本发明的剂的药物制剂还可采取水性或无水溶液或分散体的形式，或者可选地乳液或悬浮液的形式。
因此，所述剂可配制用于施用并且可以单位剂量形式存在于安瓿、预填充注射器、小容量输注容器中或多剂量容器中且添加有防腐剂。所述活性成分可采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。或者，活性成分在使用前可在合适的媒介物(例如，无菌无热原水)中。应理解，包含于每个剂型的个别剂量中的活性成分或成分的单位含量本身不必构成用于治疗特定的适应症或疾病的有效量，因为必需的有效量可通过施用多个剂量单位达到。此外，可以单独或一系列施用形式使用少于剂型中的剂量来实现有效量。
本发明的药物制剂可包括作为任选成分的药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂或乳化剂以及本领域熟知类型的盐。可用于本发明的药物制剂的载剂和/或稀释剂的特定非限制性实例包括水和生理学可接受的缓冲盐溶液(诸如pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲盐溶液)和水。
本文所提供的任何组合物可用遗传转移方法(诸如转染或转导)与细胞接触、施用于细胞或引入细胞中。因此，本文所提供的任何组合物可包含在基因递送媒介物内或包含在基因递送媒介物中。基因递送媒介物可以是本领域已知的任何递送媒介物，并且可包括由受者和/或脂质介导的转染促进的裸露核酸，以及多种载体中的任一种。载体包括但不限于真核载体、原核载体(例如像细菌载体)和病毒载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体(人和其他，包括猪)、疱疹病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体(Epstein-Barr viral vector)、SV40病毒载体、痘病毒载体和假型病毒载体。
术语“逆转录病毒”用于指在它们的复制周期中利用逆转录酶的RNA病毒。逆转录病毒科内包括多个属，包括池病毒A(Cisternavirus A)、肿瘤病毒A、肿瘤病毒B、肿瘤病毒C、肿瘤病毒D、慢病毒和泡沫病毒。逆转录病毒感染多个物种，并且可水平和垂直传播。
如本文所用，术语“慢病毒”是指引起缓慢发展疾病的一组(或属)逆转录病毒。此组病毒包括HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)，其是人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体；维斯纳-梅迪病病毒(visna-maedi)，其引起绵羊脑炎(visna)或肺炎(maedi)；山羊关节炎脑炎病毒，其引起山羊免疫缺陷、关节炎和脑病；马传染性贫血病毒，其引起马自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，其引起猫免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其引起牛淋巴结肿大、淋巴细胞增多，并可能引起牛中枢神经系统感染；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，其引起亚人灵长类动物免疫缺陷和脑病。这些病毒引起的疾病的特征在于潜伏期长和病程漫长。通常，病毒潜伏感染单核细胞和巨噬细胞，然后从这些细胞扩散到其他细胞。HIV、FIV和SIV也很容易感染T淋巴细胞(即T细胞)。
在一个实施方案中，病毒载体是AAV载体。“AAV”载体是指腺相关病毒并且可用于指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。此术语包括所有亚型、血清型和假型，以及天然存形式在和重组形式，除非另有要求。如本文所用，术语“血清型”是指AAV，其基于衣壳蛋白与确定的抗血清的反应性而被其他AAV鉴定并与其他AAV区分，例如，存在八种已知的灵长类AAV血清型，AAV-1至AAV-9和AAVrh10。例如，血清型AAV2用于指代含有由AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白和含有来自相同AAV2血清型的5'和3'ITR序列的基因组的AAV。如本文所用，例如，rAAV1可用于指具有来自相同血清型的衣壳蛋白和5'-3'ITR的AAV，或者它可指具有来自一种血清型的衣壳蛋白和来自不同AAV血清型的5'-3'ITR(例如，来自AAV血清型2的衣壳和来自AAV血清型5的ITR)的AAV。对于本文说明的每个实例，载体设计和生产的描述描述了衣壳和5'-3'ITR序列的血清型。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。
“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(优选野生型AAV的所有衣壳蛋白)和衣壳化多核苷酸组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，诸如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“rAAV”。
在一个实施方案中，使用已知技术构建AAV表达载体，以至少提供为在转录方向上可操作地连接的组分；包含转录起始区域、感兴趣的DNA和转录终止区域的控制元件。选择在哺乳动物细胞中发挥功能的控制元件。所得含有可操作地连接的组分的构建体侧接(5'和3')有功能性AAV ITR序列。
“腺相关病毒反向末端重复序列”或“AAV ITR”意指在AAV基因组每个末端发现的本领域公认的区域，其以顺式作为DNA复制的起始和病毒的包装信号一起发挥作用。AAVITR与AAV rep编码区域一起，提供了从两个侧接ITR之间插入的核苷酸序列的有效切除和拯救，并将其整合到哺乳动物细胞基因组中。
AAV ITR区域的核苷酸序列是已知的。如本文所用，“AAV ITR”不需要具有所描述的野生型核苷酸序列，但可例如通过核苷酸的插入、缺失或取代来改变。另外，AAV ITR可衍生自几种AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此外，侧接AAV载体中选定的核苷酸序列的5'和3'ITR不必相同或衍生自相同的AAV血清型或分离株，只要它们按预期发挥作用即可，即当细胞中存在AAV Rep基因产物时，允许从宿主细胞基因组或载体中切除和拯救感兴趣的序列，并允许将异源序列整合到接受者细胞基因组中。
在一个实施方案中，AAV ITR可衍生自几种AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此外，侧接AAV表达载体中选定的核苷酸序列的5'和3'ITR不必相同或衍生自相同的AAV血清型或分离株，只要它们按预期发挥作用即可，即当细胞中存在AAV Rep基因产物时，允许从宿主细胞基因组或载体中切除和拯救感兴趣的序列，并允许将DNA分子整合到接受者细胞基因组中。
在一个实施方案中，AAV衣壳可衍生自AAV2。用于AAV载体中的合适的DNA分子的大小将小于约5千碱基(kb)、小于约4.5kb、小于约4kb、小于约3.5kb、小于约3kb、小于约2.5kb，并且是本领域已知的。
如本文所用，术语“减弱病毒”是指已被修饰使得其在预期受试者中的致病性显著降低的任何病毒(例如，减弱慢病毒)。病毒可被减弱至从临床角度来看为不致病的程度，即，暴露于病毒的受试者相对于对照受试者不表现出统计学上显著增加的病理水平。
如本文所用，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于病毒基因组或载体内的序列，其是将病毒或载体核酸插入病毒衣壳或颗粒中所需要的或其至少促进将病毒或载体核酸插入病毒衣壳或颗粒中。为了方便起见，术语“包装信号”也用于指转录成功能性包装信号的载体序列。包装载体与转基因载体之间的区别可以是在包装载体中，主要包装信号是失活的，而在转基因载体中，主要包装信号是有功能的。理想地，在一些实施方案中，在包装载体中，所有包装信号将失活，并且在转基因载体中，所有包装信号将是有功能的。然而，相反的考虑(诸如最大化病毒滴度或抑制同源重组)可能会使此类构建体不太理想。
本文所提供的组合物可与细胞接触或在颗粒(诸如纳米颗粒)内递送或施用至受试者。颗粒(诸如纳米颗粒)可以是但不限于基于脂质的纳米颗粒(本文也称为脂质纳米颗粒，即，其中组成其结构的大部分材料是脂质的纳米颗粒)、病毒样颗粒(即，主要由病毒结构蛋白组成但没有传染性或传染性较低的颗粒)和/或具有纳米材料组合的颗粒。颗粒可以是各种不同的形状，包括但不限于球形、立方体形、金字塔形、长方形、圆柱形、环形等。
在一些实施方案中，颗粒诸如纳米颗粒可包含一种或多种脂质。在一些实施方案中，颗粒诸如纳米颗粒可包含脂质体。在一些实施方案中，颗粒诸如纳米颗粒可包含脂双分子层。在一些实施方案中，颗粒诸如纳米颗粒可包含脂单分子层。在一些实施方案中，颗粒诸如纳米颗粒可包含微胶粒。
本发明现通过以下非限制性实施例加以说明。
实施例
实施例1
已产生转移RNA分子，其中反密码子环已被修饰，使得其对非同源三联体DNA密码子具有特异性。这些具有tRNA交换的取代(Substitution with tRNA eXchange，SWTX)tRNA可抑制人遗传密码内的有义密码子(本文也称为有义、抑制性tRNA(sstRNA))。
简而言之，单个质粒设计用于表达密码子交换的tRNA和GFP报告子。tRNA盒含有上游前导序列，接着是下游终止子。如下反向转染HEK 293细胞。解冻后，细胞每天在培养物中传代至少三天，并生长至70％汇合度。将质粒cDNA与转染试剂混合并添加至96孔中，接着以10K/180ul密度添加HEK293细胞。然后在24小时和48小时时间点对细胞进行GFP表达成像。
结果
已产生SWTX tRNA或sstRNA，其可提供替代氨基酸。例如，SWTX2和SWTS3解码脯氨酸三联体密码子以将亮氨酸置于脯氨酸(CCA)密码子处(小写字母表示反密码子三联体)。换句话说，亮氨酸tRNA被重新编码以在脯氨酸(CCA)密码子处编码亮氨酸并得以产生。
SWTX2：
SWTX3：
这些构建体的共转染迅速减缓了GFP表达和细胞分裂(图3)。通过瞬时转染共表达SWTX2或SWTX3 tRNA构建体损害细胞GFP生产，并且结果显示出快速且有害的生物活性。还示出了SWTX5或SWTX7 tRNA构建体的共表达结果(图4)。
实施例2
如上所述产生的tRNA构建体的更多实例，以及一些在质粒中表达时根据所得GFP强度进行筛选的实例(SWTX51和52具有一体化质粒设计)(图5至图8)如下：
Pro->Leu AAG(抑制Leu并转换为Pro)
SWTX 11：
SWTX 13：
Leu->Pro AGG(抑制Pro并转换为Leu)
SWTX 31：
SWTX 32：
SWTX 33：
SWTX 34：
SWTX 35：
SWTX 36：
Leu->Pro TGG(抑制Pro并转换为Leu)
SWTX 50：
SWTX 51:
SWTX 52：
Ile->Pro AGG(抑制Pro并转换为Ile)
SWTX 55：
SWTX 57：
使用的质粒序列如下：
实施例3
许多产生的sstRNA也在以下细胞系(与上面类似的HEK293T，图8和图11)中被转染(WT GFP或GFP+SWTX 51或SWTX 52构建体，SWTX51和52具有一体化质粒设计)。
SK-MEL-3：恶性黑色素瘤，皮肤；源自转移部位：淋巴结。此细胞系的基础培养基是ATCC配制的McCoy's 5a改良培养基，目录号30-2007。为了制备完全生长培养基，将以下组分添加到基础培养基中：最终浓度为15％的胎牛血清。进行反向转染。
RPMI-7951：恶性黑色素瘤，皮肤；源自转移部位：淋巴结。此细胞系的基础培养基是ATCC配制的Eagle's最低必需培养基(MEM)，目录号30-2003。为了制备完全生长培养基，将以下组分添加到基础培养基中：最终浓度为10％的胎牛血清。使用FUGENE作为转染试剂。
结果证明了SWTX 51和SWTX 52损害黑色素瘤细胞系中的蛋白质生产(图9、图10和图12)。
实施例4
使用SWTX 51和52tRNA的“一体式”设计，其中两种tRNA与GFP报告子位于相同的质粒有效载荷中(即，“顺式”构型)，以评估tRNA盒启动子干扰GFP表达的可能性。SWTX 51和52tRNA与报告子分开地在它们各自质粒(称为SWTX 2和SWTX3)中共表达。这是“反式”构型。使用黑色素瘤细胞系针对tdtomato(红色荧光蛋白)和纳米荧光素酶表达来评估SWTX 2和SWTX活性。SWTX 2和SWTX3成功敲除tdtomato以及纳米荧光素酶(nanoluc)(图13和图14，24小时时的结果，图15，48小时时的结果，以及图16，24小时和48小时时的结果)。
实施例5
当通过lipofectamine和反向转染递送tRNA时，在RPMI-7951黑色素瘤细胞中观察到tRNA介导的GFP敲减。SWTX 51和SWTX 52损害SKMEL黑色素瘤细胞系中的报告蛋白功能/表达。结果示于SK Mel 3黑色素瘤细胞系和HCC三阴性细胞系中(图17至图19)。对于SKMel，示出了RPMI-7951和HEK的比较，其中WT GFP位于顶部，接着是SWTX 51和SWTX 52。
实施例6
使用两种构建体的组合：SWTX 2和SWTX3，即SWTX 51和52的“仅tRNA”型式。数据表明，两个tRNA同时攻击宿主核糖体可比单个构建体更有效。到48小时时(图20)，在SWTX 2+3条件下观察到细胞死亡，但在仅GFP条件下未观察到细胞死亡。48小时时进行划痕测定以测量细胞移回经清理区域的能力。72小时时，GFP细胞保持健康、发出荧光，并且已大部分重新填充划痕形成的间隙。在SWTX2+3细胞中，存在广泛的细胞死亡、无迁移性以及很少的GFP表达。
实施例7
使用HEK细胞，研究了内源代谢蛋白mTOR(代谢调节剂)的sstRNA表达的三重组合。此蛋白质具有超过90个可突变为亮氨酸或异亮氨酸的脯氨酸密码子。图21左边的蓝色染色是所有蛋白质，同图中的右边是在多个条件和时间点下针对mTOR的蛋白质印迹(Western)。
测试了多种SWTX tRNA组合，其中SWTX 2/3/57的三重组合在72小时时具有最大的影响(红色星号)。即使泳道充满蛋白质，mTOR水平也受到显著影响。其影响甚至比通常用于影响核糖体的环己酰亚胺更明显。
尽管前述说明书和实施例充分公开并实现了本发明，但是它们并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书限定。
所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文。虽然在前面的说明书中已经结合本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的阐述了许多细节，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，本发明可以有另外的实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文描述的某些细节可以有相当大的变化。
在描述本发明的上下文中，术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”以及“所述”以及类似指代词的使用应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)，除非另有说明。除非本文另有说明，否则本文值范围的列举仅仅意图用作单独地提及属于所述范围的每个单独值的速记方法，并且每个单独值如同它在本文中被单独列举一样被并入到本说明书中。除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文中所描述的所有方法都可按任何合适的顺序进行。本文所提供的任何以及所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意图更好地阐明本发明，并且除非另外要求保护，否则不会对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言不应解释为将任何非要求保护的要素指示为实践本发明所必需。
本发明的实施方案在本文中描述，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述说明后，那些实施方案的变型对于本领域的普通技术人员可变得显而易见。发明人希望技术人员视情况采用此类变型，并且发明人意图以不同于如本文所具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括如适用法律允许的本发明所附权利要求书中所叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另有说明或明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖呈所有可能变型的上述元素的任何组合。
Claims (34)
1.一种包含受体茎和对非同源密码子具有特异性的反密码子的有义、抑制性转移RNA(sstRNA)。
2.如权利要求1所述的sstRNA，其中所述反密码子对亮氨酸密码子具有特异性。
3.如权利要求2所述的sstRNA，其中所述受体茎对脯氨酸具有特异性。
4.如权利要求3所述的sstRNA，其中所述sstRNA由如SEQ ID NO:3和4中所示的序列编码。
5.如权利要求1所述的sstRNA，其中所述反密码子对脯氨酸密码子具有特异性。
6.如权利要求5所述的sstRNA，其中所述受体茎对亮氨酸具有特异性。
7.如权利要求6所述的sstRNA，其中所述sstRNA由如SEQ ID NO:1、2和5-13中所示的序列编码。
8.如权利要求5所述的sstRNA，其中所述受体茎对异亮氨酸具有特异性。
9.如权利要求8所述的sstRNA，其中所述sstRNA由如SEQ ID NO:14和15中所示的序列编码。
10.一种寡核苷酸，其编码如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地编码如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA。
11.如权利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有小于150个核苷酸或300个核苷酸的总长度。
12.如权利要求11所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是DNA，诸如cDNA。
13.如权利要求11所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是RNA。
14.一种表达盒，其包含启动子和编码如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA，或如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸的核酸。
15.如权利要求14所述的表达盒，其还包含终止子。
16.一种表达盒，其包含如SEQ ID NO:16-26中所示的核苷酸序列，任选地包含至少两种或三种不同的如SEQ ID NO:16-26中所示的核苷酸序列。
17.一种载体，其包含如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸，或如权利要求14-16中任一项所述的表达盒。
18.如权利要求17所述的载体，其中所述载体是病毒载体或质粒载体。
19.一种组合物，其包含：
如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA；如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸；如权利要求14-16中任一项所述的表达盒，或如权利要求17或18所述的载体，以及药学上可接受的载剂。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述药学上可接受的载剂是颗粒，诸如纳米颗粒。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述颗粒是脂质体或脂质纳米颗粒。
22.一种细胞，其包含如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA；如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸；如权利要求14-16中任一项所述的表达盒；如权利要求17或18所述的载体，或如权利要求19-21中任一项所述的组合物。
23.一种修饰或破坏蛋白质表达或功能的方法，其包括将如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA；如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸；如权利要求14-16中任一项所述的表达盒；如权利要求17或18所述的载体，或如权利要求19-21中任一项所述的组合物以有效破坏细胞中蛋白质表达或功能的量递送到所述细胞中。
24.一种杀伤细胞的方法，其包括使所述细胞与有效杀伤细胞的量的如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA；如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸；如权利要求14-16中任一项所述的表达盒；如权利要求17或18所述的载体，或如权利要求19-21中任一项所述的组合物接触。
25.一种降低细胞存活率的方法，其包括使所述细胞与有效降低所述细胞存活率的量的如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA；如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸；如权利要求14-16中任一项所述的表达盒；如权利要求17或18所述的载体，或如权利要求19-21中任一项所述的组合物接触。
26.一种降低细胞迁移率的方法，其包括使所述细胞与有效降低所述细胞迁移率的量的如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA；如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸；如权利要求14-16中任一项所述的表达盒；如权利要求17或18所述的载体，或如权利要求19-21中任一项所述的组合物接触。
27.一种激活免疫细胞的方法，其包括使细胞与有效激活免疫细胞的量的如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA；如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸；如权利要求14-16中任一项所述的表达盒；如权利要求17或18所述的载体，或如权利要求19-21中任一项所述的组合物接触。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外。
29.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述细胞在体内。
30.一种治疗患有过度增殖性疾病或病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效治疗所述过度增殖性疾病或病症的量的如权利要求1至9中任一项所述的至少一种sstRNA，任选地如权利要求1至9中任一项所述的至少两种或三种sstRNA；如权利要求10至13中任一项所述的寡核苷酸；如权利要求14-16中任一项所述的表达盒；如权利要求17或18所述的载体，或如权利要求19-21中任一项所述的组合物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述过度增殖性疾病或病症是癌症。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤或乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌。
33.如权利要求23-32中任一项所述的方法，其中当存在至少两种或三种sstRNA时，所述至少两种或三种sstRNA在相同的寡核苷酸、表达盒、载体或组合物中。
34.如权利要求23-32中任一项所述的方法，其中当存在至少两种或三种sstRNA时，所述至少两种或三种sstRNA在至少两种或三种不同的寡核苷酸、表达盒、载体或组合物中。
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