CN105358690A - 启动子组合物 - Google Patents

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Abstract

一种分离的启动子序列，其包括长度在600至1700个核苷酸之间的核酸，所述核酸与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6或SEQIDNO：7具有至少90%的同一性。

Description

启动子组合物
相关专利申请
本专利申请要求在2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/794，818的优先权，该申请以通过引用整体并入本文。
背景技术
当前用于神经退行性疾病的基因治疗的方法缺乏开启和关闭被递送的治疗基因的表达的能力。另外，当前方法缺乏在递送后定量调节治疗基因的表达的能力。对可调控的启动子有着现实的需求。
发明概述
在某些实施方案中，本发明提供一种分离的启动子序列，包括长度在500至1700个核苷酸之间的核酸或由长度在500至1700个核苷酸之间的核酸组成，所述核酸与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7具有至少90%的同一性。在某些实施方案中，该启动子与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
在某些实施方案中，本发明提供一种包含上述启动子的表达盒，所述启动子有效连接至编码蛋白质或RNA转录物的预选的DNA区段而在转化细胞中起作用。在某些实施方案中，该预选的DNA区段包含选择标记基因或报告基因。在某些实施方案中，该预选的DNA区段编码治疗组合物。在某些实施方案中，该治疗组合物为RNAi分子。
在某些实施方案中，本发明提供一种包含上述表达盒的载体。在某些实施方案中，该载体为腺相关病毒（AAV）载体。
在某些实施方案中，本发明提供一种包含上述表达盒或上述载体的转化细胞。在某些实施方案中，该宿主细胞为真核细胞。在某些实施方案中，该真核细胞为动物细胞（例如哺乳动物细胞，如人类细胞）。
在某些实施方案中，本发明提供一种产生转化细胞的方法，包括步骤：（i）将包含上述有效连接至DNA区段的启动子的重组DNA引入细胞以便产生转化细胞，和（ii）识别或选择转化细胞系。在某些实施方案中，表达该重组DNA以便将表型特征赋予该转化细胞。在某些实施方案中，当将其引入源自亨廷顿氏病患者的细胞时，相比源自对照个体的细胞，该转化细胞表现出显著增加的报告基因表达。
在某些实施方案中，本发明提供通过上述方法制备的转化细胞。
在某些实施方案中，本发明提供包含上述分离的启动子的转化细胞。
在某些实施方案中，本发明提供包含上述表达盒的转化细胞。
在某些实施方案中，本发明提供在哺乳动物中治疗神经退行性疾病的方法，包括施用（a）上述载体或（b）上述转化细胞。
附图简述
图1：当与健康对照个体比较时，在亨廷顿氏病死亡后脑患者材料中，对五种启动子的表达分析显示出其内源性转录物的上调。
图2A-2C：在6周大（图2A）、11周大（图2B）和19周大（图2C）的亨廷顿氏病小鼠脑中内源性转录物的上调。
图3：克隆的基因启动子序列的活性。
图4：通过报告基因（荧光素酶）表达所显示的克隆的基因启动子序列的诱导。
发明详述
本发明提供基因启动子序列的用途，所述基因启动子序列可以在神经退行性障碍发作时或神经退行性障碍病理进展期间激活、增强或抑制基因序列的表达。本发明可直接应用于基因治疗领域。作为在神经退行性疾病受调控的基因治疗方法的开发中的工具，它具有潜在的商业价值。本发明提供一种在病程期间基于神经退行性疾病进展的状态或进展速率定量调节或调控治疗基因表达的方法。例如，在疾病进展期间，该基因启动子序列可以激活治疗基因的表达。如果该治疗停止了疾病进展，该基因启动子序列的活性会减弱，导致减少的/有限的治疗基因表达。此治疗基因表达的疾病调控动态方法在基因治疗领域是独特的和需要的。
本发明可应用于基因治疗领域。它满足了在递送进入脑后对治疗基因的调控和/或定量调节的需求。基因表达分析已显示在神经退行性疾病进展发作时或神经退行性疾病病程期间，大量基因启动子序列起到“开启”、增强、抑制或“关闭”基因表达的作用。本发明人已在神经退行性疾病的细胞和动物模型中鉴定并克隆了在神经退行性疾病进展期间激活和/或增强基因表达的基因启动子序列。这些基因启动子序列也可以在神经退行性疾病模型中于神经退行性疾病进展期间激活和/或增强报告基因的表达。此方法是独特的并且不同于现有的用于人工调控治疗基因表达的系统，该不同在于：其依靠神经退行性疾病相关的分子事件来调制治疗基因的表达。这些事件以及因此特定的基因启动子序列的活性通过依赖于疾病发作和/或进展的细胞内和/或细胞外信号来控制/诱导。
本发明人已在得自对照个体或携带亨廷顿氏病（即，神经退行性疾病）基因突变的个体的组织培养细胞中鉴定、克隆了七种不同的基因启动子序列并测试其活性。该实验证明这些基因启动子序列在被引入源自亨廷顿氏病患者的细胞时，相比源自对照个体的细胞，可以驱动显著增加的报告基因表达。同时，引入人造应激因子（stressor）（如蛋白酶体抑制剂或促炎性刺激）导致来自基因启动子序列的活性增加，所述活性通过内源性控制的转录物或报告基因在培养细胞中的表达来测量。另外，我们已在亨廷顿氏病（即，神经退行性疾病）的小鼠模型的脑中检测出这些基因启动子序列活性的疾病进展依赖型增加，所述活性的增加如通过内源性调控的基因转录物的定量PCR分析所测量。
启动子序列
在某些实施方案中，本发明提供以下激活和/或增强基因表达的启动子序列：泛素特异性肽酶31（USP31，SEQIDNO:1），γ-FBG(SEQIDNO:2),H2A组蛋白家族,成员Y（H2AFY，SEQIDNO:3），核转录因子Y，γ（NYFC，SEQIDNO:4）,DNA损伤诱导转录物3（CHOP，SEQIDNO:5）,非编码38ARNA（38A基因座，SEQIDNO:6)，和非编码17ARNA（17A，SEQIDNO:7）。
基因ID：USP31（SEQIDNO：1）
基因ID:γ-FBG（SEQIDNO:2）
基因ID:H2AFY（SEQIDNO:3）
基因ID:NYFC（SEQIDNO:4）
基因ID:CHOP（SEQIDNO:5）
基因ID:38A基因座（SEQIDNO:6）
基因ID:17A基因座（SEQIDNO:7）
“启动子”是指通常位于其编码序列上游（5’）的核苷酸序列，它通过提供对RNA聚合酶和正确转录所需的其它因子的识别来控制该编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，所述最小启动子是由TATA框和其它用于指定转录起始位点的序列所构成的短DNA序列，向所述转录起始位点加入调控元件以控制表达。“启动子”也指包括最小启动子加上能控制编码序列或功能性RNA表达的调控元件的核苷酸序列。这种类型的启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，其中后者常常被称为增强子。因此，“增强子”是DNA序列，所述DNA序列能够刺激启动子活性并且可以是该启动子的先天元件或是插入以增强启动子的水平或组织特异性的外源元件。它能够在两个取向（正常的或翻转的）上操作，并且甚至能够在被从该启动子移动至上游或下游时起作用。增强子和其它上游启动子元件均结合介导其功效的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以是整体源自天然基因，或是由源自天然存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至是由合成的DNA区段构成。启动子也可以包含涉及蛋白质因子结合的DNA序列，所述蛋白质因子控制应答于生理或发育状况的转录起始的效率。
如本文所用，“有生物活性的”意指该启动子具有至少约0.1%、10%、25%、50%、75%、80%、85%、甚至90%或更高，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的CCT启动子活性，所述CCT启动子包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2。该启动子活性可通过本领域熟知的方法确定。例如，参见Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989)。本发明中不同于SEQIDNO：1或SEQIDNO：2但保留了可比较的生物活性的启动子被称为变体启动子。本发明的核苷酸序列包括天然存在的序列以及重组形式。
本发明涵盖分离的或基本上纯化的核酸组合物。在本发明的语境中，“分离的”或“纯化的”DNA分子或RNA分子是脱离其天然环境而存在的DNA分子或RNA分子，并且因此不是天然的产物。分离的DNA分子或RNA分子可以纯化的形式存在或可存在于非天然环境诸如，例如，转基因宿主细胞。例如，“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分，当通过重组技术产生时基本上不含其它细胞材料或细胞培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。在一个实施方案中，“分离的”核酸不含在该核酸的来源生物体的基因组DNA中天然位于该核酸侧面（即，位于该核酸的5’和3’端的序列）的序列。例如，在多个实施方案中，该分离的核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组DNA中天然位于该核酸分子侧面的核苷酸序列。本发明也涵盖了所公开的核苷酸序列的片段和变体。所谓“片段”或“部分”意指全长或小于全长的该核苷酸序列。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）及其聚合物，其由包含糖、磷酸盐和碱基（嘌呤或嘧啶）的单体（核苷酸）构成。除非具体限定，该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指明，具体的核酸序列也涵盖其保守修饰的变体（例如，简并密码子置换）和互补序列，以及明确指明的序列。具体地，简并密码子置换可以通过产生其中一个或多个选定的（或全部）密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现。“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。
“天然存在的”、“天然的”或“野生型”用于描述可以在自然界中找到并且有别于人造的对象。例如，存在于生物体（包括病毒）中的、可以从天然来源分离的并且还未被人在实验室中有意修饰的蛋白质或核酸序列是天然存在的。
载体和表达盒
在某些实施方案中，本发明提供包含上述启动子的载体和表达盒。
载体
“载体”定义为包括：尤其是任何病毒载体，以及任何质粒、粘粒、噬菌体或双链或单链的线形或环状的双元载体，所述载体可以或不可以是可自传递的或可移动的，并且可以通过整合进细胞基因组或存在于染色体外（例如，具有复制起点的自发复制质粒）来转化原核或真核宿主。
用于在细胞中表达特定的治疗组合物（例如，蛋白质）的具体表达载体的选择和优化可以通过下述方法完成：得到编码该蛋白质的、可能具有一个或多个适当的控制区域（例如，启动子、插入序列）的核酸序列；制备包含插入有编码该蛋白质的核酸序列的载体的载体构建体；用该载体构建体在体外转染或转导培养的细胞；并确定该蛋白质是否存在于培养的细胞中。
用于细胞基因治疗的载体包括病毒，诸如复制缺陷型病毒。复制缺陷型逆转录病毒能够指导所有病毒粒子蛋白质的合成，但不能制造感染性粒子。因此，这些经遗传改造的逆转录病毒表达载体具有在培养的细胞中高效转导核酸序列的一般实用性，和用于本发明方法的特定实用性。此类逆转录病毒还具有在体内将核酸序列有效转导进入细胞的实用性。逆转录病毒已被广泛用于将核酸物质转移进入细胞。产生复制缺陷型逆转录病毒的方案（包括步骤：将外源核酸材料掺入质粒；用质粒转染包装细胞系；通过该包装细胞系产生重组逆转录病毒；从组织培养基中收集病毒颗粒；和用该病毒颗粒感染靶细胞）是本领域熟知的。
将逆转录病毒用于基因治疗的优势在于：病毒将编码靶蛋白质的核酸序列插入宿主细胞基因组，从而允许该编码靶蛋白质的核酸序列在细胞分裂时被传递到该细胞的子代。LTR区域中的启动子序列可以增强插入的编码序列在多种细胞类型中的表达。
另一个可用作细胞转化的表达载体的病毒候选者是腺病毒（Ad），所述腺病毒是双链DNA病毒。腺病毒对宽范围的细胞类型（包括，例如，肌肉和内皮细胞）具有感染性。腺病毒是具有36kb基因组的双链线形DNA病毒。腺病毒的若干特征已使其可作为转基因递送载体用于治疗应用，如促进体内基因递送。重组腺病毒载体已显示能够在原位将基因有效转移至多种器官（包括：肺、脑、胰腺、胆囊和肝）的实质细胞。这已允许了将这些载体用于治疗遗传性基因疾病（如囊性纤维化）的方法，其中可将载体递送到靶器官。
与逆转录病毒一样，腺病毒基因组适合用作基因治疗的表达载体，即，通过移除控制该病毒自身的产生的遗传信息。因为腺病毒在染色体外发挥作用，所以重组腺病毒没有理论上的插入诱变问题。
传统上已使用若干方法生成重组腺病毒。一种方法涉及将含有目标核酸序列的限制性内切酶片段直接连接至该腺病毒基因组的部分。或者，可通过同源重组结果将目标核酸序列插入到有缺陷的腺病毒中。通过筛选在互补细胞菌苔上生成的个体菌斑以鉴定所期望的重组。
合适的载体的例子包括：DNA病毒（例如，腺病毒）、慢病毒、腺相关病毒（AAV）、脊髓灰质炎病毒、HSV、或基于莫洛尼鼠的病毒载体，源自哈维肉瘤病毒（HarveySarcomavirus）、劳氏肉瘤病毒（ROUSSarcomavirus）、MPSV的病毒载体，或基于复合转座子的载体。在一个实施方案中，该载体是AAV。AAV是细小病毒科家族的小型非致病性病毒。AAV有别于该家族其他成员的地方在于其复制依赖于辅助病毒。该约5kb的AAV基因组由正或负极性的单链DNA区段组成。该基因组的末端为短的反向末端重复序列，所述反向末端重复序列可以折叠成发夹结构并充作病毒DNA复制的起点。从物理上，该细小病毒病毒粒子是非包膜的并且其二十面体衣壳的直径为约20nm。
到目前为止，已经从人类或灵长类识别和分离出许多在血清学上有差异的AAV。例如，AAV2的基因组长度为4680个核苷酸并且包含两个开放阅读框（ORF）。左侧的ORF编码非结构性的Rep蛋白质：Rep40、Rep52、Rep68和Rep78，所述Rep蛋白质在产生单链子代基因组之外还涉及复制和转录的调控。Rep68/78也已显示出具备NTP结合活性以及DNA和RNA解旋酶活性。Rep蛋白质具有核定位信号以及若干潜在的磷酸化位点。在这些激酶位点之一的突变导致了复制活性的丧失。
该基因组的末端为短的反向末端重复序列（ITR），所述反向末端重复序列具有折叠成T-状发夹结构以充作病毒DNA复制的起点的潜力。在该ITR区域内，已经描述了对ITR的功能至关重要的两个元件：GAGC重复基序和末端分解位点（trs）。已表明：当ITR为线形或发夹构象时，该重复基序结合Rep。此结合用于位置Rep68/78在trs处的裂解，所述裂解以位点和链特异性的方式发生。AAV载体具有若干特征使其成为用于基因转移的有吸引力的载体，所述特征如：具有宽广的宿主范围、能够在体外和体内转导分裂和非分裂细胞、并且能够维持经转导基因的高水平表达。
在某些实施方案中，该病毒载体为AAV载体。“AAV”载体是指腺相关病毒，并且可用于指代天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。除了另行要求之处，该术语覆盖所有的亚型、血清型和假型，并覆盖天然存在的和重组形式。如本文所用，术语“血清型”是指基于衣壳蛋白质与限定的抗血清的反应性来鉴定并有别于其它AAV的AAV，例如，有八种已知的灵长类AAV血清型：AAV1至AAV8。例如，血清型AAV9用于指代包含编码自AAV9cap基因的衣壳蛋白质以及含有来自相同AAV9血清型的5’和3’ITR序列的基因组的AAV。在某些实施方案中，该AAV载体为AAV9。
缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，也被称为重组AAV载体（或“rAAV载体”）。在一个实施方案中，采用已知技术构建该AAV表达载体以至少提供在转录方向上有效连接的组分、控制元件（包括转录起始区、目标DNA和转录终止区）。选择在哺乳动物细胞中发挥功能的控制元件。得到的包含有效连接的组分的构建体的侧面（5’和3’）是功能性AAVITR序列。
所谓“腺相关病毒反向末端重复序列”或“AAVITR”意指存在于AAV基因组每一端的识别区域（art-recognizedregion），所述识别区域作为DNA复制起点和病毒包装信号以顺式共同作用。
该AAVITR区域的核苷酸序列是已知的。如本文所用，“AAVITR”不必具有前述的野生型核苷酸序列，但其可被改变，例如，通过核苷酸的插入、缺失或置换。此外，该AAVITR可以源自若干AAV血清型的任一者，包括但不限于：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。另外，在AAV载体中位于选定的核苷酸序列侧面的5’和3’ITR不必完全相同或源自相同的AAV血清型或分离物，只要它们的功能符合期望，即，允许从宿主细胞基因组或载体切除和拯救目标序列。
可以使用标准连接技术（如在Sambrook和Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(2001)中所描述的那些）将编码治疗组合物的核酸工程改造进AAV载体中。例如，连接可在下述条件下完成：20mMTris-ClpH7.5,10mMMgCl2,10mMDTT,33μg/mlBSA,10mM-50mMNaCl,和40μMATP,0.01-0.02(Weiss)单位T4DNA连接酶于0°C(对于“粘性末端”连接)或1mMATP,0.3-0.6(Weiss)单位T4DNA连接酶于14°C(对于“平末端”连接)。分子间“粘性末端”连接通常在30-100μg/ml总ＤＮＡ浓度下进行（5-100nM总终浓度）。包含ITR的AAV载体已在例如，美国专利No.5,139,941中描述。具体来说，那其中描述的若干AAV载体可从美国典型培养物保藏中心（“ATCC”）在登录号53222、53223、53224、53225和53226下获得。
在某些实施方案中，该腺相关病毒包装了全长的基因组，即，约与天然基因组大小相同的基因组，并且既不太大也不太小。在某些实施方案中，该AAV不是自身互补AAV载体。
该病毒载体还包括控制外源基因转录的启动子。所述启动子可以是控制治疗组合物转录的诱导型启动子。该表达系统适用于向哺乳动物接受者施用。
在某些实施方案中，施用了病毒颗粒。病毒颗粒是热稳定的、耐溶剂、耐去垢剂、耐pH变化、耐温，并且可以在CsCl梯度上浓缩。AAV不与任何致病事件相关联，并且尚未发现采用AAV载体的转导会在细胞生长或分化上诱导任何持续的负面效应。已显示ITR是包装所要求的唯一顺式元件，所述包装允许完全加工病毒基因以产生载体系统。
在某些实施方案中，本发明提供包含表达盒的载体，所述表达盒包含有效连接至靶序列的启动子。如本文所用，“表达盒”意指能够指导具体核苷酸序列在适当宿主细胞中表达的核酸序列，所述核酸序列包括有效连接至目标核苷酸序列的启动子，所述目标核苷酸序列可以有效连接至终止信号。该编码区域通常编码功能性目标RNA，例如RNAi分子。该包括目标核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的。
本发明的某些实施方案提供编码靶分子（如分离的RNAi分子）的载体。如本文所用，术语“由…编码”采用广义，类似于专利用辞中的术语“包含”。RNAi分子包括siRNA、shRNA和其它可以或能够调节靶基因表达（例如通过RNA干扰）的小RNA。这类小RNA包括但不限于shRNA和微RNA（miRNA）。
“有效连接的”是指核酸序列在单个核酸片断上相关联从而其中一个序列的功能受到另一个的影响。例如，调控DNA序列被认为“有效连接至”编码RNA或多肽的DNA序列或与之“相关联”，如果该两个序列处于这样的状态：该调控DNA序列影响该编码DNA序列的表达（即，该编码序列或功能性RNA处于该启动子的转录控制之下）。编码序列可以有义或反义取向有效连接至调控序列。当核酸同另一个核酸序列被置于功能关系时，该核酸是“有效连接的”。一般而言，“有效连接的”意指该连接的DNA序列是相邻的。然而，增强子不必是相邻的。连接通过在便利的限制性位点的连接反应来完成。如果此类位点不存在，则依据常规做法使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。此外，该编码酶的核酸的多个拷贝可以在表达载体中连接在一起。此类多个核酸可以由接头分隔。
“表达”是指细胞中内源基因或转基因的转录和/或翻译。例如，就反义构建体而言，表达可以仅指代该反义DNA的转录。另外，表达还指代有义（mRNA）或功能性RNA的转录和稳定积累。表达也可以指代蛋白质的产生。
如本文所用，“表达盒”意指能够指导具体核苷酸序列在适当宿主细胞中表达的DNA序列，所述DNA序列包括有效连接至目标核苷酸序列的启动子，所述目标核苷酸序列有效连接至终止信号。它通常也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。该编码区域通常编码目标蛋白质但也可以在有义或反义方向上编码功能性目标RNA，例如反义RNA或非翻译RNA。包含目标核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着其至少一个组分相对于其至少一个其它组分是外源的。表达盒也可以是天然存在的但已经以重组形式获得而用于外源表达。此类表达盒将包含连接至目标核苷酸的转录起始区。可以连同众多限制性位点提供这样的表达盒用于插入目标基因使之处于调控区域的转录调控之下。表达盒可以额外包含可选择的标记基因。
本公开也提供包含本文所述的载体的哺乳动物细胞。该细胞可以是人类的，并且可以来自脑、脾、肾、肺、心脏或肝。该细胞类型可以是干细胞或祖细胞群体。
编码治疗组合物的核酸
本发明提供施用治疗组合物的方法。在某些实施方案中，所述治疗组合物是转基因，所述转基因是编码相对于逆转录病毒是外来的多肽的基因，载体主要源自所述逆转录病毒，并且所述转基因在其施用的生物体内具有有用的生物活性（例如，治疗基因）。如本文所用，术语“治疗基因”是指其表达是细胞所需以提供治疗效果（例如，治疗疾病）的基因。
使用方法
本公开提供通过施用含有上述分离的启动子的载体以治疗神经退行性疾病的方法，所述神经退行性疾病如遗传病如亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性偏瘫、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、肯尼迪病、老年痴呆症、多聚谷氨酰胺重复疾病或病灶性暴露（focalexposure）（如帕金森病）。
本公开的某些方面涉及多核苷酸、多肽、载体和基因改造的细胞（经体内修饰）及其用途。具体来说，本公开涉及基因或蛋白质治疗的方法，所述基因或蛋白质治疗均能够系统递送治疗有效剂量的治疗剂。
现在将通过以下非限制性实施例说明本发明。
实施例1
对于此实验，使用了得自6位不同的亨廷顿氏病患者或5位对照健康个体的死亡后人脑组织以分析5种不同聚合酶2启动子的活性。提取RNA并应用定量PCR以便测量由这些启动子产生的内源RNA转录物的量。当与健康个体比较时，我们在亨廷顿氏病患者的脑中发现全部五种启动子的显著上调。图1。
在6和11周大时（症状前）和在19周大时（出现症状）处死野生型和HD小鼠。从纹状体样品中分离总RNA并且通过使用实时Q-PCR确定小鼠Nfyc、H2afy、Usp31和Chop基因的表达。在6和11周大时，没有基因上调，然而在19周大时，Nfyc和H2afy的表达有显著上调。参与测试的小鼠数目为每组4只。图2A-2C。
在编码萤火虫荧光素酶的报告基因的上游克隆了每种所述基因启动子序列。在人类培养细胞中瞬时表达这些构建体从而确认其在基础状态下的转录活性。图3。
将示于附件4中的启动子构建体瞬时转染到对照或源自亨廷顿氏病的培养成纤维细胞中。当与对照成纤维细胞比较时，我们在亨廷顿氏病成纤维细胞中观察到所述克隆的基因启动子序列的活性增加。图4。
全部的出版物、专利和专利申请均以引用方式并入于此。尽管在前述说明书中结合其某些优选实施方案对本发明进行了描述，并且出于说明目的阐明了许多细节，对本领域技术人员显而易见的将是：本发明允许另外的实施方案并且本文所述的某些细节可以在不背离本发明基本原则的情况下发生相当大的改变。
除非在本文中另外指明或与上下文明显抵触，术语“一”和“该”及类似指称在描述本发明的语境中的使用应理解为同时覆盖单数和复数形式。除非另行注明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放式术语（即，意味着“包括但不限于”）。除非在本文中另外指明，本文中对数值范围的列举仅仅意在作为速记法来分别指代落在该范围内的每个单独数值，并且每个单独数值如同在本文中单独列举那样并入说明书。除非在本文中另外指明或与上下文明显抵触，本文中所述的全部方法可以任何适合的顺序实施。本文所提供的任何和全部实施例，或示例性用语（例如，“诸如”），除非另行要求，其使用仅仅意在更好地说明本发明而非限制本发明的范围。说明书中的用语不应当理解为暗示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
本文所述的本发明的实施方案包括本发明人所知的实施本发明的最佳方式。通过阅读前述说明书，那些实施方案的变型对于本领域普通技术人员会变得显而易见。本发明人预期熟练的技术人员将会酌情采用此类变型，并且本发明人预计本发明将以本文所具体描述的以外的方式实施。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中列举的该主题的全部修改方式和等同形式。同时，除非在本文中另外指明或与上下文明显抵触，否则本发明涵盖了上述要素在其全部可能的变型中的任意组合。

Claims (29)

1.分离的启动子序列，其包括长度在500至1700个核苷酸之间的核酸，所述核酸与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6或SEQIDNO：7具有至少90%的同一性。
2.分离的启动子序列，其由长度在500至1700个核苷酸之间的核酸组成，所述核酸与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6或SEQIDNO：7具有至少90%的同一性。
3.根据权利要求1或2的分离的启动子序列，其中所述核酸与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6或SEQIDNO：7具有至少95%的同一性。
4.分离的启动子序列，其包括长度在1500至1700个核苷酸之间的核酸，所述核酸与SEQIDNO：1具有至少90%的同一性。
5.分离的启动子序列，其包括长度在600至800个核苷酸之间的核酸，所述核酸与SEQIDNO：2具有至少90%的同一性。
6.分离的启动子序列，其包括长度在1300至1400个核苷酸之间的核酸，所述核酸与SEQIDNO：3具有至少90%的同一性。
7.分离的启动子序列，其包括长度在1300至1500个核苷酸之间的核酸，所述核酸与SEQIDNO：4具有至少90%的同一性。
8.分离的启动子序列，其包括长度在1000至1200个核苷酸之间的核酸，所述核酸与SEQIDNO：5具有至少90%的同一性。
9.分离的启动子序列，其包括长度在500至700个核苷酸之间的核酸，所述核酸与SEQIDNO：6具有至少90%的同一性。
10.分离的启动子序列，其包括长度在900至1700个核苷酸之间的核酸，所述核酸与SEQIDNO：7具有至少90%的同一性。
11.表达盒，其包括根据权利要求1至10中任一项的启动子，所述启动子有效连接至编码蛋白质或RNA转录物的预选的DNA区段而在转化细胞中起作用。
12.根据权利要求11的表达盒，其中所述预选的DNA区段包含选择标记基因或报告基因。
13.根据权利要求11的表达盒，其中所述预选的DNA区段编码治疗组合物。
14.根据权利要求13的表达盒，其中所述治疗组合物为RNAi分子。
15.载体，其包含根据权利要求11至14中任一项的表达盒。
16.根据权利要求15的载体，其中所述载体为腺相关病毒（AAV）载体。
17.转化细胞，其包含根据权利要求11至14中任一项的表达盒或根据权利要求15或16的载体。
18.根据权利要求17的转化细胞，其中所述宿主细胞为真核细胞。
19.根据权利要求18的转化细胞，其中所述真核细胞为动物细胞。
20.根据权利要求19的转化细胞，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
21.根据权利要求20的转化细胞，其中所述哺乳动物细胞为人类细胞。
22.产生转化细胞的方法，其包括步骤：（i）将重组DNA引入细胞以便产生转化细胞，所述重组DNA包含根据权利要求1至10中任一项的启动子，所述启动子有效连接至DNA区段；和（ii）鉴定或选择转化细胞系。
23.根据权利要求22的方法，其中表达所述重组DNA以便将表型特征赋予所述转化细胞。
24.根据权利要求22的方法，其中当将其引入源自亨廷顿氏病患者的细胞时，相比源自对照个体的细胞，所述转化细胞表现出显著增加的报告基因表达。
25.转化细胞，其由根据权利要求22至24中任一项的方法制得。
26.转化细胞，其包括根据权利要求1至10中任一项的分离的启动子。
27.转化细胞，其包括根据权利要求11至14中任一项的表达盒。
28.在哺乳动物中治疗神经退行性疾病的方法，其包括施用（a）根据权利要求15或16的载体，或（b）根据权利要求25至27中任一项的转化细胞。
29.根据权利要求1至10中任一项的分离的启动子的用途，其中所述启动子在神经退行性障碍发作时或神经退行性障碍病理进展期间激活、增强或抑制基因序列的表达。
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